ES2272611T3 - Activacion in vitro de celulas t citotoxicas. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para producir una célula T CD8+ activaad in vitro, comprendiendo el procedimiento poner en contacto, in vitro, una célula T CD8+ con una molécula del MHC de la Clase I humana cargada con antígeno y expresada sobre la superficie de una célula de insecto durante un período de tiempo suficiente para activar, de una manera específica para el antígeno, la célula T CD8+.

Description

Activación in vitro de células T citotóxicas.
Campo técnico
La presente invención se refiere a procedimientos para activar células CD8 in vitro con especificidad para determinados péptidos antigénicos, el uso in vivo de células CD8 activadas para el tratamiento de una diversidad de condiciones morbosas, y composiciones apropiadas para estos usos.
Antecedentes
La eficiencia con la que el sistema inmune cura o protege los individuos de las enfermedades infecciosas ha intrigado siempre a los científicos, ya que se ha creído que podía ser posible activar el sistema inmune para combatir otros tipos de enfermedades. Tales enfermedades incluyen el cáncer, el SIDA, la hepatitis, y enfermedades infecciosas en pacientes inmunodeprimidos. Mientras que varios procedimientos que implican el uso de anticuerpos han sido aplicados en esos tipos de enfermedades, pocos intentos exitosos, si alguno, usando células T citotóxicas han sido descritos. Teóricamente, las células T citotóxicas serían los medios preferidos para tratar los tipos de células mencionados más arriba. No obstante, no ha habido disponible ningún procedimiento in vitro para activar específicamente las células T citotóxicas.
Las células T citotóxicas, o células CD8 como son actualmente conocidas, representan la principal línea de defensa contra las infecciones virales. Los linfocitos CD8 reconocen y matan específicamente células que han sido infectadas por un virus. Por tanto, el coste de eliminar una infección viral es la pérdida simultánea de las células infectadas. Los receptor de la célula T sobre la superficie de las células CD8 no pueden reconocer antígeno extraños directamente. Contrariamente a los anticuerpos, el antígeno debe ser presentado primero a los receptores.
La presentación del antígeno a las células B se consigue mediante las moléculas del tipo Clase I del complejo de histocompatibilidad principal (MHC). El complejo de histocompatibilidad principal (MHC) se refiere a un gran locus genético que codifica una familia extensa de glicoproteínas que juegan un rol importante en la respuesta inmune. Los genes del MHYC, el cual se denomina también complejo HLA (antígeno de leucocitos humano), están ubicados en el cromosoma 6 en humanos. Las moléculas codificadas por los genes del MHC están presentes sobre las superficies celulares, y son en gran medida responsables del reconocimiento de los transplantes de tejidos como "no propios". Por tanto, las moléculas del MHC unidas a membrana están íntimamente implicadas en el reconocimiento de antígenos por parte de células T.
Los productos del MHC se agrupan en tres clases principales, denominadas I, II y III. Las células T que sirven principalmente como células auxiliares expresan el CD4, y están restringidas primariamente por moléculas de la Clase II, mientras que las células que expresan el CD8, las cuales representan mayoritariamente las células efectoras citotóxicas, interaccionan con moléculas de la Clase I.
Las moléculas de la Clase I son glicoproteínas de membrana con la capacidad de unir péptidos derivados principalmente de la degradación intracelular de proteínas endógenas. Los complejos de moléculas del MHC con péptidos derivados de proteínas virales, bacterianas y otras proteínas extrañas comprenden el ligando que dispara la capacidad de respuesta al antígeno de las células T. Por contra, los complejos de moléculas del MHC con péptidos derivados de productos celulares normales juegan un papel en "enseñar" a las células T a tolerar los péptidos propios, en el timo. Las moléculas de la Clase I no presentan antígenos enteros, intactos; más bien presentan fragmentos de péptidos de los mismos, "cargados" sobre su "surco unidor de péptidos".
WO91/16924 describe procedimientos para potenciar la presentación de antígeno peptídico añadido exógenamente por parte de células de mamífero presentadoras de antígeno.
Levy y Kvist (International Immunology, 2(10):995-1002 (1990)) describen el uso de vectores baculovirus independientes para expresar MHC I, la beta-2-microglobulina y la proteínas del adenovirus-2, por separado y juntas en células de insecto con objeto de investigar los efectos de la proteína adenovírica sobre el ensamblaje de los complejos del MHC de la Clase I.
Durante muchos años, los inmunólogos han esperado generar células citotóxicas específicas que apuntaran a virus, retrovirus y células cancerosas. Mientras que apuntar contra enfermedades víricas en general podía conseguirse mediante vacunación in vivo con vacunas vivas o atenuadas, no se ha conseguido un éxito similar con los retrovirus o con las células cancerosas.
EP-360.205-A describe procedimientos para estimular la respuesta inmmune de un paciente de cáncer contra el cáncer. Se exponen in vitro linfocitos de la sangre periférica procedentes del paciente a células cancerosas procedentes del mismo paciente, las cuales se han tratado con mitomicina C para impedir la proliferación. A continuación, los linfocitos estimulados se administran de nuevo al paciente.
\newpage
WO93/10.816 describe vacunas de péptidos que pueden usarse para inducir células T citotóxicas contra el VIH. Este documento sugiere que las células T citotóxicas procedentes de individuos inmunizados pueden aislarse, cultivarse y expandirse in vitro y a continuación administrarse de nuevo al paciente con objeto de impulsar la respuesta inmune contra el virus.
Más aún, la estrategia de la vacuna no ha tenido la eficacia deseada en pacientes inmunodeprimidos. Un forma de salvar esta dificultad sería inmunizar un individuo sano, aislar las células CD8 a partir de este individuo, e inyectar estas células CD8 en la persona afectada por la enfermedad. Este protocolo experimental parece funcionar en cepas endogámicas de ratones, pero no se ha intentado con éxito en humanos. Hay varios posibles explicaciones. En primer lugar, los péptidos son únicos para un MHC determinad; dicho de otra forma, ciertos péptidos antigénicos se unen preferentemente a especies particulares del MHC, pero no se unen bien a otras, incluso en ausencia de la molécula del MHC "preferida". Más aún, las moléculas del MHC son altamente polimórficas, hecho que general al menos dos problemas. El primero, las células CD8 de un individuo puede interaccionar sólo con péptidos unidos a precisamente aquellas de tres a seis moléculas de la Clase I presentes en ese individuo. El segundo, las células CD8 reaccionan violentamente con todas las moléculas de la Clase I, las cuales son diferentes de aquéllas expresadas en el individuo del que se obtienen las células CD8, con independencia de qué péptidos contienen las moléculas de la Clase I. Esta reactividad se ha observado desde hace cierto tiempo, y se denomina alo-reactividad. Es la causa que subyace al rechazo inmune de los órganos trasplantados.
Por tanto, aparte del algo heroico protocolo experimental en el que un individuo se usa como donante de células CD8 activadas para otro individuo, es difícil encontrar dos personas que no sean familiares con el mismo conjunto exacto de moléculas de la Clase I. Por esta razón, al menos un investigador ha adoptado la, algo inespecífica, estrategia de "impulsar" las células CD8 existentes incubándolas in vitro con IL-2, un factor de crecimiento para las células T. No obstante, este protocolo (conocido como terapia celular LAK) sólo permitirá la expansión de aquellas células CD8 que ya están activadas. Puesto que el sistema inmune está siempre activo, por un motivo u otro, la mayoría de las células estimuladas por la IL-2 serán irrelevantes para el propósito de combatir la enfermedad. De hecho, no se ha documentado que este tipo de terapia active ninguna célula con la especificidad deseada. Por tanto, los beneficios de la terapia celular LAK son controvertidos como mucho, y los efectos secundarios son generalmente tan graves que muchos estudios han sido interrumpidos.
Varias nuevas moléculas que parecen estar implicadas en el proceso de carga del péptido pueden haber sido recientemente identificadas. También se destaca que las moléculas de la Clase I sin péptido unido (es decir, moléculas "vacías") pueden producirse bajo ciertas condiciones restrictivas. Estas moléculas "vacías" son a menudo incapaces de alcanzar la superficie celular, no obstante, puesto que las moléculas de la Clase I sin péptido unido son muy termolábiles. Por tanto, las moléculas de la Clase I "vacías" se desensamblan durante su transporte desde el interior de la célula hacia la superficie celular. Este es un medio elegante mediante el cual el sistema inmune puede asegurar que sólo son destruidas las células que están sintetizando activamente proteínas virales. Por ejemplo, cuando se mata una célula infectada viralmente, está liberará péptidos virales. Si las células vecinas estuvieran expresando moléculas "vacías" de la Clase I -es decir, aquéllas sin péptido unido- estas células serían recubiertas por los péptidosvirales liberados. Puesto que las células T citotóxicas (o células CD8) no tienen forma de discernir cómo o porqué un péptido está unido a una molécula de la Clase I, las células que obtuvieron pasivamente un recubrimiento de péptido viral serían destruidas al igual que aquéllas que están sintetizando activamente las proteínas virales.
Los péptidos virales in vivo son rotos por una gran partícula conocida como el proteosoma. Este complejo enzimático también rompe proteínas celulares normales, lo que sugiere que los péptidos derivados de nuestras propias proteínas celulares compiten con los péptidos derivados de virus por los sitios de unión de las moléculas de la Clase I. Por tanto, sólo algunas de las moléculas de la Clase I sobre la superficie de las célula infectada por virus contienen péptidos virales, puesto que la mayoría de las moléculas de la Clase I contendrán péptidos derivados de nuestras propias proteínas celulares. Puesto que hay cientos de miles de moléculas de la Clase I sobre la superficie de una célula, y puesto que las células CD8 pueden reconocer tan pocas como 200 moléculas de la Clase I cargadas con un determinado péptido viral, esta competición entre péptidos derivados de virus y proteínas celulares no compromete completamente la eficiencia por la que las células CD8 pueden destruir una célula infectada viralmente. Sin embargo, si uno fuera capaz de "diseñar" células para expresar moléculas de la Clase I exhibiendo sólo una especie de péptido antigénico -es decir, si todas las moléculas de la Clase tuvieran el mismo péptido unido a ellas- se puede argumentar que esto incrementaría la eficiencia de la activación de CD8.
Las moléculas de la Clase I unen péptidos de una manera específica. Todos los péptidos tienen que ser de aproximadamente 8-9 aminoácidos de longitud, y sus secuencias deben ajustarse al bolsillo unidor de péptidos de las moléculas de la Clase I. En relación a esto, las moléculas de la Clase I presentan algunos parecidos con los anticuerpos. No obstante, mientras que un anticuerpo determinado tiende a unir sólo un antígeno, una molécula determinada de la Clase I puede unir muchos péptidos diferentes. Puesto que el número de virus y otros patógeno es bastante elevado, es evidente que nuestra defensa inmune sería pobre si tuviéramos sólo una única molécula de la Clase I, incluso si fuera capaz de unir y alterar muchos péptidos diferentes. Por esta razón, todos los humanos tienen entre tres y seis moléculas diferentes de la Clase I, las cuales pueden unir muchos tipos diferentes de péptidos. En consecuencia, las células CD8 pueden reconocer muchos miles de péptidos unidos a una u otra molécula de la Clase I.
Puesto que la selección parece ser la fuerza dominante en la evolución, aparecen patógenos que no pueden ser reconocidos eficientemente por el sistema inmune. Por tanto, una secuencia viral, la cual da lugar a péptidos que se unen eficientemente a una diversidad de moléculas de la Clase I, puede mutar de forma que no sea reconocida por ninguna de las tres a seis moléculas de la Clase I presentes en un individuo. Por tanto, este virus puede no ser reconocido por el sistema inmune, y puede en consecuencia causar la muerte del individuo afectado. Si todos los individuos tuvieran un idéntico conjunto de moléculas de la Clase I, un virus tal puede, de forma concebible, eliminar una especie completa. No obstante, la variación individual es una salvaguardia frente esta posibilidad, puesto que hay unas 100 formas diferentes de moléculas de la Clase I presentes en la población. Por tanto, un virus mutado puede dañar algunos individuos, pero es improbable que resultara en la extinción de una población entera, puesto que individuos diferentes poseen diferentes conjuntos de moléculas de la Clase I.
Si las moléculas de la Clase I pueden unir una diversidad de péptidos, incluyendo péptidos derivados de nuestras propias proteínas celulares, uno puede preguntarse porqué las células CD8 del sistema inmune no reconocen y destruyen nuestros propios tejidos. Mientras que la respuesta a esta cuestión no está completamente clara, actualmente se cree que hay operativos dos mecanismos distintos. Primero, las células CD8 que pueden reaccionar con los péptidos propios son eliminadas en el timo. Segundo, las células CD8 pasan a no responder (anérgicas) a los péptidos propios en los órganos periféricos del sistema inmune. Puesto que cada tipo o epítopo de proteínas celulares no es sintetizado por las células en el timo, el segundo mecanismo aparecería como la explicación más probable. Este mecanismo parece ser operativo para el nivel de péptidos propios que se encuentra normalmente. Si este nivel incrementa de alguna manera, se pueden observar individuos que sí que tienen células CD8 que pueden reconocer y destruir células que expresan péptidos propios. Esta última observación es significativa en relación al concepto de usar el sistema inmune para eliminar células tumorales.
Breve resumen de la invención
Una estrategia más directa para resolver los problemas discutidos más arriba sería estimular directa y específicamente sólo aquellas células CD8 que son relevantes para combatir la enfermedad. Recientes descubrimientos sobre los mecanismos que gobiernan la carga de péptido sobre las moléculas de la Clase I nos permiten hacerlo ahora. Puesto que Drosophila no tiene un sistema inmune, las diversas proteínas implicadas en la maquinaria cargadora del péptido deberían estar ausentes de tales células. Ahora es evidente que la ausencia de maquinaria cargadora de péptido permite que las moléculas de la Clase I sean expresadas como moléculas "vacías" sobre la superficie celular.
Otra ventaja de usar el sistema Drosophila es que las células de Drosophila prefieren una temperatura de 28°C en vez de 37°C. Este hecho es importante, puesto que las moléculas "vacías" de la Clase I son termolábiles y tienden a desintegrarse a 37°C. Mediante incubación de células de Drosophila, que expresan la Clase I, con péptidos que pueden unirse a la molécula de la Clase I, es posible conseguir que cada molécula de la Clase I contenga uno y el mismo péptido. Las células son, en consecuencia, muy diferentes de las células de mamífero, en las que la molécula de la Clase I contiene muchos tipos diferentes de péptidos, la mayoría de los cuales se derivan de nuestra propias, inocuas proteínas celulares.
A pesar de los numerosos, y fallidos, esfuerzos a lo largo de años en cientos de laboratorios para activar específicamente células CD8 in vitro, parece razonable que el nivel elevado de expresión de una molécula de la Clase I conteniendo un único péptido puede superar la necesidad se la estimulación in vivo del sistema. Mediante la incubación de células de Drosophila convenientemente tratadas con células de bazo o nódulo linfático procedentes de ratones no cebados (es decir, ratones que nunca se habían encontrado previamente con los péptidos usados), es posible ahora generar células T citotóxicas que son totalmente específicas para el péptido antigénico. La respuesta citotóxica es usualmente de tres a cinco veces más intensa que la que se obtiene a través de procedimientos previamente conocidos.
Mientras que algunos ejemplos en éste presentan un "modelo" usando moléculas de la Clase I de ratón, se descubren en la presente invención otros ejemplos que usan moléculas de la Clase I humana, o ratones transgénicos expresando moléculas humanas. En un ejemplo, se usa un péptido derivado de la proteína gag del VIH (el virus del SIDA). Esta combinación de moléculas funciona bien; de hecho, funciona tan bien como los experimentos que usan un modelo de ratón puro. Más aún, el sistema actualmente descubierto, el cual usa moléculas humanas en un sistema de Drosophila tal como se descubre, es mucho más versátil que el sistema de ratón descrito en un artículo reciente por DeBruijn et al. (Eur. J. Immunol. 21:2963-2970 (1991)). En concreto, éste último sistema requiere cantidades enormes de células efectoras con objeto de matar efectivamente, y es menos versátil que el sistema descubierto en la presente invención. De forma más importante, el sistema descubierto en la presente invención, a diferencia que el sistema de ratón, eficientemente usa y activa respuestas contra moléculas humanas.
La mayoría de los experimentos, descubiertos en la presente invención, realizados hasta la fecha han usado células intactas de Drosophila. No obstante, se demuestra ahora que pueden obtenerse moléculas vacías, truncadas, a partir de células de Drosophila con buenos rendimientos (aproximadamente 1 mg/ml). Tales moléculas pueden ser útiles para conseguir la inmunosupresión en pacientes trasplantados y para el tratamiento de pacientes con enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide.
En resumen, nuestra dedicación a largo plazo, destinada a comprender los detalles de cómo se generan los péptidos y se cargan sobre moléculas de la Clase I in vivo, ha estimulado el desarrollo de un medio racional y altamente eficiente por el cual las células CD8 pasan a estar activadas con péptidos de nuestra elección. Es nuestra creencia que el uso de tales células activadas puede tener un papel en el tratamiento de una amplia variedad de estados morbosos.
Se descubre ahora, en la presente invención, un medio racional, elegante, de producir, cargar y usar moléculas de la Clase I para activar específicamente células CD8 in vitro. Se descubren además las aplicaciones terapéuticas de esta nueva tecnología en el tratamiento del cáncer, de tumores o neoplasias, así como de enfermedades virales, retrovirales, autoinmunes, y del tipo autoinmune.
La presente invención proporciona un procedimiento para producir in vitro células CD8 activadas, en donde un procedimiento comprende poner en contacto, in vitro, células CD8 con moléculas del MHC de la Clase I humanas cargadas de antígeno, y expresadas sobre la superficie de células de insecto, durante un período de tiempo suficiente para activar, de forma específica para un antígeno, la células CD8. En una variación, las moléculas expresadas sobre la superficie son monotípicas; en otra, las moléculas expresadas sobre la superficie son mono-antigénicas. El procedimiento contemplado en la presente invención puede comprender además (a) separar las células CD8 activadas de las moléculas de la Clase I cargadas de antígeno, (b) suspender las células CD8 activadas en un portador o excipiente aceptable. De acuerdo con los procedimientos descubiertos, los antígenos pueden comprender proteínas o polipéptidos nativos o no degradados, o pueden comprender polipéptidos antigénicos que se han cortado en fragmentos peptídicos, que comprenden al menos 8 residuos aminoácidos, antes de la incubación con las moléculas de la Clase I humanas.
Una célula T CD8 activada mediante los procedimientos de la invención puede usarse en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer, tumor, o neoplasia, infección vírica (por ejemplo, retrovírica), o una condición autoinmune.
El medicamento puede ser apropiado para su administración mediante inyección intravenosa.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 esquematiza la construcción de los plásmidos de expresión pRmHa-2 y pRmHa-3. En la Figura 1A se muestra la construcción del pRmHa-2; en la Figura 1B se muestra la construcción del pRmHa-3M; y en la Figura 1C, se ilustra el vector pRmHa-3, mostrando la restricción, el poliengarce, el promotor, y los sitios de poliadenilación, así como un sitio en el que puede insertarse una secuencia de nucleótidos para su expresión.
La Figura 2A muestra que el K^{b} Clase 1 MHC/\beta2 de ratón (m\beta2) y el D^{b}/m\beta2 expresados en células de Drosophila tienen las características del péptido libre o moléculas "vacías" de la Clase I. Las células de Drosophila que expresaban el K^{b}/\beta2, L^{d}/\beta2, y D^{b}/\beta2 se marcaron durante 45 minutos con 35S-metionina y se prepararon los lisados. Cada lisado se dividió en cuatro alícuotas, a las que se añadió OVA, NP o péptido GP2, o ningún péptido. Después de su incubación durante 1 hora a 4°C, se incubó la otra durante 1 hora a 30°C. A continuación se inmunoprecipitaron las moléculas de la Clase I a partir de los lisados, y se analizaron mediante SDS-PAGE. La Figura 2B ilustra los resultados de un ensayo de lisados de células radiactivos, preparados a partir de células de Drosophila, que expresaban K^{b}/\beta2, L^{d}/\beta2, y D^{b}/\beta2, con microglobulina \beta2 de ratón o humana. Se representa la temperatura de incubación (en °C) frente la inmunoprecipitación de la cadena pesada (en %). Se muestran: K^{b}/m\beta2 (cuadrados vacíos), K^{b}/m\beta2 + OVA (cuadrados rellenos), L^{d}/m\beta2 (triángulos vacíos), L^{d}/m\beta2 + NP (triángulos rellenos), D^{b}/\beta2 (círculos vacíos), y D^{b}/\beta2 + INF (círculos rellenos).
La Figura 3 (A y B) muestra la fluorescencia promedio de células de Drosophila transfectadas, cultivadas en medio carente de suero, según se determinó mediante citofluorimetría, después de teñir el K^{b}/m\beta2 con anticuerpo Y3, y el D^{b}/m\beta2 con el anticuerpo B22.249. Antes de la tinción, y tal como se indica en la figura, las células se incubaron en el péptido (25 \mug/ml) durante una hora a 27°C, seguida por una incubación de 2 hora a 37°C. La fluorescencia media de cada población celular tratada se muestra representada frente a las condiciones de incubación. La Figura 3A muestra que las moléculas de la Clase I expresadas sobre la superficie de células de Drosophila son rápidamente desnaturalizadas a 37°C, de tal forma que ya no pueden ser reconocidas por los anticuerpos anti-Clase I. La Figura 3B muestra que las moléculas del MHC de la Clase I expresadas en células de Drosophila son termolábiles en lisados de Triton X-100 a menos que se preincuben en presencia del péptido que se sabe se une específicamente a la
Clase I.
La Figura 4 ilustra datos procedentes de un experimento diseñado para determinar si las células de insectos pueden procesar antígeno y cargarlo sobre las moléculas de la Clase I, y si éstas últimas pueden presentar, endógena o exógenamente, antígeno derivado a las células T. Se incubaron células Schneider 2 (SC2) o 3T3, transfectadas con K^{b}/\beta2, con proteína ovoalbúmina (OvPro) o el péptido ovoalbúmina OVA 24 (OvPep) en medio isotónico (Iso) o hipertónico (Hyp). La línea celular de ratón BALE/3T3 está disponible a partir de la ATCC bajo el número de acceso CCL 163). Después del tratamiento, las células se cocultivaron con el hibridoma B3/CD8 de célula T. El B3/CD8 es un hibridoma de célula T entre B3 (Carbohe et al., J. Exp. Med. 169:603-612 (1989)), célula T citotóxica específica para el péptido de ovoalbúmina 253-276 presentado por moléculas H-2k^{b} de la Clase I, y la línea celular secretora de IL-2 y portadora de CD8. A partir de la estimulación antigénica, la B3/CD8 produce IL-2, medida mediante incorporación de ^{3}H-timidina en la línea celular CTLL dependiente de IL-2 (Gillis et al., J. Immunol. 120:2027-2029 (1978)). Por tanto, midiendo la cantidad de IL-2 producida, uno puede ensayar el reconocimiento por parte de la célula T.
El sobrenadante procedente de los cultivos se analizó en busca de IL-2 mediante la incorporación de ^{3}H-timidina en parte de la línea celular CTLL dependiente de IL-2 (ATCC nº TIB 214). La cantidad de 3H-timidina incorporada se representa frente los tratamientos iniciales de las células.
La Figura 5A muestra la termoestabilización, inducida por el péptido, de la HLA B27 y HLA A2.1 expresadas sobre la superficie de células de Drosophila por parte de péptidos del VIH. La fluorescencia promedio de cada población celular se muestra representada frente las condiciones de incubación.
La Figura 5B muestra que la HLA B7 expresada en células de Drosophila tiene las características de las moléculas de la Clase I vacías en lisados de Triton X100.
La Figura 5C ilustra que la HLA A2.2Y expresada en células de Drosophila tiene las características de las moléculas de la Clase I vacías en lisados de Triton X100.
La Figuras 6 ilustra la inducción de la respuesta de CD8 primaria después de la estimulación in vitro de CD8 en presencia o ausencia de péptidos. Las que responden son células B6 del bazo de ratón, y las estimulantes son RMA-S (triángulos vacíos); RMA-S más OVA (triángulos rellenos); Drosophila más OVA (cuadrados vacíos); y K^{b} de Drosophila más OVA (cuadrados rellenos). En 6A, la diana son células RMA-S y el péptido de ovoalbúmina; en 6B, la diana son células RMA-S. En ambos diagramas se representa el porcentaje de lisis respecto la proporción de efector/diana.
La Figura 7 ilustra la respuesta de inducción después de la estimulación in vitro de CD8 con células de Drosophila en presencia o ausencia de péptido. En 7, los esplenocitos C57 B1/6 que responden son estimulados con células de K^{b} de Drosophila y OVA. Las células diana incluyen: EL4 (cuadrados vacíos con un punto en el centro); EL4 OVA (rombos rellenos); EL4 + péptido de OVA (cuadrados negros con un punto blanco en el centro); RMA-S + péptido de OVA (diamantes negros con un punto blanco en el centro); y RMA-S (cuadrados sólidos). Se representa el porcentaje de lisis respecto la proporción de efector/diana.
La Figura 8 (A y B) ilustra el cebado in vivo con células transfectadas de Drosophila, en donde las que responden son esplenocitos C57 B1/6 de ratón. En 8A, algunas de las células están fijadas; en 8B, las células de Drosophila están todas sin fijar. En 8A las células estimulantes de mosca son tal como sigue: K^{b} (cuadrados vacíos con un punto central); K^{b} OVA fijadas (rombos rellenos); K^{b} OVA fijadas + S/N (cuadrado negro con un punto blanco en el centro); K^{b} OVA (sin fijar) (rombo negro con un punto blanco en el centro). En 8B, las células estimulantes de mosca se ilustran como sigue: K^{b} (cuadrados vacíos con un punto central); K^{b}/OVA (rombos rellenos); K^{b}/OVA in vivo/K^{b}/OVA in vitro (cuadrados rellenos con un punto blanco en el centro); K^{b}/OVA in vivo/D^{b}/OVA in vitro (rombos rellenos con un punto blanco en el centro); y D^{b} OVA (cuadrados rellenos). En ambas, A y B, se representa el porcentaje de lisis respecto la proporción de efector/diana.
La Figura 9 ilustra el resultado de un experimento en el que se inyectaron células C57BL/6 de ratón con 3MM EL4 OVA y, subsiguientemente, con células de Drosophila y sin células. El porcentaje de supervivencia de cada una de las tres poblaciones de ratón se representa respecto el número de días de supervivencia. El grupo I (rombos rellenos) recibió una inyección subcutánea de células 50MM de Drosophila vivas, que expresaban K^{b}/OVA, 5 días después de la inyección de EL4; el grupo II (cuadrados vacíos) recibió células 50 MM de Drosophila fijadas, que expresaban K^{b}/OVA, 5 días después de la inyección de EL4; y el grupo III (círculos rellenos), el grupo control, no recibió inyecciones adicionales. Los ratones del grupo II se sacrificaron el día 20; los ratones del grupo III el día 23.
Las Figuras 10A, B, y C ilustran la activación in vitro con células transfectadas de Drosophila. En ambas, A y B, las células que responden eran células de bazo de ratón transgénicas de la B7/humana microglobulina \beta2. Las células diana eran Jurkat (cuadrados vacíos con un punto central), y Jurkat recubiertas con el péptido A GAG de VIH (rombos rellenos), tal como se ilustra en ambas, A y B. En 10A, las células estimulantes son células de Drosophila con el GAG B7 del VIH (A); en 10B, éstas son células de Drosophila con B7. En 10C, las células que responden son células de bazo de ratón transgénico B7 estimuladas mediante VPR B7 de Drosophila. Las células diana son Jurkat (cuadrados vacíos con un punto central); Jurkat/VPR (rombos rellenos); RMA-S (cuadrados rellenos); y RMA-S/VPR (rombos vacíos con un punto central). El porcentaje de lisis se presenta respecto la proporción de efector/diana en A, B y C.
