ES2273414T3 - Procedimiento para el corte de proteinas de fusion. - Google Patents

Abstract

Se describe un procedimiento para la recuperación de polipéptidos producidos de forma recombinante. El procedimiento incluye la expresión del polipéptido recombinante como una proteína de fusión con un pro-péptido. La proteína de fusión pro-péptido-polipéptido puede escindirse y el polipéptido recombinante liberarse en condiciones adecuadas.

Description

Procedimiento para el corte de proteínas de fusión.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para la recuperación de polipéptidos producidos por recombinación. El procedimiento implica la expresión del polipéptido recombinante en forma una proteína de fusión con un propéptido. La proteína de fusión propéptido-polipéptido puede cortarse y la proteína recombinante liberarse en las condiciones apropiadas.

Antecedentes de la invención

La preparación de polipéptidos recombinantes (genéticamente manipulados) valiosos, por ejemplo proteínas farmacéuticas, frecuentemente se basa en técnicas que implican la producción de estos polipéptidos en forma de proteínas de fusión o proteínas híbridas. Estas técnicas se basan en la preparación de genes híbridos, es decir de genes que comprenden material genético que codifica el polipéptido de interés unido a material genético adicional al gen de interés. La producción del polipéptido de fusión implica la introducción del gen híbrido en un sistema celular de huésped biológico, por ejemplo células de levadura, lo que permite la expresión y la acumulación del polipéptido de fusión. La recuperación del polipéptido de interés implica la realización de una reacción de corte que resulta en la separación del polipéptido deseado de la "pareja de fusión".

A pesar de las etapas adicionales que se requieren para producir una proteína de interés en forma de proteína de fusión, en lugar de hacerlo directamente en su forma activa, se ha descubierto que la producción de proteínas híbridas resuelve varios problemas. En primer lugar, los polipéptidos producidos en exceso pueden agregarse en la célula huésped en fracciones insolubles conocidas como cuerpos de inclusión. La conversión de este material insoluble frecuentemente implica la utilización de procedimientos de replegamiento lentos y complejos, dificultando la purificación de la proteína. En segundo lugar, las proteínas que se encuentran presentes en forma soluble en el citoplasma resultan frecuentemente degradadas por enzimas específicos del huésped, reduciendo de esta manera la cantidad de proteína que se puede recuperar. Se ha descubierto que la unión del polipéptido de interés a una pareja de fusión limita estos problemas. Entre las parejas de fusión conocidas de la técnica anterior se encuentran la proteína de unión a maltosa (Di Guan et al., Gene 67:21-30, 1998), la glutatión-S-transferasa (Johnson, Nature 338: 585-587, 1989), la ubiquitina (Miller et al., Biotechnology 7:698-704, 1989), la \beta-galactosidasa (Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76:106-110, 1979), y la tioredoxina (La Vallie et al., Biotechnology 11:187-193, 1993).

Se ha propuesto asimismo la utilización de parejas de fusión como péptidos con afinidad. Esta metodología facilita el aislamiento y la recuperación del péptido de fusión con respecto a las células huésped aprovechando las propiedades físicoquímicas de la pareja de fusión (ver, por ejemplo, la patente WO nº 91/11454).

Finalmente, la utilización de una pareja de fusión puede permitir la producción de un péptido que de otra manera resultaría de dimensiones demasiado reducidas para acumularse y recuperarse eficientemente de un sistema de células huésped recombinantes. Esta tecnología se describe, por ejemplo en (Schultz et al., J. Bacteriol. 169:5385-5392, 1987).

Todos estos procedimientos se tradujeron en la producción de una proteína híbrida en la que la proteína de interés se une a un polipéptido adicional. Para recuperar el polipéptido activo, generalmente resulta necesario separar la pareja de fusión del polipéptido de interés. Más comúnmente, se lleva a cabo una reacción de corte, sea por medios enzimáticos o por medios químicos. Dichas reacciones utilizan agentes que actúan por hidrólisis de enlaces peptídicos y la especificidad del agente de corte se determina a partir de la identidad del residuo aminoácido en el enlace peptídico o próximo al mismo que se somete a corte.

Se ha descubierto que los enzimas conocidos en la técnica anterior como "enzimas proteolíticos" resultan particularmente adecuados para el corte de proteínas de fusión. La reacción de corte se lleva a cabo poniendo en contacto la proteína de fusión con un enzima proteolítico en condiciones apropiadas. Se describe un ejemplo de esta metodología en la patente US nº 4.743.679, que da a conocer un procedimiento para la producción de factor de crecimiento epidérmico humano que comprende el corte de una proteína de fusión con proteasa V8 de Staphylococcus aureus.

En contraste, el corte químico implica la utilización de agentes químicos que es conocido que permiten la hidrólisis de enlaces peptídicos en condiciones específicas. Por ejemplo, es sabido que el bromuro de cianógeno, corta la cadena polipeptídica en un residuo de metionina. Sekita et al. describen en (Keio J. Med. 24:203-210, 1975) una reacción de hidrólisis con bromuro de cianógeno de las proteínas ureasa y de la fosforilasa B basada en esta técnica.

Las reacciones de corte tanto químicas como enzimáticas requieren la presencia de un enlace peptídico que pueda ser cortado por el agente de corte utilizado. Por esta razón, con frecuencia resulta deseable establecer una secuencia diana adecuada en la unión entre la pareja de fusión y la proteína diana. Los péptidos de fusión que comprenden secuencias de enlace que contienen una diana para un enzima proteolítico pueden construirse fácilmente utilizando técnicas de ingeniería genética convencionales conocidas de la técnica.

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A pesar de su gran utilidad, los procedimientos de corte de la técnica anterior se ha reconocido que resultan ineficientes o que carecen de especificidad de corte. El corte ineficiente resulta en una eficiencia de purificación de proteínas reducida, mientras que la falta de especificidad de corte se traduce en el corte en varios sitios, resultando en pérdida de producto y en la generación de fragmentos contaminantes. Esto frecuentemente resulta en que se recupera solamente una fracción reducida de la proteína deseada. Además, los enzimas proteolíticos utilizados ampliamente en la actualidad, tales como el factor Xa de coagulación de la sangre y la trombina, resultan caros, y la contaminación del producto final con patógenos sanguíneos es una cuestión que debe considerarse.

En vista de estas desventajas, resultan evidentes las limitaciones de los procedimientos de corte conocidos de la técnica anterior.

Los zimógenos, tales como la pepsina y la quimosina, son enzimas que se sintetizan en forma de precursores inactivos in vivo. En condiciones apropiadas, los zimógenos se activan, formando la proteína activa madura en un procedimiento que implica el corte de un péptido aminoterminal que puede denominarse "propéptido", "prorregión" o "prosecuencia". La activación de los zimógenos puede requerir la presencia de un enzima proteolítico específico adicional, por ejemplo diversas hormonas, tales como la insulina, son procesadas por un enzima proteolítico específico. Alternativamente, la activación puede producirse sin un catalizador enzimático adicional. Este tipo de zimógenos frecuentemente se denominan zimógenos "de maduración autocatalítica". Entre los ejemplos de zimógenos de maduración autocatalítica se incluyen la pepsina, el pepsinógeno y la quimosina, que se activan en un medio ácido, por ejemplo en el estómago de los mamíferos.

La activación autocatalítica y el procesamiento de los zimógenos han sido ampliamente documentados (ver, por ejemplo, McCaman y Cummings, J. Biol. Chem. 261:15345-15348, 1986; Koelsch et al., FEBS Letters 343:6-10, 1994). También se ha documentado que la activación del zimógeno no requiere necesariamente un enlace físico entre el propéptido y la proteína madura (Silen et al., Nature 341:462-464, 1989).

