ES2272058T3 - Uso de un anticuerpo antagonista contra el mediador inflamatorio oncostatin m (0sm). - Google Patents

Abstract

El uso de un anticuerpo antagonista respecto de la Oncostatina M (OSM para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una artropatía inflamatoria. 2 . El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que se selecciona la artropatía inflamatoria entre el grupo constituido por artritis reumatoide, artritis psoriática, artritis reactiva. 3. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2 en el que el anticuerpo es un anticuerpo de la OSM humana. 4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre F(ab'')2, Fab, Fv'', ScFv- 5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en el que el anticuerpo es humanizado o quimerizado. 6. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 para el tratamiento de la artritis reumatoide. 7. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo está en combinación con un inmunosupresor, inductor de la tolerancia, o agente antiinflamatorio. 8. Un uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que el anticuerpo está en combinación con un agente que inhibe las células CD4+T, un anticuerpo anti-CD23 o un antagonista de TNF. 9. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el medicamento se usa para evitar o reducir la liberación de colágeno del cartílago. 1 45

Description

Uso de un anticuerpo antagonista contra el mediador inflamatorio Oncostatin M (OSM).

La presente invención se refiere al uso de un antagonista de la OSM en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una artropatía inflamatoria o trastorno inflamatorio y a los procedimientos de selección de dichos antagonistas.

La artritis reumatoide (RA) es un trastorno inflamatorio crónico que afecta a las uniones de las articulaciones, caracterizada por hiperplasia sinovial e infiltración celular extensiva por células mononucleares y leucocitos polimorfonucleares (PMN). Una compleja y mal comprendida interacción entre los tipos de células residentes e infiltrantes conduce a la secreción crónica de metaloproteinasas, dando como resultado la destrucción del cartílago articular, ligamentos y hueso subcondral (Firestein GS Current Opinion in Rheumatology. 4:348-54, 1992. Entre las numerosas citoquinas implicadas en la impulsión de la patología común de la RA, se ha demostrado que TNF\alpha juega un papel fundamental, con terapias anti TNF que muestran claros beneficios (Elliott M. J. y col. Lancet. 344(8930):1105-10, 1994). TNF\alpha media en diversos efectos patológicos entre los que se incluyen la inducción de MMP (Dayer JM. Y col. Journal of Experimental Medicine. 162(6):2163-8, 1985), la sobreregulación de otras citoquinas proinflamatorias (Haworth C. y col. European Journal of Immunology. 21(10):2575-9, 1991 y Dinarello CA. y col. Journal of Experimental Medicine. 163(6):1433-50, 1986) y el aumento de la adhesión de PMN y la migración celular transendotelial (Smart SJ. CasaleTB American Journal of Physiology. 266: L238-45, 1994). Aunque TNF\alpha se ve actualmente como el iniciador de la cascada de citoquinas proinflamatorias, se conoce relativamente poco su regulación positiva (Feldmann M. y col. Annual Review of Immunology. 14:397-440, 1996).

La Oncostatina M (OSM) (Rose TM. Bruce AG. PNAS USA 88(19):8641-5, 1991) es una proteína de 28 kDA que pertenece a una familia de citoquinas que comprende IL-6, IL-11, factor inhibidor de la leucemia (LIF) factor neurotrópico ciliar (CTNF) y cardiotropina 1 (CT-1) (Taga T. Kishimoto. Annual Review of Immunology. 15:797-819, 1997). Todos los miembros comparten una cadena de señalamiento común, gp130, como parte de una familia compleja de receptores hetero- y homodiméricos (Grotzinger J. y col... [Artículo] Proteínas. 27(1):96-109, 1997). OSM comparte un receptor heterodimérico común con LIF, (LiFr : gp130, tipo I) y tiene también su propio único receptor que comprende una cadena OSMr\beta y gp130 (tipo II) (Mosley B. y col. [Artículo] Journal Of Biological Chemistry. 271(51):32635-32643, 1996). Se conoce OSM desde hace mucho por los efectos sobre el crecimiento celular y la diferenciación (Horn D. y col [Artículo de Revista] Growth Factors. 2(2-3):157-65, 1990). Recientemente, se ha demostrado que OSM tiene potentes propiedades proinflamatorias en ratones in vivo (Modur V. y col. J. Clin Invest. 100:158-168, 1997) y demuestra una sinergia potente con IL-1 para promover la degradación del cartílago articular en sistemas modelo, ex vivo (Cawston T. Biochemical & Biophysical Research Communications. 215(1):377-85, 1995).

OSM induce un aumento prolongado de la P-selectina (y E-selectina) en células endoteliales (Yao L. y col. Journal Of Experimental Medicine. 184(1):81-92, 1996), estimula la actividad del activador del plasminógeno de tipo uroquinasa en fibroblastos sinoviales humanos (Hamilton J. y col. Biochemical & Biophysical Research Communications. 180(2):652-9, 1991) y es un inductor poderoso del IL-6 de las células endoteliales (Brown Tj. y col. Journal Of Immunology. 147(7):2175-80, 1991 Oct 1). Se ha medido recientemente OSM en RA pero no en fluido sinovial OA (Hui W. y col. Annals Of The Rheumatic Diseases. 56(3):184-187, 1997) y en el sinovio, la producción del cual se ha localizado en los macrófagos (1997, Okamoto H y col. Arthritis and Rheumatism 40(6):1096-1105) y Cawston y col. (1998, Arthritis and Rheumatism, 41(10) 1760-1771). Hasta la fecha, los experimentos adicionales en este campo han sido especulativos en función de la similitud de los miembros de la subfamilia IL-6 (Carroll G. y col Inflamm. Res. 47 (1998) 1-7).

Los presentes inventores han descubierto que OSM tiene la capacidad de inducir la secreción de TNF\alpha en los macrófagos. De manera contraria a lo que los datos recientes sugieren respecto que OSM sobreregula la producción del inhibidor del tejido de la metaloproteinasa - 1 (TIMP-1) (Nemoto y col 1996, A&R 39(4), 560-566), que se compleja con e inactiva MMP-1 y podría por tanto esperarse que disminuyera la liberación de colágeno, los inventores descubrieron que OSM induce la secreción de TNF\alpha sugiriéndoles que OSM puede realmente jugar un papel en la destrucción mediada del cartílago. Basándose en este descubrimiento, los presentes inventores han demostrado que la administración terapéutica de un anticuerpo anti OSM neutralizante sin la inhibición de otros miembros de la familia IL-6 puede sólo mejorar la artritis inducida por colágeno en un modelo de ratón. Se ha demostrado de manera subsiguiente por T. Cawston y col (1998, Arhtritis and Rheumatism, 41 (10) 1760-1771) la sinergia de la OSM con TNF\alpha para promover la liberación de colágeno del cartílago. El Documento EP 451612 enseña el uso de un anticuerpo de la OSM para el tratamiento de los trastornos de crecimiento celular. De acuerdo con la presente invención, se proporciona por tanto el uso de un antagonista de la OSM para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una artropatía inflamatoria o trastorno inflamatorio. Un uso concreto de un antagonista de la OSM es en la fabricación de un medicamento para evitar o reducir la liberación de colágeno del cartílago. La invención proporciona de manera adicional un procedimiento para e tratamiento o profilaxis de una artropatía inflamatoria o trastorno inflamatorio que comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de la OSM a un paciente que padece de dicho trastorno. El antagonista puede funcionar bloqueando OSM a partir de la interacción con el receptor de la OSM gp 130, o los otros receptores de la OSM, la cadena OSMr\beta o LIFr, o bloqueando la formación de heterodímeros de estas proteínas, y tal como evitar el enlace con la OSM y señalar por tanto la síntesis reductora de las citoquinas proinflamatorias y/o los MMP. El antagonista de acuerdo con la invención puede ser por tanto un ligando para cualquier OSM o uno o más de los receptores de la OSM (gp130, OSMr\beta o Liar) o un agente capaz de interferir con estas interacciones de una manera que afecte la actividad biológica de la OSM. A partir de ahora en el presente documento se puede tomar la referencia a un antagonista de la OSM como que significa tanto un antagonista del propio OSM o uno de sus receptores.

En el Documento de los Estados Unidos 5.571.513, se describen los anticuerpos monoclonales anti-gp130 obtenidos de los hibridomas 4B11 y 2H4. La descripción contempla el uso de estos anticuerpos en el tratamiento de la fase aguda del componente de la inflamación. Sin embargo, Yoshida y col; Contemporary Immunology, Humana Press demostraron que un golpe homozigótico de gp130 es letal y conduce a trastornos de miocardio y hematológicos.

Vandenabeele y col; Trends in Cell Biology, pp 392-399 (1995) enseña que TNF no produce señal a través de la subunidad gp130 sino a través de su propio conjunto de receptores. Richards, C. D. y col enseñan que la OSM humana (J. Immunol. (1993) 150, pp 5596-5603) y la OSM de la murina (J. Immunol. 1997), pp 2431-2437) sobreregulan la producción del inhibidor del tejido de la metaloproteinasa (TIMP). TIMP compleja e inactiva las metaloproteinasas de matriz. Estos documentos enseñan que la inducción selectiva de TIMP-1 por la OSM puede ser influyente en la alteración de la destrucción de la matriz en la inflamación crónica. Trepicchio, W. L. y col, J. Immunol., 1996, 157:3627-3634 enseña que IL-11 es antiinflamatorio. Xing, y col; J. Cellular Immunol., 101 (2) pp 311-320, Enero de 1998, enseña que IL-6 es antiinflamatorio. Ichihara M, y col., 1997, Blood, 90 pp 165-173, demuestran que, en ratones, OSM y LIF no usan el mismo receptor sugiriendo que los estudios usando OSM humana en ratones dan como resultado efectos mediados por el receptor de LIF y no por el de la OSM.

Los presentes inventores han demostrado también que en el endotelio vascular sinovial de la artritis reumatoide, las selectinas P y E se colocalizan con gp130, el elemento señalador de tipo I y los receptores OSM II. Sin desear quedar ligado por la teoría, esto indica que la OSM, producida por los macrófagos sinoviales, debería primar el endotelio vascular de la RA para facilitar la incorporación de los leucocitos mediante la sobreregulación de las selectinas P y E. El hallazgo que la ligadura de la L-selectina mediante cualquier anticuerpo específico o fucoidan (agonista de la L-selectina) lleva a las células mononucleares humanas a segregar OSM puede ser altamente significativo en términos de amplificación de la respuesta inflamatoria, proporcionando una fuente local adicional de la OSM para empujar a TNF\alpha y las selectinas P y E.

Se han identificado los residuos de aminoácidos que son importantes para la interacción de la OSM con gp130. A partir de la secuencia de aminoácidos publicada de la OSM (Malik y col., 1989, Mol Cell Biol., 9(7), 2847-53, la secuencia de entrada del ADN M27288 en la base de datos EMBL, la secuencia de entrada de la proteína P13725 en Swissprot) estas son G120, Q16 y Q20; N123 y N124 pueden también jugar una parte (véase a continuación). Los primeros 25 residuos son un péptido señal, y la proteína madura comienza en la secuencia AAIGS. La secuencia se numera a partir del primer aminoácido de la proteína madura tal como se muestra.

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La invención proporciona por tanto de manera adicional un antagonista o agente capaz de interactuar con uno o más de estos residuos específicos y/o ayudan a definir los emplazamientos de enlace sobre OSM para alterar la actividad biológica de la OSM.

