UA46689C2 - Спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду рослинною або бактеріальною клітиною-хазяїном, спосіб одержання та вивільнення рекомбінантного поліпептиду з рекомбінантного злитого поліпептиду, спосіб виготовлення їжі на основі модифікованого насіння, спосіб одержання ферменту, зв'язаного з масляним тілом, спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду, зв`язаного з масляним тілом, химерна днк, експресуюча касета, спосіб одержання трансгенної рослини, культура рослинних клітин - Google Patents
Спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду рослинною або бактеріальною клітиною-хазяїном, спосіб одержання та вивільнення рекомбінантного поліпептиду з рекомбінантного злитого поліпептиду, спосіб виготовлення їжі на основі модифікованого насіння, спосіб одержання ферменту, зв'язаного з масляним тілом, спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду, зв`язаного з масляним тілом, химерна днк, експресуюча касета, спосіб одержання трансгенної рослини, культура рослинних клітин Download PDFInfo
- Publication number
- UA46689C2 UA46689C2 UA93003022A UA93003022A UA46689C2 UA 46689 C2 UA46689 C2 UA 46689C2 UA 93003022 A UA93003022 A UA 93003022A UA 93003022 A UA93003022 A UA 93003022A UA 46689 C2 UA46689 C2 UA 46689C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- specified
- dna sequence
- dna
- recombinant
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 172
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 100
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title claims abstract description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims description 68
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 43
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 15
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 160
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 110
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 108
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 98
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 58
- 101710089395 Oleosin Proteins 0.000 claims description 58
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 26
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 22
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 17
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 17
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 15
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 14
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 12
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 12
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 9
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 8
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 9
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 claims 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims 2
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 claims 2
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 claims 2
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 claims 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 claims 2
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 claims 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims 2
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 claims 2
- 241001310771 Astata Species 0.000 claims 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 12
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 113
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 113
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 98
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 77
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 76
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 70
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 22
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 22
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 18
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- -1 aliphatic amino acid Chemical class 0.000 description 16
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 15
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 14
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 11
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 11
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 11
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 11
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 11
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 8
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 8
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 7
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 4
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 4
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000010408 film Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000341924 Buthus paris Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- 101710112984 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000082175 Arracacia xanthorrhiza Species 0.000 description 1
- 241000168823 Asida Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 235000017399 Caesalpinia tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000132536 Cirsium Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 244000102216 Crateva tapia Species 0.000 description 1
- 235000003495 Crateva tapia Nutrition 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000000731 Fagus sylvatica Species 0.000 description 1
- 235000010099 Fagus sylvatica Nutrition 0.000 description 1
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 241000526003 Minuca osa Species 0.000 description 1
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 1
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 101710152904 Oleosin 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000201976 Polycarpon Species 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 240000005499 Sasa Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000388430 Tara Species 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710090398 Viral interleukin-10 homolog Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012711 adhesive precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- DMYHGDXADUDKCQ-UHFFFAOYSA-N fenazaquin Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1CCOC1=NC=NC2=CC=CC=C12 DMYHGDXADUDKCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 101150115039 mig gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 101150055581 obp gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000021749 root development Effects 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Винахід відноситься до класу генів, який називається генами протеїнів масляних тіл, зокрема, олеозинів, на характерних властивостях яких засновано заявлений спосіб отримання рекомбінантних протеїнів, при якому протеїн, що викликає інтерес, можна легко відокремити від інших компонентів клітки-хазяїна. Спосіб полягає в тому, що рекомбінантний поліпептид експресується у формі рекомбінантного злитого поліпептиду, що містить протеїн масляного тіла та протеїн, що викликає інтерес. Далі спосіб включає розподіл злитого поліпептиду в ліпідну фазу, що містить масляні тіла. Масляні тіла далі легко відокремити від іншого клітинного матеріалу. Поліпептид, що викликає інтерес, виділяють, обробляючи злитий протеїн протеазой, яка здатна розпізнавати протеолітичний сайт розпізнавання протеїну масляного тіла, найближчий до N-кінця поліпептиду, що представляє інтерес. Запропоновано також хімерна ДНК, експресуюча касета і культура рослинних кліток для здійснення зазначеного способу, а також спосіб виготовлення їжі на основі модифікованого насіння рослин.
Description
Опис винаходу
Настоящее изобретение относится к рекомбинантному способу получения представляющих интерес 2 протейнов, которьіє легко вьіделять из компонентов клеток хозяєв. Способ иллюстрируєтся зкспрессией представляющего интерес протеийна в растениях, особенно в семенах, в форме химерного пептида, содержащего протеин масляного тела и представляющий интерес протеин.
В растениях бьіли зкспрессировань!ї различнье протейинь!. Однако, хотя и била продемонстрирована общая доступность осуществления зкспрессии чужеродньїх протеинов в растениях, получение очищенньїх протеийнов 70 из таких источников имеет некоторне ограничения. Зти ограничения включают стадию очистки, необходимую для получения чистого протеина, практически не содержащего растительньхх материалов и продуктов разложения, которье могут образовьваться в зкстрактах, полученньїх в процессе очистки, когда полученнье рекомбинантнье протейиньї контактируют с водньіми буферами.
Растения, имеющие масличнье семена, такие как соя, рапс, подсолнечник и ряд других видов растений, 72 таких как кукуруза, морковь и т. д., хранят в своих семенах триглицеридь. В растениях зти триглицеридь вьіполняют роль источника знергии для прорастания семян и последующего роста сеянца. Триглицеридь! широко используют в качестве растительньїх масел в пище и пищевьїх продуктах, а также в некоторьїх областях промьішленности.
Триглицеридьі не смешиваются с водой и вьіделяются за счет флотации на поверхности водньїх растворов или образуют небольшие глобуль! или липосомь! в виде суспензии в водной фазе. Такие глобуль! естественно сливаются, если они не стабилизированьї модифицированньм поверхностньм слоем. Такое слияние может привести к образованию суспензии из глобул случайного размера. В семенах же при сохранений триглицеридов маслянье глобульь на деле представляют собой капсулированнье липиднье или маслянье тела обьічно одинакового размера. С поверхностью зтих масляньїх тел ассоциировань! полуфрагменть (паїї пі) мембран, с 22 усьпаннье несколькими протеинами, которне обьчно назьівают протеинами масляного тела. Го)
По крайней мере, один класс протеийнов масляного тела имеет несколько характеристик, которье существенно консервативньі от вида к виду. Зтот класс протейинов масляного тела назьівают "олеозинами".
Гидрофильнье М- и С- концьі зтих протеинов, по-видимому, совершенно различньі, тогда как липофильнье внутренние участки (центральное ядро), по-видимому, строго консервативнь! для, различньїх видов. Олеозинь о прочно связаньї с масляньми телами, зта прочная связь с масляньмми телами может бьїть, в основном, связана с с липофильньїм характером зтих центральньїх ядер. Позтому представляет интерес определение возможности использования таких протейинов масляного тела, как олеозинь, для создания средств для вьіделения о рекомбинантньїх протеинов из растительньїх материалов. Ге)
Продуцирование чужеродньх (рекомбинантньїх) пептидов в растениях бьіло исследовано с использованием различньх подходов, включая транскрипционнье слияния с применениєм сильного конститутивного М растительного промотора (например, из вируса мозайки цветной капусть! - Зіетепз еї а!. (1990) ВІО/Гесппоіоаду, 8: 217 - 221) и кодирование чужеродного протеина; транскрипционнье слияния с органоспецифическими последовательностями (КаайкКе еї аї. (1988) Тпеогеї, Аррі. Сепеї., 75: 685 - 694); и трансляционнье слияния, « которье требуют последующего отщепления рекомбинантного протеийна (Мапдег Кегпгкоме еї аї, (1989) З 50 Віо/ТесппоіІоду, 7: 929 - 932). Чужероднье протеиньі, которьіе бьіли зкспрессировань! в растительньх клетках, с включают активнье протеиньі из бактерий (Ргаїеу еї аІ. (1983) Ргос. Магі. Асад. Зсі. ОБА, 80: 4803 - 4807),
Із» животньїх (Міага апа Седати (1989) Треог. Аррі. Сепеї.,, 78: 161 - 168), грибков и других видов растений (Ргаїеу еї а!. (1983) Ргос. Маг. Асад. Зсі. ОБА, 80: 4803 - 4807).
Некоторье протеиньї, обьічно маркерь! интеграции, бьіли зкспрессированьі ткане-спепдфическим образом, причем некоторье бьіли зкспрессировань! в семенах (Зеп (зиріа еї аЇ. (1985) Ргос. Маг!. Асад. ЗсіІ. ОА, 82: шк 3320 - 3324); Кайке еї аї. (1988) Тпеог. Аррі. Сепеї.,, 75: 685 - 694). Зти сообщения концентрируются
Ге»! специфически на использований промоторов протеийнов хранения семян как средства обеспечения специфической для семян зкспрессии. Используя зти системьї, Мапаегкегкоме еї аї. (1989) Віо/Тесппо)., 7: 929 - б 932, зкспрессировал очень ценньій пептид (Іеи-знкефалин) В семенах Агарідорзів ІпаПапа апа Вгазвзіса парив. о 20 Вьход зтих пептидов чрезвьчайно низок, но он демонстрируєт возможность зкспрессии пептидного гормона животного в ткани растения. Олеозин кукурузь! бьіл зкспрессирован в масляньїх телах семян Вгазвіса парив, с трансформированньїх геном олеозина кукурузьі. Зтот ген бьіл зкспрессирован под контролем регуляторних злементов из гена Вгаззіса, кодирующего налин (паріп), основной протеин хранения семян. Как сообщается, временная регуляция и ткане-специфичность зкспрессии правильньї для промотора/терминатора гена напина. 22 СМ. І ее еї аі.,, Ргос. Маї!. Асад. бсі. ОА, (1991) 88: 6181 - 6185. Маслянье глобульі, которне образуются в
ГФ) семенах, по-видимому, все одинакового размера, что указьівает на их стабилизацию (Ниапа А. Н. С. (1985) в
Модегп Меїйз». Ріапі Апаїузів М.1: 145 - 151 Зргіпдег-Мегіад, Вепіп). При более тщательном исследований бьіло о обнаружно, что они представляют собой не просто маслянье глобульі, а скорее маслянье тела, окруженнье мембраной. Такие масляньсе тела назьівали по разному злектроннье микроскописть!: олеосомьї, липиднье тела би сферосомь! (Сийг МІ (1980) в Тпе Віоспетівігу ої Ріапів, 4: 205 - 248, Асад. Ргезв, Огпіапдо, Ріа). Бьіли исследованьі маслянье тела нескольких видов, и пришли к вьіводу, что они заключень! в необьічнье "полу-фрагментарнье" мембраньї, которне представляют собой не классический липидньій би-слой, а скорее один амфофильньй слой с гидрофобньми группами с внутренней стороньії и. гидрофильньми группами с внешней (Ниапа А. Н. С. (1985) в Модегп Меїйз». Ріапі Апаїузів, мої. 1: 145 - 151 Зргіпдег-Мепгіад, Вепіп). бо Анализ содержания липидньїх тел продемонстрировал, что помимо триглицеридов и материала мембран они содержат также несколько полипептидов/протеинов, связанньїх с поверхностью или полостью масляного тела (Вомтап-Мапсе апа Ниапд (1987), 9. ВіоЇї. Спега. 262: 11275 - 11279, Мигрпу еї аї. (1989) ВіІоспет. ., 258: 285 - 293, Тауог еї аї. (1990) Ріапіа, 181: 18 - 26). Протеинь! масляньїх тел біли идентифицировань! для
Широкого круга таксономически различньїх видов (Могеаи еї аї, (1980) Ріапі Рпузіої!., 65: 1176 - 1180; би еї аІ, (1986) ВіІоспет. у)., 235: 57 - 65), и бьіло показало, что они расположеньі только в масляньїх телах, но не бьіли обнаруженьі в органеллах растительньїх тканей. В Вгазвіса париз (семена рапса) имеются, по крайней мере, три полипептида, связаннье с масляньми телами в развивающихся семенах (Тауїог еї аї. (1990), Ріапіа, 181: 18 - 26). Количество и размерь! протеинов, связанньїх с масляньіми телами, могут меняться от вида к виду. 7/0 Так например, в кукурузе существуют два имунологически различньїх класса полипептидов, обнаруженньйхх в масляньх телах (Вомтап-Мапсе апа Ниапа (1988) 9). ВіІоїЇ. Спегп. 263: 1476 - 1481).
