ES2305652T3 - Oligonucleotidos que contienen bastones moleculares. - Google Patents
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Abstract
Un método para la síntesis de un oligonucleótido que contiene un bastón molecular axial interno, siendo dicho bastón molecular una estructura rígida la cual no puede ser torcida en sí misma, el cual método comprende: - suministro de una partícula de vidrio de poro controlado - síntesis de dicho oligonucleótido por medio de la química de la fosforamidita, en donde dicho bastón molecular axial está incorporado en dicho oligonucleótido mediante el suministro de una fosforamidita que comprende un bastón molecular axial, en donde dicho oligonucleótido es una sonda TaqMan, un faro molecular o un miembro de un par de sondas de hibridación FRET.
Description
Oligonucleótidos que contienen bastones
moleculares.
La presente invención se refiere al campo de los
oligonucleótidos químicamente modificados. Más precisamente, la
presente invención se refiere al suministro de oligonucleótidos
químicamente modificados que pueden emplearse como sondas de
hibridación bien sea con la tecnología de la PCR a tiempo real, o
bien sea con la tecnología de matrices de ácidos nucleicos.
La amplificación del ADN mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica fundamental en
biología molecular. El análisis del ácido nucleico mediante la PCR
requiere la preparación de la muestra, la amplificación y el
análisis del producto. Aunque estos pasos se efectúan habitualmente
secuencialmente, la amplificación y el análisis pueden tener lugar
simultáneamente. Pueden añadirse colorantes que tiñen el ADN, ó
sondas fluorescentes, a la mezcla de la PCR antes de la
amplificación y pueden emplearse para analizar los productos de la
PCR durante la amplificación. El análisis de la muestra tiene lugar
al mismo tiempo que la amplificación en el mismo tubo dentro del
mismo aparato. Este método combinado disminuye la manipulación de
la muestra, ahorra tiempo y reduce en gran manera el riesgo de
contaminación del producto en las subsiguientes reacciones, dado
que no hay necesidad de retirar las muestras de sus recipientes
cerrados, para el análisis posterior. El concepto de la combinación
de la amplificación con el análisis del producto ha recibido el
nombre de "PCR a tiempo real". Véase por ejemplo, la patente
U.S. nº 6.174.670.
En la PCR a tiempo cinético real, la formación
de los productos de la PCR se monitoriza en cada ciclo de la PCR.
La amplificación se mide habitualmente en termocicladores que tienen
dispositivos adicionales para la medición de las señales de
fluorescencia durante la reacción de amplificación.
Formato del colorante que se une al ADN: Dado
que la cantidad de producto de amplificación de doble cadena excede
habitualmente la cantidad de ácido nucleico originalmente presente
en la muestra que se va a analizar, pueden emplearse colorantes que
tiñen específicamente el ADN de doble cadena, los cuales después de
la excitación con una longitud de onda apropiada muestran una
fluorescencia potenciada solamente si están unidos a un ADN de
doble cadena. De preferencia pueden emplearse solamente aquellos
colorantes que como el Verde Sybr II, por ejemplo, no afectan la
eficiencia de la reacción PCR.
Todos los otros formatos conocidos en la técnica
requieren el diseño de una sonda de hibridación marcada fluorescente
que emite fluorescencia solamente después de unirse a su ácido
nucleico diana.
Sondas TaqMan: Una sonda de hibridacióm
monocatenaria se marca con dos componentes. Cuando el primer
componente se excita con luz de una longitud de onda adecuada, la
energía absorbida se transfiere al segundo componente, el llamado
apagador, de acuerdo con el principio de transferencia de la energía
de resonancia fluorescente. Durante el paso de reasociación de la
reacción PCR, la sonda de hibridación se une al ADN diana y se
degrada mediante la actividad 5'-3' exonucleasa de
la Taq polimerasa durante la subsiguiente fase de prolongación.
Como resultado, el componente fluorescente excitado y el apagador
están espacialmente separados entre sí y así puede medirse una
emisión de fluorescencia del primer componente. Los ensayos con la
sonde TaqMan están descritos con detalle en las patentes US
5.210.015, US 5.538.848 y US 5.487.972. Las sondas de hibridación
TaqMan y las mezclas de reactivos están descritas en la patente US
5.804.375.
Faros moleculares: Estas sondas de hibridación
están también marcadas con un primer componente y con un apagador,
estando las marcas localizadas de preferencia en ambos extremos de
la sonda. Como resultado de la estructura secundaria de la sonda,
ambos componentes están espacialmente próximos cuando están en
solución. Después de la hibridación a los ácidos nucleicos diana,
ambos componentes están separados entre sí de tal forma que después
de la excitación con luz de una longitud de onda apropiada, puede
medirse la emisión de fluorescencia del primer componente (patente
US 5.118.801). Los faros moleculares pueden emplearse para el
análisis de la curva de fusión con el fin de identificar alelos
específicos o polimorfismo (ver más adelante).
Sondas de hibridación FRET: El formato de ensayo
de la sonda de hibridación FRET es especialmente de utilidad para
todas las clases de ensayos de hibridación homogénea (Matthews,
J.A., y Kricka, L.J., Analytical Biochemistry ("Bioquímica
Analítica") 169 (1988) 1:25. Está caracterizada por dos sondas de
híbridación monocatenarias que se emplean simultáneamente y son
complementarias a los sitios adyacentes de la misma cadena de ácido
nucleico diana amplificado. Ambas sondas están marcadas con
diferentes componentes fluorescentes. Cuando se excitan con luz de
una determinada longitud de onda, un primer componente transfiere la
energía absorbida al segundo componente de acuerdo con el principio
de la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, de
tal forma que la emisión de fluorescencia del segundo componente
puede medirse cuando ambas sondas de hibridación se unen a
posiciones adyacentes de la molécula diana que va a detectarse.
