ES2670573T3

ES2670573T3 - Secuencia de ADN y preparación recombinante del alérgeno del polen de gramíneas Phl p 4

Info

Publication number: ES2670573T3
Application number: ES11005620.7T
Authority: ES
Inventors: Andreas Dr. Nandy; Helmut Prof. Dr. Fiebig; Roland Dr. Suck; Oliver Dr. Cromwell; Arnd Dr. Petersen; Wolf-Meinhard Dr. Becker
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2002-06-25
Filing date: 2003-06-11
Publication date: 2018-05-31
Anticipated expiration: 2023-06-11
Also published as: ES2384045T3; WO2004000881A1; PL215097B1; ATE550349T1; EP1515988B1; CN1665835A; US9120866B2; RU2327739C2; CA2491038A1; RU2005101744A; US20120288526A1; AU2003279352B2; AU2003279352A1; PT2392591T; PL219272B1; PL372423A1; PL400683A1; US8128935B2; EP1515988A1; EP2392591A1

Abstract

Una molécula de ADN con una secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 1 con un intercambio de nucleótido individual seleccionado del grupo compuesto por T85A, C130A, G159A, A160C, G169A, G222C, G226A, G227C, T228C, C237T, C285T, C286T, G298A, A299C, C303T, C309G, T318C, G320A, C333G, G348C, C369G, C409T, C411T, T420C, A421C, A423C, T425C, G522C, C525G, C618T, G657A, G662A, G684C, C690A, G691A, G693A, C703A, A710C, G711A, G743A, G750A, C768T, G798C, G801A, C804G, G834C, A865G, G879C, G918A, A994T, C1047A, A1051G, G1052A, G1053A, C1090T, G1098C, C1185G, A1278C, G1370C, C1414G, C1425A, C1428T, G1443C, C1449T y G1464A.

Description

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DESCRIPCION

Secuencia de ADN y preparación recombinante del alérgeno del polen de gramíneas Phl p 4.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la preparación de la secuencia genética del alérgeno principal del polen de gramíneas PhI p 4. La invención también incluye fragmentos, nuevas combinaciones de secuencias parciales y mutaciones puntuales con efecto hipoalergénico. Las moléculas de ADN recombinante y los polipéptidos derivados, fragmentos, nuevas combinaciones de secuencias parciales y variantes se pueden utilizar para la terapia de enfermedades de alergia al polen. Las proteínas recombinantes preparadas se pueden emplear para el diagnóstico in vitro e in vivo de alergias al polen.

Las alergias del tipo 1 tienen importancia en todo el mundo. Hasta un 20% de la población de los países industrializados sufre de dolencias como rinitis alérgica, conjuntivitis o asma bronquial. Estas alergias son provocadas por alérgenos presentes en el aire (aeroalérgenos), que son liberados por fuentes de diferente procedencia, como polen de plantas, ácaros, gatos o perros. Hasta el 40% de estos alérgicos de tipo 1 muestran además reactividad IgE específica con alérgenos del polen de gramíneas (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-2001).

Las sustancias desencadenantes de las alergias de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. En personas sensibilizadas, tras la absorción a través de las mucosas estos alérgenos reaccionan con las moléculas IgE que están unidas a la superficie de los mastocitos. Cuando dos moléculas de IgE se enlazan a través de un alérgeno se produce la liberación de mediadores (p. ej., histamina, prostaglandinas) y citoquinas mediante las células efectoras y con ello se desencadenan los correspondientes síntomas clínicos.

Dependiendo de la frecuencia relativa con la que las moléculas de alérgeno individuales reaccionan con los anticuerpos IgE de los alérgicos, se diferencia entre alérgenos mayores y menores.

En el caso de la hierba timotea (Phleum pratense) hasta el momento se han identificado como alérgenos principales Phl p 1 (Petersen y col., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), Phl p 5 (Matthiesen y Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen y col., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109), Phl p 6 (Petersen y col., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54). Phl p 2/3 (Dolecek y col., 1993, FEBS 335 (3), 299304), Phl p 4 (Haavik y col., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta y col., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) y PhI p 13 (Suck y col.,

2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).

Phl p 4 se ha descrito como una glicoproteína básica con una masa molecular de entre 50 y 60 kDa (Haavik y col., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268). La molécula de Phl p 4 es resistente a la tripsina (Fischer y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) y un 70-88 % de los alérgicos al polen de gramíneas presentan anticuerpos IgE contra esta molécula (Valenta y col., 1993, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294; Rossi y col.,

2001, Allergy 56:1180-1185; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy 33:43-51). Se han descrito moléculas homólogas a partir de especies de gramíneas relacionadas (Su y col., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi y col., 1989, Int. Arch.

Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348; Jaggi y col., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; 14 - 17). Estas moléculas homólogas de Poaceae forman el grupo 4 de alérgenos, cuyas moléculas presentan entre sí una alta reactividad inmunológica cruzada, tanto con anticuerpos monoclonales de ratón como con anticuerpos IgE humanos (Fahlbusch y col., 1993 Clin. Exp. Allergy 23:51-60; Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; Su y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97:210; Fahlbusch y col., 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrovic-Jankulovic y col., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6): 361-367; Stumvoll y col. 2002, Biol. Chem. 383: 1383-1396; Grote y col., 2002, Biol. Chem. 383: 1441-1445; Andersson y Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130: 87-107; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (1): 43-51).

A diferencia de los alérgenos principales previamente mencionados de Phleum pratense (Phl p 1, Phl p 2/3, Phl 5a y 5b, Phl p 6 y Phl p 13) la estructura primaria del PhI p 4 todavía no se ha resuelto. Igualmente, no existe ninguna secuencia completa de moléculas del grupo 4 de otras especies de gramíneas.