Existe una necesidad de un procedimiento mejorado para la recuperación de polipéptidos producidos por recombinación a partir de sus sistemas de expresión.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han desarrollado un nuevo procedimiento para la recuperación de polipéptidos producidos por recombinación. El procedimiento implica la expresión del polipéptido en forma de proteína de fusión con un propéptido, de manera que el polipéptido recombinante pueda cortarse del propéptido en condiciones apropiadas.

En un aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicosquimérico que codifica una proteína de fusión, comprendiendo la secuencia de ácido nucleico quimérico una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un propéptido derivado de un zimógeno de maduración autocatalítica y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo respecto al propéptido.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende: a) un propéptido derivado de un zimógeno de maduración autocatalítica, y b) un polipéptido heterólogo respecto al propéptido. En una forma de realización, el polipéptido heterólogo es un péptido terapéutico o nutricional y la proteína de fusión puede administrarse en forma de composición farmacéutica o alimentaria. En dicha forma de realización, el polipéptido heterólogo, tras la administración de la composición al huésped, puede resultar cortado como resultado de las condiciones fisiológicas en el órgano, tejido o líquido corporal diana.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de un polipéptido recombinante, que comprende:

(a)

introducir en una célula huésped un vector de expresión que comprende:

1)

una secuencia de ácidos nucleicos que resulta capaz de regular la transcripción en una célula huésped, ligada funcionalmente a:

2)

una secuencia de ácidos nucleicos quiméricos que codifica una proteína de fusión, comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos quiméricos: a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un propéptido derivado de un zimógeno de maduración autocatalítica, ligada en el mismo marco de lectura de: b) una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga respecto al propéptido y que codifica el polipéptido recombinante; ligada funcionalmente a:

3)

una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una región de terminación que resulta funcional en la célula huésped,

b)

cultivar la célula huésped para producir dicha proteína de fusión; y

c)

alterar el medio de la proteína de fusión de manera que el propéptido resulte cortado de la proteína de fusión, liberando el polipéptido recombinante.

El medio de la proteína de fusión puede alterarse utilizando numerosos medios, incluyendo la alteración del pH, de la temperatura o de la concentración de sales, u otras alteraciones que permitan al propéptido autocortarse de la proteína de fusión, liberando el polipéptido recombinante. En una forma de realización preferida, el zimógeno maduro se añade al procedimiento en la etapa c), ayudando en el corte del propéptido de la proteína de fusión.

Otras características y ventajas de la presente invención se pondrán fácilmente de manifiesto partir de la descripción detallada siguiente. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican formas de realización preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a título ilustrativo, debido a que se pondrán claramente de manifiesto para los expertos en la materia a partir de la presente descripción detallada, diversos cambios y modificaciones comprendidas dentro del espíritu y del alcance de la invención.

Breve descripción de las figuras

A continuación, se describirá la invención haciendo referencia a las figuras, en las que:

la figura 1 es la secuencia de ácidos nucleicos (SEC. ID. nº 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. ID. nº 2) de una secuencia de propéptido-hirudina de GST-quimosina.

La figura 2 es la secuencia de ácidos nucleicos (SEC. ID. nº 3) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. ID. nº 4) de una proteína de fusión de hormona de crecimiento de carpa (His-Pro-cGH) propéptido quimosina etiquetada con polihistidina.

La figura 3 es un diagrama esquemático de constructo de fusión Pro-cGH.

La figura 4 ilustra el corte in vitro de His-Pro-cGH purificada.

La figura 5 ilustra el corte in vivo de His-Pro-cGH purificada.

Descripción detallada de la invención

Tal como se ha indicado anteriormente, la presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la preparación y recuperación de polipéptidos recombinantes, secuencias de ácidos nucleicos quiméricos que codifican proteínas de fusión y proteínas de fusión que resultan útiles en composiciones farmacéuticas y nutricionales.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de polipéptidos recombinantes, que comprende:

a)

la introducción en una célula huésped de un vector de expresión que comprende:

1)

una secuencia de ácidos nucleicos capaz de regular la transcripción en una célula huésped, ligada funcionalmente a:

2)

una secuencia de ácidos nucleicos quiméricos que codifica una proteína de fusión, comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos quiméricos: a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un propéptido derivado de un zimógeno de maduración autocatalítica, ligado en el mismo marco de lectura de: b) una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga respecto al propéptido y que codifica el polipéptido recombinante; ligada funcionalmente a:

3)

una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una región de terminación que resulta funcional en dicha célula huésped,

b)

el cultivo de la célula huésped para producir dicha proteína de fusión; y

c)

la alteración del medio de la proteína de fusión de manera que se corta proporcionando el propéptido y liberando el polipéptido recombinante.

El medio de la proteína de fusión puede alterarse mediante numerosos medios, incluyendo la alteración del pH, de la temperatura o de la concentración de sales, u otras alteraciones que permiten al propéptido autocortarse de la proteína de fusión para liberar el polipéptido recombinante. En una forma de realización preferida, el zimógeno maduro se añade al procedimiento de la etapa c), ayudando en el corte del propéptido de la proteína de fusión.

El término "propéptido", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la porción aminoterminal de un zimógeno o a una porción funcional del mismo hasta el sitio de maduración.

La expresión "zimógeno de maduración autocatalítica", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a que:

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(i)

el zimógeno puede procesarse en su forma activa sin necesidad de una proteasa específica adicional, y a que (ii) la forma madura del zimógeno puede ayudar en la reacción de corte.

La expresión "zimógeno maduro" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un zimógeno que no contiene la secuencia o porción propéptido.

El polipéptido puede ser cualquier polipéptido heterólogo respecto al propéptido, es decir, no es la proteína madura que normalmente se encuentra asociada al propéptido en forma de zimógeno.

En otro aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos quiméricos que codifica una proteína de fusión, comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos quiméricos una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un propéptido derivado de un zimógeno de maduración autocatalítica y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido heterólogo respecto al propéptido. Normalmente, la secuencia de ácidos nucleicos quiméricos no incluye una secuencia de ácidos nucleicos que codifique el zimógeno completo.

Las secuencias de ácidos nucleicos quiméricos que codifican las proteínas de fusión de la presente invención pueden incorporarse de una manera conocida a un vector de expresión recombinante que garantice una buena expresión en una célula huésped.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención comprende asimismo un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácidos nucleicos quiméricos de la presente invención ligada operativamente a una secuencia reguladora y a una región de terminación adecuadas para la expresión en una célula huésped.

La expresión "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a una secuencia de monómeros nucleótidos o nucleósidos constituidos por bases naturalmente producidas, azúcares, y enlaces entre azúcares (esqueletos). La expresión comprende asimismo secuencias modificadas o sustituidas que comprenden monómeros no naturales o porciones de los mismos, que funcionan de manera similar. Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser ácidos ribonucleicos (ARN) o ácidos desoxirribonucleicos (ADN), y pueden contener bases producidas naturalmente, entre las que se incluyen la adenina, la guanina, la citosina, la timidina y el uracilo. Las secuencias pueden asimismo contener bases modificadas, tales como xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo, 2-propilo y otras alquiladeninas, 5-halouracilo, 5-halocitosina, 6-azauracilo, 6-azacitosina y 6-azatimina, pseudouracilo, 4-tiouracilo, 8-haloadenina, 8-aminoadenina, 8-tioladenina, 8-tiolalquiladeninas, 8-hidroxiladenina y otras adeninas 8-sustituidas, 8-haloguanina, 8-aminoguanina, 8-tiolguanina, 8-tiolalquilguanina, o 8-hidroxilguanina y otras guaninas 8-sustituidas, otros aza y desazauracilos, timidinas, citosinas, adeninas, o guaninas, 5-trifluorometiluracilo y 5-trifluorocitosina.