Бьіло показано, что олеозиньії содержат участки чередующейся гидрофобности и гидрофильноети (Вомтап-Мапсе апа Ниапд (1987) У, ВіоЇї. Спет., 262: 11275 - 11279). Аминокислотнье последовательности олеозинов из кукурузьї, семян рапса и моркови бьіли полученьі. См. Си апа Ниапао (1990) 9. ВіІоЇ. Спет., 265: 2238 - 2243, Наїгорои оз еї а! (1990) Ріапі СеїІ., 2: 457 - 467, соответственно. В таких семенах масличньх как рапс, олеозин может составлять от 890 (ТауїЇог еї аїЇ. (1990) Ріапіа, 181: 19 - 26) до 2095 (МигрНу еї аї. (1989) Віоспет, У, 258: 285 - 293) от полного содержания протеина в семенах. Столь вьісокое содержание сопоставимо с тем, что бьіло обнаружено для многих протеинов хранения семян.
Сообщалось, что получень! геньії, кюддирующие протейнь! масляньїх тел, для двух видов: кукуруза (7еа таув, Вожтап-Мапсе апа Ниапо (1987) У, Вісі. Спет., 262: 11275 - 11279; и Си апа Ниапо (1990), У. Вісі. Спет, 265: 2238 - 2243) и морковь (Наїгороціоз еї аї. (1990) Ріапі Сеї.., 2: 457 - 467).
Предложень способьї и композиции для осуществления зтих способов получения пептидов, которье можно легко вьіделить из протеинов хозяев. Зтот способ включает стадиий получения химерной конструкции ДНК, которая включаєт последовательность, кодирующую специфическую последовательность масляного тела, сч ов содержащую кодирующую последовательность гена протеина масляного тела, специфического для семян, или последовательность, кодирующую, по крайней мере, участок гидрофобного ядра протеина масляного тела, и і) последовательность, кодирующую нужньй пептид, из которьїх можно получить кассету зкспрессии, содержащую химерную конструкцию ДНК; трансформация клеток хозяина кассетой зкспрессии в условиях геномной интеграции; и вьуращивания полученного трансгенного растения до получения семян, в которьїх нужньй Ге!
З0р полипептид зкспрессирован как протеин слияния с олеозином.
Представляющий интерес полипептид можно очистить, вьіделяя маслянье тела из клеток семян, разрушая со маслянье тела, так что при зтом вьісвобождается протеин слияния. Затем протеинь! масляного тела легко Ге отделяются от других протеинов и полученньїх из растений материалов за счет разделения фаз. При желаний сайт расщепления может бьть расположен, по крайней мере, перед М-концом или после С-конца ісе) зв представляющего интерес полипептида, что обеспечит возможность отщеплять полипептид слияния и «Е вьіделять его за счет фазового разделения на составляющие его пептидьі. Таким образом, создана система, обеспечивающая целенаправленньй перенос химерного пептида за счет функциональности протеина его масляного тела к масляньіїм телам, что, в свою очередь, позволяет бьістро очистить представляющий интерес полипептид. Зта система получения находит применение при получений многих пептидов, например, таких « пептидов, которне обладают нужньмми фармацевтическими, знзиматическими, реологическими и адгезивньми 7-3) с характеристиками.
В соответствии с настоящим изобретением предложен полипептид слияния, отличающийся тем, что может ;» бьіть обеспечена его доставка к масляному телу, содержащий: а) первьій пептид формуль!: вад?. ва?б. у - М ЕЕ - ь я за. в - вк а т т» аг?7- б - 6 - заз. в ь - ва??- ь - ва? (22) М
ФО б - І - ва?! - ь- аа??- ва? - т - Ь- 1 - в'ь : ли о» ШІ яа?і. і; - ваЗ3-. у - в - те в-ва?! - Ь -
У У со п.в-в-в-х- вм вР-А-А- Ва - т 1 у ї ва!7- ва!?- за!б- ва!!- ва!д. с КЕ-Ь- ь 7 8.8 веб? бу - ввв?. вабО. 1. 5 -
Ф) т І ї т з а893 вабе. 5 - ва?5. ва??7. ва?б. ва??. ва90. да7б! т при условийи, что указанньій первьій пептид отлетается от полноразмерного природного 16КЬ олеозина из бо моркови, или 16КЬ или 16КЬ олеозина из кукурузьї, и где аа?» представляет любую аминокислоту; аа?25 представляет нейтральную алифатическую аминокислоту; 65 аа?! представляет нейтральную незамещенную алифатическую аминокислоту, состоящую из З - б атомов углерода;
ааЗ3 представляет нейтральную незамещенную алифатическую аминокислоту, содержащую З - 6 атомов углерода; аа представляет нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту, содержащую З - 5 атомов углерода; ааЗ! представляет нейтральную незамещенную аминокислоту; аа? представляєт нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту; аа"! представляєт нейтральную алифатическую незамещенную или оксизамещенную аминокислоту; аа"? представляєт нейтральную алифатическую незамещенную или оксизамещенную аминокислоту; то аа? представляет нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту или оксизамещенную аминокислоту; аа"! представляет нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту; аа?9 представляет нейтральную алифатическую или ароматическую незамещенную аминокислоту; аа!9 представляєт нейтральную алифатическую незамещенную или тиозамещенную -аминокислоту; аа!"8 представляєт нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту; аа83 представляет нейтральную алифатическую незамещенную или оксизамещенную аминокислоту; аа?92 представляет нейтральную алифатическую аминокислоту с оксизамещением; аа?б5 представляет нейтральную алифатическую тиозамещенную аминокислоту или нейтральную ароматическую гетероциклическую аминокислоту; аа?" представляєт нейтральную алифатическую незамещенную или тиозамещенную аминокислоту; аа?8 представляєт нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту или ароматическую оксизамещенную аминокислоту; с аа?99 представляет любую аминокислоту; аа!90 представляет оксизамещенную аминокислоту, либо алифатическую, либо ароматическую; о аа!91 представляет нейтральную незамещенную алифатическую или ароматическую аминокислоту; слитьй с
Б) вторьім пептидом, при условийи, что зтот второй пептид отличается от части природного олеозинового /-Ф) протеина из Агарідорзів или Вгазвіса. со
В настоящем изобретений предложен также полипептид слияния, характеризуемьй как способньй осуществлять целенаправленньй перенос к масляному телу, содержащий: (Се) а) первьій пептид, вьібранньй из группьї, состоящей из: с (1) пептида, содержащего, по крайней мере, восемь последовательньх аминокислот, включенньїх в следующую аминокислотную последовательность: «
Мм-м-с-в-0-к-В-0-У-0-м-85-60-8-с-8-п0-у-8-Кк- 5-Н-О-Т-А-К-КАА-Т-А-У тд 5 ут « 5Б-5-0-Т-0-У-0- УХА ТАРА У тАВ- ,-у- 1-К-5-Р-Х--У-рР-АСТ-т-Т-У- 8-1. т-п-в- 8 с 0-5З-5-0-6-К-С-Т-А-А-І-Т-У-К-5-М-т-у-Кху- хз» Аст-с-в-н-в-0-с-8-0-К-р-0-8-8-8-М-К-І-с-
З-КУА-0-0-Ц-К-В-В-8-0-У-У-0-0-0-8-т-с-с6-
Б-Н-0-В-0-В-Т-В-6-0-0-Н-Т-Т; ве (2) пептид, которьій кодируется ДНК последовательностью, идентифицированной с о помощью б олигонуклеотидного зонда, сконструированного на основе указанной аминокислотной последовательности (1), или ее фрагмента, при условии, что указанньїй первьій пептид отличается от полноразмерного природного 16КБ б олеозина из моркови или 18КБ или 16КЬ олеозина из кукурузь, слитьй с о 250 Б) вторьім пептидом, при условии, что указанньій второй пептид отличается от части природного олеозинового протеина из Агарідорзіз ИЛИ Вгазвзіса, со Далее в настоящем изобретений предложена химерная ДНК конструкция, содержащая: а) первую ДНК последовательность, кодирующую олеозин или его часть, достаточную для обеспечения целенаправленного переноса к масляному телу, и 25 Б) вторую ДБК последовательность, кодирующую пептид, при условийи, что указанньій пептид отличается от
ГФ) части природного олеозинового протеина из Агарідорзіз ИЛИ Вгазвіса. юю Далее в настоящем изобретенийи предложена кассета зкспрессии, содержащая: в качестве компонентов в направлений транскрипции: регуляторную ДНК последовательность, содержащую достаточную часть участка 5 до сайта начала 60 трансляции гена, зкспрессируемого в семенах, для обеспечения зкспрессии ДНК последовательности в семенах; химерную ДНК последовательность, содержащую а) первую ДНК последовательность, кодирующую олеозин, или достаточную ее часть для обеспечения целенаправленного переноса к масляному телу, причем указанная ДЖ последовательность включает, по бо крайней мере, один рестрикционньй сайт, и
Б) вторую ДНК последовательность, кодирующую пептид, при условийи, что указанньйй пептид отличается от природного олеозинового протейина из Агарідорзів или Вгазвіса; и участок окончания трансляции и транскрипции; где указанньіе компоненть! операбельно связаньі, а зкспрессия указанной химерной последовательности
ДНК регулируется указанной регуляторной ДНК последовательностью.
