ES2272453T3 - Estabilizacion de colorantes de acidos nucleicos altamente sensibles en disoluciones acuosas. - Google Patents
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Abstract
Método para estabilizar un colorante de ácidos nucleicos fluorescente altamente sensible en disolventes acuosos que comprende añadir uno o más compuestos cuaternarios al disolvente, en el que el componente cuaternario tiene una fórmula estructural de R4NX, en la que R4N es un catión, y cada R es independientemente un grupo alquilo C1-6 o un grupo alcoxilo C1-6; N es nitrógeno; X es un anión haluro o un anión hidroxilo que se disocia del catión (R4N)+ en un entorno acuoso; y en el que el colorante de ácidos nucleicos fluorescente altamente sensible comprende un tinte de cianina.
Description
Estabilización de colorantes de ácidos nucleicos
altamente sensibles en disoluciones acuosas.
La presente invención se refiere al uso de
compuestos cuaternarios para estabilizar colorantes de ácidos
nucleicos fluorescentes altamente sensibles en disolventes acuosos.
La presente invención se refiere también a una composición novedosa
para geles para electroforesis de agarosa precoloreados
prefabricados con un aumento de la vida útil de almacenamiento para
la detección de ácidos nucleicos de alta sensibilidad. La presente
invención se refiere además a composiciones de disolventes que son
útiles como disoluciones de colorante listas para su uso.
Los tintes fluorescentes se usan ampliamente
para la detección de ácidos nucleicos en ensayos biológicos. En
particular, se ha demostrado que una variedad de tintes de cianina
asimétrica son altamente sensibles y útiles en electroforesis y
otros ensayos basados en disoluciones para el análisis y la
detección de ADN y ARN. Productos comerciales tales como los
colorantes SYBR® Green I y II (Molecular Probes Inc, Eugene OR;
patentes de los EE.UU. números 5.436.134 y 5.658.751); colorante
GelStar^{TM} (Bio Whittaker Molecular Applications Inc, Rockland
ME, patente de los EE.UU. número 5.863.753); y colorante SYBR Gold
(Molecular Probes, Eugene OR) son algunos ejemplos de esos tintes
de cianina asimétrica. Estos tintes proporcionan una alta
sensibilidad debido a la combinación de un aumento en la
fluorescencia de más de 1000 veces con la unión a ácidos nucleicos
y de un fondo muy bajo en el estado sin unión. El uso de estos
tintes en transiluminación ultravioleta permite la detección de ADN
a niveles de picogramo. Se cree que el modo de unión de los tintes a
ácidos nucleicos tiene un mecanismo distinto al de los tintes
intercalantes de fenantridinio más convencionales tales como bromuro
de etidio y yoduro de propidio.
A pesar de la sensibilidad superior de los
tintes de cianina asimétrica, estos tintes no son estables en
disolventes acuosos. Son estables en disolventes orgánicos tales
como dimetilsulfóxido, pero deben transferirse a disolventes
acuosos antes de usarse en ensayos biológicos. En disolventes
acuosos, la sensibilidad de estos tintes para la detección de ADN
disminuye aproximadamente a la mitad en un plazo de 4 a 14 días de
almacenamiento a temperatura ambiente. Como resultado los geles
para electroforesis prefabricados que se precolorean con estos
colorantes sensibles tienen una vida útil de almacenamiento corta y
no son útiles de manera fiable, incluso si los geles prefabricados
precoloreados con bromuro de etidio están disponibles comercialmente
(por ejemplo geles prefabricados Reliant®, vendidos por Bio
Whittaker Molecular Applications). Por tanto, la disponibilidad de
geles prefabricados con colorantes altamente sensibles tiene un
beneficio sustancial, especialmente para laboratorios de alta
capacidad de producción, donde de lo contrario, el gran número de
muestras necesitaría la fabricación de numerosos geles.
