ES2273356T3 - Procedimiento para producir l-lisina. - Google Patents
Procedimiento para producir l-lisina. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2273356T3 ES2273356T3 ES97121444T ES97121444T ES2273356T3 ES 2273356 T3 ES2273356 T3 ES 2273356T3 ES 97121444 T ES97121444 T ES 97121444T ES 97121444 T ES97121444 T ES 97121444T ES 2273356 T3 ES2273356 T3 ES 2273356T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- dna
- lysine
- bacteria
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
UN ADNC REPLICABLE AUTONOMAMENTE EN CELULAS DE BACTERIA CORINEFORME, COMPRENDIENDO UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA PARA UNA ASPARTOCINASA EN LA CUAL LA INHIBICION POR FEED-BACK CON LLISINA Y L-TREONINA ESTA SUSTANCIALMENTE DESENSIBILIZADA, Y UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA UNA DESCARBOXILASA DIAMINOPIMELATO; UNA BACTERIA CORINEFORME QUE ALBERGA UNA ASPARTOCINASA CUYA INHIBICION POR FEED-BACK CON L-LISINA Y L-TREONINA ESTA SUSTANCIALMENTE DESENSIBILIZADA, Y COMPRENDIENDO UNA SECUENCIA DE ADN MEJORADO QUE CODIFICA UNA DESCARBOXILASA DIAMINOPIMELATO; Y UN METODO PARA LA PRODUCCION DE L-LISINA COMPRENDIENDO LOS PASOS DE CULTIVAR LA BACTERIA CORINEFORME EN UN MEDIO APROPIADO PARA PERMITIR QUE LA L-LISINA SE PRODUZCA Y SE ACUMULE EN UN CULTIVO DE LA BACTERIA, Y LA RECOLECCION DE L-LISINA DEL CULTIVO.
Description
Procedimiento para producir
L-lisina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción de L-lisina
mediante el cultivo un microorganismo obtenido mediante la
modificación de una bacteria coreneiforme usada para la producción
fermentativa de un aminoácido o similar mediante una técnica basada
en la ingeniería genética.
La L-Lisina, que se usa como
aditivo en el forraje, se produce de forma habitualmente mediante un
procedimiento fermentativo que usa una cepa mutante productora de
L-lisina que pertenece a las bacterias
coreneiformes. Varias de las L-lisina que se conocen
en la actualidad están creadas mediante mutaciones artificiales que
parten de cepas de tipo salvaje que pertenecen a las bacterias
coreneiformes.
Al igual que para las bacterias coreneiformes,
se describe un vector de plásmido que se puede replicar de manera
autónoma en las células bacterianas, y que tiene un gen marcador de
resistencia al fármaco (ver la Patente de los Estados Unidos Nº
4.514.502), y un procedimiento para introducir un gen en células
bacterianas (por ejemplo, la Solicitud de Patente Japonesa abierta
a consulta Nº 2-207791). Se describe igualmente la
posibilidad de cultivar bacterias productoras de
L-treonina de L-isoleucina usando
las técnicas descritas más arriba (ver por ejemplo las Patentes de
los Estados Unidos Nº 4.452.890 y 4.442.208). Tal como para el
cultivo de una bacteria productora de L-lisina, se
conoce una técnica, en la que un gen que participa en la biosíntesis
de la L-lisina se incorpora en un vector de plásmido
para amplificar el gen en células bacterianas (por ejemplo, la
Patente Japonesa abierta a consulta por el público
56-160997).
Entre los genes conocidos para la biosíntesis de
la L-lisina se incluyen por ejemplo, un gen de la
dihidrodipicolinato reductasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta
a consulta Nº 7-75578) y a un gen de la
diaminopimelato dehidrogenasa (Ishino, S. y col., Nucleic Acids
Res., 15, 3917 (1987)) en el que se clona un gen que participa
en la biosíntesis de la L-lisina, así como el gen de
la fosfoenolpiruvato carboxilasa (Solicitud de Patente Japonesa
abierta a consulta Nº 60-87788), un gen de la
dihidropicolinato sintasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta a
consulta Nº 6-55149), y un gen de la diaminopimelato
decarboxilasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº
60-62994), en la que la amplificación de un gen
afecta a la productividad de la L-lisina.
Al igual que para los enzimas que participan en
la biosíntesis de la L-lisina, se conoce el caso de
un enzima que experimenta inhibición por retroalimentación cuando se
usa como tipo salvaje. En este caso, se estimula la productividad de
la L-lisina introduciendo el gen de un enzima que
tiene una mutación tal que se insensibiliza dicha inhibición por
retroalimentación. Entre los conocidos por este tipo de que
introducido de forma específica se incluyen, por ejemplo, el gen de
la aspartokinasa (Documento de la Publicación Internacional WO
94/25605).
Tal como se ha descrito más arriba, se han
obtenido algunos resultados exitosos mediante la amplificación de
genes del sistema de la biosíntesis de la L-lisina,
o la introducción de genes mutantes. Por ejemplo, una bacteria
coreneiforme, que alberga un gen mutante de la aspartokinasa que
insensibiliza la inhibición concertada mediante lisina y treonina,
produce una cantidad considerable de L-lisina
(aproximadamente 25 g/L). Sin embargo esta bacteria experimenta una
disminución en su velocidad de crecimiento cuando se compara con una
bacteria que alberga un gen no mutante de la aspartokinasa. También
se informa de que se mejora la productividad de la
L-lisina introduciendo un gen de la
dihidropicolinato sintasa además del gen mutante de la aspartokinasa
(Applied and Environmental Microbiology, 57(6),
1746-1752 (1991)). Sin embargo, dicha bacteria
experimenta una disminución adicional en su velocidad de
crecimiento.
No se ha informado de ningún caso en el que se
pretenda aumentar el crecimiento mejorando a la vez un gen de la
biosíntesis de la L-lisina. En las circunstancias
presente, no se conoce ningún caso de bacterias coreneiformes en las
que nadie haya tenido éxito en la mejora remarcable del rendimiento
de la L-lisina sin restringir el crecimiento,
combinando una variedad de genes para la biosíntesis de la
L-lisina.
Un objeto de la presente invención es mejorar el
rendimiento de la L-lisina sin restringir el
crecimiento de una bacteria coreneiforme, por la mejora de una
pluralidad de genes para la biosíntesis de la
L-lisina en combinación con las bacterias
coreneiformes.
Cuando se produce de forma fermentativa una
sustancia objetivo mediante el uso de un microorganismo, resultan
ser factores extremadamente importantes tanto la velocidad de
producción como el rendimiento de la sustancia objetivo respecto del
material introducido. Se puede producir una sustancia objetivo de
forma remarcablemente barata aumentando la velocidad de producción
por unidad de equipo de fermentación. De acuerdo con ello, es
extremadamente importante desde el punto de vista industrial que el
rendimiento fermentativo y la velocidad de producción sean
compatibles entre sí. La presente invención propone una solución
para el problema descrito más arriba, con el fin de producir
L-lisina por vía fermentativa mediante el uso de una
bacteria coreneiforme.
El principio de la presente invención está
basado en el hecho de que se puede mejorar el crecimiento de una
bacteria coreneiforme, y se puede mejorar la velocidad de producción
de la L-lisina mediante la anterior mejorando tanto
una secuencia de ADN que codifica una aspartokinasa en la que se ha
insensibilizado la inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina y L-treonina, como una
secuencia de ADN que codifica una diaminopimelato decarboxilasa, en
comparación con el caso en la que dichas secuencias de ADN se
mejoran de forma individual.
En un primer aspecto, la presente invención, se
proporciona un ADN recombinante que se puede replicar de forma
autónoma en células de bacterias coreneiformes, que comprende una
secuencia de ADN que codifica una aspartokinasa en la que se ha
insensibilizado la inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina y L-treonina, como una
secuencia de ADN que codifica una diaminopimelato decarboxilasa. Se
proporciona también un ADN recombinante que incluye de forma
adicional una secuencia de ADN que codifica una fosfoenolpiruvato
carboxilasa.
En un segundo aspecto de la presente invención,
se proporciona una bacteria coreneiforme que alberga una
aspartokinasa en la que se ha insensibilizado la inhibición por
retroalimentación mediante L-lisina y
L-treonina, y que comprende una secuencia de ADN
mejorada que codifica una diaminopimelato decarboxilasa. Se
proporciona también una bacteria coreneiforme que comprende de forma
adicional una secuencia de ADN mejorada que codifica una
fosfoenolpiruvato carboxilasa.
En un tercer aspecto de la presente invención,
se proporciona un procedimiento para la producción de
L-lisina que comprende las etapas de cultivas
cualquiera de las bacterias coreneiformes que se han descrito más
arriba en el medio adecuado para permitir que la
L-lisina se produzca y acumule en el cultivo de la
bacteria, y recoger la L-lisina de dicho
cultivo.
A partir de ahora en el presente documento, la
aspartokinasa se denominará como "AK", un gen que codifica la
AK se denominará como "lysC", la AK en la que se ha
insensibilizado inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina y L-treonina, se denominará
como "AK mutante", y un gen que codifica la AK mutante se
denominará como "lysC mutante", si es necesario También,
la diaminopimelato decarboxilasa se denominará como "DDC", un
gen que codifica la DDC se denominará como "lysA", la
fosfoenolpiruvato carboxilasa se denominará como "PEPC", y un
gen que codifica la PEPC se denominará como "ppc", si es
necesario.
Las bacterias coreneiformes a las que hace
referencia la presente invención son un grupo de microorganismos que
se definen en el Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, 8ª ed., p. 599 (1974), que son aerobios
Gram-positivos de forma cilíndrica acidorresistentes
que no tienen capacidad de formación de esporas. Entre las bacterias
coreneiformes se incluyen bacterias que pertenecen al género
Corynebacterium, bacterias que pertenecen al género
Brevibacterium, que se habían clasificado hasta la fecha en
el género Brevibacterium pero que se han unido a las
bacterias que pertenecen al género Corynebacterium en la
actualidad, y las bacterias que pertenecen al género
Brevibacterium muy relacionada a las bacterias que pertenecen
al género Corynebacterium.
De acuerdo con la presente invención, se puede
mejorar la cantidad de producción y la velocidad de producción de la
L-lisina mediante bacterias coreneiformes.
La Fig. 1 ilustra un procedimiento de
construcción de los plásmidos p399AK9B y p399AKYB que comprenden la
lysC mutante.
La Fig. 2 ilustra el proceso de construcción de
un plásmido p299LYSA que comprende lysA.
La Fig. 3 ilustra el proceso de construcción de
un plásmido pLYSAB que comprende lysA y Brevi.-ori.
La Fig. 4 ilustra el proceso de construcción de
un plásmido pAKPFds que comprende un gen estructural PEPC.
La Fig. 5 ilustra el proceso de construcción de
nuevos vectores de clonación para bacterias coreneiformes, pVK6 y
pVK7,
La Fig. 6 ilustra el proceso de construcción de
un plásmido pPwm que comprenden un ppc de tipo salvaje y
expresión elevada.
La Fig. 7 ilustra el proceso de construcción de
un plásmido pCL que comprenden lysC, lysA y Brevi.-ori
mutantes.
La Fig. 8 ilustra el proceso de construcción de
un plásmido pDPSB que comprende dapA y Brevi.-ori.
La Fig. 9 ilustra el proceso de construcción de
un plásmido pDPRB que comprende dapB y Brevi.-ori.
La Fig. 10 ilustra el proceso de construcción de
un plásmido pPK4D que comprende ddh y Brevi.-ori.
La Fig. 11 ilustra el proceso de construcción de
un plásmido PCRCAB que comprende lysC, dapA y
Brevi.-ori.