Cuando se reasocian a la secuencia diana, las
sondas de hibridación deben situarse muy cerca entre sí, en un
arreglo de la cabeza a la cola. Habitualmente, el hueco entre el
extremo 3' marcado de la primera sonda y el extremo 5' marcado de
la segunda sonda es el máximo pequeño posible, es decir, de 1 a 5
bases. Esto permite una estrecha proximidad del compuesto FRET
dador y el compuesto FRET receptor, que es típicamente de 10 a 100
Angstroms.
Alternativamente, para monitorizar el aumento de
la fluorescencia del componente FRET receptor, es también posible
monitorizar la disminución de la fluorescencia del componente FRET
dador, como una medida cuantitativa del transcurso de la
hibridación.
En particular, el formato de la sonda de
hibridación FRET puede ser empleado en la PCR en tiempo real, con
el fin de detectar el ADN diana amplificado. Entre todos los
formatos de detección conocidos en la técnica de la PCR en tiempo
real, el formato de la sonda de hibridación FRET se ha comprobado
que es altamente sensible, exacto y fiable (patentes WO 97/46707;
WO 97/46712; WO 97/46714). Todavía, el diseño de las secuencias
apropiadas de la sonda de hibridación FRET, puede limitarse algunas
veces debido a las especiales características de la secuencia del
ácido nucleico diana que hay que detectar.
Como una alternativa al empleo de las dos sondas
de hibridación FRET es posible también emplear un cebador marcado
fluorescentemente y solamente una sonda oligonucleótida marcada
(Bernard, P. S. et al., Analitical Biochemistry
("Bioquímica Analítica") 255 (1998) 101-107). A
este respecto, puede escogerse arbitrariamente si el cebador se
marca con el compuesto FRET dador o el compuesto FRET receptor.
Existen muchos distintos pares de colorantes
fluorescentes conocidos en la técnica que de acuerdo con la
invención son principalmente capaces de actuar juntos como un par
FRET dador/FRET receptor. Antes de la presente invención no se
había descrito ningún ejemplo funcional caracterizado porque se
habían empleado 4 diferentes pares FRET con éxito en un ensayo de
detección múltiple. Entre otras razones, esto puede ser debido a la
falta de instrumentación apropiada y, además, debido al hecho de
que la funcionalidad del proceso FRET de un par FRET específico está
interferido por otros compuestos fluorescentes que se hallan
presentes en la misma mezcla de reacción.
Además de la PCR y la PCR en tiempo real, se
emplean las sondas de hibridación FRET y los faros moleculares para
el análisis de la curva de fusión. En este tipo de análisis, el
ácido nucleico diana se amplifica primero en una reacción PCR
típica con cebadores de amplificación adecuados. Las sondas de
hibridación pueden estar ya presentes durante la reacción de
amplificación o pueden añadirse a continuación. Una vez terminada la
reacción PCR, la temperatura de la muestra se aumenta gradualmente
y la fluorescencia se detecta mientras la sonda de hibridación está
unida al ADN diana. A la temperatura de fusión las sondas de
hibridación se liberan de su diana y la señal fluorescente va
decreciendo inmediatamente al nivel original. Esta disminución se
monitoriza con una fluorescencia adecuada frente a una gráfica
temperatura-tiempo, de forma que puede determinarse
el valor de una primera derivada, al cual se observa el máximo
descenso de fluorescencia.
Sin embargo, en algunos casos y en función del
diseño de las sondas de hibridación FRET ó de las sondas de
hibridación tales como los faros moleculares, las primeras derivadas
de dichas gráficas temperatura-tiempo no tienen las
esperadas curvas en forma de campana sino que forman deformaciones
que no pueden ser explicadas mediante el análisis primario de las
secuencias. Los procesos fisicoquímicos que subyacen en el curso del
tiempo de la fusión de híbridos de ADN, en la actualidad no pueden
predecirse exactamente por ningún modelo matemático. Así, en la
práctica, el experto en la especialidad necesita diseñar y ensayar
varias sondas de hibridación similares o pares de sondas de
hibridación FRET con el fin de identificar y seleccionar un par
adecuado que pueda generar curvas de fusión que tengan más o menos
idealmente una curva en forma de campana.
Una posibilidad de soslayar este problema es la
introducción de emparejamientos artificiales como se ha descrito en
la patente WO 97/46711. Sin embargo, la introducción de
emparejamientos, solamente en algunos casos, da por resultado
curvas de fusión no idealmente formadas, especialmente en el caso de
análisis múltiplex empleando varias sondas de hibridación o varios
pares de sondas de hibridación FRET en el mismo recipiente de
reacción.
Así pues, existe en la técnica la necesidad de
proporcionar oligonucleótidos y especialmente sondas de hibridación
FRET con un comportamiento mejorado de la curva de fusión.
Este problema se soluciona proporcionando los
oligonucleótidos de acuerdo con la invención.
Más precisamente, la presente invención va
dirigida a los oligonucleótidos que comprenden un bastón molecular
axial interno, en donde dicho oligonucleótido es una sonda TaqMan,
un faro molecular o un miembro de un par de sondas de hibridación
FRET.
También se describe que el bastón molecular
conecta una primera parte y una segunda parte de una cadena de un
oligonucleótido, caracterizada porque el bastón molecular conecta
covalentemente el extremo 3' de un primer radical nucleótido,
siendo dicho radical el extremo terminal 3' de dicha primera parte
de dicha cadena con el extremo 5' de un segundo radical nucleótido,
siendo dicho segundo radical nucleótido el terminal 5' de dicha
segunda parte de dicha cadena.
Además, se describe que el bastón molecular está
covalentemente conectado a la posición 5' del radical terminal 5' ó
a la posición 3' del radical terminal 3'. De preferencia, el bastón
molecular se conecta al extremo 5' ó 3' del oligonucleótido
mediante un grupo fosfato.
