ES2271436T3 - Sondas de hibridacion fluorescente con poco ruido de fondo. - Google Patents
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Abstract
Par de sondas de hibridación FRET formado por un primer oligonucleótido portador de una unidad donante de FRET y por segundo oligonucleótido portador de una unidad aceptora de FRET, caracterizado porque un oligonucleótido portador de la primera unidad de FRET va marcado en su extremo 3'' y el se- gundo oligonucleótido va marcado en su fragmento 5'', y porque dichos fragmentos terminales forman pares de bases con frag- mentos contiguos del ácido nucleico diana o con fragmentos que solo están separados por uno o dos radicales más, de modo que el oligonucleótido portador de la unidad donante fluorescente lleva como mínimo una segunda unidad, que es un nitroindol capaz de inhibir la emisión de fluorescencia por parte de dicha unidad donante fluorescente.
Description
Sondas de hibridación fluorescentes con poco
ruido de fondo.
La presente invención procede del campo de la
PCR en tiempo real. De manera más concreta, la presente invención se
refiere a un par mejorado de sondas de hibridación FRET.
En la PCR en tiempo cinético real, la formación
de los productos de la PCR se controla en cada ciclo de la PCR. La
amplificación se mide habitualmente en termocicladores que poseen
dispositivos adicionales para detectar las señales de fluorescencia
durante la reacción de amplificación. El LightCycler de Roche
Diagnostics (nº de catálogo 2 0110468) es un ejemplo típico de
ello. Los productos amplificados se detectan, por ejemplo, mediante
sondas de hibridación marcadas fluorescentemente - que solo emiten
señales de fluorescencia cuando están unidas al ácido nucleico diana
- o, en ciertos casos, también mediante colorantes fluorescentes que
se fijan al ADN de doble hélice. Para todas las reacciones
analizadas se determina una señal umbral definida, y el número de
ciclos Cp necesarios para alcanzar el valor umbral se determina para
el ácido nucleico diana y también para los ácidos nucleicos de
referencia, tales como los genes estándar o domésticos. Los números
de copias absolutas o relativas de la molécula diana se pueden
determinar en base a los valores Cp obtenidos para el ácido nucleico
diana y el ácido nucleico de referencia (ver patentes WO 97/46707;
WO 97/46712; WO 97/46714).
El formato de ensayo PCR-FRET en
tiempo real se distingue por dos sondas de hibridación de hebra
sencilla, que se emplean simultáneamente y que son complementarias
de sitios adyacentes de la misma hebra del ácido nucleico diana
amplificado. Ambas sondas están marcadas con distintos componentes
fluorescentes. Cuando se excitan con luz de longitud de onda
adecuada, un primer componente transfiere la energía absorbida al
segundo componente, según el principio de transferencia de energía
por resonancia fluorescente, de modo que puede medirse una emisión
de fluorescencia del segundo componente cuando ambas sondas se fijan
a posiciones adyacentes de la molécula diana que quiere detectarse.
(Como alternativa se puede controlar la reducción de fluorescencia
del componente dador de FRET). Entre todos los formatos de detección
conocidos del estado técnico, este "formato de sonda de
hibridación FRET" ha resultado muy sensible, exacto y fiable. El
diseño de secuencias adecuadas para sondas de hibridación FRET puede
verse a veces limitado por las características especiales de la
secuencia del ácido nucleico diana a
detectar.
detectar.
De manera alternativa también se puede utilizar
un cebador marcado fluorescentemente y tan solo una sonda
oligonucleótida marcada (Bernard, P.S., y otros, Anal Biochem 255
(1998) 101-7).
Otra aplicación de las sondas de hibridación
FRET es el análisis de curvas de fusión. En este ensayo, primero se
amplifica el ácido nucleico diana mediante una reacción de PCR
típica, usando cebadores de amplificación apropiados. Las sondas de
hibridación ya pueden estar presentes durante la reacción de
amplificación o se pueden añadir posteriormente. Una vez completada
la reacción PCR se incrementa sustancialmente la temperatura de la
muestra y se detecta fluorescencia mientras la sonda de hibridación
está unida al ADN diana. A la temperatura de fusión las sondas de
hibridación se liberan de su diana y la señal fluorescente disminuye
inmediatamente hasta su nivel de fondo. Esta disminución se controló
con una representación gráfica apropiada de la fluorescencia frente
a temperatura-tiempo y de la primera derivada de la
fluorescencia frente a la temperatura. Se puede determinar un valor
de temperatura exacto, para el cual se observa la disminución de la
fluorescencia.
Sin embargo se ha observado que - según el tipo
de colorante fluorescente empleado - en muchos casos existe un fondo
de fluorescencia moderado. Como consecuencia, el margen dinámico del
ensayo es limitado, sobre todo si las señales de fluorescencia están
normalizadas respecto a la fluorescencia de fondo según cualquier
método conocido del estado técnico.
Es sabido de la literatura que las sondas
donantes doble o múltiplemente marcadas con fluoresceína fomentan el
proceso FRET de tal manera, que se alcanza una mayor emisión del
compuesto aceptor de FRET. Sin embargo, la eficiencia de esta
alternativa depende mucho de la orientación espacial de los
colorantes respecto a la sonda donante (Okamura, Y., y otros,
Nucleic Acids Res 28 (2000) E107). Además, los oligonucleótidos
donantes con fluorescencia múltiple son difíciles de purificar y los
bloques monoméricos donantes que forman la fosforamidita para los
oligonucleótidos son materias primas caras. Por otra parte este
principio no es universal y está limitado a los colorantes estables
en medio básico, con los cuales es viable el método de la
fosforamidita.