Las Figuras 11A, B, y C ilustran la activación in vitro con células de Drosophila transfectadas. En 11A, las células que responden son PBL HLA B7 humanas estimuladas con células B7 VPR de Drosophila. El porcentaje de lisis se presenta respecto la proporción de efector/diana. Las células diana son Jurkat VPR (cuadrados vacíos con un punto central); EL4 B7 (rombos rellenos); Jurkat (cuadrados rellenos); y EL4 B7 VPR (rombos rellenos con un punto central). En 11B, las células que responden son PBL HLA2 humanos estimulados con células A2 GAG (A) (VIH) de Drosophila. El porcentaje de lisis se presenta respecto la proporción de efector/diana. Las células diana son Jurkat A2 (rombos rellenos) y Jurkat A2 GAG (A) (cuadrados vacíos con un punto central). En 11C, las células que responden son PBL B27 humanos estimulados con células B27 VPR (VIH) de Drosophila. Las células diana son Jurkat A2 (rombos rellenos) y Jurkat A2 GAG (A) (cuadrados vacíos con un punto central). El porcentaje de lisis se presenta respecto la proporción de efector/diana.
La Figura 12 ilustra la activación in vitro con células transfectadas de Drosophila. Las células que responden son PBL HLA A2.1 humanos estimulados con células A2.1 de Drosophila recubiertas con péptido POL de VIH. El porcentaje de lisis se presenta respecto la proporción de efector/diana. Las células diana son Jurkat A2.1 de VIH (cuadrados vacíos con un punto central) y Jurkat A2.1 (rombos rellenos).
Descripción detallada de la invención A. Definiciones
Aminoácido: Todos los residuos aminoácidos identificados en la presente invención tienen la configuración L natural. De acuerdo con la nomenclatura estándar de polipéptidos, J. Biol. Chem. 243:3557-3559 (1969), las abreviaturas de los residuos aminoácidos son tal como se muestran en la siguiente Tabla de Correspondencias:
TABLA DE CORRESPONDENCIAS
Símbolo Aminoácido
1 Letra 3 Letras
Y Tyr L-tirosina
G Gly glicina
F Phe L-fenilalanina
M Met L-metionina
A Ala L-alanina
S Ser L-serina
I Ile L-isoleucina
L Leu L-leucina
T Thr L-treonina
V Val L-valina
P Pro L-prolina
K Lys L-lisina
H His L-histidina
Q Gln L-glutamina
E Glu ácido L-glutámico
W Trp L-triptófano
R Arg L-arginina
D Asp ácido L-aspártico
N Asn L-asparagina
C Cys L-cisteína
Debería destacarse que todas las secuencias de residuos aminoácidos se representan con una fórmula cuyo orientación de izquierda a derecha está en la dirección convencional de extremo amino-terminal a extremo carboxi-terminal.
Par de bases (pb): es una pareja de adenina (A) con timina (T), o de citosina (C) con guanina (G) en un doble hélice de ADN.
Clon: describe un gran número de células o moléculas idénticas con una única célula o molécula ancestral.
Bases complementarias: los nucleótidos que normalmente se emparejan cuando el ADN o ARN adopta una configuración de doble hebra.
Secuencia de nucleótidos complementaria: una secuencia de nucleótidos en una molécula de ADN o ARN de hebra única que es suficientemente complementaria a aquélla en otra hebra única como para hibridarse específicamente con ésta con los consiguientes puentes de hidrógeno.
Conservada: una secuencia de nucleótidos está conservada con respecto a una secuencia previamente seleccionada (de referencia) si se hibrida de forma no aleatoria, hasta una complementariedad exacta, con la secuencia previamente seleccionada.
Cadena abajo: identifica secuencias que progresan más allá en la dirección de expresión; por ejemplo, la región codificante de un polipéptido para un gen está cadena abajo respecto el codón de inicio.
Expresión: el proceso sufrido por un gen estructural para producir un polipéptido. Es una combinación de transcripción y traducción.
Gen (Cistrón): un ácido nucleico cuya secuencia nucleotídica codifica un ARN o un polipéptido. Un gen puede ser de ARN o ADN. También puede incluir regiones que preceden o siguen a la región codificante (líderes o traileres), así como secuencias intercaladas (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).
Hibridación: el emparejamiento de secuencias nucleotídicas sustancialmente complementarias (hebras de ácidos nucleicos) para formar un dúplex o heterodúplex mediante el establecimiento de puentes de hidrógeno entre pares de bases complementarias. Es una interacción específica, es decir, no es aleatoria, entre dos polinucleótidos complementarios que puede ser inhibida competitivamente.
Ligando: el ligando se refiere a una molécula que contiene una porción estructural que está unida mediante interacción específica con una proteína receptora determinada.
Nucleótido: una unidad monomérica de ADN o ARN, consistente en una porción azúcar (pentosa), un grupo fosfato, y una base nitrogenada heterocíclica. La base está unida a la porción azúcar mediante un enlace glicosídico (al carbono 1' de la pentosa), y esa combinación de base y azúcar es un nucleósido. Cuando el nucleósido contiene un grupo fosfato unido en la posición 3' o 5' de la pentosa, se denomina nucleótido. Una secuencia de nucleótidos operativamente unidos se denomina típicamente en la presente invención como "una secuencia de bases" o "secuencia nucleotídica", y sus equivalentes gramaticales, y se representa en la presente invención mediante una fórmula cuya orientación de izquierda a derecha está en la dirección convencional del extremo 5' al extremo 3'.
Oligonucleótido o polinucleótido: un polímero de nucleótidos de hebra única o doble. Tal como se usa en la presente invención, "oligonucleótido", y sus equivalentes gramaticales, incluirán un rango completo de ácidos nucleicos. Un oligonucleótido se referirá típicamente a una molécula de ácido nucleico formada por una hebra lineal de ribonucleótidos. El tamaño exacto dependerá de muchos factores, los cuales a su vez dependen de la condición final de uso, tal como es bien sabido en la técnica.
Pauta de lectura abierta: una secuencia nucleotídica, usualmente una secuencia de ADN, la cual es (potencialmente) traducible en una proteína.
Polipéptido o péptido son términos usados de forma intercambiable en la presente invención para designar una serie lineal de residuos aminoácidos, conectados los unos a los otros mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carboxilo de residuos adyacentes.
Receptor: Receptor y proteína receptora son términos usados de forma intercambiable en la presente invención para indicar un molécula proteica biológicamente activa que une específicamente a (o con) otras moléculas.
Molécula de ADN recombinante (rADN): una molécula de ADN producida uniendo operativamente una secuencia de ácido nucleico, tal como un gen, a una secuencia de molécula de ADN de la presente invención. Por tanto, una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN híbrida que comprende, al menos, dos secuencias nucleotídicas que normalmente no se encuentran juntas en la naturaleza. Los rADN que no tienen un origen biológicamente común, es decir, que son evolutivamente distintos, se dice de son "heterólogos".
Sustancialmente homólogo quiere decir que una secuencia o molécula determinada, por ejemplo, una secuencia mutante que es sujeto, varía respecto una secuencia de referencia mediante una o más sustituciones, supresiones, o adiciones, el efecto neto de las cuales no resulta en una diferencia funcional adversa entre las secuencias de referencia y del sujeto. Para los propósitos de la presente invención, se consideran sustancialmente homólogas las secuencias de aminoácidos que tienen más del 90 por ciento de similitud, actividad biológica equivalente, y características de expresión equivalentes, Las secuencias de aminoácidos que tienen más del 40 por ciento de similitud se consideran sustancialmente similares. Para los propósitos de determinar la homología o similitud, deberían descartarse la truncación o supresiones internas de la secuencia de referencia, así como también también deberían descartarse las modificaciosn subsiguientes de la molécula, por ejemplo, la glicosilación. Las secuencias que tienen niveles de homología inferiores y bioactividad comparable se consideran equivalentes.
Transfección: es la adquisición de nuevos marcadores genéticos mediante la incorporación de ADN añadido en células eucariotas.
Vector: un ácido nucleico, preferiblemente una molécula de ADN, capaz de replicación autónoma en una célula, y al cual se puede unir operativamente un segmento de ácido nucleico, por ejemplo, un gen o polinucleótido (preferiblemente de ADN), para incorporar la replicación del segmento unido. Los vectores capaces de dirigir la expresión de segmentos (genes) de ácidos nucleicos (preferiblemente de ADN) que codifican una o más proteínas, se denominan en la presente invención "vectores de expresión". Otra variedad de vectores importante permite la clonación de cADN (ADN complementario) a partir de mARN producidos usando la transcriptasa inversa.
Vector de clonación: es cualquier plásmido o virus en el que puede insertarse una secuencia nucleotídica ajena (preferiblemente ADN) a clonar.
Vector de expresión: es cualquier plásmido o virus en el que puede insertarse o expresarse una secuencia nucleotídica ajena (preferiblemente ADN).
B. Descripción detallada 1. Moléculas del MHC de la Clase 1 humanas
Una molécula del MHC de la Clase I humana de la presente invención se selecciona de entre el grupo formado por HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, y HLA-G, y más preferiblemente, de entre el grupo comprendido por HLA-A, HLA-B, y HLA-C.
Aunque es posible aislar secuencias nucleotídicas que codifican moléculas del MHC de la Clase I procedentes de líneas celulares, establecidas y bien conocidas, portadoras de las variantes apropiadas -por ejemplo, las líneas celulares transformadas JY, BM92, WIN, MON Y MG- es más práctico sintetizar la secuencia nucleotídica, a partir de una porción del gen, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores apropiados. Este procedimiento se ha usado exitosamente para clonar el cADN de longitud completa de HLA; por ejemplo, las secuencias para HLA-A25, HLA-A2, HLA-B57, HLA-51, y HLA-37 están depositadas en la base de datos GenBank con los números de acceso M32321, M32322, M32317, M32318, M32319 y M32320, respectivamente. Están publicadas secuencias de nucleótidos y aminoácidos parciales y putativas del HLA, incluyendo la secuencia consenso (ver, por ejemplo, Zemmour y Parham, Immunogenetics 33:310-320 (1991)), y se conocen, y están generalmente disponibles, líneas celulares que expresan variantes del HLA, muchas de ellas a partir de la American Type Culture Collection ("ATCC"). Por tanto, usando la PCR, es posible sintetizar secuencias nucleotídicas que codifican el MHC de la Clase I humana, las cuales pueden a continuación unirse de forma operativa a un vector, y usarse para transformar un célula apropiada y expresarlas en la presente invención.
Los procedimientos particularmente preferidos para producir las moléculas del MHC de la Clase I humanas y moléculas de la microglobulina \beta2 humana de la presente invención se basan en el uso de oligonucleótidos preselecionados como cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para formar productos de reacción de la PCR tal como se describe en la presente invención. LA preparación de los genes del MHC y de la microglobulina \beta2 se consigue típicamente mediante la extensión del cebador, preferiblemente mediante la extensión del cebador en un formato de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Si los genes han de producirse mediante amplificación (PCR), deben usarse dos cebadores, es decir, un par cebador de PCR, para cada hebra codificantes de ácido nucleico a amplificar. (Por motivos de simplicidad, se discutirá la síntesis de una variante de HLA de ejemplo, pero debe sobrentenderse expresamente que el procedimiento de amplificación mediante PCR descrito es igualmente aplicable a la síntesis de microglobulina \beta2 y todas las variantes de HLA, incluyendo aquéllas cuyas secuencias completas son actualmente desconocidas). El primer cebador pasa a formar parte de la hebra sin sentido (negativa o complementaria) y se hibrida a una secuencia nucleotídica conservada de entre las hebras (positivas o codificantes) de HLA. Para producir homólogos del ADN codificante, los primeros cebadores se escogen, por tanto, para que se hibriden a (es decir, sean complementarios de) regiones conservadas dentro de los genes del MHC, preferiblemente la secuencia consenso o similar, regiones conservadas dentro de cada grupo de HLA -es decir, secuencias consenso dentro de HLA-A, HLA-B, HLA-C, y los grupos menos polimórficos HLA-E, -F y -G. Los segundos cebadores pasan a formar parte de la hebra codificante (positiva) y se hibridan a una secuencia nucleotídica conservada entre las hebras negativas. Para producir los homólogos del ADN codificante de HLA, los segundos cebadores se escogen, por tanto, para hibridarse a una secuencia nucleotídica conservada en el extremo 5' del gen que codifica HLA, así como en aquella área que codifica la región líder o primera estructural. Debería destacarse que en la amplificación de los homólogos de ADN codificante, la secuencia nucleotídica 5' conservada del segundo cebador puede ser complementaria a una secuencia añadida exógenamente usando la transferasa de desoxinucleotidil terminal, tal como describieron Loh et al., Science 243:217-220 (1989). Uno o ambos de los cebadores primero y segundo pueden contener una secuencia nucleotídica que defina un sitio de reconocimiento de endonucleasa. Es sitio puede ser heterólogos al gen de la inmunoglobulina que se está amplificando, y típicamente aparece en o cerca del extremo 5' del cebador.
El primer cebador de un par cebador de PCR se denomina en la presente invención "cebador con sentido", puesto que se hibrida con la hebra codificante o con sentido de un ácido nucleico. Además, el segundo cebador de un par cebador de PCR se denomina en la presente invención "cebador anti-sentido", puesto que se hibrida con la hebra no codificante o anti-sentido de un ácido nucleico, es decir, una hebra complementaria a una hebra codificante. Una pluralidad de primer cebador y/o una pluralidad de segundos cebadores pueden usarse para formar diferentes pares cebadores. Alternativamente, puede usarse un par individual de primero y segundo cebadores. En cualquier caso, los productos de amplificación de las amplificaciones que usan la misma o diferentes combinaciones de primero y segundo cebadores pueden combinarse para incrementar la diversidad de la biblioteca de genes.
Cuando está presente, la porción que define el sitio de restricción está típicamente ubicada en una porción 5' no cebadora del cebador. El sitio de restricción definido por el primer cebador se escoge típicamente para que sea uno reconocido por un enzima de restricción que no reconozca el sitio de restricción definido por el segundo cebador, siendo el objetivo ser capaz de producir una molécula de ADN que tiene extremos adhesivos que no son complementarios entre ellos, y que, por tanto, permiten la inserción en una dirección en un vector.
En una realización, la presente invención utiliza un conjunto de polinucleótidos para formar cebadores que tienen una región cebadora ubicada en el extremo 3' del cebador. La región cebadora corresponde típicamente a las 15 a 30 bases de nucleótidos más 3' (3'-terminales). La porción cebadora 3'-terminal de cada cebador es capaz de actuar como un cebador para catalizar la síntesis de ácidos nucleicos, es decir, inicial una reacción de extensión del cebador a partir de su extremo 3'. Uno o ambos cebadores pueden adicionalmente contener una porción no cebadora 5'-terminal (la más 5'), es decir, una región que no participa en la hibridación de la plantilla de HLA.
En PCR, cada cebador trabaja en combinación con un segundo cebador para amplificar una secuencia diana de ácido nucleico. La elección de pares cebadores de PCR para su uso en PCR está gobernada por consideraciones como la que se discuten en la presente invención para producir moléculas del MHC de la Clase I y microglobulina \beta2. Esto es, los cebadores tienen una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia conservada en el gen de elección. Las secuencias cebadoras útiles se descubren en la presente invención más adelante.
La estrategia usada para clonar los genes de HLA dependerá, como es bien sabido en la técnica, del tipo, complejidad, y pureza de los ácidos nucleicos que conforman los diversos genes del HLA. Otros factores incluyen, si los genes han de ser amplificados y/o mutados.
En general, los genes del HLA están formados por hebras que codifican polinucleótidos, tales como la del mARN y/o la hebra con sentido del ADN genómico. Si el HLA está en forma de ADN genómico de doble hebra, habitualmente se desnaturaliza primero, típicamente fundiéndolo, en hebras sencillas. Una secuencia de HLA se somete a una reacción de PCR tratando (o poniendo en contacto) la secuencia con un par cebador de PCR, teniendo cada miembro del par una secuencia nucleotídica preseleccionada. El par cebador de PCR es capaz de iniciar las reacciones de extensión del cebador hibridándose a las secuencias nucleotídicas, preferiblemente a al menos 10 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente a al menos aproximadamente 20 nucleótidos en longitud, conservados dentro de la secuencia de HLA.
La reacción de la PCR se realiza mezclando el par cebador de la PCR, preferiblemente una cantidad predeterminada del mismo, con ácidos nucleicos del gen de la HLA, preferiblemente una cantidad predeterminada de los mismos, en un tampón de la PCR, para formar un mezcla de reacción de la PCR. La mezcla se mantiene en condiciones de síntesis de polinucleótidos durante un período de tiempo, el cual está típicamente predeterminado, suficiente para la formación de un producto de reacción de la PCR, produciendo, por tanto, una pluralidad de diferentes homólogos de ADN que codifican el HLA.
En otra estrategia, el objeto es clonar los genes codificando la variante de HLA a partir de una variante de HLA proporcionando un complemento de polinucleótido del HLA, tal como la hebra anti-sentido del dsADN genómico o el polinucleótido producido sometiendo el mARN a una reacción de transcriptasa inversa. Los procedimientos para producir tales complementos son bien conocidos en la técnica.
La reacción de la PCR se realiza usando cualquier procedimiento apropiado. Generalmente ocurre en una solución acuosa tamponada, es decir, un tampón de PCR, preferiblemente a un pH de 7-9, más preferiblemente aproximadamente a 8. Preferiblemente, se mezcla un exceso molar (para ácido nucleico genómico, usualmente aproximadamente 10^{6}:1 cebador:plantilla) del cebador con el tampón que contiene la hebra de plantilla. Se prefiere un gran exceso molar para mejorar la eficiencia del proceso.
El tampón de la PCR también contiene preferiblemente los trifosfatos de desoxirribonucleótido, dATP, dCTP, dGTP, y dTTP, y una polimerasa, típicamente termoestable, todo en las cantidades apropiadas para la reacción de extensión del cebador (síntesis de polinucleótidos). La solución resultante (mezcla de la PCR) se calienta a aproximadamente 90°C-100°C durante aproximadamente 1 a 10 minutos, preferiblemente de 1 a 4 minutos. Después de este período de calentamiento, se deja enfriar la solución hasta 54°C, que es preferible para la hibridación del cebador. La reacción de síntesis puede ocurrir a, desde temperatura ambiente hasta una temperatura por encima de la cual la polimerasa (agente inductor) ya no funciona eficientemente. Por tanto, por ejemplo, si se usa la polimerasa de ADN como agente inductor, la temperatura no es generalmente superior a aproximadamente 40°C. Un ejemplo de tampón de la PCR comprende lo siguiente: KCl 50 mM; Tris-HCl 10 mM; pH 8,3; MgCl_{2} 1,5 mM; gelatina al 0,001% (peso/volumen); dATP 200 \muM; dATP 200 \muM; dTTP 200 \muM; dCTP 200 \muM; y dGTP 200 \muM; 2,5 unidades de polimerasa I de ADN de Thermus aquaticus (patente estadounidense nº 4.889.818) por 100 microlitros de tampón.
El agente inductor puede ser cualquier compuesto o sistema que funcionará para conseguir la síntesis de productos de extensión del cebador, incluyendo los enzimas. Los enzimas apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, la polimerasa I de ADN de E. coli, el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN de E. coli, la polimerasa de ADN del T4, otras polimerasas de ADN disponibles, la transcriptasa inversa, y otros enzimas, incluyendo enzimas termoestables, los cuales facilitarán la combinación de los nucleótidos libres en la disposición correcta para formar los productos de extensión del cebador que son complementarios a cada hebra de ácido nucleico. Generalmente, la síntesis se iniciará en el extremo 3' de cada cebador, y procederá en la dirección 5' a lo largo de la hebra de plantilla, hasta que se termine la síntesis, produciendo moléculas de diferentes longitudes. No obstante, puede haber agentes que iniciaran la síntesis en el extremo 5' y procedieran en la dirección anterior, usando el mismo proceso que se ha descrito más arriba.
El agente inductor también puede ser un compuesto o sistema que funcionaría para conseguir la síntesis de productos de extensión del cebador de ARN, incluyendo enzimas. En las realizaciones preferidas, el agente inductor puede ser una polimerasa de ARN dependiente de ADN, tal como la polimerasa de ARN del T7, la polimerasa de ARN del T3, o la polimerasa de ARN de SP6. Estas polimerasas producen un polinucleótido de ARN complementario. La elevada velocidad de recambio de la polimerasa de ARN amplifica el polinucleótido inicial, tal como ha sido descrito por Chamberlin et al., The Enzymes, ed. P. Boyer, pp. 87-108, Academic Press, Nueva York (1982). Otra ventaja de la polimerasa de ARN de T7 es que pueden introducirse mutaciones en la síntesis del polinucleótido remplazando una porción de cADN con uno o más oligodesoxinucleótidos (polinucleótidos) mutados y transcribiendo directamente la plantilla parcialmente desaparejada, tal como ha sido previamente descrito por Joyce et al., Nuc. Acid Res. 17:711-722 (1989). Los sistemas de amplificación basados en la transcripción han sido descritos por Gingeras et al., en PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, 245-252, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990).
Si el agente inductor es una polimerasa de ARN dependiente de ADN, e incorpora por tanto trifosfatos de ribonucleótidos, se mezclan cantidades suficientes de ATP, CTP, GTP y UTP con la mezcla de extensión del cebador y la solución resultante se trata tal como se describe más arriba.
La hebra sintetizada de nuevo y su hebra de ácido nucleico complementaria forman una molécula de doble hebra, la cual puede usarse en los pasos siguientes del proceso.
Después de procesar homólogos de ADN que codifican la variante del HLA, para uno o una pluralidad de genes diferentes dentro del sistema del HLA, las moléculas de ADN se amplifican típicamente aún más. Mientras que las moléculas de ADN pueden ser amplificadas mediante técnicas clásicas, tales como la incorporación en un vector de replicación autónomo, se prefiere amplificar primero las moléculas sometiéndolas a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) antes de insertarlas en un vector. La PCR se realiza típicamente mediante termociclado, es decir, incrementando y disminuyendo repetidamente la temperatura de una mezcla de reacción de la PCR dentro de un rango de temperaturas cuyo límite inferior es desde aproximadamente 10°C hasta 40°C, y cuyo límite superior es desde aproximadamente 90°C hasta 100°C. El incremento y disminución puede ser continuo, pero es preferiblemente por fases, con períodos de tiempo de estabilidad relativa de la temperatura a cada temperatura, favoreciendo la síntesis de polinucleótido, la desnaturalización y la hibridación.
Los procedimientos de amplificación mediante la PCR se describen en detalle en las patentes estadounidenses nº 4.683.192, 4.683.202, 4.800.159, y 4.965.188, y al menos en varios textos, incluyendo "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", Ed. H. Erlich, Stockton Press, Nueva York (1989); y "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Eds. Innis et al., Academic Press, San Diego, California (1990). Varios procedimientos y cebadores usados en la presente invención se describen en la presente invención más adelante, y son descritos también, por ejemplo, por Nilsson et al., Cell 58:707 (1989), Ennis et al., PNAS USA 87:2833-2837 (1990), y Zemmour et al., Immunogenetics 33:310-320 (1991). En concreto, se prefiere diseñar cebadores a partir de la comparación de regiones 5' y 3' no traducidas de alelos de la HLA (por ejemplo, alelos -A, -B, -C, -E, -F o -G), con selección de secuencias conservadas. Los sitios de restricción también pueden incorporarse en cebadores 5' y 3' para permitir que los productos de la amplificación fueran subclonados en vectores de secuenciación y expresión. También puede ser útil colocar un espaciador con una secuencia de 4-bases proximal al sitio de restricción para mejorar la eficiencia para cortar los productos de amplificación con enzimas.
Se prefirieron los siguientes cebadores para la amplificación del cADN de HLA-A, -B, -C, -E, -F y -G, preferiblemente en reacciones separadas. Los cADN resultantes pueden clonarse y secuenciarse a continuación tal como se describe en la presente invención. Estos cebadores son apropiados para su uso en amplificar todos los tipos de HLA conocidos y actualmente desconocidos.
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En una realización preferida, sólo un par de cebadores primero y segundo se usa por reacción de amplificación. A continuación se combinan los productos de la reacción de amplificación obtenidos a partir de una pluralidad de amplificaciones diferentes, cada una usando una pluralidad de pares cebadores diferentes. No obstante, la presente invención también contempla la producción de ADN homólogo a través de co-amplificación (usando dos pares de cebadores), y la amplificación múltiple (usanda hasta aproximadamente 8, 9 o 10 pares cebadores).
El proceso de la PCR se usa no sólo para producir una variedad de moléculas de ADN que codifican la Clase I humana, sino también para inducir mutaciones que pueden emular aquéllas observadas en los locus altamente polimórficos del HLA, o para crear diversidad a partir de un único clon progenitor, y proporcionar por tanto una "biblioteca" de ADN codificando una molécula del MHC de la Clase I que tiene una mayor heterogeneidad. Primero, debería destacarse que el proceso de la PCR por sí mismo es inherentemente mutagénico, debido a una diversidad de factores bien conocidos en la técnica. Segundo, además de las variaciones inductoras de mutación descritas en la patente estadounidense nº 4.683.195 antes citada, pueden emplearse otras variaciones de la PCR inductoras de mutación. Por ejemplo, la mezcla de reacción de la PCR puede formarse con cantidades diferentes de uno o más nucleótidos a ser incorporados en el producto de extensión. Bajo tales condiciones, la reacción de la PCR procede para producir sustituciones de nucleótidos dentro del producto de extensión, a resultas de la escasez de un base determinada. Similarmente, pueden incorporarse en la mezcla inicial de reacción de la PCR cantidades molares aproximadamente iguales de los nucleótidos en una cantidad para realizar eficientemente un número X de ciclos, y a continuación ciclar la mezcla a través de un número de ciclos en exceso respecto X, tal como, por ejemplo 2X. Alternativamente, las mutaciones durante la PCR pueden inducirse mediante incorporación en una mezcla de reacción de derivados de nucleótidos, tales como inosina, que normalmente no se encuentran en los ácidos nucleicos de las variante de HLA que se está amplificando. Durante la subsiguiente amplificación in vivo, el derivado del nucleótido será remplazado por un nucleótido sustituto, induciendo por tanto una mutación localizada.
Un procedimiento preferido, el cual puede utilizarse para clonar una secuencia de nucleótidos que se puediera expresar, que codificara el MHC de la Clase I humana, es como sigue. Puede cultivarse células que contuvieran el(los) gene(s) de elección en un medio apropiado (por ejemplo, RPMI 1640), suplementado según se precise (por ejemplo, con suero fetal bovino y/o antibiótico). Se prepara el ARN celular total a partir del cultivo de elección y a continuación se sintetiza el cADN de primera hebra. El cADN puede sintetizarse usando, por ejemplo, oligo(dT) y la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis de la aves. También puede usarse el radiomarcaje para asistir en el aislamiento y la recuperación del producto clonado. A continuación, el producto preferiblemente se extrae, se precipita, y se usa como diana para la PCR de amplificación, usando el par cebador de la PCR apropiado tal como se describe en esta. La amplificación puede llevarse a cabo usando procedimientos y equipos disponibles, por ejemplo, los equipos GeneAmp y un ciclador térmico (Perkin-Elmer/Cetus). También son útiles varios protocolos; un protocolo de amplificación progresa durante 30 ciclos, en los que cada ciclo consiste en 60 segundos a 94°C, 60 segundos a 65°C, y 90 segundos a 72°C, seguidos por 10 minutos a 72°C. Otro protocolo progresa durante 20 ciclos, con 60 segundos a 94°C, un segundo a 65°C, y un tiempo variable a 72°C, el cual empieza a aproximadamente 50 segundos e incrementa gradualmente en un segundo en cada ciclo. La amplificación finaliza entonces con 10 minutos a 72°C.
