ES2273260T3

ES2273260T3 - Ligando dirigido a selectina-p y composiciones del mismo.

Info

Publication number: ES2273260T3
Application number: ES04735558T
Authority: ES
Inventors: Chantal C. M. c/o BBB Tech. BV APPELDOORN; Theodorus Josephus C. c/o LACDR VAN BERKEL; Erik Anna Leonardus c/o LACDR BIESSEN
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2003-05-30
Filing date: 2004-06-01
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2024-06-01
Also published as: DE602004002699D1; EP1481683A1; ATE341337T1; WO2004105783A1; CA2527438A1; EP1638588A1; DE602004002699T2; US8003596B2; EP1638588B1; JP2007500200A; US20070185348A1; JP4771291B2

Abstract

Molécula de ligando dirigida que comprende - un resto que reconoce la diana - un espaciador, que se forma a partir de un oligómero o polímero soluble en agua y - un restote anclaje, que se forma a partir de un lípido anfífilo, constituido por al menos un resto hidrófobo apolar y un grupo de cabeza hidrófilo polar, caracterizada porque el resto que reconoce la diana es derivado de: (1) un péptido, peptoide o derivado de los mismos que tiene una secuencia de aminoácidos X(Ax)mA3A1A2A1Y, o un equivalente funcional de dicha secuencia, en la que: - A1 es una D- o L-cisteína (C), D- o L-valina (V) o un análogo de las mismas; - A2 es un D- o L-ácido aspártico (D) o análogo del mismo; - A3 es una D-o L- fenilalanina (F), o D- o L- triptófano (W) o un análogo de los mismos; - Ax es un D-o L-aminoácido, seleccionado entre el grupo constituido por ácido glutámico (E), ácido aspártico (D), glicina (G) y cisteína (C); -X marca el lado N-terminal de dicha secuencia y es hidrógeno o un residuo que comprende 1 a 6 D-o L- aminoácidos o análogos de los mismos; - Y marca el lado C-terminal de dicha secuencia y es ¿ OH o un residuo que comprende 1 a 11 D- o L- aminoácidos o análogos de los mismos; en la que X e Y conjuntamente pueden formar un sistema cíclico.

Description

Ligando dirigido a selectina-P y composiciones del mismo.

La presente invención se refiere a ligandos dirigidos a selectina-P y a composiciones que contienen tales ligandos, incluyendo kits.

Antecedentes de la invención

La inflamación y los procesos inflamatorios desempeñan un papel fundamental en la fisiopatología de numerosas enfermedades y dolencias. Las dolencias cerebrales en las que se han descubierto niveles aumentados de mediadores de la inflamación incluyen lesión cerebral traumática grave, esclerosis múltiple recurrente-remitente, oclusión arterial cerebral, isquemia e ictus. Las dolencias cardiacas en las que se ha sugerido que mediadores tales como las selectinas desempeñan un papel incluyen infarto agudo de miocardio, lesión arterial, tal como la producida por angioplastia e isquemia. De forma similar, las selectinas están implicadas en dolencias renales tales como lesión renal producida por isquemia y repercusión y fallo renal. Además, las selectinas parecen desempeñar un papel en el rechazo a los transplantes de órganos, isquemia fría, choque hemorrágico, choque septicémico, metástasis tumoral, inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, arterioesclerosis, restenosis, angiogénesis, coagulación intravascular diseminada, síndrome de fatiga respiratoria del adulto y choque circulatorio.

Las moléculas de adhesión de la superficie celular han sido reconocidas como mediadores clave en numerosos procesos celulares incluyendo el crecimiento celular, la diferenciación, la transmigración celular y la respuesta inmune y la metástasis cancerosa. Se han identificado cuatro categorías principales de moléculas de adhesión: las moléculas de adhesión celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas (CAM), cadherinas, integrinas y selectinas. Las selectinas representan una familia actualmente de tres glucoproteínas transmembrana de unión a carbohidratos: selectina-E "endotelial", selectina-L "leucocitaria" y selectina-P "plaquetaria". Las tres selectinas son dependientes de cationes divalentes (por ejemplo, calcio) y poseen un dominio extracelular con un motivo de reconocimiento de carbohidratos, un motivo similar al factor de crecimiento epidérmico y algunos dominios más pequeños relacionados con proteínas reguladoras del complemento.

La selectina-P humana (también conocida como GMP-140, LECAM-3, PADGEM, CD62, CD62P) es expresada por las plaquetas y células endoteliales. Cuando se expresa sobre estas superficies celulares, su efecto más notable es la ralentización de leucocitos mientras estos abandonan los capilares y entran en las vénulas postcapilares, representando estas últimas el sitio principal de adhesión leucocitos-endotelio. El proceso de ralentización se observa como leucocitos rodando, lo que significa una adhesión inicial con afinidad relativamente baja. La adhesión firme de los leucocitos rodantes está mediada principalmente por integrinas.

En las células endoteliales, la selectina-P se almacena en los cuerpos de Weibel-Palade; en las plaquetas se encuentra en los gránulos \alpha. Después de la activación, la selectina-P se moviliza a las superficies celulares al cabo de unos pocos minutos como respuesta a una variedad de agentes inflamatorios o trombogénicos. La función principal de la selectina-P endotelial es reclutar leucocitos hacia el interior de las vénulas postcapilares, mientras que la selectina-P de las plaquetas también da como resultado la formación de trombos. Uno de los ligandos naturales conocidos actualmente de la selectina-P es PSGL-1 (ligando glucoproteína de la selectina-P 1, P-selectin glycoprotein ligand-1), una sialoproteína de 160 kDa expresada sobre la superficie de los leucocitos, donde se concentra en el urópodo. En numerosas publicaciones se encuentran descripciones más detalladas de la estructura y funciones de la selectina-P, tales como J. Panes, Pathophysiology 5: 271 (1999); F. Chamoun y col., Frontiers in Bioscience 5: e103 (1 de noviembre de 2000); S.-I. Hayashi, Circulation 102: 1710 (2000).

La selectina-P también parece estar implicada más directamente en la agregación plaquetaria, como fue demostrado recientemente por estudios de las interacciones independientes de calcio de la selectina-P con galactosil ceramida 3-sulfatada (también referidas como sulfátidas). Esta interacción probablemente tiene lugar en un sitio de unión diferente de la selectina-P, dado que la unión puede ser inhibida por el anticuerpo WASP12.2, pero no por AK4, mientras que la unión del ligando natural de selectina-P PSGL-1, que está implicado en la adhesión de los leucocitos es bloqueado tanto por WASP12.2 como por AK4. Sin embargo, parece que los sitios de unión se solapan. Se asume que las interacciones de sulfátidas estabilizan los agregados plaquetarios.

Por otro lado, parecería factible mejorar estas y otras dolencias que implican la activación de las células endoteliales y los leucocitos, y específicamente la movilización y expresión de selectina-P interrumpiendo de forma específica las cascadas de selectina-P. Esto puede hacerse por ejemplo administrando ligandos que se unen selectivamente a selectina-P humana, pero que no poseen su bioactividad. Por este procedimiento, se podría inactivar la selectina-P movilizada y se podría prevenir el daño tisular inducido por leucocitos. Potencialmente se podría alcanzar el mismo efecto mediante terapia génica, siempre que el ligando o antagonista de selectina-P sea un péptido o un péptido modificado. Según este procedimiento, se transfectaría un vector de expresión que transporta una secuencia de ADN que codifica un antagonista de selectina-P a células somáticas de una persona en necesidad de la terapia.

Por otro lado, las enfermedades y dolencias relacionadas con la selectina-P podrían tratarse o prevenirse también con fármacos que no interaccionan directamente con la selectina-P, pero que suprimen algunos de los efectos perjudiciales de la activación de la selectina-P en las respectivas células y tejidos. Entre las sustancias de fármacos potencialmente útiles para la intervención terapéutica están los agentes antiinflamatorios tales como los glucocorticoides.

Uno de los inconvenientes principales de cualquier terapia sistémica con compuestos altamente activos es su distribución en el interior del organismo y la exposición de células y tejidos no afectados, lo que conduce potencialmente a efectos secundarios sustanciales. Sería más deseable tener procedimientos y sistemas de suministro de fármacos disponibles que permitiesen el suministro dirigido de agentes activos de forma específica a células afectadas, sin exponer sustancialmente a las células no afectadas.