La determinación de la secuencia de aminoácidos N-terminal no ha tenido éxito hasta el momento. Sin embargo, no se sabe cuales son las causas. Fischer y col. (J. Allergy Clin. Immunol., 1996; 98: 189-198) suponen un bloqueo N- terminal, pero pudieron purificar un péptido interno tras la degradación con lisil-endopeptidasa y determinar la secuencia del mismo: IVALPXGMLK (SEC ID N° 7).

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Este péptido presenta homologías con las secuencias peptídicas de los alérgenos de ambrosias Amb al y Amb a2, así como semejanzas con las secuencias de proteínas de maíz (Zm58.2), tomate (lat 59, lat 56) y tabaco (G10) (Fischer y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198). Para Lolium perenne se describieron fragmentos de péptidos de alérgenos básicos del grupo 4 con la secuencia siguiente: FLEPVLGLIFPAGV (SEC ID N° 8) y GLIEFPAGV (SEC ID N° 9) (Jaggi y col., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348).

De los alérgenos del grupo 4 de Dactylus glomerata hasta ahora solamente se han obtenido por degradación enzimática y se han secuenciado los péptidos:

DIYNYMEPYVSK (P15, SEC ID N° 10),

VDPTDYFGNEQ (P17, SEC ID N° 11),

ARTAWVDSGAQLGELSY (P20, SEC ID N° 12),

y GVLFNIQYVNYWFAP (P22, SEC ID N° 13) (Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072).

También se han obtenido por proteólisis y se han secuenciado péptidos de los alérgenos del grupo 4 de la gramínea subtropical Bermuda (Cynodon dactylon):

KTVKPLYIITP (S, SEC ID N° 14),

KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS (V49L, SEC ID N° 15),

TVKPLYIITPITAAMI (T33S, SEC ID N° 16),

LRKYGTAADNVIDAKVVDAQGRLL (T35L, SEC ID N° 17),

KWQTVAPALPDPNM (P2, SEC ID N° 18),

VTWIESVPYIPMGDK (V26L, SEC ID N° 19),

GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (L25L, SEC ID N° 20),

TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS (T22L, SEC ID N° 21),

YRDLDLGVNQVVG (P3, SEC ID N° 22),

SATPPTHRSGVLFNI (V20L, SEC ID N° 23),

y AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (V14L, SEC ID N° 24) (Liaw y col., 2001, Biochem. Biophys. Research Communication 280: 738-743).

Sin embargo, estas secuencias peptídicas descritas para PhI p 4 y otros alérgenos del grupo 4 no han conducido hasta ahora a la resolución completa de la estructura primaria de los alérgenos del grupo 4.

Por lo tanto, el objeto en el que se basa la presente invención consta de la preparación de la secuencia de ADN completa del PhI p 4, así como de un ADN recombinante correspondiente sobre cuya base se pueda expresar el alérgeno PhI p 4 como proteína y se pueda hacer accesible un aprovechamiento farmacológico significativo como tal o en forma modificada.

Índice de figuras

Figura 1: Secuencia de ADN interna (SEC ID N° 25) del gen de PhI p 4

Con los cebadores degenerados N° 30 (sentido) y N° 37 (antisentido), ambos representados en cursiva, se clonaron y secuenciaron productos de amplificación obtenidos con ADN genómico. La secuencia presentada representa el consenso de 6 clones. El cebador sentido N° 82 específico creado a partir de esta secuencia se presenta subrayado.

Figura 2: Extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID N° 26) del gen de PhI p 4

En una PCR RACE 3' con ADNc de Phleum pratense se obtuvieron y secuenciaron productos de amplificación con el cebador sentido N° 82 específico (en cursiva) así como un cebador de anclaje. La secuencia presentada

representa el consenso de 3 secuenciaciones y comprende el extremo 3' del gen de PhI p 4 hasta el codón de

parada (doblemente subrayado). Los fragmentos de la secuencia que se han preparado para la construcción de los 5 cebadores antisentido N° 85 y N° 86 están subrayados.

Figura 3: Localización del péptido de PhI p 4 en la secuencia de aminoácidos deducida del alérgeno PhI p 4 (SEC ID N° 2)

Los péptidos P1 - P6 (SEC ID N° 27-32) obtenidos a partir de la secuenciación de aminoácidos del alérgeno PhI p 4 purificado y fragmentado permiten clasificar claramente la secuencia de aminoácidos del gen de PhI p 4 derivada a 10 partir de la secuencia de ácidos nucleicos.

Figura 4: Determinación de la identidad del PhI p 4 recombinante (rPhI p 4) mediante los anticuerpos monoclonales 5H1 (transferencia A) y 3C4 (transferencia B) específicos para el nPhI p 4r por transferencia Western.

Trayectoria 1: Extracto celular completo de E. coli que contiene el fragmento 1-200 del rPhI p 4

Trayectoria 2: Extracto celular completo de E. coli que contiene el fragmento 185-500 del rPhI p 4

15 Trayectoria 3: Extracto celular completo de E. coli que contiene el rPhI p 4

Trayectoria 4: nPhI p 4 purificado de Phleum pratense

( -4......): Fragmentos de descomposición o degradación del fragmento C-terminal de rPhI p 4 o molécula íntegra de

rPhI p 4

Figura 5: Determinación de la reactividad del PhI p 4 recombinante (rPhI p 4) con IgE de sueros de alérgicos al 20 polen de gramíneas por transferencia Western.

Extractos de células de E. coli transformadas, que o bien expresan el gen de PhI p 4 completo o bien el fragmento 1-200 N-terminal o el fragmento 185-500 C-terminal, se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La transferencia se incubó con sueros de donantes alérgicos al polen de gramíneas A, B o C y a continuación se detectó colorimétricamente el IgE unido sobre un anticuerpo IgE no humano, conjugado 25 con fosfatasa alcalina.

Trayectoria 3: Extracto celular completo de E. coli que contiene rPhI p 4

Trayectoria 4: nPhI p 4 purificado de Phleum pratense

30 Las denominaciones utilizadas previamente y a continuación para las secuencias de nucleótidos o aminoácidos “SEC ID N°” hacen referencia al listado de secuencias que se incluye en la descripción.