Por tanto se necesitan sondas de hibridación
FRET que proporcionen una mejor intensidad de la señal y un margen
dinámico de detección bastante amplio, independientemente del tipo
de colorantes marcadores utilizados.
Este problema se resuelve con las sondas de
hibridación FRET, conforme a la presente invención, de modo que la
propia sonda donante de FRET lleva un radical químico capaz de
inhibir la parte fluorescente del donante. Dicho radical químico es
un nitroindol.
De modo más concreto, la nueva invención se
refiere a un par de sondas de hibridación FRET, que se hibridan a un
ácido nucleico diana en sitios contiguos. Dicho par de sondas de
hibridación FRET consta de un primer oligonucleótido, que lleva una
unidad donante de FRET, y de un segundo oligonucleótido, que lleva
una unidad aceptora de FRET. El primer oligonucleótido lleva como
mínimo una segunda unidad - que es nitroindol - capaz de inhibir la
emisión de fluorescencia por parte de dicha unidad donante
fluorescente.
Preferentemente, el fragmento nucleótido del
primer oligonucleótido que lleva la unidad donante de fluorescencia
también lleva la segunda unidad con la actividad inhibidora.
También entra en el campo de la presente
invención el que un miembro de dicho par de sondas de hibridación
FRET pueda servir de cebador en una reacción de amplificación de
ácido nucleico, tal como la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
La presente invención también se refiere a un
procedimiento de uso del par de sondas de hibridación FRET, conforme
a la presente invención, para controlar en tiempo real la emisión de
fluorescencia por parte de la unidad donante fluorescente o por
parte de la unidad aceptora fluorescente. En una forma de ejecución
concreta, la emisión de fluorescencia de dicha unidad donante de
FRET se controla en un primer canal detector y la emisión de
fluorescencia de dicha unidad aceptora de FRET se controla en un
segundo canal detector, con lo cual la emisión de fluorescencia de
dicha unidad aceptora de FRET se puede normalizar por la emisión de
fluorescencia de dicha unidad donante de FRET.
Fig.
1
Representación gráfica de la fluorescencia F2/F1
frente al número de ciclos del experimento PCR en tiempo real
expuesto en el ejemplo 3.
+N/-N: con/sin un grupo nitroindol en el donante
FRET
a) 10^{8} copias, b) 10^{8} copias del ADN
diana
Fig.
2
Representación gráfica de la 1ª derivada de la
fluorescencia F2/F1 frente a la temperatura, que presenta el
análisis de la curva de fusión del experimento expuesto en el
ejemplo 4.
+N/-N: con/sin un grupo nitroindol en el donante
FRET
a) 10^{8} copias, b) 10^{8} copias del ADN
diana
Fig.
3
Representación gráfica de la fluorescencia F2/F1
frente al número de ciclos del experimento PCR en tiempo real
expuesto en el ejemplo 5.
La curva superior corresponde a la detección con
el empleo de una sonda marcada con fluoresceína, que lleva una G
adicional según la SEQ ID NO: 9, mientras que la curva inferior
corresponde a la detección mediante una sonda marcada con
fluoresceína, como se conoce en el estado técnico, según la SEQ ID
NO: 8.
En la PCR a tiempo real mediante el uso de
sondas de hibridación FRET, la fluorescencia se controla como medida
de la cantidad de producto amplificado que se ha sintetizado. Para
la obtención de datos fiables y cuantitativos ha resultado ventajoso
normalizar la señal absoluta por la señal de fluorescencia de fondo.
Para conseguirlo, la emisión de fluorescencia del aceptor de FRET se
controla en un primer canal detector y la emisión de fluorescencia
del donante de FRET se controla en un segundo canal detector. Por
tanto, la emisión de fluorescencia del aceptor de FRET puede
normalizarse dividiendo el valor obtenido por la emisión de
fluorescencia de dicho donante de FRET.
No obstante, dependiendo de los colorantes
fluorescentes usados realmente para crear un par FRET, los valores
normalizados distan a veces de ser óptimos. Como consecuencia el
ensayo correspondiente tiene un margen dinámico reducido. En este
contexto los inventores observaron que este efecto es debido
principalmente a la señal de fondo del radical donante de FRET.
Gracias a la idea general de la presente invención, este problema se
puede superar mediante una inhibición apropiada de la señal del
donante de FRET.
Para conseguir esto, los radicales donantes de
FRET se inhiben incorporando una o más moléculas inhibidoras muy
cerca del radical donante de FRET. Conforme a la presente invención,
se hace de modo que el oligonucleótido portador del radical donante
de FRET lleve adicionalmente nitroindol como segunda unidad, capaz
de inhibir el propio radical donante de FRET. Preferentemente, el
radical del fragmento nucleótido portador de la unidad donante de
fluorescencia también lleva la segunda unidad con la actividad
inhibidora.
El método según la presente invención mejora las
opciones de diseño de un ensayo FRET y mejora la dinámica de la
señal del proceso de detección FRET, ya que se reduce de manera
significativa la emisión interferente del donante de FRET. Esto es
de especial importancia, cuando el espectro de la emisión FRET del
donante se solapa con el espectro de la emisión FRET del aceptor,
aunque sea parcialmente.