Las artropatías inflamatorias que se pueden tratar de acuerdo con esta invención incluyen artritis reumatoide, artritis psoriática, artritis juvenil, osteoartritis inflamatoria y/o artritis reactiva. Los trastornos inflamatorios que se pueden tratar incluyen, entre otros, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa gastritis, por ejemplo gastritis resultante de infección por H. pylori, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple y soriasis. Los antagonistas potenciales de la OSM incluyen pequeñas moléculas orgánicas, iones que interactúan de manera específica con la OSM, por ejemplo un posible sustrato, un componente natural de una membrana celular, un receptor o un ligando natural, un fragmento del anterior o un péptido u otras moléculas proteináceas, particularmente preferida es una forma mutante no señaladota d OSM que bloqueará el enlace de la OSM con el receptor de la OSM, pero también modifica las moléculas de la OSM. Dichos antagonistas pueden estar en forma de ADN que codifica la proteína o péptido y se pueden liberar para la expresión in vivo de dicho antagonista. Los antagonistas pueden ser vacunas que comprenden dicha proteína o moléculas de péptido o ADN, diseñadas para producir un efecto antagonista hacia OSM mediante la inducción de respuestas de anticuerpo dirigidas in vivo hacia la OSM nativa. Dichos antagonistas pueden incluir también anticuerpos, reactivos derivados de anticuerpos o moléculas quiméricas. Incluido en la definición de antagonista, es un imitador estructural o funcional de cualquiera de dichas moléculas descritas más arriba. Están también contempladas las moléculas de ácido nucleico tales como los aptámeros de ADN o ARN.

Los antagonistas preferidos incluyen pequeñas moléculas orgánicas. Dichos compuestos pueden proceder de cualquier clase de compuestos, pero se seleccionarán sobre la base de su capacidad para afectar la actividad biológica de la OSM a través de uno de los mecanismos descritos más arriba y serán fisiológicamente aceptables, es decir, no tóxicos o que demuestren un nivel aceptable de toxicidad u otros efectos secundarios. Una clase de compuestos que pueden proporcionar antagonistas útiles son los ribonucleótidos tales como N- (1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il) benzamida); Davoll y Kerridge, J. Chem Soc., 2589, 1961).

Otros antagonistas preferidos incluyen anticuerpos, fragmentos de los mismos o constructos artificiales diseñados para imitar el enlace de los anticuerpos o los fragmentos de los mismos. Se describen dichos constructos por Dougall y col. en Tibtech 12, 372-379 (1994).

Incluidos también en la definición de anticuerpos que se pueden usar están los anticuerpos recombinantes tales como los anticuerpos humanos recombinantes. Se pueden alterar los anticuerpos, es decir, pueden ser anticuerpos "quiméricos" que comprenden las regiones variables de un anticuerpo donante y las regiones constantes de un anticuerpo humano (tal como se describe en el Documento WO 86/01533) o pueden ser anticuerpos "humanizados" en los que únicamente se derivan las CDR de especies diferentes a las del marco de las regiones variables del anticuerpo (tal como se describe en el Documento EP-A-0239400). Se pueden derivar las regiones que determinan la complementariedad (CDR) de un anticuerpo monoclonal de roedor o primate. El marco de las regiones variables, y las regiones constantes del anticuerpo alterado se derivan normalmente de un anticuerpo humano. Dicho anticuerpo humanizado no deberá obtener una gran respuesta inmune cuando se administra a un humano en comparación con la respuesta inmune montada por un ser humano frente a un anticuerpo completamente extraño tal como uno derivado de un roedor.

Los antagonistas preferidos incluyen anticuerpos completos, fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos ScFv, otros fragmentos, péptidos CDR, y miméticos. Se pueden obtener/preparar éstos por aquellas personas expertas en la técnica. Por ejemplo se puede usar la digestión del enzima para obtener los fragmentos F(ab')_{2} y Fab(sometiendo una molécula de IgG a la rotura con pepsina o papaína de manera respectiva). Deberán tomarse las referencias a "anticuerpos" en la siguiente descripción para incluir todas las posibilidades mencionadas más arriba.

Se apreciará por aquellas personas expertas en la técnica, cuando se describen en el presente documento las proteínas específicas o los antagonistas de los péptidos, se pueden usar también derivados de dichos aminoácidos. El término "derivado" incluye variantes de los antagonistas descritos que tengan una o más sustituciones, delecciones o inserciones de aminoácidos en relación con dichos antagonistas, mientras que tienen todavía la actividad de enlace descrita. De manera preferible, estos derivados tienen una identidad sustancial de la secuencia de aminoácidos con los antagonistas especificados.

Se puede calcular el grado de identidad de la secuencia de aminoácidos usando un programa tal como "bestfit" (Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981) para encontrar el mejor segmento de similaridad entre dos secuencias cualquiera. Los alineamientos se basan en maximizar la puntuación conseguida usando una matriz de similaridades entre aminoácidos, tales como las descritas por Schwarz y Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M. O., Ed pp 353-358.

De manera preferible, el grado de identidad de secuencias es al menos un 50% y de manera más preferible es al menos un 75%. Son más preferidas las identidades de secuencias de al menos un 90% o al menos un 95%. Se apreciará sin embargo, por las personas expertas que no se requieren necesariamente altos grados de identidad de secuencias debido a que se pueden sustituir a menudo diversos aminoácidos por otros aminoácidos que tienen propiedades similares sin alterar de manera sustancial o afectar de manera adversa algunas propiedades de una proteína. Estos son denominados algunas veces cambios "conservativos" de aminoácidos. De esta manera, se pueden sustituir a menudo los aminoácidos glicina, valina, leucina o isoleucina por otro que incluye: -fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas secundarias aromáticas; lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas secundarias básicas); aspartato y glutamato (aminoácidos que tiene cadenas secundarias ácidas); asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas secundarias amida) y cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas secundarias que contienen azufre). De esta manera, el término "derivado" puede incluir también una variante de una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más de dicho cambios "conservativos" en relación con dicha secuencia.

La presente invención incluye también fragmentos de los antagonistas de la presente invención o de los derivados de los mismos que tienen todavía la actividad de enlace descrita. Los fragmentos preferidos tienen al menos diez aminoácidos de longitud, pero pueden ser más largos (por ejemplo hasta 50 o hasta 100 aminoácidos de longitud).

Los antagonistas preferidos adicionales de la OSM para uso en la invención son ligandos de oligonucleótidos. La evolución sistemática de los ligandos mediante enriquecimiento exponencial (SELEX), es un protocolo en el que se seleccionan vastas bibliotecas de oligonucleótidos de cadena única para la actividad deseada frente a una proteína diana u otra molécula (Tuerk & Gold 1990 Science 249, 505-510, Green y col., 1991 Meths. Enzymol. 2 75-86; Gold y col., 1995 Annu. Rev Biochem 64, 763-797; Uphof y col., 1996 Curr. Opin Struct. Biol. 6, 281-288). El producto de esta selección es una cadena de oligonucleótido única denominada un aptámero con la actividad deseada, normalmente, con alta afinidad de enlace, por la proteína diana. Se inicia normalmente el procedimiento SELEX con una biblioteca de ARN o ADN constituida por algunas 10^{14}-10^{15} secuencias aleatorias de oligonucleótidos. En una biblioteca de oligonucleótido completamente aleatorizada, cada molécula presentará una única estructura terciaria que será enteramente dependiente de la secuencia de nucleótidos de esta molécula. De esta manera, cuando se seleccione la afinidad del enlace frente a una proteína diana del oligonucleótido para esta proteína, se determinará mediante el ajuste entre la forma del oligonucleótido y los epitopos en la proteína diana. Como consecuencia del comienzo de una biblioteca de vasta diversidad es normal ser capaces de identificar aptámeros de afinidad sub-nM por la proteína diana con selectividad para esta proteína diana sobre otras proteínas con homología estructural global (Tuerk & Gold 1990 más arriba, Green y col., 1991 más arriba; Gold y col., 1995 más arriba; Uphof y col., 1996 más arriba). Usando la metodología SELEX, se han generado aptámeros de ARN o ADN sobre 100 proteínas y pequeñas moléculas entre los que se incluyen dopamina (Mannironi y col., 1997 Biochemistry 36, 9726-9734), sustancia P (Nieuwlandt y col., 1995 Biochemistry 34, 5651-5659) elastasa neutrófila humana (Bless y col., 1997 Current Biol. 7, 877-880), Platelet Derived Growth Factor (PDGF) (Green y col., 1996 Biochemistry 35, 14413-14424); Vascular Endotelial Growth Factor (VEGF) (Green y col., 1995 Chem Biol. 2, 683-695), Thrombin (Bock y col., 1992 Nature 355, 564-66) y L-selectin (O'Connell y col., 1996 PNAS USA 93, 5883-5887).

Se ha demostrado que numerosos aptámeros tienen actividad biológica, normalmente antagonismo con el receptor o inhibición del enzima, in vitro e in vivo. Por ejemplo, los aptámeros de ARN con afinidad alta y actividad inhibitoria a la elastasa neutrófila humana (hNE) se generaron mezclando SELEX (Bless y col., 1997 más arriba). Siguiendo la modificación post-SELEX, se ensayó el aptámero para aumentar la estabilidad in vivo en un modelo de rata de inflamación del pulmón (Bless y col., 1997 más arriba). En un segundo ejemplo, se generó un aptámero de ADN de 49 nucleótidos de longitud para la L-selectina humana con afinidad nM para la proteína (O'Connell y col., 1996 más arriba). El aptámero presenta selectividad 600 veces para la L-selectina sobre la selectina E y selectividad 10.000 veces sobre la selectina P. La inyección intravenosa de una formulación PEG del aptámero inhibió el tráfico de PBMC humana radiomarcada en los nódulos linfáticos, pero no en otros órganos, de una manera dependiente de la dosis (Hicke y col., 1996, J. Clin. Invest. 98,2688-2692). En un tercer ejemplo, se han estimulado aptámeros de ARN frente a VEGF humana para investigar el papel de la VEGF en la angiogénesis (Jellinek y col., 1994 Biochemistry 33, 10450-10456; Green y col., 1995; Ruckman y col., 1998. J. Biol. Chem 273, 20556-20567; Willis y col., 1998 Bioconjug. Chem. 9, 573-582). Una función liposomal del aptámero VEGF inhibe la proliferación de células endoteliales inducida por VEGF in vitro y aumenta la permeabilidad vascular y la angiogénesis in vivo (Willis y col., 1998 más arriba). Se proporciona por tanto un ligando de oligonucleótido de la OSM para uso en la invención

Para producir un aptámero para uso en la invención tal como se ha descrito más arriba para OSM o un receptor debe en primer lugar enlazarse en placas para la selección. Se pueden llevar a cabo recorridos iterativos de selección y amplificación (es decir, el procedimiento SELEX) de acuerdo con Fitzwater y Polisky (Meths in Enzymol. 267, 275-301) para generar aptámeros de ARN o ADN para la OSM humana. Normalmente, estos aptámeros son aptámeros de ARN modificado de tal manera que el ARN proporciona la diversidad estructural más grande y por tanto, la posibilidad de generar moléculas de alta afinidad. Tras la generación de un aptámero de alta afinidad, se pueden llevar a cabo numerosos protocolos de optimización post-SELEX para aumentar la estabilidad del aptámero, para truncar el aptámero en una secuencia núcleo (normalmente los aptámeros tienen 100 unidades monoméricas o más cortas) lo que es más adecuado para la síntesis en fase sólida reduciendo por tanto el coste de la síntesis, y para desarrollar formulaciones para uso en vivo.

En el primero de estos procedimientos, se puede truncar el aptámero para reducir la longitud de la molécula a una secuencia núcleo necesaria para la actividad, la secuencia núcleo corta, a menudo entre 20 y 40 nucleótidos de longitud será más económica y más rápida de sintetizar y puede tener la biodisponibilidad aumentada. Se puede obtener la información con respecto a la composición de la secuencia núcleo a partir de las comparaciones de homología de secuencias. Sin embargo, los experimentos de truncamiento implican de manera usual la síntesis de aptámeros secuencialmente más cortos hasta que se genera una secuencia mínima requerida para la actividad. Esto implica normalmente la eliminación de las secuencias fijas, pero existen numerosos ejemplos en los que los nucleótidos dentro de las secuencias fijas han contribuido a la afinidad del aptámero (Fitzwater y Polisky, 1996 más arriba; Ruckman J, y col (1998) J. Biol. Chem. 273, 20556-20567. Green y col., 1995 más arriba). La invención puede proporcionar por tanto aptámeros que son versiones truncadas o extendidas del aptámero seleccionado o uno que demuestra una homología mayor del 70% en la secuencia de un aptámero seleccionado.