Descripción de la invención

Con la presente invención se proporciona por primera vez la secuencia genética del alérgeno principal del polen de gramíneas PhI p 4, mediante la cual se obtienen tres secuencias dominantes (SEC ID N° 1, 3 y 5) a partir de los 35 intercambios de polimorfismos de nucleótido individual (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP's).

Por lo tanto, es objeto de la invención una molécula de ADN con una secuencia de nucleótidos SEC ID N° 1 con un intercambio de nucleótido individual seleccionado del grupo compuesto por T85A, C130A, G159A, A160C, G169A,

G222C, G226A, G227C, T228C, C237T, C285T, C286T, G298A, A299C, C303T, C309G, T318C, G320A, C333G,

G348C, C369G, C409T, C411T, T420C, A421C, A423C, T425C, G522C, C525G, C618T, G657A, G662A, G684C,

40 C690A, G691A, G693A, C703A, A710C, G711A, G743A, G750A, C768T, G798C, G801A, C804G, G834C, A865G,

G879C, G918A, A994T, C1047A, A1051G, G1052A, G1053A, C1090T, G1098C, C1185G, A1278C, G1370C, C1414G, C1425A, C1428T, G1443C, C1449T y G1464A.

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En relación con la presente invención, aparte de los alérgenos del grupo 4 de otras especies de gramíneas, son de interés los alérgenos del grupo 13, ya que en el SDS-PAGE muestran un peso molecular muy similar a los alérgenos del grupo 4 y son difíciles de separar mediante técnicas bioquímicas (Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Sin embargo, con ayuda de la secuencia de proteínas y de ADN según la invención y presentada ahora por primera vez, puede demostrarse claramente que los grupos 4 y 13 presentan secuencias de aminoácidos notablemente distintas.

Con el conocimiento de la secuencia de ADN de los alérgenos que existen en la naturaleza ahora es posible preparar estos alérgenos como proteínas recombinantes, que se pueden emplear en el diagnóstico y la terapia de enfermedades alérgicas (Scheiner y Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391).

La inmunoterapia específica o hiposensibilización representa una aproximación clásica al tratamiento terapéutico eficaz de las alergias (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet y col., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4): 558-562). Así, se inyectan de forma subcutánea a los pacientes extractos de alérgenos naturales en dosis crecientes. No obstante, con este método existe el peligro de reacciones alérgicas o incluso de un choque anafiláctico. Para minimizar estos riesgos se emplean preparados innovadores en forma de alergoides. Se trata de extractos de alérgenos modificados químicamente que presentan una reactividad IgE claramente reducida, aunque presentan idéntica reactividad frente a células T en comparación con el extracto no tratado (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).

Sería posible una optimización aún más amplia de la terapia con alérgenos preparados de forma recombinante. Cócteles definidos, dado el caso basados en el patrón de sensibilización individual del paciente, de alérgenos recombinantes de elevada pureza podrían reemplazar a los extractos de fuentes de alérgenos naturales, ya que éstos, aparte de los diferentes alérgenos, contienen una gran cantidad de proteínas acompañantes inmunogénicas pero no alergénicas.

Perspectivas realistas, que podrían conducir a una hiposensibilización segura con productos de expresión, ofrecen alérgenos recombinantes mutados dirigidos en los cuales se han eliminado de forma específica epítopos IgE, sin perjudicar a los epítopos de células T esenciales para la terapia (Schramm y col., 1999, J. Immunol. 162: 24062414).

Otra posibilidad de influir terapéuticamente en el equilibrio alterado de las células TH en los alérgicos es la vacunación inmunoterapéutica con ADN. Se trata de un tratamiento con ADN con capacidad de expresión que codifica para los alérgenos relevantes. Las primeras pruebas experimentales de la influencia alergenoespecífica de la respuesta inmune se obtuvieron en roedores mediante la inyección de ADN codificante de alérgeno (Hsu y col., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).

Las correspondientes proteínas preparadas de forma recombinante se pueden emplear para la terapia y para el diagnóstico in vitro e in vivo de alergias al polen.

Para la preparación del alérgeno recombinante, el ácido nucleico clonado se liga a un vector de expresión y esta construcción se expresa en un organismo huésped apropiado. Tras la purificación bioquímica, se obtiene este alérgeno recombinante para la detección de anticuerpos IgE en procedimientos establecidos.

Por consiguiente, también es objeto de la presente invención un vector de expresión recombinante que contiene una molécula de ADN descrita previamente o a continuación, unido funcionalmente con una secuencia control de expresión y un organismo huésped, transformado con la molécula de ADN indicada o el vector de expresión indicado.

Como ya se ha mencionado la invención se puede emplear como un componente esencial en un preparado que contiene alérgenos o ácidos nucleicos recombinantes para la inmunoterapia específica. Así, se presentan varias posibilidades. Por un lado, la proteína no modificada en la estructura primaria puede formar parte del preparado. Por otro lado, mediante la deleción dirigida de epítopos IgE de la molécula completa o mediante la preparación de fragmentos individuales que codifican para epítopos de células T, se emplea para la terapia según la invención una forma (alergoide) hipoalergénica para evitar efectos secundarios no deseados. Finalmente, mediante el propio ácido nucleico, cuando éste se liga con un vector de expresión eucariótico, se consigue un preparado que aplicado directamente modifica el estado inmune alérgico en el sentido terapéutico.

La presente solicitud revela por lo tanto de moléculas de ADN recombinantes correspondientes a la SEC ID N° 1, 3 o 5, en las que la secuencia de nucleótidos de las posiciones 1-69 se derivó a partir de la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal del PhI p 4. Para ello se emplearon codones existentes principalmente en E. coli. A partir de la posición 70, la secuencia de ADN corresponde a aquella que se identificó en el ADNc y genómico de Phleum pratense.