La expresión "adecuadas para la expresión en una célula huésped" se refiere a que los vectores de expresión recombinantes contienen la secuencia de ácidos nucleicos quiméricos de la invención, una secuencia reguladora y una región de terminación, seleccionadas basándose en las células huésped que deben utilizarse para la expresión, que se encuentran ligadas funcionalmente a la secuencia de ácidos nucleicos quiméricos. La expresión "ligada funcionalmente" pretende referirse a que la secuencia de ácidos nucleicos quiméricos se encuentra ligada a una secuencia reguladora y a una región de terminación de manera que permite la expresión de la secuencia quimérica. Las secuencias reguladoras y las regiones de terminación son conocidas de la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión de la proteína deseada en una célula huésped apropiada. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, la expresión "secuencia reguladora" incluye promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión. Dichas secuencias reguladoras son conocidas por los expertos en la materia, o puede utilizarse una secuencia descrita en Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA., 1990, de Goeddel. Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores como la selección de la célula huésped que debe transformarse y/o del tipo de proteína deseado que debe expresarse. Dichos vectores de expresión pueden utilizarse para transformar células, produciendo de esta manera proteínas o péptidos de fusión codificados por ácidos nucleicos tales como los descritos en la presente invención.

Los vectores de expresión recombinantes de la presente invención pueden diseñarse para la expresión de proteínas de fusión codificadas en células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, pueden expresarse proteínas de fusión en células bacterianas, tales como E. coli, en células de insectos (utilizando, por ejemplo, baculovirus), en células de levadura, en células vegetales o en células de mamífero. Pueden encontrarse otras células huésped adecuadas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA., 1990. El tipo de célula huésped que se seleccione para expresar las proteínas de fusión no resulta crítico para la presente invención y puede ser el que se desee.

La expresión en procariotas se lleva a cabo con mayor frecuencia en células de E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que llevan a cabo la expresión de las proteínas de fusión. Entre los vectores de expresión inducibles se encuentran pTrc (Amann et al., Gene 69:301-315, 1988) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, 60-89, 1990). Aunque la expresión del gen diana se basa en la transcripción por la ARN polimerasa del huésped a partir del promotor de fusión trp-lac en el vector pTrc, la expresión de los genes diana insertados en el vector pET 11d se basa en la transcripción a partir del promotor de fusión gn10-lac0 de T7 mediada por ARN polimerasa vírica que se coexpresa (gn1 de T7). Esta polimerasa vírica la proporcionan las cepas huésped BL21(DE3) o HMS174(DE3) a partir de un vector profago \lambda residente que incluye un gn1 de T7 bajo control transcripcional del promotor lacUV 5. Otro sistema de expresión bacteriana atractivo consiste en el sistema de expresión pGEX (Pharmacia), en el que los genes se expresan como productos de fusión de glutatión-S-transferasa (GST), permitiendo una fácil purificación del gen expresado en una columna de afinidad GST.

Una estrategia para maximizar la expresión de la proteína recombinante en células de E. coli consiste en expresar la proteína en bacterias huésped con una capacidad deteriorada para cortar proteolíticamente las proteínas expresadas por recombinación (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, 119-128, 1990). Otra estrategia consiste en alterar la secuencia de ácidos nucleicos del ADN quimérico que debe insertarse en un vector de expresión, de manera que los codones individuales para cada aminoácido serían los utilizados preferentemente en proteínas de E. coli altamente expresadas (Wada et al., Nucl. Acids Res. 20:2111-2118, 1992). Dicha alteración de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención podría llevarse a cabo mediante técnicas estándar de síntesis de ADN.

Entre los ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cereviseae se incluyen pYepSec1 (Baldari et al., Embo J. 6:229-234, 1987), pMFa (Kurjan y Herskowitz, Cell 30:933-943, 1982), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54:113-123, 1987), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA.).

Entre los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insectos cultivadas (células SF 9) se incluyen la serie pAc (Smith et al., Mol. Cell Biol. 3:2156-2165, 1983) y la serie pVL (Lucklow, V. A., y Summers, M. D., Virology, 1989).

Se encuentran disponibles vectores tales como los plásmidos Ti y Ri para la transformación y la expresión de plantas. Estos vectores especifican funciones de transferencia de ADN y se utilizan cuando se desea que los constructos se introduzcan en la planta y se integren establemente en el genoma mediante transformación mediada por Agrobacterium.

Un constructo típico consiste, en dirección 5’ a 3’, en una región reguladora completa con un promotor capaz de controlar la expresión en una planta, una región codificante de proteína, y una secuencia que contiene una señal de terminación transcripcional que resulta funcional en plantas. Las secuencias que comprenden el constructo puede ser naturales o sintéticas, o cualquier combinación de las mismas.

Pueden utilizarse tanto los promotores no específicos de semillas, tales como el promotor CaMV 35-5 (Rothstein et al., Gene 53:153-161, 1987), como los promotores específicos de semillas (cuando se desea una expresión específica de semillas), tales como el promotor de la faseolina (Sengupta-Gopalan et al., PNAS USA 82:3320-3324, 1985), o el promotor de 18 kDa de la oleosina de Arabidopsis (Van Rooijen et al., Plant Mol. Biol. 18:1177-1179, 1992). Además del promotor, la región reguladora contiene un sitio de unión ribosómica que posibilita la traducción de los transcritos en plantas y que puede asimismo contener una o más secuencias intensificadoras, tales como el líder AMV (Jobling y Gehrke, Nature 325: 622-625, 1987), para incrementar la expresión de producto.

La región codificante del constructo comprende típicamente secuencias que codifican una región propéptido fusionada en el mismo marco con una proteína deseada y que terminan con un codón de terminación de la traducción. La secuencia puede asimismo incluir intrones.

La región que contiene la señal de terminación transcripcional puede comprender cualquiera de las secuencias funcionales en plantas, tales como la secuencia de terminación de la nopalina sintasa, y puede además incluir secuencias intensificadoras para incrementar la expresión de producto.

Los diversos componentes del constructo se ligan entre sí utilizando procedimientos convencionales, típicamente en un vector basado en pUC. A continuación, este constructo puede introducirse en un vector Agrobacterium y posteriormente en plantas huésped, utilizando uno de los procedimientos de transformación que se describen de manera general a continuación.

Los vectores de expresión contienen asimismo normalmente un marcador que permite la expresión en células vegetales. Convenientemente, el marcador puede ser una resistencia a un herbicida, por ejemplo el glifosato, o a un antibiótico, tal como canamicina, G418, bleomicina, higromicina, cloranfenicol o similares. El marcador particular utilizado será uno que permita la selección de células trasformadas a partir de células que carecen de la molécula recombinante de ácidos nucleicos introducida.

Se encuentran disponibles una variedad de técnicas para la introducción de secuencias de ácidos nucleicos, en particular de ADN, en células vegetales huésped. Por ejemplo, los constructos de ADN quimérico pueden introducirse en células huésped obtenidas a partir de plantas dicotiledóneas, tales como el tabaco, y de especies oleaginosas, tales como B. napus, utilizando vectores Agrobacterium estándar; mediante un protocolo de transformación, tal como el descrito por Moloney et al., Plant Cell Rep. 8:238-242, 1989, o por Hinchee et al., Bio/Technol. 6:915-922, 1988; o mediante otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la utilización de T-ADN para la transformación de células vegetales ha sido estudiada extensivamente y se describe ampliamente en la Solicitud de patente europea número de serie 120.516; Hoekema et al., 1985, Capítulo V, en: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam); Knauf et al., 1983, Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium, página 245, en: Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction, editor Puhler A., Springer-Verlag, NY); y An et al., EMBO J. 4:277-284, 1985. Convenientemente, pueden cultivarse explantes con A. tumefaciens o con A. rhizogenes para permitir la transferencia del constructo de transcripción a las células vegetales. Tras la transformación con Agrobacterium, las células vegetales se dispersan en un medio apropiado para la selección, posteriormente se recuperan los callos, los brotes y finalmente las plántulas. El huésped Agrobacterium albergará un plásmido que comprende genes víricos necesarios para la transferencia del ADN-T a las células vegetales. Para la inyección y la electroporación, (ver a continuación) pueden introducirse plásmidos Ti desarmados (que carecen de los genes tumorales, particularmente de la región de ADN-T) en la célula vegetal.