Aunque no hay ningún producto farmacéutico que comprenda un sistema de suministro de fármaco dirigido específicamente a células disponible comercialmente hoy en día, se han descrito una serie de sistemas de suministro en la bibliografía científica y de patentes. La direccionabilidad del fármaco puede basarse en conjugados de principios activos con ligandos que reconocen la diana, representando tales conjugados sistemas de suministro de fármacos moleculares. Una desventaja general de tales conjugados es la baja relación de sustancia de fármaco por ligando (a menudo sólo 1:1), dando como resultado la exposición a altos niveles de ligandos.

Como ejemplo, Everts y col. (J. Immunol. 168: 883 (2002)) informan del suministro intracelular selectivo de dexametasona a células endoteliales activadas usando un inmunoconjugado dirigido a selectina-E. Se unió covalentemente dexametasona a un anticuerpo antiselectina E, dando como resultado el llamado conjugado dexametasona-antiselectina E. Se estudió la unión del conjugado a selectina-E usando resonancia de plasmón superficial e inmunohistoquímica. Adicionalmente, se estudió la internalización del conjugado usando microscopía láser de barrido confocal y microscopía electrónica de inmunotransmisión. Se demostró que el conjugado de dexametasona anti-selectina-E, como el anticuerpo modificado anti-selectina-E se unía de forma selectiva a las células endoteliales estimuladas con TNF-\alpha y no a las células endoteliales en reposo. Después de unirse, el conjugado era internalizado y conducido a los cuerpos multivesiculares, que son un compartimento celular relacionado con los lisosomas. Después de la degradación intracelular, se liberaba dexametasona farmacológicamente activa, como se mostró en células endoteliales que fueron transfectadas con un gen informador que respondía a glucocorticoides. Adicionalmente, la dexametasona suministrada intracelularmente era capaz de regular a la baja el gen proinflamatorio IL-8.

De forma alternativa, se pueden convertir sistemas de suministro de fármacos basados en vehículos en específicos de una diana adjuntando ligandos de reconocimiento de diana apropiados sobre su superficie. Por ejemplo, esta aproximación se ha empleado usando liposomas como vehículos. Algunos de los recientes desarrollos basados en esta aproximación han sido revisados por Maruyama (Biosci. Rep. 22:251 (2002)).

Por ejemplo, Spragg y col. (Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 94:8795 (1997)) han investigado procedimientos para el suministro de fármacos dirigidos a selectina-E. Según este documento, se seleccionó la selectina-E como una diana molecular para el suministro selectivo endotelial de fármacos o genes terapéuticos para tratar varios estados de enfermedad. Los liposomas de varios tipos (clásicos, estabilizados de forma estérica, catiónicos, sensibles al pH), cada uno conjugado con mAb H18/7, un anticuerpo monoclonal murino que reconoce el dominio extracelular de la selectina-E, se unían selectiva y específicamente a células endoteliales venosas umbilicales humanas (HUVEC) activadas con IL-1-\beta a niveles de hasta 275 veces más elevados que a HUVEC inactivadas. Los inmunoliposomas dirigidos a selectina-E aparecían en vesículas ácidas perinucleares 2-4 horas después de unirse a la superficie celular, de forma coherente con la internalización por la vía de la ruta endosoma/lisosoma. HUVEC activadas incubadas con inmunoliposomas dirigidos a selectina-E cargados con el agente citotóxico doxorrubicina exhibían supervivencia celular disminuida, mientras que HUVEC inactivadas no se vieron afectadas por dicho tratamiento.

Por otro lado, hay algunas evidencias de que la selectina-P puede ser también al menos una diana molecular apropiada para células endoteliales activadas implicadas en procesos inflamatorios, como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, existe una necesidad de sistemas de suministro de fármacos que estén específicamente dirigidos a este miembro de la familia de las selectinas, y por lo tanto a células y tejidos que muestran expresión o presentación de selectina-P (incrementadas).

La mayoría de los compuestos que se unen a selectina-P conocidos hoy en día son carbohidratos, basados en sialil-LewisX (sLeX), un tetrasacárido y ligando natural de las selectinas. Sin embargo, estos miméticos tienen la desventaja de mostrar baja afinidad (en el intervalo micromolar a milimolar) y baja especificidad, ya que tienden a unirse a otros miembros de la familia de las selectinas con aproximadamente la misma afinidad que tienen por la selectina-P.

Por lo tanto, también existe una necesidad de estos sistemas dirigidos de suministro de fármacos dirigidos a la selectina-P que tengan una alta afinidad y especificidad por la molécula diana.

Resumen de la invención

Es un objeto de la invención proporcionar moléculas de ligando dirigidas a selectina-P.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar composiciones que comprenden tales moléculas de ligan do dirigidas a selectina-P, siendo tal composición útil para su uso como formulaciones farmacéuticas que se pueden administrar de forma segura y eficaz y como formulaciones de diagnóstico.

En otro aspecto, es un objeto de la invención proporcionar kits para la preparación de tales composiciones.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona una molécula de ligando dirigida que comprende:

-: un resto que reconoce la diana

-: un espaciador, que se forma a partir de un oligómero o polímero soluble en agua y

-: un resto de anclaje, que se forma a partir de un lípido anfífilo, constituido por al menos un resto hidrófobo apolar y un grupo de cabeza hidrófilo polar,

en la que el resto que reconoce la diana es derivado de:

(1) un péptido, peptoide o derivado de los mismos que tiene una secuencia de aminoácidos X(A_{x})_{m}A_{3}A_{1}A_{2}A_{1}Y, o un equivalente funcional de dicha secuencia, en la que:

-: A_{1} es una D- o L-cisteína (C), D- o L-valina (V) o un análogo o mimético de las mismas;

-: A_{2} es un D- o L-ácido aspártico (D) o análogo del mismo;

-: A_{3} es una D- o L- fenilalanina (F), o D- o L-triptófano (W) o un análogo o mimético de los mismos;

-: A_{x} es un D- o L-aminoácido, seleccionado entre el grupo constituido por ácido glutámico (E), ácido aspártico (D), glicina (G) y cisteína (C) y análogos o miméticos de los mismos;

-: X marca el lado N-terminal de dicha secuencia y es hidrógeno o un residuo que comprende 1 a 6 D- o L- aminoácidos o análogos de los mismos;

-: Y marca el lado C-terminal de dicha secuencia y es -OH o un residuo que comprende 1 a 11 D- o L-aminoácidos o análogos de los mismos;

: en la que X e Y conjuntamente pueden formar un sistema cíclico;

: caracterizada porque al menos uno de X e Y e Y+X o X+Y está sustituido con el grupo R^{1}-(Z)_{n}-, en el que

-: Z se selecciona entre -CO-, -O-, -NR^{2}- y -CO-NR^{2}-;

-: R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre

a): H;

b): un grupo alquilo C_{1}-C_{8};

c): un grupo alquilo C_{2}-C_{8}, en el que al menos un átomo de C es reemplazado por un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre;

d): un grupo arilo C_{6}-C_{14}, que puede estar sustituido con al menos un grupo seleccionado entre un halógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, -CF_{3}, -OH, -O-alquilo C_{1}-C_{6}, -COOH, -COO- alquilo C_{1}-C_{6}, -NO_{2},-NH_{2}, -NH- alquilo C_{1}-C_{6}, N-(alquilo C_{1}-C_{6})_{2} y -SO_{3}H;

e): un grupo heteroarilo que se selecciona entre sistemas de anillos con 5 ó 6 miembros y sistemas de anillos benzo-condensados, y tiene al menos un heteroátomo seleccionado entre el grupo constituido por nitrógeno, oxígeno y azufre, en el que dicho grupo heteroarilo puede estar sustituido con al menos un grupo seleccionado del grupo constituido por un halógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, -CF_{3}, -OH, -O-alquilo C_{1}-C_{6}, -COOH, -COO- alquilo C_{1}-C_{6}, -NO_{2},-NH_{2}, -NH- alquilo C_{1}-C_{6}, N-(alquilo C_{1}-C_{6})_{2} y -SO_{3}H;

f): un grupo aralquilo que comprende un grupo alquilo como se ha definido en b) o c) y un grupo arilo o grupo heteroarilo como se ha definido en d) o e) y

-: m y n son un número entero seleccionado independientemente entre 0 y 1, con la condición de que n no es 0 cuando R^{1} es H.