Tras el truncamiento se pueden llevar a cabo numerosos experimentos de modificación de las bases para mejorar la estabilidad del aptámero mediante la protección frente a la rotura por la ribonucleasa. Durante el procedimiento SELEX no es posible incluir bases de purina 2' modificada tal como la polimerasa T7 usada para la transcripción in vitro - que no tolerará esta modificación. Por lo tanto, para aumentar la estabilidad del aptámero después de SELEX es usual sustituir las bases de purina dentro del aptámero con purinas 2' modificadas. Esta modificación es normalmente a través del uso de 2'-0-metil purinas, aunque e pueden usar otras purinas modificadas entre los que se incluyen 2'-amino purinas o 2'-fluoro purinas (Ruckman y col., 1998 más arriba, 1995 más arriba). Esto tiene que hacerse de manera secuencial de tal manera que esta modificación, después de SELEX, puede dar como resultado también una pérdida de afinidad (Green y col., 1995 más arriba).

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Tras el truncamiento y estabilización es posible generar cantidades muy grandes de un aptámero corto completamente modificado que se puede sintetizar mediante síntesis a escala sólida química. Se pueden añadir muchas moléculas en el extremo 5' d un aptámero para facilitar el uso del aptámero o para formular un aptámero para la liberación in-vivo esto incluye una fracción aislada para ayudar a la formación de imágenes (Hnatowich D. J. (1996) Q. J. Nucl. Med. 40, 202-8), la fluoresceína para ayudar a la detección molecular (German y col., 1998 Anal. Chem. 70, 4540-5), un grupo lípido para ayudar a la inserción en un liposoma (Willis y col., 1998 más arriba), o la conjugación con una pequeña molécula de fármaco o péptido (Charlton J, y col (1997b) Biochemistry 36, 3018-3026). De manera general, la adición de una molécula en el extremo 5' de un aptámero no da como resultado una pérdida de afinidad o especificidad.

Para mejorar la semivida in vivo, se han modificado los aptámeros mediante la adición de moléculas de polietilén glicol (PEG) o mediante la incorporación en liposomas. En ambos casos dicha modificación puede producir un aumento significativo de la semivida in vivo (Willis y col, 1998 más arriba).

De manera adicional a las formulaciones liposomales, se han formulado aptámeros con PEG de 20K y 40K para aumentar la estabilidad al suero in vivo. Se ha generado un aptámero de ADN frente a la L-selectina humana. Para aumentar la estabilidad in vivo, se acopló un éster de PEG de 20K con el aptámero mediante la fracción amino N-terminal. Se demostró que el aptámero conjugado con PEG bloquea el tráfico de linfocitos dependiente de la L-selectina in vivo en ratones SCID (Hicke y col., 1996 más arriba). Se proporciona por tanto para uso en la invención, un conjugado de un aptámero y una molécula vehiculo, por ejemplo PEG. En esta forma de realización, el aptámero y el vehiculo se enlazarán mediante, por ejemplo, la fracción amino N-terminal. De manera adicional, se proporciona una formulación o composición para uso en la invención que comprende un aptámero y una molécula de liberación, por ejemplo un liposoma. En esta forma de realización no se puede enlazar entre el aptámero y el vehículo, se puede encapsular simplemente el aptámero, dispersarse o distribuirse a través del vehículo.

Se pueden modificar también los aptámeros aislados en este estudio para uso como moléculas de diagnóstico para detectar la presencia de la OSM humana en suero, tejido u otras muestras ex vivo, o para la detección de la OSM humana en cuerpo entero en estudios de formación de imágenes in vivo (Charlton J. y col., (1997) Chemistry and Biology 4, 809-816; Hnatowich, 1996 más arriba). Se puede añadir fluoresceína u otros grupos de detección fluorescente al extremo 5' de la molécula de aptámero para ayudar en la detección por fluorescencia de aplicaciones tales como FACS (Separación de células Activada por Fluorescencia) (Davis KA.. y col (1996) Nuc. Acids Res. 24, 702-6; Charlton y col., 1997 más arriba), los ensayos ELONA (Ensayos de Oligonucleótidos Enlazados a Enzimas) (Drolet DW, y col (1996) Nature Biotech, 14, 1201-1205) y otras aplicaciones de diagnóstico. La llegada del tecnecio-99m (Tc99m) que aísla los péptidos quelantes, tales como el MAG3 (Fritzberg A. R. y col J Nucl Med 1986: 27, 111-6) ha facilitado mucho el uso de un amplio intervalo de moléculas (Kubo A y col., (1998) Kaku Igaku 35, 909-28) y macromoléculas (Taillefer R. y col., (1995) Eur. J. Nucl. Med. 22, 453-64) la presencia de una proteína in vivo para la formación de imágenes (macromoléculas (Pallela V. R., y col (199) Nucl. Med. 40, 352-60). Se visualizan las imágenes con ayuda de una cámara \gamma y se han conseguido en una variedad de especies desde ratón a hombre. La modificación reciente de los quelantes Tc99m ha permitido un marcado de las moléculas más eficiente y estable bajo condiciones suaves (Hnatowich D. J. 1998 Nucl Med 39, 56-64). Se han desarrollado ya procedimientos para radiomarcar oligonucleótidos de cadena única, se ha investigado de manera preliminar el destino in vivo de dichos oligonucleótidos marcados no modificados (Hnatowich, 1996 más arriba).

Se apreciará, por supuesto, que ningún péptido, proteína o ácido nucleico basado en antagonistas para uso en esta invención estará en forma purificada, es decir, libre de materia asociada con dicha molécula, bien en su estado natural, o como resultado de su fabricación, notablemente, la pureza es mayor de un 70% de pureza pero de manera más preferible mayor de un 80% o un 90% de pureza.

Se pueden usar los antagonistas de la presente invención solos o en combinación con agentes inmunosupresores tales como esteroides (prednisona, etc.), ciclofosfamida, ciclosporina A o un análogo de purina (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, o similares), o anticuerpos tales como el anticuerpo anti-linfocito o de manera preferible con un agente inductor de la tolerancia, anti-autoinmune o antiinflamatorio tal como el agente que inhibe las células CD4+T, por ejemplo, anticuerpo anti CD4 (de manera preferible un bloqueante o anticuerpo no reductor) un anticuerpo anti CD8, un anticuerpo anti CD23, un antagonista de TNF, por ejemplo, un anticuerpo anti TNF o inhibidor de TNF, por ejemplo, el receptor de TNF, o agentes tales como los NSAID u otros inhibidores de la citoquina.

Las dosificaciones adecuadas de un antagonista de la presente invención variarán, dependiendo de factores tales como la enfermedad o trastorno que se va a tratar, la ruta de administración y la edad y peso del individuo que se va a tratar y la naturaleza del antagonista. Sin estar ligado por ninguna dosificación concreta, se cree que para el ejemplo de la administración parenteral, puede ser adecuada una dosificación diaria de entre 0,01 a 20 mg/kg de un anticuerpo (u otra molécula grande) de la presente invención (normalmente presente como parte de una composición farmacéutica tal como se ha indicado más arriba) para tratar a un adulto normal. De manera más adecuada, la dosis debe ser de 0,1 a 5 mg/kg, tal como de 0,1 a 2 mg/kg. Una dosis unitaria adecuada será de 1-400 mg. Serían similares las dosificaciones adecuadas de pequeñas moléculas orgánicas y las dosificaciones adecuadas de ligandos de oligonucleótidos serían, por ejemplo, de 0,1 - 10 mg/kg.

La invención proporciona de manera adicional una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable como ingrediente activo, un antagonista de acuerdo con la invención y de manera opcional, otro agente terapéutico tal como se ha descrito más arriba. El antagonista, y la composiciones farmacéuticas del mismo de esta invención, son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa, pero dependiendo de la naturaleza del antagonista, pueden ser más apropiadas otras rutas tales como la oral, mediante inhalación, intranasal, tópica, o intraarticular.

Las composiciones para la administración parenteral comprenderán usualmente una solución del antagonista o un cóctel del mismo, disuelto en un vehículo aceptable, de manera preferible un vehículo acuoso. Se pueden usar una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y están generalmente libres de materia particulada. Se pueden esterilizar estas composiciones mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tales como las requeridas para aproximar las condicione fisiológicas tales como el ajuste del pH y los agentes tamponantes, los agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro d sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc. Puede variar ampliamente la concentración de anticuerpo u otro antagonista en estas formulaciones, por ejemplo entre menos de aproximadamente un 0,5%, normalmente a o al menos aproximadamente un 1% o como mucho hasta un 15 o 20% en peso y se seleccionará principalmente en función de los volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo concreto de administración seleccionado.

De esta manera, podría fabricarse una composición farmacéutica para inyección intramuscular que contuviera hasta 1 ml de agua tamponada estéril, y 50 mg de antagonista. Podría fabricarse una composición típica para infusión intravenosa hasta que contuviera 250 ml de solución de Ringer estéril, y 150 mg de anticuerpo u otro antagonista de acuerdo con la invención. Los procedimientos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral serán bien conocidos o evidentes para aquellas personas expertas en la técnica y se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania (1980). Se han descrito más arriba las formulaciones adecuadas para los antagonistas de ácidos nucleicos.

Se pueden liofilizar los antagonistas de las proteínas de esta invención, tales como los anticuerpos, para su almacenamiento y reconstitución en un vehículo adecuado antes del uso. Estas técnicas han demostrado ser efectivas con las inmunoglobulinas convencionales. Se puede emplear cualquier técnica de liofilización y reconstitución adecuadas. Se apreciará por aquellas personas expertas en la técnica que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad del anticuerpo (por ejemplo, con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpo de IgM tienden a tener mayor pérdida de actividad que los anticuerpos de IgG) y pueden tener que ajustarse los niveles de uso para compensar.

Se pueden llevar a cabo las administraciones única o múltiple de las composiciones seleccionando niveles de dosis y modelos para el tratamiento por el médico. En cualquier episodio, las formulaciones farmacéuticas proporcionarán una cantidad del anticuerpo u otro antagonista de esta invención suficiente para tratar de manera efectiva al paciente.

La presente invención incluye dentro del alcance un ensayo para determinar si un agente concreto que enlaza con la OSM puede ser útil, o no, en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria. La invención comprende por tanto un ensayo para la identificación de los antagonistas de la OSM que comprende combinar OSM con el agente de ensayo y determinar si o no es capaz el agente de bloquear la interacción entre OSM y el receptor de la OSM o afectar la actividad biológica de la OSM a través de la expresión diferencial de la molécula marcadora.

Para seleccionar un antagonista para el uso en la invención, tal como se ha descrito más arriba la OSM, deben obtenerse en primer lugar los residuos que enlazan el interruptor de la OSM tal como se ha descrito más arriba, presentados sobre un vehículo de de manera que se definan los emplazamientos de enlace ("fracción de enlace con la OSM") o un receptor de la OSM, se puede generar el ADNc que codifica la OSM humana de manera sintética, en función de la secuencia EMBL (número de acceso M27288), clonado en un vehículo de expresión apropiado y usado para transformar un huésped apropiado tal como E. coli. A continuación se purifica la proteína OSM humana a partir del medio de cultivo y se une con las placas para la selección.

