PL190206B1 - Zrekombinowany DNA replikujący się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej, bakteria maczugowata oraz sposób wytwarzania L-lizyny - Google Patents

Zrekombinowany DNA replikujący się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej, bakteria maczugowata oraz sposób wytwarzania L-lizyny

Info

Publication number
PL190206B1
PL190206B1 PL97323545A PL32354597A PL190206B1 PL 190206 B1 PL190206 B1 PL 190206B1 PL 97323545 A PL97323545 A PL 97323545A PL 32354597 A PL32354597 A PL 32354597A PL 190206 B1 PL190206 B1 PL 190206B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ala
gene
val
lysine
leu
Prior art date
Application number
PL97323545A
Other languages
English (en)
Other versions
PL323545A1 (en
Inventor
Atsushi Hayakawa
Masakazu Sugimoto
Yasuhiko Yoshihara
Tsuyoshi Nakamatsu
Original Assignee
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=18179283&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL190206(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Kk
Publication of PL323545A1 publication Critical patent/PL323545A1/xx
Publication of PL190206B1 publication Critical patent/PL190206B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

1. Zrekombinowany DNA replikujacy sie autonomicznie w komórkach bakterii ma- czugowatej, zawierajacy sekwencje DNA kodujaca aspartokinaze charakteryzujaca sie zna- czacym zmniejszeniem czulosci hamowania zwrotnego przez L-lizyne 1 L-treonine oraz sekwencje DNA kodujaca dekarboksylaze diaminopimelinowa, znamienny tym, ze aspar- tokinaza charakteryzujaca sie znaczacym zmniejszeniem czulosci hamowania zwrotnego przez L-lizyne i L-treonine jest zmutowana aspartokinaza pochodzaca z bakterii maczugo- watej, w której reszta aminokwasowa odpowiadajaca 279 reszcie alaniny (liczac od konca N czasteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 5 jest zmieniona na reszte treoninowa w pod- jednostce alfa, zas reszta aminokwasowa odpowiadajaca 30 reszcie alaniny (liczac od konca N czasteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 7 jest zmieniona na reszte treoninowa w pod- PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zrekombinowany DNA replikujący się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej, bakteria maczugowata oraz sposób wytwarzania L-lizyny.
L-lizyna, wykorzystywana jako dodatek paszowy, wytwarzana jest zazwyczaj sposobem fermentacyjnym z użyciem zmutowanych szczepów bakterii maczugowatych wytwarzających L-lizynę Obecnie znane są różne bakterie wytwarzające L-lizynę, uzyskane w wyniku sztucznej mutagenezy szczepów dzikich, należących do korynebakterii (bakterii maczugowatych)
190 206
Dla bakterii maczugowatych ujawniono plazmid będący wektorem ulegającym, autonomicznej replikacji w komórkach bakteryjnych i posiadający gen markerowy warunkujący oporność na antybiotyk (patent US nr 4 514 502) i sposób wprowadzania genu do komórek bakteryjnych (np. japońskie zgłoszenie patentowe Nr 2-207791) dla bakterii maczugowatych. Ujawniono również możliwość hodowania bakterii wytwarzających L-treoninę lub L-izoleucynę, sposobami podanymi powyżej (patent US nr 4 452 890 i nr 4 442 208). Podobnie jak w przypadku hodowania bakterii wytwarzających L-lizynę znany jest sposób, w którym gen uczestniczący w biosyntezie L-lizyny wprowadzony jest do wektora plazmidowego w celu powielenia genu w komórkach bakteryjnych (np. japońskie zgłoszenie patentowe Nr 56-160997).
Znane geny uczestniczące w biosyntezie L-lizyny obejmują, na przykład, gen kodujący reduktazę kwasu dihydrodipikolinowego (japońskie zgłoszenie patentowe Nr 7-75578) i gen kodujący dehydrogenazę kwasu diaminopimelinowego (Ishino, S. i wsp., Nucleic Acids Res. 15, 3917 (1987), dla których gen uczestniczący w biosyntezie L-lizyny został sklonowany, jak również gen kodujący karboksylazę fosfoenolopirogronianową (japońskie zgłoszenie patentowe Nr 6-55149) i gen kodujący dekarboksylazę diaminopimelinową (japońskie zgłoszenie patentowe Nr 60-62994), dla których amplifikacja genu wpływa na produktywność L-lizyny.
Co do enzymów uczestniczących w biosyntezie L-lizyny, znany jest przypadek enzymu podlegającego hamowaniu zwrotnemu, gdy enzym występuje w formie dzikiej. W tym przypadku produktywność L-lizyny można polepszyć wprowadzając gen kodujący wspomniany enzym posiadający mutacje zmniejszające czułość hamowania zwrotnego. Przykłady tak działających enzymów obejmują na przykład gen aspartokinazy (publikacja WO 94/25605).
Jak to przedstawiono powyżej, pewne sukcesy osiągnięto sposobem amplifikacji genów systemu biosyntezy L-lizyny lub poprzez wprowadzanie genów zmutowanych. Na przykład bakteria maczugowata, niosąca zmutowany gen aspartokinazy ze zmniejszoną czułością hamowania łącznego przez lizynę i treoninę, wytwarza znaczące ilości L-lizyny (około 25 g/L). Jednakże bakteria ta charakteryzuje się obniżonym tempem wzrostu, w porównaniu z bakterią niosącą nie zmutowany gen aspartokinazy. Donoszono również, że produktywność L-lizyny ulega polepszeniu przez dodatkowe wprowadzenie genu syntazy dihydrodipikolinianowej obok zmutowanego genu aspartokinazy (Apel. Envir. Microbiol., 57(6), 1746-1752 (1991)). Bakteria taka charakteryzuje się jednak również obniżonym tempem wzrostu.
Nie donoszono o przypadkach, w których próbowano polepszyć wzrost bakterii wzmagając również gen biosyntezy L-lizyny. Nie jest znany obecnie przypadek udanego i znaczącego poprawienia wydajności uzyskiwania L-lizyny przez bakterie maczugowate bez ograniczania tempa wzrostu, sposobem manipulowania wieloma genami systemu biosyntezy L-lizyny.
Przedmiotem wynalazku jest zrekombinowany DNA replikujący się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej, zawierający sekwencję DNA kodującą aspartokinazę charakteryzującą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę oraz sekwencję DNA kodującą dekarboksylazę diaminopimelinową, w którym aspartokinaza charakteryzująca się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę jest zmutowaną aspartokinazą pochodzącą z bakterii maczugowatej, w której reszta aminokwasowa odpowiadająca 279 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 5 jest zmieniona na resztę treoninową w podjednostce alfa, zaś reszta aminokwasową odpowiadająca 30 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 7 jest zmieniona na resztę treoninową w podjednostce beta.
Korzystnie, sekwencja DNA kodująca dekarboksylazę diaminopimelinową koduje sekwencję aminokwasową nr 12 lub sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samą jak sekwencja aminokwasową nr 12.
Korzystnie, zrekombinowany DNA według wynalazku zawiera ponadto sekwencję DNA kodującą karboksylazę fosfoenolopirogronianową.
Drugim przedmiotem wynalazku jest bakteria maczugowata niosąca aspartokinazę charakteryzującą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę oraz zawierająca wzmocnioną sekwencję DNA kodującą dekarboksylazę diaminopimelinową, w której aspartokinaza charakteryzująca się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę jest zmutowaną aspartokinazą pochodzącą z bakterii maczugowatej, w której reszta aminokwasową odpowiadająca 279 reszcie
190 206 alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 5 jest zmiimiona na resztę treoninową w podjednostce alfa, zaś reszta aminokwasowa odpowiadająca 30 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 7 jest zmiimiona na resztę treoninową w podjednostce beta.
Korzystnie, bakteria maczugowata według wynalazku jest stransformowana poprzez wprowadzenie zrekombinowanego DNA według wynalazku określonego powyżej.
Korzystnie, bakteria maczugowata według wynalazku ponadto zawiera wzmocnioną sekwencję DNA kodującą karboksylazę fosfoenolopirogronianową.
Korzystnie, bakteria maczugowata według wynalazku jest stransformowana poprzez wprowadzenie zrekombinowanego DNA według wynalazku określonego powyżej.
Trzecim przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-lizyny, charakteryzujący się tym, ze hoduje się bakterię maczugowatą według wynalazku określoną powyżej w pożywce odpowiedniej do wytwarzania i akumulacji L-lizyny w hodowli bakteryjnej, a następnie wyodrębnia się L-lizynę z hodowli.
Celem wynalazku jest zwiększenie wydajności wytwarzania L-lizyny bez ograniczania wzrostu bakterii maczugowatej, poprzez skoordynowane wzmocnienie kompleksu genów biosyntezy L-lizyny w bakterii maczugowatej.
Jeżeli pożądana substancja wytwarzana jest fermentacyjnie z wykorzystaniem mikroorganizmu, tempo wytwarzania, jak również wydajność biosyntezy pożądanej substancji w stosunku do wprowadzanego na wstępie materiału jest szczególnie istotnym czynnikiem wspomnianego sposobu wytwarzania. Pożądana substancja może być wytwarzana w sposób znacząco tani przez zwiększenie tempa produkcji w przeliczeniu na jednostkę wyposażenia fermentacyjnego. W związku z tym jest szczególnie istotne z przemysłowego punktu widzenia, by wydajność fermentacji i tempo produkcji były ze sobą porównywalne.
Wynalazek przedstawia rozwiązanie przedstawionego powyżej problemu, fermentacyjnego wytwarzania L-lizyny z wykorzystaniem korynebakterii.
Zasada wynalazku oparta jest na obserwacji, ze wzrost bakterii maczugowatej można polepszyć i tym samym polepszyć tempo wytwarzania L-lizyny, przez wzmocnienie zarówno sekwencji dNa kodującej aspartokinazę, charakteryzującą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę i sekwencji DNa kodującej dekarboksylazę diaminopimelinową, w porównaniu z przypadkiem gdy wymienione sekwencje DNA wzmagane są pojedynczo.
Dalej, jeżeli jest to konieczne, aspartokinaza określana jest dalej jako „AK”, gen kodujący AK określany jest mianem „zmutowanego genu lysC”. Ponadto dekarboksylaza diaminopimelinowa określana jest jako „DDC”, gen kodujący DDC określany jest skrótem „lysA”, karboksylaza fosfoenolopirogronianowa oznaczana jest symbolem „PEPC” i gen kodujący PEPC oznaczany jest jako „ppc”, jeżeli jest to konieczne.
Bakteria maczugowata wymieniana w wynalazku to grupa mikroorganizmów defmowana wg. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology wyd. 8, str. 599 (1974), charakteryzowana jako bakterie Gram-dodatnie, kwaso-opome pałeczki, nie tworzące endospor. Korynebakterie obejmują bakterie należące do rodzaju Corynebacterium, bakterie należące do rodzaju Brevibacterium, pierwotnie klasyfikowane w rodzaju Brevibacterium, lecz ostatnio przeniesione do rodzaju Corynebacterium i bakterie należące do rodzaju Brevibacterium blisko spokrewnione z bakteriami należącymi do rodzaju Corynebacterium.
Według wynalazku można polepszyć ilości i tempo produkcji L-lizyny przez bakterie maczugowate.
Krótki opis figur
Figura 1 przedstawia sposób konstruowania plazmidów p399AK9B i p399AKYB obejmujących zmutowany gen lysC.
Figura 2 przedstawia sposób konstruowania plazmidu p299LYSA obejmującego gen lysA.
Figura 3 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pLYSB obejmującego gen lysB i miejsce początku replikacji Brevi.-ori.
Figura 4 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pAKPFds obejmującego gen strukturalny PEPC.
190 206
Figura 5 przedstawia sposób konstruowania nowych wektorów do klonowania w komórkach bakterii maczugowatych, pVK6 i pVK7.
Figura 6 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pPwm obejmującego gen ppc typu dzikiego z wysokim poziomem ekspresji.
Figura 7 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pCL obejmującego zmutowany gen lysC, lysA i Brevi.-ori.
Figura 8 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pDPSB obejmującego gen dapA i Brevi.-ori.
Figura 9 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pDPRB obejmującego gen dapB i Brevi.-ori.
Figura 10 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pPK4D obejmującego gen ddh i Brevi.-ori.
Figura 11 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pCRCAB obejmującego gen lysC, dapA i Brevi.-ori.
Figura 12 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pCB obejmującego zmutowany gen lysC, dapA i Brevi.-ori.
Figura 13 przedstawia sposób konstruowania plazmidu pCD obejmującego zmutowany gen lysC i ddh.
Szczegółowy opis wynalazku [1] Otrzymanie genów biosyntezy L-lizyny według wynalazku
Geny biosyntezy L-lizyny według wynalazku uzyskiwane są odpowiednio poprzez uzyskanie chromosomalnego DNA z bakterii, służącej jako źródło DNA, konstruowanie biblioteki chromosomalnego DNA z wykorzystaniem wektora plazmidowego lub podobnego, wybraniu szczepu niosącego pożądany gen i odzyskanie r z wybranego genu zrekombinowanego DNA, do którego włączony jest wymieniony gen. Źródło DNA genów biosyntezy L-lizyny według wynalazku nie jest szczegółowo ograniczone, przy załozeniu, iż pożądany gen biosyntezy L-lizyny koduje białko enzymatyczne działające w komórkach bakterii maczugowatych. Korzystnym źródłem DNA sąjednak bakterie maczugowate.
Wszystkie geny lysC, dapA i ppc z bakterii maczugowatych mają znaną sekwencję. Stąd można je uzyskać stosując technikę PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy; patrz: White, T. J. i WSP., Trends Genet., 5, 185, 1989).
Każdy z genów biosyntezy L-lizyny według wynalazku można uzyskać stosując sposoby wyszczególnione poniżej.
(1) Otrzymanie zmutowanego genu lysC
Fragment DNA obejmujący zmutowany gen lysC można uzyskać ze zmutowanego szczepu, w którym czułość synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności AK L-lizyną i L-treoniną została w znaczący sposób zmniejszona (międzynarodowy opis wyłożeniowy WO 94/25605). Wymieniony zmutowany szczep można uzyskać na przykład z grupy komórek pochodzących ze szczepu typu dzikiego korynebakterii poddanych działaniu mutagenizującemu, np. naświetlaniu ultrafioletem i działaniu takich związków jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguamdyna (NTG). Aktywność AK można określać stosując metodę opisaną przez Miyajima, R. i wsp J. Biochem., 63 (2), 139-148, 1968. Najkorzystniejszy szczep zmutowany reprezentowany jest przez bakterię wytwarzającą L-lizynę AJ3445 (FERM P-1944) uzyskaną w wyniku mutagenezy dzikiego szczepu Brevibacterium lactofermentus ATCC 13869 (obecna nazwa: Corynebacterium glutamicum).
Zmutowany gen lysC można również uzyskać metodą mutagenezy in vitro plazmidowego DNA obejmującego gen lysC typu dzikiego. W kolejnym aspekcie, znane są dane o konkretnych mutacjach powodujących znaczące zmniejszenie czułości synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności AK L-lizyną i L-treoniną (międzynarodowy opis wyłożeniowy WO 94/25605). W związku z tym zmutowany gen lysC można przygotować z genu lysC typu dzikiego wykorzystując wspomniane informacje, np. metodą mutagenezy kierowanej.
Fragment obejmujący gen lysC można wyizolować z bakterii maczugowatej otrzymując chromosomalny DNA, na przykład metodą Saito i Miury (Saito, H., Miura, K., Biochem.
190 206
Bioph. Acta, 72, 619, 1963) i amplifikując gen lysC techniką łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR; patrz White, T. i WSP., Trend Genet., 5, 185, 1989).
Startery DNA stanowią jednoniciowe 23 nukleotydowe i 21 nukleotydowe oligomery DNA o sekwencji przedstawionej Sek. Id Nr 1 i 2 w zestawieniu sekwencji, służące do powielenia, np. regionu liczącego około 1643 pz sekwencji kodującej genu lysC w oparciu o znaną sekwencję Corynebacterium glutamicum (Mol. Microbiol., (1991), 5(5), 1197-1204; Mol. Gen. Genet., (1990), 224, 317-324). DNA można zsyntezować metodami standardowymi, stosując syntetyzer 380B firmy Applied Biosystems i metodę fosforoamidynową (Tetrahedron Lett., (1981), 22, 1859). Powielanie techniką PCR można prowadzić w termocyklerze PJ2000 firmy Takara Shuzo, stosując polimerazę Taq, zgodnie z zaleceniami producenta.