En otro aspecto, la presente invención va
dirigida a una composición que comprende un oligonucleótido como se
ha descrito más arriba.
En un tercer aspecto, la presente invención va
dirigida a un kit que comprende un oligonucleótido como se ha
descrito más arriba.
En otro aspecto, la presente invención va
dirigida a una fosforamidita que comprende un bastón molecular.
Un oligonucleótido que contiene un bastón
molecular puede por ejemplo emplearse como un cebador para una
reacción de extensión de un cebador o un cebador para una reacción
de amplificación de un ácido nucleico.
Un oligonucleótido que contiene un bastón
molecular de acuerdo con la invención, puede emplearse como una
sonda de hibridación. En una versión específica, empleando una sonda
de hibridación de acuerdo con la invención, se monitoriza la
dependencia a la temperatura de la hibridación, por ejemplo
realizando un análisis de la curva de fusión.
Un oligonucleótido que contiene un bastón
molecular puede también ser inmovilizado sobre un soporte sólido.
De preferencia, es el bastón molecular el que conecta la cadena de
los radicales de nucleótido al soporte sólido.
La presente invención va dirigida a aquellos
oligonucleótidos que contienen un bastón molecular axial interno,
en donde dicho oligonucleótido es una sonda Taqman, un faro
molecular o un miembro de un par de sondas de hibridación FRET. Una
detallada revisión sobre los bastones moleculares viene dada por
Schwab et al., en Chem. Rev. 99 (1999)
1863-1933.
En el contexto de la presente invención, los
bastones moleculares axiales pueden definirse como eslabones que
conectan dos moléculas (p. ej. dos partes de un oligonucleótido) de
tal forma que las posiciones relativas de cada uno de los átomos de
carbono que contribuyen a la estructura interna del bastón quedan
fijas entre sí. En otras palabras: un bastón molecular es una
estructura rígida que por si misma no puede ser unida. Como
consecuencia, la distancia entre los átomos de dos moléculas que
están covalentemente unidas a la estructura del bastón es fija y no
puede ser alterada.
Dentro del ámbito de la presente invención,
puede emplearse cualquier tipo de bastón molecular que sea
compatible con los protocolos de síntesis de oligonucleótidos. De
preferencia, los bastones empleados para la síntesis de
oligonucleótidos de acuerdo con la invención son estructuras
químicas simples pequeñas que están compuestas de solamente unos
pocos átomos de carbono. Se prefieren también aquellos tipos de
bastones moleculares que pueden sintetizarse de forma muy económica
y fácilmente por métodos convencionales de química orgánica
partiendo de compuestos básicos que de preferencia sean
comercialmente adquiribles.
En una versión preferida, el bastón es un único
bastón molecular engarzado axialmente. Por definición, los bastones
moleculares individuales engarzados axialmente están unidos mediante
un enlace covalente único a cada una de las dos moléculas
conectadas por el bastón. Por ejemplo, el bastón molecular está
compuesto simplemente de dos átomos de carbono unidos por un
etileno. Otros ejemplos de bastones moleculares engarzados
individualmente, que no limitan el ámbito de la presente
invención, son el biciclopentano, biciclooctano, cubano, benceno,
naftaleno, antraceno, pireno, piridina, o porfirina. Las moléculas y
especialmente los oligonucleótidos engarzados por un bastón
molecular axial individualmente conectados pueden ser relativamente
rotados entre sí, aunque la distancia entre los átomos de las dos
moléculas que están covalentemente unidas a la estructura del bastón
permanece fija.
En una versión altamente preferida, el bastón
molecular axial unido individualmente, comprende o consta de, o
bien un grupo etileno, o bien alternativamente, un grupo
fenileno.
En otra versión altamente preferida, el bastón
molecular axial unido individualmente, comprende o consta de una
estructura molecular como sigue:
En una versión alternativa, el bastón es un
bastón molecular axial unido doblemente. Por definición, los
bastones moleculares axiales unidos doblemente están engarzados
mediante dos enlaces covalentes a cada una de las dos moléculas
conectadas mediante el bastón. Ejemplos de bastones moleculares
axiales doblemente unidos, son el eteneno, ciclobutano, ciclohexano
y ciclohexadieno. Las moléculas y especialmente los oligonucleótidos
unidos mediante un bastón molecular axial doblemente conectado no
pueden rotarse relativamente uno contra al otro, además del hecho
de que la distancia entre los átomos de las dos moléculas que están
covalentemente unidas a la estructura del bastón permanece
fija.
Figura también dentro del ámbito de la presente
invención, si el bastón molecular axial de un oligonucleótido está
compuesto de varios módulos tales como el polietileno, e.c. Por lo
tanto, en función del número de módulos que se emplean, la longitud
del bastón molecular axial puede ajustarse de conformidad a lo
requerido.
La síntesis de oligonucleótidos que contienen
bastones moleculares puede ser realizada de acuerdo con la química
convencional de síntesis de oligonucleótidos.
También se describe que el bastón molecular está
covalentemente unido a la posición 3'-OH del radical
terminal 3' ó en la posición 3' del radical terminal 3'. Para este
bastón molecular axial puede introducirse en el extremo 3' de un
oligonucleótido químicamente sintetizado empleando un CPG (cristal
de poro controlado) apropiado, el cual comprende un espaciador
trifuncional. Esto puede hacerse aplicando un CPG que ya lleva un
bastón molecular análogo a los compuestos, y en los métodos
descritos en la patente US 5.290.925.
Otra posibilidad es que el bastón molecular se
una covalentemente a la posición 5' del radical terminal 5'. Para
esto puede unirse un bastón molecular axial a la naciente cadena de
oligonucleótidos empleando una fosforamidita apropiada.