Se puede usar OSM, una fracción de enlace con la OSM y el receptor de la OSM para evaluar el enlace de moléculas pequeñas de sustratos y ligandos con, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas, y mezclas de productos naturales. La invención proporciona por tanto un ensayo para la identificación de un antagonista de la OSM que comprende poner en contacto OSM con un agente de ensayo y medir el enlace. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales que pueden ser miméticos estructurales y funcionales. Se incluyen dichas moléculas en la definición de antagonistas de la OSM. El procedimiento de selección puede implicar un rendimiento específico alto. Por ejemplo, para seleccionar los antagonistas, se puede preparar una mezcla de reacción sintética, un compartimento celular, tal como una membrana, una envoltura celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de las mismas, a partir de una célula que expresa el receptor de la OSM. A continuación se incuba la preparación con la OSM marcada en ausencia o en presencia de una molécula candidato. La capacidad de la molécula candidato para enlazar con el receptor de la OSM se refleja en la disminución del enlace de la OSM marcada. Son más apropiadas para ser buenos antagonistas las moléculas que enlazan gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos funcionales de la OSM. Se puede invertir este ensayo, y se puede usar un receptor de la OSM marcado con la OSM no marcada Se puede usar una selección adicional con un formato ELISA para identificar los antagonistas de la OSM cuando se mide la capacidad de una molécula candidato para evitar el enlace de un receptor conjugado de la OSM, tal como la proteína de fusión gp130-Fc con la OSM inmovilizada en placa, en este ensayo se detecta el enlace de gp130-Fc mediante el anticuerpo anti-Fc marcado con enzima y el ensayo colorimétrico. Se pueden medir los efectos funcionales de los antagonistas potenciales, por ejemplo, determinando la actividad de un sistema indicador tras la interacción de la molécula candidato con una célula o preparación celular apropiada, y comparando el efecto con el de la OSM o moléculas que producen los mismos efectos sobre OSM. Los sistemas indicadores que pueden ser útiles a este respecto incluyen, pero no se limitan al sustrato marcado colorimétrico convertido en producto, un gen indicador que es responsable de los cambios en la actividad funcional del receptor de la OSM, y los ensayos de enlace conocidos en la técnica.

Figuras

Figura 1a: ELISA que muestra la secreción ex vivo de la Oncostatina M por cultivos de biopsias sinoviales.

Figura 1b: Secreción espontánea ex vivo de la Oncostatina M mediante cultivos sinoviales inflamados pero no inflamados.

Figura 2: Efecto de rhOSM en la producción de TNF alfa mediante las células THP-1 diferenciadas con PMA.

Figura 3 a y b: Efecto sinérgico de la OSM con TNF\alpha para promover la liberación de colágeno ex vivo.

Figura 4a: Selección de anticuerpo anti-L que media la secreción de la OSM.

Figura 4b: Secreción de la OSM inducida por fucoidan.

Figura 5a-d: Fotomicrografía que demuestra la tinción endotelial vascular de RA usando gp130 y anticuerpos de selección E.

Figura 6: Mensaje del ARN de la OSM en las articulaciones entre control & CII - ratones artríticos

Figura 7: Ratones DBA-1 artríticos tratados con anticuerpo anti-OSM de cabra o IgG de cabra control. 7a = Puntuaciones clínicas. 7b = Espesor de la pata

Figura 8: Comparación de datos histológicos entre la infiltración en la articulación y el daño en el cartílago en ratones artríticos con colágeno. 8a & b: Ratones de control que presentan infiltración extensa de la articulación por PMN y células mononucleares (8a) y destrucción superficial de cartílago artícular, caracterizada por infiltración extendida de neutrófilos (8b). 8c & 8d: Articulaciones representativas de un animal tratado con anti-OSM con artritis normal/benigna, que demuestran un nivel marcadamente reducido de infiltrado celular con cartílago articular
intacto.

Figura 9: Ensayo de MTS y HePG2 B6 sPAP para N-(1H-pirazol[3,4]pirimidin-4-il)benzamida que muestra una inhibición dependiente de la concentración de la liberación de sPAP inducida por la OSM

Figura 10: Ensayo de MTS y TNF\alpha sPAP para N-(1H-pirazol[3,4]pirimidin-4-il)benzamida que muestra la inhibición limitada de la liberación de sPAP inducida por TNF\alpha a partir de células A549.

Figura 11: Inhibición del anticuerpo de la producción de sPAP en el ensayo de HepG2 B6. M2-M4 denota el suero de ratón procedente de cuatro ratones individuales; OM5-6.1, OM5-6.10, OM&-10.111 denotan el sobrenadante del hibridoma derivado de manera experimental.

Figura 12: Competición de la OSM-GST mutante de tipo salvaje y fusión con la OSM de tipo salvaje unida a placa para el enlace con gp130-Fc en un ELISA.

Figura 13: Gráficos O.D, de tres mutantes OSM-GST que muestran menos actividad en la conducción de la producción de sPAP en células HepG2.

Se describirá ahora la presente invención por medio de ejemplos, únicamente con referencia a los dibujos que acompañan; en los que:

Ejemplo 1 Detección de la OSM en cultivos de tejido sinovial ex vivo

Experimento 1

Se diseccionó de manera mecánica el tejido sinovial excitado fresco de pacientes diagnosticados que tenían artritis reumatoide, osteoartritis o juanetes usando agujas hipodérmicas estériles para producir aproximadamente 1 mm^{3} de fragmentos. Se colocaron estos en pocillos de 200 \mul de fondo plano sobre placas de cultivo de tejido con 96 pocillos (Costar) a las cuales se añadió RPMI 1640 (Sigma) suplementado con suero de macho AB^{+} inactivado térmicamente al 10% (North London Blood Transfusion Centre, hepes 10 mM, piruvato de sodio al 1%, aminoácidos no esenciales al 1% (todos de Sigma), l-glutamina 4 mM (Hyclone) 100 U/ml de penicilina + 100 \mug/ml de estreptomicina (Hyclone) (medio humano completo, CHM) y se incubaron a 37ºC.

Se recogieron las muestras de 100 \mul/pocillo de sobrenadante del cultivo en los días 0, 2, 5 y 9 y se congelaron a -20ºC, y a continuación se ensayaron respecto de la OSM mediante Elisa. (Quantikine R&D Systems). Se muestran los datos en la Fig 1a. Se detectó la OSM segregada en las muestras sinoviales derivadas de RA, pero no entre las derivadas del sinovio de OA o en los pacientes de control no artríticos. Los niveles de la OSM en los cultivos de tejidos de RA fueron máximos alrededor del día 5 de incubación, alcanzando una concentración de aproximadamente 1400 \mug/ml y el resto mayor de 800 pg/ml en el día 9.

Experimento 2

Se lavó tejido sinovial en PBS y se retiró el tejido graso: Se usaron tijeras estériles para cortar el tejido en fragmentos pequeños (1-4 mm). Se lavó este tejido en PBS antes del uso. Se pesó el tejido y se plaqueó directamente en una placa con 24 ó 48 pocillos (Costar), 100 mg/pocillo. Se cultivó el tejido a 37ºC en CO_{2} al 5% en 1,5 ml de Medio Eagle modificado por Dulbecco (Sigma) suplementados con suero humano AB^{+} inactivado térmicamente al 10% (Sigma), L-glutamina 2 mM (Life Technologies), 200 U/ml de penicilina y 200 \mug/ml de estreptomicina (Life Technologies), 480 U/ml de nistatina (Sigma), 50 \mug/ml de gentamicina (Life Technologies) y Hepes 10 mM (Sigma), esterilizado mediante filtro. En el día 3 se eliminaron los sobrenadantes y se ensayó para OSM en un ELISA usando anticuerpos emparejados (R&D Systems).

Los cultivos de tejido sinovial procedentes de una biopsia de rodilla de pacientes con RA u OA inflamada segregan de manera espontánea OSM. Tras el período de incubación de 3 días, el nivel medio de la OSM en el sobrenadante del cultivo de los cultivos de RA fue de 246 pg/ml (intervalo 30 a 982, n = 12) y entre los cultivos de OA fue de 473 pg/ml (intervalo 44 a 2001, n = 14). Se segregó OSM por el tejido sinovial inflamado pero no en reposo (Figura 1b).

Ejemplo 2a

Diferenciación de células THP-1

Células THP-1 de línea promonocítica humana (ECACC) se pasaron dos veces semanalmente por RPMI suplementado con FCS inactivado térmicamente al 10%, hepes 10 mM, aminoácidos no esenciales al 1% (todos de Sigma), L-glutamina 4 mM (Hyclone), 100 U/ml de penicilina + 100 \mug/ml de estreptomicina (Hyclone) (medio completo, CM) y a continuación se añadió PMA (Sigma) a las células lavadas en 1 \mug/ml y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Se lavaron las células x 3 en PBS precalentado, se volvieron a suspender en CM y se plaquearon a 1,5 x 10^{5} células/ml en placas de fondo plano con 96 pocillos (Costar). Se incubaron las placas durante 48 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%, se lavaron a continuación con PBS, se sustituyó el medio, y se incubaron durante 24 horas más. Se lavaron las placas x 1 en PBS antes del uso.

Ejemplo 2b

Preparación de monocitos de sangre estimulados con IFN-gamma

Se diluyeron células mononucleares de cultivo humano (Noorth London Blood Transfusion Centre 1:3 con PBS, se esparcieron sobre Lymphoprep (Nycomed UK) y se centrifugaron a 600 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las PBMC cosechadas 3 veces en PBS, se recontaron, y se volvieron a suspender en 80 ml de RPMI 1640/FCS al 10% a 5 x 10^{6} células/ml. Se colocaron 20 ml en cada uno de cuatro matraces de 175 cm^{2} y se incubaron durante toda la noche a 37ºC para permitir adherirse a los monocitos. Se descartaron las células no adherentes, y las células adherentes se machacaron tras la incubación con verseno enfriado en hielo 4ºC durante 15 minutos. Se lavaron las células dos veces en PBS, se volvieron a suspender en RPMI 1640 + suero humano inactivado térmicamente al 10% (Sigma) a 6,9 x 10^{5}/ml y se colocaron 250 \mul de suspensión celular en cada uno de los pocillos de una placa con 96 pocillos de fondo plano (Costar). Se añadieron 100 IU/ml de IFN\gamma (Genzyme) a la mitad de la placa, se dejó la otra mitad como control. Se incubaron las placas durante toda la noche a 37ºC, con CO_{2} al 5% antes del ensayo.

Ejemplo 2c

Estimulación de la liberación de TNF\alpha

Se consiguió Oncostatina M humana recombinante liofilizada (rhOSM) de R&D Systems, se diluyó en 10 \mug/ml de PBS estéril + BSA al 0,1% (Sigma) y se almacenaron alícuotas a -20ºC hasta su uso. Se añadió a rhOSM CM o LPS derivada de E. coli, en pocillos triplicados de macrófagos, monocitos o células Thp-1, preparados como más arriba y se incubaron durante 7 horas a 27ºC, con CO_{2} al 5%. Se cosecharon los sobrenadantes y se congelaron a -20ºC hasta ensayar la proteína de TNF\alpha mediante ELISA. En los ensayos diseñados para el coensayo del ERNm de TNF\alpha, se incubaron las células como más arriba durante 4 h, se lavaron una vez en PBS y se lisaron en tampón de extracción de ARN (RNAzol).

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Se detectó el ARN como sigue. Se preparó el ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se almacenó a -80ºC agua tratada con DEPC. Para la RT-PCR se transcribió inversamente 1 \mug de ARN usando un cebado de oligo dT (kit de síntesis de la cadena de ADNc en primer lugar, Pharmacia Biotech) y se sometió el ADNc resultante a 30 ciclos de PCR usando los siguientes cebadores para TNF\alpha (Clontech amplimers); hacia delante - GAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCA, hacia atrás - GCAATGATCCCAAAGTAGACCTGCCCAGAC. Se separó el producto amplificado (44 pb) mediante electroforesis en gel de azarosa (2%) y se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio.

Ejemplo 2d

OSM induce la producción de TNF\alpha en células humanas del linaje de los monocitos

Se indujo la línea Thp-1 promonocítica humana para diferenciado usando PMA, se lavó cuidadosamente, y se incubó con la OSM recombinante humana tal como se ha descrito más arriba. Se retiraron los sobrenadantes del cultivo a las 8 horas y se evaluaron respecto de la producción de TNF\alpha mediante un ELISA específico (TNF Quantikine, R&D Systems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. OSM indujo una liberación de TNF\alpha relacionada con la dosis, 1 ng/ml de la OSM medible más arriba y un máximo a 200-500 ng/ml, alcanzando de manera rutinaria los niveles segregados mayores de 2500 pg/ml de TNF\alpha. Se muestra en la Fig 2 un experimento representativo. La expresión del mensaje de TNF\alpha, medida mediante RT-PCR tal como se ha descrito más arriba fue fuertemente aumentada en as células THP-1 que se incubaron durante 4 h con 100 ng/ml de la OSM, en relación con las células control no estimuladas (Fig 2).