Se han usado detergentes para mejorar la
estabilidad de colorantes de ácidos nucleicos altamente sensibles
pero sólo prolongan ligeramente la estabilidad de los colorantes, si
acaso lo hacen (véase el ejemplo 1, tabla 1), y no son útiles para
geles prefabricados. Los informes de Mathies (Zeng et al
1997, Analytical Biochemistry 252: 110-114; Clark
et al 1997, Analytical Chemistry 69:
1355-1363) describen el uso del ion
tetrapentilamonio en tampón TAPS (ácido
3-[tris-(hidroximetil)metilamino]-propanosulfónico)
para aumentar la estabilidad de los complejos formados entre ADN y
tintes bis-intercalantes. Sin embargo estos informes
no sugieren que se lograra la estabilidad de los propios tintes, ni
mencionan el efecto sobre los tintes de cianina asimétrica tales
como los colorantes SYBR Green y GelStar. Por tanto, existe todavía
una necesidad de un método para estabilizar colorantes de ácidos
nucleicos altamente sensibles, y para proporcionar un medio para
crear geles prefabricados, precoloreados y disoluciones con una vida
útil de almacenamiento.
La presente invención proporciona un método para
estabilizar colorantes de ácidos nucleicos fluorescentes altamente
sensibles en disolventes acuosos mediante adición de uno o más
compuestos cuaternarios al disolvente. También es un objeto de esta
invención proporcionar una composición de gel de electroforesis para
un sistema de gel de electroforesis prefabricado que incluye un
gel, un tampón de electroforesis, un colorante de unión de ácidos
nucleicos fluorescente altamente sensible, y uno o más compuesto
cuaternarios, haciendo dichos compuestos cuaternarios que los
tintes se incorporen en el gel para tener un aumento de la
estabilidad en disolventes acuosos. Es además un objeto de esta
invención proporcionar una disolución de colorante estabilizada que
comprende un disolvente acuoso, un colorante de ácidos nucleicos
fluorescente, y una cantidad estabilizadora de uno o más compuestos
cuaternarios. Los compuestos cuaternarios de la invención tienen la
fórmula estructural general de R_{4}NX, en la que R_{4}N es un
catión, y cada R es independientemente un grupo alquilo
C_{1-6} o un grupo alcoxilo
C_{1-6}; N es nitrógeno, X es un anión haluro o un
anión hidroxilo que se disocia del catión (R_{4}N)^{+}
en un entorno acuoso; y en el que el colorante de ácidos nucleicos
fluorescente altamente sensible comprende un tinte de cianina. Los
objetos y las ventajas anteriores de la presente invención serán
evidentes con la consideración de la siguiente descripción
detallada.
Se proporciona un método de prolongación de la
vida útil de almacenamiento de colorantes fluorescentes en
disolución acuosa, mediante la adición de uno o más compuestos
cuaternarios al disolvente acuoso que contiene el colorante. El
compuesto cuaternario tiene una fórmula estructural R_{4}NX^{-}
en la que R_{4} consiste en cuatro cadenas de alcoxilo o alquilo
C_{1-6} homogéneas o heterogéneas que se unen
covalentemente a un nitrógeno cuaternario, N; y X^{-} es un anión
que se disociará del catión (R_{4}N)^{+} en un entorno
acuoso. En realizaciones preferidas, X^{-} es un anión hidroxilo o
haluro. En realizaciones más preferidas, X^{-} es un ion bromuro
o cloruro. El compuesto cuaternario se disuelve fácilmente en el
sistema acuoso y puede estar presente en cualquier cantidad eficaz.
En general, el compuesto cuaternario está presente en
concentraciones de entre 1 mM a 200 mM, que pueden optimizarse según
el uso. Cuando se usa en geles para separación electroforética de
ácidos nucleicos y proteínas, la concentración útil del compuesto
cuaternario está entre 5 y 20 mM.
Los colorantes fluorescentes se utilizan
ampliamente para la detección de moléculas biológicas. Un grupo de
este tipo son las cianinas asimétricas que fluorescen con la unión a
ácidos nucleicos, que incluyen pero no se limitan a compuestos
tales como los colorantes de ácidos nucleicos SYBR Green I y II,
SYBR Gold, y GelStar, y sus derivados, y otros colorantes descritos
en la patente de los EE.UU. número 5.436.134, patente de los EE.UU.