Típicamente, el producto de la PCR se subclona a continuación y se secuencia de acuerdo con procedimientos conocidos. Por ejemplo, el producto puede extraerse y extraerse de nuevo (por ejemplo, con fenol/cloroformo), precipitarse, y digerirse con un enzima apropiado -por ejemplo, HindIII- durante un intervalo de tiempo apropiado. El producto doblemente cortado se aísla y purifica (por ejemplo, con cuentas de vidrio) y se liga a vectores igualmente cortados. A continuación se selecciona un vector apropiado en base a las características de la línea celular seleccionada para expresar la molécula del MHC. Por ejemplo, uno puede expresar el MHC en E. coli con el propósito de recuperar el MHC para su análisis secuencial. Alternativamente, uno puede expresar el MHC en una linea celular transformada de la presente invención con el propósito de activar células CD8. Por tanto, la selección de vectores apropiados se descubre con mayor detalle en otras partes en esta sección.
2. Vectores de expresión del ADN
Un vector de la presente invención es una molécula de ácido nucleico (preferiblemente ADN) capaz de replicación autónoma en una célula, y al cual puede unírsele operativamente un segmento de ADN (por ejemplo, un gen o polinucleótido) para proporcionar la replicación del segmento unido. En la presente invención, uno de los segmentos de nucleótido a unir operativamente a las secuencias del vector, codifica al menos una parte de la molécula del MCH de la Clase I. Preferiblemente, la secuencia del gen del MHC que codifica el péptido se inserta entera en el vector y se expresa; no obstante, también es factible construir un vector que también incluya algunas secuencias no codificantes del MCH. Preferiblemente se excluyen las secuencias no codificantes del MHC. Otro vector preferido incluye una secuencia nucleotídica que codifica al menos una porción de una molécula microglobulina \beta2 de mamífero unida operativamente al vector para su expresión. Es también posible construir un vector que incluya secuencias nucleotídicas que codifican ambas, la molécula del MHC de la Clase I y la microglobulina \beta2.
Un vector preferido comprende un cassette que incluye una o más secuencias de ADN traducibles, unidas operativamente para su expresión a través de una secuencia de nucleótidos adaptada para la ligadura en una dirección. El cassette incluye preferiblemente secuencias de control control de la expresión del ADN para expresar el polipéptido o proteína que se produce cuando una secuencia traducible de ADN se inserta en una dirección en el cassette a través de la secuencia de nucleótidos adaptadas para la ligadura en una dirección. El cassette también incluye preferiblemente una secuencia promotora cadena arriba respecto la secuencia traducible, y una secuencia de poliadenilación cadena abajo respecto la secuencia del MHC de mamífero. El cassette también puede incluir un marcador de selección, aunque se prefiere que tal marcador esté codificado en una secuencia nucleotídica operativamente unida a otra secuencia del vector de expresión.
Un vector de expresión se caracteriza porque es capaz de expresar, en un huésped compatible, un producto de un gen estructural, tal como un polipéptido del MHC de la Clase I humana, una microglobulina \beta2, o ambas.
Tal como se usa en la presente invención, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar entre entornos genéticos diferentes otro ácido nucleico al cual ha sido unida operativamente. Los vectores preferidos son aquéllos capaces de replicación autónoma y de expresión de los productos de genes estructurales presentes en los segmentos de nucleótidos (ADN) a los que están unidos operativamente.
Tal como se usa en la presente invención, en relación a las secuencias o segmentos de ADN, la frase "operativamente unido" significa que las secuencias o segmentos han sido unidos covalentemente dentro de una pieza de ADN, no importa si en forma de hebra única o doble.
La elección del vector al que está unido operativamente un cassette depende directamente, como es bien sabido en la técnica, de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, la replicación del vector y la expresión de la proteína, y de la célula huésped a ser transformada, siendo éstas limitaciones inherentes en la técnica de construcción de moléculas de ADN recombinantes.
En varias realizaciones, se utiliza un vector para la producción de polipéptidos útiles en los procedimientos de la presente invención, incluyendo variantes del MHC y péptidos antigénicos. Tales vectores se utilizan preferiblemente en conjunción con células "huésped" bacterianas adaptadas para la producción de cantidades útiles de proteínas o polipéptidos. Tales vectores pueden incluir un replicón eucariota, es decir, una secuencia de nucleótidos que tiene la capacidad de replicación directa autónoma y de mantener la molécula de ADN recombinante extra-cromosomalmente en una célula huésped procariota, tal como una célula huésped bacteriana, transformada con la misma. Tales replicones son bien conocidos en la técnica. Además, aquellas realizaciones que incluyen un replicón procariota pueden incluir también un gen cuya expresión confiere una ventaja selectiva, tal como la resistencia a drogas, a un huésped bacteriano transformado con el mismo. Los genes bacterianos típicos de la resistencia a drogas son aquéllos que confieren resistencia contra la ampicilina o tetraciclina. Los vectores típicamente contienen también sitios de restricción apropiados para la inserción de secuencias nucleotídicas traducibles. Los ejemplos de vectores incluyen los plásmidos pUC8, pUC9, pUC18, pBR322, y pBR329, disponibles en BioRad Laboratories (Richmond, CA), pPL y pKK223, disponibles en Pharmacia (Piscataway, NJ), y pBS y M13mp19 (Stratagene, La Jolla, CA). Otros ejemplos de vector incluyen el pCMU (Nilsoon et al., Cell 58: 707 (1989)). También pueden sintetizarse otros vectores apropiados, de acuerdo con procedimientos conocidos; por ejemplo, los vectores pCMU/K^{b} y PCMUII, usado en varias aplicaciones en la presente invención, son modificaciones del pCMUIV (Nilsson et al., ver más arriba).
Una secuencia de nucleótidos adaptada para su ligadura en una dirección, es decir, un poliengarce, es una región del vector de expresión que (1) se une operativamente para la replicación y transporta las secuencias de nucleótidos de cadena arriba y cadena abajo, y (2) proporciona un sitio o medios para la ligadura en una dirección de una secuencia de nucleótidos dentro del vector. Típicamente, un poliengarce direccional es una secuencia de nucleótidos que definido dos o más secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción, o sitios de restricción. A partir del corte de restricción, los dos sitios generan extremos adhesivos en los que puede ligarse una secuencia de nucleótidos traducible al vector de expresión. Preferiblemente, los dos sitios de restricción proporcionan, a partir del corte de restricción, extremos adhesivos que no son complementarios, y que permiten de ese modo la inserción en una dirección de una secuencia de nucleótidos traducible dentro del cassette. En una realización, los medios de ligación en una dirección son suministrados por los nucleótidos presentes en la secuencia de nucleótidos cadena arriba, la secuencia de nucleótidos cadena abajo, o ambas. En otra realización, la secuencia de nucleótidos adaptada para la ligación en una dirección comprende una secuencia de nucleótidos que define múltiples medios de clonación en una dirección. Cuando la secuencia de nucleótidos adaptada a la ligación en una dirección define numerosos sitios de restricción, se denomina como un sitio de clonación múltiple.
Una secuencia de nucleótidos traducible es una serie lineal de nucleótidos que proporciona una serie ininterrumpida, de al menos 8 codones, que codifican un polipéptido en una pauta de lectura abierta. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN. Además, preferiblemente hay una secuencia cadena arriba respecto de la secuencia de nucleótidos traducible que codifica una secuencia promotora. Preferiblemente, el promotor es condicional (por ejemplo, inducible). Un promotor condicional preferido usado en la presente invención es un promotor de metalotioneína o un promotor de choque térmico.
Los vectores se pueden construir utilizando cualquiera de las bien conocidas técnicas de construcción de vectores. Esas técnicas, no obstante, se modifican hasta el punto de que la secuencia de nucleótidos traducible a insertar en el genoma de la célula huésped está flanqueada, "cadena arriba" de la secuencia, por un promotor apropiado, y, en algunas variaciones de la presente invención, la secuencia de nucleótidos traducible está flanqueada "cadena abajo" por un sitio de poliadenilación. Esto es particularmente preferido cuando la célula "huésped" es una célula de insecto y la secuencia de nucleótidos se transmite a través de transfección. La transfección puede conseguirse a través de numerosos procedimientos, incluyendo el procedimiento del fosfato de calcio, el procedimiento del DEAE-dextrano, el procedimiento de transferencia estable, la electroporación, o a través del procedimiento de mediación de liposomas. Hay disponibles numerosos textos en los que se detallan procedimientos de transfección conocidos y otros procedimientos para introducir nucleótidos en las células, ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991).
El vector por sí mismo puede ser de cualquier tipo apropiado, tal como un vector viral (ARN o ADN), una cadena lineal desnuda, o un ADN circular, o una vesícula o cubierta conteniendo el material de ácido nucleico y cualesquier polipéptidos que hayan de insertarse en la célula. Con respecto a las vesículas, las técnicas de construcción de vesículas lipídicas, tales como liposomas, son bien conocidas. Tales liposomas pueden apuntarse hacia células concretas usando otras técnicas convencionales, tales como proporcionar un anticuerpo, u otra molécula de unión específica, sobre el exterior del liposoma. Ver, por ejemplo, A. Huang et al., J. Biol. Chem. 255:8015-8018 (1980).
Los vectores más útiles contienen múltiples elementos, incluyendo uno o más de los siguientes, dependiendo de la naturaleza de la célula "huésped" -es decir, la célula que está siendo transformada: (1) un origen de replicación del SV40 para la amplificación de un número elevado de copias; (2) un elemento promotor eficiente para el inicio de la transcripción a un nivel elevado; (3) señales para el procesamiento del ARN, tales como el corte del mARN y secuencias de poliadenilación (y, frecuentemente, también secuencias intercaladas); (4) poliengarces que contienen múltiples sitio de restricción para endonucleasas para la inserción de ADN "ajeno"; (5) marcadores seleccionables que pueden usarse para seleccionar células que han integrado establemente el ADN del plásmido; y (6) secuencias de control de la replicación del plásmido para permitir la propagación en células bacterianas. Además de los anteriores, michos vectores contienen también un sistema de expresión inducible que está regulado por un estimulo externo. Las secuencias de un cierto número de promotores que se requieren para la transcripción inducida han sido identificadas y diseñadas en vectores de expresión para obtener la expresión inducible. Varios vectores inducibles útiles se han basado en la inducción mediante interferón \beta, choque térmico, iones de metales pesados, y esteroides (por ejemplo, glucocorticoides). (Ver, por ejemplo, Kaufman, Meth. Enzymol. 185:487-511 (1990)).
En una realización preferida, el vector contiene también un marcador de selección. Después de su expresión, el producto de la secuencia nucleotídica traducible puede purificarse usando anticuerpos contra esa secuencia. Un ejemplo un marcador de selección es la resistencia a la neomicina. Un plásmido codificando la resistencia a la neomicina, tal como phshsneo, phsneo, o pcopneo, puede incluirse en cada transfección, de forma que una población de células que exprese el(los) gen(es) de elección puede discernirse haciendo crecer los transfectados en un medio de
selección.
En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos traducible puede incorporarse en un plásmido con un promotor de transcripción controlable apropiado, secuencias de control de la traducción, y un poliengarce para simplificar la inserción de la secuencia nucleotídica traducible con la orientación correcta, y puede expresarse en una célula eucariota, tal como Drosophila, o en una célula procariota, tal como E. coli, usando técnicas convencionales. Preferiblemente, hay secuencias de control en 5' que definen un promotor para el inicio de la transcripción, y un sitio de unión de ribosomas operativamente unido al extremo 5' de la secuencia de ADN traducible ubicada cadena arriba. Para conseguir niveles de expresión génica elevados en células transformadas o transfectadas -por ejemplo, E. coli- es necesario usar no sólo promotores fuertes para generar grandes cantidades de mARN, sino también sitios de unión de ribosomas para asegurar que el mARN se eficientemente traducido. Por ejemplo, en E. coli el sitio de unión de ribosomas incluye también un codón de inicio (AUG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud ubicada 3-11 nucleótidos cadena arriba respecto el codón de inicio (Shine et al., Nature 254:34 (1975)). La secuencia AGGAGGU, la cual se denomina secuencia Shine-Dalgarno (SD), es complementaria respecto el extremo 3' del mARN de 16S de E. coli. La unión del ribosoma al mARN y la secuencia en el extremo 3' del mARN puede verse afectada por diversos factores, incluyendo (1) el grado de complementariedad entre la secuencia SD y el extremo 3' del tARN de 16S; y (2) el espaciado y la posibilidad de que la secuencia de ADN esté entre la secuencia SD y el AUG. (Ver, por ejemplo, Roberts et al., PNAS USA 76:760 (1979a); Roberts et al., PNAS USA 76:5596 (1979b); Guarente et al., Science 209:1428 (1980); y Guarente et al., Cell 20:543 (1980)). La optimización se consigue generalmente midiendo el nivel de expresión de los genes en plásmidos en los que este espaciado es sistemáticamente alterado. La comparación de mARN diferentes muestra que hay secuencias estadísticamente preferidas a partir de las posiciones -20 a +30 (en donde la A de AUG está en la posición 0; ver, por ejemplo, Gold et al., Ann. Rev. Microbiol. 35:365 (1981)). También se ha observado que las secuencias líder influencian dramáticamente la traducción (Roberts et al., 1979a, b, ver más arriba). La unión del ribosoma también puede verse afectada por la secuencia de nucleótidos que sigue al AUG, la cual afecta la unión del ribosoma. (Ver, por ejemplo, Tanigucchi et al., J. Mol. Biol. 118:533 (1978)).
Un vector que puede usarse de acuerdo con la presente invención incluye el promotor de choque térmico. Tales promotores son conocidos en la técnica; por ejemplo, ver Stellar et al., EMBO J 4:167-171 (1985). Si se usa este promotor, también se prefiere añadir un sitio de poliadenilación.
Un vector preferido para su uso de acuerdo con la presente invención es un plásmido; más preferiblemente, es un plásmido con un elevado número de copias. También es deseable que el vector contenga una secuencia de promotor inducible, puesto que los promotores inducibles tienden a limitar la presión de selección contra las células en las que se han introducido tales vectores (los cuales se construyen a menudo para portar secuencias nucleotídicas no nativas o quiméricas). Es también preferible que el vector de elección sea apropiado para la expresión en el huésped escogido. Si la población de células huésped es un cultivo de células de Drosophila, entonces un vector compatible incluye vectores funcionalmente equivalentes a aquellos tales como el p25-lacZ (ver Bello y Couble, Nature 346:480 (1990)) o pRmHa-1, -2 ó -3 (ver Bunch et al., Nucl. Acids Res 16:1043-1061 (1988)). En la realización preferida, el vector es el pRmHa-3, el cual se muestra en la Figura 1. Este vector incluye un promotor de metalotioneína, el cual está preferiblemente cadena arriba respecto el sitio en el que se inserta la secuencia del MHC, y el sitio de poliadenilación está preferiblemente cadena abajo respecto dicha secuencia del MHC. Las células de Drosophila son los huéspedes preferidos de acuerdo con la presente invención; en particular, las células de Drosophila tales como las células Schneider 2, que tienen los factores trans-actuadores necesarios requeridos para la activación del promotor, y son, por tanto, más preferidas incluso.
El vector de expresión pRmHa-3 se base en el plásmido bacteriano pRmHa-1, el cual se basa en el plásmido pUC18 y está depositado en la Americal Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), y tiene el número de acceso 37.253. El vector pRmHa-3 contiene el promotor, la secuencia líder 5' no traducida del gen de la metalotioneína (secuencias 1-421, SEC. Nº ID 13) con los sitios R1 y Stu suprimidos; ver Figura 1C). También contiene la porción 3' del gen ADH de Drosophila (secuencia #6435-7270, SEC. Nº ID 14), incluyendo el sitio de poliadenilación. Por tanto, el ADN clonado estará regulado transcripcionalmente por el promotor de la metalotioneína y poliadenilado. La construcción del plásmido pRmHa-1 se describe en Bunch et al., Nucl. Acids Res. 16:1043-1061 (1988). La construcción de los plásmidos pRmHa-3 y pRmHa-2 (el último de los cuales tiene una secuencia del promotor de metalotioneína que puede suprimirse como un fragmento de EcoRI) se ilustra en la Figura 1A, B y C. Con respecto a pRmHa-3, un plásmido preferido para su uso de acuerdo con la presente invención, PstI, SphI y HindIII están en el fragmento promotor, y no son por tanto únicos. Xba está en el fragmento de ADH (4 bases a partir de su extremo 3') y tampoco es único. Los siguientes sitios de restricción son, no obstante, únicos en pRmHa-3: EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, SalI, Hinc2, y AccI.
Un cassette en un vector de expresión de ADN es la región del vector que forma, a partir de la inserción de una secuencia de ADN traducible, una secuencia de nucleótidos capa de expresar, en un huésped apropiado, una proteína de fusión de esta invención. La secuencia de nucleótidos competente para la expresión se denomina "cistrón". Por tanto, el cassette preferiblemente comprende elementos de control de la expresión del ADN operativamente unidos a una o más secuencias traducibles de ADN. Un cistrón se forma cuando una secuencia traducible de ADN se inserta en una dirección (se liga en una dirección) entre los elementos de control a través de la secuencia de nucleótidos adaptada para este propósito. La secuencia de ADN traducible resultante, es decir, la secuencia insertada, está, preferiblemente, operativamente unida en la pauta de lectura apropiada.
Las secuencias de control de la expresión del ADN comprenden un conjunto de señales de expresión del ADN para expresar un producto del gen estructural, e incluyen tanto elementos 5' como 3', tal como es bien sabido, operativamente unidos al cistrón, de tal forma que el cistrón es capaz de expresar un producto de gen estructural. Las secuencias de control en 5' definen un promotor para iniciar la transcripción, y un sitio de unión de ribosomas operativamente unido al extremo 5' de la secuencia de ADN traducible ubicada cadena arriba.
Por tanto, un vector de expresión de ADN de esta invención proporciona un sistema para clonar secuencias de ADN traducibles en la porción del cassette del vector, para producir un cistrón capaz de expresar una proteína de fusión de esta invención.
3. Líneas celulares
Una linea celular preferida de la presente invención es capaz de crecer continuamente en cultivo, y es capaz de expresar moléculas del MHC de la Clase I de mamíferos sobre la superficie de sus células.
La línea celular es un línea celular de insecto. Hay disponibles varias lineas celulares para su uso de acuerdo con la presente invención, incluyendo la de polilla (ATCC CCL 80), la de oruga de polilla (ATCC CRL 1771), las de larva de mosquito (ATCC lineas CCL 125, CCL 126, CRL 1660, CRL 1591, CRL 6565, CRL 6586), y la del gusano de seda (ATCC CRL 8851). En una realización preferida, la linea celular es una linea celular de Drosophila tal como una linea celular de Schneider (ver, Schneider et al., J. Embryo. Exp. Morph. 27:353-365 (1972)); preferiblemente, la linea celular es una linea celular Schneider 2 (S2/M3) adaptada a crecer en medio M3 (ver Lindquist et al., Drosophila Information Service 58:164 (1982)).
Las células Schneider pueden prepararse sustancialmente como sigue. Se recogen huevos de Drosophila melanogaster a los largo de aproximadamente un intervalo de 4 horas y se suprime el corion en hipoclorito sódico acuoso al 2,5%, y se esteriliza su superficie mediante inmersión en etanol al 70% durante 20 minutos, seguida por 20 minutos adicionales en HgCl_{2} al 0,05% en etanol al 70%. Después de aclararlos a conciencia en agua destilada estéril, se transfieren los huevos a placas de petri que contienen filtros negros Metricel estériles, soportados por prefiltros Millipore, ambos humedecidos previamente con medio cultivo. Se colocan los huevos durante la noche en un incubador a 22°C y se retiran para cultivarlos cuando tiene 20-24 horas de edad. Los embriones se cortan en mitades o tercios, se colocan a continuación en tripsina al 0,2% (1:250, Difco) en solución salina de Rinaldini (Rinaldini, Nature (London) 173:1134-1135 (1954)) durante 20-45 minutos a temperatura ambiente. Se usaron unos 100-300 embriones para iniciar cada cultivo.
Después de la adición del suero fetal bovino (FBS), se centrifugaron los fragmentos a 100 \timesg durante 2-3 minutos, se resuspendieron en 1,25 ml de medio de cultivo, y se sembraron sobre frascos T-9 de vidrio. Los cultivos se mantuvieron a aproximadamente 22-27^{d}eC \pm 0,5°C, con una fase gaseosa de aire ambiente. Preferiblemente se usó el medio de Schneider (Schneider, J. Exp. Zool. 156:91-104 (1964); Schneider, J. Embryo. Exp. Morph. 15:271-279 (1966)) conteniendo 500 mg adicionales de peptona bacteriológica por 100 ml de medio, y suplementado con un 15% de FBS inactivado. El pH (preferiblemente 6,7-6,8) se monitoriza con rojo de fenol al 0,01%. Las lineas celulares se mantienen preferiblemente subcultivándolas cada 3-7 días. Las células se unen fácilmente al vidrio, pero no tan firmemente como para requerir tratamiento con tripsina; típicamente, un sencillo pipeteado es adecuado para arrancar la mayoría de las células del fondo de los frascos. El aspecto morfológico de las células se describe en Schneider, J. Embryo. Exp. Morph. 27:353-365 (1972). Estas son esencialmente parecidas a epiteliales en su aspecto, y oscilan en aproximadamente 5-11 \mum en diámetro y 11-35 \mum de longitud. Puede haber pequeñas bolsas, conteniendo células redondeadas, dispersas aleatoriamente entre las otras células.
Preferiblemente, las células Schneider 2 se mantienen en medio de Schneider para Drosophila más un 10% de FBS, incluyendo penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). Es preferible mantener las células en una densidad de más de 0,5 \times 10^{5} ml, y cultivarlas a un rango de temperaturas de 24-30°C. Las células tienden a duplicarse en menos de 24 horas, y crecen hasta una densidad elevada, por ejemplo, 2 \times 10^{7}/ml o superior. Las células también pueden congelarse en 90% de FBS y 10% de DMSO, para su uso o análisis posterior. Uno puede colocar las células a -70°C y almacenarlas a continuación en nitrógeno líquido.
Una linea celular preferida de acuerdo con la presente invención, identificada como células de Schneider 2, ha sido depositada, cumpliendo los requisitos del Tratado de Budapest, en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, el 18 de febrero de 1992, y se le asignó el número de acceso CRL-10.974.
La linea celular es una linea celular transformada capaz de expresar genes del MHC de la Clase I humana.
También se prefiere que la línea celular sea capaz de expresar la microglobulina \beta2 humana. Una linea celular aún más preferida es capaz de expresión estable o transitoria.
Puede utilizarse un vector para transformar/transfectar tal linea celular. Hay muchos vectores disponibles que pueden ser útiles en la transformación/transfección de lineas celulares; estos vectores se discuten con más detalle más arriba. No obstante, en resumen, en las realizaciones preferidas, las células de la presente invención se transfectan con cADN que codifican cadenas pesadas del MHC (humanas) y microglobulina \beta2, las cuales han sido insertadas en (es decir, se han unido operativamente a) un vector de expresión. En una realización más preferida, el vector comprende el plásmido pRmHa-3 de expresión en Drosophila, en el cual se han insertado secuencias nucleotídicas expresables codificando moléculas del MHC de la Clase I humanas o de la microglobulina \beta2 humana, usando técnicas descubiertas en la presente invención. Preferiblemente, los cADN que codifican el MHC y aquéllos que codifican la microglobulina \beta2 están operativamente unidos a plásmidos de expresión distintos, y se cotransfectan en las células cultivadas. Alternativamente, los cADN que codifican el MHC y la microglobulina \beta2 pueden estar operativamente unidos al mismo plásmido de expresión y cotransfectarse con el mismo plásmido. En otra variación, los cADN que codifican el MHC, la microglobulina \beta2, y una citoquina tal como la IL2, están operativamente unidos a plásmidos de expresión, y se cotransfectan en una linea celular de la presente invención. La selección de genes del HLA, la construcción de vectores apropiados, y la selección de cebadores, se describen con mayor detalle en las secciones B.1 y B.2 más arriba.
Las células exitosamente transformadas, es decir, las células que contienen una secuencia nucleotídica expresable de acuerdo con la presente invención, pueden identificarse mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de un cADN o rADN de la presente invención pueden clonarse para producir colonias monoclonales. Las células procedentes de estas colonias pueden recolectarse, lisarse, y su contenido en ADN examinarse en busca de la presencia de rADN usando un procedimiento tal como el descrito por Southern, J. Mol. Biol. 98:503 (1975). Además de ensayar directamente en busca de la presencia de rADN, la transformación o transfección exitosa puede confirmarse mediante procedimientos inmunológicos bien conocidos cuando el rADN es capaz de dirigir la expresión de un polipéptido quimérico sujeto. Por ejemplo, las células exitosamente transformadas con un vector de expresión pueden producir proteínas que exhibieran propiedades antigénicas concretas, las cuales pueden determinarse fácilmente usando los antibióticos apropiados. Además, la transformación/transfección exitosa puede discernirse mediante el uso de un vector adicional portador de una secuencia marcadora, tal como la resistencia a la neomicina, tal como se describe en la presente invención más arriba.
Es también preferible que el cultivo sea capaz de crecimiento sostenido a temperaturas reducidas. Por ejemplo, se prefiere que el cultivo se mantenga a aproximadamente temperatura ambiente, por ejemplo, aproximadamente 24-27°C. En otras realizaciones, el cultivo se mantiene a temperaturas superiores, particularmente durante el proceso de activación de células CD8. Por tanto, se prefiere que un cultivo de acuerdo con la presente invención sea capaz de soportar una condición de temperatura de aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 37°C. La adición de microglobulina \beta2 a un cultivo lo estabiliza al menos frente a la condición de 30°C; la adición de microglobulina \beta2 y péptidos resulta en una mayor termoestabilidad a temperaturas más elevadas, es decir, a 37°C.
Por tanto, es aún más preferido que un linea celular de la presente invención sea capa de lo siguiente: (1) crecimiento sostenido a temperaturas reducidas durante un período de tiempo predeterminado; (2) transformación mediante un vector de expresión; (3) expresión de microglobulina \beta2; (4) expresión de uno o más tipos de moléculas del MHC de la Clase I; (5) cargar péptidos sobre las moléculas del MHC de la Clase I; y (6) expresar moléculas del MHC de la Clase I vacías sobre la superficie celular.
En una realización preferida de la presente invención, se establece un cultivo de células de Drosophila y se transfecta con vectores operativamente unidos a (1) una o más secuencias nucleotídicas que codifican moléculas del MHC de la Clase I, (2) a al menos una secuencia nucleotídica que codifica la microglobulina \beta2 humana. Estas secuencias pueden estar operativamente unidas al mismo vector, pero preferiblemente, las secuencias para la microglobulina \beta2 y para el MHC humano están en vectores separados. Para propósitos de selección, es también ventajoso transfectar la linea celular con un vector operativamente unido a un marcador de selección, por ejemplo, la resistencia a la neomicina. Subsiguientemente, se selecciona una población de células que expresan moléculas del MHC de la Clase I humana y microglobulina \beta2, y se mantienen en cultivo.