De modo sorprendente, a pesar de la presencia de
un radical inhibidor cerca del radical dador de FRET, el donante de
FRET aún es capaz de actuar como pareja de FRET. De modo todavía más
sorprendente, en comparación con la fluorescencia del donante de
FRET, la actividad transferidora de energía por parte del donante de
FRET disminuye menos en estas condiciones, para todas las sustancias
inhibidoras probadas hasta ahora por los inventores. Por lo tanto la
introducción de un radical nitroindol, conforme a la presente
invención, reduce de manera significativa la fluorescencia del
donante de FRET, pero no afecta a la eficiencia del propio proceso
de FRET.
Según un primer aspecto, la presente invención
se refiere a un par de sondas de hibridación FRET que consta de un
primer oligonucleótido, portador de al menos una unidad donante de
FRET, y de un segundo oligonucleótido, portador de al menos una
unidad aceptora de FRET. Dicho primer oligonucleótido portador de la
unidad donante fluorescente lleva al menos una segunda unidad, que
es nitroindol, capaz de inhibir la emisión de fluorescencia por
parte de dicha unidad donante fluorescente.
La posición del fragmento nucleótido en el
primer oligonucleótido se puede elegir arbitrariamente, siempre que
tenga un efecto inhibidor respecto a la emisión de la unidad donante
de FRET. No obstante es preferible que los dos fragmentos portadores
de la unidad donante de FRET y de la unidad inhibidora estén muy
próximos uno del otro. Por ejemplo estos dos fragmentos pueden ser
contiguos. De modo más preferente, el mismo fragmento está marcado
tanto con la unidad donante de fluorescencia, como con la unidad de
nitroindol.
También es preferible que un oligonucleótido
portador de la primera unidad FRET esté marcado en su fragmento
terminal 3' y el segundo oligonucleótido portador de la segunda
unidad FRET esté marcado en su fragmento terminal 5', de modo que,
cuando ambos oligonucleótidos se hibridan con el ácido nucleico
diana, los marcadores fluorescentes de ambas unidades FRET quedan
muy próximos entre sí, debido al hecho de que dichos fragmentos
terminales forman pares de bases con fragmentos adyacentes del ácido
nucleico diana o al menos con fragmentos que solo están separados
por uno o más radicales. En este contexto, el oligonucleótido
portador del fragmento dador de FRET junto con el compuesto
inhibidor de la presente invención se puede escoger arbitrariamente,
ya que estos elementos pueden introducirse en ambos extremos, el 5'
o el 3', de un oligonucleótido.
Según un segundo aspecto, la presente invención
se refiere a una serie formada por al menos 3 oligonucleótidos, la
cual se caracteriza porque un primer oligonucleótido y un segundo
oligonucleótido son capaces de actuar como un par de cebadores en
una reacción de amplificación de ácido nucleico dependiente de un
molde. Dicho primer oligonucleótido y dicho tercer oligonucleótido
están marcados respectivamente con al menos un miembro
correspondiente de un par FRET, formado por una unidad donante de
FRET y por una unidad aceptora de FRET, de tal manera, que el
oligonucleótido portador de la unidad donante de FRET lleva al menos
una segunda unidad, que es un nitroindol, capaz de inhibir la
emisión de fluorescencia de dicha unidad donante fluorescente. De
nuevo, los dos fragmentos del primer oligonucleótido portador de la
unidad donante de FRET y de la unidad inhibidora están
preferentemente muy cerca uno del otro. Por ejemplo, estos dos
fragmentos pueden ser contiguos. Con mayor preferencia, el mismo
fragmento está marcado a la vez con la unidad donante de
fluorescencia y con la unidad inhibidora de nitroindol.
Es importante que, al hibridar dicho tercer
oligonucleótido con el ácido nucleico diana amplificado, los
marcadores de dicho primer oligonucleótido y dicho tercer
oligonucleótido se introduzcan muy cerca uno del otro, de manera que
no queden separados por ningún fragmento de nucleótido o solo por
uno, dos o pocos radicales. Esto se puede conseguir, por ejemplo,
mediante un diseño cebador/sonda, caracterizado de tal modo, que
dicho primer oligonucleótido y dicho tercer oligonucleótido sean
parcialmente complementarios entre sí. A este respecto el término
"parcialmente" debe entenderse como incluyendo formas de
ejecución en que la complementariedad se limita a uno, dos, tres o a
unos pocos oligonucleótidos.
Preferiblemente, el oligonucleótido que sirve de
cebador y que al mismo tiempo está marcado para poder participar en
la FRET se marca de modo preferente en un fragmento nucleótido
interno, porque un marcaje terminal 3' inhibiría la elongación por
una polimerasa dependiente de molde y, como consecuencia, no habría
amplificación de producto. Por otra parte tampoco es aplicable un
marcaje terminal 5', porque un marcador en esa posición requeriría
una sonda oligonucleótida que sería prácticamente complementaria de
dicho primer oligonucleótido, lo cual a su vez provocaría problemas
durante el proceso de amplificación, ya que dicho primer
oligonucleótido y la sonda oligonucleótida podrían formar híbridos
antes de la reacción de amplificación, dando como resultado una
mayor fluorescencia de fondo.
Preferiblemente, el tercer oligonucleótido, que
se usa como sonda de hibridación, se marca en su fragmento terminal
5' o en su fragmento terminal 3' con el radical donante de FRET y el
nitroindol inhibidor según la presente invención. Al hibridarlo con
el ácido nucleico diana amplificado, los marcadores fluorescentes de
ambas unidades FRET se incorporan muy cerca uno del otro, de tal
manera, que los dos fragmentos nucleótidos marcados forman pares de
bases entre sí o al menos con fragmentos adyacentes.