La utilización de técnicas no Agrobacterium permite la utilización de los constructos descritos en la presente memoria para obtener la transformación y la expresión en una amplia diversidad de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas y en otros organismos. Estas técnicas resultan especialmente útiles para especies intratables en un sistema de transformación de Agrobacterium. Entre otras técnicas de transferencia de genes se incluyen la biolística (Sanford, Trends in Biotech. 6:299-302, 1988), la electroporación (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824-5828, 1985; Riggs y Bates, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, 1986) o la captación de ADN mediada por PEG (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:169-177, 1985).

En una aplicación específica, tal como la referente a B. napus, las células huésped que deben recibir los constructos de ADN recombinante típicamente se derivan de petíolos de los cotiledones, tal como describen Moloney et al. (Plant Cell Rep. 8: 238-242, 1989). Entre otros ejemplos que utilizan semillas oleaginosas se incluyen la transformación de cotiledones en explantes de semillas de soja (Hinchee et al., Bio/Technology 6:915-922, 1988), y la transformación del tallo del algodón (Umbeck et al., Bio/Technology 5:263-266, 1981).

Tras la transformación, las células, por ejemplo en discos foliares, se cultivan en un medio selectivo. Tras emerger los brotes, se cortan y se colocan sobre un medio de enraizamiento. Tras la formación de suficientes raíces, las plantas se transfieren a tierra. A continuación, se someten a ensayo plantas putativamente transformadas para la detección de la presencia de un marcador. Se lleva a cabo la transferencia southern del ADN genómico utilizando una sonda adecuada, por ejemplo una prosecuencia de la quimosina, para mostrar que se ha producido la integración de las secuencias deseadas en el genoma de la célula huésped.

Se deja que las plantas transformadas cultivadas de acuerdo con modos convencionales produzcan semillas. Véase, por ejemplo, McCormick et al., (Plant Cell Reports 5:81-84, 1986). La transferencia northern puede llevarse a cabo utilizando una sonda génica apropiada con ARN aislado de tejido en el que se espera que se produzca transcripción, tal como embrión de semilla. El tamaño de los transcritos seguidamente puede compararse a continuación con el tamaño teórico del transcrito de la proteína de fusión.

Pueden cultivarse dos o más generaciones de plantas transgénicas y cruzarse o autofecundarse para permitir la identificación de plantas y cepas con propiedades fenotípicas deseadas, incluyendo la producción de proteínas recombinantes. Puede resultar deseable asegurar la homocigosidad de las plantas, cepas o líneas que producen proteínas recombinantes para garantizar la herencia continuada del carácter recombinante. Los procedimientos de selección de plantas homocigóticas son bien conocidos por los expertos en la técnica del cultivo de plantas, e incluyen la autofecundación y selección recurrentes y el cultivo de anteras y microsporas. Las plantas homocigóticas también pueden obtenerse mediante la transformación de células haploides o de tejidos, seguido de la regeneración de las plántulas haploides, convertidas posteriormente en plantas diploides mediante cualquiera de entre varios medios conocidos (por ejemplo: tratamiento con colchicina u otros agentes de alteración de los microtúbulos).

El polipéptido de la presente invención puede ser cualquier polipéptido que no se encuentra fusionado normalmente con el propéptido utilizado en el procedimiento. El polipéptido es preferentemente estable en condiciones de corte, por ejemplo bajo pH ácido, y el polipéptido puede activarse tras el corte ajustando el pH, o alterando el medio de otro modo, de manera que se generen condiciones óptimas para la actividad enzimática. La reacción de corte puede llevarse a cabo en cualquier momento a partir del inicio de la producción de proteína de fusión en un sistema celular recombinante. En las formas de realización preferidas, la reacción de corte se lleva a cabo utilizando extractos celulares crudos que producen la proteína recombinante o cualquier fracción purificada de la misma.

El propéptido utilizado en la presente invención puede ser cualquier propéptido derivado de cualquier zimógeno de maduración autocatalítica, incluyendo los propéptidos derivados de proteasas, incluyendo proteasas aspárticas, serina proteasas y cisteína proteasas. En las formas de realización preferidas de la invención, el propéptido se deriva de entre quimosina, pepsina, proteasa de VIH-1, pepsinógeno, catepsina o proteinasa A de levadura. Se encuentran disponibles las secuencias de aminoácido y/o de ADN del pepsinógeno (Ong et al., J. Biol. Chem. 6104-6109, 1968; Pedersen et al., FEBS Letters 35:255-526, 1973), de la quimosina (Foltmann et al., 1977; Harris et al., Nucl. Acids. Res. 10:2177-2187, 1982), de la proteinasa A de levadura (Ammerer et al., Mol. Cell. Biol. 6:2490-2499, 1986; Woolford et al., Mol. Cell. Biol. 6:2500-2510, 1986), de la proteasa de VIH-1 (Ratner et al., AIDS Res. Human Retrovir. 3:57-69, 1987), de la catepsina (McIntyre et al., J. Biol. Chem. 269:567-572, 1994) y de la pepsina (Koelsch et al., FEBS Lett. 343:6-10, 1994). Basándose en estas secuencias, pueden prepararse clones de ADNc que comprenden el material genético codificante de los propéptidos y pueden prepararse genes de fusión de acuerdo con la presente invención y poniendo en práctica técnicas conocidas comúnmente por los expertos en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, 1990).

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Para identificar otras prosecuencias que presenten las propiedades deseadas, en el caso en que se ha aislado un zimógeno sometido a corte autocatalítico (por ejemplo, quimosina y proteína A de levadura), la proteína puede secuenciarse parcialmente, de manera que puede diseñarse una sonda de ácidos nucleicos para identificar otros propéptidos. La sonda de ácidos nucleicos puede utilizarse para cribar las bibliotecas de ADNc o genómicas preparadas a partir de cualquier célula o virus vivo. A continuación, pueden aislarse secuencias que se hibriden con la sonda en condiciones restrictivas.

También pueden aislarse otras prosecuencias mediante el cribado de bibliotecas de expresión de ADNc. Pueden obtenerse anticuerpos frente a propéptidos existentes y pueden cribarse bibliotecas de expresión del ADNc con estos anticuerpos, esencialmente tal como describen Huynh et al. en DNA cloning vol. 1, A Practical Approach, editor D. M. Glover, IRL Press, 1985). Pueden prepararse bibliotecas de expresión a partir de cualquier célula o virus vivo.

Los expertos en la materia podrán descubrir otros zimógenos de procesamiento autocatalítico. La prosecuencia real que se selecciona no resulta de importancia crítica y puede ser la que se desee. Debe entenderse claramente que la prosecuencia de cualquier zimógeno de maduración autocatalítica puede utilizarse sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención.

Tras el aislamiento de una prosecuencia, el material genético codificante del propéptido puede fusionarse con el material genético codificante del polipéptido de interés utilizando técnicas de clonación de ADN conocidas por los expertos de la materia, tales como la digestión de restricción, la ligación, la electroforesis en gel, la secuenciación del ADN y la PCR. Se encuentran disponibles una gran diversidad de vectores de clonación para llevar a cabo las etapas de clonación necesarias. Resultan especialmente adecuados para estos fines los vectores de clonación que incluyen un sistema de replicación funcional en células de E. coli, tales como pBR322, la serie pUC, la serie M13mp, pACYC184, pBluescript, etc. Pueden introducirse secuencias en estos vectores y los vectores pueden utilizarse para transformar la célula huésped de E. coli, que puede cultivarse en un medio apropiado. Pueden recuperarse los plásmidos de las células tras la recolección y lisis de las mismas.