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La presente solicitud revela de ahí una molécula de ADN que comprenda una secuencia de nucleótidos según SEC ID N° 1, SEC ID N° 3 o SEC ID N° 5, empezando por la posición 70, la cual codifica para un polipéptido con las características del alérgeno mayor Phl p 4 de Phleum pratense.

Por consiguiente, también es objeto de la invención un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEC ID N° 2 con un intercambio de nucleótido individual seleccionado del grupo compuesto por A6L, A7K, K8N, E9D, S29T, I54L, V57I, G76T, E100T, S107N, H137Y, T141P, V142A, R221K, V231I, P235T, K237T, R248K, S289G, T332S, R351E, P364S, Q472E y K498Q.

La presente solicitud también revela de polipéptidos según SEC ID N° 2, SEC ID N° 4 o SEC ID N° 6, mediante los cuales se determinaron las posiciones de los aminoácidos 1-33 mediante la secuenciación de aminoácidos N- terminal del alérgeno Phl p 4 natural aislado. Las posiciones 24-500 se derivaron de la secuencia de ADN según SEC ID N° 1, 3 o 5. Los aminoácidos variables de las posiciones 6, 7, 8 y 9 proceden de la secuenciación N- terminal de la proteína de distintas preparaciones del PhI p 4 natural (Tab. 1).

Estos polipéptidos o proteínas según la invención, los cuales actúan como alérgenos para los humanos, se encuentran en los granos de polen de Phleum pratense. Los granos de polen de otras especies de Poaceae, como por ejemplo Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus, entre otras, contienen moléculas alergénicas homólogas (alérgenos del grupo 4).

La homología de estas moléculas se comprueba mediante su reactividad inmunológica cruzada tanto con anticuerpos monoclonales murinos como con anticuerpos IgE humanos.

Para la determinación de la secuencia de proteínas y ADN del Phl p 4 se procedió como sigue:

La purificación y aislamiento del alérgeno natural PhI p 4 se realizó según los métodos descritos (Fahlbusch y col. 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807; Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). La purificación y la eliminación de trazas del alérgeno del grupo 13 se realizó según el método descrito por Suck y col. (2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).

De este PhI p 4 aislado a partir de Phleum pratense se determinó la secuencia de aminoácidos N-terminal mediante degradación de Edman. Con distintas cargas del PhI p 4 se determinaron las secuencias N-terminales (P1a-f) que se muestran en la Tabla 1. Como secuencia de consenso para las primeras 15 posiciones se considera la siguiente secuencia: YFPP'P'AAKEDFLGXL (SEC ID N° 33). No se pudo determinar la posición 14, posiblemente está ocupada por una cisteína. Los distintos aminoácidos de las posiciones 6, 7, 8 y 9 con las distintas cargas indican variaciones en el sentido de isoformas. Las posiciones 4 y 5 están ocupadas por hidroxiprolina (P'), lo que se comprobó de forma inequívoca mediante una analítica específica en los análisis de los preparados p1-a y b.

Mediante el tratamiento del PhI p 4 desnaturalizado por SDS con endopeptidasa Glu-C (Promega, Heidelberg, Alemania) se obtuvieron varios péptidos. De dos péptidos (P1 y P2) se determinaron las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Tabla 1. Mediante la disociación con la endopeptidasa Lys-C (Roche, Mannheim, Alemania) se purificaron y secuenciaron 2 péptidos (P4 y P5) (Tab. 1). Mediante disociación con CNBr se aisló otro péptido (P6) y se determinó la secuencia de aminoácidos (Tab.1).

Las secuencias de aminoácidos de la secuencia N-terminal y de los péptidos internos 2 y 6 se utilizaron como base para la construcción de cebadores degenerados. Con el cebador sentido N° 30 y el cebador antisentido N° 37 (Tab. 2) se prepararon amplificados con ADN genómico de Phleum pratense. Los clones obtenidos a partir de estos amplificados se secuenciaron (Fig. 1) y se utilizaron para la construcción del cebador sentido específico N° 82 (Tab. 2). Con un ADNc, que se preparó a partir de la población de ARNm representativo del polen de Phleum pratense, y el cebador sentido específico N° 82 según la invención, así como el cebador de anclaje AUAP (Life Technologies, Karlsruhe, Alemania) se realizó una PCR bajo condiciones rigurosas. Este producto de amplificación de aprox. 450 kb se secuenció y, de este modo, se identificó la secuencia que faltaba hasta el extremo 3' del gen de PhI p 4 (Fig. 2). Basándose en esta secuencia del PhI p 4 C-terminal determinada según la invención se construyeron los cebadores antisentido específicos N° 85 y N° 86 (Tab. 2). Basándose en la secuencia de aminoácidos N-terminal del péptido P1-a de PhI p 4 (Tab. 1) se construyó el cebador sentido degenerado N° 29, derivado del ADN que codifica para las posiciones de aminoácidos 24-33 (LYAKSSPAYP (SEC ID N° 34)).

Con los cebadores N° 29 y 86 se llevó a cabo una PCR con ADN genómico de Phleum pratense. Este producto de PCR se utilizó como base para una segunda PCR (PCR anidada) con los cebadores N° 29 y N° 85. Los productos de amplificación se insertaron, clonaron y secuenciaron en el vector pGEM T-easy (Promega, Heidelberg, Alemania). Esta secuencia empieza en la posición 24 del extremo N, éste inclusive, o la posición 70 de la secuencia de ADN según SEC ID N° 1, 3 o 5 y llega hasta el cebador N° 85, (posición 1402 de la SEC ID N° 1, 3 o 5) que está localizado en un segmento C-terminal ya determinado del gen de PhI p 4. Con estos datos se puede construir la secuencia de aminoácidos completa de la molécula de PhI p 4 a partir de las primeras 33 posiciones de

aminoácidos determinadas mediante la secuenciación de la proteína y la secuencia de aminoácidos deducida (477 posiciones), que puede derivarse a partir de los clones preparados con los cebadores N° 29/N° 85 y N° 82/cebador de anclaje. Ambos clones se solapan en 197 posiciones de su secuencia de nucleótidos. El péptido codificado por el clon N° 29/N° 85 se solapa en 10 posiciones de aminoácidos con la secuencia N-terminal (posiciones 1-33) del 5 Phl p 4 determinada mediante secuenciación de aminoácidos directa, coincidiendo los aminoácidos determinados por ambos métodos.