Según un tercer aspecto, la presente invención
se refiere a composiciones que contienen los oligonucleótidos arriba
descritos. De manera más precisa, una composición conforme a la
presente invención comprende una muestra de ácido nucleico y un par
de sondas de hibridación caracterizado por constar de un primer
oligonucleótido, portador de una unidad donante de FRET, y de un
segundo oligonucleótido, portador de una unidad aceptora de FRET, de
modo que dicho primer oligonucleótido portador de la unidad donante
fluorescente lleva al menos una segunda unidad, que es un
nitroindol, capaz de inhibir la emisión de fluorescencia de dicha
unidad donante fluorescente.
Como alternativa, la composición conforme a la
presente invención puede contener al menos 3 oligonucleótidos y se
caracteriza porque un primer oligonucleótido y un segundo
oligonucleótido son capaces de actuar como par de cebadores para una
reacción de amplificación de ácidos nucleicos dependiente de molde.
El primer oligonucleótido y el tercer oligonucleótido están marcados
respectivamente con un correspondiente miembro de un par FRET
formado por una unidad donante de FRET y una unidad aceptora de
FRET, donde el oligonucleótido portador de la unidad donante de FRET
lleva al menos una segunda unidad, que es un nitroindol capaz de
inhibir la emisión de fluorescencia por parte de dicha unidad
donante fluorescente. De modo preferente dicho primer
oligonucleótido y dicho tercer oligonucleótido pueden ser
parcialmente complementarios entre sí sobre una secuencia de uno,
dos, tres o unos pocos fragmentos.
La presente invención también se refiere a
diversos métodos y aplicaciones con el empleo de los pares de
oligonucleótidos y de las composiciones conforme a la presente
invención, que se han descrito anteriormente.
De una manera más concreta, la presente
invención se refiere a un método para detectar cualitativa o
cuantitativamente una secuencia de ácido nucleico en una muestra de
ácido nucleico, hibridando dicha muestra con un par de sondas FRET
que consta de un primer oligonucleótido, portador de al menos una
unidad donante de FRET, y de un segundo oligonucleótido, portador de
al menos una unidad aceptora de FRET. Dicho primer oligonucleótido
portador de la unidad donante fluorescente lleva, como mínimo, una
segunda unidad, que es un nitroindol, capaz de inhibir la emisión de
fluorescencia de dicha unidad donante fluorescente.
Según una forma de ejecución, este método puede
ser un típico ensayo de hibridación. La hibridación puede tener
lugar en solución o alternativamente, el ácido nucleico diana o bien
un miembro del par de sondas de hibridación FRET ya está
inmovilizado sobre un soporte sólido. El propio soporte sólido puede
ser por ejemplo una membrana de hibridación, una perla de vidrio
magnético, una micromatriz para la inmovilización de ácidos
nucleicos o cualquier otro material conocido del estado técnico.
En otra forma de ejecución muy preferida, una
parte de dicho ácido nucleico presente en la muestra es sometido a
una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, antes o durante
el proceso de hibridación, por ejemplo a una reacción en cadena de
polimerasa (PCR). Como requisito previo el ácido nucleico diana
incluye una secuencia esencialmente complementaria de la secuencia
de las sondas de hibridación empleadas. En otras palabras, las
sondas de hibridación empleadas tienen que hibridarse
específicamente con el ácido nucleico diana.
Como alternativa, en caso de que el ácido
nucleico diana esté amplificándose, se utiliza una serie de al menos
3 oligonucleótidos distintos. La serie se caracteriza porque un
primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido son capaces de
actuar como un par de cebadores para una reacción de amplificación
de ácidos nucleicos dependiente de molde. Dicho primer
oligonucleótido y dicho tercer oligonucleótido están marcados
respectivamente con al menos un miembro correspondiente de un par
FRET formado por una unidad donante de FRET y una unidad aceptora de
FRET, en que el oligonucleótido portador de la unidad donante de
FRET lleva al menos una segunda unidad, que es un nitroindol capaz
de inhibir la emisión de fluorescencia por parte de dicha unidad
donante
fluorescente.
fluorescente.
Asimismo, los métodos arriba expuestos permiten
el seguimiento de la reacción de amplificación en tiempo real,
mediante el control de la emisión de fluorescencia por parte de la
unidad donante fluorescente, o de la unidad aceptora fluorescente,
durante la misma reacción de amplificación. Por lo tanto, el control
en tiempo real permite la generación de datos cinéticos y facilita
el análisis cuantitativo.
Un bajo ruido de fondo de la unidad donante de
FRET es especialmente importante en los casos en que la emisión de
fluorescencia de la unidad aceptora de FRET se normaliza por la
emisión de fluorescencia de dicha unidad donante de FRET. La
normalización se efectúa habitualmente dividiendo el valor
controlado de emisión de fluorescencia de la unidad aceptora de FRET
por el valor controlado de emisión de fluorescencia de dicho donante
de FRET. Por consiguiente, un bajo ruido de fondo produce una
elevada señal normalizada.
A este respecto la nueva invención también trata
de un método para detectar cualitativa o cuantitativamente una
secuencia de ácido nucleico en una muestra de ácido nucleico. Este
método se caracteriza porque la emisión de fluorescencia de la
unidad donante de FRET es controlada en un primer canal detector y
la emisión de fluorescencia de la unidad aceptora de FRET es
controlada en un segundo canal detector, y también porque la emisión
de fluorescencia de dicha unidad aceptora de FRET se normaliza por
la emisión de fluorescencia de dicha unidad donante de
FRET.