La invención comprende asimismo el propéptido de longitud completa, así como porciones funcionales del propéptido o formas mutadas funcionales del propéptido. Pueden utilizarse formas mutadas del propéptido para obtener un corte específico entre el propéptido y una proteína heteróloga. Las mutaciones en el propéptido podrían alterar las condiciones óptimas, tales como temperatura, pH y concentración de sales, bajo las que se consigue el corte de un péptido heterólogo (McCaman, M. T. y Cummings, D. B., J. Biol. Chem. 261:15345-15348, 1986). Dependiendo del propéptido, el corte de la proteína heteróloga a partir de diversos propéptidos resultará óptimo en condiciones variables diferentes. De esta manera, la invención podrá aplicarse a proteínas heterólogas que se corten preferentemente bajo una diversidad de condiciones deseables.

La secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido heterólogo puede fusionarse corriente arriba o corriente abajo de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el propéptido, y pueden utilizarse concatámeros que contienen unidades repetitivas del propéptido fusionado con la proteína heteróloga. En las formas de realización preferidas, la proteína heteróloga se fusiona corriente abajo del propéptido. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica el propéptido generalmente no incluye la forma madura del zimógeno.

En una forma de realización, el propéptido es un propéptido derivado de la quimosina y el polipéptido heterólogo es la hirudina (Dodt et al., FEBS Letters 65:180-183, 1984). En particular, los presentes inventores han construido una secuencia de ADN quimérico en la que el ADN que codifica el propéptido de la quimosina se encontraba fusionado corriente arriba de la secuencia de ADN que codificante de la proteína anticoagulante de la sanguijuela llamada hirudina. La fusión génica (Pro-Hirudina) se expresó en células de E. coli. Se descubrió que tras reducir el pH a 2, y más preferentemente a un 4,5, y en presencia de una cantidad reducida de quimosina madura, la proteína de fusión heteróloga, la hirudina, resultaba eficientemente cortada del propéptido de la quimosina.

El corte autocatalítico requiere una alteración del medio del péptido de fusión. Esto puede incluir alteraciones del pH, de la temperatura, de las concentraciones de sales, de las concentraciones de otros agentes químicos, o cualquier otra alteración que resulte en unas condiciones del medio que permitan el corte autocatalítico de la proteína de fusión. Puede alterarse el medio mediante la administración de la proteína de fusión en un medio de corte adecuado. El medio de corte puede ser un medio fisiológico, tal como, por ejemplo, estómago, intestino, riñones, leche o sangre de mamífero, o las condiciones del medio pueden ser artificiales. El medio de corte puede asimismo generarse mediante la adición de uno o más agentes o mediante la alteración de la temperatura del medio de la proteína de fusión. La reacción de corte puede tener lugar cuando la proteína de fusión es pura o sustancialmente pura, así como cuando se encuentra presente en preparaciones más crudas, por ejemplo en extractos celulares.

En una forma de realización preferida, los inventores han utilizado quimosina madura para ayudar en la reacción de corte. Generalmente, la adición de enzima maduro ayuda en la reacción de corte. El enzima utilizado para esta reacción puede ser homólogo del propéptido, por ejemplo puede utilizarse quimosina para ayudar en el corte de la proquimosina fusionada con una proteína deseada, o puede ser heterólogo respecto al propéptido, por ejemplo puede utilizarse pepsina para ayudar en el corte de la proquimosina fusionada con una proteína deseada.

Aunque en una forma de realización preferida se añade quimosina madura, cabe la posibilidad de que la utilización de otros propéptidos no requiera la adición del péptido maduro para conseguir un corte eficiente.

La activación de la proteína de fusión puede ser in vitro o in vivo. En una forma de realización, el propéptido se utiliza para facilitar el corte de las proteínas producidas por recombinación en cuerpos lipídicos, tal como se da a conocer en la publicación de la solicitud PCT nº solicitud de patente WO 96/21029. En esta forma de realización, el propéptido se fusionaría corriente abajo de una proteína de cuerpo lipídico y corriente arriba de la proteína o péptido recombinante de interés.

En otra aplicación in vivo, se introducirían dos vectores en el mismo huésped. En un vector se controlaría la expresión del zimógeno o de la proteína madura mediante un sistema de promotor inducible. El otro vector comprendería un propéptido fusionado corriente arriba de una proteína heteróloga de interés. De esta manera, resulta posible controlar el momento de corte del péptido o proteína corriente abajo del propéptido utilizando el promotor que controla la expresión del zimógeno o de la proteína madura. Alternativamente, los dos genes expresados se combinarían en el mismo vector. En las formas de realización preferidas de esta aplicación, el propéptido utilizado se corta en condiciones fisiológicas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende: (a) un propéptido derivado de un zimógeno de maduración autocatalítica, y (b) un polipéptido heterólogo respecto al propéptido. En una forma de realización, el polipéptido es un péptido terapéutico o nutricional, o una proteína terapéutica o nutricional, que puede administrarse en forma de proteína de fusión inactiva. La activación o la maduración a través del corte se produciría únicamente al administrarse en las condiciones fisiológicas únicas prevalentes en el órgano diana, en el tejido diana o en el líquido corporal diana, por ejemplo estómago, intestino, riñón, leche o sangre de mamífero. El corte podría incrementarse con una proteasa específica para el péptido, se utiliza preferentemente el zimógeno maduro homólogo del propéptido. Este procedimiento resulta particularmente útil para la administración de vacunas, citoquinas, lipasa gástrica, antibióticos peptídicos, lactasa y enzimas de pienso para ganado ingeridos oralmente, que facilitan la digestión, tales como xilanasa y celulasa. Por ejemplo, un péptido o proteína terapéutico o nutricional fusionado corriente abajo del propéptido de la quimosina podría activarse en el estómago de mamífero tras su ingestión. Puede añadirse la forma madura de la quimosina o la forma precursora inactiva de la quimosina para ayudar en el corte del péptido nutricional o terapéutico.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en una forma de realización la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión que comprende: (a) un propéptido derivado de un zimógeno de maduración autocatalítica, y (b) un polipéptido heterólogo respecto al propéptido, mezclado con un diluyente o portador adecuado. La composición puede administrarse por vía oral, intravenosa o a través de cualquier otra vía de administración.

La proteína de fusión y/o la proteína madura también puede producirse en una fuente de alimento comestible, tal como leche animal o en un cultivo comestible, que puede consumirse sin necesidad de otra purificación. Por lo tanto, en otra forma de realización, la presente invención proporciona una composición alimentaria que comprende una proteína de fusión que comprende: (a) un propéptido derivado de un zimógeno de maduración autocatalítica, y (b) un polipéptido heterólogo respecto al propéptido, mezclado con un diluyente o un portador adecuado. La composición nutricional puede mezclarse con cualquier alimento líquido o sólido y puede ser consumido por un ser humano o un animal.

Las composiciones de la invención pueden incluir secuencias de ácidos nucleicos quiméricos o un vector de expresión que contenga secuencias de ácidos nucleicos quiméricos de la presente invención. En esta forma de realización, la proteína de fusión se produce in vivo en el animal huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos quiméricos de la invención pueden introducirse directamente in vivo en células o en tejidos utilizando vehículos de administración, tales como vectores retrovíricos, vectores adenovíricos y vectores de virus ADN. Las secuencias de ácidos nucleicos quiméricos también pueden introducirse in vitro en células utilizando técnicas físicas, tales como la microinyección y la electroporación, o procedimientos químicos, tales como la coprecipitación y la incorporación de ácidos nucleicos en liposomas. Los vectores de expresión pueden asimismo administrarse en forma de aerosol o de lavado.