Con objeto de preparar el cultivo para la expresión de moléculas del MHC vacías, o, más preferiblemente, cargadas con péptido, el cultivo puede requerir primero su estimulación, por ejemplo, a través de inducción con CuSO_{4}, durante un período de tiempo predeterminado. Después de un período de inducción apropiado -por ejemplo, aproximadamente 12-48 horas, los péptidos pueden añadirse en una concentración predeterminada (por ejemplo, aproximadamente 100 \mug/ml). Los péptidos pueden prepararse tal como se discute en la presente invención más adelante en la sección B.5. Después de un período de incubación adicional -por ejemplo, durante aproximadamente 12 a aproximadamente 27°C- el cultivo está listo para su uso en la activación de células CD8. Aunque este período de incubación adicional puede reducirse, o tal vez omitirse, nuestra observación es que el cultivo pasa a ser más estable frente a la condición de temperatura si se le permite incubar durante un intervalo antes de la adición de células CD8 en reposo o precursoras. Por ejemplo, los cultivos de acuerdo con la presente invención, a los que se ha añadido péptido, son capaces de expresar cantidades significativas de moléculas del MHC de la Clase I cargadas con péptido incluso cuando se incuban durante períodos de tiempo prolongados a 37°C.
Los medios nutritivos útiles en el cultivo de células huésped transformadas son bien conocidos en la técnica y pueden obtenerse a partir de numerosas fuentes comerciales. En las realización en las que la célula huésped es de mamífero, preferiblemente se usa un medio "libre de suero".
4. Microglobulina \beta2 humana
Con objeto de establecer una linea celular capaz de producir cantidades terapéuticamente útiles de moléculas del MHC de la Clase I humanas expresadas sobre su superficie, es preferible co-transfectar una linea celular con un vector operativamente unido a una secuencia nucleotídica que codifique la microglobulina \beta2, con objeto de efectuar los niveles de expresión apropiados de moléculas del MHC en la linea celular. Mientras que la secuencia nucleotídica que codifica la microglobulina \beta2 de mamíferos, tal como la microglobulina \beta2 de ratón, incrementa la estabilidad de las moléculas del MHC de la Clase I humana expresadas en las lineas celulares de la presente invención, es preferible co-transfectar la linea celular con un vector operativamente unido a una secuencia nucleotídica expresable que codifique una microglobulina \beta2 humana. Tal como se discutió en la sección B.2 anterior, un vector preferido incluye una secuencia nucleotídica que codifica al menos una porción de la molécula de microglobulina \beta2 humana operativamente unida al vector para su expresión. Es también posible construir un vector que incluya secuencias nucleotídicas codificando ambas, una moléculas del MHC de la Clase I y una molécula de microglobulina \beta2.
Ha sido publicada una secuencia de cADN de microglobulina \beta2 humana (ver Suggs et al., PNAS 78;6613-6617 (1981)), y se usó la secuencia como una plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los siguientes cebadores:
100
101
Los cebadores se usan en una reacción estándar de la PCR (ver sección B.1 anterior y las referencias citadas en la misma). Los productos de la reacción se extrajeron con fenol, se purificaron usando un equipo Geneclean (Bio 101, San Diego, CA), se digirieron con BamHI y se clonaron en el sitio BamHI de pBS (Stratagene, La Jolla, CA). Después de verificar la secuencia, este fragmento BamHI se clonó en el sitio BamHI de un vector de expresión apropiado. En la realización preferida, se sintetizó el cADN de la microglobulina \beta2 humana, y se unió operativamente al vector de expresión pRmHa-3.
5. Péptidos
Virtualmente todas las proteínas celulares, además de los antígenos virales, son capaces de ser usadas para generar fragmentos de péptidos relevantes que sirven como un ligando potencial de la Clase I. En la mayoría de las células de mamíferos, por tanto, cualquier complejo particular de péptido del MHC representaría sólo una pequeña fracción del total de moléculas codificadas del MHC encontradas sobre la superficie celular. Por tanto, con objeto de producir moléculas del MHC de la Clase I humanas, expresadas sobre la superficie, que tengan una capacidad incrementada para activar específicamente células CD8, es preferible aislar y cargar fragmentos de péptido, del tamaño y características antigénicas apropiadas, sobre moléculas de la Clase I.
Los péptidos de la presente invención se unen a moléculas del MHC de la Clase I. La unión ocurren en condiciones biológicas que pueden crearse in vivo así como in vitro. La naturaleza exacta de la unión de los péptidos no tiene porque conocerse para practicar la invención.
En una realización preferida, los péptidos a cargar sobre las moléculas de MHC de la Clase I son antigénicos. También se prefiere que los péptidos sean de un tamaño uniforme, preferiblemente de 8-meros ó 9-meros, y más preferiblemente, 8-meros. Es también preferible que los péptidos preparados para cargar sobre las moléculas de MHC sean de especies únicas; esto es, que todos los péptidos cargados sobre el MHC sean idénticos en tamaño y secuencia. De esta forma, es posible producir moléculas monoantigénicas de MHC cargadas de péptidos.
Los péptidos pueden presentarse sobre las células de varias formas. Preferiblemente, los péptidos se presentan en una forma que les permite entrar en un pool intracelular de péptidos. Los péptidos pueden añadirse al cultivo en forma de un polipéptido intacto o proteína, el cual es subsiguientemente degradado por procesos celulares, por ejemplo, mediante degradación enzimática. Alternativamente, le polipéptido intacto o proteína puede degradarse a través de algunos otros medios, tales como la digestión química (por ejemplo, con bromuro de cianógeno) o protesas (por ejemplo, quimiotripsina) antes de su adición al cultivo celular. En otras realizaciones, los péptidos se presentan en segmentos más pequeños que pueden, o no, incluir secuencias de aminoácidos epitópicos.
En una realización preferida, se añade una cantidad suficiente de proteína(s) o péptido(s) al cultivo celular para permitir que las moléculas de MHC de la Clase I se usan y, subsiguientemente, presenten una gran densidad del péptido -preferiblemente, con el mismo tipo de péptido unido a cada MHC- sobre la superficie de células que están expresando el MHC de la Clase I humano. Es también preferido permitir que el MHC de la Clase I humano y la microglobulina \beta2 se unan -por ejemplo, para formar heterodímeros- antes de presentar intracelularmente el péptido a las moléculas del MHC.
En otra realización de la invención, los péptidos se añaden a células transfectadas de la presente invención con objeto de mejorar la termoestabilidad de las moléculas del MHC expresadas por las células. Tal como se ha destacado más arriba, los péptidos se añaden preferiblemente al medio de cultivo. Los péptidos antigénicos que se unen a las moléculas de la Clase I sirven para termoestabilizar las moléculas del MHC, y también incrementan la expresión sobre la superficie celular. Los cultivos con péptidos añadidos que se unen a las moléculas del MHC son, por tanto, significativamente menos susceptibles a la condición de temperatura que los cultivos sin péptido añadido.
En una realización de la presente invención, los péptidos antigénicos se presentan a la linea celular transformadas/transfectadas en varias formas. Por ejemplo, puede degradarse química o enzimáticamente una proteína entera u otros polipéptidos antigénicos, y añadirse a la linea celular en esta forma. Por ejemplo, se degrada una proteína de interés con quimiotripsina, y la mezcla resultante de fragmentos de "péptidos" se añade a un cultivo de células transformadas o transfectadas; a continuación, se deja "escoger" a estas células los péptidos apropiados (los cuales son a menudo péptidos más pequeños, preferiblemente 8-meros ó 9-meros) a cargar sobre las moléculas del MHC de la Clase I. Alternativamente, puede clonarse un proteína entera o secuencia polipeptídica en un vector apropiado, e insertarse en una célula procariota, en donde la célula genera cantidades significativas del polipéptido transgénico, las cuales se recolectan a continuación, se purifican, y se digieren en péptidos, los cuales se añaden a continuación al cultivo de células eucariotas transformadas/transfectadas; de nuevo, se deja "escoger" a las células los péptidos a cargar sobre el MHC expresado.
6. Aislamiento de células CD8 en reposo o precursoras
Las células CD8 en reposo (o precursoras) -es decir, las células T que no ha sido activadas para apuntar a un antígeno específico- se extraen preferiblemente del paciente antes de la incubación de las células CD8 con los cultivos transformados. También se prefiere que las células CD8 precursoras se recolecten de un paciente antes del inicio de otro tratamiento o terapia que pudiera interferir con la capacidad de las células CD8 de ser activadas específicamente. Por ejemplo, si uno pretende tratar un individuo con una neoplasia o tumor, es preferible obtener una muestra de células y cultivarlas antes del inicio del tratamiento de quimioterapia o radiación.
Los procedimientos para extraer y cultivar linfocitos son bien conocidos. Por ejemplo, la patente estadounidense nº 4.690.915 de Rosenberg describe un procedimiento para obtener un número elevado de linfocitos mediante linfocitoferesis. Los condiciones de cultivo usadas son apropiadas para células de mamíferos, y se llevan a cabo típicamente a 37°C.
También hay varios procedimientos disponible para separar y/o enriquecer los cultivos de células CD8 precursoras. Algunos ejemplos de procedimientos generales para la separación de células incluyen la unión indirecta de células a superficies específicamente recubiertas. En otro ejemplo, los linfocitos de sangre periférica humana (PBL), los cuales incluyen células CD8, se aíslan mediante centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NH). Los linfoblastos de PBL pueden usarse inmediatamente después, o pueden almacenarse en nitrógeno líquido, después de congelarlos con nitrógeno líquido en FBS conteniendo un 10% de DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), lo que conserva la viabilidad celular y las funciones de linfocitos.
Los procedimientos alternativos de separación y/o enriquecimiento de cultivos de células precursoras incluyen el siguiente ejemplo. Después de preparar poblaciones de PLB enriquecidas en linfocitos a partir de sangre completa, las subpoblaciones de linfocitos CD8 se aíslan a partir de las mismas mediante técnicas de separación basadas en afinidad, dirigidas a la presencia del antígeno del receptor del CD8. Estas técnicas basadas en afinidad incluyen la microfluorimetría, incluyendo la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), la adhesión celular, y procedimientos similares. (Ver, por ejemplo, Scher y Mage, en Fundamental Immunology, Ed. W. E. Paul, pp. 767-780, River Press, NY (1984)). Los procedimientos de afinidad pueden utilizar anticuerpos anti-receptor de CD8 como la fuente de reactivo de afinidad. Hay varios anticuerpos monoclonales anti-células T y anti-CD8 disponibles de forma general, para su uso en estos procedimientos, a partir de una diversidad de fuentes comerciales, incluyendo la Americal Type Culture Collection (Rockville, MD) y Pharmigen (San Diego, CA). Dependiendo de la designación del antígeno, pueden ser apropiados diferentes anticuerpos. (Para una discusión y revisión de la nomenclatura, designación de antígenos, y anticuerpos asignados para leucocitos humanos, incluyendo células T, ver Knapp et al., Immunology Today 10:253-258 (1989). Por ejemplo, en el catálogo de ATCC de lineas celulares e hibridomas (ATCC, Rockville, MD) se identifica que los anticuerpos monoclonales OKT4 (anti-CD4, ATCC nº CRL 8002), OKT5 (ATCC nº CRL 8013 y 8016), OKT8 (anti-CD8, ATCC nº CRL 8014), y OKT9 (ATCC nº CRL 8021) reaccionan respectivamente con los linfocitos T humanos, con subconjuntos de células T humanas, y células T activadas. Varios otros anticuerpos están disponibles para identificar y aislar especies de células T.
Preferiblemente, los PBL se purifican a continuación. Para este propósito pueden utilizarse, por ejemplo, gradientes de Ficoll. Los PBL purificados se mezclarían a continuación con células de Drosophila sinérgicas preincubadas con los péptidos antigénicos apropiados.
7. Activación in vitro de células CD8
Con objeto de optimizar las condiciones in vitro para la generación de células T citotóxicas específicas, el cultivo de células estimulantes se mantiene en un medio apropiado. En una realización preferida, las células estimulantes son células de Drosophila, las cuales se mantienen preferiblemente en un medio carente de suero (por ejemplo, Excell 400).
Antes de la incubación de las células estimulantes con las células a activar, por ejemplo, células CD8 precursoras, se añade una cantidad del péptido antigénico al cultivo celular estimulante, en cantidad suficiente para ser cargado sobre las moléculas de la Clase I humanas que se expresarán sobre la superficie de cada célula estimulante. Preferiblemente, las células estimulantes se incuban con > 20 \mug/ml de péptido.
Las células CD8 en reposo o precursoras se incuban a continuación con las células estimulantes apropiadas durante un período de tiempo suficiente como para activar las células CD8. Preferiblemente, las células CD8 deberían, por tanto, activarse en una forma específica para antígeno. La proporción de células CD8 (efectoras) en reposo o precursoras respecto células estimulantes puede variar de individuo a individuo, y puede depender además de varias variables, tales como la docilidad de los linfocitos de un individuo a las condiciones de cultivo, y la naturaleza y gravedad de la condición morbosa u otra condición para la cual se usa la modalidad de tratamiento descrita en la presente invención. No obstante, preferiblemente la proporción de linfocito:célula estimulante (por ejemplo, célula de Drosophila) está en el rango de aproximadamente 30:1 a 300:1. Por ejemplo, en una realización se mezclaron 3 \times 10^{7} PBL humanos y 1 \times 10^{6} células de Drosophila, y se mantuvieron en 20 ml de medio de cultivo RPMI 1640.
El cultivo efector/estimulador puede mantenerse durante tanto tiempo como fuera necesario para estimular un número de células CD8 terapéuticamente usable o efectivo. En términos generales, el tiempo óptimo está entre uno y cinco días, observándose generalmente una meseta ("plateau") -es decir, un "máximo" específico para el nivel de activación de CD8- después de cinco días de cultivo.
8. Separación de células CD8 de células de Drosophila
Las células CD8 activadas pueden separarse efectivamente de las células estimulantes (por ejemplo, Drosophila) usando uno de una diversidad de procedimientos conocidos. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales específicos para las células estimulantes, para los péptidos cargados sobre las células estimulantes, o para las células CD8 (o un segmento de las mismas) para unir su ligando complementario apropiado. Las moléculas marcadas con anticuerpos pueden extraerse a continuación a partir de la mezcla de células estimulantes-efectoras a través de medios apropiados, por ejemplo, mediante procedimientos de inmunoprecipitación o inmunensayo bien conocidos.
9. Administración de células CD8 activadas
La cantidades efectivas, citotóxicas de las células CD8 activadas pueden variar entre los usos in vitro e in vivo, así como con la cantidad y tipo de células que son la diana final de estás células asesinas. La cantidad también variará dependiendo de la condición del paciente, y debería ser determinada, mediante la consideración de todos los factores apropiados, por el practicante. No obstante, se usan preferiblemente de 1 \times 10^{6} a aproximadamente 1 \times 10^{12}, más preferiblemente de 1 \times 10^{8} a aproximadamente 1 \times 10^{11}, e incluso más preferiblemente de 1 \times 10^{9} a aproximadamente 1 \times 10^{10} células CD8 activadas para humanos adultos, en comparación con las aproximadamente 5 \times 10^{6} a aproximadamente 5 \times 10^{7} usadas en ratón.
Preferiblemente, tal como se discutió más arriba, las células CD8 activadas se recolectan del cultivo de células de Drosophila antes de la administración de las células CD8 al individuo que se está tratando. No obstante, es importante notar que, a diferencia de otras modalidades de tratamiento actuales y propuestas, el presente procedimiento usa un sistema de cultivo celular (es decir, células de Drosophila) que no es tumorigénico. Por tanto, si no se consigue la completa separación de células de Droso y células CD8 activadas, no hay peligro inherente conocido asociado a la administración de un pequeño número de células de Drosophila, mientras que la administración de células promotoras de tumores puede ser extremadamente arriesgada.
Los procedimientos para introducir componentes celulares son conocidos en la técnica e incluyen procedimientos tales como aquéllos ejemplificados en la patente estadounidense nº 4.844.893 para Honsik et al., y la patente estadounidense nº 4.690.915 para Rosenberg. Por ejemplo, la administración de células CD8 vía infusión intravenosa es apropiada.
10. Tipado del HLA
Tal como se ha destacado previamente, los haplotipos/alotipos del HLA varían de individuo a individuo, y, mientras que no es esencial para la práctica de la presente invención, a menudo es útil determinar el tipo de HLA del individuo. El tipo de HLA puede determinarse mediante procedimientos de tipado estándares, y los PLB pueden purificarse mediante gradientes de Ficoll. Los PBL purificados se mezclarían a continuación con células de Drosophila sinérgicas preincubadas con los péptidos antigénicos apropiados -por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas relacionadas con infecciones virales, cánceres, o tumores malignos, péptidos derivados de proteínas específicas del cáncer o
de virus.
Continuando con el uso de condiciones virales o malignas como ejemplo, en aquellas circunstancias en las que se han caracterizado péptidos específicos de un determinado antígeno viral o del cáncer, preferiblemente se usarán los péptidos sintetizados que codifican estos epítopos. En los casos en los que los péptidos antigénicos preferidos no se han determinado con precisión, pueden usarse digeridos de proteasas de proteínas específicas virales o del cáncer. Como una fuente de tales antígenos, el cADN que codifica proteínas específicas virales o tumorales se clona en un plásmido de expresión en bacterias, y se usa para transformar bacterias, por ejemplo, mediante procedimientos descubiertos en la presente invención.
Después del tipado del HLA, si no hay disponibles células de Drosophila que expresen el HLA preferido, los cADN que codifican el HLA preferido pueden clonarse a través del uso de la reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores descubiertos en las SECCIÓN B.1 anterior (SEC. ID nº 1 a SEC. ID nº 12) pueden usarse para amplificar los cADN de HLA-A, -B, -C, -E, -F, o ADN-G en reacciones separadas, las cuales pueden clonarse a continuación y secuenciarse tal como se ha descrito en los procedimientos descubiertos mas abajo para HLA A2.1. Las líneas celulares estables que expresan el HLA clonado pueden a continuación establecerse en las células de Drosophila. Alternativamente, para la activación de CD8 in vitro, puede usarse una población de células de insecto expresando transitoriamente una población a granel de moléculas clonadas recombinantes procedentes de la reacción de la PCR.
11. Mitógeno de Drosophila
Se ha encontrado que el sobrenadante procedente de células cultivadas de acuerdo con la presente invención aumenta o restablece la capacidad de las lineas celulares de generar células CD8 activadas específicas. La adición de aproximadamente un 10% de sobrenadante del cultivo de Drosophila a un cultivo de linfocitos, o a células fijadas, activa eficientemente las CD8. Las células cultivadas que expresan antígenos singénicos de la Clase I que no consiguieron activar CD8 en cultivo primario, fueron capaces de generar CD8 específicas después de la adición de sobrenadante del cultivo de células de Drosophila.
Un factor aislado procedente del cultivo, el cual parece tener un impacto significativo sobre la activación de las CD8 en cultivos de células de Drosophila es el mitógeno celular de Drosophila. El mitógeno se caracteriza como una sustancia secretada soluble con una buena estabilidad, el cual mantiene su actividad incluso después de cuatro meses de almacenamiento a 4°C. El mitógeno tiene un peso molecular relativamente elevado -es decir, 500 kDa mediante filtración en gel Superose (Pharmacia, Piscataway, NJ). También se une intensamente a la Sepharose Mono Q (Pharmacia, Piscataway, NJ). El mitógeno de células de Drosophila aparentemente induce la proliferación de células B y activa los macrófagos.
El mitógeno hallado en Drosophila puede ser un ejemplo de otros mitógenos de insectos, y proporcionar un adyuvante terapéutico efectivo. Por ejemplo, pueden retirarse las células procedentes de un animal infectado y usarse para estimular subsiguientemente células de Drosophila mezcladas con linfocitos de sangre primarios y mitógeno de Drosophila. La mezcla puede usarse a continuación para el tratamiento del organismo.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos de pretende que ilustren pero no limiten, la presente invención.
Ejemplo 1 Expresión de moléculas del MHC de la Clase I humanas A. Preparación del vector de expresión pRmHa-3
El vector de expresión pRmHa-3, para su uso en la expresión de proteínas del MHC en células Schneider 2 de Drosophila tal como se describe en esta invención, se construyo ligando el vector de expresión de ADN pRmHa-1, linealizado con SphI, con un fragmento de ADN resultante de un digestión con SphI del vector de expresión pRmHa-2 descrito más abajo. La ligación de esta manera del pRmHa-1 con el fragmento de pRmHa-2 se realizó para suprimir uno de los dos sitios de clonación para endonucleasa de restricción EcoRI presentes en el pRmHa-1. Por tanto, el vector de expresión pRmHa-3 resultante contenía sólo un sitio de restricción EcoRI el el sitio de clonación múltiple (poliengarce) en el que se insertaron varios fragmentos de ADN codificando MHC, tal como se describe en los Ejemplos.
1. Preparación del vector de expresión pRmHa-1
El vector de expresión pRmHa-1, conteniendo un promotor de metalotioneína, secuencias consenso de respuesta a metales (denominada MT), y un gen de la deshidrogenasa de alcohol (ADH) conteniendo un sitio de poliadenilación aislado a partir de Drosophila melanogaster, se construyó tal como describieron Bunch et al., Nucl. Acids Res. 16:1043-1061 (1988). En la Figura 1B se muestra un esquema de la construcción final del pRmHa-1. El vector de expresión de plásmido, pUC18, que tiene el número de acceso 37.253 en ATCC, se usó como vector fuente a partir del cual se derivaron los diversos vectores descritos en la presente invención. El plásmido pUC18 contiene los siguientes sitios de restricción, de 5' a 3', en el sitio de clonación múltiple, todos los cuales no se ilustran en las representaciones esquemáticas de los vectores derivados del puc18 de la Figura 1: EcoRI; SacI; KpnI, SmaI y SmaI ubicados en la misma posición; BamHI; XbaI; SalI; AccI e HincII ubicados en la misma posición; PstI; SphI e HindIII. El vector puc18 se digirió primero con HindIII para formar un puc18 linealizado. A continuación se crearon los extremos romos rellenando los extremos de HindIII con el fragmento grande de la polimerasa I de ADN, tal como describieron Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Eds. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1982).
El vector puc18 de extremos romos, linealizado, se ligó con un fragmento HinfI de 740 pares de bases (p.b.) procedente del gen de la ADH de Drosophila melanogaster, que contiene un sitio de poliadenilación. El alelo de la ADH ligado se aisló primero a partir del plásmido pSACI, descrito por Goldberg et al., PNAS USA 77:5794-5798 (1980), mediante digestión con el fragmento de HinfI, seguida por embotamiento de los extremos con Klenow, resultando en la secuencia nucleotídica listada en la SEC. Nº ID. 14. El vector pSACI que contiene el alelo de la ADH se construyó subclonando en pBR322 (número de acceso en ATCC 31.344) un fragmento EcoRI de 4,7 kilobases (kb) del ADN de Drosophila, seleccionado a partir de una biblioteca del bacteriófago lambda que contenía fragmentos aleatorios de peso molecular elevado (superior a 15 kb). El sitio de restricción 5' HinfI ocurrió de forma natural en el gen de la ADH en la posición 1770, tal como describió Kreitman, Nature 304:412-417 (1983). El sitio 3' HinfI se derivó a partir del vector puc18 en el que se había clonado el gen de la ADH. Esta posición estaba 4 pares de base 3' respecto el sitio XbaI, en la posición 25.000 del gen de la ADH. El segmento de la ADH se extendía, desde los 35 p.b. cadena arriba de la secuencia de poliadenilación/corte en la porción 3' no traducida del mARN de la ADH, hasta 700 p.b. cadena abajo respecto la señal de poliadenilación. El vector derivado del puc18 resultante conteniendo el fragmento del gen de la ADH se denominó pHA-1 tal como se muestra en la Figura 1A.
El fragmento EcoRI/StuI de 421 p.b. del gen MT se obtuvo a partir de un clon que contenía ADN de aproximadamente 15,3 kb en una biblioteca de ADN genómico de Drosophila melanogaster. La biblioteca, preparada con una digestión parcial con MboI de ADN de imago, se clonó en el EMBL4 derivado de lambda. El fragmento contenía el promotor de la MT y el elemento consenso de respuesta a metal del gen de la MT de Drosophila (Maroni et al., Genetics 112:493-504 (1986)). Esta región, conteniendo el promotor y el inicio de transcripción en el nucleótidos +1, correspondía a la posición -370 a +54 del gen de la MT (SEC. Nº ID. 13). El fragmento resultante se ligó entonces en el vector de expresión pHA-1 preparado más arriba, el cual se linealizó previamente con EcoRI y SmaI. El extremo romo 3' en MT, creado por la digestión con StuI, era compatible con el extremo romo en pHA-1, creado por la digestión con SmaI. El vector derivado de puc18 resultante, que contenía un fragmento 5' del gen de la MT de Drosophila y un fragmento 3' del gen de la ADH, se denominó pRmHa-1. El vector de expresión pRmHa-1, mostrado en la Figura 1B, contenía el origen de replicación (ori) y el gen de la beta-lactamasa, confiriendo resistencia a la ampicilina (Amp^{r}) procedente del puc18, tal como se muestra en la Figura 1A sobre el vector pHa-1. El diagrama ed pRmHa-1 también muestra las posiciones 5' a 3' contiguas al fragmento del gen MT, el sitio de clonación múltiple, y el fragmento del gen de la ADH. El vector pRmHa-1 se usó tal como se describe en c., más abajo, en la construcción del vector de expresión pRmHa-3.
2. Preparación del vector de expresión pRmHa-2
La construcción del pmrha-2 se muestra en la Figura 1A. Para la construcción del vector de expresión pRmHa-2, se insertó el fragmento MT preparado más arriba en el vector pHA-1, derivado de puc18, tal como se describió para la construcción del pRmHa-1 más arriba, con unas pocas modificaciones. Se añadió un engarce EcoRI al sitio StuI del fragmento del gen de la MT aislado mediante EcoRI/StuI, preparado más arriba, para formar un fragmento de metalotioneína que tenía sitios de restricción EcoRI en ambos extremos. El fragmento resultante se ligó a continuación en el vector de expresión pUC18 que contenía el fragmento de la ADH, el cual se linealizó previamente con EcoRI. El vector derivado de puc18 resultante, que contenía un fragmento 5' del gen de la MT de Drosophila, y un fragmento 3' del gen de la ADH, teniendo dos sitio de restricción EcoRI 5' respecto el sitio de clonación múltiple, se denominó pRmHa-2. El vector de expresión pRmHa-2, mostrado en la Figura 1A, contenía el origen de replicación (ori) y el gen de la beta-lactamasa, que confiere resistencia a la ampicilina (Amp^{r}), procedente del puc18. El diagrama de pRmHa-2 también muestra las posiciones contiguas 5' a 3' del fragmento del gen de la MT, el sitio de clonación múltiple, y el fragmento del gen de la ADH. El vector pRmHa-2 se usó tal como se describe en c., más abajo, en la construcción del vector de expresión pRmHa-3.
3. Preparación del vector de expresión pRmHa-3
Para preparar el vector de expresión pRmHa-3 que tenía sólo un sitio de restricción EcoRI, se ligó un fragmento procedente de pRmHa-2 en pRmHa-1. Para esta construcción, el pRmHa-2, preparado en b., más arriba, se digirió primero con SphI. El fragmento de SphI resultante, que empezaba en la mitad del gen de la MT y se extendía hasta el sitio SphI en el sitio de clonación múltiple, se aisló primero a partir del vector del pRmHa-2, y se ligó a continuación en el pRmHa-1 preparado en A.1., más arriba. El vector pRmHa-1 se había modificado previamente para suprimir el sitio de restricción EcoRI 5' respecto el fragmento del gen de la MT, linealizado a continuación con SphI. Este proceso se ilustra esquemáticamente en la Figura 1B. Para suprimir el sitio EcoRI en el vector pRmHa-1, se digirió primero el vector con EcoRI para formar un vector linealizado, a continuación se hicieron romos sus extremos con la nucleasa Mung Bean, y se religaron.