\newpage

(2) un compuesto representado por la siguiente fórmula Ia

1

y su estereoisómero, representado por la siguiente fórmula Ib:

2

en la que

X es un grupo opcional, que representa -O-, -OCH_{2}, -S-, SCH_{2}-, -NH- O -NHCH_{2}-;

R^{1} representa QR^{4}, en el que Q representa -O-, -NH-, -NH-(C=O)-, -O-(C=O), -NH-(C=O)-O- o -NH-(C=O)-NH-; y en el que R^{4} representa H o cualquier compuesto que comprenda al menos un átomo de carbono;

R^{2} es un resto que porta al menos una carga negativa y

R^{3} puede ser cualquier grupo,

siempre que si Q=-O- y R^{4} es -H-, está presente X.

(3) ácido gálico o un derivado del mismo, un polifenol o un polihidroxifenol de fórmula estructural II:

3

caracterizado porque:

R^{1} = un hidrógeno; un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado o un grupo aromático, opcionalmente sustituido respectivamente por un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico, un grupo amino o un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado;

R^{2} = un grupo opcional, siendo un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado;

R^{3} = un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado, opcionalmente sustituido por uno o más grupos ácido carboxílico, o un grupo alquilamido alifático (C_{1}-C_{4}); o un grupo cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), opcionalmente sustituido por un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) o uno o más grupos ácido carboxílico.

Como moléculas de ligando dirigidas, se prefieren compuestos con afinidad selectiva por selectina-P.

En estas moléculas, el resto que reconoce a la diana puede ser derivado de un péptido, peptoide o un derivado de los mismos.

Los péptidos se definen como amidas que son derivadas de dos o más aminoácidos por combinación del grupo amino de un ácido con el grupo carboxilo de otro (Merriam Webster Medical Dictionary 2001). Como se usa en este documento, un péptido también se puede referir a una estructura peptídica en el interior de una molécula. Típicamente, los péptidos están compuestos de L-\alpha-aminoácidos naturales, que son alanina (Ala o A), arginina (Arg o R), asparagina (Asn o N), ácido aspártico (Asp o D), cisteína (Cys o C), glutamina (Gln o Q), ácido glutámico (Glu o E), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile o I), leucina (Leu o L), lisina (Lys o K), metionina (Met o M), fenilalanina (Phe o
F), prolina (Pro o P), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), triptófano (Trp o W), tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V).

Son equivalentes funcionales de los péptidos de la invención moléculas proteináceas que comprenden la misma actividad de unión a selectina-P humana en tipo, pero no necesariamente en cantidad y pueden ser, por ejemplo, péptidos modificados, peptoides, análogos de péptidos o peptidomiméticos.

Los péptidos modificados son moléculas derivadas de péptidos por la introducción de sustituyentes o grupos funcionales que no están presentes en aminoácidos naturales. El término también incluye compuestos que se obtienen por reacción de péptidos con moléculas de otras categorías químicas, siendo estas moléculas naturales o no. Por ejemplo, en la naturaleza se encuentran con frecuencia péptidos biotinilados, glucoproteínas y lipoproteínas, mientras que los péptidos modificados con polietilenglicol, como interferones pegilados son ejemplos de péptidos modificados químicamente que se han diseñado para alterar algunas, pero no todas las propiedades del péptido.

Los peptoides, al igual que los péptidos, son típicamente amidas de dos o más aminoácidos. Sin embargo, estos con frecuencia no derivan directamente de aminoácidos naturales, sino más bien de diversos tipos de L- o D-aminoácidos sintetizados químicamente.

Los peptidomiméticos, en su alcance más amplio, son compuestos que son más o menos similares en su estructura funcional a un péptido, pero que pueden contener también enlaces no peptídicos en el esqueleto, o D-aminoácidos. En general, los peptidomiméticos sirven como sustituyentes para péptidos nativos en la interacción con receptores y enzimas (Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D.J.A. Crommelin y R.D. Sindelar, Harwood Academia Publishers, 1997, p. 138). Los pseudopéptidos, una clase de peptidomiméticos, son compuestos que contienen isoésteres con enlaces amida, en lugar de enlaces amida (en la misma referencia, páginas 137-140).

Los ligandos peptídicos de la invención también incluyen sales de péptidos o equivalentes funcionales, tales como sales farmacéuticamente aceptables de adición de ácido o base.

Los ligandos peptídicos dirigidos comprenden un resto que reconoce la diana con la secuencia de aminoácidos XA_{X}A_{3}A_{1}A_{2}A_{1}Y, o un equivalente funcional de dicha secuencia, en la que A_{1} es una D- o L-cisteína (C), D- o L-valina (V), o un análogo de los mismos, A_{2} es un D- o L-ácido aspártico (D) o un análogo o mimético del mismo, A_{3} es una D- o L- fenilalanina (F), o D- o L-triptófano (W) o un análogo o mimético de los mismos; A_{x} es un D- o L-aminoácido, seleccionado entre el grupo constituido por ácido glutámico (E), ácido aspártico (D), glicina (G) y cisteína (C) y análogos o miméticos de los mismos; X marca el lado N-terminal de dicha secuencia y es hidrógeno o un resto que comprende 1 a 6 D- o L- aminoácidos o análogos de los mismos; Y marca el lado C-terminal de dicha secuencia y es -OH o un resto que comprende 1 a 11 D- o L-aminoácidos o análogos de los mismos; en la que X e Y conjuntamente pueden formar un sistema cíclico. En una de las formas de realización particularmente preferidas, los ligandos comprenden la secuencia de aminoácidos XEWVDVY, o un equivalente funcional de esta secuencia. Los compuestos peptídicos que comprenden esta secuencia de aminoácidos se han descrito con mayor detalle en el documento WO 03/020753 y en el documento WO 04/018502, cuyas descripciones se incorporan en el presente documento mediante referencia y a cuyas descripciones se remite específicamente al lector para los detalles referentes a la fabricación.

El resto que reconoce la diana puede ser también derivado de los compuestos químicos, como se describe en el documento WO 04/033473 y en la solicitud de patente internacional no publicada previamente PCT/EP04/004898.

Los compuestos como se describe en el documento WO 04/033473 están representados por las fórmulas Ia y Ib en esta solicitud. Estos compuestos basados en glucosa se caracterizan porque poseen un sustituyente R^{1} en el C-2 de la estructura monosacárida. Este sustituyente R^{1} es mucho más crítico que el sustituyente R^{3}. Sin querer restringirse a ninguna teoría, se cree que R^{1} desempeña un papel activo en el reconocimiento de o en la selectividad hacia selectina-P. R^{1} representa QR^{4}, en el que Q representa -O-, -NH-, -NH-(C=O)-, -O-(C=O), -NH-(C=O)-O- o -NH-(C=O)-NH-; y en el que R^{4} representa H o cualquier compuesto que comprenda al menos un átomo de carbono. Son grupos R^{4} preferidos grupos alquilo o arilo lineales o ramificados, grupos aralquilo o alcarilo lineales o ramificados, pudiendo contener los grupos uno o más heteroátomos, tales como átomos de nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre y teniendo los grupos hasta 20 átomos de carbono, más preferiblemente entre 1 y 12 átomos de carbono; los grupos pueden estar sustituidos con átomos de halógenos, grupos hidroxilo, átomos de oxígeno, grupos alcoxi y ariloxi, grupos amino o amino sustituidos, así como otros sustituyentes. En formas de realización especialmente preferidas, los grupos aceptores de electrones están presentes sobre los restos aromáticos.

De la forma más preferida, R^{4} es H, un resto alquilo, un resto aromático o un resto aceptor de electrones.

El resto aromático puede ser, por ejemplo, un grupo fenilo, naftilo, cresilo, tolilo, antracilo, fenantrilo, piridilo, pirazilo, piridazilo o quinolilo, pudiendo estar el grupo opcionalmente sustituido. Preferiblemente, R^{4} es un grupo fenilo o naftilo.

En otra forma de realización, R^{4} es un grupo que comprende un resto aceptor de electrones. Preferiblemente, el resto aceptor de electrones es un resto seleccionado entre el grupo constituido por nitro, -(C=O)-alquilo, cianonitrilo, -SO_{3}H, CCl_{3} o CF_{3}, más preferiblemente, el grupo aceptor de electrones es un grupo nitro.

En esta invención, compuestos adicionales a partir de los cuales se puede derivar el resto que reconoce a la diana son ácido gálico y derivados del mismo, polifenoles y polihidroxifenoles como se describen en la solicitud de patente internacional PCT/EP04/004898.