Opcionalmente, puede introducirse un grupo amino en el extremo libre
del bastón, el cual puede servir como base para subsiguientes
estrategias convencionales después del marcado.
El método de la química de la fosforamidita es
ya bien conocido por cualquier persona experta en la técnica. Un
grupo fosforoso 3' de un nucleósido reacciona con el grupo
5'-hidroxilo de otro nucleósido. La reacción tiene
lugar del 3' al 5' entre cada fosforamidita con un monómero
protegido con 5'-dimetoxitritilo suministrado en
solución y el crecimiento del oligonucleótido reactivo en 3' unido a
un substrato inerte. En comparación con otros métodos, los
rendimientos de copulación inherentes son típicamente del orden de
98 \pm 0,5%, dando por resultado unos aductos que se purifican
fácilmente. Un importante factor que asegura una síntesis de alto
rendimiento es el paso de encasquetado - la acetilación de bases no
copuladas en el grupo 5'-hidroxilo. La mezcla de
reacción en bruto recogida al final de cada síntesis, consta del
aducto deseado, juntamente con pequeñas cantidades de productos
secundarios. Este margen de secuencias de deleción oscila en tamaño,
desde una base hasta n-1 bases - en donde n es el
número de bases en el producto deseado. Las secuencias de deleción,
las cuales se han formado debido a las copulaciones falladas, deben
ser químicamente encasquetadas antes de las subsiguientes adiciones
de bases. De otra manera, estas secuencias que faltan competirían
con el aducto de longitud completa de las fosforamiditas. También,
la separación del (n-1)-mero del
producto deseado es mucho más estimulante que la separación de
otras secuencias truncadas de corta longitud.
Los oligonucleótidos nacientes tienen las
posiciones 5'-hidroxilo protegidas por grupos
dimetoxitritilo (DMT), los cuales han de ser eliminados después de
cada ciclo de síntesis con el fin de generar un grupo 5' OH
reactivo de la cadena naciente de oligonucleótidos. Para producir
los nucleótidos, el grupo DMT puede eliminarse durante la síntesis
(TRITYL OFF) ("síntesis sin el tritilo") o puede dejarse
(TRITYL ON) ("síntesis con el tritilo") si la HPLC de fase
inversa es el método de purificación elegido. Se crea un grupo
3'-hidroxilo cuando el oligonucleótido sintetizado
se escinde del soporte, por lo cual no es necesaria ninguna
desprotección más.
Los inventores de la presente invención
descubrieron sorprendentemente que las sondas de hibridación que
tienen un bastón molecular interno poseen un comportamiento
alterable y más predecible en los experimentos de análisis de la
curva de fusión. Por lo tanto, en una importante versión de la
presente invención, el bastón molecular conecta una primera parte y
una segunda parte de una cadena de oligonucleótidos, en donde dicho
oligonucleótido es una sonda Taqman, un faro molecular o un miembro
de un par de sondas de hibridación FRET, caracterizado porque el
bastón molecular conecta covalentemente el extremo 3' de un primer
radical nucleótido, siendo dicho radical el radical terminal 3' de
dicha primera parte de dicha cadena, con el extremo 5' de un segundo
radical nucleótido, siendo dicho segundo radical nucleótido el
terminal 5' de dicha segunda parte de dicha cadena.
Existe una fácil posibilidad de generar
oligonucleótidos que tienen un bastón molecular axial interno. Una
fosforamidita apropiada que contiene un bastón molecular axial puede
ser introducida llevando un grupo hidroxilo apropiadamente
protegido, el cual durante el siguiente ciclo de síntesis puede ser
desprotegido de manera que puede reaccionar con otro
desoxinucleótido-fosforamidita.
Un ejemplo para la síntesis de un fenileno
fosforamidita viene dado en la figura 1 y el ejemplo 1. Otros
bastones moleculares fosforamiditas pueden sintetizarse
correspondientemente, partiendo de estructuras de bastón que tienen
por ejemplo dos grupos hidroxilo como grupos reactivos.
En otra versión, varios bastones llevando
fosforamiditas pueden copularse a la cadena de nucleótidos nacientes
uno después de otro con el fin de generar un oligonucleótido que
tiene un bastón interno de longitud apropiada.
En otro aspecto, la presente invención se dirige
a composiciones que contienen por lo menos un oligonucleótido con
bastones moleculares axiales internos como se ha descrito más
arriba.
Todavía en otro aspecto, la presente invención
se refiere a un kit que comprende un oligonucleótido como se ha
descrito más arriba.
En general, los oligonucleótidos que contienen
bastones moleculares axiales pueden emplearse para una variedad de
aplicaciones, por ejemplo, como cebador para un reacción de
extensión de cebadores, como cebador para una reacción de
amplificación de un ácido nucleico, o como una sonda de
hibridación.
Los bastones moleculares axiales pueden servir
como engarces de oligonucleótidos marcados entre la cadena de
oligonucleótidos y la entidad marcadora. Como consecuencia, la
estructura rígida del bastón da como resultado la prevención de una
parcial vecindad entre la entidad marcadora y la cadena de
oligonucleótido. En caso de que la marca sea una entidad
fluorescente, dicha evitación es altamente ventajosa, dado que el
indeseado efecto de extinción debido a una incontrolable
interacción entre los radicales G y la entidad fluorescente no es
posible.
En otra versión importante, los oligonucleótidos
que contienen bastones moleculares axiales internos de acuerdo con
la invención, se emplean como sondas de hibridación. Los bastones
moleculares axiales son parte integral de sondas de hibridación
tales como p. ej. sondas TaqMan, faros moleculares o pueden ser
parte integral de uno o ambos miembros de un par de sondas de
hibridación FRET. Dichas sondas de hibridación de acuerdo con la
invención, pueden emplearse para la hibridación en blots, placas de
microtitulación, micromatrices, y en particular para PCR a tiempo
real.