El vector pRmHa-1, carente de un sitio EcoRI, se digirió a continuación con SphI para suprimir la región correspondiente al fragmento SphI insertado, procedente de pRmHa-2, y formar un vector pRmHa-1 linealizado. El fragmento de SphI procedente de pRmHa-2 se ligó a continuación en el pRmHa-1, linealizado con SphI, para formar el vector de expresión pRmHa-3. En la Figura 1C se muestra un esquema del vector pRmHa-3. Las posiciones relativas de los diversos sitios de restricción procedentes del vector puc18, a partir del que se derivó el pRmHa-3, se indican en la figura. Además, se indican en la figura las posiciones relativas y longitudes de los fragmentos de gen de la MT y ADH, separados por el sitio de clonación múltiple (poliengarce) en el que se clona el gen del MHC de interés. El vector pRmHa-3, derivándose del vector puc18, contiene el origen de replicación (ori) del puc18, y el gen de la beta-lactamasa, que confiere resistencia a la ampicilina (Amp^{r}). Por tanto, los fragmentos de ADN codificando el MHC, tal como se preparan en esta invención y se clonan en el sitio de clonación múltiple del pRmHa-3, están transcripcionalmente regulados por el promotor de la MT y poliadenilados a través del gen de la ADH.
C. Síntesis del cADN
Para sintetizar el HLA A2.2., el cADN que codifica un A2.2 completo (ver, Holmes et al., J. Immunol. 139:936-941 (1987), para las secuencias publicadas) se clona en un plásmido M13pm19, un vector de bacteriófago comercialmente disponible (Stratagene, La Jolla, CA). El cADN se sintetiza mediante PCR usando cebadores derivados a partir de la secuencia publicada de A2. El cADN se libera a partir de un clon M13mp19 como un fragmento NotI(voladizo rellenado con Klenow)/EcoRI. (Los fragmentos Klenow son parte de la molécula de la polimerasa I de ADN de E. coli, producidos por tratamiento de la pol I de ADN De E. coli con subtilisina. Se usan para "rellenar" voladizos 5' o 3' en los extremos de moléculas de ADN producidos por nucleasas de restricción). El fragmento NotI/EcoRI se inserta en pSP64T digerido con BgIII (extremos rellenados con Klenow) y EcoRI. pSP64T es un vector de clonación SP6 diseñado para proporcionar regiones flanqueantes 5' y 3' procedentes de un mARN, las cuales son eficientemente traducidas (\beta-globina) a cualquier cADN que contenga su propio codón de inicio. Este vector de traducción SP6 se construyó mediante la digestión de pSP64-X\betam con BalI y BstEII, rellenando los extremos escalonados con polimerasa de ADN de T4, y añadiendo un engarce BglII mediante ligación. El BalI corta el cADN de la \beta-globina dos bases cadena arriba respecto el ATG (codón de inicio), el BstEII corta ocho bases cadena arriba del TAA (codón de paro). Hay un único gran sitio BglII en pSP64T, de forma que los enzimas de restricción que cortar en el fragmento poliengarce, desde PatI hasta EcoRI, pueden usarse todavía para linealizar el plásmido para su transcripción. (Ver Kreig y Melton, Nucleic Acid Res. 12:7057-7070 (1984), que también describen la construcción del plásmido pSP64-Xbm). El plásmido resultante se corta con EcoRI (extremo rellenado con Klenow) y HindIII, y se clona en el poliengarce de pCMUII entre HindIII (5') y StuI (3'). (Ver Paabo et al., EMBO J. 5:1921-1927 (1986)). El cADN entero se suprimió como un fragmento HindIII (extremo relleno con Klenow)/BamHI, el cual se clonó en pRmHa-3 cortado con SmaI y BamHI.
El HLA A2.2 sol se preparó diseñando un codón de paro en el cADN de A2.2 descrito más arriba, precediendo inmediatamente al dominio transmembrana. La mutagénesis se consigue cortando el cADN de A2.2 clonado en el vector de expresi pCMUII entre HindIII 5' y StuI 3' (ver más arriba) con MboII y BamHI, insertando los siguientes oligonucleótidos:
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Los plásmidos recombinantes resultantes se cortaron con HindIII, los voladizos finales se rellenaron con Klenow, a continuación se cortaron con BamH1, liberando un fragmento de restricción que se clonó en el pRmHa-3 de la misma forma que el A2.2 de longitud completa.
El cADN de HLA A2.1 se preparó como sigue. Se sintetizó una secuencia de cADN truncada de HLA A2.1, mediante PCR, usando los siguientes cebadores derivados a partir de la secuencia publicada del A2.1 (Koller y Orr, J. Immunol. 134:2727-2733 (1985)) y las condiciones de reacción descritas por Nilson et al., Cell 58:707-718 (1989).
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El fragmento de PCR resultante se clonó en pBS (Stratagene, La Jolla, CA), y la secuencia se verificó mediante secuenciación con dideoxi. Se cortó un fragmento de 800 p.b., codificando la mayoría de la secuencia codificante del HLA A2.1, a partir de este plásmido con AvaI y StuI, y se usó para remplazar el mismo fragmento en la secuencia de transmembrana del HLA A2.2, la cual se había clonado previamente en el pRmHa-3 (ver más arriba).
El HLA B7 se sintetizó mediante la PCR usando cebadores derivados de la secuencia publicada del B7 (ver, por ejemplo, Zemmour y Parham, Immunogenetics 33:310-320 (1991)), flanqueada por sitios BamHI clonados directamente en el sitio BamHI de pRmHa-3 (Ver Sood et al., Immunogenetics 22:101-121 (1988)).
El cADN de HLA B27 se sintetizó mediante la PCR usando cebadores derivados de la secuencia publicada del B27 (ver, por ejemplo, Zemmour y Parham, Immunogenetics 33:310-320 (1991)). Se proporcionan más detalles inmediatamente más abajo.
El cADN de HLA B27 sol se preparó como el cADN de B27 anterior, pero incorporando el codón de paro en el extremo del dominio alpha 3 del clon pBI (ver Szotz et al., PNAS USA 83:1428 (1986)). Ambos cADN de B27, truncado y de longitud completa, se obtienen en el vector pDS5, con un extremo 5' modificado (ver Stueber et al., EMBO J. 3:3143-3148 (1986)). Se realizó la mutagénesis dirigida contra un sitio para extender el extremo 5' del cADN. Se añadió la siguiente secuencia (en letras mayúsculas) al clon de cADN de B27 publicado; la secuencia después de la barra inclinada (/) es el inicio de la secuencia publicada:
GGATCCTCTCAGACGCCGAGATGCGGGTCACGGCGCCC/acggcgccc.. (SEC Nº ID 21)
Los cADN del B27 completo y del B27 sol se cortaron del plásmido pDS5 cortando primero con ApaLI (extremo rellenado con Klenow) y BamHI. Los fragmentos resultantes se clonaron directamente en pRmHa-3 cortado con SalI (rellenado con Klenow) y BamHI.
Los cADN clonando cualquier HLA preferido pueden clonarse mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores descritos en la sección B.1. anterior (SEC Nº ID 1 a SEC. Nº ID 12) pueden usarse para amplificar los cADN de los HLA-A, -B, -C, -E, -F, o -G apropiados, en reacciones separadas, los cuales pueden clonarse a continuación y secuenciarse tal como se describió en los procedimientos descritos para HLA A2.1 más arriba. La preparación de cADN a partir de células humanas se realiza tal como se describe en Ennis et al., PNAS USA 87:2833-2837 (1990). En resumen, se obtiene una muestra de sangre a partir de un individuo, y se recuperan las células después de su centrifugación, y se usan para preparar ARN total. Se sintetiza cADN de la primera hebra usando oligo(dT) y transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis de las aves. El cADN resultante se usa en una reacción de amplificación de la PCR utilizando el(los) cebadore(s) apropiado(s) tal como se menciona en la sección B.1 anterior, y un equipo GeneAmp y un ciclador térmico (Perkin-Elmer/Cetus). Las condiciones de reacción son preferiblemente como sigue: se usan 100 ng de plantilla de cADN y 50 picomoles de cada cebador oligonucleotídico. Se corren treinta ciclos como sigue: (a) un minuto a 94°C; (b) un minuto a 60°C; y (c) un minuto, 30 segundos a 72°C. A continuación se calienta la reacción de la PCR hasta 100°C durante 10 minutos para destruir la polimerasa Taq, y se embotan los extremos del ADN mediante la polimerasa T4 (Stratagene, La Jolla, CA).
El cADN de la microglobulina \beta2 humana se preparó usando una secuencia parcial de cADN publicada (ver Suggs et al., PNAS USA 78:6613-6617 (1981)) como plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los siguientes cebadores:
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Los cebadores se usan en una reacción de PCR estándar (ver Nilsson et al., Cell 58:707 (1989)). Los productos de la reacción se extrajeron con fenol, se purificaron usando un equipo Geneclean (Bio 101, San Diego, CA), se digirieron con BamHI, y se clonaron en el sitio BamHI del pBS (Statagene, La Jolla, CA). Después de verificar la secuencia, este fragmento de BamHI se clonó en el sitio BamHI del pRmHa-3.
Tal como se destaca en los ejemplo, se utilizó el cADN de la Clase I de ratón en varios casos. El cADN de la Clase I de ratón se preparó como sigue.
H-2K^{b}: el cADN codificando una molécula de K^{b} completa se obtuvo a partir de un plásmido de expresión pMCU/K^{b} construido como sigue. Se preparó un cADN líder H-2K^{b}, que carecía de la secuencia líder y de la mayoría del dominio alpha I, de acuerdo con el procedimiento de Reyes et al., PNAS 79:3270-3274 (1982), produciendo pH202. Este cADN se usó para generar una molécula de longitud completa. La secuencia ausente se proporciona usando un clon genómico que codifica el H-2K^{b} (Caligan et al., Nature 291:35-39 (1981)) como plantilla en una reacción de PCR, usando un cebador 5' flanqueado por un sitio NotI, seguido por 21 nucleótidos que codifican los últimos siete aminoácidos de la secuencia líder, y 18 nucleótidos complementarios al inicio del dominio alpha I, y un cebador 3' complementario de la región que abarca el sitio StyI. El fragmento resultante se ligó con pH202 en el sitio StyI. La secuencia 50 que codifica el resto de la secuencia de señal se obtuvo a partir del cADN D^{b} (ver más abajo) como un fragmento BamHI/NotH. La secuencia codificante entera se cortó a partir del plásmido de expresión como un fragmento BamHI y se clonó en pRmHa-3 cortado con BamHI.
H-2L^{d}: el cADN codificando una molécula de L^{d} completa se obtuvo a partir de un plásmido de expresión pCMUIV/L^{d} (ver Joly y Oldston, Gene 97:213 (1991)). El cADN completo se cortó a partir del vector de expresión pCMUIV/L^{d} como un fragmento BamHI, y se clonó en pRmHa-3 como K^{b}.
H-2D^{b}: el cADN codificando una molécula de D^{b} completa se obtuvo a partir de un plásmido de expresión pCMUIV/D^{b} (ver Joly y Oldston, Science 253:1283-1285 (1991)). El cADN completo se cortó a partir del vector de expresión pCMUIV/D^{b} como un fragmento BamHI, y se clonó en pRmHa-3 como K^{b}.
Microglobulina \beta2 de ratón: el cADN de la microglobulina \beta2 de ratón de longitud completa se obtuvo como un fragmento HindIII (5') (rellenado con Klenow)/BglII (3') a partir del cADN de la microglobulina de ratón 132 de pSV2neo (ATCC nº 37.149), y se clonó en pRmHa-3 cortado con SmaI y BamHI.
Tal como se ha mencionado anteriormente, el vector pCUM (pCUMIV) se deriva del vector de expresión en eucariotas pC18G como describen Nilsson et al., ver más arriba. El vector pC81G, a su vez, se deriva de pA81G (Paabo et al., Cell 33:445-456 (1983)) de acuerdo con el procedimiento descrito en (Paabo et al., EMBO J. 5:1921-1927 (1986)). En resumen, estos tres vectores se construyeron como sigue.
La secuencias líder de 220 p.b. de longitud del vector pA81G se acortaron suprimiendo un fragmento de 80 p.b. HindIII a DdeI (nt 1286-1366 de la secuencia publicada por Herisse et al., NAR 8:2173-2192 (1980)); esta construcción se denominó pB81G. Un fragmento HinfI del gen de la alfa-globina, abarcando la región desde nt -112 hasta +19 con respecto el sitio de inicio de la transcripción, se subclonó en el sitio PstI del pUC9, y el potenciador de la repetición de 72 p.b. del SV40 se insertó cadena arriba respecto el promotor. Este elemento potenciador-promotor se ensayó primero clonándolo en frente de la región que codifica el antígeno de SV40, y la construcción resultante se transfectó en células HeLa (ATCC CCL 185). Se fijaron las células transcurridos dos días, y se tiñeron en busca de antígeno T mediante inmunofluorescencia indirecta. Se hallo un número elevado de núcleos teñidos, indicando una intensa actividad del promotor del fragmento de la alfa-globina. A continuación se remplazó el promotor del SV40 en el vector pB81G por este eficiente elemento promotor conduciendo a la construcción de pC81G.
pCMUIV se construyó digiriendo el pC81G con HindIII y BamHI, e insertando oligonucleótidos codificando la secuencia 5' no traducida del cADN de la \beta-globina de Xenopus laevis, usado para genera el pSP64T (Krieg et al., NAR 12:7057-7070 (1984)). No obstante, se escogió el sitio BamHI en vez del sitio BglII usado en pSP64T. La secuencia insertada entre el HindIII y BamHI del pC81G fue:
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El vector phshsneo confiere resistencia a la neomicina (G418), y es un derivado del phsneo (pUChsneo) con una secuencia adicional del promotor de choque térmico (hs), la cual puede sintetizarse, a partir de pUC8 comercialmente disponibles, tal como se describe en Steller et al., EMBO J. 4:167 (1985). El promotor de choque térmico contenido en estos vectores es el promotor hsp70. Otros vectores útiles que confieren resistencia a la neomicina (resistencia G418) incluyen el vector cósmido smart2 (ATCC 37.588), el cual se expresa bajo el control del promotor hsp70 de Drosophila, y el vector de plásmido pcopneo (ATCC 37.409).
C. Inserción de genes en vectores de expresión
Los productos de restricción se sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1982)). Los fragmentos de restricción codificando los cADN se cortaron a partir del gel, y se purificaron de la agarosa usando "Geneclean" de acuerdo con las indicaciones del fabricante (Bio 101, San Diego, CA). El plásmido de expresión de Drosophila pRmHa-3 (ver Bunch et al., Nucl. Acid Res. 16:1043-1061 (1988)) se cortó con los enzima de restricción apropiados en tampón One Phor All de acuerdo con las indicaciones del fabricantes (Pharmacia, Piscataway, NJ), y se trataron con fosfatasa alcalina tal como se describe en la literatura del fabricante (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Cien ng del vector pRmHa-3 cortado y "fosfatasado" se mezclaron con 300 ng de cADN de la cadena pesada el MHC de la Clase I purificada en gel de agarosa o cADN de microglobulina \beta2, y se ligaron usando la ligasa de ADN de T4 y tampón One Phor All tal como se describe en la literatura del fabricante. Después de su incubación a 16°C durante cinco horas, se usó la mezcla de ligación para transformar E. coli JM83 competente (Maniatis et al., ver más arriba (1982)).
Los procedimientos descritos por Maniatis et al., ver más arriba, se usaron para preparar el cADN necesario; en resumen, los procedimientos son como sigue. Los transformantes se seleccionaron sembrando E. coli sobre placas de agar que contenían ampicilina. Las colonias resistentes a la ampicilina se cultivaron individualmente en cultivo líquido, y se preparó el ADN usando el procedimiento miniprep de lisis alcalina. La presencia de cADN de la cadena pesada de MHC, y su orientación en el vector, se determina mediante mapado de restricción. Las bacterias que contenían el vector con el cADN en la orientación correcta relativa al promotor de la metalotioneína se usaron para la preparación a gran escala de ADN usando el procedimiento de lisis alcalina y purificación en gradiente de cloruro de cesio. La cantidad de ADN obtenida se determinó espectrofotométricamente.
D. Transfección y marcaje de células Schneider
La células Schneider II se cultivan en medio Schneider (Gibco/BRL, Grand Island, NY) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (tratado con calor durante una hora a 55ºC), 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, y glutamina 1 mM. (Por conveniencia, este medio suplementado se denomina a partir de ahora como medio de Schneider). Las células se cultivaron a 27ºC, y se pasaron típicamente cada siete días mediante dilución 1:17 en medio fresco. Las células se convirtieron a crecimiento en medio libre de suero (Excell 400 ó 401, suplementado con 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, glutamina 1 mM, y 500 \mug/ml de G418 (JRH Biosciences, Lenexa, KS), mediante dilución inicial al 50% de Schneider/50% de Excell 401. Una semana más tarde, las células pueden pasarse a 10% de medio Schneider/90% de Excell 401, y una semana más tarde a 100% de Excell 401. Las células se mantuvieron en este medio y se pasaron cada siete días diluyéndolas 2:17 en medio fresco.
Se sembraron 15 \times 10^{6} células Schneider a una concentración de 10^{6} células por ml en placas de petri de 85 mm. Doce horas más tarde, se añadieron precipitados de fosfato/ADN, preparados como se describe más abajo (1 ml), gota a gota, a las células. Después de 48 horas, se retiró cuidadosamente el sobrenadante y se transfirieron las células a un frasco de 175 cm^{2} en un volumen total de 50 ml en medio de Schneider que contenía 500 \mug/ml de Geneticin (G418) (Gibco/BRL, Grand Island, NY). Transcurridos 21 días, se retiraron 20 ml de cultivo a un frasco nuevo que contenía 30 ml de medio de schneider conteniendo 500 \mug/ml de G418. Diez días más tarde, se obtuvo una población estable de células que se adherían débilmente al frasco y crecían con una velocidad de duplicación de aproximadamente 24 horas, y estas células se cultivaron subsiguientemente y se pasaron en el medio de selección tal como se describe más arriba. Se prepararon alícuotas congeladas de estas células recolectando 5-20 \times 10^{6} células mediante centrifugación y resuspendiéndolas en 1 ml de medio de congelación de células (93% de suero fetal bovino/7% dimetilsulfóxido). A continuación de colocaron las alícuotas a -70°C durante una semana y subsiguientemente se transfirieron para almacenamiento en nitrógeno líquido.
Los precipitados de fosfato cálcico se prepararon tal como describieron Paabo et al. (EMBO J. 5:1921-1927 (1986)), excepto que se usaron 25 \mug de ADN por transfección. Las siguientes combinaciones de ADN se usaron para preparar los transfectantes indicados:
(a)
cadena pesada del MCH de la Clase I sola: 23 \mug del ADN del vector de expresión de la cadena pesada + 2 \mug de ADN de phshsneo.
(b)
cadena pesada del MCH de la Clase I + microglobulina \beta2: 11,5 \mug del ADN del vector de expresión de la cadena pesada + 11,5 \mug de microglobulina \beta2 (humana o de ratón) + 2 \mug de ADN de phshsneo.
Veinticuatro horas antes del marcado metabólico, se sembraron las células a una densidad celular de 3-5 \times 10^{6} células/ml (10 ml/placa de petri de 85 mm) en medio Schneider que contenía CuSO_{4} 1 mM. Treinta minutos antes del marcado, se aspiró el medio de las placas y se lavaron las células con 2 \times 10 ml de PBS, y se incubaron a continuación en medio Grace para insectos, menos la metionina y cisteína (pedido especial a Gibco/BRL, Grand Island, NY), durante 20 minutos, y entonces en 1 ml de este medio conteniendo 0,1 mCi de 35S Trans marcado (New England Nuclear; duPont, Boston, MA). Después del período de marcado, se aspiró la solución de marcado, y las células, o se lisaron inmediatamente sobre hielo, con PBS/Triton X100 al 1% enfriado en hielo (1 ml), o después de un período de caza en presencia de medio Schneider o Excell 400 conteniendo metionina (5 ml) (JRH Biosciences). El medio de caza se recolectó si se estaban analizando moléculas del MHC de la Clase I solubles.
Todas las operaciones siguientes se realizaron con los lisados mantenidos fríos (menos de 8°C). Los lisados se recolectaron en tubos Eppendorf, se centrifugaron en un tubo de microfuga durante 15 minutos a 13.000 \times g, se transfirieron a un tubo nuevo que contenía 100 \mul de una papilla al 10% de proteína A Sepharose, y se colocaron en un rotador de extremo a extremo durante dos horas. A continuación de una centrifugación adicional en la microfuga durante 15 minutos, los lisados de células estaban listos para su análisis.
En los experimentos que utilizaban MHC de ratón, se transfectaron células de Schneider 2 con los recombinantes del MHC de ratón descritos más arriba usando el procedimiento de precipitación en CuSO_{4}; cada cadena pesada se transfectó bien sola o como una mezcla 50:50 con el vector que codificaba la microglobulina \beta2. En cada transfección se incluye un plásmido que codifica la resistencia a la neomicina, ADN phshsneo, de forma tal que pudo obtenerse una población de células que expresaba establemente el MHC de la Clase I mediante el cultivo de los transfectantes en medio de selección (Geneticin G418-sulfato, Gibco/BRL, Grand Island, NY).
E. Generación del péptido
Los péptidos antigénicos de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse a partir de fuentes que existen naturalmente o puede sintetizarse usando procedimientos conocidos. En varios ejemplos discutidos en esta, los péptidos se sintetizan en un sintetizador Applied Biosystems, ABI 431A (Foster City, CA), y se purifican subsiguientemente mediante HPLC. Los péptidos antigénicos usados en varios experimentos descubiertos en la presente invención incluyen aquéllos listados mas abajo:
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El aislamiento o síntesis de péptidos "aleatorios" también pueden ser apropiados, particularmente cuando uno está intentando discernir un epítopo concreto con objeto de cargar una molécula de MHC vacía con un péptido lo más probable para estimular células CD8 precursoras. Uno puede producir una mezcla de péptidos "aleatorios" a través del uso de proteosomas (ver, por ejemplo, el Ejemplo 2.B.6), o sometiendo una proteína o polipéptido a un proceso de degradación -por ejemplo, digestión con quimiotripsina- o pueden sintetizarse péptidos. Mientras que hemos observado que las lineas celulares de la presente invención son capaces de degradar proteínas y polipéptidos en péptidos más pequeños capaces de ser cargados sobre moléculas del MHC de la Clase I humana, es preferible introducir péptidos más pequeños -por ejemplo, 8-meros y 9-meros- directamente en el cultivo celular para facilitar un carga y proceso de expresión más rápidos.
Si uno está sintetizando péptidos, por ejemplo, péptidos aleatorios de 8-, 9- y 18-aminoácidos, todas las variedades de aminoácidos se incorporan preferiblemente durante cada ciclo de la síntesis. No obstante, debería notarse que varios parámetros -por ejemplo, incompatibilidad de solvente de ciertos aminoácidos- pueden resultar en una mezcla que contiene péptidos que carecen de ciertos aminoácidos. Por tanto, el proceso debería ajustarse según se precise -es decir, alterando los solventes y condiciones de reacción- para producir la mayor variedad de péptidos.
Con objeto de determinar las "preferencias" en la selección de péptidos mediante moléculas del MHC, se han sintetizado, por tanto, una serie de péptidos de diferentes longitudes, tal como se muestra en la Tabla 3. Estos incluyen péptidos de 8 y 9 aminoácidos de longitud, así como péptidos más largos. Con objeto de cuantificar la cantidad de termoestabilidad conferida por péptidos de diferente longitud y por diferentes microglobulinas \beta2, se ha examinado la estabilidad de estas diversas moléculas en los lisados de células. Los lisados radiactivos de células se prepararon a partir de células de Drosophila que expresaban K^{b}/\beta2, L^{d}/\beta2, y D^{b}/\beta2, bien con microglobulinas \beta2 de ratón o humana, tal como se ha descrito previamente. Los lisados se alicuotaron a continuación y se hicieron adiciones según se describe. Para cada tratamiento, se prepararon cinco tubos; estos se incubaron a continuación a diferentes temperaturas entre 4°C y 47°C durante una hora, transcurrida la cual se inmunoprecipitó la Clase I y se analizó mediante SDS-PAGE. A continuación, se escanearon los autoradiogramas usando un densitómetro de láser, y la cantidad de señal se representó frente a la temperatura de la incubación a la que se había sometido la muestra. Se calculó la temperatura a la que el 50% de las moléculas eran estables a partir del gráfico, y se usó como una medición de las termoestabilidades relativas de las diferentes especies. Tal como se ha destacado en la presente invención más arriba, la cadenas pesadas de ratón complejadas con microglobulina \beta2 humana fueron estables a temperaturas aproximadamente 6-8 grados superiores que si se complejaban con \beta2 de ratón. También se observó que las estabilidades impartidas por el péptido y la microglobulina \beta2 xenogénica eran aditivas. Un gran incremento en la termoestabilidad de las moléculas de la Clase I tiene lugar si se usan 8-9-meros en comparación con 12-25-meros; más aún, la diferencia entre la estabilización impartida por los 8-9-meros comparada con los péptidos mayores puede ser incluso mayor que la observada previamente, porque, aunque los péptidos se han purificado mediante HPLC, es probable que haya cierta contaminación de los péptidos mayores con 8-9-meros.
Se muestra ahora que la termoestabilidad de una molécula de la Clase I depende aparentemente de: (1) el origen de la microglobulina \beta2; (2) la presencia de péptido; y (3) la longitud y secuencia de este péptido.
F. Generación de MHC termoestable expresado en superficie 1. Refinando los parámetros usando MHC de ratón
Antes de la experimentación con células expresando moléculas del MHC de la Clase I humana, se realizó la optimización de varios parámetros usando MHC de ratón. Primero se verificó que las moléculas del MHC de la Clase I de ratón expresadas en células de Drosophila tenían las características de las molécula de Clase I "vacías" o libres de péptido.
Por ejemplo, las Figuras 2A y B ilustran resultados de ensayos preparados a partir de células de Drosophila que expresaban K^{b}/\beta2, L^{d}/\beta2, y D^{b}/\beta2, con microglobulina \beta2 humana o de ratón. Se marcaron células de Drosophila que expresaban K^{b}/\beta2, L^{d}/\beta2, y D^{b}/\beta2 durante 45 minutos con 35S metionina, y se prepararon lisados tal como se describe más arriba. Cada lisado se dividió en cuatro alícuotas, a las que se añadió OVA, o péptido NP o GP2, o ningún péptido en absoluto. Después de su incubación durante una hora a 4°C, se incubó la otra durante una hora a 30°C. A continuación se inmunoprecipitaron las moléculas de la Clase I a partir de lisados, y se analizaron mediante SDS-PAGE. Ocurrió una dramática estabilización K^{b}/\beta2 respecto el desafío de temperatura cuando se añadieron OVA o péptido NP a los lisados; similarmente, la L^{d}/beta2 fue estabilizada por la adición de péptido NP. La D^{b}/\beta2 no parece ser tan lábil a la temperatura como las otras dos moléculas; sin embargo, se observa un incremento en la estabilidad de la molécula a partir de la adición del péptido GP2 al lisado, mientras que la adición de OVA o péptido NP no lo consigue. Pueden observarse dos bandas inmunoprecipitadas para cada Clase I, representado las formas procesadas en Golgi (inferior) o no procesada (superior), ambas moléculas parecen ser estabilizadas igualmente bien mediante la adición de péptido al lisado. La pequeña cantidad de proteína "resistente a 30°C" observada en la K^{b}/\beta2 no tratada o en lisados de GP2 es señal de fondo, puesto que la adición de Y3 a un lisado de células marcadas con L^{d}/\beta2 resultó en el aislamiento de esta banda (no se muestra).