El ácido gálico, o ácido 3,4,5-trihidroxibenzoico es un polihidroxifenol natural que se encuentra en frutas, vegetales tales como hierbas, así como en agallas, nueces, semillas de mango, uvas rojas, té verde y aceite de oliva. En muchos productos vegetales, el ácido gálico está contenido en forma de precursores tales como ácido tánico, también llamado tanino o galotanino, que describe una clase de compuestos con una estructura química compleja y no uniforme. Los taninos se pueden dividir en 2 grupos: (a)derivados de flavonoles, llamados taninos condensados y (b)taninos hidrolizables (el grupo más importante), que son ésteres de un azúcar, usualmente glucosa, con uno o más ácidos hidroxibencenocarboxílicos. El ácido gálico es un importante producto de hidrólisis del tanino. Además, el resto que reconoce a la diana se puede derivar de derivados de ácido gálico y compuestos que están químicamente relacionados con el ácido gálico o incluir uno o más restos ácido gálico. También se incluyen compuestos (precursores) que, después de su administración, experimentan una degradación química o enzimática para producir in situ ácido gálico, el derivado de ácido gálico o el compuesto que está químicamente relacionado con el ácido gálico incluyendo uno o más restos que contienen ácido gálico. Los derivados de ácido gálico según la invención incluyen estructuras químicas derivadas de ácido gálico, tales como conjugados, dímeros, multímeros, sales, ésteres, éteres, amidas, etc. Adicionalmente, los derivados incluyen aquellos compuestos que difieren químicamente en cierta medida del ácido gálico, tal como por el número y/o posición de los grupos fenólicos hidroxilo o por la presencia de uno o más sustituyentes adicionales, pero que tienen afinidad por la selectina-P. Ejemplos de otros polihidroxifenoles son: galato de n-dodecilo, ácido cafeico y ácido 3,4,5-trihidroxicinámico.

De forma similar, se ha demostrado que los polifenoles son útiles en más o menos la misma medida que los poihidroxifenoles, que son ácido gálico y derivados del mismo. Los polifenoles se definen como compuestos que incluyen más de un anillo aromático que porta 6 átomos de carbono, que tienen uno o más grupos hidroxilo unidos a él. Ejemplos de tales polifenoles son (-)-galato de epigalocatequina, (epi)catequiza, ácido m-galolilgálico y ácido elágico.

En esta solicitud, los polihidroxifenoles a partir de los cuales se puede derivar el resto que reconoce a la diana se representan por la fórmula II. A continuación se proporciona una explicación algo más detallada sobre el significado de los sustituyentes.

Un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) ejemplifica metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo y similares. Un grupo aromático es aquel que tiene 6 a 14 átomos de carbono y comprende un grupo arilo carbocíclico y un grupo arilo heterocíclico. El grupo arilo carbocíclico es monocíclico a tricíclico y es preferiblemente fenilo, naftilo, antrilo o fenantrilo y similares.

El grupo arilo heterocíclico es un grupo monocíclico a tricíclico que tiene 1 a 4 heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por átomo de nitrógeno, átomo de oxígeno o átomo de azufre. El grupo heterocíclico es pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, isooxazorilo, 1,3,5-triazolilo, 1,2,4-triazolilo, 1,3,5-tiadiazolilo, 1,3,5-oxadiazolilo, pirizilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazilo, benzofuranilo, isobenzofuranilo, benzotienilo, indolilo, cromenilo, quinolilo, isoquinolilo, ftalazinilo o quinoxalinilo y similares.

El grupo cicloalquilo (C_{3}-C_{8}) representa ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo o ciclooctilo. Además, el grupo cicloalquilo (C_{3}-C_{8})es opcionalmente sustituido por un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) o uno o mas grupos ácido carboxílico.

En una forma de realización preferida, se usan polifenoles caracterizados porque:

R^{1} = etilo, fenilmetilo, indolilmetilo o 4-hidroxifenilmetilo;

R^{2} = un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) lineal;

R^{3} = un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) lineal, sustituido por uno o dos grupos ácido carboxílico, opcionalmente sustituidos por un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado.

En una forma de realización más preferida, se usan polihidroxifenoles en los que:

R^{1} = etilo, fenilmetilo, indolilmetilo o 4-hidroxifenilmetilo;

R^{2} = hidrógeno, etilo, propilo o isopropilo

R^{3} = ácido etilcarboxílico o ácido propilcarboxílico.

Para ser eficaces como ligandos dirigidos, las estructuras moleculares que tienen afinidad por la diana selectina-P deberían estar presentes sobre o en la superficie de los vehículos coloidales del sistema de suministro de fármacos. Estos deben estar unidos a componentes vehículos de forma covalente o no covalente. En una de las formas de realización, el ligando comprende no sólo estructuras o restos que reconocen a la diana, sino también una parte molecular que puede servir como un resto de anclaje, es decir, que es capaz de anclar el ligando en el interior del vehículo, preferiblemente de tal manera que el ligando se mantenga en su lugar incluso si el resto que reconoce a la diana se extiende hasta o a través de la superficie del vehículo. Por ejemplo, el resto de anclaje puede representar un polímero.

Si el vehículo coloidal es un liposoma, uno de los tipos de ligando que resultan más útiles son conjugados, que comprenden un resto peptídico que reconoce a la diana y un resto lipídico de anclaje, y opcionalmente un espaciador entre estos restos.

El resto de anclaje está formado preferiblemente a partir de un lípido anfífilo, constituido por al menos un resto hidrófobo apolar y un grupo de cabeza hidrófilo polar. El lípido anfífilo se selecciona entre el grupo constituido por fosfolípidos, glucolípidos, ceramidas, colesterol y derivados, mono- o dialquilaminas saturadas o insaturadas, de cadena ramificada o lineal C_{8}-C_{100}, arilalquilaminas, cicloalquilalquilaminas, alcanoles, aldehídos, carbohaluro o ácidos alcanoicos y los anhídridos de los mismos y se caracterizan porque el número total de átomos de C es 25 o más. Preferiblemente, el lípido anfífilo contiene al menos dos restos hidrófobos apolares y ejemplos de los mismos que se pueden usar de forma muy favorable se seleccionan entre el grupo constituido por 1-heptadecil-octadecilamina, N-succinil-dioctadecilamina y diestearilfosfatidiletanolamina.

El polímero soluble en agua es un polietilenglicol, un poli(aminoácido), un poli(derivado de aminoácido), un poli(análogo de aminoácido), una polivinilpirrolidona o gangliosido GM1. Para más detalles respecto a los polímeros basados en poli(aminoácidos), se hace referencia al documento WO02/98952, que se incorpora en el presente documento mediante referencia.

Por ejemplo, una forma de realización preferida es la molécula de ligando dirigida, en la que el resto que reconoce a la diana incluye la secuencia de aminoácidos XEWVDVY, el resto lipídico de anclaje está representado por un resto fosfolípido y el espaciador es un polímero u oligómero. Una forma de realización más preferida es la molécula XEWVDVY-PEG-DSPE.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vehículo coloidal y al menos un ligando dirigido como se ha descrito anteriormente que tienen afinidad por la selectina-P asociado con la superficie del vehículo.

Los sistemas de suministro de fármacos son típicamente formulaciones farmacéuticas avanzadas o componentes de formulaciones que generalmente pretenden optimizar el suministro de fármacos maximizando la conformidad favoreciendo procedimientos de suministro más simples y menos intrusivos. Se han desarrollado sistemas de suministro de fármacos para prácticamente todas las posibles vías de administración. Un sistema de suministro de fármacos dirigido se refiere a cualquier formulación o componente de formulación que efectúa un suministro más selectivo de la sustancia del fármaco a una diana en el interior del cuerpo. En el contexto de la presente invención, la diana está representada por células o tejidos que expresan selectina-P. Por lo tanto, el suministro dirigido de fármacos implica que el sistema de suministro proporciona una mayor exposición de las células diana a la sustancia del fármaco en comparación con, por ejemplo, una solución simple de la sustancia del fármaco que se inyecta por vía intravenosa.

Un compuesto activo, como se usa en el presente documento es cualquier sustancia terapéutica o de diagnóstico, incluyendo mezclas naturales o artificiales y combinaciones de sustancias. Los compuestos activos se pueden seleccionar entre moléculas naturales, semisintéticas o sintéticas pequeñas o grandes, orgánicas o inorgánicas. Los compuestos activos incluyen, por ejemplo, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos tales como ADN, ARN, ARN de horquilla pequeña, oligonucleótidos y oligonucleótidos antisentido.

El sistema de suministro de fármacos de la invención comprende específicamente (a) un vehículo coloidal, (b) un compuesto activo asociado con el vehículo y (c) al menos un ligando dirigido como se ha descrito anteriormente que tiene afinidad por la selectina-P asociado con la superficie del vehículo.