La secuencia de aminoácidos del Phl p 4 basada en los aminoácidos N-terminales determinados directamente y la secuencia de aminoácidos deducida corresponde a la secuencia especificada bajo la SEC ID N° 2, 4 o 6 del listado de secuencias.

10 Con el cebador sentido específico N° 88 (Tab. 2) y el cebador antisentido específico N° 86 se prepararon y secuenciaron directamente los productos de la PCR tanto con ADN genómico como con ADNc de Phleum pratense.

De este modo es posible descartar errores de la PCR y descubrir variaciones genéticas (polimorfismos de nucleótido individual).

Los intercambios de nucleótido individual encontrados en la secuencia de ADN SEC ID N° 1 se presentan en la 15 Tabla 3. Algunos de estos intercambios de nucleótido individual conducen a aminoácidos modificados. Éstos se presentan en la Tabla 4. Además, se secuenciaron los clones de ADN que conducen a aminoácidos divergentes respecto a las secuencias dominantes SEC ID N° 2, 4 y 6 (Tab. 5).

Estas variaciones de aminoácidos deben considerarse isoformas de la molécula de Phl p 4. La existencia de tales isoformas es de esperar a causa del comportamiento isoeléctrico heterogénico del Phl p 4 natural. Todos los 20 alérgenos de polen conocidos hasta el momento presentan tales isoformas. Que el segmento de ADN, el cual se determinó con los cebadores N° 29 y 86, realmente codifica para una proteína, la cual es idéntica al alérgeno Phl p 4 natural, puede también demostrarse, entre otros, porque para los péptidos internos identificados P3, P4 y P5 (Tab. 1) del Phl p 4 natural se encuentran secuencias peptídicas homólogas en la secuencia de aminoácidos deducida de la molécula de Phl p 4 recombinante según la invención (Fig. 3). La secuencia de aminoácidos del Phl 25 p 4 descrita muestra que se trata de una molécula básica con un punto isoeléctrico calculado de 8,99 (SEC lD N° 2), 8,80 (SEC lD N° 4) o 9,17 (SEC lD N° 6) y que consta de 500 aminoácidos. La composición de aminoácidos cuantitativa se presenta en la Tabla 6. El peso molecular calculado del Phl p 4 recombinante asciende a 55.762 (SEC lD N° 2), 55.734 (SEC lD N° 4) o 55.624 (SEC lD N° 6) dalton. Esta masa molecular calculada concuerda muy bien con la masa molecular determinada mediante SDS-PAGE del Phl p 4 natural, que fue de 55 kDa (Fahlbusch y 30 col., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807 y Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).

También para los alérgenos del grupo 4 de especies de gramíneas relacionadas se han descrito masas moleculares de entre 50 y 60 kDa (Su y col., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi y col., 1989, lnt. Arch. Allergy Appl. lmmunol. 89: 342-348; Jaggi y col., 1989, J. Allergy Clin. lmmunol. 83: 845-852; Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. lmmunol. 98: 1065-1072; 14 - 17).

35 Para la preparación de la proteína de Phl p 4 recombinante se construyó en vectores de expresión la secuencia de ADN según SEC lD N° 1, 3 y/o 5 que codifica para Phl p 4 (p. ej., pProEx, pDCro, pSE 380). Para los aminoácidos N-terminales conocidos a partir de la secuenciación de la proteína se emplearon codones optimizados de E. coli.

Tras la transformación en E. coli, la expresión y la purificación del alérgeno Phl p 4 recombinante mediante diferentes técnicas de separación, la proteína obtenida se sometió a un proceso de replegado.

40 Esta proteína rPhl p 4 así obtenida produce una sola banda en el SDS-PAGE, que se encuentra en la misma zona de peso molecular que el Phl p 4 natural. La reactividad inmunológica del rPhl p 4 se pudo comprobar mediante la reacción con los anticuerpos monoclonales murinos 5H1 y 3C4, que se indujeron con Phl p 4 natural y reaccionaron de forma cruzada con las proteínas homólogas (grupo 4) de Poaceae (Fahlbusch y col., 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrovic-Jankulovic y col., 2000, lnvest. Allergol. Clin. lmmunol. 10 (6): 361-367) (Fig. 4). El rPhl p 4 45 reaccionó con anticuerpos lgE de alérgicos que presentan una reactividad lgE comprobada con el Phl p 4 natural. Esta reactividad lgE y, con ello, el efecto como alérgeno pudo comprobarse tanto en el ensayo de puntos, transferencia Western, como también tras la adsorción del alérgeno en placas de microtitulación de poliestireno. La determinación por transferencia Western se muestra en la Figura 5. En la reacción del rPhl p 4 con basófilos de alérgicos al polen de gramíneas reactivos a los alérgenos del grupo 4, éstos se estimulan para una expresión 50 amplificada del marcador de activación CD 203c. Esta activación de basófilos mediante rPhl p 4 muestra claramente que esta molécula también es funcional como alérgeno.

De esta forma, este alérgeno rPhl p 4 puede utilizarse para el diagnóstico altamente específico de alérgicos al polen de gramíneas. Este diagnóstico se puede realizar in vitro mediante la detección de anticuerpos específicos (lgE,

5

10

15

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25

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35

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45

50

IgG1 - 4, IgA) y la reacción con células efectoras cargadas con IgE (p. ej., basófilos de la sangre) o in vivo mediante reacciones de ensayos en la piel y provocación en el órgano de reacción.