В настоящем изобретений предложена также кассета зкспрессии, содержащая: ген протеина масляного тела (ої! роду ргоїеІп - ОВР), которьій включает достаточную часть участка 5 до сайта начала трансляции для обеспечения зкспрессии указанного гена в клетки семян, и которьій включает, по 7/0 крайней мере, один рестрикционньй сайт между 5-концом кодона инициации метионина, и 5'-сигналом окончания трансляции указанного ОВР гена, и
ДНК последовательность, встроенную в указанньій рестрикционньій сайт в рамке считьівания с указанньім
ОВР геном, где указанная ДНК последовательность кодирует пептид, которьій отличается от части нативного олеозинового протеина из Агарідора!5 или Вгазвіса.
В настоящем изобретений предложена также кассета зкспрессии, содержащая: первую ДНК последовательность, кодирующую пептид, при условии, что указанньій пептид отличается от части природного олеозинового протеина из Агарідорзіз или Вгазвіса, встроенную в рамке считьївания в ген протеина масляного тела, которая включает достаточную часть регуляторного участка 5 до сайта начала трансляции указанного ОВР гена для обеспечения зкспрессии указанного гена в семенах, где указанная 2о последовательность встроена по такому сайту указанного гена, чтобь! бьіть зкспрессированной под контролем указанного регуляторного участка.
В настоящем изобретении предложен способ достижения зкспрессии целевого пептида в семенах, причем указанньй способ включаєт трансформацию клеток растения - хозяина зкспрессионной кассетой в условиях геномной интеграции, где указанная кассета зкспрессии содержит в качестве компонентов, в направлений с г транскрипции, первую ДНК последовательность, содержащую достаточную часть участка 5 до сайта начала трансляции гена, зкспрессируемого в семенах, для обеспечения зкспрессии ДНК последовательности в і) семенах, вторую ДНК последовательностью, кодирующую олеозин или достаточную его часть, для обеспечения нацеленного переноса к масляному телу, причем указанная вторая ДНК последовательность включает, по крайней мере, один природньй или синтетический рестрикционньй сайт, в которьій встроена в рамке ду Считьвания третья ДНК последовательность, кодирующая целевой пептид, при условии, что указанньй пептид отличаєтся от части природного олеозинового протеина из Агарідорзіз или Вгазвіса; и участок окончания со трансляции и транскрипции; где указаннье компоненть! операбельно связаньі, и зкспрессия указанной второй «о
ДНК последовательности регулируется указанной первой ДНК последовательностью, для обеспечения зкспрессии в семенах. ісе)
В настоящем изобретении предложен способ получения очищенного целевого пептида, причем указанньй «г способ включает: трансформацию клеток растения хозяина ДНК конструкцией в условиях геномной интеграции, где указанная
ДНК конструкция содержит первую ДНК последовательность, коюдирующую целевой пептид, при условийи, что указанньій пептид отличаєтся от части природного олеозинового протеина из Агарідорзіз или Вгаззіса, « Встроенную в считьвающую рамку гена протеина масляного тела, которая содержит достаточную часть в с регуляторного участка 5 до сайта начала трансляции указанного ОВР гена для обеспечения зкспрессий указанного гена в семенах, причем указанная последовательность встроена по такому сайту указанного гена, ;» что зкспрессия указанной ДНК последовательности контролируется, указанньім регуляторним участком, за счет чего указанная ДЖ конструкция интегрируется в геном указанньх клеток растения; вьращивание указанного растения до получения семян, в которьіїх целевой пептид зкспрессирован как ї5» протейин слияния с продуктом зкспрессии указанного ОВР гена; вьіделение масляньх тел из клеток указанньїхх семян;
Ме. разрушение указанньїх масляньх тел, в результате чего вьіделяется указанньйй протеин слияния; и б очистку указанного целевого пептида.
Краткое описание чертежей со Фиг1А представляет нуклеотидную последовательность и вьіведенную /аминокислотную
Ге) последовательность (17/кКДа протеин) гена протеина масляного тела (олеозина) из Агарідорзів (ПаїЇПапа.
Подчеркнутьї прямье повторьі (К 4 и Ко) и инвертньій повтор (т), САСА, ТАТА, ТААТ и сигналь полиаденилирования. 5Б Интронная последовательность напечатана мелким шрифтом, а предполагаемьй АВА-связьивающий сайт указан жирньмм шрифтом.
Ф) На фиг.18 представлено сравнение последовательностей протеина 16КЬ масляного тела из моркови и 18К5 ка и 16КЬ протеийнов масляного тела из кукурузьі и 17/КЬ протеина масляного тела из Агарідора!5 ІпаІапа, где показаньї сохраняющиеся (консервативнье) и различающиеся участки зтих протеийнов; аминокислотнье бор последовательности вьіровнень, чтобь! показать консервативность последовательности в центральном участке протеинов.
На фиг.2 представленьі конструкциий, использованнье для слияния генов протеийинов масляного тела с генами, кодирующими чужероднье пептидь. ІА представляет С-терминальное слияние целевого пептида с
ОВР; ІВ представляет М-терминальное слияние целевого пептида с ОВР; ІЇ представляет внутреннее слияние 65 Челевого пептида с ОВР; и ІП представляет меж-димерное трансляционноє слияние целевого пептида, заключенного между двумя практически полньіми последовательностями протеина масляного тела,
обеспечивающими его направленную доставку. В верхней части фиг(А) представлена ДНК конструкция, использованная для трансляционного слияния целевьїх пептидов с протеинами масляного тела. В нижней части фиг.(В) представленьї конфигурации генньїх продуктов, показанньїх на верхнем участке трансляции и доставки к масляньм телам. Ключ к фиг. следующий: заштрихованньій снизу слева вверх направо прямоугольник представляет ОВР промотор.или другой специфический для семян промотор; заштрихованньій снизу справа вверх налево прямоугольник представляет последовательность, кодирующую целевой пептид; не заштрихованньй прямоугольник представляет последовательность, кодирующую протейн масляного тела или синтетическую последовательность, 7/0 обеспечивающую направленную доставку, основанную на ОВР консервативньх фрагментах; заштрихованньсе в клеточку прямоугольники представляют терлинатор гена, содержащий сигнал полиаденилирования; заштрихованньій кружок представляет фрагмент распознавания протеазьі; спиральная линия представляет нативньй С- или Е -конец ОВР.
Фиг.3 представляет подробную структуру конструкций С-терминального слияния. Изображена структура /5 последовательности, кодирующей участок распознавания коллагеназь,, в качестве линкера при слияний типичного гена протеина масляного тела и пептида слияния, которьій нужно связать, используя Їїїсої, для клонирова-ния и зкспрессии в растениях.
На фиг.4 схематически представлен процесс конструирования векторов пептида слияния, их введение в растения и последующую зкстракцию и анализ целевого рекомбинантного пептида.
На фиг.5 схематически представлено конструирование рСоСОВРІЇТ. Прямоугольник с пунктиром представляет олеозиновьій промотор; прямоугольник, заштрихованньій сверху слева-вправо вниз представляет олеозиновую кодирующую последовательность; заштрихованньій в клеточку прямоугольник представляет интрон; прямоугольник со штрихами представляет 3'-нетранслируемую последовательность;, прямоугольник с редко расположенньми полосами сверху слева - вправо вниз, представляет последовательность с г Мнтерлейкина-І-д, снабженную последовательностью, кодирующей сайт расщепления протеазь! (Фактор Ха или тромбин, расположенньїй непосредственно в обратном направлений). о
На фиг.б представлена конструкция олигонуклеотида СУК. На фиг.ЗА представлена 3 кодирующая последовательность А. ІпаІапа оіеозіп, трансляционно слитая с кодирующей последовательностью фактора
Халі-1-д, после которой следует ТАА стоп-кодон. Для целей дальнейшего кодирования включают Руці и заїЇ Ге») рестрикционнье сайть. Создание Руші рестрикционного сайта приводит к дополнительной кодирующей последовательности для аланина (аа). Подчеркнутьі последовательности распознавания рестрикционного со знзима. Друг над другом расположеньй последовательности олеозина А. (йайапа и последовательность «о распознавания фактора Ха. Действительньїй сайт расщепления обозначен звездочкой. На фиг.3В представлена последовательность СЗМКІЇ для осуществления слияния с А. ІпаІйапа олеозином, праймер СМНІЇ должен бьть ее,
Комплементарен последовательности верхней нити. «І
На фиг.7 представлена нуклеотидная последовательность ОВРІЇТ. Подчеркнута последовательность, кодирующая 1/-1- Д; последовательность, кодирующая сайт распознавания фактора Ха, указана жирньм шрифтом. Терминаторная последовательность нопалин-синтетазьі указана мелкими буквами. «
Описание, предпочтительного варианта
В соответствий с целью изобретения предложень! способь! и композиции для получения пептидов, которье щей с легко поддаются очистке. Целевой способ включает стадии получения зкспрессионной кассетьі, содержащей ц ДНК последовательность, кодирующую достаточную часть специфической последовательности масляного тела, "» например, олеозина, для обеспечения направленного транспорта к масляному телу, и представляющий интерес пептид;.. трансформации зкспрессионной кассетой клеток растения хозяина; создания трансгенного растения и
Вніращивание его для получения семян, в которьїх химерньйй протеин зкспрессирован и перемещен к масляньм ї телам. Химерньй пептид включает целевой пептид и такой протеин масляного тела, как олеозин. Целевой б» пептид обьічно является чужеродньм пептидом, которьій обьчно не зкспрессируется в семенах или не находится на масляньїх телах. Использование протеина масляного тела в качестве носителя или в качестве
Ге) средства для направленной доставки обеспечивает простой механизм очистки чужеродного протеийна. со 50 Химерньй протейн вьделяют из массьй клеточньїх протейнов в одну стадию (например, за счет центрифугирования или флотации); зтот протеин также защищен от разложения в процессах зкстракции, так как іЧе) при разделении удаляются неспецифические протеазьі из конетакта с масляньми телами. Ген, кодирующий чужеродньй пептид, может бьть получен из любого источника, включая растительнье, бактериальньє, грибковне или животньсе источники.