El término "vehículos coloidales" se usa para incluir todas las partículas sólidas, semisólidas o líquidas o estructuras supramoleculares, o macromoléculas únicas en el intervalo de tamaño de pocos micrones a submicrónico, que es en general el intervalo de tamaño más útil para la administración por vía intravascular. Ejemplos de vehículos coloidales son micro y nanopartículas, micro y nanoesferas, micro y nanocápsulas, micelas, micelas reticuladas, hidrogeles coloidales, complejos, vesículas, tales como liposomas y niosomas, virosomas, dendrímeros, gotas de emulsiones y polímeros estrellados. Son vehículos muy adecuados partículas o estructuras supramoleculares.

En una de las formas de realización preferidas, los vehículos coloidales de la invención son vesículas y más preferiblemente liposomas, que son vesículas llenas de líquido a partir de capas ensambladas de forma concéntrica (típicamente bicapas) de lípidos, tales como fosfolípidos, ceramidas y esteroles. En función de su tamaño y estructura, las vesículas y/o liposomas se clasifican en ocasiones en subcategorías, tales como vesículas unilamelares pequeñas (SUV), vesículas unilamelares grandes (LUV), vesículas multilamelares (MLV) o liposomas gigantes, por mencionas sólo algunas. Los liposomas se pueden diseñar para tener casi cualquier diámetro entre aproximadamente 30 nm hasta varios micrómetros.

Entre los liposomas preferidos se encuentran aquellos que tienen un diámetro relativamente pequeño, tal como no más de 1.000 nm, independientemente de su estructura lamelar. El diámetro, como se usa en el presente documento, es el diámetro medio evaluado por los procedimientos convencionales conocidos en la técnica, tales como mediciones usando espectroscopia de correlación fotónica y técnicas dinámicas de dispersión lumínica. En otra forma de realización preferida, los liposomas tienen un diámetro de menos de 400 nm, lo cual es un tamaño de partícula asociado a una alta estabilidad física de la suspensión respectiva o una baja tendencia de los liposomas a precipitar o flotar. En función de la aplicación o uso particular del producto, puede ser útil limitar el diámetro de los liposomas (o, si se usan otros vehículos, el diámetro de las respectivas partículas o estructuras) a un tamaño incluso inferior, tal como no más de 200 nm. Por ejemplo, puede ser más fácil de alcanzar una semivida de circulación más prolongada con vehículos de este intervalo de tamaños.

Los liposomas se pueden preparar a partir de varios tipos de lípidos, tales como fosfolípidos, esfingolípidos, ceramidas, esteroles naturales, semisintéticos o sintéticos u otros materiales similares a lípidos que pueden ser incorporados en bicapas lipídicas. Son lípidos preferidos aquellos que son fisiológicamente seguros y tolerables, tales como fosfolípidos neutros (o más bien anfóteros), incluyendo fosfatidilcolina (que es una mezcla principalmente compuesta de fosfolípidos neutros), fosfatidilcolina hidratada, lecitina, lecitina hidratada, dimiristoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilcolinas insaturadas que tienen una o dos cadenas de ácido oleico, opcionalmente mezcladas con esteroles tales como colesterol.

El compuesto activo puede asociarse con el vehículo de varias formas diferentes, dependiendo del vehículo concreto que se seleccione, el procedimiento de fabricación y la naturaleza del propio compuesto activo, especialmente en lo que respecta a las propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, si el vehículo es un liposoma y el compuesto activo es una molécula lipófila, escasamente soluble, esta última es más probable que se asocie con las regiones lipófilas de las bicapas lipídicas. Por otro lado, si el ingrediente activo es una sustancia hidrófila soluble, esta puede encapsularse dentro de la región central interior acuosa del liposoma. Si el vehículo es una micro o nanopartícula polimérica, el ingrediente activo puede intercalarse en la matriz polimérica (o de hidrogel). En estructuras con núcleo y corteza tales como micro y nanocápsulas, el material activo puede encapsularse en el interior del núcleo. De forma alternativa, este se puede asociar con o unirse a la corteza, fisicoquímica o químicamente.

Si el sistema de suministro de fármacos está concebido para la administración sistémica intravascular, la posibilidad de interacción específica con las células o tejidos diana puede incrementarse si se reduce la eliminación del vehículo, dado que la mayoría de los procesos conjuntamente denominados eliminación compiten con la interacción con la diana. Las partículas coloidales tienden a ser eliminadas más bien rápidamente a partir del torrente circulatorio dado que son captadas de formulación eficaz por parte de los macrófagos del sistema retículoendotelial localizados principalmente en el hígado y en el bazo. En función del tamaño y las propiedades superficiales de las partículas coloidales, éstas se pueden eliminar de la circulación con una semivida de minutos. Sin embargo, seleccionando un tamaño de partícula relativamente pequeño y especialmente modificando la superficie de las partículas puede incrementarse la semivida de eliminación al menos hasta horas. Se conocen varios recubrimientos poliméricos que aumentan el tiempo de circulación de los liposomas, nanopartículas y otros vehículos coloidales para fármacos. Uno de los recubrimientos poliméricos más eficaces conocidos hoy en día se compone de polietilenglicol o polímeros que comprenden polietilenglicol. Es ahora por lo tanto una forma de realización preferida que el recubrimiento de los vehículos de la invención comprenda polietilenglicol o restos relacionados con polietilenglicol. Sin embargo, otros recubrimientos basados en poli(aminoácidos), poli(derivados de aminoácidos), poli(análogos de aminoácidos), polivinilpirrolidonas y gangliósido GM1 parecen ser tan eficaces como el polietilenglicol.

El sistema de suministro de fármacos de la invención está concebido como un medio para dirigir fármacos a células o tejidos que expresan selectina-P, una glucoproteína de membrana expresada por células endoteliales vasculares y plaquetas que está implicada en la adhesión de los leucocitos al endotelio y a las plaquetas. Es particularmente útil para dirigirse a células o tejidos que sobreexpresan selectina-P o a células que exhiben una actividad de selectina-P incrementada. Por ejemplo, las células endoteliales activadas presentan más moléculas de selectina-P sobre su superficie celular. En consecuencia, la actividad farmacológica típica de un compuesto activo que se incorpora en el sistema de suministro y que, según la invención, se asocia con el vehículo coloidal, es tal que el compuesto está indicad para la prevención, diagnóstico o tratamiento de enfermedades y dolencias relacionadas con la actividad o aumento de actividad de la selectina-P. Entre las enfermedades conocidas hoy en día que probablemente implican selecltina-P están enfermedad arterial coronaria, trombosis, aterotrombosis, cáncer, trastornos inflamatorios crónicos, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, aterosclerosis, restenosis, isquemia, daños de repercusión incluyendo insuficiencia renal, metástasis tumoral, sepsis bacteriana, coagulación intravascular diseminada, síndrome de insuficiencia respiratoria en el adulto, ictus, angiogénesis, rechazo a transplante, trombosis venosa profunda, infarto de miocardio o choque circulatorio.

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Son candidatos especialmente útiles para tales sustancias de fármacos compuestos que contrarrestan el proceso inflamatorio en células activadas con selectina-P. Compuestos antiinflamatorios como se definen en el presente documento incluyen esteroides, en particular glucocorticoides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos e inmunosupresores. En una de las formas de realización preferidas, el compuesto activo se selecciona entre el grupo constituido por glucocorticoides, tales como dexametasona, betametasona, prednisolona, metilprednisolona, cortisona, hidrocortisona, triamcinolona, deflazacort, rimexolona, cloprednol y fluorocortolona.

El direccionamiento a las células que expresan o presentan selectina-P se consigue por medio de ligandos dirigidos que se asocian con la superficie de los vehículos coloidales, que están comprendidos en el sistema de suministro de fármacos de la invención. Estos ligandos dirigidos deben tener afinidad selectiva por selectina-P. Como se usa en el presente documento, "selectiva" significa que los ligandos tienen una afinidad mayor por la selectina-P que por otras estructuras moleculares que se encuentran típicamente sobre superficies celulares. En un sentido más estricto, la selectividad se refiere a aquellos ligandos que tienen una mayor afinidad por la selectina-P que por otras moléculas de adhesión celular que están relacionadas con la selectina-P, tales como selectina-E. La afinidad o características de unión de compuestos o ligandos a selectina-P se pueden cuantificar por ejemplo en términos de concentración que da un 50% de inhibición de la unión (CI_{50}). Típicamente, una concentración de 50-100 \muM o menor sería considerada como prueba de afinidad y unión. Para los ligandos, son más deseables sustancias con valores de la concentración que da un 50% de inhibición de la unión de 10 \muM o menores. Los mayores valores alcanzables para los enlaces de tipo no covalente que desempeñan un papel en las interacciones o uniones según la presente invención son de 10^{-15} M. Generalmente no obstante, los valores son mayores de 10^{-12} M y en la mayoría de los casos, mayores de aproximadamente 10^{-9} M.