número 5.658.751, y patente de los EE.UU. número 5.863.753. Cuando
estos colorantes están en sistemas acuosos (tales como geles para
electroforesis o tampones biológicos) y en presencia de los
compuestos cuaternarios mencionados, hay un aumento de al menos 4
veces en la semivida de estos colorantes. Para los fines de la
presente invención, la semivida, o t½ se define como el tiempo que
lleva que los colorantes pierdan la mitad de su intensidad de
fluorescencia que resulta de la unión al ADN. Las sales cuaternarias
de tetrametilamonio, tetrabutilamonio, y tetrapentilamonio son
realizaciones particularmente preferidas. Los hidróxidos de amonio
cuaternario se usan convenientemente como parte del sistema tampón
(tal como en el caso del tampón TAPS) y son particularmente
compatibles con electroforesis en gel de alta resolución. Los
haluros de amonio cuaternario pueden usarse convenientemente para
complementar disolventes tamponados o no tamponados para el
almacenamiento de colorantes. Puede usarse una combinación de dos o
más compuestos cuaternarios mientras que ésta sea compatible con el
uso. No son útiles para los fines de la presente invención, los
compuestos de amonio cuaternario con cadenas de carbono de más de
6, tales como pero no limitadas a compuestos de tetrahexilamonio
(que no son solubles en disolventes acuosos) y detergentes (véase
la tabla I). Sin embargo, pueden usarse detergentes además de los
compuestos cuaternarios de la invención para aumentar adicionalmente
el efecto estabilizante del colorante. Se muestra un ejemplo en la
tabla 3, en la que la adición de detergente a una disolución que
contiene hidróxido de tetrametilamonio prolonga la semivida del
colorante SYBR Green I en de 1,6 a 2 veces además del aumento de 4
veces ya conseguido por el hidróxido de tetrametilamonio solo.
Además de las cianinas asimétricas mencionadas
anteriormente, también pueden estabilizarse los tintes de ácidos
nucleicos fluorescentes tales como dímeros y monómeros de cianina
mediante los compuestos cuaternarios, mientras que los tintes de
ácidos nucleicos de fenantridinio convencionales tales como bromuro
de etidio y yoduro de propidio no. Los dímeros y monómeros de
cianina preferidos incluyen, pero no se limitan a, TOTO, YOYO,
TO-PRO (cada uno disponible comercialmente de
Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) y Cy3, Cy5 y Cy7 (cada uno
disponible comercialmente de Amersham Life Science, Inc., Arlington
Heights, Il).
El gel para electroforesis de la invención
comprende un hidrogel, un sistema tampón, un tinte de ácidos
nucleicos fluorescente, y uno o más compuestos cuaternarios. Los
hidrogeles útiles para electroforesis incluyen geles de agarosa y
poliacrilamida, aunque cuando se usan geles de poliacrilamida, puede
requerirse incorporar el colorante tras la formación del gel para
evitar la descomposición del colorante durante la polimerización de
la acrilamida. Los tampones usados normalmente para electroforesis
incluyen, pero no se limitan a, MOPS, TAPS (cada uno disponible
comercialmente de Sigma, St. Louis, MO), TAE (la concentración 1x es
Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM) y puede usarse TBE
para la invención, siempre que el pH de los tampones se ajuste
apropiadamente tras la adición de los compuestos cuaternarios y que
el sistema sea compatible con la separación electroforética. Se
prefiere particularmente la combinación de tampón TAPS e hidróxido
de tetrapentilamonio. Se prefiere la combinación de tampón TAPS e
hidróxido de tetrapentilamonio e hidróxido de tetrabutilamonio.
También se prefiere la combinación de tampones TBE o TAE con
bromuro de tetrapentilamonio. Los tintes de ácidos nucleicos
fluorescentes pueden ser colorantes de cianina asimétrica. Se
prefiere particularmente el uso del colorante de ácidos nucleicos
GelStar. El uso de geles con colorante SYBR Green o SYBR Gold
requiere la optimización de la concentración de colorante y la
cantidad de ADN o ARN aplicada al gel con el fin de obtener
resultados de electroforesis de alta resolución.
Las disoluciones de tinte estables en
almacenamiento de la invención están comprendidas por un tinte de
cianina fluorescente, un disolvente acuoso y uno o más compuestos
cuaternarios. Las disoluciones pueden usarse para colorear geles
tras electroforesis con el fin de visualizar ácidos nucleicos o
proteínas que se separaron en los geles.
Se vaciaron geles de agarosa SeaKem LE (al 1%
p/v, BMA Inc) en tampón 1X TAPS (ácido
3-(N-tris(hidroximetil)metilamino)propanosulfónico,
40 mM) en presencia de colorante de ácidos nucleicos 1X GelStar
(BMA Inc) y los aditivos indicados en la tabla 1. Se incubaron los
geles en la oscuridad durante 6 días a 45ºC y se sometieron a prueba
para la detección de ADN, tal como sigue: Se sumergieron los geles
en tampón de electroforesis 1X TAPS sin tinte. Entonces, se sometió
a electroforesis el ADN a través del gel a 20 V/cm durante una hora.