La Fig. 12 ilustra el proceso de construcción de
un plásmido pCB que comprenden lysC, dapB, y
Brevi.-ori mutante.
La Fig. 13 ilustra el proceso de construcción de
un plásmido pCD que comprenden lysC y ddh mutante.
Los genes para la biosíntesis de la
L-lisina usados en la presente invención se obtienen
de forma respectiva preparando ADN cromosómico procedente de una
bacteria como donante de ADN, construyendo una biblioteca de ADN
cromosómico usando un vector de plásmido, o similar, seleccionando
una cepa que alberga un gen deseado, y recuperar, a partir de dicha
cepa seleccionada, ADN recombinante en el que se ha insertado el
gen. El ADN donante del gen para la biosíntesis de la
L-lisina usado en la presente invención no está
limitado de manera específica, siempre que el gen deseado para la
biosíntesis de la L-lisina exprese una proteína
enzimática que funcione en las células de las bacterias
coreneiformes. Sin embargo, se prefiere que el ADN donante proceda
de una bacteria coreneiforme.
Todos los genes lysC, dapA, y
ppc que se originan a partir de bacterias coreneiformes
tienen secuencias conocidas. De acuerdo con ello, se pueden obtener
llevando a cabo su amplificación de acuerdo con el procedimiento de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR; ver White, T. J. y col.,
Trends Genet., 5, 185 (1989)).
Cada uno de los genes para la biosíntesis de la
L-lisina usados en la presente invención se puede
obtener de acuerdo con algunos procedimientos como los que se
ejemplifican a continuación:
Se puede preparar un fragmento de ADN que
contiene la lysC mutante a partir de una cepa mutante en la
que se ha insensibilizado de forma sustancial la inhibición
sinérgica por retroalimentación mediante L-lisina y
L-treonina (Documento Internacional de Publicación
WO 94/25605). Dicha cepa mutante se puede obtener, por ejemplo, a
partir de un grupo de células originadas a partir de una cepa de
tipo salvaje de una bacteria coreneiforme sometida a un tratamiento
de mutación aplicando un tratamiento de mutación ordinario tal como
irradiación con ultravioleta y tratamiento con un agente mutagénico
tal como la
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG). Se puede medir la actividad de AK usando un procedimiento
descrito por Miyajima, R. y col. en The Journal of
Biochemistry (1968), 63(2),
139-148. El más preferido es aquel en el que una
cepa mutante está representada por una bacteria productora de
L-lisina AJ3445 (FERM P-1944)
derivada mediante un tratamiento de mutación de una cepa de tipo
salvaje de la Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (que
ha cambiado su nombre en la actualidad por el de Corynebacterium
glutamicum).
De manera alternativa, se puede obtener también
la lysC mutante mediante un tratamiento de mutación in
vitro con un ADN de plásmido que contenga la lysC de tipo
salvaje. En otro aspecto, se conoce de forma específica la
información para insensibilizar la inhibición por retroalimentación
sinérgica de la AK mediante L-lisina y
L-treonina (Documento Internacional de Publicación
of WO 94/25605). De acuerdo con ello, se puede obtener también la
lysC mutante mediante a partir de lysC de tipo salvaje
sobre la base de la información de acuerdo con, por ejemplo, el
procedimiento de mutagénesis dirigida al emplazamiento.
Se puede aislar un fragmento que comprende
lysC a partir de una bacteria coreneiforme preparando ADN
cromosómico de acuerdo con, por ejemplo, un procedimiento de Saito y
Miura (H. Saito y K. Miura, Biochem. Biophys. Actav, 72, 619
(1963)), y amplificar la lysC de acuerdo con el procedimiento
de reacción en cadena de la polimerasa (PCR; ver White, T. J. y
col., Trends Genet., 5, 185 (1989)).
Los cebadores de ADN se ejemplifican mediante
ADN de cadena simple de
23-mer y 21-mer
que tienen la secuencia de nucleótidos que se muestra en las SEC. DE
ID. NROS.: 1 y 2 del listado de secuencias con el objetivo de
amplificar, por ejemplo, una región de aproximadamente 1.643 pb que
codifican la lysC basado en una secuencia conocida de
Corynebacterium alutamicum (ver Molecular Microbiology
(1991), 5(5), 1197-1204; Mol. Gen.
Genet. (1990), 224, 317-324). Se puede
sintetizar el ADN de acuerdo con un procedimiento ordinario usando
un sintetizador de ADN modelo 380B producido por Applied Biosystems
y usando el procedimiento de la fosfoamidita (ver Tetrahedron
Letters (1981), 22, 1859). Se puede llevar a cabo la PCR
ADN Thermal Cycler Model PJ2000 producido por Takara Shuzo, y usando
polimerasa Taq ADN de acuerdo con un procedimiento establecido por
el suministrador.
Se prefiere que la lysC amplificada
mediante PCR se enlace con un vector de ADN que se puede replicar de
manera autónoma en células de E. coli y/o bacterias
coreneiformes para preparar ADN recombinante, y que el ADN
recombinante se introduzca en células de E. coli anteriores.
Dicha condición facilita las operaciones posteriores. El vector que
se puede replicar de manera autónoma en células de E. coli es
de forma preferible un vector de plásmido que de manera preferible
se puede replicar de manera autónoma en células de un huésped, entre
los que se incluyen por ejemplo pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299,
pHSG399, pHSG398, y RSF1010.
Cuando un fragmento de ADN que tiene la
capacidad de permitir que un plásmido se puede replicar de manera
autónoma en bacterias coreneiformes se inserta en dichos vectores,
se puede usar como un así llamado vector lanzadera que se puede
replicar de manera autónoma tanto en E. coli como en
bacterias coreneiformes.
Dicho vector lanzadera incluye lo siguiente: se
muestran los microorganismos que albergan cada uno de los vectores
con números de acceso en las autoridades internacionales de depósito
entre paréntesis:
pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM
PB-3532)
pAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM
PB-136) Corynebacterium glutamicum SR8201
(ATCC 39135)
pAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM
PB-137) Corynebacterium glutamicum SR8202
(ATCC 39136)
pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM
PB-138)
pAJ3148: Corynebacterium glutamicum
SR8203 (ATCC 39137)
pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM
PB-140)
Estos vectores se puede obtener a partir de los
microorganismos depositados como sigue: las células recogidas en la
fase de crecimiento logarítmico se lisaron usando lisozima y SDS,
seguido de la separación del lisato mediante centrifugación a 30.000
X g para obtener un sobrenadante. Se añadió a este sobrenadante
polietilén glicol, seguido por fraccionamiento y purificación
mediante una centrifugación en gradiente de densidades en equilibrio
de cloruro de cesio - bromuro de etidio.
Se puede transforma la E. coli
introduciendo un plásmido de acuerdo con, por ejemplo, un
procedimiento de D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68,
326 (1979)) o un procedimiento en el que las células receptoras se
tratan con cloruro de calcio para aumentar su permeabilidad al ADN
(Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
Se obtiene la lysC de tipo salvaje cuando
se aísla la lysC a partir de una cepa de AK de tipo salvaje,
a la vez que se obtiene lysC mutante cuando se aísla la
lysC a partir de una cepa de AK mutante de acuerdo con el
procedimiento que se ha descrito más arriba.
Un ejemplo de una secuencia de nucleótido de un
fragmento de ADN que contiene la lysC de tipo salvaje se
muestra en la SEC. DE ID. Nº: 3 en el Listado de Secuencias. La
secuencia de aminoácidos de \alpha-subunidades de
una proteína AK de tipo salvaje se deduce de la secuencia de
nucleótidos, y se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 4 en el Listado de
Secuencias junto con la secuencia de ADN. Sólo se muestra la
secuencia de aminoácidos en la SEC. DE ID. Nº: 5. Se deduce una
secuencia de aminoácidos de \beta-subunidades de
una proteína AK de tipo salvaje a partir de la secuencia de
nucleótidos del ADN, y se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 6 en el
Listado de Secuencias junto con la secuencia de ADN. Sólo se muestra
la secuencia de aminoácidos en la SEC. DE ID. Nº: 7. En cada una de
las subunidades, se usa GTG como codón de iniciación, y se
representa un aminoácido correspondiente por la metionina. Sin
embargo, esta representación se refiere a metionina, valina, o
formilmetionina.
La lysC mutante usada en la presente
invención no se limita de manera específica siempre que codifique
una AK en la que se haya insensibilizado la inhibición por
retroalimentación sinérgica mediante by L-lisina y
L-treonina. Sin embargo, la lysC mutante se
ejemplifica mediante una que incluya una mutación en la que un
residuo de aminoácido correspondiente al residuo de alanina número
279 que cuenta con un N-terminal se cambie por un
residuo de aminoácido diferente a la alanina y diferente a un
aminoácido ácido en la \alpha-subunidad, y que un
residuo de aminoácido correspondiente al residuo de alanina número
30 que cuenta con un N-terminal se cambie por un
residuo de aminoácido diferente a la alanina y diferente a un
aminoácido ácido en la \beta-subunidad, de la
secuencia de aminoácidos de la AK de tipo salvaje. La secuencia de
aminoácidos de la AK de tipo salvaje incluye de forma específica la
secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 5 en
el Listado de Secuencias como las
\alpha-subunidades, y la secuencia de aminoácidos
que se muestra en SEC. DE ID. Nº: 7 en el Listado de Secuencias como
las \beta-subunidades.
Se prefieren aquellos residuos de aminoácido
diferentes a la alanina y diferentes de los aminoácidos ácidos, e
incluyen residuos de treonina, arginina, cisteína, fenilalanina,
prolina, serina, tirosina, y valina.
El codón correspondiente a un residuo de
aminoácido a sustituir no está limitado de forma específica por su
tipo, siempre que codifique el residuo de aminoácido. Se prefiere
que la secuencia de aminoácidos de la AK de tipo salvaje sea
ligeramente diferente dependiendo de la diferencia de especie
bacteriana y de cepa bacteriana. Los AK que tienen mutaciones
basadas en, por ejemplo, sustitución, delección, o inserción de uno
o más residuos de aminoácidos en una o más posiciones irrelevante
para la actividad enzimática según se ha descrito más arriba, se
pueden usar también para la presente invención. Se puede obtener un
ADN que codifique un AK que tenga una mutación espontánea aislando
un ADN que se puede hibridar con, por ejemplo, el ADN que tenga
parte de la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEC. DE ID.
Nº: 3 con la condición restrictiva. Por "condición restrictiva"
definida en el presente documento se entiende una condición bajo la
cual se forma un híbrido específico, y no se forma un híbrido no
específico. Es difícil expresar la condición de forma clara con
valores numéricos. Sin embargo, la condición se ejemplifica con una
condición bajo la cual, los ácidos nucleicos que muestran elevada
homología, por ejemplo ADN con una homología de no menos el 90% se
hibridaban entre sí, mientras que los ácidos nucleicos que muestran
una homología inferior a la señalada no se hibridaban entre sí, o
una condición de una temperatura procedente de la temperatura de
fusión (Tm) de un híbrido completamente emparejado de
(Tm-30)ºC, de manera preferible comprendida entre Tm
y (Tm-20)ºC y una concentración de sal
correspondiente a 1 X SSC, de manera preferible 0,1 X SSC.
Otros AK, que tienen una mutación artificial
basa en por ejemplo, sustitución, delección, o inserción de uno o
más residuos de aminoácidos se pueden usar también siempre que no
tengan influencia sustancial sobre la actividad de la AK, y sobre
insensibilización de la inhibición por retroalimentación sinérgica
mediante by L-lisina y L-treonina.