La reacción del rPhI p 4 con linfocitos T de alérgicos al polen de gramíneas se pudo comprobar mediante la estimulación alergenoespecífica de los linfocitos T para la proliferación y síntesis de citoquina, tanto con células T en linfocitos sanguíneos de preparación reciente como en líneas y clones de células T establecidas reactivas frente a nPhI p 4.

Basándose en la secuencia de ADN expuesta del rPhI p 4 se clonaron en vectores de expresión secuencias parciales que codifican para péptidos de 50 a 350 aminoácidos. Estas secuencias parciales cubren secuencialmente la secuencia completa del rPhI p 4, lo que produce solapamientos de al menos 12 aminoácidos. Los péptidos expresados corresponden a fragmentos de PhI p 4. Estos fragmentos de PhI p 4 no reaccionan, o lo hacen en un grado muy bajo, solos o mezclados con anticuerpos IgE de alérgicos, de modo que pueden clasificarse como hipoalergénicos. Por el contrario, la mezcla de estos fragmentos, del mismo modo que el PhI p 4 natural o completamente recombinante, es capaz de estimular linfocitos T de alérgicos al polen de gramíneas con reactividad frente a PhI p 4.

En la figura 4 se muestra como ejemplo la caracterización de dos de estos fragmentos de PhI p 4 que corresponden a los aminoácidos 1-200 y 185-500 mediante la unión a anticuerpos de ratón monoclonales específicos para PhI p 4. El fragmento 185-500 C-terminal reacciona sólo con el anticuerpo monoclonal 5H1, mientras que el fragmento 1200 N-terminal reacciona claramente con el anticuerpo monoclonal 3C4. En la figura 5 puede verse que el fragmento 185-500 reacciona en menor grado con el IgE de sueros de alérgicos B y C, por lo que es menos alergénico que el fragmento 1-200, el cual presenta una reactividad IgE (hipoalergenicidad) aumentada como mínimo frente al suero de pacientes C.

Mediante mutagénesis dirigida al sitio se modificaron los tripletes codificantes para la cisteína, de manera que codifican para otros aminoácidos, preferentemente serina. Se prepararon variantes, tanto en las que se reemplazaron cisteínas individuales como aquellas en las que se modificaron diferentes combinaciones de 2 restos cisteína o todas las 5 cisteínas. Las proteínas expresadas de estos mutantes puntuales de cisteína presentan una reactividad fuertemente reducida o inexistente con anticuerpos IgE de alérgicos, aunque reaccionan con los linfocitos T de estos pacientes.

Por consiguiente, también es objeto de la presente invención una molécula de ADN descrita previamente o a continuación, en la que mediante mutagénesis dirigida al sitio, uno, varios o todos los restos cisteína del polipéptido correspondiente se intercambiaron por otro aminoácido.

La actividad inmunomoduladora de los fragmentos hipoalergénicos que corresponden a los polipéptidos con epítopos de células T, así como la de los mutantes puntuales hipoalergénicos (p. ej., intercambios de cisteína) se puede comprobar mediante su reacción con las células T de los alérgicos al polen de gramíneas.

Dichos fragmentos o mutantes puntuales de cisteína hipoalergénicos se pueden emplear como preparados para la hiposensibilización de alérgicos, ya que reaccionan con la misma eficacia con las células T, aunque a causa de la reducida o inexistente reactividad IgE ocasionan pocos efectos secundarios producidos por IgE.

Si los ácidos nucleicos que codifican para las variantes PhI p 4 hipoalergénicas o el ADN no modificado que codifica para PhI p 4 se ligan con un vector de expresión humano, estas construcciones se pueden emplear también como preparados para una terapia inmune (vacunación con ADN).

Otro grupo de preparaciones farmacéuticas según la invención, en lugar de ADN contiene al menos un polipéptido descrito anteriormente y es adecuado para el diagnóstico y/o tratamiento de las alergias indicadas.

Las preparaciones farmacéuticas en el sentido de la presente invención contienen como principio activo un polipéptido según la invención o un vector de expresión y/o sus respectivos derivados de uso farmacéutico, incluidas sus mezclas en todas las proporciones. Así, los principios activos según la invención pueden mezclarse con al menos un excipiente o coadyuvante sólido, líquido y/o semilíquido y, dado el caso, combinarse con uno o varios principios activos adicionales en una forma de dosificación adecuada.

Como coadyuvantes son particularmente apropiados el ADN inmunoestimulante u oligonucleótidos con motivos CpG.

Estas preparaciones se pueden emplear como agentes terapéuticos o diagnósticos en medicina humana o veterinaria. Como excipientes entran en consideración sustancias orgánicas o inorgánicas apropiadas para la aplicación parenteral y que no influyen negativamente en el efecto del principio activo según la invención. Para la aplicación parenteral se emplean en particular soluciones, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas, otras suspensiones, emulsiones o implantes. El principio activo según la invención también se puede liofilizar y los

liofilizados obtenidos se pueden emplear, por ejemplo, para la preparación de preparados inyectables. Las preparaciones mencionadas pueden esterilizarse y/o contener coadyuvantes, como lubricantes, conservantes, estabilizantes y/o humectantes, emulsionantes, sales para influir sobre la presión osmótica, tampones y/o varios principios activos adicionales.

5 Además, mediante la formulación correspondiente del principio activo según la invención se pueden obtener preparados de depósito.

Por tanto, la invención también sirve para mejorar el diagnóstico/n vitro en el marco de una identificación de componentes alérgenos activadores del espectro de sensibilización específico de los pacientes. La invención sirve también para la elaboración de preparados claramente mejorados para la inmunoterapia específica de alergias al 10 polen de gramíneas.