De manera importante, la inducción de TNF\alpha no fue debida a la endotoxina contaminante ya que la preebullición de la OSM eliminó completamente la secreción de TNF\alpha (no se muestran los datos). También, la eliminación de la OSM mediante inmunoprecipitación usando anticuerpos específicos suprimió la actividad (no se muestran los datos). Se extendieron estos hallazgos al incluir monocitos de sangre humana, preactivados con interferón-\gamma, y macrófagos de sangre humana, diferenciados en cultivos de 7 días. Ambos tipos de células, cuando se coincuban durante 8 h con la OSM, segregan TNF\alpha, tal como se midió mediante ELISA. La secreción media de TNF\alpha por los monocitos fue 1447 pg/ml (intervalo 137-4709 pg/ml; n = 4 donantes) y 542 pg/ml mediante los macrófagos (intervalo 62-1428 pg/ml; n = 3 donantes).

Ejemplo 3a

Ensayo de degradación del cartílago

Se mantuvo cartílago del septum nasal bovino a 4ºC durante toda la noche tras el sacrificio. Se cortaron discos de 2 mm de diámetro a partir de porciones de 2 mm y se lavaron dos veces en HBSS. Se incubaron tres discos por pocillo de una placa con 24 pocillos (Costar) a 37ºC, con CO_{2} al 5% durante 24 h en un volumen de 600 \mul de DMEM (Sigma) que contenían HEPES 25 mM suplementado con glutamina 2 mM, 100 \mug/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina y 2,5 \mug/ml de anfotericina B (medio de degradación del cartílago, CDM). Se cultivó el cartílago en pocillos cuadriplicados en los que había: sólo 600 \mul de cDM, sólo 2,10 o 50 ng/ml de TNF\alpha recombinante humana, sólo 10 ng/ml de rhOSM (R&D systems) o TNF\alpha + OSM y se incubaron durante 7 días a 37ºC, con CO_{2} al 5%. Se cosecharon los sobrenadantes y se sustituyeron con medio fresco que contenía reactivos de ensayo idénticos en el día 1. Se continuó el experimento durante 7 días más y en el día 14 se retiraron todos los medio y el cartílago restante se digirió con 4,5 mg/ml de papaína (Sigma) en tampón fosfato 0,1 M pH 6,5, que contenía EDTA 5 mM y clorhidrato de cisteína 5 mM, incubando a 65ºC durante 16 h, para determinar el contenido de hidroxiprolina restante de los fragmentos de cartílago. Se midió el nivel acumulativo de OH-prolina liberada en el medio el día 14 y se expresó como porcentaje del total liberado tal como se muestra a continuación.

Ejemplo 3b

Ensayo de hidroxiprolina

Se evaluó la liberación de hidroxiprolina (como una medida de la degradación del colágeno) usando una modificación del procedimiento de placa de microvaloración (Bergmann I y Loxley R. (1963) Anal. Biochem. 35 1961-1965. Se diluyó Cloramina T (7%) W/V) en tampón de acetato citrato 1:4 (57 g de acetato de odio, 37,5 g de citrato de trisodio, 5,5 g de citrato ácido, 385 ml de Propan-2-ol por litro de agua) Se diluyó 1:3 P-dimetilaminobenzaldehído (DAB; 20 g en 30 ml de ácido perclórico al 60%) en propan-2-ol. Se hidrolizaron los especimenes en HCl 6 M durante 20 h a 105ºC y se neutralizó el hidrolizado secando sobre NaOH al vacío usando una Savant Speed Vac. Se disolvió el residuo en agua y se añadieron 40 \mul de muestra o patrón (hidroxiprolina; 5-30 \mug/ml) a las placas de microvaloración conjuntamente con el reactivo de Cloramina- T y a continuación después de 4 minutos con el reactivo DAB (150 \mul). Se calentó la placa a 65ºC durante 35 min, se enfrió y se determinó la absorbancia a 560 nm.

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Ejemplo 3c

Sinergia de la OSM con TNF\alpha para aumentar la liberación de MMP1 y colágeno a partir de explantes de cartílago, ex vivo

Se cultivó cartílago nasal bovino en pocillos cuadriplicados durante 14 días en presencia o ausencia de la OSM o TNF\alpha sólo (ambos de R&D Systems), o en combinación, tal como se ha descrito más arriba. Se evaluaron los sobrenadantes del cultivo para la actividad de la colagenasa total en el día 7 y para el colágeno liberado en el día 14. Los datos de la Fig 3b demuestran que ni OSM ni TNF\alpha solos, usados a 10 ng/ml o 50 ng/ml, de manera respectiva, indujeron secreción significativa de MMP1. Sin embargo, la combinación de la OSM y TNF\alpha usados a estas concentraciones, hicieron inducir una liberación medible de MMP1, Se acompañaron estos hallazgos por una sinergia notable entre OSM y TNF\alpha para aumentar la liberación de colágeno a partir del cartílago. La Fig 3a muestra que OSM solo a 10 ng/ml no hace inducir la liberación de colágeno, mientras que únicamente una concentración más alta del TNF\alpha usado (50 ng/ml) tuvo un pequeño, pero demostrable efecto (menos de un 10%). Sin embargo, la combinación de 10 ng/ml de la OSM con 50 0 10 ng/ml de TNF\alpha dieron como resultado una liberación de colágeno mayor de un 80% y un 30%, de manera respectiva.

Ejemplo 4a

Estimulación de PBMC mediante L-selectina

Se aislaron células mononucleares a partir de células mononucleares de cultivo humano tal como se ha descrito más arriba. Se plaquearon 5 x 10^{5} células en 0,5 ml de volumen y se incubaron durante 24 h a 37ºC, con CO_{2} al 5% con anticuerpos monoclonales anti-L-selectina fucoidan de 60 - 80 kD M en peso (Sigma), LAMI-3 y TQ1 o un isotipo emparejado con el anticuerpo de IgG control (todos de Coulter). Se evaluaron los sobrenadantes para OSM usando un ensayo ELISA específico (Quantikine, R&D Systems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 4b

La ligadura de L-selectina induce la secreción de la OSM

Se incubaron durante 24 h células mononucleares procedentes de donantes sanos con anticuerpos L-selectina anti-humanos, (TQ1 o LAM-1), o un anticuerpo control de isotipo emparejado, y se evaluaron los sobrenadantes del cultivo mediante ELISA respecto de la OSM. Los datos de la Fig 4a muestran una inducción de la OSM dependiente de la dosis usando anticuerpos anti-L-selectina. El anticuerpo control tuvo un efecto mínimo. A continuación se investigó la capacidad del fucoidan, agonista de la L-selectina, para inducir OSM a partir de cultivos de células mononucleares. La Fig 4b muestra que el fucoidan fue un estimulante poderosos de la secreción de la OSM, induciendo niveles similares a aquellos vistos en los cultivos de biopsia sinovial de RA y OA (Ejemplo 1, Experimento 2 Fig 1b).

Ejemplo 5a

Inmunohistoquímica

Se congelaron muestras de tejido humano fresco en hexano líquido enfriado mediante CO_{2} y se almacenaron en fase vapor de N_{2} líquido hasta su uso. Se cortaron secciones de criostato de 7 mm sobre 3-aminopropiltrietoxisilano (APES) (Maddox P. y col J. Clin Path 40; 1256-1260, 1987) recubiertos por portas de vidrio y se fijaron durante 10 minutos a 4ºC en paraformaldehído al 2%. Se bloqueó la actividad de la peroxidasa endógena durante 20 minutos en H_{2}O_{2} al 0,05%. Se obtuvieron anticuerpos monoclonales primarios no conjugados a partir de las siguiente fuentes: CD62P, CLB, Países Bajos; CD62E y gp130 R&D Systems Reino Unido. Se aplicaron los anticuerpos primarios en dilución óptima durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se incubaron las secciones de control negativo con un anticuerpo monoclonal anti-BrdU (SIGMA) usado a concentraciones de proteína equivalentes a las de los anticuerpos de ensayo. Se usó un anticuerpo biotinilado, seguido por ABC marcado mediante peroxidasa (Vector Elite) para marcar el anticuerpo primario. Se desarrolló la peroxidasa con un sustrato de DAB (3,3' Diaminobenzidina) (SIGMA).

Ejemplo 5b

Codistribución de selectinas y receptores de la OSM en el sinovio de RA

Se tiñeron las secciones congeladas del tejido sinovial de RA inflamado usando anticuerpos específicos para gp130, y las P y E selectina tal como se ha descrito más arriba. La fotomicrografía (a) de la Fig 5 demuestra que el endotelio vascular de RA se tiñó fuertemente positivo para gp130.

La tinción del sinovio de RA para la expresión de las P- y E- selectina reveló un modelo de tinción idéntico para gp130, restringido a las células endoteliales vasculares (Fig 5 b y c de manera respectiva). Señalar en la Figura 5c el infiltrado de células mononucleares perivasculares asociado con la tinción con E-selectina Fue negativa la tinción de secciones seriales usando anticuerpos primarios control sobre células endoteliales vasculares (Fig 5, paneles c y d).

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Ejemplo 6a

Tratamiento con anticuerpos anti-OSM de la artritis inducida mediante colágeno

Se indujo la artritis inducida mediante colágeno en ratones DBA/1 machos (8-12 semanas de edad) mediante la inmunización con colágeno de tipo II bovino nativo (CII) tal como se ha descrito más arriba (Plater-Zyberk C. Clin Exp. Immunol 98:442-7 1994 y Plater-Zyberk C. Nature Medicine 1: 781-5, 1995). A partir del día 16 después de la inmunización CII, se monitorizaron los ratones diariamente para las señales de enrojecimiento y tumefacción de la articulación. Se examinaron los ratones tres veces por semana a partir de la primera aparición de los síntomas clínicos y se graduó cada extremidad para la gravedad de la enfermedad usando las siguientes puntuaciones visuales: 0 = normal. 0,5 = artritis en 2 o más dígitos, 1 = tumefacción y eritema ligeros de la pata sin implicación de los dígitos. 2,5 = igual que en 1 con implicación del dígito, 3 = grave tumefacción con deterioro del movimiento, 3,5 = igual que en 3 con implicación del dígito. Se midió el espesor de la pata usando calibres (Proctest 2T, Kroeplin
Langenmesstechnik).

Se trataron los ratones DBA/1 inmunizados mediante CII tras el comienzo de la enfermedad mediante inyecciones intraperitoneales de 100 mg de anticuerpo de la OSM cabra anti-ratón (R y D Systems, cat. Nº AF-495-NA). Se evaluó la progresión de la enfermedad tal como se ha descrito más arriba. En el día 14 después del comienzo, se sacrificaron los ratones mediante dislocación cervical y se recogieron las patas para el examen histopatológico.

Ejemplo 6b

Evaluación histológica de las articulaciones de ratón artrítico

Se desollaron los miembros y se diseccionaron las rodillas y la patas. Se fijaron las articulaciones en formalina tamponada al 10% durante 4 días (rodillas) o 1 día (patas) y se descalcificaron durante 3 días en ácido fórmico al 25%, se deshidrataron y se embebieron en cera de parafina. Se desencerraron las secciones sagitales (5-7 mm) de las articulaciones y se tiñeron con Safranina O, o se contratiñeron con hematoxilina verde/hierro rápida (tal como se describe en Plater-Zyberk Nature Medicine más arriba) se graduó a ciegas la sinovitis desde 0 (sin infiltración) hasta 3 (infiltración extensa e hiperplasia sinovial). El grado de pérdida de intensidad de la tinción con Safranina O es indicativo del agotamiento del proteoglicano, se puntuó sobre una escala desde 0 (cartílago completamente teñido) hasta 3 (agotamiento completo y pérdida de cartílago).