Желательно, чтобьі химерньій пептид содержал последовательности, которне позволяли бьії отщеплять целевой пептид от олеозина. Такой метод можно использовать для зкспрессии различньїх пептидов, которье о затем легко поддаются очистке. ко Обеспечение направленной доставки чужеродного рекомбинантно-го протеина к масляному телу обеспечиваєт несколько преимуществ, включая следующие. Протейн можно вьіделить из клеточной массь бо после лизиса, клеток за счет центрифугирования. Частицьі масляньх тел будут плавать на поверхности зкстракта. Протеин можно необязательно снабдить пептидньім линкером, содержащим сайт распознавания протеазьі. Зто позволяет отделить пептид от масляного тела. Протеин можно ввести в рекомбинантньй полипептид таким образом, чтобьі он бьіл внутри липофильного консервативного участка... Зто приводит к интернализации рекомбинантного пептида в маслянсе тело, таким образом защищая его от атаки протеазь.. 65 Зкспрессионная кассета обьічно будет включать в 5' - 3 направлений транскрипции, транскрипционньй и трансляционньій регуляторний участок, обеспечивающие возможность зкспрессии в развивающихся семенах,
служат типичньім примером которьїх промотор, и расположеннье в обратном направлений участки, связаннье с протеином масляного тела, что обеспечит зкспрессию химерного протеина в семенах. ДНК последовательность, кодирующую химерньій пептид, содержащий аминокислотную последовательность для обеспечения направленной доставки к масляному телу и целевой протеин, транскрипционньій и трансляционньй терминальнье участки функциональньсе в растениях. Может также присутствовать один или более из интронов.
Специфическая последовательность масляного тела встречает аналогию во фрагментах протеинов масляного тела, в частности, олеозинов. Специфическая последовательность масляного тела может бьїіть той же, что и последовательность, получаемая из протеина масляного тела, и они имеют, достаточную гомологию, 7/0 чтобь), обеспечить направленную доставку целевого протейина к масляному, телу. Под "получаемой" подразумевают аминокислотную последовательность, которая может бьть природной, синтетической или комбинированной, достаточно близкой к аминокислотной последовательности протеина нативного масляного тела, для достижения нужного обеспечения направленной доставки. Особьй интерес представляют центральньй гидрофобньй домен протеийнов масляного тела, которьій, по-видимому, в вьісшей степени /5 Консервативен среди различньїх видов растений, и его фрагментов и гомологичньїх последовательностей на аминокислотном уровне.
Вьіведенная последовательность аминокислот для Агарідорзів (пайапа протеина масляного тела следующая: го М-н-6--0-8-0-0-у-0-К-5-6-8-6-5-0-У-5-К- 40 5-8-0-І1-А-К-А-А-Т-А-У-ТА-СеСя5- 0 -Х-Ь- 50 БО 5-5-0-7-0-У-0-Т-Х-Ї-А-Б-Т-М-А-Т-Р---М- с » то во (о) т-Е-85-Р-1-0-У-8Р-А-І-І1-тТ-М-А-Ь-Ь-1-т-4-Е- 90 100 1 -5-5-0-б-г-С-І-А-А-І-Т-У-Е-5-8-І-Х-К- (22) 30 110 120 со а -1.-6-Е-Н-Р-)-0-5-0-К-Б-0-5-А-8-М-К-0-с- 130 140 (Се) 5-к-А-0-0-П-К-0-8-А-0О-У-У-с-9-0-н-т-6-6- ісе) 150 «Її
Е-Н-0-К-0-8-7-8-60-60-0-Н-Т-Т
Аминокислоть от около 25 до 101 содержат центральньйй гидрофобньй домен.
Особьй интерес представляют в качестве средств, обеспечивающих направленную доставку для некоторьсх « применениий, специфические последовательности масляного тела или их фрагментьї следующей формульі, которне обеспечивают направленную доставку к масляному телу: - с ов7- за??. вав. У - хУ- т - р- аа3ї. в. ;» А А т аг34- сі с- ва36 . г. Б. за33. т- ва?
М щ» б 9 сова р вав. вай! тов. т. 5 мМ ох
Ф за7і. ї- аа? У- А Ї 59 бе о ТТ Р п-ва -5-
Мк ОБ ж 8 ВАМ А ХА Р. А. А. вд, т І т ва"! ва!5 - за! . ва?! . аа/ї б-р о 5- 8-вааб? . б- У вай ща. в їх) т І тот 60 ва? дай. хх - аа?5 аа? адов ва?9 ва700 - аа101 - рв- где рр! и рр? одинаковь! или различнь, и могут бьіть такими же, или могут отличаться от природного протеина б5 масляного тела, и обьічно отличаются; они могут представлять водорода, что указьівает на терминальную часть указанного полипептида, или они могут бьіть полипептидами, содержащими вплоть до 1000 аминокислот,
обьчно вплоть до около 500 аминокислот, и могут содержать лишь одну аминокислоту, или могут индивидуально или раздельно бьіть полипептидами, содержащими от 1 до 100 аминокислот, обьічно от около 1 до 75 оаминокислот, и.особенно от около 5 до 50 аминокислот; зти полипептидьі могут иметь специфические. применения при модификации специфически описанньїх последовательностей для заранее определенньїх целей; аа?? может бьїть любой аминокислотой, в частности, нейтральной алифатической аминокислотой, обьічно содержащей от З до б атомов углерода, более конкретно, лейцином или аланином; аа269 представляет нейтральную алифатическую аминокислоту, особенно аланин или гидроксизамещенную 70 аминокислоту, содержащую от З до 4 атомов углерода, в частности, треонин, или основную аминокислоту, содержащую от 5 до 6 атомов углерода, в частности, лизин; аа?! представляєт нейтральную незамещенную алифатическую аминокислоту, содержащую от З до 6 атомов углерода, в частности, аланин, валин или лейцин, или ароматическую незамещенную аминокислоту, особенно фенилаланин; ааЗ3 представляєт нейтральную незамещенную алифатическую аминокислоту, содержащую от З до 6 атомов углерода, особенно аланин, валин или лейцин, или оксизамещенную алифатическую аминокислоту, особенно треонин; ааЗб представляєт нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту, содержащую от З до 5 атомов углерода, особенно лейцин, или нейтральную алифатическую оксизамещенную аминокислоту, содержащую от З до 4 атомов углерода, особенно треонин или серин; аа?! представляєт нейтральную незамещенную аминокислоту, особенно лейцин или тиозамещенную аминокислоту, особенно метионин; аа? представляєт нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту, особенно валин, или сч ов Ввроматическую незамещенную. аминокислоту, особенно фенилаланин; аа?! представляєт нейтральную алифатическую незамещенную или оксизамещенную аминокислоту, о особенно, аланин, лейцин или серии; аа?! представляєт нейтральную алифатическую незамещенную или оксизамещенную аминокислоту, в частности, аланин, изолейцин или треонин; Ге»! аа?б представляет нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту или оксизамещенную аминокислоту, особенно аланин, валин или треонин; со аа?! представляєт нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту, особенно глицин или аланш; (Се) аа"? представляєт нейтральную алифатическую или ароматическую незамещенную аминокислоту, особенно «о лейцин или фенилаланин; 3о аа/"б9 представляет нейтральную алифатическую незамещенную или тиозамещенную аминокислоту, З особенно аланин, лейцин или метионин; аа/"8 представляєт нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту, особенно аланин, или нейтральную алифатическую аминокислоту, содержащую тио- или окси-замещения, особенно метионин или « дю третонин; Й -о аа представляет нейтральную алифатическую незамещенную или оксизамещенную аминокислоту, с особенно глицин, серии или треонин; з аа?2 представляєт нейтральную алифатическую аминокислоту с окси-замещением, особенно серии или треонин; аа?б5 представляєт нейтральную алифатическую тиозамещенную аминокислоту или нейтральную «» ароматическую гетероциклическую аминокислоту, особенно триптофан; б» аа?! представляєт нейтральную алифатическую незамещенную или тио-замещенную аминокислоту, особенно валин, лейцин, изолей-цин или метионин; (о) аа?8 представляєт нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту или ароматическую о 50 океи-замещенную аминокислоту, особенно аланин, лейцин или тирозин; аа? может представлять любую аминокислоту; с аа!"90 представляет окси-замещенную аминокислоту, либо алифатическую, либо ароматическую, особенно тирозин или треонин; аа"91! представляєт нейтральную незамещенную алифатическую или ароматическую аминокислоту, особенно аланин, лейцин или фенилаланин.
ГФ) Особьй интерес в качестве источника ДНК, кодирующей последовательности, способнье обеспечить 7 направленную доставку к протеину масляного тела, представляют геньі протейнов масляньїх тел, получаемье из Агарідорзів или Вгаззіса парив, которне обеспечивают зкспрессию целевого протеина в семенах (См. Тауог еї аї., (1990), Ріапіа 181: 18 - 26). Нужнье участки и аминокислотнье последовательности, необходимье для бо обеспечения способности направленной доставки к маслянь/м телам, должнь! бьіть, невидимому, существенно гидрофобньїм центральньїм участком протеийнов масляного тела.
Для идентификации других генов протеинов масляного тела, обладающих нужньми характеристиками, где протеин масляного тела уже бьл вьіделен, зтот протеин можно частично секвенировать, с тем, чтобь! можно бьіло сконструировать зонд для идентификации мРНК. Такой зонд особенно ценен, если он сконструирован бо таким образом, чтобьі нацелить его к кодирующему району центрального гидрофобного домена, которьй в вьісшей степени консервативен среди различающихся видов растений. Следовательно, ДНК или РНК зонд для зтого участка может бьіть особенно полезен для идентификации кодирующих последовательностей протеинов масляного тела из других видов растений. Для дальнейшего повьішения концентрации мРНК, можно получить
КДНК и зту кКДНК вьічесть с мРНК или кДНК из клеток, продуцирующих немаслянье тела. Оставшуюся кКДНК можно затем использовать для зондирования генома для комплементарньїх последовательностей, используя соответствующе библиотеки, полученнье из растительньїх клеток. Затем можно вьіделить последовательности, которье гибридизуются с кКДНК в жестких условиях. В некоторьїх случаях, как указано ранее, использующих зонд гена протеина масляного тела (консервативньій участок), зонд можно использовать непосредственно для 7/0 Сскринирования геномной библиотеки кКДНК и идентификации последовательностей, которьіе гибридизуются с зондом. Вьіделение можно также осуществить стандартньм иммунологическим скринированием библиотеки зкспрессий кКДНК специфической для семян. Антитела можно легко получить к протеинам масляньх тел, используя способьі! очистки и схемь! получения антител, описаннье Тауйог еї а/!. (Ріапіа, (1990), 181, 18 - 26).
Библиотеку зкспрессии кКДНК скринируют, используя антитела по способу Ниупй еї аї. (1985 ОМА Сіопіпо, Мої.1, /5 а Ргасіїса! Арргоасі, ей. О.М. Сіомег, ІК. Ргевв, рр. 49 - 78). Подтверждение структурь! последовательности облегчаєтся за счет вьісокого консерватизма, существующего в центральном гидрофобном участке (фиг.1). ДНК секвенирование по способу Запдег еї аї. (Ргос. Май. Асад. сі. О5А, (1977) 74: 5463 - 5467) или Махат апа
СіІрегі (1980), Мей. Епгутої, (1980) 65: 497 - 560) можно осуществить на всех предполагаемьх клонах и осуществить поиски гомологов. Гомология последовательностей, кодирующих центральньй гидрофобньй го домен, обьчно составляет » 70956, как на аминокислотном, так и на нуклеотидном уровнях между различающимися видами. Если доступно антитело, подтверждение идентичности последовательности можно осуществить в зкспериментах отбора гибридов и трансляции из препаратов мРНК семян по способу Затьгоок еї а!(Моїіесшіаг Сіопіпо, (1990), 2па Еа., Сода Зргіпу Нагброг Ргезз, рр.8 - 49 до 8 - 51).