Para asegurar una probabilidad suficiente de unión entre el vehículo coloidal y la molécula diana selectina-P, debería haber preferiblemente dos ligandos dirigidos asociados con la superficie de una partícula vehículo. Más preferiblemente, el número de ligandos por vehículo debería ser considerablemente mayor de dos, tal como al menos 5, o al menos 10. Asumiendo una distribución espacial aleatoria de los ligandos sobre el área superficial del vehículo, el número de ligandos por vehículo que parece apropiado para asegurar una probabilidad sustancial de interacción con la diana dependería por lo tanto del diámetro de la partícula vehículo. Por ejemplo, vehículos pequeños en el intervalo de aproximadamente 50 a 100 nm pueden considerarse sustancialmente fortalecidos cuando están cargados con un número de varias docenas a varios cientos de ligandos. Por otro lado, vehículos más grandes en el intervalo de pocos micrones se espera que muestren una eficacia de dirección significativa cuando exhiben al menos aproximadamente unos cientos de ligandos sobre su superficie. En una horma de realización preferida, el tamaño de partícula del vehículo es menor de 400 nm y el número de ligandos dirigidos por partícula de vehículo es de 20 a 1.000.

La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden un sistema de suministro de fármacos dirigido como se ha definido anteriormente. Típicamente, tal composición farmacéutica también comprenderá excipientes adicionales, que se seleccionan según técnicas de formulación del estado de la técnica farmacéutica.

Como se usa en el presente documento, un excipiente es cualquier sustancia farmacéuticamente aceptable o mezcla de sustancias que no tiene actividad farmacéutica sustancial, que se puede usar como un vehículo o como una sustancia auxiliar para formular un compuesto o un sistema de suministro de fármacos en una forma de dosificación que sea estable y fácil de administrar. Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables se encuentran en las monografías de todas las principales farmacopeas.

En una forma de realización, la composición se formula y se procesa para su inyección por vía parenteral, preferiblemente para inyección intravascular, tal como intravenosa o intraarterial, pero también para intramuscular, subcutánea, intralesional, intraperitoneal u otras vías de administración parenteral. Los mismos principios que regulan la formulación de otros fármacos para estas vías de administración también enseñarán a los expertos en la materia cómo preparar tales composiciones. Por ejemplo, uno de los requisitos de las formas de dosificación parenteral es su esterilidad. Otros requisitos se describen en todas las principales farmacopeas, tal como en USP 24, en la monografía "General Requirements for Tests and Assays. 1. Injections", p. 1775-1777.

Para incrementar la estabilidad de una formulación, puede ser necesario proporcionar una forma de dosificación seca que debe ser reconstituida antes de que se pueda administrar. Un ejemplo de tal forma de dosificación es una formulación secada por congelación o liofilizada. Para incrementar adicionalmente la comodidad y seguridad, la forma de dosificación seca puede combinarse con una composición líquida apropiada con la que se puede reconstituir para formar un líquido. En otras palabras, esta forma de realización de la invención representa un kit para la preparación de una composición farmacéutica, que comprende un componente sólido y uno líquido, en la que el componente sólido comprende un sistema de suministro de fármacos para suministrar un compuesto activo a células que expresan selectina-P como se ha definido anteriormente, mientras que el componente líquido es una composición acuosa. Las formulaciones parenterales están obviamente dentro del alcance de la invención.

Los excipientes que son particularmente útiles para la preparación de formulaciones parenterales son disolventes, cosolventes y vehículos líquidos o semisólidos, tales como agua estéril, etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, butanodiol, aceites grasos, triglicéridos de cadena corta y media, lecitina, derivados polioxietilénicos de aceite de ricino, sustancias para ajustar la osmolalidad y el pH, tales como azúcares, especialmente glucosa, alcoholes de azúcar, especialmente manitol, cloruro de sodio, carbonato de sodio, ácido cítrico, acetato, fosfato, ácido fosfórico, ácido clorhídrico, hidróxido de sodio, etc.; estabilizantes, antioxidantes y conservantes, tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrógenosulfito de sodio, EDTA, alcohol bencílico, etc.; otros excipientes y ayudantes de liofilización, tales como albúmina, dextrano, etc.

Alternativamente, las composiciones farmacéuticas pueden diseñarse para la administración por vía oral y procesarse en consecuencia. Las formas de dosificación adecuadas incluyen comprimidos, cápsulas duras, cápsulas blandas, polvos, granulados, formas de dosificación desintegrables por vía oral, jarabes, gotas, suspensiones, comprimidos efervescentes, comprimidos masticables, películas orales, formas de dosificación liofilizadas, formas de dosificación de liberación prolongada, formas de dosificación de liberación controlada. En una de las formas de realización preferidas, la forma de dosificación oral es una forma de dosificación recubierta entéricamente para proporcionar protección al compuesto frente al ambiente ácido y proteolítico del estómago.

También puede resultar ventajoso administrar el sistema de suministro de fármacos dirigido de la invención como una forma de dosificación o composición trasnmucosa. Esta vía de administración no es invasiva ni molesta para el paciente; al mismo tiempo puede conducir a una biodisponibilidad mejorada en comparación con la administración por vía oral. La administración transmucosa es posible, por ejemplo, por medio de formas de dosificación por vía nasal, bucal, sublingual, gingival o vaginal. Estas formas de dosificación pueden prepararse mediante técnicas conocidas, pueden formularse para representar gotas o pulverizadores nasales, insertos, películas, parches, geles, ungüentos o comprimidos. Preferiblemente, los excipientes usados para una forma de dosificación transmucosa incluyen una o más sustancias que proporcionan adhesión a la mucosa, prolongando de esta forma el tiempo de contacto de la forma de dosificación con el sitio de absorción e incrementando así potencialmente el grado de absorción.

En una forma de realización adicional, el sistema de suministro de fármacos de la invención se administra por vía pulmonar, usando un inhalador con medición de dosis, un nebulizador, un pulverizador de aerosol o un inhalador de polvo seco. Se pueden preparar formulaciones apropiadas mediante procedimientos y técnicas conocidos. La administración transdérmica, rectal u ocular también puede ser factible en algunos casos. Sin embargo, las más preferidas ahora son composiciones inyectables que contienen el sistema de suministro de fármacos dirigido a selectina-P.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar de forma adicional la invención, pero no limitar su alcance a las formas de realización presentadas en este documento.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de un ligando peptídico dirigido que tiene afinidad por selectina-P

Se sintetizó el péptido de unión a selectina-P humana H_{2}N-DVEWVDVSY-COOH (Pstar) mediante química en fase sólida usando un sintetizador de péptidos Applied Systems 9050 (Warrington, Reino Unido) usando química Fmoc convencional. El péptido se purificó en una columna RP C8 (Alltech, Breda, Países Bajos), usando un gradiente acetonitrilo/agua con TFA al 0,1%. La secuencia y la pureza se comprobaron con DILAM/CL-EM y cromatografía de exclusión por tamaño usando un sistema SMART (columna Pep30).

En una segunda etapa, el péptido se radiomarcó según el procedimiento ICI. Se eliminó el ^{125}I por filtración en Sephadex G10 con PBS como eluyente. Se comprobó la pureza por electroforesis en gel SDS-PAGE (al 20%) y se analizó usando un formador de imágenes fosforescente. El péptido se conservó a 4ºC en PBS.

En una tercera etapa, el péptido radiomarcado se disolvió en tampón HEPES (Biosolve, Valkenswaard, Países bajos) (HEPES 10 mM, pH 6,6) y se añadió N-hidroxi-succimidilpoli(etilenglicoldiestearoil-fosfatidiletanolamina) (PM 3400) (DSPE-PEG_{3400}-NHS: 7 equivalentes) (Shearwater Polymers Inc, Hunstville, EE.UU.) a esta solución en varias porciones. Después de agitar suavemente a temperatura ambiente durante 18 horas, los grupos NHS restantes se inactivaron mediante la adición de glicina. La formación del conjugado DSPE-PEG-(^{125}I)-Pstar se determinó por electroforesis en gel SDS-PAGE (al 20%)y análisis SMART usando una columna Pep30 o Superose 6 con PBS (NaN_{3} al 0,02% y EDTA 1 mM (Roche Molecular Biochemicals)) como eluyente.