Korzystne, by gen lysC powielany techniką PCR w celu otrzymania zrekombinowanego DNA zligowany był z DNA wektora replikującego się autonomicznie w komórkach E. coli i/lub korynebakterii i by zrekombinowany DNA wprowadzony był następnie do komórek E coli. Następujące załozenia czynią łatwymi kolejne manipulacje. Wektor autonomicznie replikujący się w komórkach E. coli korzystnie jest wektorem plazmidowym, ulegającym korzystnie autonomicznej replikacji w komórkach gospodarza, obejmującym na przykład pUC19, pUCIS, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 i RSF1010.
Gdy do wymienionych wektorów zostanie wprowadzony fragment DNA posiadający zdolność do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej, wektory te wykorzystać można jako wektory przenośnikowe (shuttle vector), ulegające replikacji zarówno w komórkach E coli, jak w bakterii maczugowatej. '
Poniżej wymieniono wektory przenośnikowe. Wymieniono również mikroorganizmy niosące każdy z wektorów i numery nadane przez międzynarodowe organizacje depozytowe (w nawiasach).
pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532) pAJ655: Escherichia coli AJH882 (FERM BP-136)
Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39133) pAJ1844. Escherichia coli AJH883 (FERM BP-137)
Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 30 9 Ki) pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERMBP-138) pAJ3148’ Coiynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 3S^9^^) pAJ440: Bacillus subtilis AJH901 (FERM BP-140)
Wektory można otrzymać ze zgromadzonych w depozytach mikroorganizmów w następujący sposób. Komórki należy zebrać w fazie logarytmicznej wzrostu i zlizować przy użyciu lizozymu i SDS, a następnie oddzielić od lizatu przez wirowanie przy 30000 x g w celu uzyskania supernatantu. Do supernatantu należy dodać glikolu polietylenowego, a następnie frakcjonować i oczyszczać poprzez wirowanie w gradiencie CsCł z bromkiem etydyny.
E. coli można transformować przez wprowadzenie plazmidu według metody, na przykład D. M. Morrisona (Methods Enzymom., 68, 326, 1979) lub metodą, w której komórki biorcy traktowane są CaCl2 w celu zwiększenia przepuszczalności ścian komórkowych dla DNA (Handel, M., Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159, 1970).
Gen lysC typu dzikiego uzyskuje się przez izolację genu ze szczepu produkującego dziką formę AK, podczas gdy zmutowany gen lysC uzyskuje się ze zmutowanego szczepu AK, według przedstawionych wyżej sposobów.
Przykładowa sekwencja nukleotydowa fragmentu DNA obejmującego gen lysC typu dzikiego przedstawia Sek. Id Nr 3 w zestawieniu sekwencji. Sekwencję aminokwasową podjednostki alfa białka AK typu dzikiego wyprowadzoną z wyżej wymienionej sekwencji nukleotydowej przedstawia Sek. Id Nr 4 w zestawieniu sekwencji wraz z sekwencją DNA. Sek. Id Nr 5 przedstawia jedynie sekwencję aminokwasową. Sekwencję aminokwasową podjednostki beta białka AK typu dzikiego wyprowadzoną z sekwencji DNA przedstawia Sek. Id Nr 6 w zestawieniu sekwencji wraz z sekwencją DNA. Sek. Id Nr 7 obrazuje jedynie sekwencję aminokwasową W każdej z podjednostek GTG stanowi kodon inicjacyjny i odpowiadającym mu aminokwasem jest metionina. Kodon ten może jednak określać zarówno metioninę, jak walinę lub formylometioninę.
190 206
Zmutowany gen lysC nie jest w szczególny sposób ograniczony według wynalazku, zakładając że koduje AK, w której czułość synergistycznego hamowania zwrotnego L-lizyną i L-treoniną została w znaczący sposób zmniejszona. Zmutowany gen lysC przedstawiony jest na przykładzie genu obejmującego mutację, powodującą zastąpienie 279 reszty alaniny (licząc od końca N cząsteczki) przez resztę aminokwasową różną od alaniny i różną od kwasowego aminokwasu z podjednostki alfa i reszta aminokwasowa odpowiadająca 30 reszcie alaniny z końca N została zamieniona przez inną resztę aminokwasową inną niz alanina i inną niz kwasowy aminokwas z podjednostki beta w sekwencji aminokwasowej AK typu dzikiego. Sekwencja aminokwasową AK typu dzikiego obejmuje sekwencję aminokwsową przedstawioną Sek. Id Nr 5 w zestawieniu sekwencji opisaną jako podjednostka alfa i sekwencję przedstawioną Sek Id Nr 7 w zestawieniu sekwencji, opisaną jako podjednostka beta.
Korzystne reszty aminokwasowe inne niż alanina i inne niz kwasowy aminokwas obejmują: treoninę, argininę, cysteinę, fenyloalaninę, prolinę, serynę, tyrozynę i walinę.
Kodon odpowiadający podstawianej reszcie aminokwasowej nie jest w szczególny sposób ograniczony co do typu, przy założeniu, że koduje wymienioną resztę aminokwasową. Jest możliwe, że sekwencja aminokwasową AK typu dzikiego może się nieco różnić, w zależności od gatunku i szczepu bakterii. Białko AK zmutowane poprzez na przykład substytucję, delecję lub insercję jednej lub więcej reszt aminokwasowych w jednej lub więcej pozycji, gdy mutacja pozostaje bez wpływu na aktywność enzymatyczną przedstawioną powyżej, może być również wykorzystana według wynalazku. DNA kodujący AK, niosący mutacje spontaniczne można uzyskać izolując DNA hybrydyzujący w warunkach „ścisłych” z na przykład DNA posiadającym część sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek. Id Nr 3. Termin „warunki ścisłe” oznacza warunki, w których powstają specyficzne hybrydy i nie powstają hybrydy niespecyficzne. Trudno jednak opisać liczbowo wymienione warunki hybrydyzacji. Warunki te przedstawione są wartościami, przy których kwasy nukleinowe wykazujące wysoką homologię, na przykład DNA wykazujący homologię nie mniejszą niz 90% hybrydyzują ze sobą i kwasy nukleinowe wykazujące homologię mniejszą niz podana powyżej nie hybrydyzują ze sobą lub przedstawione są wartościami temperatury hybrydyzacji w zakresie od temperatury topnienia (Tm) w pełni parujących hybryd do temperatury (Tm - 30)°C, korzystnie od Tm do temperatury (Tm - 20)°C i przy stężeniu soli odpowiadającym 1 x SSC, korzystnie 0,1 x SSC.
Inne AK, posiadające sztuczne mutacje, na przykład substytucje, delecje lub insercje innych i więcej reszt aminokwasowych, można również zastosować według wynalazku, przy załozeniu, ze mutacja pozostaje bez wpływu na aktywność enzymatyczną charakteryzująca się znaczącym zmniejszeniem czułości synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności przez L-lizynę i L-treoninę. DNA kodujący AK niosący sztucznie wprowadzone mutacje można uzyskać modyfikując sekwencję nukleotydową tak, by otrzymać pożądaną substytucję, delecje lub insercję w specyficznej pozycji, na przykład drogą mutagenezy kierowanej. Zmutowany gen lysC można otrzymać również poprzez traktowanie mutagenem. Traktowanie mutagenem in vitro obejmuje kontaktowanie dNa obejmującego gen lysC z hydroksylaminą lub substancją podobną, i traktowanie mikroorganizmu niosącego DNA obejmujący gen lysC mutagenem, takim jak ultrafiolet czy mutagenem stosowanym standardowo w sztucznej mutagenezie, takim jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (NTG) lub kwas azotowy. Po mutagenizacji miejsce wprowadzenia mutacji czy wystąpienia mutacji można określić wybierając DNA lub mikroorganizm kodujący lub wytwarzający AK posiadający aktywność AK i którego sekwencja aminokwasowa jest zmutowana, kodowany przez DNA poddany mutagenezie lub pochodzący z mikroorganizmu poddanego traktowaniu mutagenem. Miejsce wprowadzenia mutacji nie jest szczególnie ograniczone, przy załozeniu, ze mutacja nie wpływa w sposób znaczący na aktywność AK i na zmniejszenie czułości hamowania zwrotnego. Ilość wprowadzanych mutacji zmienia się w zalezności od miejsca lub rodzaju zmutowanego aminokwasu w przestrzennej strukturze białka i nie jest w sposób szczególny ograniczona, przy załozeniu, ze nie wpływa w sposób znaczący na aktywność AK i na zmniejszenie czułości hamowania zwrotnego. Liczba mutacji waha się zazwyczaj od 1 do 20, korzystnie od 1do 10.
190 206
Szczep AJ 12691 uzyskany przez wprowadzenie plazmidu p399AK9B ze zmutowanym genem lysC do szczepu AJ12036 (FERM BP-734) jako do szczepu dzikiego Brevibacterium lactofermentus został przekazany do depozytu 10 04 1992 i uzyskał numer depozytowy FERM P-12918 w National Institute of Bioscience and Human Technology należącym do Agency of Industrial Science and Technology w ramach Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonia) i przekazany został do depozytu międzynarodowego zgodnie z układem budapeszteńskim z 10 02 1995 r. i uzyskał numer depozytowy FERM BP-4999.
(2) Pzygotowanie lysA
Fragment DNA obejmujący gen lysA można przygotować z chromosomu bakterii maczugowatej techniką PCR. Dawca DNA nie jest w szczególny sposób ograniczony, choć jako przykład wybrano szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
U bakterii maczugowatych gen lysA tworzy operon wraz z genem argS (gen kodujący arginylo-tRNA) i lysA położony jest w kierunku 3' od genu argS. Ekspresja lysA regulowana jest przez promotor położony przed genem argS (J. Bacteriol. Nov., 7356-7362, 1993). Sekwencja DNA tych genów jest znana dla Corynebacterium glutamicum (Mol. Microbiol., 4(11), 1819-1830, 1990; Mol. Gen. Genet., 212, 112-H9, 1988) i na tej podstawie można przygotować startery do powielania DNA. Przykładami takich starterów są 23 nukleotydowe oligomery DNA o sekwencji przedstawionej Sek. Id Nr 8 w zestawieniu sekwencji (odpowiadają nukleotydom od 11 do 33 w sekwencji nukleotydowej opublikowanej w Mol. Microbiol., 4(11), 1819-1830, 1990) i o sekwencji przedstawiońej Sek. Id Nr 9 w zestawieniu sekwencji (odpowiadają nukleotydom od pozycji 1370 do 1392 w sekwencji nukleotydowej podanej w Mol. Gen. Genet., 212, 112-19, 1988). Syntezę DNA, PCR i otrzymanie plazmidu zawierającego lysA można dokonać tak samo, jak opisano to powyżej, dla genu lysC.
W przykładzie podanym później, fragment DNA obejmujący promotor, gen argS i gen lysA został użyty w celu wzmocnienia genu lysA. Gen argS nie jest zasadniczo niezbędny według wynalazku. Dopuszczalne jest wykorzystanie fragmentu DNA, w którym gen lysA zligowany jest tuz za promotorem.
Sekwencja nukleotydowa fragmentu DNA obejmującego argS i lysA i sekwencja aminokwasową wyprowadzona z sekwencji wymienionej nukleotydowej zostały przedstawione Sek. Id Nr 10. Przykład sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen argS przedstawia Sek. Id Nr 11; i przykład sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen lysA przedstawia Sek. Id Nr 12. Oprócz fragmentów DNA kodujących wymienione sekwencje aminokwasowe, można według wynalazku wykorzystać sekwencje kodujące sekwencje aminokwasowe zasadniczo takie same, jak sekwencja aminokwasową przedstawiona Sek. Id Nr 12, to jest sekwencje aminokwasowe posiadające mutacje typu substytucji, delecji lub insercji jednego lub więcej aminokwasów przy załozeniu, ze nie mają one zasadniczego wpływu na aktywność DDC. Gen lysA posiadający mutacje spontaniczne lub sztuczne można uzyskać w ten sam sposób, jak DNA posiadający mutacje nie wywierające wpływu na aktywność AK i na zmniejszenie czułości synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności AK L-lizyną i L-treoniną.
(3) Otrzymanie genu ppc
Fragment DNA obejmujący gen ppc można otrzymać z chromosomu bakterii maczugowatej techniką PCR. Dawca DNA nie jest w szczególny sposób ograniczony, choć jako przykład wybrano szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Sekwencje genu ppc znane są dla Corynebacterium glutamicum (M. O'Regan i wsp., Gene 77, 237-251, 1989) i na tej podstawie można zaprojektować startery do reakcji PCR. Przykładami takich starterów są 23 nukleotydowe oligomery DNA o sekwencji przedstawionej Sek. Id Nr 13 i Sek. Id Nr 14 w zestawieniu sekwencji. Syntezę DNA, PCR i otrzymanie plazmidu zawierającego gen ppc można dokonać tak samo, jak opisano to powyżej dla genu lysC.
Sekwencja nukleotydowa fragmentu DNA obejmującego gen ppc i sekwencja aminokwasową wyprowadzona z wymienionej sekwencji nukleotydowej pzedstawiona jest Sek. Id Nr 15. Sama sekwencja aminokwasową przedstawiona jest Sek. Id Nr 15
Oprócz fragmentów DNA kodujących wymienione sekwencje aminokwasowe, można według wynalazku wykorzystać sekwencje kodujące sekwencje aminokwasowe zasadniczo takie same jak sekwencja aminokwasową przedstawiona Sek. Id Nr 16, to jest sekwencje ami190 206 nokwasowe posiadające mutacje typu substytucji, delecji łub insercji jednego lub więcej aminokwasów przy założeniu, że nie mają one zasadniczego wpływu na aktywność PEPC. Gen ppc niosący mutacje spontaniczne lub sztuczne można uzyskać w ten sam sposób, jak DNA posiadający mutacje nie wywierające wpływu na aktywność AK i na zmniejszenie czułości synergistycznego hamowania zwrotnego aktywności AK L-lizyną i L-treoniną.
U bakterii maczugowatych gen ppc tworzy operon wraz z genem gap (kodujący dehydrogenazę gliceroaldehydo-3-fosforanową) pgk (gen kodujący kinazę fosfoglicerynianową) i tpi (gen kodujący izomerazę triozofosforanową) i ppc podłożony jest w kierunku 3' od genu tpi. Ekspresja ppc regulowana jest prze/z promotor położony przed genem pgk (Schwinde, J. W. i wsp J. Bacteriol., 175, 3905-3908, 1993). Tak więc, podobnie jak gen lysA, ppc można powielić wraz z genami pgk i tpi techniką PGR, tak by uzyskać fgment obejmujący ppc, pgk i tpi. Jak przedstawiono to w przykładzie poniżej możliwe jest zligowanie fragmentu DNA niosącego region kodujący PEPC tuż poniżej użytecznego promotora. Promotor ten obejmuje promotor genu lysC, promotor tac (pochodzący z E. coli) i promotor trc.
[2] Zrekombinowany DNA i bakteria maczugowata według wynalazku
Zrekombinowany DNA obejmujący sekwencję DNA kodującą aspartokinazę, w której czułość synergistycznego hamowania zwrotnego L-lizyną i L-treoniną została w znaczący sposób zmmejszona i sekwencję DNA kodującą dekarboksylazę diaminopimelinową i ulega autonomicznej replikacji w komórkach bakterii maczugowatej. W korzystnym zastosowaniu zrekombinowany DNA obejmuje ponadto sekwencję DNA kodującą karboksylazę fosfoenolopirogronianową oprócz wymienionych wyżej sekwencji DNA.
Bakteria maczugowata według wynalazku niesie aspartokinazę (zmutowaną AKK, w której czułość synergistycznego hamowania zwrotnego L-lizyną i L-treoniną została w znaczący sposób zmniejszona, której DNA (gen lysA) kodujący dekarboksylazę diaminopimelinową został wzmocniony. W korzystnym zstosowaniu bakteria maczugowata według wynalazku jest bakterią maczugowatą zawierającą DNA (ppc) kodujący karboksylazę fosfoenolopirogronianową, który został również wzmocniony.
Termin „wzmocniony”, „wzmozony” („enhanced”) dotyczy zjawiska powiększenia wewnątrzkomórkowej aktywności enzymu kodowanego przez DNA, sposobem zwiększenia liczby kopii genu, użycia mocniejszego promotora, użycia genu kodującego enzym o wyższej aktywności specyficznej czy połączeniem wymienionych sposobów.
Baktera maczugowata niosąca zmutowaną AK może być bakterią wytwarzającą zmutowaną aspartokinazę w wyniku mutacji lub bakterią transformowaną poprzez wprowadzenie zmutowanego genu lysC.