En una versión específica, empleando una sonda
de hibridación o un par de sondas de hibridación FRET de acuerdo
con la invención, se monitoriza la dependencia a la temperatura de
la hibridación, por ejemplo, por medio de la realización del
análisis de la curva de fusión.
El análisis de la curva de fusión de la PCR a
tiempo real, se efectúa habitualmente una vez completada la
reacción PCR. Después de un paso inicial de desnaturalización y
enfriamiento, la temperatura del amplicón se aumenta gradualmente,
y la fluorescencia es detectable en tanto la sonda de hibridación
está unida al ADN diana. En el caso del formato de la sonda de
hibridación FRET, ambas sondas necesitan permanecer hibridadas al
ácido nucleico diana con el fin de generar una señal fluorescente. A
la temperatura de fusión, las sondas de hibridación (en el caso de
formato FRET: por lo menos un miembro de dicho par de sondas de
hibridación), se liberan a partir de su diana y la señal de
fluorescencia va disminuyendo inmediatamente hasta el nivel
original.
Esta disminución se monitoriza mediante una
gráfica de la fluorescencia frente a la
temperatura-tiempo, de manera que puede
determinarse el valor de la primera derivada, a la cual se observa
la máxima disminución de la fluorescencia. Como se demostrará en el
ejemplo de más adelante, los oligonucleótidos que contienen
bastones moleculares axiales internos de acuerdo con la invención,
serán altamente ventajosos para esta versión particular.
Debido a la naturaleza rígida del bastón
molecular axial, las características de fusión de un oligonucleótido
pueden alterarse substancialmente y así ajustarse a las condiciones
requeridas.
En primer lugar, la introducción de un bastón
molecular interno puede dar como resultado un moderado
desplazaniento de la temperatura de fusión ^{TM} del
oligonucleótido, el cual consiste habitualmente en un moderado
descenso de la temperatura. Dicho descenso puede ser ventajoso
especialmente para métodos de curva de fusión multiplex en donde
tienen que analizarse múltiples Tm y discriminarse entre sí.
En segundo lugar, la introducción de un bastón
molecular interno da como resultado un aumento en la diferencia de
las temperaturas de fusión, detectable cuando se comparan las
hibridaciones con y sin emparejamientos de pares de bases. Por lo
tanto, los oligonucleótidos de acuerdo con la invención, mejoran
significativamente la discriminación alélica y el análisis del
polimorfismo de nucleótidos individuales en PCR a tiempo real así
como también en versiones empleando soportes sólidos.
En tercer lugar, la introducción de un bastón
molecular interno en todos los casos investigados hasta la fecha,
da como resultado unos puntos de fusión puntiagudos, delgados y
óptimamente bien formados, cuando se obtiene la primera derivada de
la gráfica de la temperatura frente al tiempo. Esto podría
explicarse por la naturaleza rígida de los bastones moleculares
axiales, lo cual da por resultado una situación en donde la
respectiva sonda de hibridación está todavía o bien completamente
hibridada al ADN diana, o bien está completamente libre en su forma
monocatenaria en la solución de reacción. En otras palabras: se
evitan parcialmente los intermediarios de la hibridación que dan
como resultado, curvas de fusión con deformaciones.
En cuarto lugar, el empleo de sondas que
contienen bastones moleculares axiales internos da como resultado
en muchos casos, un aumento de la especificidad del ensayo.
Los oligonucleótidos que contienen un bastón
molecular axial pueden también inmovilizarse sobre un soporte
sólido, por ejemplo, una micromatriz de ácidos nucleicos. De
preferencia es el bastón molecular el que conecta la cadena de
radicales nucleótidos al soporte sólido. Esta aplicación es
altamente ventajosa debido a que la rígida estructura de los
bastones conduce a una separación espacial limitada, definida y
controlable entre el propio oligonucleótido y el soporte sólido.
Como consecuencia, se evita un presumible obstáculo estérico de la
hibridación al oligonucleótido inmovilizado, causado por la vecindad
al soporte sólido.
Dado que para aplicaciones de matrices de ácidos
nucleicos es particularmente importante conseguir una discriminación
emparejado/desemparejado óptima, la introducción de un bastón
molecular interno de acuerdo con la invención, es altamente
ventajosa, debido a que da como resultado un aumento de la
diferencia de temperaturas de fusión, detectable cuando se comparan
las hibridaciones con y sin los desemparejamientos de los pares de
bases.
El modo de copulación apropiado del bastón
molecular sobre el soporte sólido depende del tipo de soporte sólido
que se empleará realmente. Por ejemplo, los grupos amino del bastón
pueden reaccionar con grupos epoxi sobre la superficie como por
ejemplo, de vidrio o plástico. Alternativamente, pueden copularse
bastones alcoxisilanados a superficies de vidrio. Para superficies
que llevan grupos C-OH, la unión puede obtenerse
empleando la química convencional de la fosforamidita.
Con el fin de controlar la densidad de los
oligonucleótidos inmovilizados mediante síntesis in situ
sobre soporte sólido, el soporte sólido se hace reaccionar en un
primer paso con una solución mezcla de bastones moleculares axiales
extensibles mediante síntesis de oligonucleótidos y bastones
moleculares axiales no extensibles. La densidad puede ajustarse a
continuación rectificando la concentración de los compuestos de
bastones no extensibles.
La figura representa la estrategia de síntesis
para la generación de una fosforamidita que comprende un bastón
molecular, el cual de acuerdo con la invención puede ser incorporado
internamente en un oligonucleótido mediante la química convencional
de síntesis de oligonucleótidos. Los detalles están descritos en el
ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó 1 ng de protrombina homocigótica
tipo salvaje, ADN de plásmido mutante heterocigótico y homocigótico.