КДНК клоньі), полученнье из семян, можно скринировать, используя кКДНК зондьі), полученнье из с Консервативньїх кодирующих участков любого доступного гена протейна масляного тела (например,
Вом/тап-Мапсе апа Ниапд (9. Вісі. Спет., (1987) 262: 11275 - 11279). Отбирают клоньі, которне обладают о степенью гибридизации с ДНК семян, нежели с кКДНК сеянцев. Скринирование повторяют для идентификации конкретной кКДНК, связанной с масляньми телами развивающееся семян, используя прямое скринирование антителами или отбор гибридов и трансляцию. мРНК, комплементарнье специфическим кДНК, отсутствуют в Ге»)
Зо других тканях, подвергавшихся тестированию. Затем кКДНК используют для скринирования геномной библиотеки и отбирают фрагмент, которьій гибридизуется с нужной КДНК. со
Для достижения зкспрессиий химерного гена в семена, участок, регулирующий начало транскрипции и Ге) участок, регулирующий начало трансляции нетранслируемьїх 5' последовательностей, "рибосомо-связьвающие сайть!", ответственнье за связьівание мРНК с рибосомами, и начало трансляции, получаемье из любого гена, ее, предпочтительно зкспрессируемого в семенах, могут бьіть использованьі. Примерь! таких генов включают гень -«ф протеинов хранения семян, например из напина ()озеївзоп еї аї.,). Віої, Спет., (1987) 262: 12196 - 12201;
ЗсойПеїд 5. К. апа Стос М. Г. У, ВіІоЇ. Спет. (1987) 262: 12202 - 12208). Предпочтительно, чтобь!ї участок бьл получен из протеина масляного тела (протейиньі масляньїх тел из Агарідорзів, моркови (Наїгороціоз еї аї., см. ранее) или кукурузь! (Ниапад еї аЇ. 1987 и 1990 см. ранее). Такой участок обьічно содержит, по крайней мере, «
Л00Бр 5 до начала трансляции последовательности, кодирующей структурньй ген, вплоть до 2,5КЬ 5 до того же Пд с начала трансляции. Предпочтительно, чтобьі все транскрипционнье и трансляционнье функциональнье й злементь! участка, контролирующего инициацию, бьіли полученьі или их можно бьло бьі получить из одного и и? того же гена. Под вьіражением "можно получить" подразумевают ДНК последовательность, достаточно сходную с нативномй последовательностью для того, чтобьі обеспечить целевую специфичность, транскрипции. ДНК последовательности, кодирующей химерньй протейн. Она включаєт природнье и синтетические ї» последовательности и может бьіть комбинацией синтетических и природньїх последовательностей.
Уровень транскрипции должен бьть достаточньм для обеспечения такого количества РНК, которое
Фо способно обеспечить получениег модифицированньїх семян. Под термином "модифицированнье семена"
Ге») подразумевают семена, обладающие заметно отличающимся фенотипом от фенотипа семян 5ор нетрансформированного растения того же вида, например, не содержащих рассматриваємой кассеть бо зкспрессии в его геноме. Представляют интерес различнье изменения в фенотипе. Зти изменения включают (Че) избьіточную зкспрессию протеина масляного тела или ОВР-накопление на масляном теле, или полученного химерного протеина в цитоплазме.
Представляющим интерес полипептидом может бьїть любой протеин, и они включают, например, знзим, антикоагулянт, нейропептид, гормон или адгезивньй предшественник. Примерь! протейнов включают интерлейкин-І-В, антикоагулянт Нігидіп, знзим Д-глюкуронидазу или одноцепочечноє антитело, содержащееє і) трансляционное слияние м н или му, цепей иммуноглобулина. ДНК последовательность, кодирующая целевой іме) полипептид, может бьть синтетической или природной, или их комбинацией. В зависимости от характера источника ДНК кодирующей целевой полипептид, может оказаться желательньм синтезировать ДНК бо последовательность с предпочтительньми растительньми колонами. Предпочтительнье растительнье кодо-нь можно определить из кодовое, найболее часто встречающееся в протеинах, зкспрессированньїх в больших количествах в конкретнье видь! растений, представляющих интерес в качестве растений-хозяев.
Используемьїй терлинаторньїй участок должен бьіть преимущественно одним из обьічньїхх, так как во многих случаях терминационнье участки, по-видимому, относительно взаймозаменяемьі. Терминационньій участок б5 монет бьть онативньм с участком о инициирования транскрипции, может бьть онативньм с ДНК последовательностью, кодирующей целевой полипептид, или может бьть получен из другого источника,
Удобнье терлинационньюе участки доступньії из ТІ-плазмид А. (Штеїасіепе, такие как октопин-синтазнье и нопалин-синтазньіе терминационньсе участки.
Лигирование ДНК последовательности, кодирующей обеспечивающую направленную доставку последовательность с геном, кодирующим целевой пептид, может осуществляться различньми способами, включая терминальное слияние, внутреннее слияние и полимерное слияние. Во всех случаях такие слияния осуществляют таким образом, чтобьі не прерьвать считьівающую рамку протеина масляного тела, и с тем, чтобьї избежать каких-либо сигналов прекращения трансляции внутри или вблизи зтих соединений. Различнье типьї терминальньх и внутренних слияний представлень! на фиг.2 наряду с представлением их конфигураций Іп 7/0 УМО.
Во всех описанньїх случаях лигирование гена, кодирующего пептид, предпочтительно должно включать линкер, кодирующий протеазньій мишеневьій фрагмент. Зто позволит осуществить вьіделение пептида после его зкстрагирования в виде протеина слияния. Потенциальнье сайтьї расщепления, которье можно использовать, являются распознающими фрагментами для тромбина (Іеи-маІ-рго-аго-чіу) (ЕціКаума еї аї., 7/5 Віоспетівіу (1972) 11: 4892 - 4899), фактора Ха (рпе-дін-діу-агд-аа) (Мада! еї аї, Ргос. Майї! Асад. зоі.
ЗА, (1985 82: 7252 - 7255) или коллагеназь (рго-Іеи-діу-рго) (ЗспоїІззек апа Сгоазе Сепе (1988) 62: 55 - 64).
За счет соответствующих манипуляций, таких как рестрикция, переваривание (спем/Іпуд баск) или заполнение липких концов для создания тупьїх концов, лигирование линкеров или т.п., комплементарнье конць! фрагментов можно получить соединением и лигированием. При проведений различньїх стадий используют клонирование с 2о тем, чтобьі умножить количество ДНК и обеспечить возможность анализа ДНК для того, чтобь! убедиться,О что операция прошла должньім образом. Доступно множество векторов клонирования, когда вектор клонирования включает функциональную в ЕЕ. сої систему репликации и маркер, которьій обеспечиваєт селекцию трансформированньїх клеток. Иллюстративнье векторь включают рВвкЗ32, руС серии, М'Зтр серии,
РАСУСІ184 и. д. Так, последовательность можно встроить в вектор по соответствующему рестрикционному сч сайту (сайтам), полученную плазмиду использовать для трансформации Е. соїї хозяина, внірастить в Е. сої! в соответствующей питательной среде, собрать клетки, провести лизис и вьіделить плазмиду. Анализ может і) включать анализ последовательности, рестрикционньій анализ, злектрофорез или т. п. После каждой манипуляции ДНК последовательность, которая долина бьть использована в окончательной конструкции, может бьть рестриктирована и соединена со следующей последовательностью, где каждая из час тайньх б зо Конструкций может бьіть клонирована в ту же самую или в отличающуюся плазмидь!.
Для введения ДНК в растительнье клетки хозяина существует множество возможньх методик. Так со например, химернье ДНК конструкций можно вводить в клетки хозяев, полученнье из двудольньїх растений, «о например, табака, и таких масличньїх видов, как Вгазвіса парив, используя стандартнье Адгобрасіегічт векторь, по такой схеме трансформации, как например та, которая описана Моіопеу еї аї!. Ріапі Сеї! Кер., (1989) 8: 238 ісе) зв 242 или Ніпспее еї аї. Віо. Тесппої!., (1988) 6: 915 - 922; или другие методики, известнье специалистам. Так «Е например, использование Т-ДНК для трансформации растительньїх клеток интенсивно исследуется, и подробно описано в ЗРА Мо120516; НоеКета, В "Те Віпагу Ріапі Месіог бувіет ОПзеї-агикКегі| Капіеге В. М.,
АїІріаззегдаат, 1985, Спаріег М, Кпаш, еї аЇ., Сепейс Апаїузіз ої Нові Капде Ехргезвіоп ру Адгобасіегішга, В "МоїІесшаг Сепейсв ої (Ше Васіегіа. Ріапі ІпіегасПоп, Рийіег, А. ей, Зргіпдег-Мепад, МУ, 1983, р.245, апа «
Ап еї аі., ЕМВО 3. (1985), 4: 277 - 284. в с Удобно зксплантать! культивировать с А. (Штегасіепз или А. гпІгодепез для того, чтобьі обеспечить перенос транскрипционной конструкции в растительнье клетки. После трансформации с использованием Аадгобасіегіа, ;» растительнье клетки диспергируют в подходящей селективной среде для отбора, виращивают до образования каллуса, проростки и молодье растения регенерируют из каллуса, вніращивая в среде для образования корней.
Адгобрасіегішга хозяин будет содержать плазмиду, содержащую Міг геньї, необходимье для переноса Т-ДНК в їх растительнье клетки, и может содержать или не содержать Т-ДНК. Для иньекцийи злектропорации (см. далее) обезоруженнье Ті-плазмидь! (не содержащие опухолевьх генов, особенно Т-ДНК участка) можно вводить в
Ме. растительнье клетки. б Мспользование не - Адгопасіегішт методик позволяет использовать описаннье здесь конструкции для осуществления трансформации и зкспрессии в широкий круг однодольньїх и двудольньх растений. Зти со методики оособенно подходят для таких видов, которье не дают результатов в Адгобасіегцт
Ге) трансформационной системе. Другие методики для переноса генов включают биолизис (Запіога, Тгепав Іп
ВіІоїеен. (1988) 6: 299 - 302), злектропорацию (ЕРготга еї а). (1985) Ргос, На. Асад. сі, ОБА 82: 5824 - 5828; КіІдоз апа Ваїез (1986), Ргос. Магі. Асай. 5сі. (0БА) 83, 5602 - 5606 или захват ДНК с помощью РЕО в (Роїгукиз еї а!. (1985), Мої. Сеп. Сепеї, 199: 169 - 177).