Se puede obtener un ADN que codifica la AK que tenga la mutación
artificial modificando la secuencia de nucleótidos para la
sustitución, delección, o inserción dada en un emplazamiento
específico mediante, por ejemplo, mutagénesis específica del
emplazamiento. Igualmente, se puede usar una lysC que tenga
una mutación mediante tratamiento mutagénico conocido. Entre los
tratamientos mutagénicos se incluyen tratamiento in vitro de
un ADN que contenga lysC con hidroxialanina o similar, y
tratamiento de un microorganismo que albergue un ADN que contenga
lysC con un mutágeno tal como irradiación con ultravioleta o
un agente mutagénico usado para mutagénesis artificial ordinaria tal
como la
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) o ácido nítrico. Tras el tratamiento mutagénico, se puede
determinar el emplazamiento en el que se introduce la mutación o en
el que la mutación tiene lugar seleccionando un ADN o un
microorganismo que codifique o produzca la AK que tenga la actividad
AK y cuya secuencia de aminoácidos se haya mutado a partir del ADN
sometido a tratamiento mutagénico o el microorganismo sometido a
tratamiento mutagénico. El emplazamiento en el que se produce la
mutación no se restringe de manera específica siempre que no ejerza
influencia sustancial sobre la actividad de la AK y sobre la
insensibilización a la inhibición por retroalimentación sinérgica
mediante L-lisina y L-treonina. El
número de mutaciones introducidas varía dependiendo del
emplazamiento y del tipo de aminoácido mutado en la estructura
estérica de una proteína, y no se restringe de manera específica
siempre que no ejerza influencia sustancial sobre la actividad de la
AK y sobre la insensibilización a la inhibición por
retroalimentación sinérgica mediante L-lisina y
L-treonina. Este número está normalmente comprendido
entre 1 y 20, de manera preferible entre 1 y 10.
Se ha depositado una cepa AJ12691 obtenida
mediante introducción un plásmido lysC mutante p399AK9B en
una cepa AJ12036 (FERM PB-734) como una cepa de tipo
salvaje de Brevibacterium lactofermentum el 10 de abril de
1992 en el National Institute of Bioscience and Human Technology de
la Agency of Industrial Science and Technology del Ministry of
International Trade and Industry (1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, 305 Japón), con el número de acceso
FERM P-12918 y se ha transferido a depósito
internacional basado en el Tratado de Budapest el 10 de febrero de
1995, y depositada con el número de acceso FERM
PB-4999.
Se puede preparar un fragmento de ADN que
contiene la lysA a partir del cromosoma de una bacteria
coreneiforme mediante PCR. El donante de ADN no se limita de manera
específica, sin embargo, se ejemplifica mediante la cepa de
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
En las bacterias coreneiformes, el lysA
forma un operón junto con el argS (gen de la
arginil-ARNt sintasa), y el lysA está aguas
abajo del argS. La expresión del lysA está regulado
por un promotor que está aguas arriba del argS (ver
Journal of Bacteriology, Nov.,
7356-7362 (1993)). Las secuencias de ADN de estos
genes son conocidas para Corynebacterium alutamicum (ver
Molecular Microbiology, 4(11),
1819-1830 (1990); Molecular and General
Genetics, 212, 112-119 (1988)), sobre la
base de lo cual se pueden preparar cebadores de ADN para PCR. Dichos
cebadores de ADN se ejemplifican de forma específica mediante ADN de
23-mers que de manera respectiva tienen la secuencia
de nucleótidos que se muestra en SEC. DE ID. Nº: 8 en el Listado de
Secuencias (correspondiente a los números de nucleótido del 11 al 33
en una secuencia de nucleótidos descrita en Molecular
Microbiology, 4(11), 1819-1830
(1990)) y en la SEC. DE ID. Nº: 9 (correspondiente a los números de
nucleótido del 1370 al 1390 en una secuencia de nucleótidos descrita
en in Molecular and General Genetics, 212,
112-119 (1988)). La síntesis de ADN, PCR, y la
preparación de un plásmido que contiene lysA se pueden llevar a cabo
de la misma forma que se ha descrito para el lysC
descrito más arriba.
En el ejemplo que se describe más adelante, se
usó un fragmento de ADN que contiene un promotor, argS, y
lysA con el fin de mejorar lysA. Sin embargo, el
argS no es esencial para la presente invención. Se permite el
uso de un fragmento de ADN en el que el lysA se enlace
justamente corriente abajo del promotor.
Se ejemplifica una secuencia de nucleótidos de
un fragmento de ADN que contiene argS, y lysA, y una
secuencia de aminoácidos deducida que se debe codificar mediante la
secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 10. Un ejemplo de una
secuencia de aminoácidos codificada por argS se muestra en la SEC.
DE ID. Nº: 11, y un ejemplo de una secuencia de aminoácidos
codificada lysA se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 12. Además de los
fragmentos de ADN que codifican estas secuencias de aminoácidos la
presente invención puede usar de forma equivalente fragmentos de ADN
que codifiquen secuencias de aminoácidos que sean sustancialmente
las mismas que las secuencias de aminoácidos que se muestran en la
SEC. DE ID. Nº: 12, nominalmente secuencias de aminoácidos que
tengan mutaciones basadas en, por ejemplo, sustitución, delección o
inserción de uno o más aminoácidos, siempre que no tengan una
influencia sustancial sobre la actividad DDC. Se puede obtener un
lysA que tenga mutaciones espontáneas o artificiales de la misma
manera que el ADN que codifica un AK que tenga una mutación que no
ejerza influencia sobre la actividad AL y sobre la insensibilización
de la inhibición por retroalimentación sinérgica mediante by
L-lisina y L-treonina.
Se puede preparar un fragmento de ADN que
contiene la ppc a partir del cromosoma de una bacteria
coreneiforme mediante PCR. El donante de ADN no se limita de manera
específica, sin embargo, se ejemplifica mediante la cepa de
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Se conocen las secuencias del gen ppc
para Corynebacterium glutamicum (ver O'Regan, M. y col.,
Gene, 77, 237-251 (1989)), sobre la
base de lo cual se pueden preparar cebadores de ADN para PCR. Dichos
cebadores de ADN se ejemplifican de forma específica mediante ADN de
23-mers que de manera respectiva tienen la secuencia
de nucleótidos que se muestra en las SEC. DE ID. NROS 13 y 14 en el
Listado de Secuencias. La síntesis de ADN, PCR, y la preparación de
un plásmido que contiene lysA se pueden llevar a cabo de la
misma forma que se ha descrito para el lysC descrito más
arriba.
Se muestra una secuencia de nucleótidos de un
fragmento de ADN que contiene la ppc, y una secuencia de aminoácidos
deducida para codificar mediante la secuencia de nucleótidos en la
SEC. DE ID. Nº: 15, Se muestra únicamente la secuencia de
aminoácidos en la SEC. DE ID. Nº: 16.
Además de los fragmentos de ADN que codifican
estas secuencias de aminoácidos la presente invención puede usar de
forma equivalente fragmentos de ADN que codifiquen secuencias de
aminoácidos que sean sustancialmente las mismas que las secuencias
de aminoácidos que se muestran en la SEC. DE ID. Nº: 16,
nominalmente secuencias de aminoácidos que tengan mutaciones basadas
en, por ejemplo, sustitución, delección o inserción de uno o más
aminoácidos, siempre que no tengan una influencia sustancial sobre
la actividad PEPC. Se puede obtener un ppc que tenga
mutaciones espontáneas o artificiales de la misma manera que el ADN
que codifica un AK que tenga una mutación que no ejerza influencia
sobre la actividad AL y sobre la insensibilización de la inhibición
por retroalimentación sinérgica mediante by L-lisina
y L-treonina.
El ppc procedente de las bacterias
coreneiformes forma un operón junto con gap (gen de la
gliceraldehído-3-fosfato
dehidrogenasa), pgk (gen de la fosfoglicerato kinasa) y
tpi (gen de la triosa fosfato isomerasa), y el ppc se
encuentra aguas abajo del tpi. La expresión del ppc se
regula mediante un promotor que se encuentra corriente arriba del
pgk (ver Schwinde, J. W. y col., J. Bacteriol.,
175(12), 3905-3908 (1993)). Por tanto, al
igual que el lysA anteriormente mencionado, el ppc se
puede amplificar junto con pgk y tpi mediante PCR para
usar un fragmento de ADN que contiene pgk, tpi y
ppc. Como se muestra en el ejemplo que se describe más
adelante, se permite el uso de un fragmento de ADN en el que se
enlace un promotor adecuado justo corriente arriba de una región de
codificación del PEPC. El promotor incluye un promotor de
lysC, promotor tac originado de E. coli, y un promotor
trc.
El ADN recombinante comprende una secuencia de
ADN que codifica una aspartokinasa en la que se ha insensibilizado
la inhibición por retroalimentación sinérgica mediante
L-lisina y L-treonina, y una
secuencia de ADN que codifica una diaminopimelato decarboxilasa, y
que se puede replicar de manera autónoma en células de bacterias
coreneiformes. En una forma de realización preferida, el ADN
recombinante comprende de manera adicional una secuencia de ADN que
codifica una fosfoenolpiruvato carboxilasa además de las anteriores
una secuencias de ADN.
La bacteria coreneiforme de la presente
invención hospeda una aspartokinasa (AK mutante) en la que se ha
insensibilizado la inhibición por retroalimentación sinérgica
mediante by L-lisina y L-treonina,
mientras que se ha estimulado el ADN (lysA) que codifica una
diaminopimelato decarboxilasa. En una forma de realización
preferida, la bacteria coreneiforme de la presente invención es una
bacteria coreneiforme cuyo ADN (ppc) que codifica una
fosfoenolpiruvato carboxilasa se ha estimulado de manera adicional.
El término "mejora" en el presente documento hace referencia al
hecho que la actividad intracelular de un enzima codificado por el
ADN se aumenta mediante, por ejemplo, incrementar el número de
copias de un gen, usando un promotor fuerte, usando un gen que
codifica un enzima con una elevada actividad específica, o
combinando estos procedimientos.
La bacteria coreneiforme que alberga la AK
mutante se puede elegir entre las que producen la aspartokinasa
mutante como resultado de una mutación, o las que hayan sido
transformadas mediante la introducción de un lysC
mutante.
Entre los ejemplos de bacterias coreneiforme
usadas para introducir el ADN descrito más arriba incluye, por
ejemplo, las siguientes cepas de tipo salvaje productoras de
lisina.
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC
13870;
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC
15806;
Corynebacterium callunae ATCC 15991;
Corynebacterium glutamicum ATCC
13032;
(Brevibacterium divaricatum) ATCC
14020;
(Brevibacterium lactofermentum) ATCC
13869;
(Corynebacterium lilium) ATCC 15990;
(Brevibacterium flavum) ATCC 14067;
Corynebacterium melassecola ATCC
17965;
Brevibacterium saccharolyticum ATCC
14066;
Brevibacterium immariophilum ATCC
14068;
Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium thioaenitalis ATCC
19240;
Microbacterium ammoniaphilum ATCC
15354;
Corynebacterium thermoaminoaenes AJ12340
(FERM PB-1539).
Se pueden usar otras aparte de las cepas
bacterianas descritas más arriba, las que se pueden usar como
huésped incluyen por ejemplo, cepas mutantes que tengan una
capacidad productora de L-lisina derivada de las
cepas anteriormente mencionadas. Entre dichas cepas artificiales
mutantes se incluyen las siguientes:
S-(2-aminoetil)-cisteína (a partir
de ahora en el presente documento abreviada como "AEC") cepas
mutantes resistentes (por ejemplo, Brevibacterium
lactofermentum AJ11082 (NRRL B-1147),
Publicación de Patente Japonesa con números.
56-1914, 56-1915,
57-14157, 57-14158,
57-30474, 58-10075,
59-4993, 61-35840,
62-24074, 62-36673,
5-11958, 7-112437, y
7-112438); cepas mutantes que requieren para su
crecimiento aminoácidos tales como L-homoserina
(Publicación de Patente Japonesa con números.