FRET.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere al empleo de las sondas de hibridación FRET arriba
descritas, para el análisis de curvas de fusión, en que el control
de la disociación de un complejo entre un ácido nucleico diana y una
sonda de hibridación permite detectar pequeñas variantes de
secuencia, tales como polimorfismos nucleótidos simples.
De manera más concreta, en un aspecto, la
presente invención se refiere a un método, en el que primero se
forma un complejo híbrido ternario entre el ácido nucleico diana y
las dos sondas de hibridación. Después se aumenta la temperatura y
la disociación térmica del complejo ternario se determina
controlando la fluorescencia en tiempo real. En otras palabras, la
nueva invención también se refiere a un método para determinar el
perfil de fusión de un híbrido formado por un ácido nucleico diana y
un par de sondas de hibridación FRET, tal como se ha descrito
arriba, el cual se caracteriza porque la emisión de fluorescencia se
determina en función de la temperatura.
Como alternativa, también es posible determinar
un perfil de fusión de un híbrido formado por un ácido nucleico
diana y un solo oligonucleótido, en aquellos casos en que el primer
componente de un par FRET ha sido incorporado al producto de
amplificación mediante un cebador marcado adecuadamente y el segundo
componente de un par FRET es aportado por un oligonucleótido
debidamente marcado, lo cual permite controlar la disociación
térmica de un complejo híbrido binario entre el ácido nucleico diana
y el oligonucleótido marcado que actúa como sonda de
hibridación.
Para analizar las curvas de fusión, conforme a
la presente invención, también ha resultado ventajoso controlar la
emisión de fluorescencia del fragmento aceptor de FRET en un primer
canal detector y la emisión de fluorescencia del fragmento donante
de FRET en un segundo canal detector, con lo cual el valor obtenido
de la emisión de fluorescencia de dicha unidad aceptora de FRET se
puede normalizar por la emisión de fluorescencia de dicha unidad
donante de FRET.
Según un último aspecto, la presente invención
se refiere a un kit, que incluye un par de sondas de hibridación
conforme a la invención.
Este tipo de kit puede contener un juego de
sondas de hibridación FRET según la presente invención, como las que
se han descrito arriba. Además puede llevar oligonucleótidos capaces
de actuar como un par de cebadores para una reacción de
amplificación de ácido nucleico.
Concretamente, el kit incluye un par de sondas
de hibridación FRET, formado por un primer oligonucleótido portador
de una unidad donante de FRET y por un segundo oligonucleótido
portador de una unidad aceptora de FRET, de modo que dicho primer
oligonucleótido portador de la unidad donante fluorescente lleva, al
menos, una segunda unidad, que es un nitroindol capaz de inhibir la
emisión de fluorescencia de dicha unidad donante fluorescente.
Preferiblemente, los dos fragmentos que llevan la unidad donante de
FRET y la unidad inhibidora están muy cerca uno del otro. Por
ejemplo, estos dos fragmentos pueden ser contiguos. Más
preferiblemente, el mismo fragmento va marcado a la vez con la
unidad donante de fluorescencia y con la unidad inhibidora.
Como alternativa, el kit comprende una serie de
al menos 3 oligonucleótidos, que se caracteriza porque un primer
oligonucleótido y un segundo oligonucleótido son capaces de actuar
como un par de cebadores para una reacción de amplificación de
ácidos nucleicos dependiente de molde, y asimismo, porque dicho
primer oligonucleótido y dicho tercer oligonucleótido van marcados
respectivamente con un miembro correspondiente de un par FRET
formado por una unidad donante de FRET y una unidad aceptora de
FRET, en que el oligonucleótido portador de la unidad donante de
FRET lleva como mínimo una segunda unidad, que es un nitroindol
capaz de inhibir la emisión de fluorescencia por parte de dicha
unidad donante fluorescente. De nuevo, los dos fragmentos del primer
oligonucleótido, portador de la unidad donante de fluorescencia y de
la unidad inhibidora, se hallan preferentemente muy cerca uno del
otro. Por ejemplo, estos dos fragmentos pueden ser contiguos. Más
preferiblemente, el mismo fragmento está marcado a la vez con la
unidad donante de fluorescencia y con la unidad inhibidora.
Además, un kit según la presente invención puede
llevar al menos un componente adicional, como una polimerasa de
ácido nucleico, desoxinucleósido trifosfatos o compuestos
respectivamente análogos, y un tampón adecuado, que se puede emplear
para una reacción de amplificación de ácido nucleico dependiente de
molde, tal como la PCR. Asimismo, el kit puede incluir herramientas
de software, tales como discos compactos con programas de cálculo
para el análisis cuantitativo de los experimentos de cuantificación
absoluta o relativa de ácidos nucleicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se prepararon cebadores en un sintetizador ABI
394 a escala 1 \mumolar, usando fosforamiditas estándar
comercialmente asequibles (DMTr ibu G, DMTr bzA; DMTr bz C y DMTr T)
y el correspondiente soporte. Las sustancias químicas para la
síntesis estándar se obtuvieron de GlenResearch. La separación de
los oligonucleótidos del soporte sólido y la desprotección se llevó
a cabo con 33% de NH_{3} durante 8 h a 55ºC. La síntesis se
realizó en el modo tritilo. La purificación tuvo lugar en una
columna RP 18 Oligo R3 4,6 x 50 mm de Perseptive Biosystems. Tampón
A: acetato de trietilamonio 0,1 M en agua, pH 7,0/MeCN 95:5; tampón
B: MeCN. Gradiente: 3 min. 20% de B; 12 min. 12-40%
de B; caudal 1 ml/min.; detección a 260 nm. A continuación, la
solución concentrada de oligonucleótidos se trató durante 5 min. a
temperatura ambiente con ácido acético al 80%, a fin de eliminar el
grupo protector 5' DMTr. Luego los oligonucleótidos se desalaron con
una columna RP 18 y se liofilizaron en un evaporador tipo Speed
Vac.