В качестве клеток хозяев можно использовать клетки любьїх растений, имеющих семена, причем зти клетки (Ф, получают из таких частей растений, как стебли, листья, корни или семена, или соответствующих виду ка репродуктивньїх структур. Клетки могут бьіть как вьіделенньіми клетками, так и частями растений, например, листовьіми дисками. В специфических применениях, таких как с Вгазвіса париз, клетки хозяева обьічно бо получают из семядольньйх петиолей, как указано Моіопеу еї аї. Ріапі Сеї! Кер, (1989) 8: 238 - 242). В других примерах с использованием коммерческих маслосодержащих семян, используют трансформацию семядолей в соевне зксплантать! (Ніпснее еї а!. ВіоїесппоіІоду, (1988) 6: 915 - 922) и трансформацию стебля хлопка (Штреск еї аї, ВІо-(есппоіоду, (1981) 5: 263 - 266).
После трансформации клетки, например, в виде дисков листьев, виращивают на селективной среде. После б5 Того, как начинают образовьваться ростки, их иссекают и помещают на корнеобразующую среду. После достаточного развития корней растения переносят в почву. Затем предположительно трансформированнье растения тестируют на присутствие маркера. Осуществляют Саузерн-блоттинг на геномной ДНК, используя соответствующий зонд, например, А. (ШаПйапа олеозиновьій ген для доказательства интеграции целевой последовательности в геном клетки хозяина.
Зкспрессионную кассету обьічно соединяют с маркером для селекции в растительньїх клетках. Удобно, чтобьї маркер бьіл устойчивьїм к гербицидам, например, антибиотику, такому, как канамицин, 5418, блеомицин, гигромицин, хлорамфеникол и т. п. Конкретньім используемьм маркером должен бьїть такой, которьій обеспечит селекцию трансформированньх клеток при сравнений сметками, которніе не содержат ДНК, которую вводили.
Пептид слияния в кассете зкспрессии, сконструированной как указано ранее, зкспрессируется, по крайней /о мере, предпочтительно, в развивающихся семенах. Соответственно, трансформированньм растениям, вьращенньм в соответствии с принятьіми способами, дают возможность завязать семена. См. например,
МеСогтіск ей аїЇ. Ріапі Сей Керогіз (1986) 5: 81 - 84. Норзерн-блоттинг можно вести, используя соответствующий генньій зонд с РНК, вьіделенной из ткани, в которой ожидается транскрипцій, например, в змбрионе семени. Затем размерь транскриптов можно сравнить с размерами, предсказанньми для /5 транскриптов протеина слияния.
Можно вьірастить два или более поколений трансгенньїх растений, и либо опьілить их пьІЛЬЦОй от того же трансформированного штамма, либо от других штаммов, контролируя в полученном гибриде нужнье фенотипические характеристики для подтверждения того, что нужнье фенотипические характеристики стабильно сохраняются и наследуются, а затем семена собирают для того, чтобьі! вбіделить представляющий го Мнтерес пептид, или для того, чтобьі получить семена, обладающие новьіми фенотипическими характеристиками.
Целевой протейн можно зкстрагировать из семян, которье могут бьїть гомо- или гетерозиготньіми, для последующих испьітаний, различньми способами, которнше включают использование водньїх, забуференньх зкстракционньїх сред и различнье способь! измельчения (размальівания, раскальввания, пульверизации) для с разрушения клеток семян. Затем продукть! зкстракции можно разделить (например, центрифугированием или за счет седиментации) на три фракции: седимент, или нерастворимьй осадок, водньій супернатакт и плавающую і) пленку, содержащую липид хранения семян и маслянье тела. Зти маслянье тела содержат как нативнье протеиньі масляньїх тел, так и химернье протеинь! масляньїх тел, причем последние содержат чужероднье пептидьі. Масляньсе тела вьіделяют из водорастворимьїх протеийнов и повторно суспендируют в водном буфере. б зо Если в кассету зкспрессии бьіл включен линкер, содержащий фрагмент распознавания протеазь, тогда к повторно суспендированному буферу добавляют протеазу, спедифичную для фрагмента распознавания, со полученного в результате трансляции линкерной последовательности. Зто приводит к вьіделению целевого «о пептида в водную фазу. Теперь в результате второй стадий центрифугирования снова получают плавающую пленку обработанньх масляньх тел с присоединенньми к ним протеийнами, и остается водньій раствор ісе)
Зз5 целевого пептида. Зтот целевой пептид можно осадить, химически модифицировать или лиофилизировать, в «г зависимости от предполагаемого применения.
В некоторьїх случаях применения нет необходимости отделять химерньйй протеин от протеинов масляного тела. Такие применения включают случайи, в которьїх пептид слияния включает знзим, которьій толерантен к М- или С-терминальному слиянию и сохраняет свою активность; такие знзимь! могут бьіть использовань! без « дальнейшего расщепления и очистки. Химерньй знзим-ОВР будет контактировать с субстратом как протеин /-7-З с слияния. Возможно также, при желании, провести очистку знзим-ОВР протеина слияния, используя иммуно-афинную колонку, содержащую иммобилизованнье антитела с вьісоким титром против ОВР (см. ;» например, Тауйог еї аї., (1990 ранее).
Возможно другое применение предмета изобретения. Так как ОВР содержат вьісокий процент протеинов семян, оказьвается возможньм снабдить семена для некоторьїх целей такими ценньіми свойствами, как ї5» вьісокое содержание лизина, метионина и т. д., просто обогащая протеин слияния нужньми аминокислотами.
Зтот способ может найти применение особенно при модификации зерновьїх, которье прямо или косвенно
Ме. используются для корда домашних животньїх, включая скотО, птицу, а также для продуктов питания людей. б Может оказаться возможньім включать как пептид слияния, знзим, которьій облегчит последующую обработку масла или муки в обьічньїх процессах измельчения и зкстракции семян масличньх растений, например, за, счет со включения термостабильного липид-модифицирующего знзима, которьй оостанется активньм и при
Ге повьішенньїх температурах измельчения, которье обьічно наблюдаются в зтом процессе обработки семян, и, тем самьїм, удастся повьісить ценность зкстрагированньїх триглицеридов или протеинов.
Другие применения протейнов слияния включают использование их для повьішения устойчивости в сельскохозяйственньїх растений к неблагоприятньім условиям. Так, например, с протейном масляного тела
Можно соединить инсектицидньій опротеийин или часть иммуноглобулина, специфичного /- для (Ф, сельскохозяйственньїх вредителей, такую как стенки клеток или мембран грибков, тем самьім уменьшая ка опасность нападения на семена конкретньїх вредителей растений. Приводимье далее примерь! представлень лишь в целях иллюстрации и не являются ограничивающими. 60 Зкспериментальная часть
ПРИМЕР 1
Зкспрессия терминальньїх слияния чужеродньїх пептидов с протеинами масляньх тел
А. С-терминальнье слияния
Геномньій клон гена протеина масляного тела, содержащий, по крайней мере 100Бр 5 до начала, 65 трансляции, клонируют в плазмидном векторе, способном к репликации в подходящем бактериальном хозяине (например, рОС или рВКЗ322 в Е. соїї.). Рестрикционньй сайт расположен в участке, коюдирующем гидрофильную
С-терминальную часть гена. В 19коОа ОВР зтот участок простирается обьічно от кодонов 125 до конца клона.
Идеальньй рестрикционньїй сайт является уникальнь!м, но зто не является абсолютно необходимьм. Если в зтом участке нет удобного рестрикционного сайта, его можно ввести за счет сайт-направленного мутагенеза, по
Кипкеї Ргос. Маг, Асад. Зсі. ОБА, (1985) 82: 488 - 492. Единственньім основньім ограничением по встрайванию зтого сайта, является то, что он должен бьіть расположен в направлений 5' от трансляционного стоп сигнала
ОВР клона.
Получив такой мутантний клон, можно получить синтетический олигонуклеотидньій адаптер, которьй содержит кодирующую последовательность для сайта распознавания протеазьї, например; Рго-І еш-СіІу-Рго или 7/0 его мультимер. Зто сайт распознавания для протеазь! коллагеназьі. Адаптер следует синтезировать такті образом, чтобьї обеспечить: 4-основной вьіступ у 5' конца, совместимьй с рестракционньїм сайтом 3' конца ОВР клона, 4-основной вьіступ у 3' конца адаптера для облегчения жирования с последовательностью, кодирующей чужеродньй пептид и дополнительньми основаниями, при необходимости, чтобьі обеспечить отсутствие сдвигов рамки в переходе между ОВР кодирующей последовательностью, сайтом распознавания протеазь и 7/5 последовательностью, кодирующей чужеродньй пептид. Типичная конструкция такого слияния представлена на фиг.3. Представленньй пример использует существующий ХпоІ! сайт вблизи стоп кодона ОВР моркови (Наїгороціоз аї аї. Ріапі СеїІ, (1990) 2: 457 - 467. Его переваривают и он может бьіть лигирован с адаптером, сконструированньім из двух описанньїх олигонуклеотидов. Зтот адаптер образует прекрасньій Хпо! вьіступ на конце и не будет нарушать трансляционной рамки. Другой конец образует Мсої! вьіступ, которьій вьібирают 2о произвольно (подходят любье отрезки из б оснований), ко которьій содержит АТО из целевого чужеродного пептида.
Окончательньй продукт лигирования содержит, самое большее, полньй ОВР ген, последовательность, кодирующую фрагмент распознавания коллагеназь), и участок, кодирующий целевой пептид, причем все в единой считьвающей рамке. Зтот состоящий из трех частей фрагмент клодируют в Адгорасіегішт бинарную сч ов плазмиду (Вемап Мисі. Асіа Кез, (1984) 12: 8711 - 8721), такую как обьічно используют для переноса чужеродной
ДНК в растения (Ргаїеу еї аЇ. Ргос. Маїг!І, Асай. 5сіІ. ОСОБА, (1983) 80: 4803 - 4807), и зто используют для і) трансформации семян масличньїх растений, таких как рапс, используя способ Моіопеу еї а!. Ріапі Сеї! Кер., (1989) 8: 238 - 242) или аналогичную процедуру. Трансгеннье растения могут бьіть получень из зтого зксперимента по трансформации, и вьіращеньі до цветения. Затем получают семена растения в результате Ге! зо бамоопьления.
Семенам дают вьізреть (60 - 80 дней), а затем собирают и измельчают в водном зкстракционном буфере со (Тауюог еї аї. Ріапі а, (1990) 181: 18 - 26). Полученную суспензию центрифугируют при 5000х9 в течение 20 («О минут, в результате получают на поверхности пленку. Ее снова вьіделяют и суспендируют при интенсивном встряхиваний в коллагеназном аналитическом буфере (ЗспоЦіззек апа Сгоззе, Сепе (1988) 62: 55 - 64). ісе)
Добавляют 5ед. коллагеназь,, и суспензию инкубируют со встряхиванием в течение 4 часов. После зтого «Е суспензию снова центрифугируют при 5000худ в течение 20 минут. Удаляют поверхностную пленку, и определяют содержание протеина в водной фазе с помощью злектрофореза на ЗО5-полиакриламидном геле.