Ejemplo 6c

Detección de ARNm de la OSM en tejidos de articulaciones de ratones artríticos mediante colágeno

Se sacrificaron ratones artríticos, más animales control no tratados y se retiraron las patas y los pies y los trozos se congelaron en nitrógeno líquido seguido por un almacenamiento a -80ºC. Se preparó ARN triturando cada extremidad en RNAzol usando un homogeneizador ultraturrax mecánico. Se dejó sedimentar el material particulado, y a continuación se mezcló el sobrenadante con 1/10 de volumen de cloroformo y se centrifugó para separar la fase acuosa que contenía el ARN. Se precipitó el ARN usando RNAmate (BioChain Institute Inc, San Leandro, California) para eliminar los proteoglicanos contaminantes. Tras el lavado en etanol al 75%, se disolvió el ARN total en DEPC-agua y se transcribió inversamente usando el kit de primera cadena de ADNc de Pharmacia y el cebado mediante oligo dT. Se llevaron a cabo las reacciones PCR usando los siguientes cebadores (cebadores de uso de Life Technologies) derivados de la secuencia de la OSM de ratón (Yoshimura A. y col EMBO Journal 15 1055-1063, 1996): GGGTGTCCTAC
CAAGGAACA, CTGAGACCTTTCAAGAGGAC. Tras 30 ciclos de PCR, se detectaron los productos de reacción (379 pb) usando electroforesis en gel de azarosa, se usó RT-PCR para detectar el ARNm de la OSM en las patas de ratones artríticos tal como se ha descrito más arriba. La Fig 6 muestra que se aumentaron los niveles del producto de la PCR específico para OSM en las articulaciones tomadas de los animales con un progresivo aumento de las puntuaciones de las enfermedades clínicas. En contraste, se detectó poco o no se detectó mensaje de la OSM en los animales control.

Ejemplo 6d

La neutralización de la OSM mejora la artritis inducida por colágeno

Para ensayar de manera directa la hipótesis de que la neutralización puede mejorar los síntomas clínicos de la artritis, se administraron dos eyecciones de 100 \mug de anticuerpo policlonal neutralizante de la OSM intraperitonealmente en los días 1 y 3 tras la primera aparición de la artritis clínica en un grupo de 6 ratones. En paralelo, se trataron de manera idéntica un segundo grupo de 6 ratones artríticos, usando IgG de cabra no inmune en vez de anti-OSM. Se puntuaron los ratones para la gravedad clínica de la artritis, y se midió la tumefacción de las patas de los individuos durante un período de seguimiento de 11 días tras la inyección del segundo anticuerpo. Los ratones tratados con IgG de cabra control desarrollaron una artritis progresiva, acompañada por un incremento en la tumefacción de la
pata.

En marcado contraste, los ratones tratados con anticuerpo anti-OSM desarrollaron una artritis significativamente menos severa en términos de puntuación clínica y de la tumefacción de la pata (Fig 7 a y b). También, el número de patas artríticas fue significativamente reducido en los animales tratados con anti-OSM en comparación con los tratados con IgG control, demostrando que este protocolo terapéutico fue efectivo en los animales protegidos que tenían ya establecida la enfermedad a partir de la progresión adicional de la enfermedad. (No se muestran los datos). Se repitió este experimento de manera idéntica, usando 7 ratones por grupo y los datos de emparejamiento exactamente producidos (no se muestran los datos).

Se confirmó la reducción de la gravedad clínica resultante del tratamiento con anticuerpo anti-OSM mediante el examen histológico post-mortem de las patas artríticas en el día 14 después del comienzo de la enfermedad. Se muestran en la Figura 8 los datos histológicos comparando la infiltración de la articulación y el daño del cartílago en el día 14 de ratones artríticos con colágeno tratados con IgG control o anticuerpo anti-OSM. Los ratones tratados con IgG control presentaron infiltración extensiva del cartílago por PMN y células mononucleares (Fig 8a). Esta se acompañó por la destrucción superficial del cartílago articular caracterizada por infiltración generalizada de neutrófilo (Fig 8b). En contraste, la Fig 8c y d muestra articulaciones representativas de un animal tratado con anti-OSM con artritis mínima, demostrando un nivel marcadamente reducido de infiltrado celular, con el cartílago articular intacto. De manera adicional, se puntuaron los cartílagos a ciegas para la apariencia histopatológica del cartílago y el sinovio, y se informaron como normal, moderado o grave. Se evaluaron un total de 73 articulaciones de individuos por grupo de tratamiento. En la Tabla 1 se resumen los datos. En los animales tratados con anti-OSM, el 47% de las articulaciones examinadas fueron normales o presentaron una sinovitis ligera, en comparación con solo un 6% en el grupo tratado con IgG control. De manera similar, en los ratones tratados con anti-OSM, el 58% de las articulaciones examinadas mostraron poco o ningún daño del cartílago en comparación con el 21% en el grupo tratado con la IgG control: Las articulaciones de los dos ratones tratados con anti-OSM, con signos claros de enrojecimiento y tumefacción en la articulación en el día 1 de tratamiento mostraron de manera subsiguiente una mejora completa de la artritis y ni presentaron infiltración celular ni anormalidades visibles en el cartílago o sinovio (no se muestran
los datos).

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TABLA 1 Puntuación histológica de las articulaciones de los ratones tratados con anti-OSM o IgG control

2

Articulaciones totales examinadas: 73 articulaciones/tratamiento.

Ejemplo 7

Identificación de pequeñas moléculas orgánicas antagonistas

Se identificaron pequeñas moléculas orgánicas antagonistas de la OSM mediante la inhibición de la respuesta biológica inducida por la OSM a partir de la línea celular indicadora sin producir toxicidad celular abierta. Se ensayó también como control el efecto de los compuestos sobre una línea de células responsable de TNF\alpha.

Ejemplo 7a

Expresión y purificación de la OSM humana

Se amplificó un fragmento de ADN que codifica la OSM humana (Homs) con las secuencia líder de 25 aminoácidos eliminada usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) a partir de una biblioteca de ADNc de leucocitos activados usando los cebadores de los oligonucleótidos sintéticos 5'-GCATAGGATCCGGCTATAGGCAGCTGCTCG-3' y 5'-ATCGCGAATTCCTACCGGGGCAGCTGTCCCCT-3', diseñados a partir de la secuencia EMBL para Homs (número de acceso M27288). Se subclonó este producto de PCR en pCR2.1 (Invitrogen) para dar pCR2.1hOSM. Se creó un emplazamiento de rotura de la endonucleasa de restricción SaII dentro del emplazamiento Factor Xa en el vector de expresión bacteriana pGEX-3X (Pharmacia) mediante la inserción de AC por TG usando el kit de mutagénesis "Quickchange" dirigido al emplazamiento (Stratagene) para crear la secuencia representada a continuación (SEC DE ID 7):

3

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Tras la verificación del inserto de la OSM en la secuencia en pCR2.1hOSM, se amplificó mediante PCR el ADN que codifica la forma madura de la OSM humana a partir de este vector usando el cebador hacia delante 5'-GATACGATCGTCCTCATCGAGCGGCTATAGGCAGCTGC-3' que contenía un emplazamiento para la endonucleasa de restricción BsmBI (subrayado). Este producto de PCR contiene la forma madura de la OSM humana sin la secuencia líder y sin los aminoácidos 31 procedentes del término C que se eliminó tras la maduración de la proteína. Tras la PCR, se purificó el fragmento de ADN amplificado, se digirió con los enzimas de restricción BsmBI y EcoRI y se subclonó en el vector pGEtC-3X modificado (Pharmacia: conteniendo el ADN que codifica GST) que se restringió con SaII y EcoRI para generar un plásmido designado pGEX 196. Tras la verificación de la secuencia, se transformó el plásmido pGEX196 en BLR-DE3 de E. coli (Novagen). Se cultivaron las células transformadas en medio 2xYT+G (tristona 16 g/l; extracto de levadura 10 g/l; NaCl 5 g/l; pH 7,0 con NaOH; glucosa al 2%) suplementado con 100 \mug/ml de ampicilina.

Para preparar la proteína purificada se diluyó 1:100 un cultivo de PGEX 196 durante toda la noche en BLR-DE3 de E. coli y se hizo crecer este cultivo a 37ºC a una A_{600nm} de 0,8. Se indujo la expresión de la proteína de fusión GST-hOSM mediante la adición de IPTG 0,1 mM (Isopropil-1-tio-\beta-D-galactopiranósido) y se mantuvo el cultivo durante dos horas más.

Se aisló GST-hOSM a partir del cultivo de E. coli mediante purificación discontinua. Se cosechó un cultivo bacteriano de 3 litros mediante centrifugación a 3000 rpm y se volvió a suspender el residuo resultante en 50 ml de PBS enfriado en hielo (Phosphate Buffered Saline) que contenía comprimidos de inhibidor de la proteinasa (Boerhinger). Se añadieron 5 ml de lisozima y se incubó la suspensión celular en hielo durante 5 minutos. Se sonicaron las células a 4ºC y se añadió Triton X100 al 1% y ditiotreitol 10 mM. A continuación se finalizó el lisado sobre la mezcla final a 4ºC durante 10 minutos, y a continuación se centrifugó a 14000 g. Se añadió el sobrenadante a glutatión agarosa (Sigma cat nº G4510) y el final sobre la mezcla final a 4ºC durante 30 minutos. Se centrifugó ligeramente la suspensión, se aspiró el sobrenadante y se lavó la azarosa sedimentada dos veces con PBS enfriado en hielo. Se añadió el tampón de elusión (glutatión 20 mM, Tris 100 mM pH 8,0, NaCl 100 mM; de nuevo pH 8,0) y se incubó la suspensión en hielo durante 5 minutos. Se recogió el sobrenadante y se analizaron las fracciones mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio/poliacrilamida (SDS-PAGE), seguida por tinción en tinte azul brillante de Coomassie, para confirmar la integridad de la proteína purificada.

Se llevaron a cabo los experimentos de optimización de la rotura proteolítica usando Factor Xa y trombina, con la trombina dando como resultado la cantidad óptima de Homs tal como se demostró mediante el análisis SDS-PAGE teñido con azul brillante de Coomassie. Se consiguió la separación de los productos de GST y OSM mediante la cromatografía de intercambio iónico y se verificó el producto de la OSM purificada mediante el secuenciamiento N-terminal y la espectrometría de masa.

Ejemplo 7b

HepG2 B6: Ensayo de sPAP inducido por la OSM

Se transfectó de manera estable una línea de células HepG2 (ECACC) con seis elementos de respuesta (RE) funcional STAT3 corriente arriba del ADNc de sPAP (fosfatasa alcalina placental segregada) tal como se describe a continuación para formar HepG2B6. STAT3 (transductor de la señal y activador de la transcripción) es un intermedio en la cascada de señalamiento intercelular de la familia de la citoquina IL-6. Tras la dimerización de los receptores superficiales celulares STAT3 se fosforila y a continuación se enlazará con el RE del ADN en el núcleo y activa el ADN corriente abajo, en este constructo el ADN es sPAP. De esta manera, se puede impulsar esta línea para producir sPAP mediante incubación durante toda la noche en Oncostatina M.

Se construyó tal como sigue un gen indicador de la fosfatasa alcalina placental segregada (sPAP) responsable de STAT. Inicialmente se clonaron una pareja de oligonucleótidos que contenían tres copias de un elemento de respuesta STAT3 palindrómico (Wegenka U. M. y col Mol. Cell. Biol., 1993 Vol 13 p 276-288 Tabla 1 en p 277) y un emplazamiento 5' XhoI en el único emplazamiento SaI1 del plásmido pBluescript tkSPAP para crear pIIP3-tk-SPAP. Se encontraron seis copias de un oligonucleótido sintético que codifica el elemento de respuesta STAT3 en el promotor del Fibrinógeno \beta (Dalmon y col, Mol. Cell. Biol.; 1993; 13: 1183-1193 Figura 9 la secuencia h\betaFG que incluye el motivo de Consenso IL6RE y el líder TTG sin la cola GAT) se clonaron a continuación en el emplazamiento Xho1 de ppIIP3-tk-SPAP para generar pIIx6/IIP3-tk-SPAP. Tras el secuenciamiento para confirmar el número de elementos de respuesta, se digirió pIIx6/IIP3-tk-SPAP con NruI y XbaI para aislar un fragmento de ADN que contenía los elementos de respuesta 9STAT y la secuencia que codifica tk-SPAP. Esta se transfirió de manera subsiguiente entre los emplazamientos NruI y XbaI del plásmido pcDNA4 (Invitrogen) (sustituyendo el promotor CMV) para crear un gen indicador de SPAP que contenía los elementos responsables de 9 STAT3, y el marcador seleccionable Peor para el establecimiento de la línea de células HepG2.