Se examinó la intensidad de una banda de ADN de 2,5 ng mediante
transiluminación a 300 nm. El colorante en el gel se consideró
estabilizado si la intensidad de fluorescencia del ADN fue superior
al 80% comparado con cuando el gel estaba recién preparado con el
colorante. El colorante de ácidos nucleicos GelStar se estabilizó
por la presencia de compuestos de tetrapentilamonio y
tetrabutilamonio, pero no con detergentes de amonio cuaternario. La
calidad de resolución del ADN en los geles nuevos se registró como
"buena" cuando la banda de ADN era estrecha, "regular"
cuando la banda de ADN era ancha y "mala" cuando la banda de
ADN era borrosa.
Se suspendió el colorante de ácidos nucleicos
SYBR Green I (1X, BMA Inc) en los disolventes indicados (tabla 2) y
se guardó en botellas de polipropileno a 21-23ºC con
luz ambiental. El tampón TBE a una concentración 1X consistió en
Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM y EDTA 2 mM. Periódicamente, se
mezclaron 5 \mul de las disoluciones con 3 ng de ADN de lambda, y
luego se aplicaron como una mancha en una placa Petri de
poliestireno (VWR, MA). Se excitó la mancha a 500 nm (Dark Reader,
Clare Chemical Research, CO) y se capturo la intensidad de
fluorescencia y se integró sobre un área superficial constante
mediante el analizador AlphaImager ("Spot Density Tools"
(herramientas de densidad de las manchas), Alpha Innotech, CA). Los
números se normalizaron entonces frente a la intensidad en tiempo
cero. Se registró el tiempo que lleva que el colorante pierda la
mitad de su intensidad de fluorescencia como t½. El t½ del
colorante de ácidos nucleicos SYBR Green I sin los aditivos de la
invención fue de entre 5 y 14 días, dependiendo del tipo de
disolvente control.
Se sometieron a prueba cianinas asimétricas
(colorantes de ácidos nucleicos 1X SYBR Green I, 1X SYBR Gold y 1X
GelStar), Hoechst 33258 pentahidratado
(bis-bencimida: BisBnz., 1,5 ug/ml) y tintes
intercalantes de fenantridinio (bromuro de etidio 1 \mug/ml;
yoduro de propidio 10 \mug/ml) para determinar su respuesta
frente al agente estabilizante TPABr. Se sometieron a prueba los
tintes en tampón 1X TAPS que se ajustó con NaOH hasta pH 8,2, con o
sin TPABr 14,6 mM. Se midió la estabilización del tinte usando el
método descrito en el ejemplo 2 excepto en que para la medición de
los colorantes bromuro de etidio, yoduro de propidio y Hoechst
33258 se usó la transiluminación a 300 nm. El efecto de TPABr sobre
la estabilidad de estos tres compuestos fue mínimo. Por el
contrario, el t½ de SYBR Green se extendió hasta más de 100 días
(comparado con 5 días sin TPABr), el del colorante SYBR Gold hasta
36 días (comparado con 9 días sin TPABr); y el del colorante GelStar
hasta 24 días (comparado con 4 días sin TPABr).
Se suspendió el colorante de ácidos nucleicos
SYBR Green I (1X) en tampón 1X TAPS con los aditivos indicados
(tabla 3) y se sometieron a prueba para determinar si se
estabilizaba usando el método descrito en el ejemplo 2.
Claims (21)
1. Método para estabilizar un colorante de
ácidos nucleicos fluorescente altamente sensible en disolventes
acuosos que comprende añadir uno o más compuestos cuaternarios al
disolvente, en el que el componente cuaternario tiene una fórmula
estructural de R_{4}NX, en la que R_{4}N es un catión, y cada R
es independientemente un grupo alquilo C_{1-6} o
un grupo alcoxilo C_{1-6};
N es nitrógeno;
X es un anión haluro o un anión hidroxilo que se
disocia del catión (R_{4}N)^{+} en un entorno acuoso;
y
en el que el colorante de ácidos nucleicos
fluorescente altamente sensible comprende un tinte de cianina.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho compuesto cuaternario está presente en una concentración en el
intervalo de 1 mM a 200 mM.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho compuesto cuaternario está presente en una concentración en el
intervalo de 5 mM a 20 mM.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
el compuesto cuaternario comprende una sal de tetrapentilamonio, una
sal de tetrabutilamonio, o una mezcla de sal de tetrapentilamonio y
sal de tetrabutilamonio.