La sonda de hibridación que se extendía sobre el sitio de la
mutación (sonda de mutación) tenía el 100% de homología al ADN del
plásmido tipo salvaje homocigótico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó 1 ng de protrombina homocigótica
tipo salvaje, ADN de plásmido mutante heterocigótico y homocigótico.
La sonda de hibridación que se extendía sobre el sitio de la
mutación (sonda de mutación) llevaba un desemparejamiento
artificial.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó 1 ng de protrombina homocigótica
tipo salvaje, ADN de plásmido mutante heterocigótico y homocigótico.
La sonda de hibridación que se extendía sobre el sitio de la
mutación (sonda de mutación) llevaba un engarce fenileno
insertado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó 1 ng del ADN de plásmido mutante
homocigótico de protrombina. Se ensayaron tres diferentes sondas de
mutación: una con el 100% de homología al ADN del plásmido tipo
salvaje homocigótico, una con un desemparejamiento artificial y una
con un engarce de fenileno insertado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificaron 10^{4} copias del ADN del
plásmido EBV. La sonda de hibridación marcada con LC rojo 640, la
cual determinó la T_{M}, mostró un 100% de homología con el ADN
del plásmido EBV.
Se amplificaron 10^{4} copias del ADN del
plásmido EBV. La sonda de hibridación marcada con LC rojo 640, la
cual determinó la T_{M}, llevaba un fenileno insertado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos, referencias, listados
de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a la comprensión
de la presente invención, cuyo verdadero ámbito está descrito en
las reivindicaciones del apéndice.
\vskip1.000000\baselineskip
Como ejemplo para la síntesis de un
oligonucleótido de acuerdo con la invención, se sintetizó un
oligonucleótido de acuerdo con la invención llevando un bastón
interno, de acuerdo con la estrategia representada en la figura 1
como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
En el espacio de 1 hora, se añadió gota a gota
una solución de 51,5 g de cloruro de dimetoxitritilo en 300 ml de
piridina anhidra, a temperatura ambiente, a una solución de 20 g de
1,4 bishidroximetilbenceno en 100 ml de piridina anhidra. Después
de agitar durante toda la noche, se evaporó el disolvente empleando
un evaporador rotatorio. El residuo se disolvió en 800 ml de éster
etílico del ácido acético y se lavó una vez con 400 ml y a
continuación dos veces con 200 ml de agua. La fase orgánica se
separó y se secó con sulfato de sodio. Después de la filtración se
eliminó el disolvente empleando un evaporador rotativo.
La purificación se efectuó mediante una columna
cromatográfica sobre silica gel. Por lo tanto se disolvieron 10
gramos del producto en bruto en una mezcla tolueno/éster etílico del
ácido acético/metanol 4:1:1 conteniendo 0,1% de trietilamina. La
solución se aplicó sobre una columna de 40 cm / d = 6,9 cm, rellena
con silica gel 60 (0,063 - 0,200 mm). El producto se eluyó con la
mezcla tolueno / éster etílico del ácido acético / metanol 4:1:1
conteniendo 0,1% de trietilamina.
TLC: mezcla tolueno / éster etílico del ácido
acético / metanol 4:1:1 conteniendo 0,1% de trietilamina, Rf:
0,56
\vskip1.000000\baselineskip
A temperatura ambiente y en atmósfera de argón,
se añadieron 0,78 gramos de tetrazolido de diisopropilamonio a una
solución de 2 gramos de
1-(O-dimetoxitritil-hidroximetil)
4-hidroximetilbenceno en 15 ml de cloruro de
metileno anhidro. Una solución de 1,37 g de
2-cianoetil-tetra
isopropil-fosfordiamidita en 10 ml de cloruro de
metileno anhidro, se añadió gota a gota en el intervalo de 30
minutos. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas
se filtró la suspensión. Se eliminó el disolvente del filtrado
empleando un evaporador rotativo. El residuo se disolvió en 50 ml
de éster etílico del ácido acético y se lavó dos veces con 10 ml de
solución acuosa al 5% de bicarbonato de sodio. La fase orgánica se
separó y se secó con sulfato de sodio. Después de la filtración se
eliminó el disolvente empleando un evaporador rotativo.
La purificación se efectuó en una columna
cromatográfica sobre silica gel. Por lo tanto, el producto en bruto
se disolvió en una mezcla de éster etílico del ácido acético /
hexano 1 : 1 conteniendo un 0,1% de trietilamina. La solución se
aplicó sobre una columna cromatográfica con l = 32 cm / d = 4,5 cm,
rellena de silica gel 60 (0,063 - 0,200 mm). El producto se eluyó
con una mezcla de éster etílico del ácido acético / hexano 1 : 1
conteniendo un 0,1% de trietilamina.
TLC: Mezcla de éster etílico del ácido acético /
hexano conteniendo un 0,1% de trietilamina. Rf: 0,80.
RMN H^{1}(300 MHz): 1,21 t [12H], 2,76
t[2H], 3,7 m[2H], 3,78 s[6H], 3,88
m[2H], 4,16 s[2H], 4,75 m[2H], 6,91
d[4]7,23-7,67 m,s [13] RMN
P^{31}(300 MHz): 149,19.
El fosforamidato resultante se incorporó a los
oligonucleótidos de la síntesis convencional de oligonucleótidos
empleando la química del fosforamidato. El bastón molecular del
oligonucleótido sintetizado más arriba se abrevia con el nombre de
"engarce de fenileno" en los ejemplos que siguen.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar la validez de la invención, se
escogió la formación de los genotipos de la mutación del punto de
protrombina (G2021OA) empleando las sondas de hibridación como
sistema de ensayo.