48-28078 y 56-6499); cepas mutantes
que presentan resistencia a AEC y requieren aminoácidos tales como
L-leucina, L-homoserina,
L-prolina, L-serina,
L-arginina, L-alanina, y
L-valina (Patente de los Estados Unidos con números
3.708.395 y 3.825.472); cepas mutantes productoras de
L-lisina que presentan resistencia a
DL-\alpha-amino-\varepsilon-caprolactama,
\alpha-amino-laurilactama,
análogos de aspartato, sulfa fármacos, quinoides, y
N-lauroil leucina; cepas mutantes productoras de
L-lisina que presentan resistencia a inhibidores de
la oxialoacetato decarboxilasa o enzimas del sistema respiratorio
(Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº.
50-53588, 50-31093,
52-102498, 53-9394,
53-86089, 55-9783,
55-9759, 56-32995 y
56-39778, y Publicación de Patente Japonesa con
números. 53-43591 y 53-1833); cepas
mutantes productoras de L-lisina que requieren
inositol o ácido acético (Solicitud de Patente Japonesa abierta a
consulta Nº. 55-9784 y 56-8692);
cepas mutantes productoras de L-lisina que muestran
sensibilidad al ácido fluoropirúvico o a temperatura no inferior a
34º C (Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº.
55-9783 y 53-86090); y cepas
mutantes productoras que pertenezcan a los géneros
Brevibacterium o Corynebacterium que presenten
resistencia a etilén glicol y produzcan L-lisina
(Patente de los Estados Unidos Nº 4.411.997).
En una forma de realización específica, con el
fin de estimular los genes de la biosíntesis de la
L-lisina en los huéspedes tal como se ha descrito
más arriba, los genes se introducen en el huésped mediante un vector
de plásmido, transposoma o vector de fago o similar. Tras la
introducción, se espera que se produzca mejora en cierta extensión,
incluso usando un vector de bajo tipo de copia. Sin embargo, se
prefiere usar un vector de múltiple tipo de copia. Entre dichos
vectores se incluyen, los vectores de plásmido, pAJ655, pAJ1844,
pAJ611, pAJ3148, y pAJ440 que se describen más arriba. Además, los
transposones derivados de bacterias coreneiformes se describen en
los Documentos Internacionales de Publicación WO02/02627 y
WO93/18151, en la Publicación de Patente Europea Nº 445385, en la
Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº
6-46867, en Vertes, A. A. y col., Mol. Microbiol.,
11, 739-746 (1994), en Bonamy, C., y col., Mol.
Microbiol., 14, 571-581 (1994), en Vertes, A. A. y
col., Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994), en
Jagar, W. y col., FEMS Microbiology Letters, 126,
1-6 (1995), en la Solicitud de Patente Japonesa
abierta a consulta Nº 7-107976, en la Solicitud de
Patente Japonesa abierta a consulta Nº 7-327680 y
similares.
En la presente invención, no es indispensable
que se mejore de forma específica el lysC mutante. Se permite
el uso de aquellas que tengan una mutación el lysC del ADN
cromosómico o en el que se incorpore el lysC mutante en el
ADN cromosómico. De manera alternativa, se puede introducir el
lysC mutante mediante el uso de un vector de plásmido. Por
otra parte, se prefiere mejorar lysA y ppc con el fin
de producir L-lisina de manera eficiente.
Cada uno de los genes de lysC,
lysA, y ppc se pueden introducir de forma sucesiva en
el huésped usando vectores diferentes, de manera respectiva. De
manera alternativa, se pueden introducir conjuntamente dos o tres
especies de genes usando un vector único. Cuando se usan vectores
diferentes, los genes se pueden introducir en cualquier orden, sin
embargo, se prefiere el uso de vectores que tengan un mecanismo
estable de compartir y alojar en el huésped, y que sean capaces de
coexistir entre sí.
Una bacteria coreneiforme que alberga el AK
mutante y que comprende además lysA se puede obtener, por
ejemplo mediante la introducción en una bacteria coreneiforme
huésped, de un ADN recombinante que contiene lysC,
lysA y ppc mutantes que se puede replicar de manera
autónoma.
Una bacteria coreneiforme que contiene de manera
adicional ppc mejorado además de los lysC, lysA
mutantes se puede obtener, por ejemplo mediante la introducción en
una bacteria coreneiforme huésped, de un ADN recombinante que
contiene lysC, lysA y ppc mutantes que se puede
replicar de manera autónoma. Igualmente, se puede obtener una
bacteria coreneiforme que comprende los mutantes mejorados
lysC, lysA y ppc mediante la introducción, en
una bacteria coreneiforme que comprende los mutantes mejorados
lysC, y lysA un ADN recombinante que contiene un
ppc que se puede replicar de manera autónoma en las células
de la bacteria coreneiforme.
Los ADN recombinantes mencionados mas arriba se
pueden obtener, por ejemplo, insertando cada uno de los genes que
participan en la biosíntesis de la L-lisina en un
vector tales como un vector de plásmido, transposoma o vector de
fago, como se ha descrito más arriba.
En el caso de que se use un plásmido como
vector, el ADN recombinante se puede introducir en el huésped de
acuerdo con el procedimiento del pulso eléctrico (Sugimoto y col.,
Solicitud de Patente Japonesa abierta a consulta Nº
2-207791). Se puede llevar a cabo la amplificación
del gen usando transposomas mediante la introducción de un plásmido
que trasporta un transposoma al interior de la célula huésped, e
induciendo la transposición del transposoma.
Se puede producir L-Lisina de
manera eficiente mediante el cultivo, en un medio apropiado de una
bacteria coreneiforme que comprende los genes mejorados de la
biosíntesis de la L-lisina que se describen más
arriba, para permitir que se produzca y acumule la
L-lisina en el cultivo de la bacteria, y recoger la
L-lisina del cultivo.
El medio a usar se ejemplifica mediante un medio
ordinario que contiene una fuente de carbono, una fuente nitrógeno,
iones inorgánicos, y de manera opcional otros componentes
orgánicos
Como fuente de carbono, es posible utilizar
azúcares tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melazas, y almidón
hidrolizado; y ácidos orgánicos tales como ácido fumárico, ácido
cítrico, y ácido succínico.
Como fuente de nitrógeno, es posible utilizar
sales de amonio inorgánico tales como sulfato de amonio, cloruro de
amonio, y de amonio fosfato; nitrógeno orgánico tales como
hidrolizado de soja; amoniaco gas; y amoniaco acuoso.
Como nutrientes orgánicos traza, es deseable
contener sustancias necesarias tales como vitamina B_{1}, y
L-homoserina o extracto de levadura o similar, en
cantidades apropiadas. Además de los anteriores, si es necesario se
pueden añadir pequeñas cantidades de fosfato de potasio, sulfato de
magnesio, ion hierro e ion manganeso.
Es preferible llevar a cabo los cultivos en
condiciones aerobias durante aproximadamente 30 a 90 horas. La
temperatura de cultivo se controla de manera preferible entre 25º C
y 37º C, y el pH se controla de manera preferible entre 5 y 8
durante el cultivo. Para el ajuste del pH se pueden usar sustancias
inorgánicas u orgánicas, ácidas o alcalinas, o amoniaco gaseoso. Se
puede recoger la L-lisina de los cultivos combinando
un procedimiento ordinario de resina de intercambio iónico, un
procedimiento de precipitación, y otros procedimientos
conocidos.
La presente invención se explicará de forma más
específica con referencia a los Ejemplos.
Una cepa de Brevibacterium lactofermentum
ATCC 13869, y una cepa mutante productora de
L-lisina AJ3445 (FERM P-1944)
obtenida a partir de la cepa ATCC 13869 mediante un tratamiento de
mutación se usaron como donantes de ADN cromosómico. Se sometió la
cepa AJ3445 a mutación de forma que se cambió el lysC para
implicar insensibilización de la inhibición por retroalimentación
sinérgica mediante L-lisina y
L-treonina (Journal of Biochemistry, 68,
701-710 (1970)).
Se amplificó un fragmento de ADN que contiene la
lysC a partir de ADN cromosómico de acuerdo con el
procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa; ver White,
T. J. y col., Trends Genet., 5, 185 (1989)). Al igual
que para los cebadores de ADN usados para la amplificación, se
sintetizaron ADN de cadena única de 23-mer y
21-mer que tienen la secuencia de nucleótidos que se
muestra en SEC. DE ID. NROS.: 1 y 2 con el fin de amplificar una
región de aproximadamente 1.643 pb que codifican el lysC
sobre la base de una secuencia conocida del Corynebacterium
glutamicum (ver Molecular Microbiology (1991),
5(5), 1197-1204; y Mol. Gen.
Genet. (1990), 224, 317-324). Se
sintetizó el ADN de acuerdo con un procedimiento ordinario usando un
sintetizador de ADN modelo 380B producido por Applied Biosystems y
usando el procedimiento de la fosfoamidita (ver Tetrahedron
Letters (1981), 22, 1859).
El gen se amplificó por PCR usando un ADN
Thermal Cycler Model PJ2000 producido por Takara Shuzo, y usando
polimerasa Taq DNA de acuerdo con un procedimiento diseñado por el
fabricante. Se confirmó mediante electroforesis en gen de agarosa el
fragmento de gen amplificado de 1.643 pd. Tras de eso, el fragmento
retirado del gel se purificó de acuerdo con un procedimiento
ordinario, y se digirió con los enzimas de restricción NruI
(producido por Takara Shuzo) y EcoRI (producido por Takara
Shuzo).
Se usó el pHSG399 (ver Takeshita, S. y col.,
Gene (1987), 61, 63-74) como vector de
clonación para el fragmento de gen. El pHSG399 se digirió con los
enzimas de restricción SmaI (producido por Takara Shuzo) y
EcoRI, y se usó unido con el fragmento amplificado de
lysC. Se enlazó el ADN usando un kit de enlace de ADN
(producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento
diseñado. Una vez preparados los plásmidos, en los que los
fragmentos de lysC amplificados de cromosomas procedentes de
Brevibacterium lactofermentum se ligaron con pHSG399,
respectivamente. El plásmido que comprendía lysC procedente de ATCC
13869 (cepa de tipo salvaje) se designó como p399AKI, y el plásmido
que comprendía lysC procedente de AJ3463 (bacteria productora
de L-lisina) se designó como p399AK9.
Un fragmento de ADN (denominado a partir de
ahora en el presente documento como "Brevi.-ori") que tiene la
capacidad de fabricar un plásmido que se puede replicar de manera
autónoma en una bacteria que pertenece al género
Corynebacterium se introdujo en p399AKI y p399AK9 de forma
respectiva para preparar plásmidos que contienen lysC que se
puede replicar de manera autónoma en bacterias que pertenecen al
género Corynebacterium. Se preparó Brevi.-ori a partir de un
vector de plásmido pHK4 que contiene la Brevi.-ori y que se puede
replicar de manera autónoma en células tanto de Escherichia
coli como pertenecientes al género Corynebacterium. Se
preparó el pHK4 digiriendo el pHC4 con KpnI (producido por
Takara Shuzo) y BamHI (producido por Takara Shuzo),
extrayendo un fragmento Brevi.-ori y ligándolo con pHSG298 que se
había digerido también con KpnI y BamHI (ver Solicitud
de Patente Japonesa abierta a consulta Nº 5-7491).
El pHK4 proporciona resistencia a la kanamicina a un huésped. La
Escherichia coli que alberga pHK4 se denominó como
Escherichia coli AJ13136, y se depositó el 1 de agosto de
1995 en el National Institute of Bioscience and Human Technology de
la Agency of Industrial Science and Technology del Ministry of
International Trade and Industry (1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, 305 Japón) bajo el número de acceso
FERM PB-5186.