La presente invención resulta asimismo útil en el procedimiento de purificación de las proteínas recombinantes. En una forma de realización, se aplica a una columna cromatográfica un extracto celular que contiene una proteína de fusión heteróloga respecto al propéptido. La unión selectiva de la proteína de fusión a anticuerpos cultivados contra la secuencia propeptídica e inmovilizados en la columna, se traduce en la retención selectiva de la proteína de fusión. En lugar de basarse en anticuerpos contra la secuencia propeptídica, puede incluirse en la fusión génica un gen codificante de otro dominio inmunogénico o un gen codificante de un péptido con afinidad para un material de columna utilizado comúnmente, tal como celulasa, glutatión-S-transferasa o quitina, o cualquier otro marcador deseable.

En otra aplicación contemplada, se incluiría en el constructo un péptido codificante de una secuencia que tiene como resultado el anclaje de la proteína de fusión a la pared celular. Son proteínas de anclaje adecuadas para esta aplicación la \alpha-glutenina FLO1, la principal proteína de pared celular de los eucariotas inferiores, y una proteinasa de las bacterias del ácido láctico (patente PCT nº 94/18330). La expresión de una proteína de fusión resultaría en la inmovilización de la proteína de interés en la pared celular. La proteína de interés podría aislarse mediante lavado de las células con agua o con tampón de lavado. Tras el corte, las células podrían eliminarse en una simple etapa de centrifugación y la proteína podría aislarse del tampón de lavado.

Los ejemplos no limitativos siguientes resultan ilustrativos de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1

En el primer ejemplo, se preparó la proteína hirudina en forma de una proteína de fusión con el propéptido de la quimosina, y la hirudina se demostró que se encontraba activa en extractos celulares de E. coli tras la realización de una reacción de corte.

Construcción de una fusión pGEX-Pro-Hirudina

La proteína de fusión que estudiaron los presentes inventores comprendía el propéptido de la quimosina B bovina (Foltmann et al., 1977; Harris et al., Nucl. Acids. Res. 10:2177-2187, 1982) fusionado a la variante 1 de la hirudina (Dodt et al., FEBS Letters 65:180-183, 1984). El gen híbrido que codificaba esta proteína de fusión se construyó utilizando procedimientos PCR estándares (Horton et al., Gene 77:61-68, 1989). La secuencia de ADN de esta fusión Pro-Hirudina se clonó en pGEX-4T-3 (Pharmacia) corriente abajo del gen codificante de la glutatión-S-transferasa (GST). La secuencia completa de la GST-Pro-Hirudina se muestra en la figura 1.

Cultivo de E. coli transformado con pGEX-4T-3 y con pGEX-Pro-Hirudina

Se transformaron los plásmidos pGEX-4T-3 y pGEX-Pro-Hirudina en la cepa DH5\alpha de E. coli para conseguir un nivel de expresión elevado. Se utilizó una sola colonia para inocular 5 ml de caldo de cultivo LB-amp. Estos cultivos se cultivaron durante la noche. Se utilizó un mililitro de cada cultivo cultivado durante la noche para inocular 50 ml de caldo de cultivo LB-amp. Estos cultivos se cultivaron hasta un valor de DO_{600} = 0,6. A este valor de DO, se añadió IPTG (concentración final 1 mM) para inducir la expresión de la GDT y de las proteínas de fusión GST-Pro-Hirudina. Tras esta inducción, los cultivos se cultivaron durante 3 horas más a 37ºC. Las células se peletizaron a 5.000 x g durante 10 minutos, y se resuspendieron en 5 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS). Se sonicaron las células resuspendidas y se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 minutos para separar los cuerpos de inclusión (fracción de pellet) de las proteínas solubles (fracción de sobrenadante). La transferencia western de tanto el pellet como de la fracción sobrenadante indicó que, bajo las condiciones de cultivo indicadas anteriormente, se encontraban cantidades significativas (de entre 5% y 10%) de GST y de proteína GST-Pro-Hirudina en la fracción sobrenadante. El resto (entre 90% y 95%) se acumuló en cuerpos de inclusión (resultados no mostrados).

Mediciones de actividad de hirudina

Las fracciones sobrenadantes tanto de GST como de GST-Pro-Hirudina se sometieron a ensayo para la actividad antitrombina. Las muestras se trataron de la manera siguiente: A) 20 \mul de sobrenadante + 20 \mul de agua, B) 20 \mul de sobrenadante + 20 \mul de fosfato sódico 100 mM a pH 2,0, C) 20 \mul de sobrenadante + 20 \mul de fosfato sódico 100 mM a pH 2,0 + 2 \mug de quimosina (Sigma), D) 20 \mul de sobrenadante + 20 \mul de fosfato sódico 100 mM a pH 4,5, E) 20 \mul de sobrenadante + 20 \mul de fosfato sódico 100 mM a pH 4,5 + 2 \mug de quimosina. Estas muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió un total de 10 \mul de las muestras a 1 ml de tampón de ensayo (Tris 20 mM [pH 7,5], NaCl 100 mM, CaCl_{2} 5 mM, 0,1 unidades de trombina) y se incubaron durante 2 a 3 minutos antes de la adición de 50 \mul de p-tos-gli-pro-arg-nitroanilida (1 mM). Se midió la actividad de trombina como función de corte de la cromozima mediante seguimiento del incremento de la absorbancia a 405 nm a lo largo del tiempo (Chang, FEBS Letters 164:307-313, 1983). Se determinó el valor de \Delta_{Abs} (405 nm) tras 2 minutos. Los resultados de las mediciones de actividad se indican en la Tabla 1.

Tal como se puede apreciar en la Tabla 1, el único extracto que mostró una actividad antitrombina significativa fue el extracto que contenía la fusión GST-Pro-Hirudina, que se había tratado a pH 4,5 y a la que se había añadido un suplemento de 2 \mug de quimosina (E). La transferencia western (resultados no mostrados) indicó que, aparte del tratamiento a pH 4,5, se apreciaba asimismo un corte completo con la fusión GST-Pro-Hirudina tratada a pH 2,0 y suplementada con 2 \mug de quimosina. Ha sido bien documentado que la quimosina no procesada expuesta a pH 2,0 forma una pseudoquimosina, antes de madurar para convertirse en quimosina (Foltmann et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 42:65-79, 1977; Foltmann, Proc. Natl. Acad. Sci. 74:2321-2324, 1992; McCaman y Cummings, J. Biol. Chem. 261: 15345-15348, 1988). El sitio del corte de la pseudoquimosina se encuentra situado en el enlace peptídico Phe^{27}-Leu^{28} y se indica en la figura 1. La incapacidad de la fusión GST-Pro-Hirudina, tratada a pH 2,0 y suplementada con 2 \mug de quimosina, de inhibir la actividad de trombina podría explicarse por el hecho de que el corte se produjo en el enlace peptídico Phe^{27}-Leu^{28} y no en el enlace peptídico Phe^{43}-Val^{44}, que separa el propéptido de la quimosina de la hirudina madura. Ha sido bien documentado que la hirudina madura se encuentra activa únicamente cuando no presenta ningún aminoácido adicional unido a la secuencia N-terminal nativa (Loison et al., Bio/Technology 6:72-77, 1988).

Ejemplo 2

En el segundo ejemplo, se preparó la proteína hormona de crecimiento de la carpa (cGH) en forma de fusión de la proquimosina. La hormona de crecimiento de la carpa se demostró que se encontraba presente en extractos celulares de E. coli tras la realización de la reacción de corte.