Ejemplo 2 Preparación de un sistema de suministro de fármacos liposomal que comprende dexametasona

Se prepararon liposomas por medio de extrusión. Resumidamente, se mezclaron fosfatidilcolina de yema de huevo (Lipoid, Ludwigshafen, Alemania) (EYPC; 100 mg/ml en MeOH/CHCl_{3} 1:1 v/v) y colesterol (10 mg/ml en MeOH/CHCl_{3} 1:1 v/v) en una relación en peso de 5,0:0,44 (mg/mg) y la mezcla se secó bajo una corriente de nitrógeno. Después de la hidratación de los lípidos en 2 ml de tampón (KCl 0,1 M, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0), la suspensión se extruyó 31 veces a través de una membrana de policarbonato Whatman Nuclepore (100 nm, Pleasanton, California) usando una bomba neumática LipoFast (Cavestin Inc., Ottawa, Canadá). El tamaño de partícula se determinó por espectroscopia de correlación fotónica (sistema Malvern 4700 C, Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) a 27ºC y con un ángulo de 90º entre el láser y el detector (65-73 nm, polidispersidad 0,1-0,27). El contenido en fosfatidilcolina de los liposomas se determinó enzimáticamente usando el kit enzimático de Roche Molecular Biochemicals para fosfolípidos, con Precipath L (Roche Molecular Biochemicals) como un patrón interno. Los liposomas marcados con fluorescencia se prepararon añadiendo 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianida (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos) (DiI al 1% en MeOH/CHCl_{3} 1:1 v/v) a la mezcla de lípidos en bruto. Se añadió fosfato de dexametasona (10 mg) al tampón de sonicación para obtener los liposomas que contienen fosfato de dexametasona.

En una siguiente etapa, se asoció el ligando dirigido DSPE-PEG-(^{125}I)-Pstar (preparado según el ejemplo 1) con los liposomas. Las cantidades deseadas de DSPE-PEG_{3400}-(^{125}I)-Pstar y poli(etilenglicol)diestearoilfosfatidil-etanolamina (PM 2000) (Shearwater Polymers Inc., Huntsville, EE.UU.) (DSPE-PEG_{2000} 5% en moles en total) se incorporaron por incubación con los liposomas a 37ºC durante dos horas. El número de conjugados asociados por liposoma de 70 nm se calculó asumiendo 1,12 x 10^{11} liposomas/mg de fosfolípidos. Se prepararon liposomas que contenían 100 (LP_{100}) y 500 (LP_{500}). Para la preparación de liposomas de control (P0), se añadió la misma cantidad de DSPE-PEG-NHS inactivado con glicina. Una muestra de estos liposomas se sometió entonces a análisis SMART usando una columna de Superose 6 a 50 \mul/minuto con EDTA 10 mM y NaN_{3} al 0,02% como eluyente.

Ejemplo 3 Evaluación de la afinidad

La afinidad del sistema liposomal de suministro de fármacos preparado en el ejemplo 2 se evaluó usando un ensayo de competición. Se preparó TM11-PO nuevo, un complejo de TM11/strepPO tetramérico descrito por Molenaar y col. (Blood 100: 3570-3577 (2002)) incubando streptavidina-peroxidasa (Amersham Life Science, Little Chalfont, Reino Unido) (strepPO; 8,4 \mul, 2,0 \muM) y biotina-CDVEWVDVSSLEWDLPC (sintetizado por el Dr. Van der Zee, Departamento de Inmunología, Universidad de Utrecht, Utrecht, Países Bajos) (TM11-biotina; 1,5 \mul 190 mM) durante 2 horas a temperatura ambiente en tampón de ensayo (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2}, pH 7,4). Para los estudios de competición, se recubrió durante toda la noche una placa de microtitulación de 96 pocillos (unión elevada, fondo plano, Costar, Corning, EE.UU.) a 4ºC con anticuerpo de cabra anti IgG humana 10 \mug/ml (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos) en tampón de recubrimiento (NaHCO_{3} 50 mM, pH 9,6). A continuación, los pocillos se lavaron con tampón de ensayo y se incubaron durante 1 hora a 37ºC con tampón de bloqueo (BSA al 3% en tampón de ensayo). Después de lavar con tampón de ensayo, los pocillos se incubaron durante 2 horas a 37ºC con selectina-P humana/IgG-Fc (R&D Systems Europe, Ltd., Abingdon, Reino Unido) (0,3 \mug/ml). A continuación se lavaron los pocillos con tampón de ensayo y se incubaron durante 1 hora a 4ºC con el complejo TM11-PO. Los pocillos se lavaron seis veces con tampón de lavado (Tween 20 al 0,1% en tampón de ensayo). Se añadió 3,3',5,5'-tetrametilbenzamidina (TMB)/peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) (Pierce, Rochford, EE.UU.) y se incubaron los pocillos a temperatura ambiente durante 15 minutos. La reacción se detuvo añadiendo H_{2}SO_{4} 2 M y se midió la absorbancia a 450 nm. Como resultado, los liposomas P_{100} y P_{500} mostraron una afinidad mucho más elevada (CI_{50} = 0,78 y 0,34 nM, respectivamente) por la selectina-P que tanto los liposomas de control sin ligandos dirigidos, los cuales no mostraron afinidad ninguna, como Pstar libre, que mostró una afinidad micromolar baja (CI_{50} = 7 \muM).

Ejemplo 4 Evaluación de las propiedades de direccionamiento

Las propiedades de direccionamiento del sistema liposomal de suministro de fármacos preparado en el ejemplo 2 se evaluaron usando un modelo de cultivo celular. Como medida de la eficacia de direccionamiento de liposomas cargados con dexametasona P_{100} y P_{500}, se midió su capacidad de inducir la expresión génica respondedora a los corticosteroides y se comparó con la de los liposomas son ligandos (P_{0}).

Se cultivaron células CHO humanas, transfectadas de forma estable con selectina-P humana (células CHO-P, un generoso regalo del Dr. Modderman, Universidad de Ámsterdam, Ámsterdam, Países Bajos) en DMEM que contenía suero de ternero fetal al 10% (BioWhittaker, Verviers, Bélgica), L-glutamina 5 mM, 20.000 unidades de penicilina/estreptomicina (BioWhittaker, Verviers, Bélgica) y aminoácidos no esenciales 5 mM. Los frascos de cultivo se incubaron a 37ºC en atmósfera de CO_{2} al 5% durante 3 ó 4 días hasta que las células crecieron hasta alcanzar confluencia. Se sembraron las células en placas de cultivo de 24 pocillos (aproximadamente 100.000 células por pocillo) y se cultivaron hasta un 90% de confluencia en DMEM libre de esteroides (FCS al 10%). Las células se transfectaron por incubación durante 5 horas con una mezcla recién preparada de lipofectina que contenía una construcción de gen informador que codificaba para luciferasa de luciérnaga controlada por elemento respondedor a glucocorticoides (Clontech) (gen TAT_{3}-Luc; 10 ng/pocillo), se añadieron pCMV-Luc que codifica para luciferasa de Renilla (Promega) (0,1 ng/pocillo) y vector vacío hasta 1 \mug de ADN por pocillo en Optimem. La luciferasa de Renilla controlada por CMC se añadió para corregir la eficiencia de transfección. la mezcla de transfección se eliminó y se añadió DMEM libre de esteroides a las células. Después de 18 horas, se añadieron a las células liposomas P_{500} (1 nMm con o sin fosfato de dexametasona), P_{0} de control (1 nM) o fosfato de dexametasona (1 \muM) y se dejaron incubar durante 5 horas. Se eliminó el medio y se levaron las células con PBS. Después de incubar con tampón de lisis, se midió simultáneamente la actividad luciferasa de Renilla y luciérnaga usando un kit de ensayo dual de luciferasa (Promega).

Se observó la expresión de luciferasa 5 horas después de la transfección: la transfección relativa se había incrementado 5 veces con P_{500} cargados con dexametasona en comparación con P_{0} y P_{500} sin dexametasona. A una concentración de liposomas de 1 nM, estos liposomas tienen un efecto comparable sobre la actividad luciferasa que la dexametasona libre a una concentración de 1 \muM.