A continuación, se investigó la posibilidad de que la microglobulina \beta2 humana fuera mejor que la microglobulina \beta2 de ratón para estabilizar las cadenas pesadas de ratón. Se encontró que la adición de la \beta2 humana a células de Drosophila creciendo en medio Excell 400 no tan sólo incrementaba el nivel de estadio estacionario de las tres moléculas de la Clase I de ratón, también hacía a las moléculas estables a 37°C durante tres horas. La estabilidad incrementada de la Clase I de ratón a partir de la adición de la \beta2 humana pudo haber sido el resultado de incrementar la concentración de \beta2 en el medio; esta posibilidad se descartó. Se clonó cADN de la microglobulina \beta2 humana en el vector pRmHa-3 de expresión en Drosophila, y se cotransfectó con plásmidos de expresión que contenían los diversos cADN de la cadena pesada de la Clase I de ratón y el plásmido marcador de la resistencia, tal como se describió previamente. Después de su selección con G418, se tiñeron las células con los anticuerpos anti-Clase I apropiados para la expresión sobre superficie, se seleccionaron las células que expresaban intensamente usando la FACS. Se obtuvieron poblaciones estables de células (no se muestran los datos). A continuación se condicionaron las células a crecer en Excell 400, y se incubaron durante diferentes períodos de tiempo a 37°C. Las moléculas de la Clase I de ratón sintetizadas con la microglobulina \beta2 humana fueron estables a una incubación de 3 horas a 37°C sin la adición de \beta2 exógena al medio Excell (no se muestran los datos). Nuestros resultados indican que la termoestabilidad de las moléculas
de la Clase I de ratón depende de la presencia de péptido y del origen de la microglobulina \beta2. (Ver Figuras 3A y 3B).
Además, se ha determinado ahora que las moléculas de la Clase I expresadas sobre la superficie celular son estabilizadas aún más por la adición de péptidos del tamaño apropiado. (Ver Figuras 5A-C). Se sintetizaron una serie de péptidos de diferentes longitudes, tal como se muestra en la Tabla 3 (ver Ejemplo 5.2). Estos incluyen un péptido que tiene 8 aminoácidos de longitud; RGYVYQGL (SEC. Nº ID 24) ha sido caracterizado como el epítopo en la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV). Similarmente, el péptido 8-mero de OVA SIINFEKL (SEC. Nº ID 23, residuos 5-12) ha sido identificado como el péptido en ovoalbúmina que es presentado por la K^{b}/\delta2, y el péptido de 9 aminoácidos de longitud ASNENMETM (SEC. Nº ID 25) ha sido caracterizado como el epítopo de la proteína nuclear del virus de la gripe presentado por la D^{b}/\delta2. La adición de estos péptidos "progenitores" a células de Drosophila cultivadas en Excell y expresando la Clase I de ratón resultó en la termoestabilidad a 37°C de la K^{b}/\delta2 por el péptido de OVA y de la D^{b}/\delta2 por el péptido de NP.
Con objeto de cuantificar la cantidad de termoestabilidad conferida por péptidos de diferente longitud y por diferentes microglobulinas \beta2, se examinó la estabilidad de estas diversas moléculas en lisados de células. Los lisados radiactivos de células se prepararon a partir de células de Drosophila que expresaban K^{b}/\beta2, L^{d}/\beta2, y D^{b}/\beta2, bien con microglobulinas \beta2 de ratón o humana, tal como se ha descrito previamente. Los lisados se alicuotaron a continuación y se hicieron adiciones según se describe en el Ejemplo 1.D. Para cada tratamiento, se prepararon cinco tubos; estos se incubaron a continuación a diferentes temperaturas entre 4°C y 47°C durante una hora, transcurrida la cual se inmunoprecipitó la Clase I y se analizó mediante SDS-PAGE. A continuación, se escanearon los autoradiogramas usando un densitómetro de láser, y la cantidad de señal se representó frente a la temperatura de la incubación a la que se había sometido la muestra. Se calculó la temperatura a la que el 50% de las moléculas eran estables a partir del gráfico, y se usó como una medición de las termoestabilidades relativas de las diferentes especies. Tal como se había observado previamente, las cadenas pesadas de ratón complejadas con microglobulina \beta2 humana fueron estables a temperaturas aproximadamente 6-8 grados superiores que si se complejaban con \beta2 de ratón. Interesantemente, las estabilidades impartidas por el péptido y la microglobulina \beta2 xenogénica eran aditivas. Un gran incremento en la termoestabilidad de las moléculas de la Clase I tiene lugar si se usan 8-9-meros en comparación con 12-25-meros; más aún, la diferencia entre la estabilización impartida por los 8-9-meros comparada con los péptidos mayores puede ser incluso mayor que la observada previamente, porque, aunque los péptidos se han purificado mediante HPLC, es probable que haya cierta contaminación de los péptidos mayores con 8-9-meros.
La tabla siguiente muestra la temperatura (en °C) a la que el 50% de las cadenas pesadas del MCH de la Clase I (se indican) son estables en los lisados de TX100, cuando se co-expresan con \beta2 de ratón o humana en presencia o ausencia de péptidos.
TABLA 1
15
Con objeto de prestar atención a la cuestión de si el péptido puede unir moléculas de la Clase I vacías en ausencia de microglobulina \beta2, se prepararon lisados con detergente a partir de células de Drosophila que expresaban cadenas pesadas K^{b} o D^{b} de la Clase I, marcadas con ^{35}S-metionina durante una hora, y tratadas. La molécula de K^{b} se inmunoprecipitó con el anticuerpo Y3 y la D^{b} con el anticuerpo B22.249. Sólo pudieron detectarse niveles bajos de cadena pesada K^{b} inmunoreactiva en los lisados sin tratar. La adición de cualquier péptido que se una a la Clase I o la microglobulina \beta2 humana resulta en un incremento en la cantidad de material inmunoreactivo; la adición de ambos resultó en una mucha mayor cantidad de cadena pesada inmunoreactiva. Se obtuvieron resultados similares para D^{b}. Por tanto, parece que la cadena pesada puede unir péptido en ausencia de la microglobulina \beta2, no obstante, o esta unión no resulta en una conformación muy estable, o los anticuerpos usados no se unen bien a esta conformación. La adición de microglobulina \beta2 también conduce a un incremento en el número de moléculas inmunoreactivas, presumiblemente por la misma razón. Los efectos de estos dos reactivos son aditivos, sugiriendo que el complejo triple es la forma más estable de la molécula y/o que esta molécula es la mejor reconocida por el anticuerpo.
Estos resultados generan la pregunta de si uno puede "reconstruir" complejos de cadena pesada/\beta2 a partir de los lisados después del tratamiento a 30°C de temperatura. Se trataron lisados procedentes de células de Drosophila que expresaban K^{b}/\beta2 durante una hora a 30°C, transcurridos los cuales se añadió péptido de NP o microglobulina \beta2 humana. Después de su incubación a 4°C durante 4 horas, se inmunoprecipitaron las cadenas pesadas de la Clase I o con Y3 o con el anticuerpo K193 anti-cola citoplasmática. La preparación de los antisueros se describe en el Ejemplo 2.1.
Tal como se ha informado previamente, se encontró que la temperatura de tratamiento de moléculas de la Clase I vacías en lisados de Triton TX-100 no resultaba en su degradación (la molécula K^{b} puede inmunoprecipitarse igualmente bien después del tratamiento a 30°C con un anticuerpo anti-cola citoplasmática), pero que resultaba en su desnaturalización. Más aún, la conformación asumida por estas moléculas desnaturalizadas mediante calor es tal que ya no se unen a la microglobulina \beta2, o pueden recuperarse en moléculas que son reconocidas por el Y3 mediante la adición de péptido o microglobulina \beta2 humana. Por tanto, es razonable concluir que las cadenas pesadas de la Clase I pueden unir péptido, bien solas o cuando están complejadas con microglobulina \beta2.
No obstante, la expresión en superficie del MHC de la Clase I humana cargado con péptido parece ser, como mucho, facilitada cargando las moléculas con péptido después de que las cadenas pesadas se hayan complejado la microglobulina \beta2.
2. Expresión del MHC humano
Una vez que se ha determinado que la termoestabilidad de una molécula de la Clase I depende del origen de la microglobulina \beta2, la presencia de péptido, y la longitud y secuencia de este péptido, hemos utilizado esta información en la creación de lineas celulares capaces de activar células CD8 específicamente a través de la expresión de moléculas del MHC de la Clase I cargadas con péptido.
La termolabilidad parece ser una propiedad inherente de las moléculas de la Clase I; presumiblemente evolucionó para asegurar que las moléculas de la Clase I que, o no contienen péptido o contienen un péptido con propiedades de unión pobres (que confiere poca termoestabilidad), se autodestruyen. De esta forma, la célula minimiza el número de moléculas vacías de la Clase I sobre su superficie, puesto que tal situación sería presumiblemente peligrosa en que péptidos derivados exógenamente pueden unirse y presentarse. Las moléculas de la Clase I humana (B27 y A2.1) expresadas en células de insectos con la \beta2 humana no son estables frente una incubación extensa a 37°C; ni lo son las moléculas de la Clase I humana expresadas en la línea celular mutante T2, la cual se ha observado que es deficiente para cargar péptidos sobre moléculas de la Clase I (Hosken y Bevan, Science 248:367-370 (1990); Cerundolo et al., Nature 345:449-452 (1990)). Por tanto, parece que la afinidad entre la cadena pesada y la microglobulina \beta2 ha sido cuidadosamente conservada a través de la co-evolución de las moléculas, de tal forma que moléculas de la Clase I vacías, o aquéllas portando péptidos pobremente unidores, se autodestruyen a la temperatura corporal del organismo "huésped".
Se expresaron moléculas del MHC de la Clase I humana en células Schneider. Se establecieron lineas celulares que co-expresaban la microglobulina \beta2 humana y el HLA A2.2Y, HLA A2.1, HLA B7 o HLA B27 usando procedimientos previamente descritos. En resumen, los cADN que codificaban las proteínas anteriores se clonaron en el vector pRmHa-3 de expresión en Drosophila, y se cotransfectaron con un plásmido que contenía la microglobulina \beta2 humana y el plásmido phshsneo en células Schneider a través de procedimientos descubiertos en la presente invención. Tres o cuatro semanas más tarde, la población de células resistentes al G418 se diluyeron 1:5 con medio de selección nuevo. Una vez se hubo obtenido una población de células creciendo sanas, se añadió CuSO_{4} a una alícuota de células y, 24 horas más tarde, se analizaron las células mediante citometría de flujo usando un anticuerpo monoclonal W6/32 (ATCC HB95, Bethesda, MD), el cual reconoce un determinante monomórfico de las cadenas pesadas de la Clase I humana cuando están asociadas con la microglobulina \beta2. (Ver Barnstable et al., Cell 14:9 (1978)). Se indujeron niveles elevados se expresión en superficie de cada una de las moléculas de la Clase I humana inducidas por la adición de CuSO_{4} (no se muestran los datos). Estas poblaciones estables se clasificaron en busca de células de elevada expresión usando citofluorimetría tal como se describe más abajo. Son estas estas poblaciones de células clasificadas las que se usaron para todos los experimentos subsiguientes.
Veinticuatro horas antes del análisis con FACS, se añadió CuSO_{4} a las células Schneider establemente transfectadas (3-4 \times 10^{6} células/ml) hasta una concentración final de 1 mM, "encendiendo", por tanto la expresión a partir de los genes transfectados. Se sembraron las células en placas de 24 pocillos (2 ml por pocillo). Ocho horas antes del análisis FACS, se remplazó el medio CuSO_{4} con medio nuevo (1 ml), con o sin péptido a una concentración de 50 \mug/ml. Se realizaron desafíos de temperatura a 37°C transfiriendo las placas a una superficie plana en una habitación a 37°C, a diversos intervalos de tiempo, antes de recolectar las células para su análisis.
Para analizar la expresión en superficie del MHC de la Clase I sobre las células Schneider, se transfirieron alícuotas de células (5 \times 10^{5}) a tubos en hielo, se recolectaron mediante centrifugación (1000 \times g, durante 4 minutos), se resuspendieron en 3 ml de PBS/BSA al 1%, 0,02% azida sódica, se recolectaron mediante centrifugación, y se resuspendieron en PBS/BSA (0,5 ml) conteniendo el anticuerpo primario apropiado (fluidos ascíticos Y3, 28:18:8S, 30.5.7, W6/32, diluidos 1:200). Los antisueros de conejo se diluyeron 1:500 y el sobrenadante de hibridomas B22.293 se usó directamente. Después de una hora de incubación sobre hielo, se lavaron las células dos veces en 3 ml de PBS/BSA y se resuspendieron en 0,5 ml de PBS/BSA que contenía el anticuerpo secundario marcado con FITC (Cappell, Durham, NC) y 1 mg/ml de yoduro de propidio. Después de 30 minutos de incubación sobre hielo, se lavaron las células una cez con PBS/BSA y se resuspendieron en este tampón a una concentración de 1 \times 10^{6}/ml. A continuación se analizaron las muestras mediante FACS 440 (Becton Dickinson). Las células muertas teñidas con yoduro de propidio, se excluyen mediante la inclusión de una compuerta viva en el análisis.
Para la clasificación de las células se usó el mismo procedimiento descrito más arriba, excepto que todas las operaciones de tinción se realizaron en una campana estéril. La soluciones, incluyendo los anticuerpos, se esterilizaron mediante filtración, y se usó medio de Schneider o Excell 400 en lugar del PBS/BSA. Las células que unían específicamente el anticuerpo primario se clasificaron usando un clasificador de células Becton Dickinson. Las células clasificadas (2-8 \times 10^{5}) se lavaron una vez en medio antes de sembrarlas a una concentración de 2 \times 10^{5} célu-
las/ml.
Con objeto de demostrar que las moléculas de la Clase I humana expresadas sobre la superficie de células de Drosophila están vacías, se incubaron las células a 37°C durante dos horas, y se analizó la expresión sobre la superficie celular mediante citofluorimetría. La expresión sobre la superficie de ambos HLA, B27 y A2.1, está enormemente reducida si las células se incuban a 37°C durante 2 horas; no obstante, preincubando las células en péptidos HIV, que se sabe se unen a las moléculas de la Clase I, permite una estabilidad térmica significativa de la Clase I, mientras que los péptidos que no se unen no tienen poco efecto (ver Figura 5A). Un péptido de 9 aminoácidos (ILKEPVHGV, SEC. Nº ID 31) procedente de la proteína POL del VIH se une y estabiliza el HLA A2.1. Un péptido de 9 aminoácidos procedente de la proteína Vpr del VIH se une y estabiliza el B27 (FRIGCRHSR, SEC. Nº ID 30). Estos datos muestran que las moléculas de la Clase I humana expresadas sobre la superficie de células de Drosophila están vacías y pueden estabilizarse mediante la unión de péptidos del VIH específicos.
La Figura 5A muestra la termoestabilización inducida por péptido del HLA B27 y HLA A2.1 expresados sobre la superficie de células de Drosophila mediante péptidos del VIH. Se incubaron células de Drosophila que expresaban HLA B27 o A2.1 con péptidos donde se indica, y se mantuvieron a continuación a 28°C o se incubaron a 37°C durante dos horas antes del análisis de la expresión sobre superficie de las moléculas de la Clase I mediante el uso del anticuerpo W6/32 (procedente de ATCC HB95) y citofluorimetría. La fluorescencia promedio de cada población celular se muestra representada frente a las condiciones de incubación. El péptido de POL del VIH (ILKEPVHGV, SEC. Nº ID 31) estabiliza el A2.1 pero no el B27, mientras que el péptido de Vpr (FRIGCRHSR, SEC. Nº ID 30) estabiliza el B27 pero no el A2.1.
La Figura 5B ilustra que el HLA A2.2Y expresado en células de Drosophila tiene características de las moléculas de la Clase I vacías en lisados con Triton X100. Los lisados radiactivos con Triton X100, preparados a partir de células de Droso que expresaban el A2.2Y, se alicuotaron y las adiciones de péptidos se hicieron tal como sigue: A y B: sin adiciones; C: un péptido KRWIILGLN (SEC. Nº ID 29) de GAG (B) de VIH; D: péptido de la gripe ILGFVTLTV (SEC. Nº ID 32); E: péptido 8-mero aleatorio; F: péptido 9-mero aleatorio. Las alícuotas B-F se incubaron a 37°C durante una hora antes de su inmunoprecipitación con W6/32 y análisis mediante SDS-PAGE.
La Figura 5C muestra que el HLA B7 expresado en células de Drosophila tiene características de moléculas de la Clase I vacías en lisados de Triton X100. Los lisados se prepararon como en la Figura 5B, en células de Drosophila que expresaban el HLA B7. Las alícuotas o no recibieron péptido (-P) o péptido aleatorio de 18-meros o 9-meros según se indica. La mitad de las alícuotas se incubaron a 39°C durante una hora antes de su inmunoprecipitación con W6/32 y SDS-PAGE.
También se observó que el HLA B7 y A2.2Y expresados en células de Drosophila estaban vacíos, ya que se encontró que eran termolábiles en lisados de células con Triton TX100 (ver Figuras 5B y 5C); no obstante, pudieron estabilizarse mediante la adición de péptidos a los lisados antes del desafío de temperatura. En particular, puede verse que un 10-mero derivado de la matriz de la gripe, ILGFVFTLTV (SEC. Nº ID 32) (Gotch et al., J. Exp. Med. 168:2045-2057 (1988)) estabiliza el HLA A2.2, así como lo hace un péptido 8-mero aleatorio que también estabiliza el HLA B7.
El desafío de temperatura para los lisados de células con Triton TX100 se realizó como se ha descrito previamente en la presente invención para la Clase I de ratón. La conclusión a partir de estos estudios es que las moléculas de Clase I humanas expresadas en células de Drosophila tienen todas las características de las moléculas vacías expresadas en la linea celular mutante T2 (Salter et al., (1985), ver más arriba; Hosken y Bevan (1990), ver más arriba).
Ejemplo 2 Generación de péptidos con características de unión óptimas para moléculas de la Clase 1 A. Discusión y visión de conjunto
Datos recientes han demostrado que las moléculas de la Clase I unen péptido, los cuales contiene motivos secuencia consenso. (Ver Falk et al., Nature 351:290-296 (1991); Van Bleek y Nathenson, Nature 348:213-216 (1990)). Por tanto, los residuos amino- y carboxi-terminales de péptidos unidos a una determinada forma alélica de la molécula de la Clase I parecen estar restringidos a unos pocos tipos de aminoácidos, y uno o más residuos internos tendrían que ocupar posiciones específicas. Falk et al., ver más arriba (1991); Van Bleek et al., ver más arriba (1990). El examen de la unión de péptidos a la molécula K^{b} de ratón confirma que un péptido de ovoalbúmina, OVA-8, con la secuencia SIINFEKL (SEC. Nº ID 23, residuos 5-12), el cual se une a las moléculas de K^{b} in vivo, contiene un motivo de unión óptimo y se une intensamente a las moléculas de K^{b} in vitro. Puesto que esta secuencia peptídica está flanqueada en la molécula de ovoalbúmina por las secuencias ...QLE y TEW..., es evidente que varias proteasas, una proteasa con una especificidad de sustrato muy amplia, o un complejo enzimático con múltiples actividades proteolíticas, deben ser responsables de la generación del péptido OVA-8 a partir de la ovoalbúmina intacta.
Para examinar si los proteosomas aislados pueden generar el péptido óptimo para la unión a moléculas de K^{b}, fue útil hacer uso del hallazgo de que moléculas de K^{b} de la Clase I vacías, es decir, aquéllas sin péptido unido- son muy termolábiles (Ljunggren et al., ver más arriba (1990)). La incubación de moléculas K^{b} vacías en detergente a 30°C durante una hora hace que el anticuerpo Y3, específico para K^{b} y dependiente de \beta2M, sea incapaz de reaccionar con la molécula de K^{b} porque la \beta2 M se disocia rápidamente de la cadena pesada. La unión de un péptido apropiado tal como la OVA-8 impide la disociación de la subunidad, permitiendo que el Y3 se una al complejo de la Clase I. Péptidos de la misma longitud que OVA-8, los cuales no pueden ser presentados por moléculas de K^{b} in vivo (por ejemplo, el péptido SNENMETM (SerAsnGluAsnMetGlyThrMe) (SEC. Nº ID 25, residuos 2-9), el cual se une a D^{b}, Townsend et al., Cell 44:959-968 (1986)) son incapaces de prevenir la disociación inducida por calor de las moléculas la Clase I K^{b} (ver Figura 3). El péptido OVA-24 con la secuencia EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER (SEC. Nº ID 23) (el cual abarca la secuencia de OVA-8, se muestra subrayada) se une débilmente a las moléculas de K^{d}. No obstante, la débil unión del OVA-24 no fue suficiente para impedir que el complejo K^{b}-\beta2 M se disociara a 30°C.
Los diversos antisueros se prepararon como sigue. El antisuero K193 se genera inmunizando conejos con la limfocianina de la lapa con forma de ojo de cerradura (Keyhole Limpet) (Calbiochem, La Jolla, CA) conjugada con péptido sintético correspondiente a la secuencia COOH terminal de la H-2K^{b} (LPDCKVMVHDPSLA o LeuProAspCysArgValMetValHisAspProSerLeuAla) (SEC. Nº ID 33). Los ascites Y3 se prepararon usando el hibridoma HB176 (ATCC, Rockville, MD). (Ver también Hammerling et al,. PNAS USA 79: 4737-4741 (1982). Los ascites 28-14-8S se prepararon a partir del hibridoma HB 27 (ATCC, Rockville, MD). (Ver Ozato y Sachs, J. Immunol. 126:317-321 (1980); Myers et al., J. Immunol. 142:2751-2758 (1989)). Los ascites 30-5-7 se prepararon a partir del sobrenadante de cultivo procedente del hibridoma B22.249 (Ver Hammerling et al., Immunogenetics 8:433-445 (1979); Allen et al., Nature 309:279-281 (1984)). Los antisueros policlonales purificados contra el MHC de ratón se prepararon de acuerdo con Kvist et al., Scan. J. Immunol. 7:265-276 (1978). Los anticuerpos secundarios marcados con FITC (IgG de cabra anti-ratón y anti-conejo purificadas mediante afinidad) se obtuvieron a partir de Cappell (Durham, NC).
Usando este sistema de ensayo, se incubaron moléculas con el anticuerpo monoclonal Y3, específico para K^{b}, K^{b} "vacías" marcadas biosintéticamente procedentes de células RMA-S, las cuales no consiguen cargar péptidos sobre las moléculas de la Clase I, se incubaron con el anticuerpo monoclonal Y3 específico para K^{b}, y dependiente de \beta2 M. Las moléculas unidas a anticuerpo se separaron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante autoradiografía. El análisis de SDS-PAGE se realizó como sigue. Los inmunoprecipitados recolectados para cuentas de proteóna
A-Sepharose se lavaron cinco veces con 1 ml de TX100 al 0,1%/PBS, e inmediatamente se hirvieron en tampón de muestras del SDS-PAGE o, donde se indica, después de la digerir la mitad de la muestra con Endoglicosidasa H (ver Jackson et al., EMBO J. 9:3153-3162 (1990)). A continuación se analizaron las muestras sobre geles de SDS-PAGE con un gradiente del 10-15%, y se trataron con Amplify (Amershman, Arlington Heights, IL) antes de autoradiografiarlas a -70°C usando película Kodak XOmat (Rochester, NY).
Las bandas correspondientes a la cadena K^{d} se cuantificaron mediante densitometría. Para generar los datos (no se muestra) se incubaron lisados de células RMA-S,que contenían moléculas K^{b} de la Clase I "vacías", con péptido y/o proteosomas purificados antes de su incubación a 4°C o 30°C. durante una hora. Las moléculas de K^{b} se inmunoprecipitaron con el anticuerpo monoclonal Y3, y se analizaron mediante SDS-PAGE. Las moléculas K^{b} "vacías" se incubaron con OVA-24; proteosomas solos; OVA-24 y proteosomas; OVA-24, proteosomas, y p-hidroximercuribenzoato; y OVA-8. Se analizaron los lisados que contenían K^{b} "vacía" sola (no se muestran los datos). Antes de la inmunoprecipitación, se desafiaron las moléculas con calor a 30°C durante una hora, y se mantuvieron a 4°C durante el mismo período (no se muestran los datos). El péptido OVA-8 se usó a una concentración final de 75 \muM y el péptido OVA-24 a una concentración de 75 \muM.
Las moléculas de K^{b} incubadas durante la noche a 4°C se disociaron casi completamente, a juzgar por su ausencia de reactividad con el anticuerpo, pero se recuperaron cuantitativamente de la mezcla de incubación que contenía el péptido OVA-8.
Los barridos densitométricos de los carriles numerados pares (no se muestran los datos) permitieron la determinación de la cantidad de K^{b} recuperada después del desafío con calor. Los datos se expresaron como porcentajes de la cantidad de complejos K^{b}/OVA-8 recuperados después del desafío con calor. La mayoría de las moléculas de K^{b}, las cuales se habían incubado con OVA-8, permanecieron intactas después del tratamiento a 30°c. El péptido más largo, OVA-24, no fue tan eficiente como el OVA-8 para estabilizar las moléculas de K^{b}, y, en concordancia con nuestros datos previos sobre la unión débil del OVA-24, sólo aproximadamente el 30% de las moléculas permanecieron después del tratamiento con calor. Cuando la mezcla de incubación contenía el péptido OVA-24 y proteosomas purificados, pudieron precipitarse un mayor número de moléculas de K^{b}, y aproximadamente el 80% de las moléculas de K^{b} sobrevivieron a la exposición a 30°C. Que la estabilidad incrementada de las moléculas de K^{b} se debía a péptido(s) deriva-
do(s) del OVA-24 era evidente a partir del hecho de que los proteosomas solos fallaron para generar péptidos en el lisado que pudieran prevenir la disociación del complejo K^{b}-\beta2 M. Esta conclusión está apoyada también por el hecho de que los proteosomas tratados con el inhibidor p-hidroximercuribenzoato (Rivett, Arch. Bioch. Biophys. 268:1-8 (1989)) no consiguieron generar péptidos procedentes de OVA-24, lo cual puede estabilizar las moléculas de K^{b} a 30°C.
Estos datos demostraron que los proteosomas aislados pueden generar péptido(s) a partir de un péptido precursor que se une débilmente a K^{b}, de tal forma que la molécula de la Clase I fue estabilizada hasta el mismo nivel que con péptidos endógenos. En consecuencia, el(los) péptido(s) derivados del OVA-24 deberían tener aproximadamente 8 aminoácidos de longitud y deben haber abarcado la secuencia del péptido OVA-8. Además, experimentos similares en los que se incubo ovoalbúmina desnaturalizada, reducida, y alquilada, con proteosomas, también resultaron en la recuperación de moléculas K^{b} termoestables (no se muestran los datos).
B. Procedimientos 1. Cultivos celulares
Se cultivaron células HeLa (ATCC nº CCL 185) en medio de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM, Gibco, Grnad Island, NY) suplementado con un 8% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, penicilina (100 \mug/ml), y estreptomicina (100 \mug/ml). Los esplenocitos de cuatro haplotipos de H-2 diferentes (H-2^{k}, ^{s}, ^{d}, y ^{q}), RMA-S, T1, T2 y astrocitos de ratón se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY). RMA-S, un mutante de ratón de la linea celular H-2^{b} de linfoma (Ljunggren y Karre, J. Exp. Med. 162:1745-1759 (1985); Karre et al., Nature 319:675-678 (1986)), es incapaz de presentar antígenos endógenos (Twonsend et al., Nature 340:443-448 (1989); Townsend y Bodmer, Ann. Rev. Immunol. 7:601-624 (1989)). T1 y T2 derivan de la linea celular mutante LBL 721.174 (0.174) de linfoblastoides B fusionados al linfoma CEM de células T (Salter et al., Immunogenetics 21:235-237 (1985)). T1, del híbrido 0.174-CEM, expresó niveles elevados del MHC de la Clase I derivado del 0.174. T2, seleccionada por la pérdida de ambas copias del cromosoma 6 humano, tiene el fenotipo de expresión inferior de la Clase I del 0.174 (Hosken y Bevan, Science 248:367-370 (1990)).