Los oligonucleótidos se sintetizaron en la
escala 1 \mumolar. Las fosforamiditas estándar comercialmente
asequibles (DMTr ibu G, DMTr bzA; DMTr bz C y DMTr T) y las
sustancias químicas para la síntesis estándar se obtuvieron de la
GlenResearch. La 5' fluoresceína se introdujo empleando 5'
fluoresceína fosforamidita comercial de GlenResearch (nº de catálogo
10-1916-90). El nitroindol se
introdujo durante la síntesis, empleando 5' nitroindol fosforamidita
comercial de la GlenResearch (nº de catálogo
10-1044-90). Como soporte sólido se
usó 3' fosfato CPG de la GlenResearch (nº de catálogo
20-2900-01). La separación de los
oligonucleótidos del soporte sólido y la desprotección se llevó a
cabo con 33% de NH_{3} durante 8 h a 55ºC. La solución se evaporó
al vacío. El residuo se disolvió en agua doblemente destilada. El
oligonucleótido marcado se purificó por cromatografía de fase
inversa con una columna RP 18 Oligo R3 4,6 x 50 mm. Tampón A:
acetato de trietilamonio 0,1 M en agua, pH 7,0; tampón B: acetato de
trietilamonio 0,1 M en agua/MeCN 1:1. Gradiente: 2 min. con 0% de B
y en 45 min. hasta 100% de B (el gradiente se paró cuando el
producto comenzó a eluirse). El producto se eluyó aproximadamente a
50% de B, el caudal fue de 1 ml/min. y la detección a 260 nm. Se
recogieron las fracciones del pico del oligonucleótido marcado y el
disolvente se eliminó con una centrífuga de vacío. El residuo se
disolvió en agua doblemente destilada y se volvió a evaporar con
centrífuga de vacío. Este proceso se repitió tres veces. La
pastilla se disolvió en agua y se
liofilizó.
liofilizó.
Para preparar un oligonucleótido marcado en 3'
con LC Red 640, la síntesis se efectuó en la escala 1 \mumolar.
Las fosforamiditas estándar comercialmente asequibles (DMTr ibu G,
DMTr bzA; DMTr bz C y DMTr T) y las sustancias químicas para la
síntesis estándar se obtuvieron de la GlenResearch. Se introdujo un
grupo 3' amino, usando un modificador comercial 3' amino CPG (de
ChemGenes nº de catálogo NSS-0004A02CL) como soporte
sólido. La separación de los oligonucleótidos
amino-modificados del soporte sólido y la
desprotección se llevó a cabo con 33% de NH_{3} durante 8 h a
55ºC. La solución se evaporó al vacío. El marcado y la purificación
se realizó siguiendo el procedimiento descrito en el folleto del
envase del éster LC Red 640 NHS, comercialmente disponible (de Roche
Applied Science, nº de catálogo 2015161).
Se sintetizaron y purificaron oligonucleótidos
marcados con 3' fluoresceína según el procedimiento descrito en el
folleto del envase del LightCycler Fluorescein CPG, comercialmente
asequible (de Roche Applied Science, nº de catálogo 3138178). Se
sintetizaron y purificaron oligonucleótidos marcados con 5'
LightCycler Red 640, siguiendo el procedimiento descrito en el
folleto del envase del LightCycler Red 640 NHS Ester, comercialmente
asequible (de Roche Applied Science, nº de catálogo 2015161).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
PCR cuantitativa en tiempo real del factor V ADN
con y sin un donante de FRET inhibido por nitroindol.
Para amplificar un fragmento de ADN con factor V
se preparó la siguiente mezcla de reacción PCR de 20 \mul a tiempo
real:
- 10^{3} o 10^{8}
- copias de un plásmido que contiene el gen factor V (banco de genes, acceso nº M_014335)
- 3 mM
- de MgCl_{2}
- 500 nM
- respectivamente de cebadores según SEQ ID NO: 1 y 2
- 200 nM
- respectivamente de sondas de hibridación FRET según SEQ ID NO: 3 y 4
Componentes para la PCR del kit de sondas de
hibridación "LightCycler DNA Master" (Roche Applied Science, nº
de catálogo 2158825).
La sonda según SEQ ID NO: 3 se marcó en el
extremo 3' con LC-Red-640 (Roche
Applied Science) según el ejemplo 1. La sonda según SEQ ID NO: 4 se
marcó en el extremo 5' con fluoresceína, según el ejemplo 1, o bien
con fluoresceína y un fragmento de nitroindol, según el ejemplo
2.
La amplificación se llevó a acabo en un
instrumento LightCycler (Roche Applied Science), según el siguiente
programa de termociclado:
| T [ºC] | t [seg] | Rampa | Adquisición | Ciclos | |
| [ºC/seg] | |||||
| Desnaturalización | 95 | 30 | 20,0 | ninguna | 1 |
| Amplificación | 95 | 0 | 20,0 | ninguna | |
| 55 | 10 | 20,0 | una sola | 45 | |
| 72 | 10 | 20,0 | ninguna |
El control en tiempo real se realizó utilizando
el método umbral de la 2ª derivada sobre 45 ciclos, dividiendo los
valores de señal absoluta medidos en el canal aceptor de FRET por
los valores de señal absoluta medidos en el canal donante de FRET,
dando como resultado una normalización de la señal fluorescente
respecto p.ej. a los efectos de posicionamiento capilar.