Przykłady korynebakterii wykorzystywanych do wprowadzenia DNA przedstawionego powyżej obejmują, na przykład, następujące szczepy typu dzikego wytwarzające lizynę:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;
Corynebacterium callunae ATCC 15991;
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;
(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020, (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869, (Corynebacterium lilium) ATCC 15990, (Brevibacterium flavum) ATCC 14067;
Corynebacterium melassecola ATCC 17965;
Brevibactenum saccharolyticum ATCC 14066;
Brevibacterium immariophilium ATCC 14068;
Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibactermm thiogenitalis ATCC 19240;
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
Inni użyteczni gospodarze bakteryjni obejmują na przykład szczepy zmutowane posiadające zdolność wytwarzania L-lizyny, pochodzące z wymienionych wyżej szczepów. Takim sztucznym, zmutowanym szczepem jest: szczep oporny na S-(2-aminoetylo)-cysteinę (skracany dalej jako „AEC”) (na przykład Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-1147) (japońska publikacja patentowa Nr 56-1914, 56-1915, 57-1.4157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-H2437 i 7-112438); zmuto10
190 206 wane szczepy wymagające do wzrostu aminokwasu, takiego jak L-homoseryna (japońska publikacja patentowa Nr 48-28078 i 56-6499); zmutowane szczepy wykazujące oporność na AEC i wymagające aminokwasów, takich jak L-leucyna, L-homoseryna, L-prolina, L-seryna, L-arginina, L-alanina, L-walina (US Patent Nr 3 708 395 i 3 825 472)1; zmutowane szczepy wytwarzające L-lizynę wykazujące oporność na DL-alfa-amino-eta-kaprolaktam, alfa-amino-laurylolaktam, analog asparaginianu, sulfonamidy, chinoid i N-lauroyloleucynę; zmutowane szczepy wytwarzające L-lizynę wykazujące oporność na inhibitory dekarboksylazy oksylooctanowej lub enzymów układu oddechowego (japońskie zgłoszenie patentowe Nr 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-979\59, 56-32995 i 56-39778 i japońska publikacja patentowa Nr 53-43591 i 53-1833); zmutowane szczepy wytwarzające L-lizynę wymagające inozytolu lub kwasu octowego (japońskie zgłoszenie patentowe Nr 55-9874 i 56-8692); zmutowane szczepy wytwarzające L-lizynę wykazujące wrażliwość na kwas fluoropirogronowy lub temperaturę nie mniejszą niz 34°C (japońskie zgłoszenie patentowe Nr 55-9783 i 53-86090); wytwarzające zmutowane szczepy należące do rodzaju Brevibacterium lu Corynebacterium wykazujące oporność na glikol etylenowy i wytwarzające L-lizynę (US Patent Nr 4 411 997).
W konkretnym zastosowaniu według wynalazku, w celu wzmocnienia genów biosyntezy L-lizyny w komórce gospodarza jak podano to wyżej, geny wprowadzane są do gospodarza z wykorzystaniem wektora plazmidowego, transpozonu, wektora fagowego lub podobnego. Po wprowadzeniu, możliwe jest wzmocnienie do pewnego stopnia, nawet przy wykorzystaniu niskokopiowego wektora. Korzystne jest jednak wykorzystanie wysokokopiowego wektora. Wektor taki obejmuje na przykład wektory plazmidowe: pAJ655, pAj1844, pAJ611, pAJ3148 i pAJ440 przedstawione powyżej. Ponadto można zastosować transpozony pochodzące z bakterii maczugowatej, jak przedstawiono to międzynarodowym opisie wyłozeniowym W002/02627 i W002/18151, europejskim zgłoszeniu patentowym Nr 44538, japońskim zgłoszmu patentowym Nr 6-46867, Vertes, A. A. i wsp., Mol. Microbiol., 11, 739-746 (3,994), Bonamy, C i wsp., Mol. Microbiol., 14, 571-583. (1994), Vertes, A, A, i wsp., Mol. Gen. Genet., 245; 397-405 (1994), Jagar, W. i wsp., FEMS Mikrob. Lett., 126, 1-6 (1995), japońskie zgłoszenie patentowe Nr 7-107976, 7-327680 i podobne.
Według wynalazku nie jest konieczne by zmutowany gen lysC był wzmacniany. Możliwe jest wykorzystanie zmutowanego genu lysC położonego w chromosomalnym DNA lub zmutowanego genu lysC zintegrowanego z chromosomalnym DNA. Alternatywnie, zmutowany gen lysC można wprowadzić z wykorzystaniem wektora plazmidowego. Z drugiej strony geny lysA i ppc są korzystnie wzmacniane dla uzyskania efektywnego wytwarzania L-lizyny.
Każdy z genów lysC, lysA i ppc można sukcesywnie wprowadzić do komórki gospodarza w wykorzystaniem różnych wektorów. Alternatywnie, dwa lub trzy rodzaje genów można wprowadzić na tym samym wektorze. Gdy wykorzystywane są różne wektory geny można wprowadzić w dowolnym porządku, jednak korzystnie stosować wektory mające stabilne mechanizmy przekazywania w czasie podziałów do komórek potomnych i zdolne do wzajemnej koegzystencji w komórce gospodarza.
Korynebakteria niosąca zmutowaną AK i obejmująca ponadto wzmocniony gen lysA uzyskana została, na przykład, sposobem wprowadzenia do korynebakteryjnego gospodarza, zrekombinowanego DNA obejmującego zmutowany gen lysC, lysA i ppc, replikującego się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej.
Uzyskano następnie bakterię maczugowatą obejmującą ppc oprócz zmutowanego genu lysA i lysC, na przykład poprzez wprowadzenie do korynebakteryjnego gospodarza zrekombiowanego DNA obejmującego zmutowane geny lysC, lysA i ppc, zdolnego do autonomicznej replikacji w komórkach gospodarza. Ponadto uzyskano bakterię maczugowatą obejmującą wzmocnione zmutowane geny lysC lysA i ppc poprzez wprowadzenie do bakterii maczugowatej zawierającej wzmocnione, zmutowane geny lysC i lysA, zrekombinowany DNA obejmujący gen ppc, zdolny do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii maczugowatej.
Wymienione zrekombinowane cząsteczki DNA można uzyskać na przykład poprzez wprowadzenie każdego z genów uczestniczących w biosyntezie L-lizyny do wektora, takiego jak wektor plazmidowy, transpozonu lub wektora fagowego, przedstawionych powyżej.
190 206
W przypadku, gdy jako wektor stosowany jest plazmid, zrekombinowany DNA można wprowadzić do gospodarza metodą oloktrnpnrauJi pulsowej (Sugimoto i wsp., japońskie zgłoszenie patentowe Nr 2-207791). Amplifikację genu z wykorzystaniem transpozonu można dokonać przez wprowadzenie plazmidu niosącego transpozon do komórki gospodarza i indukcję przeniesienia transpozonu.
[3] Sposób wytwarzania L-lizyny
L-lizynę można efektywnie wytwarzać poprzez hodowanie bakterii mauzugoO'atoj obejmującej wzmocnione geny biosyntezy L-lizyny jak podano to wyżej, w odpowiednim podłożu, w celu wytworzenia L-lizyny i gromadzenia w hodowli bakteryjnej oraz zbierania L-lizyny z hodowli.
Pożywka stosowana może być zwyczajną pożywką zawierającą źródło węgla, źródło azotu, jony nieorganiczne i w zalezności od potrzeb inne składniki organiczne.
Źródłem węgla jest zwykle cukier· glukoza, fruktoza, sacharoza, melasa i hydrolizat skrobiowy; kwas organiczny, taki jak kwas fumarowy, kwas cytrynowy czy kwas bursztynowy''.
Źródłem azotu mogą być nieorganiczne sole amonowe, takie jak siarczan amonowy·', chlorek amonowy i fosforan amonowy; azot organiczny, taki jak hydrolizat sojowy; amoniak gazowy; i roztwór wodny amoniaku.
Źródłem śladowych substancji odzywczych, jeżeli jest pożądane dodanie substancji takich jak witamina B| i L-homoseryna czy ekstrakt drozdżowy lub podobne w odpowiednich ilościach. Jeżeli jest to konieczna, inne substancje takie jak fosforan potasowy, siarczan magnezowy, jon zelaza, jon manganu i inne dodawane są w niewielkich ilościach.
Hodowla prowadzona jest korzystnie w warunkach tlenowych przez około od 30 do 90 godzin. Temperatura hodowli jest korzystnie utrzymywana na poziomie od 25 do 37°C, a pH utrzymywane jest korzystnie w zakresie od 5 do 8 w czasie hodowli. Do ustalania pH można stosować substancje zarówno organiczne, jak nieorganiczne, kwasowe lub zasadowe, amoniak gazowy i podobne. L-lizynę można zbierać z hodowli sposobem chromatografii z żywicą jonowymienną, sposobem precypitacyjnym i innymi znanymi metodami.
Przykłady
Wynalazek przedstawiony jest w szczegółach za pomocą następujących przykładów.
Przykład 1
Otrzymanie genu lysC typu dzikiego i zmutowanego genu lysC z Brevibacterium lactofermentum [1] Otrzyoanie genu lysC typu d/.ikiedz i emuiowanego genu lysC oraz uzyskanie plazmidów zawierających wymienione geny
Szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 i zmutowany szczep wytwarzający L-lizynę AJ3445 (FERM P-1944) uzyskany ze szczepu ATCC 13869 przez mutagenizację wykorzystano jako dawców DNA chromosoma^ego. Szczep AJ3445 poddano mutagonizacji tak, ze gen lysC został zmieniony w celu uzyskania znaczącego zmniejszenia czułości hamowania zwrotnego przez lizynę i treoninę (J. Biochem., 68, 701-710, 1970).
Fragment DNA obejmujący gen lysC powielono z chromosomalnogo DNA techniką PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy; patrz· White, T. J. i wsp., Trends Genet., 5, 185, 1989). Startery DNA stanowiły jednoniciowo 23- i 21-mery DNA o sekwencji przedstawionej Sek. Id Nr 1 i 2 w zestawieniu sekwencji służące do powielenia, np. regionu liczącego około 1643 pz sekwencji kodującej genu lysC w oparciu o znaną sekwencję Corynebacterium glutamicum (Mol Microbiol., (1991), 5(5), 1197-1204; Mol. Gen. Genet., (1990), 224, 317-324). DNA zsyntezowano metodą standardową, stosując syntetyzer 380B firmy Applied Biosystems i metodę fosforoamidynową (Terrahedron Lett, (1981), 22, 1859).
Powielanie techniką PCR prowadzono stosując termocykler PJ2000 firmy Takara Shuzo i polimerazę Taq, zgodnie z zaleceniami producenta. Powielony fragment genu lysC liczący około 1643 pz sprawdzono techniką elektroforezy agarozowej. Następnie fragment wycięto z zelu, oczyszczono metodą standardową i strawiono enzymami restrykcyjnymi Nrul (Takara Shuzo) i EcoRI (Takara Shuzo).
pHSG399 (Takeshita, S. i wsp., Gene (1987) 61, 63-74) wykorzystano jako wektor do klonowania wymienionego fragmentu genu. pSHG399 strawiono enzymami restrykcyjnymi
190 206
Smal (Takara Shuzo) i EcoRI i zligowano następnie z zamplifikowanym fragmentem genu lysC. DNA ligowano wykorzystując zestaw do ligowania DNA (Takara Shuzo) postępując zgodnie ze wskazaniami producenta. Następnie otrzymano plazmidy, w których fragment lysC zamplifikowany z chromosomu Brevibacterium lactofermentum został zligowany z pHSG399. Plazmid obejmujący gen lysC ze szczepu ATCC 13896 (szczepu dzikiego) określono mianem p3999AKY, plazmid obejmujący gen lysC ze szczepu AJ3463 (bakteria wytwarzająca L-lizynę) oznaczono jako p399AK9.
Fragment DNA (dalej określany jako „Brevi.-ori”) nadający plazmidowi zdolność autonomicznej replikacji w bakteriach należących do rodzaju Corynebacterium wprowadzono do plazmidów p399AKY i p399AK9, w celu przygotowania plazmidów niosących lysC i zdolnych do autonomicznej replikacji w bakteriach należących do rodzaju Corynebacterium. Brevi.-ori otrzymano z wektora plazmidowego pHK4 obejmującego Brevi.-ori, autonomicznie replikującego się w komórkach Eschenchia coli i bakteriach należących do rodzaju Corynebacterium. pHK4 skonstruowano trawiąc plazmid pHC4 enzymem KpnI (Takara Shuzo) i BamHI (Takara Shuzo), ekstrahując fragment Brevi.-ori i ligując wymieniony fragment z pHSG298 strawionym również KpnI i BamHI (japoński opis wyłożeniowy Nr 5-7491). pHK4 nadaje gospodarzowi oporności na kanamycynę. Eschenchia coli niosąca pHK4 została określona jako Escherichia coli AJ13136, i przekazana do depozytu 01 08 1995 i uzyskała numer depozytowy FERM BP-5186 w National Institute of Bioscience and Humań Technology należącym do Agency of Industrial Science and Technology w ramach Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome\ Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonia).
pHK4 strawiono enzymami restrykcyjnymi KpnI i BamHI, a utworzone lepkie końce przeprowadzono w końce tępe. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych, do otrzymanego produktu zligowano ufosforylowany linker BamHI (Takara Shuzo), tak by fragment odpowiadający części Brevi.-ori mógł być wycinany z pHK4 przez trawienie BamHI.
Plazmid strawiono BamHI i otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano z plazmidem p399AKY i p399AK9 również strawionymi BamHI, w celu przygotowania plazmidów zawierających gen lysC zdolny do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należącej do rodzaju Corynebacterium.
Plazmid zawierający gen lysC typu dzikiego pochodzący z p399AKY określono mianem p399AKYB, a plazmid zawierający zmutowany gen lysC pochodzący z plazmidu p399AK9 oznaczono jako p399AK9B. Proces konstruowania plazmidów p399AKYB i p399AK9B przedstawiono na fig 1. Szczep AJ 12691 uzyskany przez wprowadzenie plazmidu p399AK9B zawierającego zmutowany gen lysC do dzikiego szczepu Brevibacterium lactofermentum (szczep AJ 12036, FERM BP-734) przekazano do depozytu 10 04 1992 i uzyskał numer depozytowy FERM P-12918 w National Institute of Bioscience and Humań Technology należącym do Agency of Industrial Science and Technology w ramach Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonia) i przekazany został do depozytu międzynarodowego zgodnie z układem budapeszteńskim 30 02 1995 i uzysał numer depozytowy FERM BP-4999.
[2] Określeknie sekwencji nukleotykowych genu IgsC typu dzikiego i zmotowauego genu lysU o Brevibacterium lactofermentum
Plazmid p399AKY zawierający gen lysC typu dzikiego i plazmid p399AK9 zawierający zmutowany gen lysC otrzymano z odpowiednich transformantów w celu oznaczenia sekwencji nukleotydowej genów lysC: typu dzikiego i zmutowanego.
Oznaczenie sekwencji prowadzono zgodnie z metodą Sangera i wsp. (np. F Sanger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 5463, 1977).
Sekwencję genu lysC typu dzikiego z plazmidu p399AKY obrazuje Sek. Id Nr 3 w zestawieniu sekwencji. Sekwencją nukleotydową zmutowanego genu lysC z plazmidu p399AK9 z pojedynczą mutacją w nukleotydzie 1051, zmieniającą G w A, w porównaniu z genem lysC typu dzikiego, obrazuje Sek. Id Nr 3.
Wiadomo, ze gen lysC z Corynebacterium glutamicum posiada dwie podjednostki (alfa i beta) kodowane przez identyczne ramki odczytu, z identycznego łańcucha DNA (Kalinow190 206 ski, J. i wsp., Mol. Microbiol., (1991) 5(5), 1197-1204). Sądząc z homologii, zakłada się, ze zsekwencjonowany gen posiada również dwie podjednostki (alfa i beta), kodowane przez identyczne ramki odczytu, z identycznego łańcucha DNA.
Sekwencja aminokwasową podjednostki alfa AK typu dzikiego wyprowadzona z sekwencji nukleotydowej DNA przedstawia Sek. Id Nr 4, wraz z sekwencją DNA. Sek. Id Nr 5 przedstawia jedynie sekwencję aminokwasową.
Sekwencję aminokwasową podjednostki beta białka AK typu dzikiego wyprowadzoną z sekwencji DNA przedstawia Sek. Id Nr 6 w zestawieniu sekwencji wraz z sekwencją DNA. Sek. Id Nr 7 obrazuje jedynie sekwencję aminokwasową.
W każdej z podjednostek GTG stanowi kodon inicjacyjny i odpowiadającym mu aminokwasem jest metionina. Kodon ten kodować może zarówno metioninę, jak walinę i formylometioninę.