Если обнаруживают полосу приблизительно того же размера, что и нужньій пептид, протеин можно осадить, используя сульфат аммония, концентрированно с использованием ультрафильтрации или лиофилизировать. «
В. М-терминальное слияние з с Гидрофильньй М-терминальньй конец протеинов масляньїх тел позволяет осуществить слияние пептидов с
М-концом, обеспечивая при зтом сохранение чужеродного пептида. на внешней поверхности масляного тела. ;» Конфигурации таких слияний представлень! на фиг.2ІВ.
Такую конфигурацию молено сконструировать из таких же исходньїх материалов, что бьіли использовань! для С-терминальньїх слияний, но необходима идентификация удобньїх рестрикционньїх сайтов вблизи начала їх трансляции гена протеина масляного тела. Удобньій сайт можно создать для многих генов протеинов масляньх тел без изменения в кодирующей последовательности за счет введения изменения одного основанім сразу в
Ме, направлений 5' к первому "АТО". В исследованньїх до настоящего времени протеинах масляньїх тел второй
Ге» аминокислотой является аланин, кодон которого начинается с "С". Контекст последовательности представлен 5ор далее: со | А-б переход здесь дает Моосї сайт с 3 ТО Тс і а. А АСА АтТе 0сА 0. ОВР моркови 3, ..00 ОА ОбА АТе бе... 18 кра ОВР кукурузи
Изменение одного основания у аденина перед "АТО" дает в обоих случаях ...ССАТОО..., что представляет 59 собой Мсо! сайт. Таким образом модификация зтого основания с помощью сайт-направленного мутагенеза по
ГФ) КипКе! (Ргос. Маг. Асай. 5сіІ, ОСОБА, (1985) 82: 488 - 492) дает возможность подготовить зтот клон для 7 использования, предполагая, что в последовательности нет других Мсо! сайтов.
Кодирующая последовательность для чужеродного пептида монет потребовать измененийи, которье обеспечат ее дотирование непосредственно по Мсо! сайту. Обьічно зто мотет потребовать изменения одного 60 или двух оснований за счет сайт-направленного мутагенеза (Кипкеї, 1985, ранеє) для создания Мсо! сайта около начала трансляции чужеродного пептида. Затем зтот пептид иссекают из его вектора клонирования, используя
Мсої и второй знзим, которьій разрезает вблизи остановки трансляции мишени. И снова, используя описанньй ранее способ, второй удобньій сайт можно ввести за счет сайт-направленного мутагенеза. Бьіло предположено, в5 Ои. апа Ниапао (1990, ранееє), что М-терминальньй метионин может бьїть удален в процессинге протеийна Іп мімо, и что аланин, которьій следует непосредственно в прямом направлений от него, гложет бьіть ацилирован.
Чтобь учесть зту возможность, монет оказаться необходимьм сохранить последовательность Меї-Аїа по
М-терминальному концу протеина. Зто легко осуществить, используя различнье стратегии введения удобного рестрикционного сайта в кодирующую последовательность в АІа кодон или после него. Так например, за счет сайт-направленного мутагенеза последовательность можно модифицировать следующим образом: 8... 7 ТОА АСА АТО ОСА сАА ОсА 000 Ат ТАЖ... изменить мутацией на
І Максі о 3"... ТО ТА АСА Ато, оса тод ссА сос (сс тат...
Бр
Такое изменение одного кодона позволяет ввести 5рп!Ї сайт в кодирующую последовательность. Второе изменение, которое можно осуществить в том же цикле мутагенеза, превращает два основания в кодоне 6 до получения БОС, (зСС, что представляет Маг! сайт. Зтот полученньій в результате мутации ген можно затем /5 раскрьть ЗР и Маг! до получения отрезка прямого клонирования, которьій исключает три кодона. В зтот сайт можно ввести адаптор, содержащий 3 вьіступ с последовательностью САТО... (совместимую с зр) до 5 вьіступ с противоположного конца.
Точная последовательность зтого адаптера представлена далее:
Бра по раз Магі
ЕЕ ст осот зво | ас
Стаса | 000 бла ас ссоо асес с
Зтот адаптер будет воссоздавать как Зрп! так и Маг! рестрикционнье сайтьі, которне можно использовать о для диагностических целей. ЗрпЇ сайт теперь можно использовать для раскрьтия плазмидь! и клона в рамке
ДНК фрагмента, содержащего последовательность для нужного пептида. Затем следует проанализировать ориентацию клонирования за счет нарезания по любьм несимметрично расположенньм сайтам и Магі плазмидьі. Ге)
Полученньсе из зтих М-терминальньїх слияний конструкции могут бьіть типичньмми примерами ІВ фиг.2. Они должньі содержать ОВР промоторную последовательность в первьїх нескольких кодонах ОВР гена, со представляющего вьісокую ценность пептида с его собстввенной АТО в качестве стартового сигнала при (Се) необходимости, и остальную часть ОВР гена и терминатор.
Зтот модифицированньй ген вводят в бинарную Адгобасіегішт плазмиду (Вемап, (1984, ранеє) и мобилизуют ї-о в Адгобрасіегішт Трансформации осуществляют в соответствии с вьішеприведенньім описанием. Вьіделение «І ценного пептида из семян осуществляют по способу, описанному в разделе "С-терминальнье слияния".
С. Внутренние трансляционнье слияния
Третий тип слияний включает помещение кодирующей ценньй пептид последовательности внутрь « кодирующей последовательности ОВР. Зтот тип слияния требует той же стратегии, что и М-терминальное слияниє, но может бьіть функциональньім лишь при модификациях в участках с низкой консервативностью, так /-- с как считают, что участки с вьісокой степенью консервативности в зтих ОВР существенньі для обеспечения а направленной доставки зрелого протеина. ,» Ключевое отличие в зтом типе слияния состоит в необходимости фланкирующих сайтов распознавания коллагеназьі для вьісвобождения протеина. Зто означает, что вместо стандартной коллагеиазной системь линкер/адаптер, описанной ранее, необходимо иметь линкер следующего вида: п раз (о) коноц І | 00 пас осА соб пон Где воно о (22)
Липкие конць І и 2 будут использованьі для клонирования адаптера в ОВР клон непосредственно. Затем со встроенньій рестрикционньій сайт используют для введения последовательности, кодирующей ценньй пептид,
Ге фланкированньй рестрикционньмми сайтами или линкерами. Ориентацию контролируют, используя ассиметрично расположенньїй рестрикционньій сайт в последовательности, кодирующей ценньїй пептид и один из двух рестрикционньїх сайтов, фланкирующих последовательность, кодирующую фрагмент распознавания Коллагеназь!.
Мобилизация зтих конструкций в Адгобасіегішт плазмидь, а затем в растения идентична ранее описанной (Ф, процедуре. Вьіделение ценного протеина из семян трансгенньїх растений несколько отличается тем, что после ка того, как маслянье тела вьіделяют и промьівают, может понадобиться удалить липидь с масляньх тел для того, чтобьї сделать доступньіми сайть! распознавания коллагеназьі, которьіе могут бьіть спрятаньі внутри масляньх бо тел в липидной фазе. Зта стадия может уменьшить некоторне преимущества использования протеинов масляньх тел в качестве носителей, но может, с другой сторонь), оказаться очень удобной для последовательностей протеинов, которне лабильнь в водной среде или в растительньїх цитоплазмах.
Д. Интердимернье трансляционнье слияния
Возможно, создать конструкцию, в которой целиком повторяется кодирующая последовательность ОВР. 65 Димерньй протеин, получаемьй из такой конструкции, может все еще содержать все необходимье факторь для обеспечения направленной доставки ОВР к масляньм телам. Такая конструкция должна содержать промоторньій участок, полную или почти полную открьтую рамку считьівания для ОВР, но без остановки трансляции, и затем полную открьтую считьвающую рамку второго ОВР, на зтот раз укомплектованного трансляционньм "стоп" и терминаторньїм участком.
При конструированиий зтого химерного гена пару различающихся рестрикционньїх сайтов либо находят, либо создают в участке соединения зтих двух копий. Зти сайть! используют для обеспечения возможности введения такого линкера, как описанньій ранее для внутренних трансляционньїх слияний. Линкерьі содержат не только наборьі фрагментов распознавания коллагеназь, но также внутренний рестрикционньій сайт, в которьй вставляют последовательность, кодирующую представляющий вьсокую ценность протеийн. Форма такой 7/0 Конструкции представлена на фиг.2Іїї. Введение зтой конструкции в Адгорасіегіт, а затем в растения осуществляется описанньм ранее способом. Вьіделение представляющего вьісокую ценность протеина из семян трансформированньїх растений осуществляют по способу, описанному ранее для процедурь
С-терминального слияния.
ПРИМЕР 2
Стратегия клонирования и зкспрессии Интерлейкина-І-В (І/-1- Д) в результате слияния с олеозинами в растениях
А. Клонирование и секвенирование гена олеозина Агарідорзів (паППапа
Ген олеозина Вгаззіса париз (Мигрпу еї аї., (1991) Віоспіт Віорпуз Асіа 1088: 86 - 94) используют для скринирования геномной библиотеки А. (ПпайПапа(сум. Соіштріа) в ЕМВІЗА (Зігаїадепе). В результате скринирования получают вьіделенньій ЕМВІЗА клон (52.1), содержащий 15КЬ геномньй фрагмент из А. аПапа.
Олеозин картируют внутри 6,6КЬ Крпі вставки, внутри зтого 15КЬ фрагмента (фиг.5). 1,8КЬ МсоКрп1 фрагмент, содержащий ген олеозина, шлеет тупой конец, и его субклонируют в та! сайт КЕМІЗтр19. 1,8КЬ вставку переваривают подходящими рестракционньми знзимами и субклонируют в М1Зтр19 для секвенирования.
Последовательность.1800КЬ гена олеозина А. (пайапа представлен на фиг.1а. Все процедурьі! копирования Га рЕ5 осуществляют по ЗБатрбгоокК еї аї., (1989) (МоїІесшіаг Сіопіпд: А Іарогаїгу тапиа! 2па еа. Соїа Зргіпд Нагрог
І арогаюгу Ргезв.) і)
В. Конструирование олигонуклеотида, кодирующего ІЇ-1-р
І -1-В8 состойт из 9 оаминокислот (аа); маї-діп-діу-діи-ді-взег-азп-азр-уз (Апіопі еї аї., (1986) ).
Іттипої. 137: 3201 - 3204). Протеазньій фактор Ха может расщепить последовательность протеина, которая (о) содержит последовательность аминокислот Пе-діи-діу-агд. Расщепление происходит после аминокислоть! ага.