El resultado está representado en la fig. 1.
Como se puede ver en la figura, para ambos números de copias del ADN
diana ensayado (fig. 1a: 10^{8} copias, fig. 1b: 10^{3} copias)
el uso de una sonda de hibridación donante de FRET portadora de un
fragmento de nitroindol como radical inhibidor dio una señal de
amplificación claramente
incrementada.
incrementada.
Después de la reacción descrita en el ejemplo 2,
las muestras se sometieron a un análiss de curvas de fusión según
las instrucciones del manual LightCycler (Roche Applied Sciences),
utilizando el siguiente programa de transición de temperaturas:
| T [ºC] | t [seg] | Rampa | Adquisición | Ciclos | |
| [ºC/seg] | |||||
| Curva de fusión | 95 | 0 | 20,0 | ninguna | |
| 45 | 60 | 20,0 | continua | 1 | |
| 75 | 10 | 0,1 | ninguna | ||
| Refrigeración | 40 | 30 | 20,0 | ninguna | 1 |
El control de fluorescencia se realizó
dividiendo los valores absolutos de la señal obtenidos en el canal 2
por los valores absolutos de la señal obtenidos en el canal 1 y
calculando luego la primera derivada.
El resultado está representado en la fig. 2.
Como se puede ver en la figura, para ambos números de copias del ADN
diana ensayado (fig. 2a: 10^{8} copias, fig. 2b: 10^{3} copias)
el uso de una sonda de hibridación donante de FRET portadora de un
grupo nitroindol como fragmento inhibidor dio picos de fusión
notablemente aumentados.
Para amplificar un Her4 ADNc se prepararon dos
mezclas independientes de reacción PCR a tiempo real, de 20 \mul,
tal como está descrito básicamente en el ejemplo 3, pero con las
siguientes variaciones:
- -
- En vez de Taq polimerasa se usó FastStart Taq polimerasa (Roche Applied Sciences, nº de catálogo 2 158 264).
- -
- Se amplificó ADNc codificador de Her4 (banco de genes, acceso nº L07868) obtenido por transcripción inversa de 20 ng de ARN total procedente de células HeLa.
- -
- 500 nM respectivamente de cebadores según SEQ ID NO: 5 y 6
- -
- 300 nM respectivamente de sondas de hibridación FRET según SEQ ID NO: 7 y 8 o, alternativamente,
- -
- 200 nM respectivamente de sondas de hibridación FRET según SEQ ID NO: 7 y 9
La sonda según SEQ ID NO: 7 se marcó en el
extremo 5' con LC-Red-640 (Roche
Applied Science). Las sondas según SEQ ID NO: 8 y 9 se diferencian
en que la correspondiente a SEQ ID NO: 8 representa una sonda de
hibridación tal como se conoce del estado técnico, que es
exactamente complementaria del ácido nucleico diana, mientras que la
correspondiente a SEQ ID NO: 9 representa una sonda de hibridación
conforme a la presente invención, con un fragmento G en el extremo
3' que no se hibrida con el ácido nucleico diana. Ambas sondas se
marcaron con fluoresceína en su extremo 3'.
La amplificación se llevó a cabo básicamente tal
como se describe en el ejemplo 3. El resultado está representado en
la fig. 3. La curva superior corresponde a la señal de control en
tiempo real, usando un par de sondas de hibridación FRET conforme a
la presente invención, de las cuales, la marcada con fluoresceína
llevaba una base G adicional en su extremo 3' según SEQ ID NO: 9. La
curva inferior corresponde a la señal de control en tiempo real,
empleando un par de sondas de hibridación FRET tal como se conoce
del estado técnico, y se caracteriza porque se usó una sonda marcada
con fluoresceína según SEQ ID NO: 8, que se aparea perfectamente con
el ácido nucleico diana. Se puede deducir que el aumento de
intensidad de la señal producido por el uso de una sonda donante de
FRET según SEQ ID NO: 9 se debe a las propiedades inhibidoras del
fragmento G adicionalmente introducido, respecto al compuesto con
fluoresceína.
Bernard, P. S., y otros, Anal
Biochem 255 (1998) 101-7
Kreuzer, K. A., y otros, Clin Chem
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0022-3654. CAN 124:261578 AN 1996:145280 CAPLUS
Patente WO 01/86001
Patente WO 97/46707
Patente WO 97/46712
Patente WO 97/46714
<110> Roche Diagnostics GmbH
\hskip1cmF. Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Sondas de hibridación fluorescentes
con menor ruido de fondo
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21329 EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patent Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagagacatc gcctctgggc ta
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttatcaca ctggtgctaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatacctgta ttcctcgcct gtc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggatctgc tcttacagat tagaagtagt cctatt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgaggttg tcatgggcaa c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtaacgaa actgattaag agccac
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtctgttc gagaagtcac aggctacg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcacaacc gggacctctc cttcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgagcacaac cgggacctct ccttcg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Par de sondas de hibridación FRET formado
por un primer oligonucleótido portador de una unidad donante de FRET
y por segundo oligonucleótido portador de una unidad aceptora de
FRET, caracterizado porque un oligonucleótido portador de la
primera unidad de FRET va marcado en su extremo 3' y el segundo
oligonucleótido va marcado en su fragmento 5', y porque dichos
fragmentos terminales forman pares de bases con fragmentos contiguos
del ácido nucleico diana o con fragmentos que solo están separados
por uno o dos radicales más,
de modo que el oligonucleótido portador de la
unidad donante fluorescente lleva como mínimo una segunda unidad,
que es un nitroindol capaz de inhibir la emisión de fluorescencia
por parte de dicha unidad donante fluorescen-
te.
te.