Se clonaron fragmentos parciales de tipo salvaje
y la secuencia mutante de protrombina en vectores separados del
plásmido pCR^{TM} 2,1 (Invitrogen). La concentración del ADN del
plásmido se determinó mediante espectrofotometría. Se prepararon
diluciones del ADN del plásmido de protombrina y mezclas del tipo
salvaje y el plásmido mutante para obtener un ADN heterocigótico,
empleando un diluyente consistente en MS2 ARN (10 ng/\mul) en 10
mM de Tris-HCl, pH 8,3.
La PCR se efectuó sobre un aparato LightCycler
(Roche Molecular Biochemicals). Un ensayo típico de PCR consta de
2 \mul de ADN, 1 x mezcla de detección, 1 x tampón de reacción, 4
mM de cloruro de magnesio y 1,6 unidades de Taq polimerasa (todo de
Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), completando con agua hasta
un volumen de 20 \mul en una reacción capilar.
Para un análisis de mutación, se empleó el
tampón de reacción y el Taq polimerasa sin modificar del LightCycler
- kit master de sondas de hibridación de ADN (Roche Molecular
Biochemical, nº de catálogo 2 015 102).
Las mezclas 10 x de detección para la
protrombina estaban formadas por 5 \muM de cada cebador (delantero
e inverso), 2 \muM de sonda de mutación (marcada con
fluoresceína), 4 \muM de sonda de anclaje (marcada con LC rojo
640), 0,05% de Brij-35 en 10 mM de tampón
Tris-HCl, pH 8,3.
Se emplearon las siguientes secuencias del
cebador y sonda de hibridación:
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador delantero de protrombina:
- 5'CCAATCCCGTGAAAGAATTAT-3'
- (Seq. Id. No: 1)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso de protrombina:
- 5'-AGGTGGTGGATTCTTAAGTC-3'
- (Seq. Id. No: 2)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda de protrombina 1:
- 5'-LCRed640-CACTTTTATTGGGAACCATAGTTTTAGAAACACAA-fosfato-3'
- (Seq. Id. No: 3)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda de protrombina 2:
- 5'-GCATTGAGGCTCGCTGAGAG-fluoresceína-3'
- (Seq. Id. No: 4)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda de protrombina 3:
- 5'-GCATTGTGGCTCGCTGAGAG-fluoresceína-3'
- (Seq. Id. No: 5)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda de protrombina 4:
- 5'- GCATTGxGGCTCGCTGAGAG-fluoresceína-3'
- (Seq. Id. No: 6)
x = engarce de fenileno
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones regulares del ciclado de la PCR
consistieron en una incubación inicial a 95ºC durante 30 segundos
seguido de 45 ciclos de 95ºC durante 0 segundos, 55ºC durante 10
segundos y 72ºC durante 5 segundos, finalizando con 40ºC durante 30
segundos.
Las temperaturas de fusión de cada reacción se
determinaron mediante el programa del análisis Light Cycler
empleando el método de cálculo polinómico mediante substracción del
valor de fondo original.
\vskip1.000000\baselineskip
Se efectuó la PCR a tiempo real de 1 ng del ADN
de protrombina de tipo salvaje heterocigótico y mutante en un
ajuste de acuerdo con el ejemplo 1. Los resultados están mostrados
en la figura 2. Como puede verse, después de realizar un análisis
de la curva de fusión con una sonda de mutación de emparejamiento
perfecto, no es posible determinar el genotipo de protrombina
exactamente, puesto que el tipo salvaje homocigótico y el genotipo
heterocigótico no pueden diferenciarse exactamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se efectuó la PCR a tiempo real de 1 ng del ADN
de protrombina de tipo salvaje heterocigótico y mutante en un
ajuste de acuerdo con el ejemplo 1. Los resultados están mostrados
en la figura 3. Como puede verse, la correcta determinación del
genotipo de protrombina es principalmente posible empleando la sonda
de mutación con un emparejamiento artificial, pero el pico de
fusión del tipo salvaje es todavía muy ancho y muestra unas
deformaciones bien visibles. Adicionalmente, el mínimo entre los dos
picos de fusión de las muestras heterocigóticas tienen un alto
nivel de la señal, de manera que no hay una gran diferencia entre el
mínimo entre los picos y el máximo del pico de fusión del tipo
salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Se efectuó la PCR a tiempo real de 1 ng del ADN
de protrombina de tipo salvaje heterocigótico y mutante en un
ajuste de acuerdo con el ejemplo 1. Los resultados están mostrados
en la figura 4. Como puede verse, el genotipo de protrombina puede
determinarse perfectamente empleando la sonda de mutación con un
engarce de fenileno insertado. Todos los picos de fusión son muy
puntiagudos y sin deformaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se efectuó la PCR a tiempo real de 1 ng del ADN
de protrombina mutante en un ajuste de acuerdo con el ejemplo 1.
Los resultados están mostrados en la figura 5. Como puede verse, la
temperatura de fusión del pico de fusión de la mutación de
protrombina se desvía en función de la sonda de mutación empleada.
La tabla que sigue a continuación muestra las diferentes
temperaturas de fusión.
Para demostrar la validez de la invención, se
escogió el virus Epstein-Barr, designado
habitualmente como EBV, un miembro de la familia de los herpes
virus y uno de los virus humanos más comunes, como segundo sistema
de ensayo.
Se clonó un fragmento parcial de EBV en el
vector plásmido pT3T7 (Roche Molecular Biochemicals). Los números
de copias del ADN del plásmido se determinaron mediante
espectrofotometría aceptando que 1 mol es equivalente a 6 x 1023
copias. Se prepararon diluciones del ADN del plásmido EBV empleando
un diluyente consistente en MS2 ARN (10 ng/\mul) en 10 mM de
Tris-HCl, pH 8,3.