Tabla 1 Secuencia de aminoácidos de péptidos de Phl p 4

Preparado: Carga peptídica SEC ID N° Aminoácidos 1 6 11 16 21 26 31

PhI p 4 intacto: P1-a 35 YFPP'P' AAKED FLGXL VKEIP PRLLY AKSSP AYP

: P1-b 36 YFPP'P' AAKED FLGXL VKE-P PRLLY AKSSP

: P1-c 37 YFPXX AAKED FLGXL

: P1-d 38 YFPXX AKKED FLGXL

: P1-e 39 YFPXX AAKDD FLGXL

: P1-f 40 YFPXX LANED F

Fragmento Glu-C: P2 41 SATPF XHRKG VLFNI QYV

: P3 42 GLXYR XLXPE

Fragmento Lys-C: P4 43 KXMGD DHFXA VR

: P5 44 APEGA VDI I

Fragmento CNBr: P6 45 MEPYV SINPV QAYAN Y

Tabla 2 Cebadores sentido y antisentido específicos y degenerados que se construyeron sobre la base de secuencias de péptidos y secuencias de ADN de PhI p 4

15

Cebado N.°: Péptido/ADN Sentido/ antisentido SEC ID N° Secuencia de nucleótidos

29: Phl p 4-P1 s 46 YTN TAY GCN AAR WSN WSN CCN GCN TAY CC

30: Phl p 4-P2 s 47 CAY MGN AAR GGN GTN YTN TTY AAY ATM C

37: Phl p 4-P6 as 48 TAR TTN GCR TAN GCY TGN ACN GGR TT

82: Phl p 4-DNA-NYW s 49 ACT ACT GGT TCG CCC CGG GAG CC

85: Phl p 4-DNA-GLV as 50 TGA AGT ATT TCT GGC CCC ACA CCA AAC C

86: Phl p 4-DNA-QRL as 51 CCC TTG GTG ATG GCG AGC CTC TGG

88: Phl p 4-DNA-PSV s 52 CTC AGT CCT GGG GCA GAC CAT CC

Las secuencias de nucleótidos de los cebadores 82, 85, 86 y 88 se representan en el código de 4 caracteres habitual. Para los cebadores 29, 30 y 37 se utiliza el código de ADN IUPAC-IUB; la letra N aquí representa inosina.

20 Tabla 3 Intercambios de nucleótido individual detectados

Posición en la secuencia: Nucleótido según SEC ID N° 1 SNP detectados

85: T A

130: C A

159: G A

160: A C

169: G A

185: C T

186: C A

222: G C

226: G A

227: G C

228: T C

237: C T

273: C T

285: C T

286: C T

298: G A

299: A C

303: C T

309: C G

318: T C

320: G A

333: C G

348: G C

369: C G

409: C T

411: C T

420: T C

421: A C

423: A C

424: G A

425: T C

456: C G

462: C A

522: G C

525: C G

567: G A

618: C T

655: A C

657: G A

662: G A

680: C T

684: G C

690: C A

691: G A

693: G A

703: C T, A

710: A C

711: G A

713: C T

743: G A

750: G A

768: C T

773: A C

790: G A

798: G C

801: G A

804: C G

809: C A

834: G C

844: C A

859: A T

865: A G

879: G C

895: G C

900: G C, A

918: G A

961: A G

962: A C

964: A C

987: G C

994: A T

1020: G A

1023: G C

1036: G C

1040: C T

1041: G C

1047: C A

1051: A G

1052: G A, C

1053: G A, C, T

1056: G C

1069: T C

1073: G A

1084: C G

1086: G C

1090: C T

1098: G C

1151: G C

1152: G C

1155: G C

1161: G C

1185: C G

1229: G C

1233: G C

1239: A C

1240: T C

1242: G C

1257: G C

1266: C T

1269: C T

1278: A C, G

1305: C G

1308: C T

1311: C A

1335: G C

1350: G C

1357: T A

1359: A G

1370: G C

1377: T C

1378: T A

1379: T A

1383: G C

1398: C T

1411: T C

1414: C G

1425: C A

1428: C T

1443: G C

1449: C T

1464: G A

1485: G A

1498: A C

Tabla 4 Intercambios de aminoácidos, como consecuencia de intercambios de nucleótido individual

Posición en la secuencia: Aminoácido según SEC ID N° 2 Intercambio detectado

6: A L

7: A K

8: K N

9: E D

29: S T

54: I L

57: V I

62: A V

76: G T, N, S

100: E T

107: S N

137: H Y

141: T P

142: V A, T

189: T K

219: K Q

221: R K

227: P L

231: V I

235: P T, S

237: K T

238: A V

248: R K

258: D A

264: V I

270: T K

282: Q K

287: M L

289: S G

299: A P

321: N A

322: I L

332: T S

346: E Q

347: P L

351: R E, T

357: F L

358: S N

362: L V

364: P S

384: W S

410: G A

419: E D

456: F Y

457: S A, N

460: L K

468: K M

472: Q E

498: K Q

Tabla 5 Posiciones de aminoácidos divergentes en clones de Phl p 4 recombinantes individuales en comparación con SEC ID N° 2

Ejemplo: Posiciones divergentes*

Clon 1: L54, I57, V62, S76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, L227, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472

Clon 2: L54, I57, V62, T76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472

Clon 3: P141, K282, L287, P299, L347, E351

Clon 4: G289, A410, D419, Y456, A457, K460, E472

Clon 5: L347, E351, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472

Clon 6: N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460

Clon 7: K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384

Clon 8: Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, E351

Clon 9: M231, T246, A251, C263, G289, L307, L309, E334

Clon 10: Q219, K221, I231, S235, T237, M238, V242, V246, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, N358, V362, S384, inserción GA entre posición 407 y 408, N452, Y456, A457, K460, E472

Clon 11: Inserción GA entre posición 407 y 408

‘[aminoácidos según SEC ID N° 2 / posición en la secuencia / aminoácidos divergentes]