2. Par de sondas de hibridación FRET según la
reivindicación 1, en que el mismo fragmento nucleótido de dicho
primer oligonucleótido portador de la unidad donante fluorescente
lleva dicha segunda unidad, capaz de inhibir la emisión de
fluorescencia de dicha unidad donante fluorescente.
3. Serie de al menos 3 oligonucleótidos
caracterizada porque un primer oligonucleótido y un segundo
oligonucleótido son capaces de actuar como un par de cebadores en
una reacción de amplificación de ácido nucleico dependiente de
molde, y porque dicho primer oligonucleótido y un tercer
oligonucleótido van marcados respectivamente con un miembro
correspondiente de un par FRET, formado por una unidad donante de
FRET y por una unidad aceptora de FRET, y dicho primer
oligonucleótido va marcado internamente con dicho miembro
correspondiente de un par FRET, caracterizado porque dicho
primer y dicho tercer oligonucleótido son parcialmente
complementarios entre sí, de tal manera que los marcadores de dicho
primer y dicho tercer oligonucleótido están separados por ninguno,
por uno o por dos fragmentos,
en que el oligonucleótido portador de la unidad
donante de FRET lleva una segunda unidad, que es un nitroindol capaz
de inhibir la emisión de fluorescencia de dicha unidad donante
fluorescente.
4. Serie de 3 oligonucleótidos según la
reivindicación 3, en que el mismo fragmento nucleótido de dicho
primer oligonucleótido portador de la unidad donante de FRET lleva
dicha segunda unidad capaz de inhibir la emisión de fluorescencia de
dicha unidad donante fluorescente.
5. Composición que contiene una muestra de
ácido nucleico y un par de sondas de hibridación según la
reivindicación 1-2 o una serie de oligonucleótidos
según la reivindicación 4.
6. Kit que comprende un par de sondas de
hibridación según la reivindicación 1-2 o una serie
de oligonucleótidos según la reivindicación 3-4 y al
menos otro componente seleccionado de un grupo formado por cebadores
de amplificación de ácidos nucleicos, polimerasa de ácido nucleico
dependiente de molde, desoxinucleósido trifosfatos y un tampón para
una reacción de amplificación de ácido nucleico dependiente de
molde.
7. Método para detectar cualitativa o
cuantitativamente una secuencia de ácido nucleico en una muestra de
ácido nucleico que se hibrida con un par de sondas de hibridación
según la reivindicación 1-2.
8. Método según la reivindicación 7,
caracterizado porque una parte de dicho ácido nucleico
presente en
dicha muestra, que lleva una secuencia de ácido nucleico diana sustancialmente complementaria de la secuencia de dicha sonda de hibridación según la reivindicación 1 o 2, se amplifica mediante una reacción de amplificación de ácidos nucleicos dependiente de molde, preferiblemente mediante una reacción de polimerasa en cadena.
dicha muestra, que lleva una secuencia de ácido nucleico diana sustancialmente complementaria de la secuencia de dicha sonda de hibridación según la reivindicación 1 o 2, se amplifica mediante una reacción de amplificación de ácidos nucleicos dependiente de molde, preferiblemente mediante una reacción de polimerasa en cadena.
9. Método para detectar cualitativa o
cuantitativamente una secuencia de ácido nucleico en una muestra de
ácido nucleico que incluye una amplificación de ácidos nucleicos
dependiente de molde, usando un par de cebadores según dicho primer
y dicho segundo oligonucleótido de la reivindicación 3 o 4, y la
hibridación del producto amplificado con dicho tercer
oligonucleótido de la reivindicación 3 o 4.
10. Método según las reivindicaciones
8-9, en que la emisión de fluorescencia de la unidad
donante fluorescente o bien la emisión de fluorescencia de la unidad
aceptora fluorescente se controla en tiempo real.
11. Método según la reivindicación 10,
caracterizado porque la emisión de fluorescencia de dicha
unidad donante de FRET se controla en un primer canal detector y la
emisión de fluorescencia de dicha unidad aceptora de FRET se
controla en un segundo canal detector, y también porque la emisión
de fluorescencia de dicha unidad aceptora de FRET se normaliza por
la emisión de fluorescencia de dicha unidad donante de FRET.
12. Método para determinar el perfil de fusión
de un híbrido formado por un ácido nucleico diana y por un par de
sondas de hibridación FRET según la reivindicación
1-2, caracterizado porque la emisión de
fluorescencia se determina en función de la temperatura.
\newpage
13. Método según la reivindicación 12,
caracterizado porque la emisión de fluorescencia de la unidad
donante de FRET se controla en un primer canal detector y la emisión
de fluorescencia de la unidad aceptora de FRET se controla en un
segundo canal detector, y también porque la emisión de fluorescencia
de dicha unidad aceptora de FRET se normaliza por la emisión de
fluorescencia de dicha unidad donante de FRET.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| EP02016265 | 2002-07-23 | ||
| EP02016265 | 2002-07-23 |
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Family Applications (1)
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| DE (1) | DE60308454T2 (es) |
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