Se efectuó la PCR con un instrumento LightCycler
(Rocher Molecular Biochemicals). Un ensayo típico de PCR constaba
de 5 \mul de ADN, 1 x mezcla de detección 1 x de tampón de
reacción, 3,5 mM de cloruro de magnesio y 1,6 unidades de Taq
polimerasa modificada (todos de Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania), completando con agua hasta un volumen de 20 \mul en
una reacción de capilaridad.
Para la PCR, se emplearon el tampón de reacción
y la Taq polimerasa modificada del kit master de sondas de
hibridación Fast Start ADN del LightCycler (Roche Molecular
Biochemical, nº de catálogo 3003 248).
Las mezclas de detección 10 x para el EBV
constaron de 5 \muM de cada cebador (delantero e inverso), 2
\muM de cada una de las sondas de hibridación (marcadas con
fluoresceína y LC rojo 640)), 0,05% de Brij-35 en
10 mM de tampón de Tris-HCl, pH 8,3.
Se emplearon las siguientes secuencias del
cebador y las sondas de hibridación:
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador delantero del EBV:
- 5'-ATGAGGAACGTGAATCTAATGA-3'
- (Seq. Id. No: 7)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso del EBV:
- 5'-TACAGATAGATGGCACTCTTACCTT-3'
- (Seq. Id. No: 8)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda EBV 1:
- 5'-GGGATTGCAACACGACGGGAATGACG-fluoresceína-3'
- (Seq. Id. No: 9)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda EBV 2:
- 5'-LCRed640-GCTCCCTCCCCCTCCCTACTCTC-fosfato-3'
- (Seq. Id. No: 10)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda EBV 3:
- 5'-LCRed640-GCTCCCTCCCCCTCxCTACTCTC-fosfato-3'
- (Seq. Id. No: 11)
x = engarce de fenileno
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones regulares para la ciclación de
la PCR consistieron en una incubación inicial a 95ºC durante 10
minutos seguido de 45 ciclos a 95ºC durante 10 segundos, a 55ºC
durante 15 segundos y a 72ºC durante 15 segundos finalizando con
40ºC durante 30 segundos.
Las temperaturas de fusión para cada reacción,
se determinaron mediante el programa de análisis LightCycler
empleando un método de cálculo polinómico con substracción del valor
del fondo original.
\newpage
Se efectuó una PCR a tiempo real de 10^{4}
copias de EBV en un ajuste de acuerdo con el ejemplo 6. Los
resultados están mostrados en la figura 6. Como puede verse, la
realización de un análisis de una curva de fusión con sondas de
hibridación con un emparejamiento perfecto, generó un pico doble y
no un pico de fusión único, como se esperaba.
\vskip1.000000\baselineskip
Se efectuaron 10^{4} copias de EBV con una PCR
a tiempo real, en un ajuste de acuerdo con el ejemplo 6. Los
resultados se muestran en la figura 6. Como puede verse, si la sonda
de hibridación, la cual determina la T_{M}, lleva insertado un
engarce de fenileno, se genera el pico de fusión sencillo esperado,
después de realizar el análisis de la curva de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Bernard, P. S., et al.,
Analytical Biochemistry 255 (1998)
101-107
Matthews, J.A., and Kricka, L.J.,
Analytical Biochemistry 169 (1988)
1-25
Schwab et al., In Chem.
Rev. 99 (1999) 1863-1938
US 5,118,801
US 5,141,837
US 5,210,015
US 5,290,925
US 5,487,972
US 5,538,848
US 5,804,375
US 6,174,670
WO 97/45707
WO 97/46711
WO 97/46712
WO 97/46714
<110> Roche Diagnostics GmbH
\hskip1.05cmF. Hoffmann-La
Roche AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Oligonucleótidos que contienen
bastones moleculares
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 22320 EP1
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 03027753
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-12-02
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador delantero de protrombina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaatcccgt gaaagaatta t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso de protrombina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtggtgga ttcttaagtc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de protombina 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacttttatt gggaaccata gttttagaaa cacaa
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de protrombina 2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcattgaggc tcgctgagag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de protrombina 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcattgtggc tcgctgagag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de protrombina 4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n en la posición 7 significa un
engarce de fenileno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcattgnggc tcgctgagag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador delantero de EBV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaggaacg tgaatctaat ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso de EBV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacagataga tggcactctt acctt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de EBV 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggattgcaa cacgacggga atgacg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de EBV 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctccctccc cctccctact ctc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de EBV 3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n en la posición 15 significa un
engarce de fenileno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctccctccc cctcnctact ctc
\hfill23
Claims (4)
1. Un método para la síntesis de un
oligonucleótido que contiene un bastón molecular axial interno,
siendo dicho bastón molecular una estructura rígida la cual no
puede ser torcida en sí misma, el cual método comprende:
- suministro de una partícula de vidrio de poro
controlado
- síntesis de dicho oligonucleótido por medio de
la química de la fosforamidita,
en donde dicho bastón molecular axial está
incorporado en dicho oligonucleótido mediante el suministro de una
fosforamidita que comprende un bastón molecular axial,
en donde dicho oligonucleótido es una sonda
TaqMan, un faro molecular o un miembro de un par de sondas de
hibridación FRET.
2. Empleo de un oligonucleótido que contiene un
bastón molecular axial interno, siendo dicho bastón molecular una
estructura rígida la cual no puede ser torcida en sí misma, como una
sonda de hibridación, en donde la dependencia de la hibridación a
la temperatura se monitoriza en tiempo real, en donde dicho
oligonucleótido es un faro molecular o un miembro de un par de
sondas de hibridación FRET.
3. Composición que comprende un oligonucleótido
que puede obtenerse mediante un método de acuerdo con la
reivindicación 1.
4. Kit que contiene un oligonucleótido que puede
obtenerse mediante un método de acuerdo con la reivindicación
1.
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