Construcción de una fusión pHis-pro-cGH

Se construyó una proteína de fusión que comprendía el propéptido de la quimosina B bovina (Foltmann et al., 1977; Harris et al., Nucl. Acids Res. 10:2177-2187, 1982) fusionada a la hormona de crecimiento de carpa (Koren et al., Gene 67:309-315, 1989). El gen híbrido que codificaba esta proteína de fusión se construyó utilizando una fusión génica mediante PCR. La secuencia de ADN para esta fusión Pro-cGH se clonó en pUC19, produciendo el plásmido pPro-cGH. La fusión génica Pro-cGH se liberó de pPro-cGH mediante digestión SwaI/Kpnl y se insertó en el sitio PvuII/KpnI de pRSETB (Invitrogen Corp.), que contenía una etiqueta polihistidina, que facilita la purificación, y un sitio de reconocimiento y corte de enteroquinasa, generando la fusión pHis-Pro-cGH. La secuencia completa de la inserción His-Pro-cGH se muestra en la figura 2.

Cultivo de células de E. coli transformadas con pHis-Pro-Hirudina

Se transformó el plásmido pHis-Pro-cGH en una cepa BL21 de E. coli para conseguir niveles de expresión elevados. Se utilizó una sola colonia para inocular caldo de cultivo LB-amp. Estos cultivos se cultivaron durante la noche. Se utilizó un mililitro de cada cultivo cultivado durante la noche para inocular 50 ml de caldo de cultivo LB-amp. Estos cultivos se cultivaron hasta un valor de DO_{600} = 0,6. A este valor de DO, se le añadió IPTG (concentración final 0,5 mM) para inducir la expresión de la proteína de fusión His-Pro-cGH. Tras esta inducción, los cultivos se cultivaron durante 3 horas adicionales a 37ºC. Las células se peletizaron a 5.000 x g durante 10 minutos, y se resuspendieron en 5 ml de tampón de PBS (pH 7,3). Las células resuspendidas se rompieron con una prensa de French y se centrifugaron a 10.000 x g durante 10 minutos. Se resuspendieron los cuerpos de inclusión en 5 ml de agua y se disolvieron mediante adición lenta de NaOH. Se añadió 1 ml de 10 x PBS a esta solución y se ajustó el volumen a 10 ml. Se ajustó el pH de la solución a un valor de 8,0 mediante adición lenta de HCI y se incubó la solución a 4ºC durante 2 horas. Se ajustó el pH a 7,5 y en este punto la solución se centrifugó a 10.000 x g durante 15 minutos para eliminar las materias insolubles. A continuación, se purificó la proteína de fusión mediante cromatografía quelante de afinidad utilizando columnas de unión de metal Hi-Trap (Pharmacia). Se saturó la columna con iones de Zn^{++} y a continuación se utilizó para purificar por afinidad la proteína de fusión His-Pro-cGH siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Corte de cGH producido en E. coli transformado con pHis-Pro-cGH

Con el fin de cortar la proteína de fusión, se trataron 15 \mul (aproximadamente 1 \mug) del preparado proteico con 17 \mul de PBS (No cortado), con 14 \mul de PBS y 3 \mul de enteroquinasa (Cortado (EQ)), o con 16 \mul de tampón fosfato (pH 2) y 1 \mul de quimosina (Cortado (PRO)). Se incubaron todas las muestras a 37ºC durante 2 horas y a continuación se analizaron mediante SDS-PAGE, seguido de transferencia western. El principal anticuerpo utilizado consistía de un antisuero de conejo preparado contra cGH. El anticuerpo secundario consistía de una IgG de cabra anticonejo conjugada con fosfatasa alcalina.

Tal como se puede apreciar en la figura 4, se observó el corte de la proteína de fusión con enteroquinasa, proporcionando una banda de proteína correspondiente a la masa molecular calculada de la fusión Pro-cGH (26 kDa). De manera similar, el corte con quimosina proporcionó una banda de proteína correspondiente a la masa molecular teórica esperada del polipéptido cGH (aproximadamente 22 kDa).

Ejemplo 3

En este ejemplo, se preparó proteína de hormona de crecimiento de la carpa (cGH) en forma de fusión de proquimosina. La proteína de fusión de hormona de crecimiento de carpa se cortó con extracto intestinal de escarabajo del nabo rojo, ilustrando de esta manera una aplicación in vivo de la invención.

Se preparó His-Pro-cGH siguiendo el protocolo del Ejemplo 2. El extracto intestinal se preparó a partir de larvas de escarabajo del nabo rojo de la manera siguiente. Adultos criados en laboratorio pusieron huevos de escarabajo del nabo rojo (Entomoscelis americana Brown (Coleoptera: Chrysomelidae)), y se almacenaron a -20ºC durante por lo menos tres meses antes de su utilización. Se eclosionaron los huevos en platos que contenían papel de filtro húmedo, y se mantuvieron las larvas en plántulas de canola. Solamente se utilizaron larvas que se alimentaban activamente. Se extrajeron los intestinos medios de larvas de segundo estadio mediante disección en solución salina y se almacenaron en solución salina a -20ºC. Se descongelaron los intestinos, y se enjuagaron en ddH_{2}O (50 \mul por intestino). Se centrifugó el homogenato a 16.000 x g (10 minutos, 4ºC) y se utilizó el sobrenadante decantado en el ensayo proteolítico.

Tal como se puede observar en la figura 5, los extractos preparados a partir de intestino de escarabajo del nabo rojo cortaron la proteína de fusión y liberaron el polipéptido cGH. No se observó que el corte fuese completo. Esto podría deberse al hecho de que el pH en el extracto intestinal no era óptimo para que transcurriese la reacción de corte.

Aunque la presente invención se ha descrito en relación a ejemplos considerados preferidos en la actualidad, debe entenderse que la invención pretende comprender diversas modificaciones y organizaciones equivalentes comprendidas dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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Leyendas detalladas de las figuras

Figura 1. Secuencia de ácidos nucleicos y secuencia deducida de aminoácidos deducida de una secuencia de GST-Pro-Hirudina. Se ha subrayado la secuencia deducida del propéptido de quimosina y se ha señalado en cursiva la secuencia deducida de la proteína hirudina. Se optimizó la secuencia de ácidos nucleicos de la hirudina para la utilización en codones de plantas. El sitio de corte de la pseudoquimosina entre Phe27 y Leu28 y el enlace peptídico que separa la proquimosina y la hirudina madura (Phe42 - Val43) se indican con una flecha (\uparrow).

Figura 2. Secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de ducida de aminoácidos de una secuencia de His-Pro-cGH. Se ha subrayado la secuencia deducida del propéptido de quimosina y se ha marcado en cursiva el aminoácido de cGH deducido. El sitio de corte de la enteroquinasa entre Lys31 y Asp32 y el enlace peptídico que separa la proquimosina y la cGH madura (Phe84 - Ser85) se indican con una flecha (\uparrow). Se indican asimismo el sitio de la polihistidina (His5-His10) y el sitio de reconocimiento de la enteroquinasa (Asp27-Lys31).

La figura 3 es un diagrama esquemático del constructo de fusión His-Pro-cGH. El sitio de corte de la enteroquinasa (corte de enteroquinasa) y el sitio de corte de la proquimosina (corte de PRO) se indican con una flecha (\uparrow).

La figura 4 muestra el corte de la His-Pro-cGH purificada. Se muestran en la transferencia western sondeada con anticuerpos anti-cGH, extractos de proteína His-Pro-cGH purificados en columna procedentes de células de E. coli que expresaban el constructo de fusión His-Pro-cGH tratadas con enteroquinasa (Cortado (EQ)), con quimosina madura a pH reducido (Cortado (PRO)), y el control, tratado con tampón PBS (No cortado).

La figura 5 muestra el corte de His-Pro-cGH purificada. Se muestran en la transferencia western sondeada con anticuerpos anti-cGH, extractos de proteína His-Pro-cGH purificados en columna procedentes de células de E. coli que expresaban el constructo de fusión His-Pro-cGH tratadas con quimosina madura a pH reducido (Cortado (PRO)), tratadas con enteroquinasa (Cortado (EQ)), tratadas con extracto intestinal de escarabajo rojo del nabo (Cortado (Intestino de Escarabajo del Nabo Rojo).