Se hicieron crecer células HepG2 (ECACC) en medio DMEM suplementado con L-glutamina 2 mM, NEAA al 1% y suero fetal de ternero HI al 10% a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%, humedad 92%. Para la transfección con el indicador STAT-sPAP, se plaqueron las células hasta confluencia del 1% en una placa de cultivo de tejido de 10 cm y se transfectaron con 10 \mug del vector indicador STAT-sPAP usando un kit de transfección de fosfato de calcio (Invitrogen). Tras la selección clonal en presencia de 1 mg/ml de líneas de células individuales G418 se seleccionaron para la capacidad de Il-6 para producir un incremento en la expresión de sPAP a partir del gen indicador
STATsPAP.

Se plaquearon células HepG2B6 en placas con 96 pocillos hasta una concentración final de 3 x 10^{4} células por pocillo en 100 \mul de medio (DMEM (Sigma), HI FCS al 10%, aminoácidos no esenciales al 1%, glutamina 2 mM,, 500 \mug ml^{-1} de G418 (todos de Life Technologies)). Se dejó a las células equilibrar durante 48 horas. Se fabricaron supuestos compuestos sólidos anti-OSM hasta una dilución de almacenamiento de 20 mM en DMSO y se diluyeron en serie 1:3 en DMSO. Estos se diluyeron a continuación en medio de ensayo HepG26B, este es como el medio anterior pero con FCS inactivado térmicamente al 1%, se sustituyó la baja actividad de la fosfatasa alcalina (Life Technologies) por HI FCS al 10%. Se diluyeron los compuestos 1:3 a partir de una concentración superior de 200 \muM hasta una concentración final de 0,09 \muM en una concentración final de DMSO al 1%./Esto es, 200, 66,67, 22,22, 7,41, 2,47, 0,82, 0,27, 0,09 y 0 \muM). Se retiró el medio viejo de los pocillos y se sustituyó con compuesto diluido que contenía también 2 ng ml^{-1} de la OSM (R&D Systems), se incubaron las células durante 20 h más. Se llevó a cabo cada dilución por triplicado. Se retiraron 20 \mul de medio de cada pocillo y se evaluaron respecto de la actividad de sPAP usando pNPP (p-Nitrofenil fosfato; Sigma), como sustrato. La fosfatasa alcalina endógena se bloqueó con L-homoarginina. La densidad óptica del sustrato se lee a 405-650 nm. Se representa gráficamente la concentración de compuesto frente a OD como una medida del sPAP producido y se puede analizar para determinar los valores
DI50.

Ejemplo 7c

Células A549; Ensayo de SPAP inducida por TNF\alpha

Este ensayo usó células A549 que se habían transfectado de manera estable con un gen indicador, que comprende la región responsable de la citoquina del gen de la E-selectina acoplado con la fosfatasa alcalina (Ray y col., Biochem J 328:707-715, 1997). Se puede impulsar esta línea de células transfectadas para producir sPAP mediante incubación durante toda la noche con TNF\alpha.

Se plaquearon células A549 en placas con 96 pocillos hasta una concentración final de 5 x 10^{4} células por pocillo en 100 \mul de medio. Se dejaron equilibrar las células durante 24 horas. Se fabricaron los supuestos compuestos sólidos hasta una dilución de almacenamiento de 20 mM en DMSO y se diluyeron en serie 1:3 en DMSO. A continuación, éstos se diluyeron en medio (DMEM, FCS inactivado térmicamente al 1%, baja actividad de la fosfatasa alcalina, aminoácidos no esenciales al 1%, Glutamina 2 mM, 500 \mug ml^{-1} de G418 (, (todos de Life Technologies), para dar una respuesta de concentración de 0,09-200 \muM en una concentración final de DMSO al 1%. Se retiró el medio viejo de los pocillos y se sustituyó con compuesto diluido que también contenía 3 ng ml^{-1} de TNF\alpha (R&D Systems), se incubaron las células durante 20 horas más. Se llevó a cabo cada dilución por triplicado, se retiraron 20 \mul de medio de cada pocillo y se evaluaron respecto de la actividad de sPAP usando p-Nitrofenil fosfato (Sigma, como sustrato. Se bloqueó la fosfatasa alcalina endógena con L-homoarginina (Sigma). Se leyó la densidad óptica del sustrato a 405-650 nm. Se representó gráficamente la concentración de compuesto frente a OD como una medida del sPAP producido y se puede analizar para determinar los valores de DI50.

Ejemplo 7d

Ensayo de viabilidad celular

Se midió la viabilidad celular como la capacidad de los enzimas deshidrogenadas en células metabólicamen-
te activas para reducir un compuesto de tetrazolio (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(sulfo-
fenil)-2H-tetrazolio, sal inerte; MTS para un producto de formazán soluble que se puede medir directamente a
490 nm.

Se preparó una solución de 2 mg/ml de MTS (Promega) que contenía 0,046 \mug/ml de metosulfato de fenazina (PMS; Sigma) en PBS de Dulbeccos. Tras la retirada del medio para el ensayo de la actividad de la sPAP, se añadieron 20 \mul/pocillo de MTS/PMS. A continuación se incubaron las células durante 45 minutos más. A continuación se midió la absorbancia a 490 nm usando una referencia de 630 nm.

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Ejemplo 7e

Antagonistas

N-(1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il]benzamida (Davoll y Kerridge, J. Chem. Soc. 2589, 1961) (GW 340442X) produjo una inhibición dependiente de la concentración de la liberación de sPAP inducida por la OSM con una DI_{50} de 0,3 \muM (Figura 9) pero fue mucho menos potente inhibiendo la sPAP inducida por TNF\alpha (aprox. Un valor DI_{50} de 92 \muM) (Figura 10). Por tanto, este compuesto tiene una selectividad mayor de 100 veces para OSM sobre
TNF\alpha.

Ejemplo 8a

Generación y ensayo de anticuerpos de la OSM antihumanos

Se aumentaron los anticuerpos monoclonales frente a la OSM humana (R+D systems) tal como sigue; se inmunizaron ratones hembra SJL (Jackson Inc. Bar Harbor, MA) con la OSM recombinante humana (R&D Systems) con cualquier combinación de 1 \mug de antígeno de la OSM recombinante humano emulsificado en coadyuvante RIBI (RIBI, Hamilton; MT) por vía subcutánea y 1 \mug de antígeno en coadyuvante completo de Freund por vía intaperitoneal en los días 0, 3, 5 y 24 (en el día 27 se proporcionó al ratón una inyección intraperitoneal de 1 \mug de antígeno en solución salina); o 1 \mug de antígeno emulsificado en coadyuvante RIBI en los días 0, 3, 5, 24 y 54 por vía intraperitoneal (en el día 54, se inyectó al ratón con 1,5 \mug de antígeno en solución salina por vía intraperi-
toneal).

Veinticuatro horas después de la última inmunización, se sacrificaron los ratones, y se cosecharon los esplenocitos y se prepararon para la fusión. El procedimiento de fusión fue tal como se describe en Su J-L y col: Hybridoma 1998; 17(1): 47-53). De manera breve, se fusionaron los esplenocitos y las células P3X63Bcl-2-13 de mieloma (Kilpatrick KE, y col Hybridoma 1997; 16(4): 387-395) en la relación de%:1 o 1:1 usando polietilén glicol 1500 (Boehringer Mannheim, Alemania). Se volvieron a suspender las células fusionadas a 1 x 10^{6} células/ml en medio de crecimiento de hibridoma que está compuesto de un volumen igual de RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Gaithesburg, MD) y EXCELL-610 (JRH Biosciencies, Lenexa, KS) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone, Logan, UT), 1 X Factor de Clonación del Hibridoma de Origen (Igen, Gaithersburg, MD), L-glutamina 2 mM, y penicilina/estreptomicina. Se plaquearon las células en placas de microvaloración con 24 pocillos (Costar, Cambridge, MA) a 1 ml/pocillo. Veinticuatro horas más tarde, se añadieron en cada pocillo 1 ml de selección 2xHAT; 100 \muM de hipoxantina, 0,4 \muM de aminopterina, 16 \muM de timina (Life Technologies, Inc.) en medio de crecimiento de hibridoma. Tras 2 semanas de cultivo a 37ºC, se seleccionaron los sobrenadantes del hibridoma con CO_{2} al 5% para la secreción de anticuerpos anti-OSM mediante ELISA. Se llevó a cabo la clonación de la dilución limitante sobre hibridomas seleccionados.

Los sobrenadantes de hibridoma y el suero diluido se incubaron en placas con 96 pocillos que contenían OSM humana enlazada. Se detectaron los anticuerpos anti-hOSM mediante la fosfatasa alcalina de los anticuerpos anti-ratón. Los valores O.D. duplicados para los anticuerpos dieron un resultado positivo que se proporciona en la
Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

4

Tres de los sobrenadantes, y todos salvo uno de los sueros de ratón, dieron resultados positivos en el ELISA. Usando los datos de ELISA se determinó una medida cruda de la concentración de anticuerpo y los anticuerpos positivos se valoraron a continuación frente a 2 ng ml^{-1} de la OSM en el ensayo de HepG2 B6 sPAP descrito en el Ejemplo 7b. En resumen, se incubó un anticuerpo durante toda la noche con la citoquina a 4ºC antes de incubarse con las células HepG2 B6. Se evaluó la producción de sPAP tal como se ha descrito en el Ejemplo 7b. En la Figura 11 se muestran la inhibición de la producción de sPAP por los sobrenadantes del hibridoma y el suero de ratón.

Ejemplo 9a

Identificación de los residuos del enlace claves para el receptor sobre OSM

Se identificaron los emplazamientos de enlace del receptor sobre Homs inicialmente por referencia a los miembros relacionados de la familia IL6 de las citoquinas. Los emplazamientos 1 y 3 se orientan para implicarse en el enlace con la/s cadena/s específica/s de la citoquina del receptor mientras que el emplazamiento 2 se orienta para implicarse en el enlace con el componente común del receptor gp130. Los estudios de las mutaciones en el emplazamiento 2 en el factor inhibidor de la leucemia de las citoquinas de la familia IL-6 (lif) (Hudson y col (1996) J. Biol Chem 271, 11971-11978), interleuquina-6 (IL-6) (Paonessa y col (1995) EMBO J. 14, 1942-1951 y Savino y col (1994) EMBO J. 13 1357-1367) sugieren que los cambio de los residuos dentro del emplazamiento 2 pueden dar como resultado el enlace alterado con gp130. Con el fin de investigar los residuos de la OSM que son importantes para su interacción con gp130 fue necesario identificar aquellos residuos que podrían exponerse a la superficie de la OSM en la región del emplazamiento 2. Usando la información de los experimentos nmr (Hoffman y col (1996) J. Biomol. NMR 7 273-282) y de la estructura publicada de LIF (Robinson y col (1994) Cell 77 1101-16), se construyo un modelo de homología de la OSM. Se seleccionaron los residuos que ocupan las posiciones superficiales en este modelo en la región del emplazamiento 2 para la mutagénesis. Se ha determinado la estructura del complejo formado entre la hormona de crecimiento (un homólogo de la OSM) y su receptor (De Vos y col (1992) Science 255 306). Mediante la superposición del modelo de la OSM con la hormona del crecimiento, se identificaron los emplazamientos adicionales de interacción potencial entre OSM y gp130.

Basándose en estos estudios de modelización, se seleccionaron 27 emplazamientos para la mutación en OSM para investigar su interacción con gp130. Véase la Tabla 3. En cada uno de estos emplazamientos se sustituyó un residuo de alanita por el residuo de tipo salvaje.