Z drugiej strony, mutacja w sekwencji zmutowanego genu lysC oznacza wystąpienie substytucji reszty aminokwasowej, takiej ze reszta alaniny 279 podjednostki alfa zmieniona jest w resztę treoniny i że reszta alaniny 30 podjednostki beta zmieniona jest w resztę treoniny, w porównaniu z sekwencją białka AK typu dzikiego (Sek. Id Nr 5, 7).
Przykład 2
Otrzymanie genu lysA z Brevibacterium lactofermentum [1] Otrzymanie genu lysAi konstruowanie plazmidu zawierającego gen lysA
Szczep Brevibacterium lactofermentum typu dzikiego ATCC 13869 wykorzystano jako dawcę DNA. Chromosomalny DNa otrzymano standardowymi metodami. Fragment DNA obejmujący argS, lysA i promotor operonu zawierającego oba geny zamplifikowano z chromosomalnego DNA techniką PCR. Do powielania użyto startery DNA, w postaci syntetycznych DNA o długości 23 nukleotydów, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek. Id Nr 8 i 9 w zestawieniu sekwencji i zostały użyte do zamplifikowania regionu wielkości ok 3,6 kpz kodującego syntazę arginylo-tRNA i DDC w oparciu o sekwencję Corynebacterium glutamicum (Mol. Microbiol., 4(11), 1819-1830 (1990); Mol. Gen. Genet., 212, 112-119 (1988). Syntezę DNA i PCR prowadzono jak przedstawiono to w przykładzie 1.
Jako wektora użyto plazmidu pHSG399 do klonowania fragmentu PCR o wielkości 3,579 pz. pHSG399 strawiono enzymem restrykcyjnym Smal (Takara Shuzo) i zligowano z fragmentem DNA obejmującym gen lysA. Plazmid zawierający gen lysA, pochodzący z ATCC 13869, otrzymano jak podano powyżej i oznaczono jako p399LYSA.
Fragment DNA obejmujący gen lysA ekstrahowano przez trawienie plazmidu p399LYSA enzymem KpnI (Takara Shuzo) i BamHI (Takara Shuzo). Wymieniony fragment DNA ligowano z plazmidem pHSG299 strawionym KpnI i BamHI. Uzyskany plazmid oznaczono jako p299LYSA. Sposób konstrukcji plazmidu p299LYSA przedstawiono na fig. 2.
Brevi.-ori wprowadzono do p299LYSA w celu otrzymania plazmidu niosącego gen lysA zdolny do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. pHK4 strawiono enzymami restrykcyjnymi KpnI i BamHI, a utworzone lepkie końce przeprowadzono w końce tępe. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta.
Po utworzeniu końców tępych, z otrzmanym produktem zligowano ufosforylowany linker KpnI (Takara Shuzo), tak by fragment odpowiadający części Brevi.-ori mógł być wycinany z pHK4 przez trawienie wyłącznie KpnI.
Plazmid strawiono KpnI, otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano z plazmidem p299LYSA również strawionym KpnI w celu przygotowania plazmidu zawierającego gen lysA zdolny do autonomicznej replikacji w komórkach korynebakterii.
Otrzymany plazmid oznaczono jako pLY-SAB. Proces konstrukcji plazmidu pLYSAB przedstawia fig 3.
[2] Określenie sekwencji nukleotydowych genu lysA z Brevibacterium lactofermentum
Plazmidowe DNA p299LYSA otrzymano i oznaczono jego sekwencję nukleotydową, jak podano w przykładzie 1. Określoną sekwencję nukleotydową i sekwencję aminokwasową wyprowadzoną z otrzymanej sekwencji nukleotydowej przedstawia Sek. Id Nr 10 Wyprowadzoną sekwencję aminokwasową kodowaną przez gen argS i sekwencję aminokwasową kodowaną przez lysA przedstawia odpowiednio Sek. Id Nr 11 i 12.
190 206
Przykład 3
Otrzymanie genu ppc z Brevibacterium lactofermentum [1] Otrzymanie genu ppc
Szczep Brevibacterium lactofermentum typu dzikiego ATCC 13869 wykorzystano jako dawcę DNA. Chromosomalny DNA otrzymano standardowymi metodami. Fragment DNA obejmujący gen ppc zamplifikowano z chromosomalnego DNA techniką PCR. Do powielania użyto startery DNA, w postaci syntetycznych DNA o długości 23 nukleotydów, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek. Id Nr 13 i 14 w zestawieniu sekwencji, które zostały użyte do powielenia regionu wielkości ok. 3,3 kpz kodującego PEPC w oparciu o sekwencję Corynebacterium glutamicum (0’Regan, M. i wsp., Gene 77, 237-251 (1989). Syntezę DNA i PCR prowadzono tak, jak podano w przykładzie 1.
Powielony fragment genu o wielkości około 3300 pz sprawdzono techniką elektroforezy agarozowej i następnie wyodrębniono z zelu i oczyszczono metodami standardowymi i strawiono enzymem restrykcyjnym Sali (Takara Shuzo). Jako wektora do klonowania ppc użyto pHSG399. pHSG399 strawiono enzymem restrykcyjnym Sali (Takara Shuzo) i zligowano z fragmentem DNA obejmującym zamplifikowany gen ppc. Otrzymany jak podano powyżej plazmid, posiadający gen ppc pochodzący z ATCC 13869, oznaczono jako pPCF.
[2] Ligowanie genu ppc z promotorem lysC
Plazmid pPCF otrzymany jak podano powyżej strawiono enzymem restrykcyjnym Dral (Takara Shuzo). Po usunięciu fragmentu DNA o wielkości około 150 pz położonego od strony 5' strukturalnego genu PEPC, przeprowadzono autoligację DNA, uzyskując plazmid pPCFds. pPCFds strawiono następnie enzymem restrykcyjnym Sali (Takara Shuzo), a utworzone lepkie końce przeprowadzono w końce tępe. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta.
p399AKYB zawierający gen lysC typu dzikiego otrzymany w przykładzie 1 strawiono eznymami restrykcyjnymi ApaLI i Pstl (Takara Shuzo), a utworzone lepkie końce przeprowadzono w końce tępe jak podano wyżej. Mniejszy fragment z otrzymanych dwu fragmentów DNA obejmuje Brevi.-ori i promotor lysC. Ten fragment zligowano z wymienionym wyżej fragmentem pPCFds otrzymanym przez trawienie Sali i doprowadzonym do postaci z tępymi końcami (DNA Ligation Kit, Takara Shuzo).
DNA w roztworze ligacyjnym wprowadzono do Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 metodą elektroporacji pulsowej (Sugimoto i wsp., japońskie zgłoszenie patentowe Nr 2-207791). Transformanty selekcjonowano na podłożu pełnym zawierającym 5 mikrog/ml chloramfenikolu. Z transformantów otrzymywano plazmidowe DNA i trawiono enzymem EcoRI w celu uzyskania plazmidu, w którym promotor genu lysC był zligowany z genem strukturalnym ppc w orientacji naturalnej. Uzyskany plazmid oznaczono jako pAKPFds. Proces konstrukcji plazmidu pAKPFds przedstawiono na fig 4. Gen ppc zligowany z promotorem genu lysC oznaczony jest dalej jako „gen ppc typu dzikiego w wysokim poziomie ekspresji”.
[3] Wprowadzenie genu ppc typu dzikiego o wysokim poziomie ekspresji do wektora
Gen ppc typu dzikiego w wysokim poziomie ekspresji otrzymany jak podano powyżej powielono techniką PCR i wprowadzono do wektora posiadającego miejsce startu replikacji (ori), pozwalające na autonomiczną replikację w korynebakteriach, jednak inne niz Brevi.-ori. Zsyntezowano startery DNA w postaci oligonukleotydu odpowiadającego części promotorowej genu lysC (Sek. Id Nr 7), w oparciu o sekwencję genu lysC Corynebacterium glutamicum (Mol. Microbiol., 5(5), 1197-1204 (1991); Mol. Gen. Genet., 224, 317-324 (1990)) i oligonukleotydu odpowiadającego części ppc (Sek. Id Nr 8), w oparciu o sekwencję genu ppc Corynebacterium glutamicum (0’Regan, M. i wsp., Gene 77, 237-251, 1989). Startery te umożliwiają powielenie fragmentu wielkości około 3150 pz obejmującego gen ppc typu dzikiego w wysokim poziomie ekspresji, a część końcowa otrzymanego fragmentu PCR może zostać strawiona enzymem restrykcyjnym KpnI. Syntezę DNA i reakcję PCR prowadzono tak, jak podano to w przykładzie 1.
Nowo skonstruowany wektor do klonowania odpowiedni dla korynebakterii (pVK7) zastosowano jako wektor służący do wprowadzenia genu ppc typu dzikiego w wysokim poziomie ekspresji do bakterii maczugowatej. pVK7 skonstruowano ligując pHSG299 (wektor
190 206
E. coli (Kri; Takeshita, S. i wsp., Gene 61, 63-74 (1987)) z pAM330, plazmidem krytycznym Brevibacterium lactofermentm, tak jak przedstawiono to poniżej. pHSG299 strawiono enzymem restrykcyjnym dającym jedno miejsce cięcia, AvaII (Takara Shuzo), uzupełniono do tępych końców stosując polimerazę DNA z faga T4. W zależności od orientacji wstawki pAM330 w pHSG299, otrzymano dwa plazmidy oznaczone pVK6 i pVK7, i pVK7 wykorzystano w dalszych eksperymentach. pVK7 ulega autonomicznej replikacji zarówno w E. coli, jak w Brevibacterium lactofermentum, posiada MCS (miejsce rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych), pochodzący z pHSG299 oraz lacZ'. Sposób konstrukcji pVK6 i pVK7 przedstawiono na fig 5.
Powielony fragment genu o wielkości około 3150 pz sprawdzono techniką elektroforezy agarozowej i następnie wyodrębniono z żelu i oczyszczono metodami standardowymi i strawiono enzymem restrykcyjnym KpnI (Takara Shuzo). Fragment DNA zligowano z wektorem pVK7 strawionym uprzednio enzymem KpnI. Otrzymany plazmid oznaczono jako pPwm. Sposób konstrukcji pPwm przedstawiono na fig 6.
Przykład 4
Otrzymanie plazmidu obejmującego kombinację zmutowanych genów lysC i lysA
Plazmid obejmujący zmutowane geny lysC, lysA i ori z bakterii maczugowatej otrzymano z plazmidu p399AK9B obejmującego zmutowany gen lysC i Brevi.-ori i z plazmidu p299LYSA obejmującego gen lysA. p299LYSA strawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i KpnI (Takara Shuzo) i doprowadzono do postaci z tępymi końcami. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Uzyskany fragment DNA zligowano z p399AK9B strawionego uprzednio enzymem Sali i doprowadzonego do postaci z tępymi końcami. W ten sposób otrzymano plazmid oznaczony symbolem pCL, obejmujący zmutowany gen lysC i lysA, zdolne do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. Sposób konstruowania pCL przedstawiono na fig. 7.
Przykład porównawczy 1
Otrzymanie dapA, dapB i ddh z Brevibacterium lactofermentum
Geny związane z biosyntezą L-lizyny inne niż lysC, lysA i ppc: dapA (kodujący syntazę kwasu dihydrodipikolinowego), dapB (kodujący reduktazę kwasu dihydrodipikolinowego) i ddh (kodujący dehydrogenazę kwasu diaminopimelinowego) uzyskano jak podano poniżej.
[1] Otrzymanie genu dapA i konstarukcja plazmidu zawierającego dapA
Szczep Brevibacterium lactofermentum typu dzikiego ATCC 13869 wykorzystano jako dawcę DNA. Chromosomalny DNA otrzymano standardowymi metodami. Fragment DNA obejmujący gen dapA zamplifikowano z chromosomalnego DNA techniką PGR. Do powielania użyto startery DNA, w postaci syntetycznych DNA o długości 23 nukleotydów, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek. Id Nr 21 i 22 w zestawieniu sekwencji i zostały użyte do zamplifikowania regionu wielkości ok. 1,5 kpz kodującego DDPS w oparciu o sekwencję Corynebacterium glutamicum (Nucleic Acids Res., 18(21), 6421, 1990; EMBL nr depozytu K53993). Syntezę DNA i reakcję PGR prowadzono tak, jak przedstawiono to w przykładzie 1. Jako wektora do klonowania wykorzystano plazmid pCR1000 (Invitrogen; Bio/Techniques 9, 657-663, 1991) zamplifikowanego fragmentu genu o wielkości 1411 pz i zligowano z powielonym fragmentem genu dapA. Ligacji dokonano stosując zestaw do ligacji (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. W ten sposób skonstruowano plazmid, w którym fragment dapA o wielkości 1411 pz zamplifikowany z chromosomu Brevibacterium lactofermentum został zligowany z pCR1000. Plazmid otrzymany jak podano powyżej, posiadający dapA pochodzący z ATCC 13869 oznaczono symbolem pCRDAPA.
Szczep stransformowany AJ12106, otrzymany przez wprowadzenie pCRDAPA do E coli JM109 został przekazany do depozytu międzynarodowego 25 05 1995 i uzyskał numer depozytowy FERM BP-513.3 w National Institute of Bioscience and Human Technology należącym do Agency of Industrial Science and Technology w ramach Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonia), zgodnie z układem budapeszteńskim.
Do pCRDAPA wprowadzono następnie Brevi.-ori w celu otrzymania plazmidu niosącego gen dapA zdolny do autonomicznej replikacji w korynebakterii. pHK4 strawiono enzyma16
190 206 mi restrykcyjnymi KpnI i BamHI (Takara Shuzo) i doprowadzono do postaci z tępymi końcami. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych, do otrzymanego produktu zligowano ufosforylowany linker Smal (Takara Shuzo), tak by fragment odpowiadający części Brevi.-ori mógł być wycinany z pHK4 jedynie przez trawienie Smal. Otrzymany plazmid strawiono Smal i otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano z pCRDAPA strawionym uprzednio Smal, otrzymując plazmid zawierający dapA, zdolny do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. Plazmid oznaczono symbolem pDPSB. Sposób konstruowania plazmidu pDPSB (Kmr) przedstawiono na fig 8.
[2] Otrzymanie dapB i utworzenie plazmidu zawierającego gen dapB
Szczep Brevibacterium lactofermentum typu dzikiego ATCC 13869 wykorzystano jako dawcę DNA. Chromosomalny DNA otrzymano ze szczepu ATCC 13896 standardowymi metodami. Fragment DNA obejmujący gen dapB zamplifikowano z chromosomalnego DNA techniką PGR. Do powielania użyto startery DNA, w postaci syntetycznych DNA o długości 23 nukleotydów, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek. Id Nr 19 i 20 w zestawieniu sekwencji i zostały użyte do zamplifikowania regionu wielkości ok. 2,0 kpz kodującego DDPR w oparciu o sekwencję Brevibacterium lactofermentum (J. Bacteriol., 175(9), 2743-2749 (1993). Syntezę DNA i reakcję PCR prowadzono tak, jak podano w przykładzie 1. Jako wektora użyto plazmidu pCR-Script (Invitrogen), do klonowania zamplifikowanego fragmentu DNA liczącego 2,001 pz i zligowano go ze zamplifikowanym fragmentem genu dapB. Utworzono plazmid, w którym fragment genu dapB o wielkości 2001 pz zamplifikowany z chromosomu Brevibacterium lactofermentum zligowany został z plazmidem pCR-Script. Uzyskany plazmid przedstawiony powyżej, posiadający dapB pochodzący z ATCC 13896, oznaczono jako pCRDAPB. Stransformowany szczep AJ13107 uzyskany przez wprowadzenie pCRDAPB do E. coli JM 109 został przekazany do depozytu międzynarodowego 26 05 1995 i uzyskał numer depozytowy FERM BP-511.4 w National Institute of Bioscience and Human Technology należącym do Agency of Industrial Science and Technology w ramach Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonia), zgodnie z układem budapeszteńskim.
Fragment liczący 1101 pz obejmujący gen kodujący DDPR został wyodrębniony poprzez trawienie pCRDAPB EcoRV i SphI. Fragment ten został następnie zligowany z pHSG399 strawionym HincII i SphI w celu otrzymania plazmidu. Otrzymany plazmid oznaczono symbolem p399DPR.
Brevi.-ori wprowadzono do p399DPR w celu otrzymania plazmidu niosącego gen dapB zdolny do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. pHK4 strawiono enzymem restrykcyjnym KpnI, a utworzone lepkie końce przeprowadzono w końce tępe. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych, do otrzymanego produktu zligowano ufosforylowany linker BamHI (Takara Shuzo), tak by fragment odpowiadający części Brevi.-ori mógł być wycinany z pHK4 przez trawienie wyłącznie BamHI. Plazmid strawiono BamHI i otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano z plazmidem p399DPR również strawionym BamHI w celu przygotowania plazmidu zawierającego gen dapB zdolny do autonomicznej replikacji w komórkach korynebakterii. Otrzymany plazmid oznaczono jako pDPRB. Sposób konstrukcji plazmidu pDPRB przedstawia fig 9.