El pHK4 se digirió con los enzimas de
restricción KpnI y BamHI, y se enromaron los extremos
rotos. La formación de los extremos enromados se llevó a cabo usando
un ADN Blunting kit (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un
procedimiento diseñado. Tras la formación de los extremos romos, se
ligó un enlazante BamHI (producido por Takara Shuzo) para
hacer una modificación tal que el fragmento de ADN correspondiente a
la porción Brevi.-ori se pudiera cortar del pHK4 mediante digestión
con únicamente BamHI. Se digirió este plásmido con
BamHI, de forma respectiva, y el fragmento generado
Brevi.-ori ADN se ligó con p399AKI y p399AK9 que se habían digerido
también con BamHI de forma respectiva para preparar
plásmidos, que contuviera cada uno el gen lysC que se puede
replicar de manera autónoma bacterias que pertenecen al género
Corynebacterium.
El plásmido que contiene el gen de lysC
de tipo salvaje originado en p399AKI se denominó como p399AKYB, y el
plásmido que contiene el gen de lysC mutante originado en
p399AK9 se denominó como p399AK9B. El procedimiento de construcción
de p399AK9B y p399AKYB se muestra en la Fig. 1. Una cepa de AJ12691
obtenida por introducción del plásmido p399AK9B con lysC
mutante en una cepa de Brevibacterium lactofermentum (AJ12036
cepa, FERM PB-734) de tipo salvaje se depositó el 10
de abril de 1992 en el National Institute of Bioscience and Human
Technology de la Agency of Industrial Science y Technology del
Ministry of International Trade y Industry (1-3,
Higashi 1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, 305 Japón), bajo el número de acceso
FERM P-12918, y transferido a un depósito
internacional basado en el Tratado de Budapest, y depositada bajo el
número de acceso FERM
PB-4999.
PB-4999.
El plásmido p399AKI que contiene la lysC
de tipo salvaje y el plásmido p399AK9 que contiene el lysC
mutante se prepararon a partir de sus transformantes respectivos
para determinar las secuencias de nucleótidos de los lysC de
tipo salvaje y mutante. Se llevó a cabo la determinación de las
secuencias de nucleótidos mediante un procedimiento de Sanger y col.
(por ejemplo, F. Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci.,
74, 5463 (1977)).
La secuencia de nucleótidos del lysC de
tipo salvaje codificado por el p399AKI se muestra en la SEC. DE ID.
Nº: 3 en el Listado de Secuencias. Por otra parte, la secuencia de
nucleótidos del lysC mutante codificado por el p399AK9 tiene
únicamente la mutación de un nucleótido tal como que el 1051º G se
cambió por A en la SEC. DE ID. Nº: 3 cuando se compara con el
lysC de tipo salvaje. Se sabe que el lysC de
Corynebacterium glutamicum tiene dos subunidades (\alpha,
\beta) codificadas en un marco de lectura idéntico sobre una hebra
de ADN idéntica (ver Kalinowski, J. y col., Molecular Microbiology
(1991) 5(5), 1197-1204). Juzgando a partir de
la homología, se asume que el gen secuenciado en el presente
documento también tiene dos subunidades (\alpha, \beta)
codificadas en un marco de lectura idéntico sobre una hebra de ADN
idéntica.
Una secuencia de aminoácidos de la
\alpha-subunidad de la proteína AK de tipo salvaje
deducida procedente de las secuencia de nucleótidos de ADN se
muestra en la SEC. DE ID. Nº: 4 junto con la secuencia de ADN. Solo
se muestra la secuencia de aminoácidos en la SEC. DE ID. Nº: 5. Una
secuencia de aminoácidos de la \beta-subunidad de
la proteína AK de tipo salvaje deducida procedente de la secuencia
de nucleótidos del ADN se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 6 junto con
la secuencia de ADN. Sólo se muestra la secuencia de aminoácidos en
la SEC. DE ID. Nº: 7. En cada una de las unidades, se usa GTG como
codón de iniciación, y el correspondiente aminoácido se representa
por la metionina. Sin embargo, esta representación hace referencia a
metionina, valina, o formilmetionina.
Por otra parte, la mutación en la secuencia del
lysC mutante significa la incidencia de la sustitución de
residuos de aminoácido tales como que el residuo número 279 de
alanina de de la \alpha-subunidad se cambia por un
residuo de treonina, y que el residuo número 30 de la alanina de la
\beta-subunidad se cambia por un residuo de
treonina en la secuencia de aminoácidos de la proteína de tipo
salvaje AK (SEC. DE ID. NROS.: 5, 7).
Una cepa de tipo salvaje de Brevibacterium
lactofermentum ATCC 13869 se usó como donante ADN cromosómico.
Se preparó ADN cromosómico procedente de las cepa ATCC 13869 de
acuerdo con un procedimiento ordinario. Un fragmento de ADN que
contiene la argS, lysA, y un promotor de un operón que
los contiene se amplificó a partir del ADN cromosómico de acuerdo
con PCR. Al igual que con los cebadores de ADN usados para la
amplificación, se usó ADN sintético de 23-mers con
la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEC. DE ID. NROS.: 8 y
9 en el Listado de Secuencias, de forma respectiva con el fin de
amplificar una región de aproximadamente 3,6 kb que codifica la
arginil-ARNt sintasa y DDC sobre la base de una
secuencia conocida de Corynebacterium glutamicum (ver
Molecular Microbioloby, 4(11),
1819-1830 (1990); Molecular and General
Genetics, 212, 112-119 (1988)). Se llevó
a cabo la síntesis del ADN y la PCR de la misma forma que se ha
descrito en Ejemplo 1. El pHSG399 se usó como vector de clonación
para el fragmento amplificado del gen de 3.579 pb. El pHSG399 se
digirió con un enzima de restricción SmaI (producido por
Takara Shuzo), y se ligó con el fragmento de ADN que contiene la
lysA amplificada. Se obtuvo un plásmido tal como se ha
descrito más arriba, que tenía un lysA originado a partir de
ATCC 13869, y que se designó como p399LYSA.
Se extrajo un fragmento de ADN que contiene la
lysA digiriendo el p399LYSA con KpnI (producido por
Takara Shuzo) y BamHI (producido por Takara Shuzo). Este
fragmento de ADN se ligó con pHSG299 que se había digerido con
KpnI y BamHI. El plásmido obtenido se designo como
p299LYSA. El proceso de construcción del p299LYSA se muestra en la
Fig. 2.
Se introdujo Brevi.-ori en el p299LYSA obtenido
para construir un plásmido que transportaba la lysA que se
puede replicar de manera autónoma en las bacterias coreneiformes. El
pHK4 se digirió con los enzimas de restricción KpnI y BamHI,
y los extremos romos se enromaron. Se llevó a cabo la formación de
los extremos romos mediante un ADN Blunting kit (producido por
Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado. Tras la
formación de los extremos romos, se ligó un enlazante KpnI
fosforilado para hacer una modificación de tal manera que el
fragmento de ADN correspondiente a la porción Brevi.-ori se pudiera
extraer del pHK4 mediante digestión únicamente con KpnI. Este
plásmido se digirió con KpnI, y el fragmento de Brevi.-ori
ADN generado se ligó con p299LYSA que se había digerido también con
KpnI para preparar un plásmido que contiene la lysA
que se puede replicar de manera autónoma en las bacterias
coreneiformes. El plásmido preparado se denominó pLYSAB. El
procedimiento de construcción del pLYSAB se muestra en la Fig.
3.
Se preparó el plásmido de p299LYSA, y se
determinó su secuencia de nucleótidos de la misma forma que se ha
descrito en Ejemplo 1. Una secuencia de nucleótidos deducida y una
secuencia de aminoácidos que se deduce que es codificada por la
secuencia de nucleótidos se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 10.
Respecto de la secuencia de aminoácidos, una secuencia de
nucleótidos codificada por argS y una secuencia de
aminoácidos codificada por lysA se muestran en la SEC. DE ID.
NROS.: 11 y 12, de forma respectiva.
Una cepa de tipo salvaje de Brevibacterium
lactofermentum ATCC 13869 se usó como donante de ADN
cromosómico. El ADN cromosómico se preparó a partir de las cepas
ATCC 13869 de acuerdo con un procedimiento ordinario. Se amplificó
un fragmento de ADN que contiene la ppc a partir de los ADN
cromosómico de acuerdo con PCR. Al igual que con los cebadores de
ADN usados para la amplificación, se usaron ADN sintéticos de
23-mers con la secuencia de nucleótidos que se
muestra en SEC. DE ID. NROS.: 13 y 14 en el Listado de Secuencias,
de forma respectiva, con el fin de amplificar una región de
aproximadamente 3,3 kb que codifica el PEPC sobre la base de una
secuencia conocida de Corynebacterium glutamicum (ver
O'Regan, M. y col., Gene, 77, 237-251
(1989)). La síntesis del ADN y la PCR se llevaron a cabo de la misma
forma que se ha descrito en Ejemplo 1.
\newpage
Un fragmento de gen amplificado de
aproximadamente 3.300 pb se confirmó mediante electroforesis en gel
de agarosa, y a continuación, el fragmento extraído del gel se
purifico mediante una un procedimiento ordinario y se digirió con el
enzima de restricción SalI (producido por Takara Shuzo). El
pHSG399 se usó como el vector de clonación para ppc. El
pHSG399 se digirió con el enzima de restricción SalI
(producido por Takara Shuzo), y se ligó con el fragmento de ADN que
contiene el ppc amplificado. Se obtuvo un plásmido como se ha
descrito más arriba, que tiene un ppc originado en ATCC
13869, y que se designó como pPCF.
El pPCF obtenido tal como se ha descrito más
arriba se digirió con el enzima de restricción DraI
(producido por Takara Shuzo). Tras eliminar un fragmento de ADN de
aproximadamente 150 pb corriente arriba del gen estructural de PEPC,
se llevó a cabo el autoenlazado para obtener el plásmido pPCFds. El
pPCFds se digirió con el enzima de restricción SalI (producido por
Takara Shuzo), y los extremos romos se enromaron. Se llevó a cabo la
formación de los extre-
mos romos mediante un ADN Blunting kit (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado.
mos romos mediante un ADN Blunting kit (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado.
El p399AKYB que contiene el lysC de tipo
salvaje que se obtiene en el Ejemplo 1 se digirió con los enzimas de
restricción ApaLI y PstI (ambos producidos por Takara
Shuzo), y los extremos rotos se enromaron de la misma forma que
anteriormente. Un fragmento más pequeño entre los dos fragmentos de
ADN obtenidos contienen Brevi.-ori y un promotor de lysC.
Estos fragmentos se ligaron con el fragmento anteriormente
mencionado obtenido mediante digestión del pPCFds con SalI y los
extremos se enromaron mediante un ADN Ligation kit (producido por
Takara Shuzo).
Se introdujo ADN en solución de enlace en la
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 de acuerdo con el
procedimiento del pulso eléctrico (Sugimoto y col., Solicitud de
Patente Japonesa abierta a consulta Nº 2-207791).
Se seleccionaron los transformantes en un medio completo que
contenía 5 \mug/ml de cloranfenicol. Se recogió el plásmido de ADN
a partir de los transformantes, y se digirieron con EcoRI
para obtener un plásmido en el que el promotor de lysC se
ligó con el gen estructural de ppc en una orientación normal. Se
denominó el plásmido obtenido como pAKPFds. El procedimiento de
construcción del pAKPFds se muestra en la Fig. 4. El ppc
ligado con el promotor lysC se denomina a partir de
ahora en el presente documento como "ppc de tipo salvaje y elevada
expresión".