5. Método de la reivindicación 1, en el que el
compuesto cuaternario comprende bromuro de tetrapentilamonio,
cloruro de tetrapentilamonio, o hidróxido de tetrapentilamonio.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
el tinte de cianina comprende un tinte de cianina asimétrica.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
el colorante de ácidos nucleicos fluorescente altamente sensible
comprende los colorantes SYBR Green I, SYBR Green II, GelStar, y
SYBR Gold, o un derivado de los mismos.
8. Composición de gel para electroforesis que
comprende un gel, un tampón de electroforesis, un colorante de
ácidos nucleicos fluorescente altamente sensible, y una cantidad
estabilizadora de uno o más compuestos cuaternarios, en la que el
compuesto cuaternario tiene una fórmula estructural de
R_{4}NX,
en la que R_{4}N es un catión y cada R
comprende independientemente un grupo alquilo
C_{1-6} o un grupo alcoxilo
C_{1-6};
en la que N es nitrógeno;
en la que X es un ion haluro o un anión
hidroxilo que se disocia del catión (R_{4}N)^{+} en un
entorno acuoso; y
en la que el colorante de ácidos nucleicos
fluorescente altamente sensible comprende un tinte de cianina.
9. Composición según la reivindicación 8, en la
que dicho compuesto cuaternario está presente en una concentración
en el intervalo de 1 mM a 200 mM.
10. Composición según la reivindicación 8, en la
que dicho compuesto cuaternario está presente en una concentración
en el intervalo de 5 mM a 20 mM.
11. Composición según la reivindicación 8, en la
que el compuesto cuaternario comprende una sal de tetrapentilamonio,
una sal de tetrabutilamonio, o una mezcla de sal de
tetrapentilamonio y sal de tetrabutilamonio.
12. Composición según la reivindicación 8, en la
que el tinte de cianina comprende un tinte de cianina
asimétrica.
13. Composición según la reivindicación 8, en la
que el colorante de ácidos nucleicos fluorescente altamente sensible
comprende los colorantes SYBR Green I, SYBR Green II, GelStar, y
SYBR Gold, o derivados de los mismos.
14. Composición según la reivindicación 8, en la
que gel comprende agarosa, el colorante es GelStar; y
el compuesto cuaternario comprende hidróxido de
tetrapentilamonio, bromuro de tetrapentilamonio, o una combinación
de hidróxido de tetrapentilamonio e hidróxido de
tetrabutilamonio.
15. Composición según la reivindicación 8, en la
que el gel comprende agarosa y el colorante es SYBR Green I.
16. Disolución de colorante estabilizada que
comprende un disolvente acuoso, un colorante de ácidos nucleicos
fluorescente, y una cantidad estabilizante de uno o más compuestos
cuaternarios, en la que dicho compuesto cuaternario tiene una
fórmula estructural de R_{4}NX,
en la que R_{4}N es un catión y cada R
comprende independientemente un grupo alquilo
C_{1-6} o un grupo alcoxilo
C_{1-6};
en la que N es nitrógeno;
en la que X es un anión haluro o un anión
hidroxilo que se disocia del catión (R_{4}N)^{+} en un
entorno acuoso; y
en la que el colorante de ácidos nucleicos
fluorescente comprende un tinte de cianina.
17. Disolución de colorante según la
reivindicación 16, en la que dicho compuesto cuaternario está
presente en una concentración en el intervalo de 1 mM a 200 mM.
18. Disolución de colorante según la
reivindicación 16, en la que dicho compuesto cuaternario está
presente en una concentración en el intervalo de 5 mM a 20 mM.
19. Disolución de colorante según la
reivindicación 16, en la que el compuesto cuaternario comprende o
bien sal de tetrapentilamonio, una sal de tetrabutilamonio, o una
mezcla de sal de tetrapentilamonio y sal de tetrabutilamonio.
20. Disolución de colorante según la
reivindicación 16, en la que el tinte de cianina comprende un tinte
de cianina asimétrica.
21. Disolución de colorante según la
reivindicación 16, en la que el colorante de ácidos nucleicos
fluorescente comprende los colorantes SYBR Green I, SYBR Green II,
GelStar, y SYBR Gold o un derivado de los mismos.
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