[3] Otrzymanie genu ddh i utworzenie plazmidu zawierającego ddh
Gen ddh otrzymano amplifikując gen ddh z chromosomalnego DNA Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 techniką PCR, używając do powielania dwu oligonukleotydowych starterów DNA, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek. Id Nr 23 i 24 przygotowanych w oparciu o znaną sekwencję genu ddh z Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. i wsp., Nucleic Acids Res., 15, 3917, 1987). Uzyskany zamplifikowany fregment DNA strawiono EcoT22I i Aval i doprowadzono do postaci z tępymi końcami. Następnie fragment ten wstawiono w miejsce Smal w plazmidzie pMW119 otrzymując plazmid pDDH.
Następnie pDDH strawiono Sali i EcoRI i utworzono tępe końce. Tak otrzymany fragment zligowano z pUC18 strawionym uprzednio Smal. Uzyskany plazmid oznaczono symbolem pUCISDDH.
190 206
Do pUCISDDH wprowadzono następnie Brevi.-ori w celu otrzymania plazmidu niosącego gen ddh zdolny do autonomicznej replikacji w korynebakterii. pHK4 strawiono enzymami restrykcyjnymi KpnI i BamHI i doprowadzono do postaci z tępymi końcami. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych, do otrzymanego produktu zligowano ufosforylowany linker Pstl (Takara Shuzo) tak, ze fragment odpowiadający części Brevi.-ori został wprowadzony w miejsce Pstl plazmidu pHSG299. Następnie plazmid puC18DDH strawiono Xbal i KpnI i otrzymany fragment zligowano z pPK4 strawionym uprzednio KpnI i Xbal. W ten sposób otrzymano plazmid zawierający gen ddh zdolny do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. Plazmid oznaczono symbolem pPK4D. Sposób konstruowania plazmidu pPK4D przedstawiono na fig 10.
Przykład porównawczy2
Konstrukcja plazmidu obejmującego kompozycję zmutowanego genu lysC i dapA, dapB lub duh [1] Konstrukcja kompozycji zmutowanego genu lysC i dapA
Z plazmidu pCRDAPA obejmującego zmutowany gen lysC i Brevi.-ori otrzymano plazmid obejmujący zmutowany gen lysC, dapA i miejsce startu replikacji (ori) specyficzne dla bakterii maczugowatej. p399AK9B strawiono całkowicie Sali i doprowadzono do formy z tępymi końcami. Następnie zligowano linker EcoRI w celu uzyskania plazmidu, w którym miejsce Sali zmodyfikowano tak, by było rozpoznawane przez EcoRI. Uzyskany plazmid oznaczono jako p399AK9BSE. Zmutowany gen lysC i Brevi.-ori wycięto w postaci jednego fregmentu przez częściowe trawienie plazmidu p399AK9BSE enzymem EcoRI. Fragment otrzymany zligowano z pCRDAPA strawionym uprzednio EcoRI. Otrzymany plazmid nazwano pCRCAB. Plazmid ten ulega autonomicznej replikacji w komórce E. coli i w komórce bakterii maczugowatej i nadaje gospodarzowi oporność na kanamycynę. Plazmid obejmuje kompozycję zmutowanego genu lysC i dapA. Sposób konstrukcji plazmidu pCRCAB przedstawiono na fig 11.
[2] Konstrukcja plazmidu obejmującego kompozycję zmutowanego genu lysC i dapB
Plazmid obejmujący zmutowany gen lysC i dapB przygotowano w oparciu o plazmid p399AK9 zawierający zmutowany gen lysC i w oparciu o plazmid p399DPR posiadający gen dapB. Fragment o wielkości około 1101 pz obejmujący gen strukturalny kodujący DDPR wycięto z plazmidu p399DPR enzymami EcoRV i SphI. Fragment ten zligowano z plazmidem p399AK9 strawionym uprzednio Sali i następnie przeprowadzonym do postaci z tępymi końcami i strawionym następnie enzymem SphI, w celu otrzymania plazmidu obejmującego kompozycję zmutowanego genu lysC i dapB. Plazmid ten nazwano p399AKDDPR.
Do p399AKDDPR wprowadzono następnie Brevi.-ori. pHK4 obejmujący Brevi.-ori strawiono enzymem restrykcyjnym KpnI (Takara Shuzo) i doprowadzono do postaci z tępymi końcami. Utworzenie końców tępych wykonano przy pomocy zestawu DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z zaleceniami producenta. Po utworzeniu końców tępych, do otrzymanego produktu zligowano ufosforylowany linker BamHI (Takara Shuzo), tak by fragment odpowiadający części Brevi.-ori mógł być wycinany z pHK4 jedynie przez trawienie BamHI. Otrzymany plazmid strawiono BamHI i otrzymany fragment Brevi.-ori zligowano zp399AKDDPR strawionym uprzednio BamHI otrzymując plazmid zawierający zmutowany gen lysC i dapB, zdolny do autonomicznej replikacji w bakterii maczugowatej. Plazmid oznaczono symbolem pCB. Sposób konstruowania plazmidu pCB przedstawiono na fig 12.
[3] Konstrukcja plazmidu obejmującego kombinację zmutowanego genu lysC i ddh
Plazmid obejmujący zmutowany gen lysC, ddh i miejsce początku replikacji specyficzne dla korynebakterii otrzymano z plazmidu pUCISDDH zawierającego gen ddh i plazmidup399AK9B zawierającego zmutowany gen lysC i Brevi.-ori Plazmid pUCISDDH strawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI (Takara Shuzo), przeprowadzono do postaci z tępymi końcami, zligowano jego końce z polilinkerem Sali w celu zmiany miejsca EcoRI na miejsce Sali Uzyskany plazmid strawiono enzymem Sali w celu otrzymania fragmentu DNA obejmującego gen ddh.
190 206
Następnie plazmid p399AK9B strawiono enzymem restrykcyjnym SalI i zligowano z fragmentem DNA obejmującym gen ddh. Następnie przygotowano plazmid obejmujący zmutowany gen lysC, ddh i Brevi.-ori, umożliwiający autonomiczną replikację w korynebakterii i oznaczono symbolem pCD. Sposób otrzymania plazmidu pCD przedstawiono na fig. 13.
Przykład 5
Wprowadzenie plazmidów obejmujących geny biosyntezy L-lioyuy go socospu Brevibacterium lactofermentum wytwarzającego L-lizynę
Plazmidy obejmujące geny biosyntezy L-lizyny utworzone jak podano powyżej, tzn. p399AK9B (Cm'), pLYSAB (Cm'), pPwm (Km'), pCRCAB (Km'), pCB (Cm'), pCB (Cmr), pCL (Cm'), wprowadzono odpowiednio do bakterii wytwarzającej L-lizynę AJ1W82 (NRRL B-11470) Brevibacterium lactof ermentum. Szczep AJ11082 charakteryzuje się cechą oporności na AEC. Wymienione plazmidy wprowadzano sposobem elektroporacji pulsowej (Sugimoto i wsp., japońskie zgłoszenie patentowe Nr 2-207791). Transformanty wybierano wykorzystując obecność genów markerowych warunkujących oporność na antybiotyki w plazmidowym DNA. Transformanty selekcjonowano na podłożu pełnym zawierającym 5 mikrog/ml chloramfenikolu, gdy wprowadzano plazmid nadający oporność na chloramfenikol lub transformanty selekcjonowano na podłożu pełnym zawierającym 25 mikrog/ml kanamycyny, gdy wprowadzano plazmid nadający oporność na kanamycynę.
Do szczepu, spośród otrzymanych transformantów, w którym wzmocniony został zmutowany gen lysC i lysA, wprowadzano pPwm (Km') w celu uzyskania szczepu, w którym wzmocnione zostały trzy geny: zmutowany gen lysC, gen lysA i gen ppc (AJ11082/pCL/pPwm). Transformanty selekcjonowano na podłożu pełnym zawierającym 5 mikrog/ml chloramfenikolu i 25 mikrog/ml kanamycyny.
Przykład 6
Wytwarzanie L-lizyny
Każdy z otrzymanych w przykładzie 5 transformantów hodowany był w podłożu właściwym dla wytwarzania L-lizyny, w celu oceny produktywności L-lizyny. Pożywka odpowiednia dla wytwarzania L-lizyny posiada następujący skład:
[Pożywka odpowiednia dla wytwarzania L-lizyny]
Następujące składniki, poza węglanem wapniowym zostały rozpuszczone (w 1 litrze) i pH zostało ustalone na 8,0 (KOH). Pożywkę wysterylizowano przy 115°C przez 15 minut i dodano wysterylizowany uprzednio gorącym powietrzem w stanie suchym węglan wapniowy (50 g).
Do pożywki dodano zatem:
glukozę 100 g (NH4)2SO4 55g
KH2PO4 1 g
MgSO4 · 7H2O 1 g biotynę 500 mikrog tiaminę 2000 mikrog
FeSO4 · 7H2O 0,01 g
MnSO4 0,01 g amid kwasu nikotynowego 5 mg hydrolizat białkowy (Mamenou) 30 ml węglan wapniowy 50 g
Każdy z różnych typów transformantów i szczepów wyjściowych został zaszczepiony w pożywce o składzie podanym powyżej i następnie hodowany przy 31,5°C z wytrząsaniem. Ilości uzyskanej po od 40 do 72 godzinach hodowli L-lizyny podano w tabeli 1. W talebli zmutowanny gen lysC oznaczono jako lysC*.
190 206
Tabela 1
Akumulacja L-lizyny po okresie hodowli od 40 do 72 godzin
Szczep bakterii /plazmid Wprowadzany gen Ilość wytworzonej L-lizyny
po 40 godz po 72 godz
AJ 11082 22,0 29,8
AJ11082/p399AK9B lysC* 16,8 34,5
AJ1082/pLYSAB lysA 19,8 32,5
AJ1082/pPwm ppc 20,7 28,9
AJ 11082/pCRCAB lysC*, dapA 19,7 36,5
AJ11082/pCB lysC*, dapB 23,3 35,0
AJ11082/pCD lysC*, ddh 15,0 27,0
AJH082/pCL lysC*, lysA 24,0 44,0
AJ 11082/pCL/pPwm lysC*, lysA, ppc 25,0 45,2
Jak podano to powyżej, gdy zmutowany gen lysC, gen lysA lub ppc zostały wzmocnione w układzie pojedynczym, lub gdy zmutowany gen lysC został wzmocniony w kompozycji z dapA lub ddh, ilość wytworzonej L-lizyny była większa lub równa ilości wytworzonej przez szczep wyjściowy po 72 godzinach hodowli, jednak ilość wytworzonej L-lizyny była mniejsza niż ilość wytworzonej L-lizyny przez szczep wyjściowy po 40 godzinach hodowli, tzn. szybkość wytwarzania L-lizyny była mniejsza podczas hodowania przez czas krótszy.
Podobnie, gdy zmutowany gen lysC i ddh zostały wzmocnione w kompozycji, ilość wytworzonej L-lizy-ny była mniejsza niż ilość wytworzona przez szczep wyjściowy po 40 godzinach i 72 godzinach hodowli.
Z drugiej strony, w przypadku szczepu ze wzmocnionym genem dapB i zmutowanym genem lysC wzrost uległ polepszeniu, szybkość wytwarzania L-lizyny została skutecznie polepszona przy krótkim okresie hodowli, jak również zostało polepszone gromadzenie L-lizyny w hodowli przy długim okresie hodowli.
W przypadku szczepu, w którym trzy geny· zmutowany gen lysC, lysA i ppc zostały jednocześnie wzmocnione, produktywność L-lizyny została jeszcze bardziej polepszona.
190 206
ZESTAWIENIE SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY: AJINOMOTO CO., LTD.
(ii) NAZWA WYNALAZKU: SPOSÓB WYTWARZANIA L-LIZYNY (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 24 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRES:
(B) ULICA:
(C) MIASTO:
(E) KRAJ:
(F) KOD:
(v) FORMAT ZAPISU KOMPUTEROWEGO:
(A) TYP PODŁOŻA: Dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSYTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Version #1.30 (vi) DANE ZGŁASZAJĄCEGO:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: , (B) DATA ZGŁOSZENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 8-325658 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 05 12 1996 (viii) INFORMACJA O PRAWNIKU:
(A) NAZWISKO:
(B) NUMER REJESTRACYJNY:
(ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:
(A) TELEFON:
(B) FAX:
(2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) LANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 1:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 2:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) LANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
190 206 (A) OPIS: SIntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: tak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 2:
ACGGAATTCA ATCTTACGGC C (2) INFORMACJA SEK ID NR 3:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1643 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) LAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM: Brevibacteriura lactofermencum (B) SZCZEP: ATCC 13869 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 3:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240
GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300
ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360
GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420
CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480
GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540
GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600
AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660
TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720
GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780
AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840
TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960
CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020
GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080
GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140
GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200
CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260
CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320
CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGĄTCCGCAT TTCCGTGCTG 1380
ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC AtGaGCAGTT CCAGCTGGGC 1440
GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500
TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560
CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACiGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620 CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 4:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1643 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) laNcuchowość. DWUNICIOWA (d) TOPOLOGIA: LINIOWA (ii) TYP CZĄSTECZKI: GENOMOWY DNA (vi) ŹRÓDŁO (A) ORGANIZM: Brevibaccerium lactofermentum
190 206 (B) szczep:ATCC 13869 (ix) CEHCHY· (A) NAZWA· CDS (sekwencja kodująca) (SEKWENCJA KODUJĄCA) (B) POŁOŻENIE· 217.. 1482 (xi) OPIS SEKWENCJI· SEK ID NR 4·
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA 120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234
Met Ala Leu Val Val Gin
5
AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282
Lys Tyr Gly Gly 10 Ser Ser Leu Glu Ser 15 Ala Glu Arg Ile Arg 20 Asn Val
GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330
Ala Glu Arg 25 Ile Val Ala Thr Lys 30 Lys Ala Gly Asn Asp 35 Val Val Val
GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378
Val Cys 40 Ser Ala Met Gly Asp 45 Thr Thr Asp Glu Leu 50 Leu Glu Leu Ala
GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426
Ala 55 Ala Val Asn Pro val 60 Pro Pro Ala Arg Glu 65 Met Asp Met Leu Leu 70
ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474
Thr Ala Gly Glu Arg 75 Ile Ser Asn Ala Leu 80 Val Ala Met Ala Ile 85 Glu
TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522
Ser Leu Gly Ala 90 Glu Ala Gin Ser Phe 95 Thr Gly Ser Gin Ala 100 Gly Val
CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570
Leu Thr Thr 105 Glu Arg His Gly Asn 110 Ala Arg Ile Val Asp 115 Val Thr Pro
GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618
Gly Arg 120 Val Arg Glu Ala Leu 125 Asp Glu Gly Lys Ile 130 Cys Ile Val Ala
GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666
Gly 135 Phe Gin Gly Val Asn 140 Lys Glu Thr Arg Asp 145 val Thr Thr Leu Gly 150
CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714
Arg Gly Gly Ser Asp 155 Thr Thr Ala Val Ala 160 Leu Ala Ala Ala Leu 165 Asn
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762
Ala Asp Val Cys 170 Glu Ile Tyr Ser Asp 175 Val Asp Gly Val Tyr 180 Thr Ala
GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810
Asp Pro Arg 185 Ile Val Pro Asn Ala 190 Gin Lys Leu Glu Lys 195 Leu Ser Phe
GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858
Glu Glu 200 Met Leu Glu Leu Ala 205 Ala Val Gly Ser Lys 210 Ile Leu Val Leu
CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906
Arg 215 Ser Val Glu Tyr Ala 220 Arg Ala Phe Asn Val 225 Pro Leu Arg Val Arg 230
TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954
Ser Ser Tyr Ser Asn 235 Asp Pro Gly Thr Leu 240 Ile Ala Gly Ser Met 245 Glu
GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002
Asp Ile Pro Val 250 Glu Glu Ala Val Leu 255 Thr Gly Val Ala Thr 260 Asp Lys
TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050
Ser Glu Ala 265 Lys Val Thr Val Leu 270 Gly Ile Ser Asp Lys 275 Pro Gly Glu
GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098
Ala Ala 280 Lys Val Phe Arg Ala 285 Leu Ala Asp Ala Glu 290 Ile Asn Ile Asp
ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146
Met 295 Val Leu Gin Asn Val 300 Ser Ser Val Glu Asp 305 Gly Thr Thr Asp Ile 310
190 206
ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194
Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu
315 320 325
AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242
Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp
330 335 340
CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290
Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro
345 350 355
GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338
Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn
360 365 370
ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386
Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg
375 380 385 390
GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434
Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gin
395 400 405
CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 14 82
Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
410 415 420
AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 5:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 421 aminokwasów (B) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 5:
Met 1 Ala Leu Val Val 5 Gin Lys Tyr Gly Gly 10 Ser Ser Leu Glu Ser 15 Ala
Glu Arg Ile Arg 20 Asn Val Ala Glu Arg 25 Ile Val Ala Thr Lys 30 Lys Ala
Gly Asn Asp 35 Val Val Val Val Cys 40 Ser Ala Met Gly Asp 45 Thr Thr Asp
Glu Leu 50 Leu Glu Leu Ala Ala 55 Ala Val Asn Pro Val 60 Pro Pro Ala Arg
Glu 65 Met Asp Met Leu Leu 70 Thr Ala Gly Glu Arg 75 Ile Ser Asn Ala Leu 80
Val Ala Met Ala Ile 85 Glu Ser Leu Gly Ala 90 Glu Ala Gin Ser Phe 95 Thr
Gly Ser Gin Ala 100 Gly Val Leu Thr Thr 105 Glu Arg His Gly Asn 110 Ala Arg
Ile Val Asp 115 Val Thr Pro Gly Arg 120 Val Arg Glu Ala Leu 125 Asp Glu Gly
Lys Ile 130 Cys Ile Val Ala Gly 135 Phe Gin Gly Val Asn 140 Lys Glu Thr Arg
Asp 145 Val Thr Thr Leu Gly 150 Arg Gly Gly Ser Asp 155 Thr Thr Ala Val Ala 160
Leu Ala Ala Ala Leu 165 Asn Ala Asp Val Cys 170 Glu Ile Tyr Ser Asp 175 Val
Asp Gly Val Tyr 180 Thr Ala Asp Pro Arg 185 Ile Val Pro Asn Ala 190 Gin Lys
Leu Glu Lys 195 Leu Ser Phe Glu Glu 200 Met Leu Glu Leu Ala 205 Ala Val Gly
190 206
Ser Lys 210 Ile Leu Val Leu Arg 215 Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala 220 Phe Asn
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Iie Ser Thr Ser Glu Iie Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
(2) INFORMACJA DAL SEK ID NR 6:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1643 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM: Brevibacterium lactofermentum (B) SZCZEP: ATCC 13869 (ix) CECHY:
(A) NAZWA: CDS (sekwencja kodująca) (B) POZYCJA: 964.. 1482 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 6:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCtCUATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TWAAGCCCCA GGJACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATWAAGGTAG AGTTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGWAAAT 24 0 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGTACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA WATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG TGGAjTCCCTT 4 80 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACGAC CGAGCGCCAC 54 0 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGTAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG A-AACCCGCGA ^^C^^ΓC^C^C^CC^C^C( 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GWACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG 7 80 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGG(VACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCTATGT GCCACTTCGC 900
190 206
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960
CCT GTG Met 1 GAA GAA GCA GTC CTT Leu ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC Ser GAA Glu 15 1008
Glu Glu Ala Val 5 Thr Gly Val Ala 10 Thr Asp Lys
GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056
Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala
20 25 30
AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104
Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met val
35 40 45
CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152
Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe
50 55 60
ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200
Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys
65 70 75
CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248
Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val
80 85 90 95
GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296
Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val
100 105 110
ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344
Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp val Asn Val Asn Ile Glu
115 120 125
TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392
Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp
130 135 140
GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440
Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Glm Phe Gln Leu Gly
145 150 155
GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490
Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
160 165 170
AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG AGACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TGCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 7:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 172 aminokwasów (b) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID Nr 7:
net Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala 10 Thr Asp Lys Ser Glu 15 Ala
1 5
Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys
20 25 30
Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu
35 40 45
Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr
50 55 60
Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu
65 70 75 80
Gin Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly
85 90 95
190 206
Lys Val Ser Leu 100 Val Gly Ala Gly Met Lys 105 Ser His Pro Gly 110 Val Thr
Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu
115 120 125
Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp
130 135 140
Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly
145 150 155 160
Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
165 170
(2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 8:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy.