El ppc de tipo salvaje y elevada
expresión obtenido más arriba se amplificó mediante PCR para
insertarlo en un vector que tiene un origen de replicación que se
puede replicar de manera autónoma en bacterias coreneiformes
diferente a Brevi.-ori. Al igual que con los cebadores de ADN, un
oligonucleótido que se corresponde con la porción del promotor del
lysC (SEC. DE ID. Nº: 7), que se había sintetizado sobre la
base de una secuencia de lysC conocida para
Corynebacterium glutamicum (ver Molecular
Microbiology, 5(5), 1197-1204
(1991); Mol. Gen. Genet., 224, 317-324
(1990)), y un oligonucleótido que se corresponde con la porción
ppc (SEC. DE ID. Nº: 8), que se había sintetizado sobre la
base de una secuencia de ppc conocida para Corynebacterium
glutamicum (ver O'Regan, M. y col., Gene, 77,
237-251 (1989)). Se diseñaron estos cebadores de
forma que un fragmento de aproximadamente 3.150 pb que contiene el
ppc de tipo salvaje y elevada expresión se pudiera
amplificar, y que una porción terminar del fragmento de ADN
amplificado se pudiera digerir mediante el enzima de restricción
KpnI. La síntesis de ADN y la PCR se llevaron a cabo de la
misma forma que se ha descrito en Ejemplo 1.
Un vector de clonación para bacterias
coreneiformes, pVK7, que se había construido de nuevo, se usó como
vector para la introducción del ppc de tipo salvaje y elevada
expresión en las bacterias coreneiformes. Se construyó el pVK7
enlazando el pHSG299, un vector de E. coli (Km^{r};
Takeshita, S. y col., Gene, 61, 63-74
(1987)) con pAM330, un plásmido críptico de Brevibacterium
lactofermentum tal como se describe más adelante. El pHSG299 se
digirió con un enzima de restricción dando como resultado un
emplazamiento de rotura, AvaII (producido por Takara Shuzo),
se enromó mediante T4 ADN polimerasa, y se ligó con pAM330 que se
había digerido con HindIII (producido por Takara Shuzo) y
enromado mediante T4 ADN polimerasa. Dependiendo de la orientación
del pAM330 insertado en pHSG299, los dos plásmidos obtenidos se
designaron como pVK6 y pVK7, y se usó el pVK7 en los siguientes
experimentos. El pVK7 se puede replicar de manera autónoma tanto en
E. coli como en Brevibacterium lactofermentum y tiene
múltiples emplazamientos de clonación que se originan a partir de
pHSG299 y lacZ'. El procedimiento de construcción de los pVK6 y pVK7
se muestra en la Fig. 5.
Un fragmento de gen amplificado de
aproximadamente 3.150 pb se confirmó mediante electroforesis en gel
de agarosa, ay a continuación, el fragmento extraído del gel se
purificó mediante un procedimiento ordinario y se digirió con el
enzima de restricción KpnI (producido por Takara Shuzo). El
fragmento de ADN se ligó con pVK7 que se había digerido con el
enzima de restricción KpnI. El plásmido preparado se designó
como pPwm. El procedimiento de construcción del pPwm se muestra en
la Fig. 6.
Un plásmido que contiene los mutantes
lysC, lysA, y un origen de replicación para bacterias
coreneiformes se preparó a partir del plásmido p399AK9B que contiene
los mutantes lysC y Brevi.-ori y el plásmido p299LYSA que
contiene el lysA. El p299LYSA se digirió con los enzimas de
restricción BamHI y KpnI (ambos producidos por Takara
Shuzo) y los extremos se enromaron. Se llevó a cabo la formación de
los extremos romos mediante un ADN Blunting kit (producido por
Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado. El fragmento
de ADN obtenido se ligó con p399AK9B que se había digerido con
SalI y los extremos se enromaron. Así, se preparó un plásmido
que contenía los mutantes lysC y lysA que se puede
replicar de manera autónoma bacterias coreneiformes, y se designó
como pCL. El procedimiento de construcción del pCL se muestra en la
Fig. 7.
Ejemplo comparativo
1
Se obtuvieron como sigue los genes asociados con
la biosíntesis de la L-lisina diferentes a
lysC, lysA y ppc: dapA (gen de la
dihidropicolinato sintasa), dapB (gen de la dihidropicolinato
reductasa) y ddh (gen de la diaminopimelato
dehidrogenasa).
Se usó una cepa de Brevibacterium
lactofermentum ATCC 13869 de tipo salvaje como donante de ADN
cromosómico. El ADN cromosómico se preparó a partir de la ATCC cepa
13869 de acuerdo con un procedimiento ordinario. Se amplificó un
fragmento de ADN que contiene la dapA a partir del ADN
cromosómico de acuerdo con PCR. Al igual que con los cebadores de
ADN usados para amplificación, se sintetizaron ADN' de
23-mers con la secuencia de nucleótidos que se
muestra en las SEC. DE ID. NROS.: 21 y 22 en el Listado de
Secuencias, de forma respectiva, con el fin de amplificar una región
de aproximadamente 1,5 kb que codifica el DDPS sobre la base de una
secuencia conocida de Corynebacterium glutamicum (ver
Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); Nº
de acceso EMBL Nº X53993). La síntesis de ADN y la PCR se llevaron a
cabo de la misma forma que se ha descrito en Ejemplo 1. El pCR1000
(producido por Invitrogen, ver Bio/Technology, 9,
657-663 (1991)) se usó como vector de clonación para
el fragmento de gen amplificado de 1.411 pb, y se ligó con el
fragmento dapA amplificado. Se llevó a cabo el enlace con el
ADN mediante el kit de enlace de ADN l (producido por Takara Shuzo)
de acuerdo con un procedimiento diseñado. Así, se construyó un
plásmido en el que el fragmento dapA de 1.411 pb amplificado a
partir del cromosoma de Brevibacterium lactofermentum se ligó
con pCR1000. El plásmido, que se obtiene tal como se describe más
arriba, que contenía dapA originado a partir de ATCC 13869, se
denominó como pCRDAPA.
Una cepa transformante AJ13106 obtenida mediante
introducción de PCRDAPA en la cepa E. coli JM109 está
depositada de forma internacional desde el 26 de mayo de 1995 en el
National Institute of Bioscience and Human Technology de la Agency
of Industrial Science and Technology del Ministry of International
Trade and Industry (1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, 305 Japón) basado en el Tratado de
Budapest bajo el número de acceso FERM PB-5113.
Se introdujo Brevi.-ori en el pCRDAPA preparado
para construir un plásmido que transportaba dapA que se puede
replicar de manera autónoma en bacterias coreneiformes. El pHK4 se
digirió con los enzimas de restricción KpnI y BamHI
(producido por Takara Shuzo), y se enromaron los extremos rotos. Se
llevó a cabo la formación de los extremos romos mediante un ADN
Blunting kit (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un
procedimiento diseñado. Tras la formación de los extremos enromados,
se ligó un enlazante SmaI fosforilado kit (producido por
Takara Shuzo) para llevar a cabo una modificación de forma que el
fragmento correspondiente a la porción Brevi.-ori se pudiera
recortar del pHK4 mediante digestión únicamente con SmaI, y
el fragmento de Brevi.-ori ADN generado se ligó con el pCRDAPA que
se había digerido también con SmaI para preparar un plásmido
que contiene la dapA que se puede replicar de manera autónoma
en bacterias coreneiformes. Este plásmido se designó como pDPSB. El
procedimiento de construcción del pDPSB(Kmr) se muestra en la
Fig. 8.
Se usó una cepa de Brevibacterium
lactofermentum ATCC 13869 de tipo salvaje como donante de ADN
cromosómico. El ADN cromosómico se preparó a partir de la ATCC cepa
13869 de acuerdo con un procedimiento ordinario. Se amplificó un
fragmento de ADN que contiene la dapB a partir del ADN
cromosómico de acuerdo con PCR. Al igual que con los cebadores de
ADN usados para amplificación, se sintetizaron ADN de
23-mers con la secuencia de nucleótidos que se
muestra en las SEC. DE ID. NROS.: 19 y 20 en el Listado de
Secuencias, de forma respectiva, con el fin de amplificar una región
de aproximadamente 2,0 kb que codifica el DDPR sobre la base de una
secuencia conocida de Brevibacterium lactofermentum (ver
Journal of Bacteriology, 175(9),
2743-2749 (1993)). La síntesis de ADN y la PCR se
llevaron a cabo de la misma forma que se ha descrito en Ejemplo 1.
El pCR-Script (producido por Invitrogen) se usó como
vector de clonación para el fragmento de gen amplificado de 2.001
pb, y se ligó con el fragmento dapB amplificado. Así, se
construyó un plásmido en el que el fragmento dapB de 2.001 pb
amplificado a partir del cromosoma de Brevibacterium
lactofermentum se ligó con pCR-Script. El
plásmido, que se obtiene tal como se describe más arriba, que
contenía dapB originado a partir de ATCC 13869, se denominó como
pCRDAPB. Una cepa transformante AJ13107 obtenida mediante
introducción de PCRDAPB en la cepa E. coli JM109 está
depositada desde el 26 de mayo de 1995 de forma internacional en el
National Institute of Bioscience and Human Technology de la Agency
of Industrial Science and Technology del Ministry of International
Trade and Industry (1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, 305 Japón) basado en el Tratado de
Budapest bajo el número de acceso FERM PB-5114.
Se extrajo un fragmento de 1.101 pb que contiene
el gen estructural de DDPR mediante la digestión de pCRDAPB con
EcoRV y SphI. Este fragmento se ligó con pHSG399 que
se había digerido con HincII y SphI para preparar un
plásmido. El plásmido preparado se designó como p399DPR.
Se introdujo Brevi.-ori en el p399DPR preparado
para construir un plásmido que transportaba dapB que se puede
replicar de manera autónoma en bacterias coreneiformes. El pHK4 se
digirió con el enzima de restricción KpnI (producido por
Takara Shuzo), y se enromaron los extremos rotos. Se llevó a cabo la
formación de los extremos romos mediante un ADN Blunting kit
(producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento
diseñado. Tras la formación de los extremos enromados, se ligó un
enlazante BamHI fosforilado kit (producido por Takara Shuzo)
para llevar a cabo una modificación de forma que el fragmento
correspondiente a la porción Brevi.-ori se pudiera recortar del pHK4
mediante digestión únicamente con BamHI, y el fragmento de
Brevi.-ori ADN generado se ligó con el p399DPR que se había digerido
también con BamHI para preparar un plásmido que contiene la
dapB que se puede replicar de manera autónoma en bacterias
coreneiformes. Este plásmido se designó como pDPRB. El procedimiento
de construcción del pDPRB se muestra en la Fig. 9.
Se obtuvo un gen ddh mediante la
amplificación del gen ddh a partir de ADN cromosómico de
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 de acuerdo con el
procedimiento de PCR mediante el uso de dos cebadores de
oligonucleótido (SEC. DE ID. NROS.: 23, 24) preparados sobre la base
de una secuencia de nucleótidos conocida de un gen ddh de
Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. y col., Nucleic
Acids Res., 15, 3917 (1987)). El fragmento obtenido de
ADN amplificado se digirió con EcoT22I y AvaI, y se
enromaron los extremos rotos. Tras esto, el fragmento se insertó en
un emplazamiento a SmaI del pMW119 para obtener el plásmido
PDDH.
A continuación, el pDDH se digirió con
SalI y EcoRI, seguido por la formación de extremos
romos. Tras esto, el fragmento obtenido se ligó con el pUC18 que se
había digerido con SmaI. El plásmido así obtenido se denominó
pUC18DDH.