TABLA 3

50

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Ejemplo 9b

Síntesis de las moléculas de fusión OSM-GST mutantes

Para cada una de las 27 mutaciones, se diseñó una pareja de oligonucleótidos mutagénicos. Estos tuvieron aproximadamente 33 bases de longitud y tenían de manera preferible un residuo G o C en cualquiera de los extremos. Se analizaron éstos respecto de la expresión derivada de pGEX (Pharmacia) que contenía el ADN de la OSM de "tipo salvaje" (Véase página 4) bajo el control de un promotor lac (/inducible por IPTG) (Pharmacia) y usando de manera extendida una polimerasa Pfu nativa (Stratagene). Se digirió la plantilla original de ADN con Dpnl (New England Biolabs) y el plásmido nuevamente sintetizado (que no fue un sustrato de Dpnl) se transformó en la cepa DH5alfa de E. coli (GibcoBBL/Life Technologies). Se repico un lote pequeño (normalmente 4) de colonias, se aisló el plásmido de ADN y se determinó la secuencia de ADN. Un clon mutante representativo para cada mutación junto con uno de tipo salvaje construido de manera similar se transformaron en la cadena BLR de E. coli (nada de DE3: Novagen) para la expresión de las proteínas recombinantes. Se establecieron cultivos 0.51 y se indujeron a un OD550 de aproximadamente 0,5. Tras 3 horas de inducción, se rompieron las células mediante centrifugación y se lisaron usando un procedimiento combinado de lisozima y sonicación. Debido a que las proteínas mutantes recombinantes se expresaron como fusiones con GST, se usaron columnas de glutatión sefarosa para enlazar las fusiones. A continuación se eluyeron las proteínas de fusión procedentes de las columnas usando glutatión libre y a continuación se incubaron en 10 mm de DTT durante 4 horas a temperatura ambiente para eliminar el aducto de glutatión y se almacenaron a -80ºC.

Ejemplo 9c

Efecto de las mutaciones puntuales sobre la capacidad de la OSM-GST para competir con el OSM de tipo salvaje que enlaza con gp130-FC en un ELISA

Se recubrieron inmunoplacas Nunc (F6 Maxisorp, Life Technologies) durante toda la noche (4ºC) con la OSM de tipo salvaje (producida de acuerdo con el ejemplo 7a) 50 \mul/pocillo, 1 \mug/ml en tampón carbonato/bicarbonato pH 9,4). Se lavaron las placas (x 6 en PBS tween 20 a 0,05%, usando el lavador de placas Skatron), se manipularon en seco y se bloquearon para reducir el enlace no específico (200 \mul/pocillo, BSA/PBS al 1%). Tras 1 h de incubación (temperatura ambiente en un agitador) se manipularon las placas en seco y se añadió la OSM-GST mutante o de tipo salvaje (wt) del Ejemplo 9b (50 \mu/pocillo, 20-0,002 \mug/ml, valorados en BSA/PBS al 1%). Se ensayó también (20-0,02 \mug/ml), como control positivo, anticuerpo de la OSM antihumano policlonal (R&D System). Un complejo de gp130-Fc (Producido como a continuación 300 ng/ml) y un conjugado de fosfatasa alcalina e IgG anti-human (1:500, Sigma) en BSA/PSB al 1% (50 \mul/pocillo) se añadieron inmediatamente después de los agentes bajo ensayo. Tras una incubación de 5 h (temperatura ambiente en un agitador), se lavaron las placas (x 6) y se desarrollaron usando el Sistema de Amplificación ELISA (Life Technologies) con las instrucciones del fabricante y se midió OD a 490 nm. Se determinó el enlace total sobre cada placa mediante la gp130-Fc/conjugado y la OSM en presencia d BSA/PBS al 1%, y el enlace no específico mediante la gp130-Fc/conjugado en ausencia de la OSM, o el enlace del conjugado con la OSM en ausencia de gp130-Fc.

Se amplificó el ADN que codifica la región extracelular de la gp130 humana mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) usando cebadores de oligonucleótidos sintéticos, cebador hacia delante:

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diseñado a partir de la secuencia de la base de datos del GenBank (número de acceso M57230) para la gp130 humana. El cebador hacia delante contenía BamHI, y los emplazamientos de la endonucleasa de restricción HindIII, y la secuencia 5' no traducida consenso, seguida por la secuencia complementaria de ADN en el comienzo de la secuencia que codifica gp130. El cebador inverso contenía un emplazamiento para la endonuclesa de restricción XhoI seguido por la secuencia complementaria de ADN en el extremo 3' de la región extracelular de la secuencia que codifica gp130. Se purificó este fragmento de PCR y se subclonó en PCR2.1 (Invitrogen) para dar pCR2.1gp130.

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Se digirió el plásmido pCR2.1gp130 con los enzimas de restricción RamHI y XhoI y se purificó y se subclonó el fragmento de gp130 en los emplazamientos de las endonucleasas BamI y XhoI en un plásmido que contiene una secuencia de ADN que codifica un fragmento Fc de la IgG1 humana. A continuación se digirió el plásmido con el enzima de restricción HindIII y se purificó y subclonó el fragmento gp130Fc resultante en el emplazamiento Hind III de un vector de expresión de baculovirus, pFastBac1 (Life Technologies), para generar un plásmido designado pBACgpFc.

Se expresó la proteína de fusión gp130Fc en células de insecto usando el sistema de expresión de l baculovirus Bac-to Bac y se verificó mediante SDS-PAGE teñido con azul brillante de coomassie y mediante análisis western blot usando anticuerpos anti-gp130 y anti-hIgG comercialmente disponibles.

Se ensayaron el mutante y wt OSM-GST para obtener los DI_{50} en 3-6 experimentos. La OD media en presencia de la OSM y la gp130-Fc en ausencia del ligando de competición (es decir, el enlace total) fue 1,157 (intervalo 0,825-1,807) y el enlace no específico fue menor de 0,08. El anticuerpo anti-OSM produjo una inhibición dependiente de la concentración en todos los ensayos (inhibición del 74 \pm 1% a 1 \mug/ml). El wt OSM-GST compitió con el OSM enlazado en placa para dar una inhibición dependiente de la concentración (Fig. 12), con un DI50 de 0,139 \pm 0,0258 \mug/ml determinado en 6 experimentos independientes. Se resume en la Tabla 4 la potencia del OSM-GST mutante en competir con el wt OSM enlazado a placa. Las mutaciones que dan como resultado una disminución sustancial en la capacidad para competir con la wt OSM para enlace con gp130 fueron L13A, Q20A, G120A, N123A y N124A. De estas, las más débiles fueron Q20A y Q16A: a la concentración máxima ensayada (10 \mug/ml) Q20A produjo una inhibición del 66 \pm2,3% y Q16A únicamente un 15 \pm 8% (Figura 12).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4 Potencia de l OSM-GST mutante y wt en competir con la wt OSM enlazada a placa para el enlace con gp130-Fc en el ELISA. Se determinaron los valores DI_{50} en 3-6 experimentos independientes

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Ejemplo 9d

Efecto de la mutaciones puntuales en OSM sobre la producción de la OSM impulsada por la SPAP en un ensayo de HepG2 B6 in vitro

Se empleó el ensayo descrito más arriba en el Ejemplo 7b. Se diluyeron los mutantes OSM-GST a una concentración de 100 ng ml^{-1} usando la concentración conocida de los mutantes OSM intactos generados en el Ejemplo 9b. Se incluyó una OSM-GST de tipo salvaje para los objetivos de control. Se hicieron las diluciones en medio HeoG2 B6 con FCS inactivada térmicamente al 1%, baja actividad de la fosfatasa alcalina. A continuación se hicieron las diluciones en serie 1:3. (100; 33, 33; 11,11; 3,7; 1,23; 0,4 ng ml^{-1}). Se dispensaron 3 x 10^{4} HepG2B6 en los pocillos individuales de una placa con 96 pocillos en 100 \mul de medio. Se dejaron equilibrar las células durante 48 horas. A continuación se retiró el medio y se sustituyó con 100 \mul de la OSM-GST mutante diluida. Se incubaron las células durante 20 horas más. Se llevó a cabo cada dilución por triplicado en 20 \mul de medio, se retiró y se evaluó para sPAP usando pNPP como sustrato. Se bloqueó la ALP endógena con L-homoarginina. Se leyó la O.D. a 405-650 nm. Se repitió el experimento dos veces.

La mayor parte de los mutantes podría impulsar la liberación de sPAP de manera similar a la del tipo salvaje. Tras mutantes produjeron bajos niveles de sPAP. No se obtuvo la EC_{50} de estos mutantes. La (Figura 13) muestra los gráficos de la O. D. obtenidos a partir de los mutantes 9 (Q16A), 13 (Q20A) y 20 (G120A), que fueron menos efectivos en la impulsión de sPAP. Se muestra wt OSM-GST para comparación. Se usaron estos datos para calculas los valores de EC_{50}. Las EC_{50} reales para cada mutante y se expresaron como un porcentaje del tipo salvaje tal como se muestra en la Tabla 5.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5

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Se muestran los valores expresados de EC_{50} como porcentaje de los valores de EC_{50} de Tipo Salvaje y los de EC_{50} reales. < 80% Más potente; 80-120% Igual potencia; > 120% Menos potente que el tipo salvaje. NC - no calculado.

El examen de esta tabla muestra tres de aquellos mutantes que son sustancialmente diferentes de wt en el ELISA, son también menos potentes en el ensayo sPAP, 6 - L13A; 10 - L17A; 22 - N123A y el cuarto, 23 - N124A fracasa justo en el grado de igual potencia por el sistema de puntuación arbitrario. De esta manera, ambos tipos de ensayo muestran buena concordancia. Algunos de los mutantes fueron menos "potentes" que el tipo salvaje en el impulso de la producción de sPAP pero fue la variación entre los dos experimentos, excepto en aquellos mutantes (Q16A, Q20A, G120A) que no impulsaron sPAP en todos. Los resultados de los ensayos indican que G120A, Q16A y Q20A realizan el enlace de la OSM con gp130. También parece que N123A y N124A tienen algún efecto sobre las interacciones con gp130.

Ejemplo 10

Papel de la OSM en la gastritis

H. pylori es una bacteria Gram negativa con forma de espiral que se ha implicado en la producción de la gastritis, enfermedad de la úlcera péptica y cáncer gástrico. Las cepas Cag+ de H. pylori tienen mayor incidencia con las úlceras que las cepas Cag- de H. pylori. Se cocultivaron cepas de H. pylori Cag+ más patogénicas, y Cag-) in vitro con la línea de células epiteliales gástricas KATO III (ECACC) para investigar la respuesta del huésped a la infección por H. pylori mediante análisis de la expresión del gen diferencial. Se aisló el ARNm en tiempos concretos: 45 min, 3 horas y 24 horas, se hibridaron las sondas radioactivas derivadas con matrices de genes de ADNc de alta densidad (que contenían de manera aproximada 136 genes humanos que incluían citoquinas, receptores de la citoquina y moléculas de adhesión). El análisis de los perfiles de expresión del gen obtenido reveló la inducción/represión de numerosos genes en respuesta a las cepas de H. pylori. Se encontró que se podía inducir la Oncostatina M en las células expuestas a la cepa altamente patogénica de H. pylori (Cag+) en comparación con las células expuestas a la débilmente patogénica H. pylori (Cag-) o células control no tratadas.

Claims (9)

1. El uso de un anticuerpo antagonista respecto de la Oncostatina M (OSM para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una artropatía inflamatoria.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que se selecciona la artropatía inflamatoria entre el grupo constituido por artritis reumatoide, artritis psoriática, artritis reactiva.

3. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2 en el que el anticuerpo es un anticuerpo de la OSM humana.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre F(ab')_{2}, Fab, F_{v'}, ScF_{v-}.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en el que el anticuerpo es humanizado o quimerizado.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 para el tratamiento de la artritis reumatoide.

7. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo está en combinación con un inmunosupresor, inductor de la tolerancia, o agente antiinflamatorio.

8. Un uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que el anticuerpo está en combinación con un agente que inhibe las células CD4+T, un anticuerpo anti-CD23 o un antagonista de TNF.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el medicamento se usa para evitar o reducir la liberación de colágeno del cartílago.