(A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 8:
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 9:
(1) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) LAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: tak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 9:
CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 10:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 3579 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM: Brevibaccerium lactofermentum (B) SZCZEP: ATCC 13869 (ix) CECHY:
190 206 (A) NAZWA: CDS (sekwencja kodująca) (B) POZYCJA: 533..2182 (ix) CECHY:
(A) NAZWA: CDS (sekwencja kodująca) (B) POZYCJA: 2188..3522 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK TID NR 10:
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAAGT CGGAGGTTTG GTACATGGCT 60
TCTGGCCAGT TTATGCAGTC GGCGGC^G CAGCGCACCA GGGCGftCCGA 120
CTTACCGAAC AGCCTCCTCG GCTTTGGCCC TTTG^^^^ AGCCC7ACGCG 180
GAGAGCGCCA ACTCACCCAT CAGGAATGGT TCCGMGCGGC CACCATrGAGC 240
CGAGGTAAGA GTGACTGGGG GCGCCCTGTT TGGCCCGGCG AGGGGGGCGG GCGCGGCGGC 300
AGGCCGCAGG GAGACCAAAAAGGGGCTTGGC CTCAGGGTAG TCCGCTGGGGG. CT^i^AC 360
TTGTGGTATT T^TG^TTC CGGGCAGGGA 4 20
TCTTAGAAAC CAGAGACAGAGACCAAGGAG TT^T^T^(^;^TT^;Ai TAA^G^^t^C^C^^C^ ATTGCTTAGA 4 80
ACGAGGCGGC GTATTCTGTGCGACGGGTGT ACC^^CC^I^CIIG GCAGTTGGGT CC ATG 535
Met
ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT 583
Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu Val
5 10 15
TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT 631
Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val Val
20 25 30
GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT 679
Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile
35 40 45
GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT 727
Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu Ala
50 55 60 65
ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT 775
Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser Ala
70 75 80
GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT .TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA GCA 823
Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala Ala
85 90 95
CAG GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT TTC GGA 871
Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe Gly
100 105 110
AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC GTT TCT 919
Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser
115 120 125
GCA AAC CCA ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC GCC GCT GCC 967
Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala
130 135 140 145
GTG GGT GAC TCT TTG GGT CGT GTG CTG GAG GCT TCC GGC GCG AAA GTG 1015
Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys Val
150 155 160
ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC 1063
Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg Phe
165 170 175
GCT TTG TCC CTT CTT GCA GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC 1111
Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp
180 185 190
GGT TAT GGC GGC GAA TAC ATT AAG GAA ATT GCG GAG GCA ATC GTC GAA 1159
Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val Glu
195 200 205
AAG CAT CCT CAG GCG TTG GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT 1207
Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu Leu
210 215 220 225
TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC 1255
Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser Ser
230 235 240
CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC 1303
Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser
245 250 255
CTG TTC GAG TCC GCG GTG GAC AAG GCC CGC CAG CGC TGC AAG GAC 1351
Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys Asp
260 265 270
190 206
AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGG TGG CTG CGT TCC ACC 1399
Asn Gly Asn 275 Leu Tyr Glu Asn 280 Glu Gly Ala Trp Trp 285 Leu Arg Ser Thr
GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC 1447
Glu Phe Gly 290 Asp Asp Lys 295 Asp Arg Val Val Ile Lys 300 Ser Asp Gly Asp 305
GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC 1495
Ala Ala Tyr Ile Ala Gly 310 Asp Ile Ala Tyr Val Ala 315 Asp Lys Phe Ser 320
CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT 1543
Arg Gly His Asn Leu Asn 325 Ile Tyr Met 330 Leu Gly Ala Asp His His Gly 335
TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA CTT GGC TAC AAG CCA 1591
Tyr Ile Ala 340 Arg Leu Lys Ala Ala 345 Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Pro 350
GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC 1639
Glu Gly Val 355 Glu Val Leu Ile 360 Gly Gin Met Val Asn 365 Leu Leu Arg Asp
GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA 1687
Gly Lys Ala 370 Val Arg Met 375 Ser Lys Arg Ala Gly Thr 380 Val Val Thr Leu 385
GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC· GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG 1735
Asp Asp Leu Val Glu Ala 390 Ile Gly Ile Asp Ala Ala 395 Arg Tyr Ser Leu 400
ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG 1783
Ile Arg Ser Ser Val Asp 405 Ser Ser Leu 410 Asp Ile Asp Leu Gly Leu Trp 415
GAA TCC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC 1831
Glu Ser Gin 420 Ser Ser Asp Asn Pro 425 Val Tyr Tyr Val Gin Tyr Gly His 430
GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACC TTG GGT GTC ACC 1879
Ala Arg Leu 435 Cys Ser Ile Ala 440 Arg Lys Ala Glu Thr 445 Leu Gly Val Thr
GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT 1927
Glu Glu Gly 450 Ala Asp Leu 455 Ser Leu Leu Thr His Asp 460 Arg Glu Gly Asp 465
CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT 1975
Leu Ile Arg Thr Leu Gly 470 Glu Phe Pro Ala Val Val 475 Lys Ala Ala Ala 480
GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA TTA GCT 2023
Asp Leu Arg Glu Pro His 485 Arg Ile Ala 490 Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala 495
GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CTT CCA AAG GTT 2071
Gly Thr Phe 500 His Arg Phe Tyr Asp 505 Ser Cys His Ile Leu Pro Lys Val 510
GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CGT CTG GCA CTT GCA GCA 2119
Asp Glu Asp 515 Thr Ala Pro Ile 520 His Thr Ala Arg Leu 525 Ala Leu Ala Ala
GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC 2167
Ala Thr Arg 530 Gin Thr Leu 535 Ala Asn Ala Leu His Leu 540 Val Gly Val Ser 545
GCA CCG GAG Ala Pro Glu AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA Lys Met Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu 550 1 5 2214
CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC 2262
Leu Pro Ala 10 His Val Trp 15 Pro Arg Asn Ala Val Arg 20 Gin Glu Asp Gly 25
190 206
GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC 2310
Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr
30 35 40
GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT 2358
Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys
45 50 55
CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA 2406
Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala
60 65 70
TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG 2454
Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu
75 80 85
GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG 2502
Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu
90 95 100 105
GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA 2550
Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys
110 115 120
GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG 2598
Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gin Asn Gly Val Gly His Val
125 130 135
GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA.' CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT 2646
Val Leu Asp Ser Ala Gin Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala
140 145 150
GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC 2694
Gly Glu Gly Lys Ile Gin Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile
155 160 165
GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG 2742
Glu Ala His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gin Lys
170 175 180 185
TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC 2790
Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala
190 195 200
GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT 2838
Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val
205 210 215
GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC 2886
Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg
220 225 230
GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT 2934
Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gin Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu
235 240 245
CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT 2982
Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala
250 255 260 265
GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA 3030
Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala
270 275 280
GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT 3078
Val Gly Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu
285 290 295
GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC 3126
Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr
300 305 310
GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC 3174
Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg
315 320 325
190 206
CGT TAC ATC GCC GTG GAC GGA GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA 3222
Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala
330 335 340 345
CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA 3270
Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu
350 355 360
GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC 3318
Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly
365 37 0 375
GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC 3366
Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly
380 385 390
GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC 3414
Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser
395 400 405
TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT 3462
Ser Arg Tyr A3h Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala
410 415 420 425
GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC 3510
Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu
430 435 440
TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562
Ser Leu Glu Ala
445
GTGGAGGGCG GTTTTGG 3579 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 11:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ. 550 aminokwasów (B) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 11:
Met 1 Thr Pro Ala Asp 5 Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu
10 15
Val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gin Val
20 25 30
Val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn
35 40 45
ile Ala Leu Gin Val Ala Lys Lys Val Gly Gin Asn Pro Arg Asp Leu
50 55 60
Ala Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser
65 70 75 80
Ala Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Gin Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gin Gly Glu Thr Phe
100 105 110
Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe vai
115 120 125
Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala
130 135 140
Ala Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys
145 150 155 160
Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gin Ile Asp Arg
165 170 175
Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu
180 185 190
190 206
Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val
195 200 205
Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu
210 215 220
Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser
225 230 235 240
Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn
245 250 255
Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln val Leu Lys
260 265 270
Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser
275 280 285
Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly
290 295 300
Asp Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe
305 310 315 320
Ser Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His
325 330 335
Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys
340 345 350
Pro Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg
355 360 365
Asp Gly Lys Ala val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr
370 375 380
Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser
385 390 395 400
Leu He Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu
405 410 415
Trp Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly
420 425 430
His Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val
435 440 445
Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly
450 455 460
Asp Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala
4 65 470 475 480
Ala Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu
485 490 495
Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys
500 505 510
Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala
515 520 525
Ala Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val
530 535 540
Ser Ala Pro Glu Lys Met
545 550 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR12:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 445 aminokwasów (B) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 12:
Met 1 Ala Thr Val Glu 5 Asn Phe Asn Glu Leu 10 Pro Ala His Val Trp 15 Pro
Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
20 25 30
190 206
Pro Leu Pro 35 Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly 40 Thr Pro Leu 45 Phe Val Val
Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50 55 60
Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys
65 70 75 80
Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
85 90 95
Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
100 105 110
Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
115 120 125
Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
130 135 140
Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp
145 150 155 160
Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
165 170 175
Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
195 200 205
Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
210 215 220
Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln
225 230 235 240
Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
245 250 255
Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Prę Leu Asn Val Ala
260 265 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
275 280 285
Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile
290 295 300
Ala Gly Pro Ser Thr val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp
305 310 315 320
vai His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly
325 330 335
Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
340 345 350
Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
355 360 365
Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
370 375 380
Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala
385 390 395 400
Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
405 410 415
Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
420 425 430
Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala
435 440 445
(2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 13:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy
190 206 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 13:
TCGTCGGTCA GCCTGACGTC GAC (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 14:
(ii) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: tak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 14:
TCTTGGTGTCGAAAGTGCACACC (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 15:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 3533 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy DNA (vi) ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM: Brevibacterium lactofermentum (B) SZCZEP: ATCC 13869 (ix) CECHY.
(A) NAZWA: CDS (sekwencja kodująca) (B) POZYCJA: 321.. 3077 (xi) OPIS SEKWENCJE SEK ID NR 15.