Se introdujo Brevi.-ori en el pUC18DDH preparado
para construir un plásmido que transportaba ddh que se puede
replicar de manera autónoma en bacterias coreneiformes. El pHK4 se
digirió con los enzimas de restricción KpnI y BamHI, y
se enromaron los extremos rotos. Se llevó a cabo la formación de los
extremos romos mediante un ADN Blunting kit (producido por Takara
Shuzo) de acuerdo con un procedimiento diseñado. Tras la formación
de los extremos enromados, se ligó un enlazante PstI
fosforilado (producido por Takara Shuzo) para llevar a cabo una
modificación de forma que se insertó en el emplazamiento PstI de
pHSG299. El plásmido construido tal como se describe más arriba se
denominó pPK4. A continuación, el pUC18DDH se digirió con
XbaI y KpnI, y el fragmento generado se ligó con el
pPK4 que se había digerido con KpnI y XbaI. Así, se
construyó un plásmido que contiene la ddh que se puede
replicar de manera autónoma en bacterias coreneiformes. Este
plásmido se designó como pPK4D. El procedimiento de construcción del
pPK4D se muestra en la Fig. 10.
Ejemplo comparativo
2
Se construyó un plásmido que comprendía los
mutantes lysC, dapA, y un origen de replicación de
bacterias coreneiformes a partir del plásmido pCRDAPA que comprende
dapA y el plásmido p399AK9B que comprenden los mutantes lysC
y Brevi.-ori. El p399AK9B se digirió completamente con SalI,
y a continuación se enromaron los extremos rotos. Se ligó un
enlazante EcoRI al anterior para construir un plásmido en el
que el emplazamiento SalI estaba modificado en un
emplazamiento EcoRI. El plásmido obtenido se denominó como
p399AK9BSE. Los mutantes lysC y Brevi.-ori se recortaron en
un único fragmento tras la digestión parcial del p399AK9BSE con
EcoRI. Este fragmento se ligó con el pCRDAPA que se había
digerido con EcoRI. El plásmido obtenido se denominó como
pCRCAB. El plásmido se puede replicar de manera autónoma en E.
coli y bacterias coreneiformes, y proporciona a un huésped
resistencia la kanamicina, el plásmido comprende una combinación de
los mutantes lysC y dapA. El procedimiento de
construcción del pCRCAB se muestra en la Fig. 11.
Se construyó un plásmido que comprendía los
mutantes lysC, a partir del plásmido p399AK9 que tiene el
lysC mutante y el plásmido p399DPR que comprenden dapB. Un
fragmento de 1.101 pb que contiene el gen estructural de DDPR se
extrajo mediante digestión de p399DPR con EcoRV y
SphI. Este fragmento se con p399AK9 que se había digerido con
SalI y a continuación los extremos se enromaron, y después se
digirió con Sph para construir un plásmido que comprende una
combinación de lysC y dapB mutantes. Este plásmido se
denominó como p399AKDDPR.
A continuación, se introdujo Brevi.-ori en el
p399AKDDPR obtenido. El plásmido pHK4 que contenía Brevi.-ori se
digirió con el enzima de restricción KpnI (producido por
Takara Shuzo), y se enromaron los extremos rotos. Se llevó a cabo la
formación de los extremos romos mediante un ADN Blunting kit
(producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento
diseñado. Tras la formación de los extremos enromados, se ligó un
enlazante BamHI fosforilado (producido por Takara Shuzo) para
llevar a cabo una modificación de forma que el fragmento
correspondiente a la porción Brevi.-ori se pudiera recortar del pHK4
mediante digestión únicamente con BamHII Este plásmido se
digirió con BamHI, y el fragmento de Brevi.-ori ADN generado
se ligó con el p399AKDDPR que se había digerido también con
BamHI para preparar un plásmido que contiene los mutantes
lysC y dapB que se puede replicar de manera autónoma
en bacterias coreneiformes. Ele plásmido construido se designó como
pCB. El procedimiento de construcción del pCB se muestra en la Fig.
12.
Se construyó un plásmido que comprendía los
mutantes lysC, ddh, y un origen de replicación de
bacterias coreneiformes a partir del plásmido pUC18DDH que comprende
ddh y el plásmido p399AK9B que comprenden los mutantes
lysC y Brevi.-ori. El pUC18DDH se digirió con el enzima de
restricción EcoRI (producido por Takara Shuzo), se enromaron
los extremos rotos y se ligó un polienlazante SalI al anterior para
cambiar un emplazamiento EcoRI a un emplazamiento
SalI. El plásmido obtenido se digirió con SalI para
obtener un fragmento de ADN que contiene la ddh.
A continuación el p399AK9B se digirió con el
enzima de restricción SalI y se ligó con el fragmento de ADN
que contiene la ddh. Así, se preparó un plásmido que contiene
los mutantes lysC, ddh y Brevi.-ori que se puede
replicar de manera autónoma en bacterias coreneiformes, y se
denominó como pCD. El procedimiento de construcción del pCD se
muestra en la Fig. 13.
Los plásmidos que comprenden los genes de la
biosíntesis de la L-lisina construidos como se
describen más arriba, nominalmente p399AK9B (Cm^{r}), pLYSAB
(Cm^{r}), pPwm (Km^{r}), pCRCAB (Km^{r}), pCB (Cm^{r}), pCD
(Cm^{r}), y pCL (Cm^{r}), se introdujeron en una bacteria
productora de L-lisina AJ11082 (NRRL
B-11470) de Brevibacterium lactofermentum de
forma respectiva. La cepa AJ11082 tiene la propiedad de resistencia
a AEC. Los plásmidos se introdujeron de acuerdo con un procedimiento
de pulso eléctrico (Sugimoto y col., Solicitud de Patente Japonesa
abierta a consulta Nº 2-207791). Se seleccionaron
transformantes basados en marcadores de resistencia a fármacos
contenidos por los plásmidos respectivos. Se seleccionaron los
transformantes en un medio completo que contenía 5 \mug/ml of
cloranfenicol, cuando se había introducido un plásmido que contiene
el gen de la resistencia al cloranfenicol, o se los transformantes
en un medio completo que contenía 25 \mug/ml de kanimacina cuando
se había introducido un plásmido que contiene el gen de la
resistencia a la kanimacina.
Una cepa con los mutantes lysC y
lysA se mejoró entre los transformantes obtenidos, se
introdujo pPwm (Km^{r}) para obtener una cepa en la que se
estimulaban los tres mutantes mutante lysC, lysA y
ppc (AJ11082/pCL/pPwm). Los transformantes se seleccionaron
en un medio completo que contenía 5 \mug/ml de cloranfenicol o 25
\mug/ml de kanimacina.
Cada uno de los transformantes obtenidos en el
Ejemplo 5 se cultivó en un medio de producción de
L-lisina para evaluar la productividad de
L-lisina. El medio de de producción de
L-lisina tenía la siguiente composición:
Los siguientes componentes, excepto el carbonato
de calcio, se disolvieron (en 1 L), y el pH se ajustó a 8,0 con KOH.
El medio se esterilizó a 115ºC durante 15 minutos, y se añadió
posteriormente a lo anterior el carbonato de calcio (50 g) en estado
seco que se había esterilizado por separado en aire caliente
| Glucosa | 100 g |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 55 g |
| KH_{2}PO_{4} | 1 g |
| MgSO_{4}7\cdotH_{2}O | 1 g |
| Biotina | 500 \mug |
| iamina | 2000 \mug |
| FeSO_{4}\cdot7H_{2}O | 0,01 g |
| MnSO_{4}\cdot7H_{2}O | 0,01 g |
| Nicotinamida | 5 mg |
| Hidrolizado de proteína (Mamenou) | 30 ml |
| Carbonato de calcio | 50 g |
Cada uno de los diferentes tipos de
transformante y cepas padre se inocularon al medio con la
composición que se describe más arriba para llevar a cabo el cultivo
a 31,5ºC con agitación recíproca. La cantidad de
L-lisina producida tras 40 ó 72 horas de cultivo se
muestra en la Tabla 1. En la tabla, lysC* representa el
lysC mutante.
Tal como se muestra más arriba, los mutantes
lysC, lysA, o ppc se estimularon de manera
separada, o cuando el mutante lysC se estimuló en compañía de
dapA o ddh, la cantidad de L-lisina
producida fue mayor que o equivalente la que produce la cepa padre
tras 72 horas de cultivo, sin embargo, la cantidad de
L-lisina producida es inferior a la producida por la
cepa pariente tras 40 horas de cultivo. Nominalmente, la velocidad
de producción de L-lisina disminuyó en cultivo
durante un periodo de tiempo corto. De manera similar, cuando los
mutantes lysC y ddh se estimularon en combinación, la
cantidad de L-lisina producida es inferior a la
producida por la cepa pariente tras 40 horas y 72 horas de cultivo.
Por el contrario, en el caso de la cepa en la que se estimuló el
dapB junto con el lysC mutante, se mejoró el
crecimiento, se restauró con éxito la velocidad de producción de
L-lisina en el periodo de cultivo a corto plazo, y
la cantidad acumulada de L-lisina en el periodo de
cultivo a largo plazo. En el caso de la cepa en la que los tres
mutantes lysC, lysA, y ppc se estimularon de
forma conjunta, la productividad de L-lisina mejoró
de manera adicional.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: AJINOMOTO CO., LTD
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-LISINA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP):
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn, versión #1.0, versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: JP 8-325658
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 5-DIC-1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE LA SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGGAATTCA ATCTTACGGC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1643 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1643 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 217..1482
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 421 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1643 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 964...1482
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 172 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3579 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 533..2182
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2188..3522
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 550 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 445 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 12
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGTCGGTCA GCCTGACGTC GAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTTGGTGTCGAAAGTGCACACC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3533 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: ATCC 13869
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 321..3077
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 919 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 16
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGAGGTAC CACCTGTCAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATCCAGGT ACCGGCAACC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATCCCCAA TCGATACCTG GAA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCTAAGTA TGCATCTCGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE IDE. Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: diferente de un ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des = "ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: sí
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDE. Nº: 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCCCCTCGA GCTAAATTAG
\hfill20
| Referencia: | 72 565 (m2) wa | |
| Fecha: | 20.03.1998 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: AJINOMOTO CO., LTD
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 15-1, Kyobashi 1-chome, Chuo-ku
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Tokyo
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Japón
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 104
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-LISINA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn, versión #1.0, versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 97 121 444.0
Claims (6)
1. Un ADN recombinante que se puede
replicar de manera autónoma en células de bacterias coreneiformes,
que comprende una secuencia de ADN que codifica una aspartokinasa en
la que se ha insensibilizado de forma sustancial la inhibición por
retroalimentación debida a L-lisina y
L-treonina, una secuencia de ADN que codifica una
diaminopimelato decarboxilasa, y una secuencia de ADN que codifica
una fosfoenolpiruvato carboxilasa.
2. El ADN recombinante de acuerdo con
la reivindicación 1, en el que dicha aspartokinasa en la que se ha
insensibilizado de forma sustancial la inhibición por
retroalimentación debida a L-lisina y
L-treonina es una aspartokinasa que está originada
en bacterias coreneiformes, y en el que dicha aspartokinasa es una
aspartokinasa mutante en la que el residuo de aminoácido que
corresponde al residuo de alanina número 279 tal como se cuenta
desde su extremo N-terminal en la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 5 se cambia por un
residuo de aminoácido diferente de la alanina y diferente de un
aminoácido ácido en su subunidad \alpha, y un el residuo de
aminoácido que corresponde al residuo de alanina número 30 tal como
tal como se cuenta desde su extremo N-terminal en la
secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 7 se
cambia por un residuo de aminoácido diferente de la alanina y
diferente de un aminoácido ácido en su subunidad \beta.