2. Radiomarcaje metabólico, inmunoprecipitación, y densitometría
El marcado metabólico de células se llevó a cabo como se describe en Jackson et al., EMBO J. 9:3153-3162 (1990), con las siguientes modificaciones. A menos que se indique lo contrario, las células se trataron con interferón gamma (IFN-gamma; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) (2500 U/ml) durante 96 horas antes del marcado metabólico. El medio del pulso contenía 0,15 mCi/ml de L[35S]metionina-deficiente y cisteína-deficiente DMEM. Las células se marcaron rutinariamente durante 4 horas seguidas por períodos de caza de diferentes intervalos de tiempo (hasta 36 horas) en presencia de medio de cultivo normal. La inmunoprecipitación, la SDS-PAGE (Blobel y Dobberstein, J. Cell. Biol. 67:835-851 (1975)) y la fluorografía (Bonner y Laskey, Eur. J. Biochem. 46:83-88 (1974)) se realizaron tal como se ha descrito (Jackson et al., EMBO J. 9:3153-3162 (1990)). La electroforesis en gel con gradiente de pH no en equilibrio en la primera dimensión (usando anfolinas de pH 3,5-10) se realizó como se describe en Jones, en Selected Methods in Cellular Immunology, Eds. Mishell y Shigii, Freeman, San Francisco, 1980, pp. 398-400. Para cuantificar la radiactividad incorporada en la proteína, se determinaron las intensidades de las bandas en las fluorografías mediante densitometría de barrido usando un Ultroscanl XL de LKB (Brouma, Suecia). Las proteínas marcadoras radiactivas, albúmina de suero bovina (67 kDa), ovoalbúmina (46 kDa), anhidrasa carbónica (30 kDa) y lactoglobulina A (18,4 kDa) se compraron a New England Nuclear (duPont, Boston, MA).
Para el análisis del pulso-caza, los lisados procedentes de varios instantes se alicuotaron en tubos dependiendo del número de antibióticos que se usaban para analizar el transporte. Se añadió anticuerpo al lisado (1 \mul de fluido de ascites, Y3, 30.5.7, 28:14:8S, W6/32), o antisuero (K193, K270), 100 \mul de sobrenadante de cultivo de hibridomas (anticuerpo B22.293); la mezcla de dejó durante 2-12 horas antes de recoger el anticuerpo mediante incubación con proteína A Sepharose durante una hora, y 5 segundos de centrifugación en la microfuga.
3. Antisueros, anticuerpo monoclonal y péptidos
Los sueros de conejo anti-humano y anti-proteosomas de rata fueron proporcionados amablemente por el Dr. A. Ichihara (Tanaka et al., J. Cell Physiol. 139:34-41 (1986)). Los ascites Y3, un anticuerpo monoclonal contra la H2-K^{b} de ratón, se prepararon usando el hibridima nº HB 176 de las ATCC (Hammerling et al., PNAS USA 79:4737-4741 (1982)). El IFN-gamma procedente de linfocitos T humanos se obtuvo de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). El IFN-gamma de ratón se obtuvo de Genentech (South San Francisco, CA) y de Amgen Biologicals (Thousand Oaks, CA). Los péptidos se sintetizaron medaitne técnicas de fase sólida en un sintetizador de péptidos 430A de Applied Biosystems, y se purificaron adicionalmente en una columna de cromatografía en fase inversa C_{18} (VyDac).
4. Fraccionamiento con sulfato amónico de homogenados de células HeLa
Las células HeLa homogeneizadas, no tratadas o tratadas con IFN-gamma, se centrifugaron para suprimir los restos nucleares y celulares, y los sobrenadantes resultantes se sometieron a fraccionamiento con sulfato amónico según se describió (Rivett, J. Biol. Chem. 260:12600-12612 (1985)). Los complejos de proteosoma de 26S presentes en el sobrenadante se precipitaron selectivamente a una saturación del 38%, mientras que los complejos de proteosomas de 19S presentes en el sobrenadante después del paso de fraccionamiento al 38% se precipitaron con sulfato amónico al 60% (Wazman et al., J. Biol. Chem. 262:2451-2457 (1987)).
5. Fraccionamiento de microsomas y citosol
Las células HeLa no tratadas y tratadas con IFGN-gamma se marcaron durante 4 horas, se homogeneizaron, y se sometieron a centrifugación diferencial. Los homogenados se centrifugaron primero a 15.000 r.p.m. durante 30 minutos para suprimir los restos nucleares y celulares. Los sobrenadantes resultantes se centrifugaron a continuación a 100.000 \times g durante 30 minutos para precipitar los microsomas. Los proteosomas en la fracciones sobrenadantes (fracción citosólica) y en los precipitados (fracción microsomal cruda) se inmunoprecipitaron separadamente y se analizaron mediante electroforesis en gel bidimensional.
6. Purificación de proteosomas
Los proteosomas se purificaron a partir de hígado bovino reciente usando una modificación del procedimiento descrito por Skilton et al. (1991). En resumen, se homogeneizó el hígado bovino reciente en Tris-HCl 10 mM (pH 7,2), KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 0,1 mM, y glicerol al 20% (v/v) ("tampón A"). El homogenado se centrifugó a 105.000 \times g durante una hora. El sobrenadante se trató primero con sulfato amónico al 38% de saturación con objeto de suprimir los grandes agregados proteicos así como la forma 26S del proteosoma (Waxman et al., J. Biol. Chem. 262:2451-2457 (1987)). El sobrenadante restante se trató a continuación con sulfato amónico al 60% de saturación con objeto de precipitar selectivamente la forma 19S del proteosoma. Se resuspendió el precipitado en un pequeño volumen de tampón A. La fracción de 60% de sulfato amónico resuspendida se sometió a tres pasos de cromatografía secuenciales: DEAE-Sepharose, cromatografía de intercambio iónico con Mono Q 10/10, y finalmente gel filtración en una columna de Superose 6. Después de cada paso de cromatografía, las fracciones que contenían proteosomas se identificaron mediante SDS-PAGE, y mediante análisis de la actividad peptidasa tal como se describe en Hough et al., J. Biol. Chem. 262:8303-8313 (1987). Los sustratos de péptidos usados fueron: N-succinil-ala-ala-phe-MCA, N-succinil-leu-leu-val-tyr-phe-MCA, y t-butoxicarbonil-phe-ser-arg-MCA.
7. Ensayo de unión del péptido
El lisado de células RMA-S que conteniendo molécula K^{b} de la Clase I vacía ser preparó usando un procedimiento modificado (Lujnggren et al., Nature 346:476-480 (1990)). En resumen, las células RMA-S se cultivaron en RPMI 1640 a 26°C durante 8 horas. A continuación se lavaron las células una vez en PBS y se incubaron de nuevo a 26°C en medio que contenía 0,25 mCi/ml de L-[^{35}S]metionina y, 25 mCi/ml de L-[^{35}S]cisteína en RPMI 1640 carente de metionina y carente de cisteína, y en medio RPMI 1640 normal, en una proporción de 10:1, durante 16 horas. Se aclararon las células en PBS y se lisaron tal como se describe más arriba. A continuación se incubó el lisado conteniendo moléculas K^{b} de la Clase I vacías con péptidos y/o proteosomas purificados, a 26°C, durante 1 hora, antes de someterlo a incubación a 30°C durante una hora adicional. A continuación se sometió esta mezcla a inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal Y3, y se analizó mediante SDS-PAGE.
Ejemplo 3 Inducción de efectores citotóxicos in vitro A. Carga osmótica
La carga osmótica de células SC2 y 3T3 con proteína ovoalbúmina se realizó tal como describen Moore et al., Cell 54:777-785 (1988). El procedimiento de ensayo es como sigue. En una placa de 96 pocillos, se co-cultivaron 1 \times 10^{5} células de Drosophila (con o sin carga de proteína/péptido) o células 3T3 con 1 \times 10^{5} células del hibridoma B3/CD8T, en 200 \mul de medio RPMI suplementado con suero fetal bovino al 10%. Después de 24 horas de incubación, se añadieron 100 \mul del sobrena procedente de estos cultivos a 100 \mul de RPMI que contenía 5000 células CTLL. Se co-cultivaron las células durante 24 horas a 37°C cuando se añadieron 1 \muCi de ^{3}H-timidina (Amersham). Después de una incubación adicional de 15 horas a 37°C, la incorporación de radiomarcaje en las células CTLL se determinó mediante recuento del centelleo.
Los ensayos realizados con MHC de ratón también verificaron que las células de insecto son capaces de cargar péptido sobre las moléculas de la Clase I. Células expresando tan pocas como 200-500 moléculas del MHC conteniendo un antígeno determinado pueden ser detectadas por una célula T. Puesto que las células de Drosophila no acumulan cromo, se usó un ensayo de presentación de antígeno basado en B3/CD8, un hibridoma de célula T. B3/CD8 es un hibridoma entre B3, una célula T citotóxica específica para el péptido de la ovoalbúmina 253-276 presentado por moléculas H-2K^{b} de la Clase I, y la linea celular portadora de CD8 y secretora de IL-2 (ver Carbone et al., ver más arriba, 1989). A partir de la estimulación antigénica, la B3/CD8 produce IL-2, mediada mediante incorporación de ^{3}H-timidina en la linea celular CTLL dependiente de IL-2 (Gillis et al., Immunol. 120:2027-2029 (1978)). Por tanto, midiendo la cantidad de IL-2 producida, se puede ensayar el reconocimiento de células T.
Con objeto de proporcionar un conjunto intracelular de proteína ovoalbúmina a partir de la cual pudieran derivarse péptidos, la ovoalbúmina (Sigma Chem. Co., MO) se cargó osmóticamente en las células tal como describieron Moore et al., ver más arriba (1988). Inmediatamente después de cargarlas, se mezclaron las células con el hibridoma de la célula T. Después de dos días de incubación, se retiró el medio y se ensayó en busca de IL-2. La cantidad de IL-2 se determinó por la capacidad del medio de mantener el crecimiento de la línea celular CTLL dependiente de IL-2 (Gillis et al., ver más arriba (1978)), y el crecimiento se cuantificó mediante la cantidad de timidina radiactiva incorporada en las células. Puede observarse en la Figura 4 que las células T respondieron a las células de Drosophila si se añadía al medio el péptido de ovoalbúmina. Las moléculas del MHC de la Clase I expresadas sobre la superficie celular de la célula de insecto son completamente funcionales en que pueden unir péptido si se añade al medio de cultivo, y pueden presentarlo en el contexto correcto para que sea reconocido por una célula T.
B. Optimización de condiciones in vitro
Para la optimización de las condiciones in vitro para la generación de células T citotóxicas específicas, el cultivo de células estimulantes de células de Drosophila se mantiene preferiblemente en medio libre de suero (por ejemplo, Excell 400). Las células estimulantes de células de Drosophila se incuban preferiblemente con > 20 \mug/ml de péptido. La proporción efectoras:estimulantes (proporción celular de linfocito:Drosophila) está preferiblemente en el rango de aproximadamente 30:1 hasta 300:1. El máximo específico de CD8 se observa generalmente después de cinco días de cultivo. El cultivo de células diana para ensayos de destrucción (killing assay) se mantiene preferiblemente en un medio carente de suero.
C. Ensayo citotóxico de liberación de ^{51}Cr
La actividad citolítica mediada por células se detectó con ^{51}Cr o ensayo de liberación. El porcentaje de lisis específica de 10^{4} células diana marcadas con ^{51}Cr en 200 \mul se determinó para varias proporciones de linfocito respecto células diana, y varias curvas de dosis-respuestas de cada población mediante la representación de las citotoxicidad específica frente al log_{10} del número de efectoras viables. Los valores de liberación espontánea de ^{51}Cr variaron entre el 5% y el 15% del marcaje total incorporado. El porcentaje de liberación específica de ^{51}Cr se calculó de acuerdo con la fórmula siguiente: (ER-MR) (MR-SR) \times 100, en donde ER es la liberación de 51Cr experimental observada, SR es la liberación espontánea detectada incubando células diana en medio de cultivo solo, y MR es el máximo de radiactividad liberada a partir de células diana después de su incubación en 200 \mul de HCl durante la duración del ensayo.
D. Inducción de efectores citotóxicos mediante estimulación primaria in vitro con células de Drosophila que expresan la Clase I de ratón y péptidos
Los péptidos OVA, NP (gripe) y NP (LcMV) se usaron como una fuente de péptidos para verificar su capacidad para generar una respuesta CD8 primaria in vitro. (Ver Figuras 6A y 6B). Una incubación de cinco días de células de bazo procedentes de ratones Balb/c inmunizados con C57BL/6, con las respectivas células de Drosophila expresando el antígeno H2-K^{b} + antígeno H2-L^{d} + antígeno, generó efectores que eficientemente lisaron el tumor EL4 y P815 en presencia de péptidos.
P815 (ATCC T1B 64) (H2-L^{d}) es un mastocitoma procedente de ratones DBA/2. EL4 (ATCC T1B 39) es un timoma procedente de C57BL/6 (H-2^{b}). EL4 se transfectó con cADN de OVA en una construcción de plásmido con el promotor de la \beta-actina humana para derivar la línea celular EL4-OVA de producción de OVA. Estos tumores se mantuvieron como cultivos en suspensión estacionarios en RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino FBS (ver Moore et al., Cell 54:777-785 (1988)). Jurkat (ATCC CRL 8163) es una linea celular humana que expresa el HLA B7. Jurkat A2 es una linea celular transfectada producida transfectando células Jurkat con HLA A2.1, por ejemplo, a través de procedimientos descritos en la presente invención. (Ver también Irwin et al., J. Exp. Med. 170:1091-1101 (1989)).
Los péptidos sintéticos pueden sustituirse por proteínas virales sintetizadas endógenamente durante el reconocimiento de CD8. La CD8 específica generada pudo reconocer péptidos sintetizados endógenamente presentados por la Clase I sobre la superficie de EL4 (transfectada con un ADN de ovoalbúmina). (Ver Moore et al., Cell 54:777-785 (1988)). Similarmente, la CD8 generada in vitro contra la D^{d} cargada con péptido NP de la gripe reconoció células diana EL4 infectadas con la cepa A/PR/8 del virus de la gripe (ver Figura 7). (Ver Carbone et al., J. Exp. Med. 167:1767-1779 (1988); la cepa A/PR/8/34 está también disponible a partir de la American Type Culture Collection con el número de acceso ATCC VR-95).
E. Caracterización de células citotóxicas antipéptido
Para determinar si el reconocimiento específico del péptido era debido a la actividad de la célula T, estas lineas se trataron con anti-CD8 (OKT8, ATCC nº CRL 8014) o anti-CD8 (OKT4, ATCC nº CRL 8002) y/o complemento, antes de su adición al cultivo de ensayo. Sólo el tratamiento con anti-CD8 abolió la citotoxicidad.
Estos CD8 específicos se ensayaron con células 3T3/D^{b} y 3T3/K^{b}, producidas mediante transfección de células BALB 3T3 (ATCC CCL 163) respectivamente con D^{b} o K^{b}. (Otros cultivos de 3T3 son fácilmente asequibles para su usó, incluyendo el ATCC CCL 163.2). Preferiblemente, se prepararon transfectantes estables vía cotransfección de 3T3 mediante p^{CKU}/K^{b} o p^{CMU}/D^{b} y pSV2neo, y se seleccionaron con G418 (Ver también Joly y Oldston, más arriba (1991)). La respuesta de CD8 anti-OVA estuvo restringida por D^{b} o K^{b}, confirmando que estas actividades muestran la restricción clásica del MCH de la Clase I.
La capacidad de elicitar CD8 mediante la estimulación con péptidos permite una técnica relativamente sencilla con la que estudiar el reconocimiento restringido de la Clase I. Puesto que las células T son específicas para formas desnaturalizadas en vez de naturales o antígenos ajenos, los péptidos representan claramente un medio potencial de vacunación efectiva.
F. Generación de células CD8 específicas
Los complejos de Clase I-péptido de célula de Drosophila se fijaron con glutaraldehído al 0,001% y se lavaron a continuación, y se usaron como estimulantes es co-cultivos de linfocitos. Transcurridos 5 días de co-cultivo se detectó una actividad citotóxica muy débil, confirmando que las células de Drosophila vivas (es decir, no fijadas) son superiores para generar CD8 específicos. La adición de un 10% de sobrenadante del cultivo de Drosophila a las células fijadas restablece la generación de CD8 específicos. (Ver Figuras 8A y B).
Las células cultivadas que expresaban los antígenos sinérgicos de la Clase I, las cuales ordinariamente no conseguían activar los CD8 en cultivos primarios, fueron capaces de generar CD8 específicos después de la adición de sobrenadante del cultivo de células de Drosophila.
La supresión de células CD4+ y Clase II+ de la población que responde disminuye la actividad CD8 generada con péptido cargado sobre células de Drosophila. Por tanto, la respuestas primarias inducidas por las células de Drosophila cargadas de péptido parece se dependiente de células CD4'u de la Clase II.
Ejemplo 4 Eficacia in vivo del tratamiento A. Rechazo de tumores
Usando los procedimientos descubiertos en la presente invención, es ahora posible matar específicamente células diana en humanos usando las células CD8 activadas, específicas, de la presente invención. Esencialmente, la metodología de tratamiento incluye los siguientes pasos: (1) obtener una muestra de fluido conteniendo células T procedentes de un individuo a ser tratado; (2) cargar moléculas del MHC de la Clase I vacías con al menos una especie de péptido antigénico, en donde el péptido es sustancialmente homólogo a al menos una porción de un péptido derivado de la célula diana; (3) mezclar las células T in vitro con una cantidad de moléculas del MHC de la Clase I cargadas con péptido suficiente para producir células CD8 activadas; (4) recolectar las células CD8 activadas del cultivo; y (5) administrar las células CD8 activadas al individuo a tratar.
Esta metodología ya está mostrando resultados prometedores en un modelo con ratón. Por ejemplo, en un estudio, se inyectaron subcutáneamente ratones hembras C57BL/6 (aproximadamente de 6-8 semanas de edad) con tres millones (3MM) de células tumorales EL4/OVA justo detrás de las orejas. Las células tumorales se hicieron tumorigénicas mediante un único pasaje en ratones C57BL/6. El día de la inoculación subcutánea con células tumorales EL4/OVA, se inyectaron los ratones con células CD8 estimuladas con Drosophila/K^{b}/OVA, bien cerca de (proximales a) el sitio de inyección de las células tumorales, o intravenosamente.
El día 8, se midieron las dimensiones del tumor. Los cinco ratones control que habían recibido sólo los 3MM de células tumorales tenían tumores que medían 12 mm \times 12 mm de tamaño. Se examinaron tres ratones que recibieron células tumorales y 24MM de células CD8 inyectadas IV; el tamaño de los tumores era (a) 2 mm \times 2 mm, (b) 5 mm \times 5 mm, y (c) 12 mm \times 12 mm en esos ratones. Se examinaron cinco ratones que recibieron células tumorales y 24MM de células CD8 cerca del sitio de inyección del tumor. Los resultados fueron como sigue: (i) tres ratones no tenían tumores detectables el día 8; (ii) un ratón tenía un tumor que medía 1 mm \times 1 mm; y (iii) un ratón tenía un tumor que medía 5 mm \times 5 mm.
En el día, se determinó que los tamaños de los tumores eran como sigue:
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En un experimento subsiguiente, se midió el volumen de tumores en ratón después de que se aplicaran varios regímenes. Los ratones se inyectaron con tres millones (3MM) de células tumorales EL4/OVA tal como se describió más arriba. El día de las inoculaciones adicionales con células tumorales EL4/OVA, los ratones se inyectaron previamente con células CD8 estimuladas con Drosophila/K^{b}/OVA de forma intraperitoneal, subcutánea o intravenosa, según se describe en la Tabla 2 más abajo. El volumen del tumor se midió en los días 6, 8, 10, 12 y 20, a continuación de la inyección. En cada experimento y en el grupo de control se incluyeron cinco ratones. Los resultados se detallan en la Tabla 2 más abajo.
TABLA 2 
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B. Tratamiento de la gripe
Por ejemplo, pueden generarse poblaciones de CD8 específicas para la gripe de acuerdo con las técnicas descubiertas en la presente invención, y probarse efectivas para proteger individuos contra la infección de gripe letal. La CD8 reactiva contra el virus, derivada del cebado con péptido in vitro, es capaz de proporcionar protección in vivo, y sugiere que la estimulación primaria de CD8 in vitro puede probarse útil en el diseño de una variedad de vacunas antivirales y antiretrovirales.
C. Cebado in vivo de ratones con células de Drosophila transfectadas con la Clase I
La inyección de 50 \times 10^{6} células de Drosophila intraperitonealmente (IP) condujo a la inducción de CD8 específicas. La detección de este cebado se realizó usando un análisis de dilución limitada. La frecuencia de las CD8 específicas para OVA fue de aproximadamente 10^{6} en ratones "ingenuos". Después de inyectar células de Drosophila recubiertas con péptido, la frecuencia es aproximadamente 10^{3} (no se muestran los datos).
La Figura 8 (A y B) ilustra el cebado in vivo con células de Drosophila transfectadas, en donde las que responden son esplenocitos de ratón C57BL/6. En 8A, algunas de las células están fijadas; en 8B, las células de Drosophila están todas sin fijar.
Para una respuesta de CD8 secundaria, se cebaron ratones C57BL/6 mediante una inyección IP de células de Drosophila (5 \times 10^{7}) y se ensayaron 5-15 días después de la inmunización. (Ver Figura 8B). La inducción de CD8 activadas in vivo aparentemente estimula el rechazo de tumores.
En otro experimento, se inyectaron subcutáneamente ratones C57BL/6 con 3MM de EL4 OVA. Cinco días más tarde, los ratones del grupo I recibieron una inyección subcutánea de 50MM de células de Drosophila (vivas) expresando K^{b}/OVA; los ratones del grupo II recibieron una inyección subcutánea de células de Drosophila fijadas expresando K^{b}/OVA; los ratones del grupo III fueron el gripo control y no recibieron inyección adicional alguna el día 5. Los resultados del experimento se ilustran en la Figura 9, la cual muestra que los ratone del grupo I sobrevivieron durante más tiempo y sobrevivieron en mayor número.
Las CD8 primarias se indujeron mediante Clase I cargada con péptido en células de Drosophila y en ratones B6 no cebados. Las CD8 se estimularon una vez in vitro con células de Drosophila cultivadas durante 36 horas a 22°C, incubadas con diferentes concentraciones de péptidos OVA. La cantidad mínima final de péptido es aproximadamente de 20 \mug/ml. Las efectoras se recolectaron y ensayaron sobre células RMA-S con 50 \mug de péptidos. Las poblaciones de CD8 fueron capaces de reconocer RMA-S OVA-8. (Ver Figuras 6A y B).
En otro experimento, se degradó proteína ovoalbúmina con la endoproteinasa Glu-C (procedente de Staph. aureus; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). La mezcla se añadió a cultivo de células de Drosophila con MHC de ratón. Después de aproximadamente 5 días, las células CD8 se expusieron a las efectoras; un cierto número de células CD8 fueron capaces de reconocer RMA-S OVA-8.
D. Valoración del péptido a nivel de células diana
Estudios recientes han demostrado que los péptidos de 9 aminoácidos de longitud están presentes como una especie menor en las preparaciones de péptidos sintéticos. Aquéllos más largos de 9 aminoácidos se unen con baja afinidad a la molécula del MHC de la Clase I H-2K^{b}. Los experimentos de valoración de péptido mostraron que una concentración 50 veces inferior de un péptido 9-mero que de un péptido 16-mero es suficiente para la inducción de respuesta de células T. La misma valoración de péptido se llevó a cabo para la sensibilización de células diana. Los resultados indican que la sensibilización de células se consigue con una concentración de péptido aproximadamente 1000 veces menor que la requerida para la inducción de una respuesta in vitro.
E. Generación de CD8 en ratones transgénicos
En este estudio se usaron ratones transgénicos expresando HLA 2.1, HLA B7 y HLA B27. Los esplenocitos de los ratones se cultivaron con células de Drosophila que expresaban el HLA sinérgico (respectivamente, A2.1, B7 y B27). Las respuestas CD8 específicas se generaron contra tres péptidos del VIH. (Ver Figuras 10A, B y C).
En estos estudios se usaron ratones C75BL/6 (H2^{b}) y Balbic (H2^{d}) emparentados, así como varios ratones transgénicos. Los ratones transgénicos incluían los siguientes. Los ratones transgénicos B7 se produjeron en laboratorio como sigue. En resumen, se microinyectó un clon HLA-B7 genómico (incluyendo varios centenares de pares de bases de las regiones flanqueantes 5' y 3') en embriones de ratón B6 \times SJL (Scripps Research Institute Transgenic Facility, La Jolla, CA). La linea transgénica B7 ha sido cruzada de nuevo con C57BL/6 (H2^{b}) (Scripps Research Institute Transgenic Facility, La Jolla, CA). Los ratones transgénicos B27 pueden producirse de acuerdo con procedimientos conocidos; los nuestros se produjeron inyectando clones genómicos en embriones B6 \times SJL y cruzándolos de nuevo los mismos con C57BL/6 (Scripps Research Institute Transgenic Facility, La Jolla, CA). (Ver también Krimpenfort et al., EMBO J. 6(8):1673 (1987), para otro procedimiento de generar ratones transgénicos B27). Los ratones transgénicos de microglobulina \beta2 y los ratones transgénicos de A2-1 se produjeron de forma similar usando técnicas conocidas (ver, por ejemplo, Irwin et al., J. Exp. Med. 170:1091-1101 (1989)).
F. Generación de CD8 específicas para VIH en humanos
Se ensayaron PBL procedentes de donantes negativos por su capacidad para generar CD8 específicas contra dos péptidos del VIH. Estos donantes eran HLA A2, HLA B7 o HLA B27. Después de 5 días de cultivo, pudo detectarse una actividad CD8 muy intensa en el cultivo contra ambos péptidos del VIH. (Ver Figuras 11A, B y C).
\newpage
Los PBL humanos se aislaron mediante centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Los linfoblastos de PLB se almacenaron en nitrógeno líquido después de congelarlos en FBS conteniendo un 10% de DMSO. La viabilidad celular y las funciones de linfocitos se conservaron.
Las células CD8 específicas para un péptido se generaron en cultivo primario sinérgico con células de Drosophila que expresaban el complejo sinérgico de la Clase I-péptido. Estos cultivos se establecieron con 3 \times 10^{7} células de bazo de ratón, o PBL humanos, que respondían, y 10^{6} células vivas de Drosophila, en 20 ml de medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 5 \times 10^{-5} M de \beta-mercaptoetanol y 5% de FBS, en un frasco de 25 cm^{2} en vertical, a 37°C en 7% de CO_{2}. Las células CD8 se recolectaron después de 5 días en cultivo.
En otro experimento, los PBL humanos se recolectaron y estimularon, a lo largo de un período de 5 días, con células de Drosophila que expresaban el HLA A2.1 humano y se cargaron con el péptido POL de VIH. Los PLB estimulados se ensayaron a continuación en células Jurkat infectadas con VIH. Los resultados de los experimentos se ilustran en la Figura 12. Los PLB humanos estimulados in vitro fueron claramente capaces de reconocer el A2.1 POL sobre células infectadas y de matar dichas células.