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Claims

1. Molécula de ligando dirigida que comprende

-: un resto que reconoce la diana

-: un restote anclaje, que se forma a partir de un lípido anfífilo, constituido por al menos un resto hidrófobo apolar y un grupo de cabeza hidrófilo polar,

caracterizada porque el resto que reconoce la diana es derivado de:

-: A_{1} es una D- o L-cisteína (C), D- o L-valina (V) o un análogo de las mismas;

-: A_{2} es un D- o L-ácido aspártico (D) o análogo del mismo;

-: A_{3} es una D- o L-fenilalanina (F), o D- o L-triptófano (W) o un análogo de los mismos;

-: A_{x} es un D- o L-aminoácido, seleccionado entre el grupo constituido por ácido glutámico (E), ácido aspártico (D), glicina (G) y cisteína (C);

: en la que X e Y conjuntamente pueden formar un sistema cíclico;

: caracterizada porque al menos uno de X e Y o X+Y está sustituido con el grupo R^{1}-(Z)_{n}-, en el que

-: Z se selecciona entre -CO-, -O-, -NR^{2}- y -CO-NR^{2}-;

-: en los que R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre

a): H;

b): un grupo alquilo C_{1}-C_{8};

c): un grupo alquilo C_{2}-C_{8}, en el que al menos un átomo de C está reemplazado con un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre;

d): un grupo arilo C_{6}-C_{14}, que puede estar sustituido con al menos un grupo seleccionado entre un halógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, -CF_{3}, -OH, -O-alquilo C_{1}-C_{6}, -COOH, -COO-alquilo C_{1}-C_{6}, -NO_{2},-NH_{2}, -NH- alquilo C_{1}-C_{6}, N-(alquilo C_{1}-C_{6})_{2} y -SO_{3}H;

e): un grupo heteroarilo que se selecciona entre sistemas de anillos con 5 ó 6 miembros y sistemas de anillos benzo-condensados, y tiene al menos un heteroátomo seleccionado entre el grupo constituido por nitrógeno, oxígeno y azufre, en el que dicho grupo heteroarilo puede estar sustituido con al menos un grupo seleccionado entre el grupo constituido por un halógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, -CF_{3}, -OH, -O-alquilo C_{1}-C_{6}, -COOH, -COO-alquilo C_{1}-C_{6}, -NO_{2},-NH_{2}, -NH- alquilo C_{1}-C_{6}, N-(alquilo C_{1}-C_{6})_{2} y -SO_{3}H;

f): un grupo aralquilo que comprende un grupo alquilo como se ha definido en b) o c) y un grupo arilo o grupo heteroarilo como se ha definido en d) o e); y

-: m y n son un número entero seleccionado independientemente entre 0 y 1, con la condición de que n no sea 0 cuando R^{1} es H.

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(2) un compuesto representado por la siguiente fórmula Ia

4

y su estereoisómero, representado por la siguiente fórmula Ib:

5

en la que

R^{2} es un resto que porta al menos una carga negativa y

R^{3} puede ser cualquier grupo,

siempre que si Q=-O- y R^{4} es -H-, está presente X.

6

caracterizado porque:

R^{1} = un hidrógeno; un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado o un grupo aromático, opcionalmente sustituidos respectivamente por un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico, un grupo amino o un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado;

R^{3} = un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado, opcionalmente sustituido por uno o más grupos ácido carboxílico, o un grupo alquilamido alifático (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado; o un grupo cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), opcionalmente sustituido por un grupo alquilo alifático (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado o uno o más grupos ácido carboxílico.

2. Molécula de ligando según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos XEWVDVY o un equivalente funcional de dicha secuencia.

3. Molécula de ligando según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el polímero del espaciador es un polímero soluble en agua.

4. Molécula de ligando según la reivindicación 3, caracterizada porque el polímero soluble en agua es un polietilenglicol, un poli(aminoácido), un poli(derivado de aminoácido), un poli(análogo de aminoácido), una polivinilpirrolidona o gangliósido GM1.

5. Molécula de ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el lípido anfífilo se selecciona entre el grupo constituido por fosfolípidos, glicolípidos, ceramidas, colesterol y derivados, mono- o dialquilaminas saturadas o insaturadas, de cadena ramificada o lineal C_{8}-C_{100}, arilalquilaminas, cicloalquilalquilaminas, alcanoles, aldehídos, carbohaluros o ácidos alcanoicos y los anhídridos de los mismos y se caracterizan porque el número total de átomos de C es 25 o más.

6. Molécula de ligando según la reivindicación 5, caracterizada porque el lípido anfífilo contiene al menos dos restos hidrófobos apolares.

7. Molécula de ligando según la reivindicación 5 ó 6, caracterizada porque el lípido anfífilo se selecciona entre el grupo constituido por 1-heptadecil-octadecilamina, N-succinil-dioctadecilamina y diestearilfosfatidiletanol-
amina.

8. Molécula de ligando según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, caracterizada porque es XEWVDVY-PEG-DSPE.

9. Una composición farmacéutica que comprende:

(a): un vehículo

(b): al menos una molécula de ligando dirigida según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, asociada con la superficie del vehículo.

10. La composición farmacéutica según la reivindicación 9, caracterizada porque el vehículo es un vehículo coloidal compuesto por partículas seleccionadas entre vesículas, tales como liposomas y niosomas, nanocápsulas, microcápsulas, nanopartículas, micropartículas, micelas o es un complejo lipídico, un hidrogel coloidal o una microemulsión.

11. La composición farmacéutica según la reivindicación 10, caracterizada porque las partículas del vehículo coloidal tienen un diámetro medio de menos de 1 \mum.

12. La composición farmacéutica según la reivindicación 11, caracterizada porque las partículas del vehículo coloidal tienen un diámetro medio de menos de 400 nm.

13. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, caracterizada porque el vehículo se compone de liposomas.

14. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, caracterizada porque contiene un agente farmacológicamente activo o un agente de diagnóstico.

15. La composición farmacéutica según la reivindicación 14, caracterizada porque el agente farmacológicamente activo es un agente para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o dolencia en la que está implicada la selectina-P, seleccionada entre enfermedad coronaria arterial, trombosis, aterotrombosis, cáncer, trastornos inflamatorios crónicos, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, aterosclerosis, restenosis, isquemia, daños por reperfusión incluyendo insuficiencia renal, metástasis tumoral, sepsis bacteriana, coagulación intravascular diseminada, síndrome de insuficiencia respiratoria en el adulto, ictus, angiogenesis, rechazo a transplante, choque circulatorio, trombosis venosa profunda o infarto de miocardio.

16. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-15, caracterizada porque la molécula de ligando es un péptido, un peptoide o un derivado de los mismos.

17. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-16, caracterizada porque el vehículo comprende un recubrimiento que proporciona una disminución de la absorción de la composición por parte de células del sistema retículo-endotelial.

18. La composición farmacéutica según la reivindicación 17, caracterizada porque el recubrimiento del vehículo comprende uno o más polímeros solubles en agua.

19. La composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizada porque el polímero soluble en agua se selecciona entre el grupo constituido por polietilenglicoles, poli(aminoácidos), poli(derivados de aminoácidos), poli(análogos de aminoácidos), polivinilpirrolidonas y gangliósido GM1.

20. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque la molécula de ligando dirigida comprende un resto de anclaje capaz de anclar el ligando en el interior del vehículo.

21. La composición farmacéutica según la reivindicación 20, caracterizada porque el resto de anclaje de la molécula de ligando dirigida se selecciona entre el grupo de los fosfolípidos.

22. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-21, caracterizada porque la composición comprende XEWVDVY-PEG-DSPE.

23. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-22, caracterizada porque contiene al menos 2 moléculas de ligando dirigidas.

24. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23, caracterizada porque contiene al menos 10 moléculas de ligando dirigidas.

25. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-24, caracterizada porque contiene de 20 a 10.000 moléculas de ligando dirigidas.

26. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-25, caracterizada porque la composición se administra por vía oral, parenteral, transmucosa o pulmonar.

27. La composición farmacéutica según la reivindicación 26, caracterizada porque la composición se administra por la vía parenteral.

28. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-27, caracterizada porque la composición se usa para potenciar la biodisponibilidad.

29. Un kit para la preparación de la composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-28, que comprende un componente líquido y uno sólido, siendo el componente líquido una composición acuosa y comprendiendo el componente sólido:

(a): un vehículo coloidal y

(b): al menos una molécula de ligando dirigida,

y que se prepara por procedimientos convencionales y subsiguiente eliminación del agua.