GGTGGTTCTG TTAAGGCAGA AACCGTCGCT GAGATCGTCG GTCAGCCTGA CGTCGACGGC 60 GGACTTGTCG GTGGCGCTTC CCTCGACGGT GAAGCATTCG CCAAGCTGGC TGCCAACGCT 120 GCGAGCGTTG CTTAAAGTAC AGAGCTTTAA AGCACAGCCT TAAAGGACAG CCTTAAAAGA 120 CAAGCACTGT AGGAGTGCGG TTTTGATGAG CCCATGAAAG CCAGCCACAC CAAACCGCCA 200 GĆTGGGCGCC TGTTTTGCTG GGTGATTTTT TATCTCATGC AGGGCAAGAG CCTCAGGGTG 300 GGAGGGTGTT TGAGGTAGTT ATG ACT GAT TTT TTA CGC GAT GAC ATC AGG 300
Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg
TTC CTC GGT CAA ATC CTC
Phe Leu Gly Gln Ile 15 Leu
GAG GTT TAT GAA CTG GTC
Glu Val Tyr Glu 00 Leu Val
GCC AAG GGC AAC GCC GAA
Ala Lys Gly 00 Asn Ala Glu
ATT ACT CCA GCC AAG GCA
Ile Thr 00 Pro Ala Lys Ala
GCT CTG CTG GCT AAC CTG
Ala 70 Leu Leu Ala Asn Leu 00
1 0
GGT GAG GTA ATT GCG GAA
Gly Glu Val Ile 00 Ala Glu
GAA CAA GCG CGC CTG ACT
Glu Gln Ala 00 Arg Leu Thr
ATG GAT AGC CTG GTT CAG
Met Asp 00 Ser Leu Val Gln
ACA CCG ATT GCT CGC GCA
Thr 00 Pro Ile Ala Arg Ala 70
GCG GAA GAC CTC TAC GAT
Ala Glu Asp Leu Tyr 00 Asp
CAA GAA GGC CAG 090
Gln Glu Gly 00 Gln
TCT TTT GAT ATC 000
Ser Phe 00 Asp Ile
GTT TTC GAC GGC 090
Val 00 Phe Asp Gly
TTT TCC CAC TTC 000
Phe Ser His Phe
GAA GAG CTT CGT 090
Glu Glu Leu Arg 90
190 206
GAA CAG GCT CTC GAT GCA GGC GAC ACC CCT CCG GAC AGC ACT CTT GAT 638
Glu Gin Ala Leu Asp 95 Ala Gly Asp Thr Pro 100 Pro Asp Ser Thr Leu 105 Asp
GCC ACC TGG CTG AAA CTC AAT GAG GGC AAT GTT GGC GCA GAA GCT GTG 686
Ala Thr Trp Leu 110 Lys Leu Asn Glu Gly 115 Asn Val Gly Ala Glu 120 Ala Val
GCC GAT GTG CTG CGC AAT GCT GAG GTG GCG CCG GTT CTG ACT GCG CAC 734
Ala Asp Val 125 Leu Arg Asn Ala Glu 130 Val Ala Pro Val Leu 135 Thr Ala His
CCA ACT GAG ACT CGC CGC CGC ACT GTT TTT GAT GCG CAA AAG TGG ATC 782
Pro Thr 140 Glu Thr Arg Arg Arg 145 Thr Val Phe Asp Ala 150 Gln Lys Trp Ile
ACC ACC CAC ATG CGT GAA CGC CAC GCT TTG CAG TCT GCG GAG CCT ACC 830
Thr 155 Thr His Met Arg Glu 160 Arg His Ala Leu Gln 165 Ser Ala Glu Pro Thr 170
GCT CGT ACG CAA AGC AAG TTG GAT GAG ATC GAG AAG AAC ATC CGC CGT 878
Ala Arg Thr Gin Ser 175 Lys Leu Asp Glu Ile 180 Glu Lys Asn Ile Arg 185 Arg
CGC ATC ACC ATT TTG TGG CAG ACC GCG TTG ATT CGT GTG GCC CGC CCA 926
Arg Ile Thr Ile 190 Leu Trp Gln Thr Ala 195 Leu Ile Arg Val Ala 200 Arg Pro
CGT ATC GAG GAC GAG ATC GAA' GTA GGG CTG CGC TAC TAC AAG CTG AGC 974
Arg Ile Glu 205 Asp Glu Ile Glu Val 210 Gly Leu Arg Tyr Tyr 215 Lys Leu Ser
CTT TTG GAA GAG ATT CCA CGT ATC AAC CGT GAT GTG GCT GTT GAG CTT 1022
Leu Leu 220 Glu Glu Ile Pro Arg 225 Ile Asn Arg Asp Val 230 Ala Val Glu Leu
CGT GAG CGT TTC GGC GAG GAT GTT CCT TTG AAG CCC GTG GTC AAG CCA 1070
Arg 235 Glu Arg Phe Gly Glu 240 Asp Val Pro Leu Lys 245 Pro Val Val Lys Pro 250
GGT TCC TGG ATT GGT GGA GAC CAC GAC GGT AAC CCT TAT GTC ACC GCG 1118
Gly Ser Trp Ile Gly 255 Gly Asp His Asp Gly 260 Asn Pro Tyr Val Thr 265 Ala
GAA ACA GTT GAG TAT TCC ACT CAC CGC GCT GCG GAA ACC GTG CTC AAG 1166
Glu Thr Val Glu 270 Tyr Ser Thr His Arg 275 Ala Ala Glu Thr Val 280 Leu Lys
TAC TAT GCA CGC CAG CTG CAT TCC CTC GAG CAT GAG CTC AGC CTG TCG 1214
Tyr Tyr Ala 285 Arg Gln Leu His Ser 290 Leu Glu His Glu Leu 295 Ser Leu Ser
GAC CGC ATG AAT AAG GTC ACC CCG CAG CTG CTT GCG CTG GCA GAT GCC 1262
Asp Arg 300 Met Asn Lys Val Thr 305 Pro Gln Leu Leu Ala 310 Leu Ala Asp Ala
GGG CAC AAC GAC GTG CCA AGC CGC GTG GAT GAG CCT TAT CGA CGC GCC 1310
Gly 315 His Asn Asp Val Pro 320 Ser Arg Val Asp Glu 325 Pro Tyr Arg Arg Ala 330
GTC CAT GGC GTT CGC GGA CGT ATC CTC GCG ACG ACG GCC GAG CTG ATC 1358
Val His Gly Val Arg 335 Gly Arg Ile Leu Ala 340 Thr Thr Ala Glu Leu 345 Ile
GGC GAG GAC GCC GTT GAG GGC GTG TGG TTC AAG GTC TTT ACT CCA TAC 1406
Gly Glu Asp Ala 350 Val Glu Gly Val Trp 355 Phe Lys Val Phe Thr 360 Pro Tyr
GCA TCT CCG GAA GAA TTC TTA AAC GAT GCG TTG ACC ATT GAT CAT TCT 1454
Ala Ser Pro 365 Glu Glu Phe Leu Asn 370 Asp Ala Leu Thr Ile 375 Asp His Ser
CTG CGT GAA TCC AAT GAC GTT CTC ATT GCC GAT GAT CGT TTG TCT GTG 1502
Leu Arg 380 Glu Ser Asn Asp Val 385 Leu Ile Ala Asp Asp 390 Arg Leu Ser Val
190 206
CTG ATT TCT GCC ATC GAG AGC TTT GGA TTC AAC CTT TAC GCA CTG GAT 1550
Leu Ile Ser Ala Ile Glu Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp
395 400 405 410
CTG CGC CAA AAC TCC GAA AGC TAC GAG GAC GTC CTC ACC GAG CTT TTC 1598
Leu Arg Gin Asn Ser Glu Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe
415 420 425
GAA CGC GCC CAA GTC ACC GCA AAC TAC CGC GAG CTG TCT GAA GCA GAG 1646
Glu Arg Ala Gin Val Thr Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu
430 435 440
AAG CTT GAG GTG CTG CTG AAG GAA CTG CGC AGC CCT CGT CCG CTG ATC 1694
Lys Leu Glu Val Leu Leu Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile
445 450 455
CCG CAC GGT TCA GAT GAA TAC AGC GAG GTC ACC GAC CGC GAG CTC GGC 1742
Pro His Gly Ser Asp Glu Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly
460 4 65 470
ATC TTC CGC ACC GCG TCG GAG GCT GTT AAG AAA TTC GGG CCA CGG ATG 17 90
Ile Phe Arg Thr Ala Ser Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met
475 480 485 490
GTG CCT CAC TGC ATC ATC TCC ATG GCA TCA TCG GTC ACC GAT GTG CTC 1838
Val Pro His Cys Ile Ile Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu
495 500 505
GAG CCG ATG GTA TTG CTC AAG GAA TTC GGC CTC ATT GCA GCC AAC GGC 1886
Glu Pro Met Val Leu Leu Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly
510 515 520
GAC AAC CCA CGC GGC ACC GTC GAT GTC ATC CCA CTG TTC GAA ACC ATC 1934
Asp Asn Pro Arg Gly Thr Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile
525 530 53S
GAA GAT CTC CAG GCC GGC GCC GGA ATC CTC GAC GAA CTG TGG AAA ATT 1982
Glu Asp Leu Gin Ala Gly Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile
540 545 550
GAT CTT TAC CGC AAC TAC CTC CTG CAG CGC GAC AAC GTC CAG GAA GTC 2030
Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr Leu Leu Gin Arg Asp Asn Val Gin Glu Val
555 560 565 570
ATG CTC GGT TAC TCC GAT TCC AAC AAG GAT GGC GGA TAT TTC TCC GCA 2078
Met Leu Gly Tyr Ser Asp Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala
575 500 585
AAC TGG GCG CTT TAC GAC GCG GAA CTG CAG CTC GTC GAA CTA TGC CGA 2126
Asn Trp Ala Leu Tyr Asp Ala Glu Leu Gin Leu Val Glu Leu Cys Arg
590 595 600
TCA GCC GGG GTC AAG CTT CGC CTG TTC CAC GGC CGT GGT GGC ACC GTC 2174
Ser Ala Gly Val Lys Leu Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val
605 610 615
GGC CGC GGT GGC GGA CCT TCC TAC GAC GCG ATT CTT GCC CAG CCC AGG 2222
Gly Arg Gly Gly Gly Pro Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gin Pro Arg
620 625 630
GGG GCT GTC CAA GGT TCC GTG CGC ATC ACC GAG CAG GGC GAG ATC ATC 2270
Gly Ala Val Gin Gly Ser Val Arg Ile Thr Glu Gin Gly Glu Ile Ile
635 640 645 650
TCC GCT AAG TAC GGC AAC CCC GAA ACC GCG CGC CGA AAC CTC GAA GCT 2318
Ser Ala Lys Tyr Gly Asn Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala
655 660 665
CTG GTC TCA GCA ACG CTT GAG GCA TCG CTT CTC GAC GTC TCC GAA CTC 2366
Leu Val Ser Ala Thr Leu Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu
670 675 680
ACC GAT CAC CAA CGC GCG TAC GAC ATC ATG AGT GAG ATC TCT GAG CTC 2414
Thr Asp His Gin Arg Ala Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu
685 690 695
190 206
AGC TTG AAG AAG TAC GCC TCC TTG GTG CAC GAG GAT CAA GGC TTC ATC 2462
Ser Leu Lys Lys Tyr Ala Ser Leu val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile
700 705 710
GAT TAC TTC ACC CAG TCC ACG CCG CTG CAG GAG ATT GGA TCC CTC AAC 2510
Asp Tyr Phe Thr Gln Ser Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn
715 720 725 730
ATC GGA TCC AGG CCT TCC TCA CGC AAG CAG ACC TCC TCG GTG GAA GAT 2558
Ile Gly Ser Arg Pro Ser Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp
735 740 745
TTG CGA GCA ATC CCG TGG GTG CTC AGT TGG TCC CAG TCT CGT GTC ATG 2606
Leu Arg Ala Ile Pro Trp Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met
750 755 760
CTG CCG GGC TGG TTT GGT GTC GGC ACC GCA CTT GAG CAA TGG ATT GGC 2654
Leu Pro Gly Trp Phe Gly Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly
765 770 775
GAA GGG GAG CAG GCC ACC CAG CGC ATT GCC GAG CTA CAA ACA CTC AAC 2702
Glu Gly Glu Gln Ala Thr Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn
780 785 790
GAG TCC TGG CCA TTT TTC ACC TCA GTG TTG GAT AAC ATG GCT CAG GTG 2750
Glu Ser Trp Pro Phe Phe Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val
795 800 805 810
ATG TCC AAG GCA GAG CTG CGT TTG GCA AAG CTC TAC GCA GAC CTG ATC 2798
Met Ser Lys Ala Glu Leu Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile
815 820 825
CCA GAT AGG GAA GTA GCT GAG CGC GTT TAT GCC GTC ATC CGC GAG GAA 2846
Pro Asp Arg Glu Val Ala Glu Arg Val Tyr Ala Val Ile Arg Glu Glu
830 835 840
TAC TTC CTG ACC AAG AAG ATG TTC TGC GTA ATC ACC GGT TCT GAT GAT 2894
Tyr Phe Leu Thr Lys Lys Met Phe Cys Val Ile Thp Gly Ser Asp Asp
845 850 855
CTG CTT GAT GAC AAC CCG CTT CTC GCA CGA TCC GTC CAG CGC CGA TAC 2942
Leu Leu Asp Asp Asn Pro Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr
860 865 870
CCC TAC CTG CTT CCA CTC AAC GTG ATC CAG GTA GAG ATG ATG CGA CGC 2990
Pro Tyr Leu Leu Pro Leu Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg
875 880 885 890
TAC CGA AAA GGC GAC CAA AGC GAG CAA GTA TCC CGC AAC ATC CAG CTG 3038
Tyr Arg Lys Gly Asp Gln Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu
895 900 905
ACC ATG AAC GGT CTT TCC ACT GCA CTG CGC AAC TCT GGC TAGTCCTGCT 3087
Thr Met Asn Gly Leu Ser Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly
910 915
GGGTAGGTAG TACTCGTGTA TACTGTCTAA AGTTATTCGA AATCAGGTGG GAATAAGGTT 3147
CACCTGGGTT CTCAAACGGC AAAGGAACAT TTTCCACATG GCATTGACGC TTCAAATCAT 3207
CCTCGTCGTC GCCAGCCTGC TCATGACGGT TTTCGTCTTG CTGCACAAGG GCAAAGGCGG 3267
CGGACTCTCC AGCCTCTTCG GTGGCGGTGT GCAGTCCAAT CTTTCGGGCT CCACTGTTGT 3327
TGAAAAGAAC CTGGATCGCG TCACCATTTT GGTTGCCGTT ATCTGGATTG TGTGCATTGT 3387
CGCACTCAAC CTCATCCAGA CTTATTCATA AGACACGAGC TTAAAAAGAG CGGTTCCCTT 3447
TTCATAGGGG AGCCGCTTTT TTGGGTTTTG TCGACCTGTT GTCTCCCCAC TGTTCCTCGG 3507
TGTGCACTTT CGACACCAAG ATTTCG 3533
(2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 16:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 919 aminokwasów (B) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 16:
190 206
Met 1 Thr Asp Phe Leu 5 Arg Asp Asp lle Arg 10 Phe Leu Gly Gln lie 15 Leu
Gly Glu Val lle 20 Ala Glu Gln Glu Gly 25 Gln Glu Val Tyr Glu 30 Leu Val
Glu Gln Ala 35 Arg Leu Thr Ser Phe 40 Asp lle Ala Lys Gly 45 Asn Ala Glu
Met Asp 50 Ser Leu Val Gln Val 55 Phe Asp Gly Ile Thr 60 Pro Ala Lys Ala
Thr 65 Pro Ile Ala Arg Ala 70 Phe Ser His Phe Ala 75 Leu Leu Ala Asn Leu 80
Ala Glu Asp Leu Tyr 85 Asp Glu Glu Leu Arg 90 Glu Gln Ala Leu Asp 95 Ala
Gly Asp Thr Pro 100 Pro Asp Ser Thr Leu 105 Asp Ala Thr Trp Leu 110 Lys Leu
Asn Glu Gly 115 Asn Val Gly Ala Glu 120 Ala Val Ala Asp Val 125 Leu Arg Asn
Ala Glu 130 Val Ala Pro Val Leu 135 Thr Ala His Pro Thr 140 Glu Thr Arg Arg
Arg 145 Thr Val Phe Asp Ala 150 Gln Lys Trp Ile Thr 155 Thr His Met Arg Glu 160
Arg His Ala Leu Gln 165 Ser Ala Glu Pro Thr 170 Ala Arg Thr Gln Ser 175 Lys
Leu Asp Glu Ile 180 Glu Lys AAn‘ ' Ile Arg 185 Arg Arg Ile Thr Ile 190 Leu Trp
Gln Thr Ala 195 Leu Ile Arg Val Ala 200 Arg Pro Arg Ile Glu 205 Asp Glu Ile
Glu Val 210 Gly Leu Arg Tyr Tyr 215 Lys Leu Ser Leu Leu 220 Glu Glu Ile Pro
Arg 225 Ile Asn Arg Asp Val 230 Ala Val Glu Leu Arg 235 Glu Arg Phe Gly Glu 240
Asp Val Pro Leu Lys 245 Pro Val Val Lys Pro 250 Gly Ser Trp Ile Gly 255 Gly
Asp His Asp Gly 260 Asn Pro Tyr Val Thr 265 Ala Glu Thr Val Glu 270 Tyr Ser
Thr His Arg 275 Ala Ala Glu Thr Val 280 Leu Lys Tyr Tyr Ala 285 Arg Gln Leu
His Ser 290 Leu Glu His Glu Leu 295 Ser Leu Ser Asp Arg 300 Met Asn Lys Val
Thr 305 Pro Gln Leu Leu Ala 310 Leu Ala Asp Ala Gly 315 His Asn Asp Val Pro 320
Ser Arg Val Asp Glu 325 Pro Tyr Arg Arg Ala 330 Val His Gly Val Arg 335 Gly
Arg lie Leu Ala 340 Thr Thr Ala Glu Leu 345 Ile Gly Glu Asp Ala 350 Val Glu
Gly Val Trp 355 Phe Lys Val Phe Thr 360 Pro Tyr Ala Ser Pro 365 Glu Glu Phe
Leu Asn 370 Asp Ala Leu Thr Ile 375 Asp His Ser Leu Arg 380 Glu Ser Asn Asp
Val 385 Leu Ile Ala Asp Asp 390 Arg Leu Ser Val Leu 395 Ile Ser Ala Ile Glu 400
Ser Phe Gly Phe Asn 405 Leu Tyr Ala Leu Asp 410 Leu Arg Gln Asn Ser 415 Glu
Ser Tyr Glu Asp 420 Val Leu Thr Glu Leu 425 Phe Glu Arg Ala Gln 430 Val Thr
Ala Asn Tyr 435 Arg Glu Leu Ser Glu 440 Ala Glu Lys Leu Glu 445 Val Leu Leu
Lys Glu 450 Leu Arg Ser Pro Arg 455 Pro Leu Ile Pro His 460 Gly Ser Asp Glu
190 206
Tyr Ser Glu Vv1 Thr Lss LAr du Leu dy IIu Phe Arg T'h Ala SSe
465 470 447 4 88
Glu Ala Val Lys LlS Phe du Vpo Arg Mee l^i Pro His Ccs He IIu
485 499 449
Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu
500 555 551
Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr
515 55 0 552
Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Gin AUi Gly
530 535 554
Ala Gly Ile Leu LAp Glu Leu Trp Lys Ilu Asp Leu Tyr TAg Asn T'r
545 550 555 556
Leu Leu Gln Arg LAp LAn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser AAP
565 550 557
Ser Asn Lys Asp Gly GUy Tyr Phe Ser Ala Asn Trp AUi Leu Tyr Asp
580 555 550
Ala Glu Leu Gln Leu Vi1 Glu Leu Cys Arg Ser Ma Gly Val Lys Llu
595 660 66^
Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly LAg Gly Gly Gly Ppo
610 615 6620
Ser Tyr Asp ALa Ile Leu Ala Gln Pro Arg Gly AUi Val Gln GUy Sst
625 630 GlyS 665 660
Val Arg Ile TT^ar Glu Gln Glu Ile Ile Ser AUi Lys Tyr GUy Asn
645 650 66 5
Pro Glu Thr Ala Arg Arg AAn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ma Thr Leu
660 665 660
Glu Ala Ser Le u Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr LAp His Gln Arg Ma
67 5 680 685
Tyr Asp Ile Me t Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leli Lys Lys Tyr Ma
690 665 700
Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phv Thr Gin Ser
705 710 715 720
Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser
725 730 735
Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg AUi Ile Pro Trp
740 745 750
Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly
755 760 765
Val Gly Thr AUi Leu Glu Gin Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr
770 175 780
Gin Arg He AUi Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro He Phe
785 790 795 eoo
Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gin Val Met Ser Lsv Ala GUu Leu
805 810 815
Arg Leu Ala Lyv Leu Tyr Ala AAp Leu Ile Pro Asp Arg Glu Val Ala
820 825 830
Glu Arg VaU T/O Ala Val I1v Arg GUu du Tyr Phe Leu Thr Lys Lys
835 840 845
Met Phe Cys VuL Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro
850 855 860
Leu Leu Ala Arg Ser VaU Gin Arg Arg Tyr Pro Tyc Luv Leu Pro Leu
865 870 8-75 880
Asn Val Ile Gln VaU Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Ss v Gly Asp Gln
885 890 895
Ser Glu Gin VuL Srv Arg Asn Ile Gin Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser
900 905 910
Thr Ala Leu Arv Asn Sev GSy
915
190 206 (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 17:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 zasad (b) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) LAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 17:
CGCGAGGTAC CACCTGTCAC (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 18:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) LAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: tak (xi) OPIS SEKWENCJI- SEK ID NR 18:
CAATCCAGGT ACCGGCAACC
2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 19 (1) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) LAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI- inny kwas nukleinowy (A) OPIS syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 19:
GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 20:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DEUGOŚĆ: 23 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) LAŃCUCHOWOŚĆ. jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA
190 206 (iv) ANTYSENSOWNY: tak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 20:
CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 21:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasady (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID Nr 21:
GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 22:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: tak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 22:
GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR 23:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 zasad (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 23:
CATCTAAGTA TGCATCTCGG (2) INFORMACJA DLA SEK ID NR: 24:
(i) CHRAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 zasad
190 206 (B) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny DNA (iv) ANTYSENSOWNY: tak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 24.