Ejemplo 6 Aplicaciones terapéuticas A. Banco de moléculas de la Clase I
Puede establecerse y mantenerse un depósito o "banco" de lineas celulares de Drosophila, expresando cada linea celular uno de las 50 a 100 moléculas más comunes de la Clase I. Los cADN codificando estas proteínas pueden clonarse en base a variantes del HLA obtenidas a partir de lineas celulares conteniéndolo -por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (ver Ennis et al., PNAS USA 87:2833-2837 (1990))- e insertarse en el vector apropiado, tal como un vector de expresión en insecto, para generar lineas celulares expresando cada variante de HLA. El ensayo de acuerdo con el protocolo siguiente puede usarse, por ejemplo, para determinar qué péptidos derivados del virus de elección se unen con la mejor de las diferentes moléculas de la Clase I. Los diversos cultivos pueden marcarse apropiadamente o catalogarse para indicar qué moléculas de la Clase I son las mejores para su uso con péptidos, alternativamente, pueden establecerse cultivos transitorios según se necesitara. Tal como se ha discutido en la presente invención, después de aproximadamente 48 horas de incubación de un cultivo de células de insecto con un vector, ese cultivo es aparentemente capaz de expresar moléculas del MHC vacías, las cuales pueden cargarse con el(los) péptido(s) de elección para el propósito de activar células CD8.
B. Preparación de lineas celulares "especiales"
Después del tipado del HLA, si no hay disponibles células de Drosophila expresando el HLA preferido, los cADN codificando el HLA preferido pueden clonarse a través del uso de la reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores descubiertos en las sección B.1 anterior (SEC Nº ID 1 a SEC Nº ID 12) pueden usarse para amplificar los cADN de HLA-A, -B, -C, -E, -F o -G apropiados en reacciones separadas, los cuales pueden clonarse a continuación y secuenciarse según se describe en los procedimientos descubiertos en el Ejemplo 1, SECCIÓN anterior. A continuación se purifica el ADN a partir de la reacción de la PCR usando un equipo Gene Clean (Bio 101, San Diego, CA) y se liga directamente en el sitio SmaI de pRmHa-3. Se aíslan clones individuales, se verifican las secuencias, y se expresan lineas celulares de Drosophila estable expresando el HLA establecido. Alternativamente, puede cultivarse a gran escala una población conjunta de plásmidos recombinantes, y purificarse el ADN mediante gradientes de cloruro de cesio. El ADN purificado se usa entonces para transfectar células de Schneider usando técnicas de precipitación con fosfato cálcico. Transcurridas 24 horas, se lavó el precipitado se elimina mediante lavado y se remplaza con medio Schneider reciente que contiene CuSO_{4} 1 mM. Cuarenta y ocho horas más tarde, la población general de células transfectadas transitoriamente se usa para la activación in vitro de CD8 después de su incubación con péptidos sinérgicos o digeridos de proteasa de proteínas específicas.
A continuación pueden establecerse lineas celulares estables expresando el HLA clonado en las células de Drosophila. Alternativamente, una población de células de insecto, expresando transitoriamente una población general de moléculas recombinantes clonadas procedentes de la reacción de la PCR, pueden usarse para la activación in vitro de CD8.
También es posible activar CD0 de haplotipo específico in vitro usando células de insecto que expresan MHC de la Clase I incubadas con péptidos, donde el MHC expresado por la linea celular no es el elemento expresado in vivo. Esto proporciona una oportunidad única para proliferar células CD8 que reconocen un antígeno específico asociado con un MHC particular, el cual no sería posible in vivo debido a restricciones alélicas. Por ejemplo, un péptido (NP) procedente de la proteína nuclear del virus de la gripo está ordinariamente restringido a la molécula D^{b}; sin embargo, hemos hallado que un péptido tal puede unirse a la K^{b} (aunque más débilmente que a la D^{b}) y puede generar un grado de estabilidad térmica para la K^{b} (ver Figura 3). Además, las células de Drosophila expresando K^{b} preincubadas con el péptido NP, y cocultivadas con esplenocitos procedentes de un ratón B6, resultan en la activación in vitro de CD8, las cuales reconocen específicamente las molécula de K^{b} asociada con el péptido NP. Además, el experimento recíproco, usando un péptido restringido a K^{b} (OVA) derivado de la ovoalbúmina, y células de Drosophila expresando D^{b}, resultó en la proliferación de CD8 que reconocían específicamente D^{b} conteniendo el péptido OVA. Tales CD8 son capaces de matar células (EL4 OVA) transfectadas con cADN codificando la proteína ovoalbúmina, indicando que, in vivo, algunas moléculas D^{b} son cargadas con el péptido OVA.
Por tanto, este sistema proporciona una oportunidad única para proliferar CD8 contra antígenos específicos presentados por una molécula de la Clase I, la cual, in vivo, no es el elemento de restricción para ese péptido. Aunque suficiente antígeno es presentado in vivo por dicha Clase I como para que la célula sea reconocida por la CD8 y destruida, no es bastante como para proliferar tales CD8 in vivo. Mediante la carga de moléculas de la Clase I vacías, expresadas por células de Drosophila, con péptido, somos presumiblemente capaces de superar la restricción in vivo proporcionando un exceso de péptido antigénico a la molécula de la Clase I en un entorno no competitivo, de tal forma que suficiente antígeno es presentado por la Clase I como para activar las CD8 específicas para que reconozcan este complejo.
C. Tratamiento del SIDA
Las células activadas in vitro pueden suministrarse a pacientes para su terapia in vivo. Preferiblemente, primero se determina el genotipo (haplotipo) de la Clase I del individuo. El tipado de tejidos convencional es apropiado para este propósito, y puede realizarse en el centro de tratamiento o mediante alguna operación comercial apropiada. Una vez que se ha(n) determinado el(los) tipo(s) de HLA del individuo, se discierne la mejor combinación de péptidos y moléculas de la Clase I apropiadas para el paciente individual, y se prepararan como se ha mencionado más arriba, y las células de Drosophila y péptidos apropiados se proporcionan para el tratamiento del paciente. Las células CD8 (T) en reposo o precursoras, procedentes de la sangre del paciente, se estimulan a continuación con el MHC cargado con péptido apropiado producido por el cultivo de células de Drosophila. Después de su activación, las células CD8 se reintroducen en el torrente sanguíneo del paciente, y se continua monitorizando el proceso morboso del paciente. Los procedimientos para retirar y reintroducir componentes celulares en el torrente sanguíneo son conocidos en la técnica, e incluyen procedimientos tales como los ejemplificados en la patente estadounidense nº 4.844.893 para Honsik et al., y la patente estadounidense nº 4.609.915 para Rosenberg.
Pueden administrarse tratamientos adicionales, según fuera necesario, hasta que la enfermedad estuviera suficientemente resuelta. Protocolos de tratamiento similares son apropiados para su uso con otros individuos inmunodeprimidos, incluyendo los pacientes de transplantes, pacientes ancianos, y similares.
D. Tratamiento del cáncer
En los pacientes de cáncer se usa un procedimiento de tratamiento similar al descrito más arriba. No obstante, en tales pacientes, debería anticiparse que la terapia convencional para reducir la masa del tumor puede preceder a la terapia inmune descrita en la presente invención. Por tanto, se prefiere que las muestra de sangre procedentes de los pacientes putativos se obtengan y almacenen (por ejemplo, mediante congelación) antes de comenzar la terapia convencional tal como la radiación o quimioterapia, las cuales tienden a destruir las células inmunitarias. Puesto que pocas, si alguna, formas de cáncer surgen en respuesta directa a una infección viral, los péptidos diana para el tratamiento se observan menos fácilmente. No obstante, estudios recientes indican que las mutaciones en los oncogenes ras, neu y p53 contribuyen al cáncer en tanto como el 50% de todos los casos de cáncer. Por tanto, los péptidos derivados de estas regiones mutadas de las moléculas son candidatos principales como dianas para la presente terapia. Siguiendo los protocolos descubiertos en la presente invención, puede determinarse y administrarse la mejor combinación de péptidos y moléculas de la Clase I para el paciente individual.
Por ejemplo, muchos tumores expresan antígenos que son reconocidos in vitro por células CD8 derivadas de los individuos afectados. Tales antígenos, que no se expresan en células normales, pueden, por tanto, identificarse, así como el tipo HLA que los presenta a las células CD8, para una inmunoterapia dirigida con precisión usando los procedimientos de la presente invención. Por ejemplo, van der Bruggen et al. han descrito un antígeno cuya expresión está dirigida por un gen específico, antígeno que parece ser presentado por HLA A1 (Science 254:1643-1647 (1991)). Puesto que se han aislado y descrito varios antígenos de tumores humanos, ellos devienen buenos candidatos para las aplicaciones inmunoterapéuticas tal como se describen en la presente invención.
E. Terapias/conjugados combinados
Puede ser posible administrar las células CD8, activadas in vitro mediante procedimientos de la presente invención, conjuntamente con otros inmunogenes. Por ejemplo, puede administrarse el Imnunogén Multivalente Grande, descubierto en la patente estadounidense nº 5.045.320, conjuntamente con células CD8 activadas.
También se contempla que citoquinas tales como la IL2 e IL4, las cuales median la diferenciación y activación de células T, pueden administrarse, puesto que las citoquinas son capaces de estimular la respuesta de células T contra células tumorales in vivo. Se cree que la IL2 juega un papel principal en el crecimiento y diferenciación de las percursoras de CTL (CD8) y en la proliferación de CD8. La administración de IL2 a pacientes con cáncer se asocia frecuentemente con una mejora en la respuesta anti-tumor, lo que probablemente esté relacionado con la inducción de células T específicas para el tumor. No obstante, los mejores efectos terapéuticos de la IL2 pueden obtenerse mediante administración continua de IL2 local en vez de sistémica, minimizando por tanto la toxicidad de IL2 y prolongado su actividad biológica. Por tanto, se sugiere en la presente invención que uno puede conseguir el suministro local a través de la transfección de células tumorales con una construcción de gen de la IL2.
El cADN de la IL2 se construye tal como describrieron Karasuymaa y Melchers en Eur. J. Immunol. 18:97-104 (1988). La secuencia completa del cADD de la IL2 se obtuvo como un fragmento XhoI a partir del plásmido pBMGneo IL2 (ver Karasuymaa y Melchers, más arriba) y se ligó directamente en el sitio SalI en pRmHa-3. El plásmido pRmHa-3 recombinante, con el inserto en la orientación correcta (determinada mediante mapado de restricción con HindIII), se purificó mediante gradientes de cesio, y se usó para cotransfectar células Schneider 2 usando la técnica del fosfato cálcico. (Con este propósito se preparó una mezcla de ADN de plásmido: 10 \mug de pRmHa-3 conteniendo cADN de IL2, 6 \mug de cada uno de los plásmidos pRmHa-3 conteniendo cadena pesada de la Clase I, o microglobulina \beta2, o 2 \mug de AND phshsneo). Se obtuvieron lineas celulares estables, las cuales son inducibles mediante CuSO_{4}, para expresar cadena pesada, microglobulina \beta2, e IL2, mediante cultivo de los transfectantes en medio G418. Estas lineas celulares estables se recubrieron con péptido y se usaron en el ensayo in vitro tal como se ha descrito más arriba. Se observa que las células tumorales transfectadas con IL2 potencian la actividad de CTL (CD8) contra las células tumorales progenitoras y prescinden de las función auxiliar de T y CD4 en la inducción de una respuesta anti-tumor o citotóxica in vivo. Por tanto, se sugiere en la presente invención el incremento del potencial del sistema de Drosophila mediante la cotransfección con el gen de la IL2.
Se pretende que lo precedente sea ilustrativo de la presente invención, pero no limitante. Pueden efectuarse numerosas variaciones y modificaciones sin apartarse del verdadero espíritu y ámbito de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Peterson, Per A
\hskip4cm Jackson, Michael
\hskip4cm Lenglade-Demoyen, Pierre
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ACTIVACIÓN IN VITRO DE CÉLULAS T CITOTÓXICAS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SEQUENCIAS: 36
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: The Scripps Research Institute
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 10666 North Torrey Pines Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: La Jolla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 92037
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US93/
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO: 18 de febrero de 1993
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 07/841.662
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO: 19 de febrero de 1992
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Logan, April
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33.950
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: SEQ0002P
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (619) 554-2937
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (619) 554-6312
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGGC CGTCATGGCG CCC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCACACTT TACAAGCTCT GAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGCT GGTCATGGCG CCC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGACTCGATG TGAGAGACAC ATC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGCG GGTCATGGCG CCC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCAGGCTT TACAAGCGAT GAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGCG GGTAGATGCC CTC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTTACAAGC TGTGAGACTC AGA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGGC GCCCCGAAGC CTC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCACACTT TATTAGCTGT GAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGGC GCCCCGAACC CTC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCACAATT TACAAGCCGA GAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 427 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 740 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTTGGATCC AGATCTACCA TGTCTCGCTC CGTGGCCTTA GCTGTGCTCG CGCTACTCTC 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCGGAT GGTTACATGT CGCGATCCCA CTTAAC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGCCGTGA CTGACTGAG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCTCGGCAC TGACTGACTC CTAG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGATCCAT GGCCGTCATG GCGCCC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGAATTCTC ATCAGGGCTT CGGCAGCCC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCTCTC AGACGCCGAG ATGCGGGTCA CGGCGCCC 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCTTGAGCA CTTGTTCTTT TTGCAGAAGC TCAGAATAAA CGCTCAACTT 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
200 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
201 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
202 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Arg Ile Gly Cys Arg His Ser Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu The Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
204 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATATGGATCC TCACCATCTC AGGGTGAGGG GC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu Lys Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> The Scripps Research Institute
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Activación in vitro de células T citotóxicas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SJK/FP6048722
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 02014141.2
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2002-06-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 93906141.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1993-02-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 7/841,662
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1992-02-19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaccatggc cgtcatggcg ccc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtcacactt tacaagctct gag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaccatgct ggtcatggcg ccc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggactcgatg tgagagacac atc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaccatgcg ggtcatggcg ccc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtcaggctt tacaagcgat gag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaccatgcg ggtagatgcc ctcc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttacaagc tgtgagactc aga 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaccatggc gccccgaagc cte 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtcacactt tattagctgt gaga 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaccatggc gccccgaacc ctc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtcacaatt tacaagccga gag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila melanogaster 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 740
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila melanogaster 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttggatcc agatctacca tgtctcgctc cgtggcctta gctgtgctcg cgctactctc 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggatccggat ggttacatgt cgcgatccca cttaac 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagccgtga ctgactgag 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccctcggcac tgactgactc ctag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggatccat ggccgtcatg gcgccc 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggaattctc atcagggctt cggcagccc 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cADN de HLA B27 sol
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggatcctctc agacgccgag atgcgggtca cggcgccc 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcttgagca cttgttcttt ttgcagaagc tcagaataaa cgctcaactt tg 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
205 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Glu Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ser Ser Gly Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Thr Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Arg Ile Gly Cys Arg His Ser Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu The Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Asp Cys Lys Val Met Val His Asp Pro Ser Leu Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atatggatcc tcaccatctc agggtgaggg gc 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu Lys Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Peterson, Per A
\hskip4cm Jackson, Michael
\hskip4cm Lenglade-Demoyen, Pierre
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ACTIVACIÓN IN VITRO DE CÉLULAS T CITOTÓXICAS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SEQUENCIAS: 36
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: The Scripps Research Institute
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 10666 North Torrey Pines Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: La Jolla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 92037
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US93/
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO: 18 de febrero de 1993
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 07/841.662
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO: 19 de febrero de 1992
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Logan, April
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33.950
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: SEQ0002P
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (619) 554-2937
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (619) 554-6312
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGGC CGTCATGGCG CCC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCACACTT TACAAGCTCT GAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGCT GGTCATGGCG CCC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGACTCGATG TGAGAGACAC ATC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGCG GGTCATGGCG CCC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCAGGCTT TACAAGCGAT GAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGCG GGTAGATGCC CTC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTTACAAGC TGTGAGACTC AGA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGGC GCCCCGAAGC CTC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCACACTT TATTAGCTGT GAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCATGGC GCCCCGAACC CTC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCACAATT TACAAGCCGA GAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 427 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 740 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTTGGATCC AGATCTACCA TGTCTCGCTC CGTGGCCTTA GCTGTGCTCG CGCTACTCTC 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCGGAT GGTTACATGT CGCGATCCCA CTTAAC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGCCGTGA CTGACTGAG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCTCGGCAC TGACTGACTC CTAG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGATCCAT GGCCGTCATG GCGCCC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGAATTCTC ATCAGGGCTT CGGCAGCCC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCTCTC AGACGCCGAG ATGCGGGTCA CGGCGCCC 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCTTGAGCA CTTGTTCTTT TTGCAGAAGC TCAGAATAAA CGCTCAACTT 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
206 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
207 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
208 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Arg Ile Gly Cys Arg His Ser Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu The Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
209 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATATGGATCC TCACCATCTC AGGGTGAGGG GC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu Lys Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu}

Claims (12)

1. Procedimiento para producir una célula T CD8^{+} activada in vitro, comprendiendo el procedimiento poner en contacto, in vitro, una célula T CD8^{+} con una molécula del MHC de la Clase I humana cargada con antígeno y expresada sobre la superficie de una célula de insecto durante un período de tiempo suficiente para activar, de una manera específica para el antígeno, la célula T CD8^{+}.
2. Procedimiento de la reivindicación 1, en la cual el procedimiento comprende además:
(a)
separar la célula T CD8^{+} activada de la molécula del MHC de la Clase I humana cargada con antígeno; y
(b)
suspender la célula T CD8^{+} activada en un portador o excipiente aceptable.
3. Procedimiento de la reivindicación 1 ó reivindicación 2, en la cual la célula de insecto es una célula de
Drosophila.
4. Procedimiento de la reivindicación 1 ó reivindicación 2, en la cual la célula de insecto es una célula de gusano soldado.
5. Procedimiento de la reivindicación 1 ó reivindicación 2, en la cual la célula de insecto es una célula de polilla, gusano de seda o de mosquito.
6. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual la célula T CD8^{+} procede de un humano.
7. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual la célula T CD8^{+} comprende un gen del MHC de la Clase I humano bajo el control de un promotor inducible, y un gen expresable de la \beta-2-microglobulina humana.
8. Procedimiento de la reivindicación 7, en la cual las moléculas vacías del MHC de la Clase I se expresan sobre la superficie de la célula de insecto, y la célula de insecto se pone en contacto con un péptido antígeno.
9. Procedimiento de la reivindicación 7, en la cual el promotor inducible es un promotor de metalotioneína.
10. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la cual el gen del MHC de la Clase I humano y el gen de la \beta-2-microglobulina humana se transfectan dentro de la línea celular de insecto.
11. Procedimiento de la reivindicación 7, en la cual el antígeno del MHC de la Clase I humano es B7, B27 ó A2.1.
12. Procedimiento de la reivindicación 8, en la cual el péptido se deriva de una proteína vírica.
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Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7252829B1 (en) 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
US5583031A (en) * 1992-02-06 1996-12-10 President And Fellows Of Harvard College Empty major histocompatibility class II heterodimers
CA2069541C (en) * 1992-05-26 2005-02-01 Cornelis J. M. Melief Induction of an antigen-specific t-lymphocyte response
IL106610A0 (en) * 1992-08-07 1993-12-08 Cytel Corp Hla binding peptides and their uses
US5571669A (en) * 1993-01-14 1996-11-05 The University Of Pennsylvania Transcription and nucleic acid sequence determination with short primer DNA/RNA molecules and RNA polymerase
EP0726941B1 (en) * 1993-08-06 2002-04-03 Epimmune Inc. Methods for (ex vivo) therapy using peptide-loaded antigen presenting cells for the activation of ctl
FR2710536B1 (fr) * 1993-09-29 1995-12-22 Transgene Sa Usage anti-cancéreux d'un vecteur viral comportant un gène modulateur de la réponse immunitaire et/ou inflammatoire.
US6090587A (en) * 1993-10-25 2000-07-18 Corixa Corporation Prokaryotic expression of MHC proteins
FR2722207B1 (fr) * 1994-07-07 1996-09-27 Inst Nat Sante Rech Med Methode pour generer une population de cellules presentant a leur surface une forte densite d'un pepride exogene specifique associe azx molecules du cmh; population de cellules
US5674681A (en) * 1994-12-06 1997-10-07 Rothenberg; Barry E. Methods to identify hemochromatosis
WO1996027392A1 (en) * 1995-03-08 1996-09-12 The Scripps Research Institute Antigen presenting system and methods for activation of t-cells
US5576197A (en) * 1995-04-07 1996-11-19 Molecular Bio-Products Polymerase chain reaction container and methods of using the same
US5794221A (en) * 1995-07-07 1998-08-11 Egendorf; Andrew Internet billing method
US6805861B2 (en) 1996-01-17 2004-10-19 Imperial College Innovations Limited Immunotherapy using cytotoxic T lymphocytes (CTL)
US5869270A (en) 1996-01-31 1999-02-09 Sunol Molecular Corporation Single chain MHC complexes and uses thereof
US6458354B1 (en) 1996-03-28 2002-10-01 The Johns Hopkins University Molecular complexes which modify immune responses
JPH11507843A (ja) 1996-03-28 1999-07-13 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー タンパク質の可溶性二価および多価ヘテロ二量体類縁体
IL126843A (en) * 1996-05-23 2007-06-17 Scripps Research Inst Mhc class ii antigen-presenting systems and methods for activating cd4+t cells in vitro
US20050003431A1 (en) * 1996-08-16 2005-01-06 Wucherpfennig Kai W. Monovalent, multivalent, and multimeric MHC binding domain fusion proteins and conjugates, and uses therefor
ES2277358T3 (es) 1996-09-06 2007-07-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Purificacion de celulas t especificas de antigeno.
US20020151690A1 (en) * 1997-08-12 2002-10-17 Luxemburg Alain T Purification of antigen-specific t cells
US6328969B1 (en) 1996-12-10 2001-12-11 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method and compositions for stimulation of an immune response to a differentiation antigen stimulated by an altered differentiation antigen
US7556805B2 (en) * 1996-12-10 2009-07-07 Sloan-Kettering Inststute for Cancer Research and The Animal Medical Center Compositions for treatment of melanoma and method of using same
US20020164318A1 (en) * 1997-02-18 2002-11-07 Houghton Alan N. Cell lines and vectors for stimulation of an immune response to a differentiation antigen stimulated by an altered antigen
US20100068263A1 (en) * 1997-02-18 2010-03-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method and Compositions for Stimulation of an Immune Response to TRP2 using a Xenogeneic TRP2 Antigen
US8021666B2 (en) * 1997-02-18 2011-09-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method and compositions for stimulation of an immune response to CD20 using a xenogeneic CD20 antigen
US20100068262A1 (en) * 1997-02-18 2010-03-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method and Compositions for Stimulation of an Immune Response to PSMA using a Xenogeneic PSMA Antigen
US6268411B1 (en) 1997-09-11 2001-07-31 The Johns Hopkins University Use of multivalent chimeric peptide-loaded, MHC/ig molecules to detect, activate or suppress antigen-specific T cell-dependent immune responses
US6713250B1 (en) 1997-08-08 2004-03-30 The Research Foundation Of State University Of New York Identification of human allergens and T-lymphocyte antigens in vitro
JP4789294B2 (ja) * 1997-08-22 2011-10-12 ソレクサ・インコーポレイテッド ローリングプライマーを用いたｄｎａ伸長および分析
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6153398A (en) * 1997-12-24 2000-11-28 The University Of Chicago Method to identify specific inhibitors of IMP dehydrogenase
AU755706B2 (en) * 1998-03-20 2002-12-19 Genzyme Corporation Methods to provoke anti-cancer immune responses
WO1999064597A1 (en) * 1998-06-10 1999-12-16 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services β2 MICROGLOBULIN FUSION PROTEINS AND HIGH AFFINITY VARIANTS
US6682741B1 (en) * 1998-06-10 2004-01-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services β2 microglobulin fusion proteins and high affinity variants
CA2343313A1 (en) * 1998-09-14 2000-03-23 Lars Ostergaard Pedersen A method of producing a functional immunoglobulin superfamily protein
ES2261197T3 (es) * 1999-04-16 2006-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Metodo para la deteccion de celulas t especificas de antigeno.
JP2003500041A (ja) * 1999-05-25 2003-01-07 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｍｅｔｈ１およびｍｅｔｈ２ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US7541184B2 (en) * 2000-02-24 2009-06-02 Invitrogen Corporation Activation and expansion of cells
US20070026433A1 (en) 2001-03-09 2007-02-01 Hildebrand William H Epitope testing using soluble HLA
US20040071671A1 (en) * 2001-02-20 2004-04-15 Leturcq Didier J. Cell therapy method for the treatment of tumors
ES2306771T3 (es) * 2001-02-20 2008-11-16 Ortho Mcneil Pharm Inc Un metodo de terapia celular para tratamiento de tumores.
AU2008200524B2 (en) * 2001-02-20 2012-01-12 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. A cell therapy method for the treatment of tumors
ATE438710T1 (de) 2001-05-15 2009-08-15 Ortho Mcneil Janssen Pharm Ex-vivo-priming zur erzeugung cd40-ligand spezifischer zytotoxischer t-lymphozyten zur behandlung von autoimmun- und allergischen erkrankungen
WO2003057171A2 (en) * 2002-01-03 2003-07-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of t-cells using an engineered multivalent signaling platform
US7745140B2 (en) * 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US7638326B2 (en) 2002-01-03 2009-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform
WO2010011999A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for eliciting an amyloid-selective immune response
US9090673B2 (en) 2003-12-12 2015-07-28 City Of Hope Synthetic conjugate of CpG DNA and T-help/CTL peptide
AU2005250408B2 (en) 2004-05-27 2010-09-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
CN101548008B (zh) 2006-10-04 2013-04-17 詹森药业有限公司 失活的人工抗原提呈细胞的制备及其在细胞疗法中的用途
WO2009078799A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Marfl Ab New vaccine for the treatment of mycobacterium related disorders
US8467973B2 (en) * 2009-07-28 2013-06-18 Promising Future, Llc Pairing processes for preparing alloreactive cytotoxic T cells
WO2015148960A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Compositions comprising soluble hla/m. tuberculosis-specific ligand complexes and methods of production and use thereof
WO2017087819A1 (en) * 2015-11-19 2017-05-26 Myriad Genetics, Inc. Signatures for predicting cancer immune therapy response

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE147990T1 (de) * 1990-05-10 1997-02-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Erhöhung der assoziation exogener peptide mit mhci-molekülen auf zellen des immunsystems
NO175188C (no) * 1990-06-27 1994-09-14 Sjur Olsnes Fremgangsmåte for fremstilling av et peptidkonjugat med evne til å trenge inn i cellecytosol

Also Published As

Publication number Publication date
EP1249490B1 (en) 2006-09-06
EP1249490A3 (en) 2003-03-05
AU3728193A (en) 1993-09-13
JPH07504089A (ja) 1995-05-11
EP0628074A1 (en) 1994-12-14
DE69334062D1 (de) 2006-10-19
DE69332606D1 (de) 2003-02-06
ATE338815T1 (de) 2006-09-15
EP0628074A4 (en) 1999-01-20
EP0628074B1 (en) 2003-01-02
PT1249490E (pt) 2007-01-31
WO1993017095A1 (en) 1993-09-02
ATE230435T1 (de) 2003-01-15
DK0628074T3 (da) 2003-04-22
JP2006022111A (ja) 2006-01-26
DE69334062T2 (de) 2007-03-15
US5827737A (en) 1998-10-27
US5314813A (en) 1994-05-24
DE69332606T2 (de) 2003-10-23
US5529921A (en) 1996-06-25
DK1249490T3 (da) 2007-01-08
JP3739786B2 (ja) 2006-01-25
JP4584794B2 (ja) 2010-11-24
EP1249490A2 (en) 2002-10-16
ES2190432T3 (es) 2003-08-01

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