3. El ADN recombinante de acuerdo con
la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN que codifica
la diaminopimelato decarboxilasa codifica una secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 12, o una secuencia
de aminoácidos que es sustancialmente la misma que la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC. DE ID. Nº: 12.
4. Una bacteria corineiforme que
alberga una aspartokinasa en la que se ha insensibilizado de forma
sustancial la inhibición por retroalimentación debida a
L-lisina y L-treonina, y que
comprende una secuencia de ADN mejorada que codifica una
diaminopimelato decarboxilasa, y una secuencia de ADN mejorada que
codifica una fosfoenolpiruvato carboxilasa.
5. La bacteria corineiforme de acuerdo
con la reivindicación 4, transformada mediante la introducción del
ADN recombinante tal como se ha definido en la reivindicación 1.
6. Un procedimiento para producir
L-lisina que comprende las etapas de cultivar dicha
bacteria corineiforme tal como se ha definido en la reivindicación 4
en un medio apropiado para permitir que la L-lisina
se produzca y acumule en un cultivo de la bacteria, y recoger la
L-lisina del cultivo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-325658 | 1996-12-05 | ||
| JP32565896A JP4075087B2 (ja) | 1996-12-05 | 1996-12-05 | Ｌ−リジンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2273356T3 true ES2273356T3 (es) | 2007-05-01 |
Family
ID=18179283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97121444T Expired - Lifetime ES2273356T3 (es) | 1996-12-05 | 1997-12-05 | Procedimiento para producir l-lisina. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6221636B1 (es) |
| EP (1) | EP0857784B1 (es) |
| JP (1) | JP4075087B2 (es) |
| CN (1) | CN1161470C (es) |
| BR (1) | BRPI9706058B1 (es) |
| DE (1) | DE69736699T2 (es) |
| DK (1) | DK0857784T3 (es) |
| ES (1) | ES2273356T3 (es) |
| HU (1) | HU224409B1 (es) |
| PL (1) | PL190206B1 (es) |
| SK (1) | SK285146B6 (es) |
Families Citing this family (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4075087B2 (ja) | 1996-12-05 | 2008-04-16 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
| WO2000056859A1 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-amino acid |
| JP2003135066A (ja) * | 1999-03-19 | 2003-05-13 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−リジンの製造法 |
| RU2368659C2 (ru) * | 1999-04-09 | 2009-09-27 | Адзиномото Ко., Инк. | Бактерия, продуцирующая l-аминокислоту, и способ получения l-аминокислоты |
| US20030049804A1 (en) | 1999-06-25 | 2003-03-13 | Markus Pompejus | Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins |
| US6599732B1 (en) | 1999-06-29 | 2003-07-29 | Archer-Daniels-Midland Company | Regulation of carbon assimilation |
| EP1196611A1 (en) * | 1999-06-29 | 2002-04-17 | Archer-Daniels-Midland Company | Regulation of carbon assimilation |
| JP2003169674A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-06-17 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−リジンの製造法 |
| JP2003144161A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2003180355A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-07-02 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2003144160A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP1197555B1 (en) | 1999-07-02 | 2006-04-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Dna encoding sucrose pts enzyme ii |
| JP2003180348A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-07-02 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| TWI289604B (en) | 1999-10-04 | 2007-11-11 | Ajinomoto Kk | neform bacteria Genes for a heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic cory |
| ATE417094T1 (de) * | 1999-12-24 | 2008-12-15 | Ajinomoto Kk | Verfahren zur herstellung von l-aminosäure |
| US6927046B1 (en) | 1999-12-30 | 2005-08-09 | Archer-Daniels-Midland Company | Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria |
| CA2402186C (en) * | 2000-03-09 | 2011-04-05 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins |
| KR100397423B1 (ko) * | 2001-02-13 | 2003-09-13 | 씨제이 주식회사 | Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 |
| US7368266B2 (en) | 2001-02-13 | 2008-05-06 | Cj Corporation | Method for L-threonine production |
| US20050255568A1 (en) * | 2003-05-30 | 2005-11-17 | Bailey Richard B | Methods and compositions for amino acid production |
| DE102005032429A1 (de) | 2005-01-19 | 2006-07-20 | Degussa Ag | Allele des mqo-Gens aus coryneformen Bakterien |
| DE102005013676A1 (de) | 2005-03-24 | 2006-09-28 | Degussa Ag | Allele des zwf-Gens aus coryneformen Bakterien |
| DE102005023829A1 (de) | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Degussa Ag | Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien |
| JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP1881076A1 (en) * | 2006-07-17 | 2008-01-23 | Evonik Degussa GmbH | Method for producing L-amino acids |
| EP3170889A1 (en) | 2006-09-15 | 2017-05-24 | CJ Cheiljedang Corporation | A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same |
| KR100838038B1 (ko) * | 2006-12-29 | 2008-06-12 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법 |
| KR100838035B1 (ko) * | 2006-12-29 | 2008-06-12 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법 |
| KR100830826B1 (ko) * | 2007-01-24 | 2008-05-19 | 씨제이제일제당 (주) | 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법 |
| JP2010226956A (ja) * | 2007-07-23 | 2010-10-14 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−リジンの製造法 |
| JP5526785B2 (ja) | 2008-01-23 | 2014-06-18 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| KR100930203B1 (ko) | 2008-01-28 | 2009-12-07 | 씨제이제일제당 (주) | 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법 |
| KR100987281B1 (ko) | 2008-01-31 | 2010-10-12 | 씨제이제일제당 (주) | 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법 |
| KR101126041B1 (ko) * | 2008-04-10 | 2012-03-19 | 씨제이제일제당 (주) | 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법 |
| US8932861B2 (en) | 2008-04-10 | 2015-01-13 | Cj Cheiljedang Corporation | Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism |
| JP2010142200A (ja) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−リジンの製造法 |
| JPWO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2013-01-10 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2012196144A (ja) | 2009-08-03 | 2012-10-18 | Ajinomoto Co Inc | ビブリオ属細菌を用いたｌ−リジンの製造法 |
| JP2012223091A (ja) | 2009-08-25 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| KR101226384B1 (ko) | 2010-03-05 | 2013-01-25 | 씨제이제일제당 (주) | 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법 |
| JP5719434B2 (ja) * | 2010-06-15 | 2015-05-20 | パク グアン インダストリアル カンパニー リミテッドＰａｉｋ Ｋｗａｎｇ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． | 微生物を用いたアスパラギン酸系アミノ酸の生産方法 |
| EP2479279A1 (de) | 2011-01-20 | 2012-07-25 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren |
| MY171302A (en) | 2011-12-21 | 2019-10-08 | Cj Cheiljedang Corp | Method for producing l-lysine using microorganisms having ability to produce l-lysine |
| EP2628792A1 (de) | 2012-02-17 | 2013-08-21 | Evonik Industries AG | Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität |
| ES2689754T3 (es) | 2012-08-20 | 2018-11-15 | Evonik Degussa Gmbh | Procedimiento para la preparación fermentativa de L-aminoácidos utilizando cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae |
| DE102014208199A1 (de) | 2014-04-30 | 2015-11-05 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums |
| EP2940143B1 (de) | 2014-04-30 | 2020-02-05 | Evonik Operations GmbH | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums |
| EP2940039A1 (de) | 2014-04-30 | 2015-11-04 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren in Corynebakterien unter Verwendung eines Glycin spaltenden Systems |
| US11034985B2 (en) | 2015-11-27 | 2021-06-15 | Evonik Operations Gmbh | Method for producing L-methionine |
| US11242545B2 (en) | 2016-09-01 | 2022-02-08 | Ningxia Eppen Biotech Co., Ltd | Corynebacterium for producing L-lysine by fermentation |
| KR102011994B1 (ko) * | 2017-06-30 | 2019-08-20 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법 |
| CN112969797A (zh) * | 2018-09-07 | 2021-06-15 | 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 | 工程化棒状杆菌属菌株 |
| CN110804602B (zh) * | 2019-11-18 | 2021-01-29 | 江南大学 | 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用 |
| CN116262916A (zh) * | 2021-12-14 | 2023-06-16 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种重组微生物及其构建方法与应用 |
| CN114292315B (zh) * | 2021-12-31 | 2024-09-06 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | ppc突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4861722A (en) * | 1983-08-24 | 1989-08-29 | Ajinomoto Company, Inc. | Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-lysine |
| JPH0746994B2 (ja) * | 1984-10-04 | 1995-05-24 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| GB2223754B (en) | 1988-09-12 | 1992-07-22 | Degussa | Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase |
| DE3908201A1 (de) | 1989-03-14 | 1990-09-27 | Degussa | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin |
| JP3473042B2 (ja) * | 1992-04-28 | 2003-12-02 | 味の素株式会社 | 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子 |
| JPH07155184A (ja) * | 1993-12-08 | 1995-06-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 |
| DK0841395T3 (da) * | 1995-06-07 | 2012-01-09 | Ajinomoto Kk | Fremgangsmåde til at fremstille L-lysin |
| EP0756007A3 (en) * | 1995-06-30 | 1997-10-29 | Ajinomoto Kk | Gene-marking process with artificial transposon |
| SK285201B6 (sk) | 1996-12-05 | 2006-08-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7 |
| JP4075087B2 (ja) | 1996-12-05 | 2008-04-16 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
| DE10031999A1 (de) | 1999-09-09 | 2001-04-19 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| DE19943587A1 (de) | 1999-09-11 | 2001-03-15 | Degussa | Neue für das dapF-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
-
1996
- 1996-12-05 JP JP32565896A patent/JP4075087B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-12-03 SK SK1635-97A patent/SK285146B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-12-05 DK DK97121444T patent/DK0857784T3/da active
- 1997-12-05 US US08/985,916 patent/US6221636B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-05 PL PL97323545A patent/PL190206B1/pl unknown
- 1997-12-05 BR BRPI9706058A patent/BRPI9706058B1/pt active IP Right Grant
- 1997-12-05 CN CNB971208190A patent/CN1161470C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-05 EP EP97121444A patent/EP0857784B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-05 DE DE69736699T patent/DE69736699T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-05 ES ES97121444T patent/ES2273356T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-05 HU HU9702361A patent/HU224409B1/hu active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP9702361A3 (en) | 2002-12-28 |
| EP0857784B1 (en) | 2006-09-20 |
| JPH10165180A (ja) | 1998-06-23 |
| EP0857784A3 (en) | 2002-10-16 |
| US6221636B1 (en) | 2001-04-24 |
| PL323545A1 (en) | 1998-06-08 |
| BRPI9706058B1 (pt) | 2015-11-03 |
| HU9702361D0 (en) | 1998-03-02 |
| DK0857784T3 (da) | 2007-01-15 |
| HUP9702361A2 (hu) | 1999-06-28 |
| CN1161470C (zh) | 2004-08-11 |
| JP4075087B2 (ja) | 2008-04-16 |
| PL190206B1 (pl) | 2005-11-30 |
| SK163597A3 (en) | 1998-07-08 |
| DE69736699T2 (de) | 2007-09-20 |
| HU224409B1 (hu) | 2005-08-29 |
| CN1187539A (zh) | 1998-07-15 |
| DE69736699D1 (de) | 2006-11-02 |
| SK285146B6 (sk) | 2006-07-07 |
| BR9706058A (pt) | 1999-10-05 |
| EP0857784A2 (en) | 1998-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2273355T3 (es) | Procedimiento de produccion de l - lisina. | |
| EP0857784B1 (en) | Method for producing L-lysine | |
| EP0811682B1 (en) | Method of producing L-lysine | |
| ES2373863T3 (es) | Procedimiento de producción de l-lisina. | |
| JP4168463B2 (ja) | Ｌ−リジンの製造法 | |
| JPWO1996040934A1 (ja) | Ｌ−リジンの製造法 |