TGCCCCTCGA GCTAAATTAG
190 206
Trawienie BamHI, KpnI
Trawienie BamHI, KpnI
FIG. 2
190 206
I
FIG. 3
190 206
Trawienie ApaLI, Pstl
Pstl ApaLI
7//7777//777^
Brevi.-ori lysC.P ł
Trawienie Sali
Tworzenie tępych końców
ApaLI/Sall
FIG. 4
190 206
Hindlll 1
Trawienie Hindlll
Tworzenie tępych końców
Trawienie Avall
I ..
Tworzenie tępych końców
FIG. 5
190 206
FIG. 6
190 206
FIG. 7
190 206
Miejsce klonowania
Klonowanie typu TA
Trawienie BamHI, KpnI
Tworzenie tępych końców i
Ligacja linkera Smal { i
Trawienie Smal Trawienie Smal
FIG. 8
190 206
Miejsce klonowania dapB pCRScriot
FIG. 9
190 206
Smal
Sali ddh EcoRI
pUC18
I ddh Brev.-ori 'SSSSSSSi pPK4O
FIG. 10
190 206
Trawienie Sali
Ψ
Tworzenie tępych końców
Cigacja linkera EcoRI
EcoRI dapA
pCRDAPA
Trawienie EcoRI y
FIG. 11
190 206
EcoRV Sphl .i daąB
Trawienie EcoRV, Sphl
Tworzenie tępych końców
Ψ
Trawienie Sphl
Ligacja j' BamHI
BamHI KpnI i Brevi.-ori
Y77///////Z.
pHK4
Trawienie KpnI i
Tworzenie tępych końców
I
BamHI ® I. Brsyi.-ori
BamHI
SSSSSSSSSSJ
pCB
FIG. 12
190 206
Trawienie Sali Trawienie EcoRI
Ligacja Sali |
FIG. 13
190 206
Smal/Nrul EcoRI Ba mH 1-γ) — ( p399AKY l (P399AK9)
BamHI KpnI
Trawienie BamHI, KpnI ł
Tworzenie tępych końców ł
| Ligacja linkera BamHI
Trawienie BamHI
I
BamHl^ma^Nrul EcoRI
BamHI
FIG. 1 . lysC
8revi.-ori p399AKYB (p399AK9B)
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz Cena 6,00 zł.

Claims (8)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1 Zrekombinowany DNA replikujący się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej, zawierający sekwencję DNA kodującą aspartokinazę charakteryzującą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę oraz sekwencję DNA kodująca dekarboksylazę diaminopimelinową, znamienny tym, ze aspartokinaza charakteryzująca się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treonmę jest zmutowaną aspartokinazą pochodzącą z bakterii maczugowatej, w której reszta aminokwasowa odpowiadająca 279 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 5 jest zmieniona na resztę treoninową w podjednostce alfa, zaś reszta aminokwasową odpowiadająca 30 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 7 jest zmieniona na resztę treoninową w podjednostce beta.
  2. 2. Zrekombinowany DNA według zastrz. 1, znamienny tym, ze sekwencja DNA kodująca dekarboksylazę diaminopimelinową koduje sekwencję aminokwasową nr 12 lub sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samą jak sekwencja aminokwasową nr 12.
  3. 3. Zrekombinowany DNA według zastrz. 1, zawierający ponadto sekwencję DNA kodującą karboksylazę fosfoenolopirogronianową.
  4. 4. Bakteria maczugowata niosąca aspartokinazę charakteryzującą się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę oraz zawierająca wzmocnioną sekwencję DNA kodującą dekarboksylazę diaminopimelinową, znamienna tym, ze aspartokinaza charakteryzująca się znaczącym zmniejszeniem czułości hamowania zwrotnego przez L-lizynę i L-treoninę jest zmutowaną aspartokinazą pochodzącą z bakterii maczugowatej, w której reszta aminokwasową odpowiadająca 279 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 5 jest zmieniona na resztę treoninową w podjednostce alfa, zaś reszta aminokwasową odpowiadająca 30 reszcie alaniny (licząc od końca N cząsteczki) w sekwencji aminokwasowej nr 7 jest zmieniona na resztę treoninową w podjednostce beta.
  5. 5. Bakteria maczugowata według zastrz. 4, znamienna tym, że jest stransformowana poprzez wprowadzenie zrekombinowanego DNA określonego w zastrz 1.
  6. 6. Bakteria maczugowata według zastrz. 4, znamienna tym, ze ponadto zawiera wzmocnioną sekwencję DNA kodującą karboksylazę fosfoenolopirogronianową.
  7. 7. Bakteria maczugowata według zastrz. 6, znamienna tym, ze jest stransformowana poprzez wprowadzenie zrekombinowanego DNA określonego w zastrz. 3.
  8. 8. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze hoduje się bakterię maczugowatą określoną w zastrz. 4 w pożywce odpowiedniej do wytwarzania i akumulacji L-lizyny w hodowli bakteryjnej, a następnie wyodrębnia się L-lizynę z hodowli.
PL97323545A 1996-12-05 1997-12-05 Zrekombinowany DNA replikujący się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej, bakteria maczugowata oraz sposób wytwarzania L-lizyny PL190206B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP32565896A JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 1996-12-05 Ｌ−リジンの製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL323545A1 PL323545A1 (en) 1998-06-08
PL190206B1 true PL190206B1 (pl) 2005-11-30

Family

ID=18179283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97323545A PL190206B1 (pl) 1996-12-05 1997-12-05 Zrekombinowany DNA replikujący się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej, bakteria maczugowata oraz sposób wytwarzania L-lizyny

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6221636B1 (pl)
EP (1) EP0857784B1 (pl)
JP (1) JP4075087B2 (pl)
CN (1) CN1161470C (pl)
BR (1) BRPI9706058B1 (pl)
DE (1) DE69736699T2 (pl)
DK (1) DK0857784T3 (pl)
ES (1) ES2273356T3 (pl)
HU (1) HU224409B1 (pl)
PL (1) PL190206B1 (pl)
SK (1) SK285146B6 (pl)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
AU3194300A (en) * 1999-03-19 2000-10-09 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-amino acid
JP2003135066A (ja) * 1999-03-19 2003-05-13 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
EP1188822B1 (en) * 1999-04-09 2007-01-24 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing bacteria and process for producing l-amino acid
US20030049804A1 (en) 1999-06-25 2003-03-13 Markus Pompejus Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins
US6599732B1 (en) 1999-06-29 2003-07-29 Archer-Daniels-Midland Company Regulation of carbon assimilation
AU4720999A (en) * 1999-06-29 2001-01-31 Archer-Daniels-Midland Company Regulation of carbon assimilation
BR0012020A (pt) 1999-07-02 2002-07-02 Ajinomoto Kk Proteìna, e, dna
JP2003144161A (ja) * 1999-07-02 2003-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2003144160A (ja) * 1999-07-02 2003-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2003169674A (ja) * 1999-07-02 2003-06-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
JP2003180355A (ja) * 1999-07-02 2003-07-02 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2003180348A (ja) * 1999-07-02 2003-07-02 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
TW200734459A (en) 1999-10-04 2007-09-16 Ajinomoto Kk Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria
EP1241246B1 (en) * 1999-12-24 2008-12-10 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-amino acid
US6927046B1 (en) 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
ES2354867T3 (es) * 2000-03-09 2011-03-18 Evonik Degussa Gmbh Genes de corynebacterium glutamicum que codifican proteínas del camino metabólico.
KR100397423B1 (ko) * 2001-02-13 2003-09-13 씨제이 주식회사 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
US7368266B2 (en) 2001-02-13 2008-05-06 Cj Corporation Method for L-threonine production
US20050255568A1 (en) * 2003-05-30 2005-11-17 Bailey Richard B Methods and compositions for amino acid production
DE102005032429A1 (de) 2005-01-19 2006-07-20 Degussa Ag Allele des mqo-Gens aus coryneformen Bakterien
DE102005013676A1 (de) 2005-03-24 2006-09-28 Degussa Ag Allele des zwf-Gens aus coryneformen Bakterien
DE102005023829A1 (de) 2005-05-24 2006-11-30 Degussa Ag Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP1881076A1 (en) * 2006-07-17 2008-01-23 Evonik Degussa GmbH Method for producing L-amino acids
JP5756259B2 (ja) 2006-09-15 2015-07-29 シージェイ チェイルジェダン コーポレイション Ｌ−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたｌ−リジン生産方法
KR100838035B1 (ko) * 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100838038B1 (ko) * 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100830826B1 (ko) * 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
JP2010226956A (ja) * 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
CN102348806A (zh) 2008-01-23 2012-02-08 味之素株式会社 L-氨基酸的生产方法
KR100930203B1 (ko) 2008-01-28 2009-12-07 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
KR100987281B1 (ko) 2008-01-31 2010-10-12 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
KR101126041B1 (ko) 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
JP2010142200A (ja) 2008-12-22 2010-07-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
BRPI1014661B1 (pt) 2009-07-29 2020-12-15 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
JP2012196144A (ja) 2009-08-03 2012-10-18 Ajinomoto Co Inc ビブリオ属細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2012223091A (ja) 2009-08-25 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
KR101226384B1 (ko) * 2010-03-05 2013-01-25 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
US9169502B2 (en) * 2010-06-15 2015-10-27 Paik Kwang Industrial Co., Ltd. Method of producing L-lysine using a Corynebacterium glutamicum microorganism
EP2479279A1 (de) 2011-01-20 2012-07-25 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren
RU2616870C1 (ru) 2011-12-21 2017-04-18 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Способ получения L-лизина с использованием микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать L-лизин
EP2628792A1 (de) 2012-02-17 2013-08-21 Evonik Industries AG Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität
PL2700715T3 (pl) 2012-08-20 2019-03-29 Evonik Degussa Gmbh Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów z zastosowaniem ulepszonych szczepów z rodziny Enterobacteriaceae
DE102014208199A1 (de) 2014-04-30 2015-11-05 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums
EP2940143B1 (de) 2014-04-30 2020-02-05 Evonik Operations GmbH Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums
EP2940039A1 (de) 2014-04-30 2015-11-04 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren in Corynebakterien unter Verwendung eines Glycin spaltenden Systems
CN108291243A (zh) 2015-11-27 2018-07-17 赢创德固赛有限公司 生产l-甲硫氨酸的方法
PL3533875T3 (pl) 2016-09-01 2023-06-12 Ningxia Eppen Biotech Co. Ltd Corynebacterium do wytwarzania L-lizyny przez fermentację
KR102011994B1 (ko) * 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
US20240254526A1 (en) * 2018-09-07 2024-08-01 Archer Daniels Midland Company Engineered strains of corynebacteria
CN110804602B (zh) * 2019-11-18 2021-01-29 江南大学 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用
CN116262916A (zh) * 2021-12-14 2023-06-16 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种重组微生物及其构建方法与应用
CN114292315B (zh) * 2021-12-31 2024-09-06 宁夏伊品生物科技股份有限公司 ppc突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4861722A (en) * 1983-08-24 1989-08-29 Ajinomoto Company, Inc. Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-lysine
JPH0746994B2 (ja) * 1984-10-04 1995-05-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
GB2223754B (en) 1988-09-12 1992-07-22 Degussa Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase
DE3908201A1 (de) 1989-03-14 1990-09-27 Degussa Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin
JP3473042B2 (ja) * 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
JPH07155184A (ja) * 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
HU222503B1 (hu) * 1995-06-07 2003-07-28 Ajinomoto Co., Inc. Eljárás L-lizin termelésére
FR2736066B1 (fr) * 1995-06-30 1998-11-20 Ajinomoto Kk Procede d'amplification d'un gene par transposon artificiel, bacterie coryneforme obtenue par ce procede et procede de production d'un acide amine a l'aide de cette bacterie
JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
SK285201B6 (sk) 1996-12-05 2006-08-03 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7
DE10031999A1 (de) 1999-09-09 2001-04-19 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE19943587A1 (de) 1999-09-11 2001-03-15 Degussa Neue für das dapF-Gen codierende Nukleotidsequenzen

Also Published As

Publication number Publication date
HU224409B1 (hu) 2005-08-29
EP0857784A2 (en) 1998-08-12
SK163597A3 (en) 1998-07-08
CN1187539A (zh) 1998-07-15
DE69736699D1 (de) 2006-11-02
DE69736699T2 (de) 2007-09-20
HU9702361D0 (en) 1998-03-02
ES2273356T3 (es) 2007-05-01
JPH10165180A (ja) 1998-06-23
SK285146B6 (sk) 2006-07-07
EP0857784A3 (en) 2002-10-16
PL323545A1 (en) 1998-06-08
EP0857784B1 (en) 2006-09-20
DK0857784T3 (da) 2007-01-15
HUP9702361A2 (hu) 1999-06-28
US6221636B1 (en) 2001-04-24
BR9706058A (pt) 1999-10-05
CN1161470C (zh) 2004-08-11
JP4075087B2 (ja) 2008-04-16
HUP9702361A3 (en) 2002-12-28
BRPI9706058B1 (pt) 2015-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL190206B1 (pl) Zrekombinowany DNA replikujący się autonomicznie w komórkach bakterii maczugowatej, bakteria maczugowata oraz sposób wytwarzania L-lizyny
US8183017B2 (en) Method of producing L-lysine
EP0811682B1 (en) Method of producing L-lysine
EP0854189B1 (en) Method for producing L-lysine
JP4168463B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
JPWO1996040934A1 (ja) Ｌ−リジンの製造法
WO2001048146A1 (en) Process for producing l-amino acid and novel gene