5 Tabla 6 Composición de aminoácidos del Phl p 4

Aminoácidos: Cantidad % en peso

Cargados: 138/138/138 33,89/33,86/33,93

Ácidos: 45/46/43 9,82/10,05/9,38

Básicos: 54/53/55 13,67/13,39/13,78

Polares: 120/119/124 24,88/24,71/25,89

Hidrófobos: 180/180/180 35,64/35,66/35,43

A Ala: 40/40/41 5,10/5,10/5,24

C Cys: 5/5/5 0,92/0,93/0,93

D Asp: 24/24/24 4,95/4,96/4,97

E Glu: 21/22/19 4,86/5,10/4,41

F Phe: 24/24/22 6,33/6,34/5,82

G Gly: 42/42/40 4,30/4,30/4,10

H His: 10/10/9 2,46/2,46/2,22

I Ile: 29/29/30 5,88/5,89/6,10

K Lys: 29/29/33 6,67/6,67/7,60

L Leu: 33/33/35 6,70/6,70/7,12

M Met: 11/11/10 2,59/2,59/2,36

N Asn: 22/22/23 4,50/4,50/4,72

P Pro*: 38/39/39 6,62/6,80/6,81

Q Gln: 15/15/15 3,45/3,45/3,46

R Arg: 25/24/22 7,00/6,73/6,18

S Ser: 32/32/33 5,00/5,00/5,17

T Thr: 22/21/22 3,99/3,81/4,00

V Val: 41/41/40 7,29/7,29/7,13

W Trp: 13/13/12 4,34/4,34/4,02

Y Tyr: 24/24/26 7,02/7,03/7,63

* incluido hidroxiprolina

Los valores se indican para las tres secuencias dominantes en el orden SEC ID N° 2 / SEC ID N° 4 / SEC ID N° 6

10

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Merck Patent GmbH

<120> Secuencia de ADN y preparación del alérgeno del polen de gramíneas Phl p 4 mediante métodos recombinantes

15 <130> P 02/101 EP DIV1

<150> EP 02 013953.1 <151 > 2002-06-25 <150> EP 03 740216.1 <151 > 2003-06-11 20 <160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<211> 1503 <212> ADN

<213> Phleum pratense <220>

5 <221> artificial_DNA_sequence

<222> (1)..(69)

<223> Secuencia de ADN derivada de la proteína secuenciada

<220>

<221 > CDS

10 <222> (1 )..(1503)

<220>

<221> native_DNA_sequence

<222> (70)..(1503) <400> 1

tac: ttc ccg ccg ccg gct gct aaa gaa gac

Tyr: Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp

1: 5 10

aaa: gaa ate ccg ccg cgt ctg ttg tac gcg

Lys: Glu lie Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala


: 20 25

ccc: tea gtc ctg ggg cag acc ate cgg aac

Pro: Ser val Leu Gly Gln Thr lie Arg Asn


: 35 40

gac: aac gtg aag ccg ate tac ate gtc acc

Asp: Asn Val Lys Pro lie Tyr lie Val Thr

50: 55

ate: cag tcc gee gtg gtg tgc ggc cgc cgg

lie: Gln Ser Al a Val Val cys Gly Arg Arg

65: 70

gtg: cgc age ggc ggg cae gac tac gag ggc

Val: Arg Ser Gly Gly Hi s Asp Tyr Glu Gly




: 85 90

cag: ccc gag gag ttc gee gtc gtc gac ctt

Gln: Pro Glu Glu Phe Ala Val val Asp Leu



: 100 105

tgg: gtg gac ggg aag gee cgc acg gcg
tgg

ttc: ctg ggt tgc Ctg gtt

Phe: Leu Gly cys Leu 15 val

aaa: teg teg ccg gcg tat

Lys: Ser ser Pro 30 Ala Tyr

teg: cgg tgg teg teg ccg

Ser: Arg Trp 45 Ser Ser Pro

ccc: acc aac gee tcc cae

Pro: Thr 60 Asn Ala Ser His

cae: ggt gtc cgc ate cgc

His 75: Gly val Arg lie Arg 80

etc: teg tac cgg tcc ctg

Leu: Ser Tyr Arg Ser 95
Leu

age: aag atg cgg gee gtg Val

Ser: Lys Met Arg 110 Ala

gtc: gac tcc ggc gcg cag

48

96

144

192

240

288

336

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ADN con una secuencia de nucleótidos SEC ID N° 1 con un intercambio de nucleótido individual

seleccionado del grupo compuesto por T85A, C130A, G159A, A160C, G169A, G222C, G226A, G227C, T228C,

C237T, C285T, C286T, G298A, A299C, C303T, C309G, T318C, G320A, C333G, G348C, C369G, C409T, C411T,

5 T420C, A421C, A423C, T425C, G522C, C525G, C618T, G657A, G662A, G684C, C690A, G691A, G693A, C703A,

A710C, G711A, G743A, G750A, C768T, G798C, G801A, C804G, G834C, A865G, G879C, G918A, A994T, C1047A,

A1051G, G1052A, G1053A, C1090T, G1098C, C1185G, A1278C, G1370C, C1414G, C1425A, C1428T, G1443C, C1449T y G1464A.
2. Una molécula de ADN, que codifica para un polipéptido, con la secuencia de aminoácidos SEC ID N° 2 con un 10 intercambio de nucleótido individual seleccionado del grupo compuesto por A6L, A7K, K8N, E9D, S29T, I54L, V57I,

G76T, E100T, S107N, H137Y, T141P, V142A, R221K, V231I, P235T, K237T, R248K, S289G, T332S, R351E, P364S, Q472E y K498Q.
3. Una molécula de ADN, correspondiente a una secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 1 o 2, que codifica para un fragmento inmunomodulador y reactivo frente a células T, caracterizada porque dicha secuencia de

15 nucleótidos se modificó de forma dirigida mediante un intercambio dirigido de una, varias o todas las cisteínas del polipéptido frente a otro aminoácido.
4. Un vector de expresión de ADN recombinante que contiene una molécula de ADN según las reivindicaciones de la 1 a la 3, unido funcionalmente con una secuencia control de expresión.
5. Un organismo huésped, transformado con una molécula de ADN según las reivindicaciones de la 1 a la 3 o un 20 vector de expresión según la reivindicación 4.