TABLA 1 Mediciones de actividad de extractos bacterianos que contenían GST (glutatión-S-transferasa) y fusiones de GST-Pro-Hirudina

1

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTES:

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(A)

NOMBRE: SemBioSys Genetics Inc.

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(B)

CALLE: 2500 University Drive N.W.

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(C)

CIUDAD: Calgary

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(D)

ESTADO: Alberta

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(E)

PAÍS: Canadá

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(F)

CÓDIGO POSTAL: T2N 1N4

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(G)

nº de TELÉFONO: (403) 220-5161

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

nº de TELEFAX: (403) 220-0704

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(A)

NOMBRE: van Rooijen, Gijs

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(B)

CALLE: 3223 Bearspaw Drive N.W.

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(C)

CIUDAD: Calgary

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(D)

ESTADO: Alberta

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(E)

PAÍS: Canadá

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(F)

CÓDIGO POSTAL: T2L 1T1

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\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Alcantara, Joenel

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(B)

CALLE: 3 Castledale Place N.W.

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(C)

CIUDAD: Calgary

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(D)

ESTADO: Alberta

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(E)

PAÍS: Canadá

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(F)

CÓDIGO POSTAL: T3J 1Y4

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(A)

NOMBRE: Moloney, Maurice M.

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(B)

CALLE: 34 Edgebrook Cove, N.W.

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(C)

CIUDAD: Calgary

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(D)

ESTADO: Alberta

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(E)

PAÍS: Canadá

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(F)

CÓDIGO POSTAL: T3A 5N5

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento para el corte de proteínas de fusión

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

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(A)

DESTINATARIO: BERESKIN & PARR

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(B)

CALLE: 40 King Street West

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(C)

CIUDAD: Toronto

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(D)

ESTADO: Ontario

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(E)

PAÍS: Canadá

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(F)

CÓDIGO POSTAL: M5H 3Y2

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(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión 1.30

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(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Gravelle, Micheline

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 40.261

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(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: 9369-54

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: (416) 364-7311

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(B)

TELEFAX: (416) 361-1398

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(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1.096 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1032

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:

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2

3

4

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(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 344 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:

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5

6

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(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 819 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1..819

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:

7

8

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(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 273 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:

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9

10

Claims (35)

1. Procedimiento para la preparación de un polipéptido recombinante, que comprende las etapas siguientes:

a)

introducir en una célula huésped un vector de expresión que comprende:

(1)

una secuencia de ácidos nucleicos capaz de regular la transcripción en una célula huésped, ligada funcionalmente a:

(2)

una secuencia de ácidos nucleicos quiméricos que codifica una proteína de fusión, comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos quiméricos (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un propéptido derivado de un zimógeno de maduración autocatalítica, ligado en el marco de lectura a (b) una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga respecto al propéptido y que codifica el polipéptido recombinante, en la que la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga se encuentra situada inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ácidos nucleicos codificante del propéptido; ligada funcionalmente a:

(3)

una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una región de terminación funcional en dicha célula huésped,

b)

cultivar la célula huésped para producir dicha proteína de fusión; y

c)

alterar el medio de la proteína de fusión de manera que el propéptido resulte cortado de la proteína de fusión para liberar el polipéptido recombinante.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho propéptido se deriva de una proteasa.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho propéptido se deriva de una proteasa aspártica, de una serina proteasa o de una cisteína proteasa.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho propéptido se selecciona de entre el grupo que comprende tripsinógeno, pepsina, proteasa de VIH-1, pepsinógeno, catepsina o proteinasa A de levadura.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho propéptido es la quimosina.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido es la hirudina o la hormona de crecimiento de carpa.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de ácidos nucleicos quiméricos no comprende una secuencia codificante de una forma madura del zimógeno.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la alteración del medio comprende la alteración del pH, la alteración de la concentración de sales o la alteración de la temperatura.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la alteración del pH comprende la alteración del pH a un pH de entre 2 y 4,5.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (c) tiene lugar in vitro.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la etapa (c) tiene lugar in vivo.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la etapa (c) tiene lugar en un tejido o en un líquido corporal de un animal no humano.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el tejido o el líquido corporal comprende leche, sangre, estómago, intestino o riñones de dicho animal.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se añade una forma madura de un zimógeno de maduración autocatalítica en la etapa (c) en la que dicho zimógeno es homólogo al propéptido.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que se añade una forma madura de un zimógeno de maduración autocatalítica en la etapa (c) en la que dicho zimógeno es heterólogo respecto al propéptido.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dichas secuencias de ácidos nucleicos son secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN).

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17. Secuencia de ácidos nucleicos quiméricos codificante de una proteína de fusión que comprende: (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un propéptido de longitud completa a partir de un zimógeno de maduración autocatalítica, y (b) una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido heterólogo respecto al propéptido, en la que la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga se encuentra situada inmediatamente corriente abajo de la secuencia de ácidos nucleicos codificante del propéptido y no incluye una secuencia codificante de una forma madura del zimógeno.

18. Secuencia de ácidos nucleicos quiméricos según la reivindicación 17, en la que el propéptido se deriva de una proteasa.

19. Secuencia de ácidos nucleicos quiméricos según la reivindicación 17, en la que el propéptido se deriva de una serina proteasa, de una proteasa aspártica o de una cisteína proteasa.

20. Secuencia de ácidos nucleicos quiméricos según la reivindicación 17, en la que el propéptido se deriva de tripsinógeno, pepsina, proteasa de VIH-1 , pepsinógeno, catepsina o proteinasa A de levadura.

21. Secuencia de ácidos nucleicos quiméricos según la reivindicación 17, en la que el propéptido se deriva de la quimosina.

22. Secuencia de ácidos nucleicos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en la que el polipéptido es la hirudina o la hormona de crecimiento de carpa.

23. Secuencia de ácidos nucleicos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en la que dichas secuencias de ácidos nucleicos son secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN).

24. Secuencia de ácidos nucleicos quiméricos según la reivindicación 23, en la que la secuencia recombinante es tal como se muestra en la SEC ID nº 1 o en la SEC ID nº 3.

25. Vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, y una secuencia reguladora adecuada para la expresión en una célula huésped.

26. Célula huésped transformada que contiene un vector de expresión según la reivindicación 25.

27. Célula huésped transformada que contiene un vector de expresión según la reivindicación 26, en la que la célula huésped es una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula vegetal o una célula animal no humana.

28. Proteína de fusión que comprende: (a) un propéptido de longitud completa derivado de un zimógeno de maduración autocatalítica, y (b) un polipéptido heterólogo respecto al propéptido, en el que el polipéptido heterólogo se encuentra situado inmediatamente más abajo del propéptido y que no incluye una forma madura del zimógeno.

29. Proteína según la reivindicación 28, en la que la proteína de fusión comprende además la propiedad o propiedades indicadas en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, o una combinación permitida de las mismas.

30. Proteína según la reivindicación 28, que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 2 o de la SEC ID nº 4.

31. Composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, mezclada con un diluyente o portador adecuado.

32. Composición alimentaria que comprende una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, mezclada con un diluyente o portador adecuado.

33. Composición farmacéutica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24.

34. Composición alimentaria que comprende una secuencia de ácidos nucleicos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24.

35. Utilización de una proteína de fusión que comprende: (i) un propéptido de longitud completa derivado de un enzima de maduración autocatalítica, ligado a (ii) un polipéptido heterólogo respecto al propéptido, y es una proteína terapéutica o nutricional en la que el polipéptido heterólogo se encuentra situado inmediatamente corriente abajo del propéptido para la preparación de un medicamento para la administración de la proteína terapéutica o nutricional a un ser humano o a un animal.