На оснований зтих последовательностей конструируют олигонуклеотид (СМКІЇ, фиг.5), которьій содержит со дополнительно к 1Ї-1-8 кодирующей последовательности, кодирующую последовательность для сайта (Се) расщепления фактора Ха, и 18 нуклеотидов 3 кодирующего участка А. ІНаІапа олеозина (положения оснований 742 - 759). Сконструирована 1І-1-3д кодирующая последовательность, используя оптимальное использование ї-о кодона для В. париз и А. ІпаІМапа олеозина (таблица І) «І , Таблица 1, 2
Йспользованиє колонов А. тТАаіїсада" и В, нарі5олеозинов
ТТТ реє Е 5 ТСТ Бек 5 8 ТАТ бук У 6 тТСТтТ сув СО - «
ТТСрне ЕЕ 3 ТСС век 510 ТАС сук у 11 тТоС сув СО -
ТТА 12ч о - ТоС о вег 5 2 ТАА ОСН Ой - ТСА ОРА ж - 8 с ТТб 1ви 0 о 4 ТА Бек 5 - ТАС АМБ й - тТоС гр м 2. ц СТТ Зеч4 Б 10 ССТтТ рго р 3 САТ нів НО 4 сСстакда в 56 и» Сто 163 Б 11 ССС рго р 1 САС пів но 6 сосСака в -
СТА зе Б - ССА рго р 4 сСАА діп 0 4 сСса ага В 1
СТб ів Б 6 сССборго р 2 сСАб діп 017 сСбб ако В - 45. тт і)зме1 7 АСТ спр Т 11 АТ авп М - АСТ Бек 5 5 г» АТС і11е І 13 АСС ЕнНг Т 14 ААС авп МО 1 СС вех 5 3
АТА 1128 І 3 АСА ПЕ ї 7 ААА 1ув Кк 5 АбА ага в 5 б АТС тес М 11 АСС ЄпЕ Т 5 ААб 1ув К 10 Абсагу в 3 б СТТ уаї У 11 ССтТаїв А 17 САТ азврр 8 сстаїус 0
СТО маї У 9 оССазїа А 2 САС авр р 19 сссСо1у б 9
СТА ма1 У - СА аіа А 10 САА 910 Б 2 ССА діу б 14 (ее) СТО уаї У - бобаїа А 2 САС оіу Б 2 сссоіу б 5 3е)
К..0004ш200.. 000 См. ди. ЛА 2 йее апі Ниапд (1991) РіапЕ Рпувісаї 95: 1395-1397. 59 С. Создание А. ТпаІМапа олеозин 1 -1-В слияния. На оснований последовательности:
ГФ) БСАСАССАСОСААСТСТСТОСТААОСЗ: (положение оснований - 638 до - 814), олигонуклеотид ОСМК10 о БСАСТОСАОССААСТСТСТОСТААОСЗ! бьіл ссконструирован. СОМК1О содержит Рві!ї рестрикционньй сайт (подчеркнут) для облегчения 60 клонирования. Полимеразная цепная реакция (РСК) бьіла использована для амплификации участка между
СМУКІТО и СМК11. Реакционная смесь содержит: 1бмкл аМТРз (1,25мММ), 1Омкл ТОХ РСК буфер (100мМ Ттгів-НСІ рна,З, 500мММ, КСІ, 15мММ Масі», 0,190 (вес/обьем) желатин, 5бмкл НьО. Реакцию ведут в течение ЗО циклов.
Каждьй цикл включает 1 минуту дешифрирования при 92"С, 1 минуту отжига при 45"7С и З минуть! удлинения при 72"С. В результате реакции РСК получают один фрагмент длиной 1652 нуклеотида. бо Д. Клонирование А. (паІМапа олеозин-іІ -1-В8 (ОВРІ) слияния
5'Заі|І-нопалин-синтетазную (поз) термінаторную ЕсокіІ 3 последовательность вьіделяют из рВІ121 (Сіопіесй
Іарогайогіев) и клонируют в Заі/ЕсокК! сайтьї рОС19. Плазмиду назьшвают рТегт. Фрагмент 1652Бр (описан в разделе С) вьіделяют и переваривают рестрикционньми знзимами Рв и ЗаїЇ. Зтот фрагмент клонируют в ВТепт. Полученную плазмиду назьвают рОсСоОВвРІСТ (фиг.5). Зту плазмиду переваривают Ееок! и Рай, и получают в переваре руС19 вектор и ЕсокКіІ-А. (паІМапа олеозин-їЇ -1-В-пов-Рві! слитьй Рвї! (ОВРІЇТ). Полная последовательность ОВРІЇ Т представлена на фиг.7. ОВРІЇТ субклонируют в ЕсовВіІ/Рзі! сайть! рВішевзсгірі". Зту плазмиду (рРВІОВРІСТ) переваривают Рез и НіпайШ, и фрагмент Рай-ОВРІТ-НіІпанй субклонируют в бинарную
Агдобрасіегішт плазмиду (Віп19) (Вемап, М., (1984) Мисі. Асід. Кезв. 12: 8711 - 8721), содержащую селекционньй 70 маркер (неомицинфосфотрансферазу) и Рвзй-Ніпапй уникальнье сайть. Полученную плазмиду назьвают рСООВРІЇТ. Схема процедурьії клонирования представлена на фиг.5. Для описания различньїх бинарньх плазмид смотри рОАб42 или 645; Ап еї а!. (1985) ЕМВО. .). 4 277 - 288 или рСОМ1558 или 1559; МасВгіде апа
З иттепнтеїаї (1990) Ріапі. Моїес. Віої. 14.269 - 276.
Р. Трансформация рССОВРІЇТ в Адгобасіегішт штамм ЕНА101
Отдельную ЕНАТ1О01 колонию (Нооса еї аї., (1986) 9. Васі. 168: 1291 - 1301) используют для того, чтобь инокулировать 5мл ІВ ї- 100мкг/мл канамицина. Зту культуру вніращивают в течение 48 часов при 287. 5мл зтой культурьі используют для инокулирования 500мл І В я 100мкг/мл канамицина. Зту культуру вніращивают при 28"С до тех пор, пока, плотность культурь! не достигает ОДбОО - 0,5 (приблизительно 4 часа). 0В результате центрифугирования клетки осаждают (1Омин, 5000х9), и снова суспендируют в 50Омл стерильной Но (повторяют 2 раза). Клетки снова центрифугируют и снова суспендируют в Змл стерильной Н2О, содержащей 1096 глицерина. Аликвоть! по 40мкл помещают в ампуль! Зппендорфа, и либо непосредственно используют для злектропорации, либо хранят при - 80"С до дальнейшего использования. Злектропорацию осуществляют по способу Вомег еї аї., Мисі. Асіда, Кез. (1888) 16 6127 - 6145. Мощность импульсного генератора устанавливают 25МмМКФ, 2,5КкВ и 200ом параллельно с камерой образца. Га б. Трансформация МіосоїІпа їарасит (табак) с помощью рССоОВРІЇТ
Для трансформации дисков листьев табака используют ЕНАТ1О01, содержащий росовВРІЇТ. Листья табака і9) длиной 8 - 10см берут с растений, растущих в оранжерее, стерилизуют в 7095 зтаноле в течение 20 секунд, а затем в 1095 хлорной извести (например, Щамех) в течение 8 минут. Затем листья 6 раз промьівают стерильной водой. Края листьев, а также среднюю жилку иссекают, а остальную часть листовой пластиньі нарезают на (о зо квадрать! 5 х 7мм или диски диаметром 5мм. Собирают около 30 листовьїх дисков и помещают в небольшую чашку Петри. Затем на диски вьіливают раствор Адгорасіегійт и инкубируют в течение 9 минут. Затем со осуществляют блоттинг на стерильной Ватманской фильтровальной бумаге, и помещают плоской стороной вниз (о на среду І (М5, З9о сахарозь и 2мг/л 2,4-Д). Такое совместное культивирование ведут в течение последующих 48 часов. В зтот момент диски листьев переносят на селекционную среду (МО, З39о сахарозь, 2,5мг/л Ва, 0,1мг/1 ее, МАА, 500мг/л карбеницциллина и 100мг/л канамицина), где.и оставляют затем на З - 4 недели. После появления «Її проростков их иссекают и помещают на корнеобразующую среду (М5, З9о сахарозьі, 0,1мг/І Маа, 5О0Омг/л карбенициллина и 5Омг/л канамицина). После образования достаточной корневой системь! растения табака переносят в почву. «
Н. Трансфорлация В. париз с помощью рРССОВРІЇТ
Трансформация на В. париз ведут по способу Моіопеу еї аї!., (1989) Ріапі СеїІ Кер., 8: 238 - 242 (включено -ЩщЗ с сюда по ссьІлке). ц Процедура трансформации "» Отдельнье колонии Адгорасіегішт (шптеїгасієпе штамма ЕМАТ10О1, содержащие бинарную плазмиду, вьращивают в течение ночи при 28"С на АВ среде. Образец 5Омкл надосадочной жидкости зтой средь 5 вніращивают в течение ночи при 28"С в 5мл бульона МО/І, дополненного соответствующими антибиотиками. «г» Зту бактериальную суспензию осаждают центрифугированием в течение 15 минут при 10000х4д, затем повторно суспендируют в ТОмл М5 средь, содержащей 395 сахарозьь при рН5,8. Тонкую пленку зтой суспензии б используют для вьістилання дна чашки Петри диаметром 5см. Отдельнье вьрезаннье семядоли берут с б описанньїх ранее пластин и срезанную поверхность их петиолей погружают в зту бактериальную суспензию на несколько секунд. Их немедленно возвращают на те же самье М5 пластинь!, с которьїх их взяли. Семядоли со культивируют совместно с Адгобасіегішга в течение 72 часов; при зтом не используют питательньх слоев. (Че) После совместного культивирования семядоли переносят на регенерационную среду, содержащую М5 среду, дополненную 20мМкМ бензиладенина, 395 сахарозьі, 0,795 фитагара, рН5,8 и 500мг/л карбенициллина (Руореп, Ауегзі|) и 15мг/л канамицин-сульфата (Воепгіпдег-Мапппе!т). Снова петиоли осторожно вставляют в агар на глубину 2мм. Плотность растений поддерживают около 10 зксплантатов на пластину. Более вьісокая плотность снижает регенерируемоемость.
Ф, Отбор и регенерация растений ко Зксплантатьії вьідерживают на регенерационной среде в специфических условиях освещенности и температурь! в течение 2 - З недель. За зто время более чем на половине зксплантатов появляются ростки при бо относительно небольшом образовании каллуса. Некоторье из зтих ростков обесцвечиваются к четвертой неделе культивирования. Оставшиеся зеленье ростки субкультивируют на среде для удлинения корней, которая представляет собой регенерационную среду, но без бензиладенина. Одна-две недели на зтой среде обеспечивают установление апикального доминирования из образовавшихся ростковьіїх кластеров. Полученнье таким образом ростки переносят на "корнеобразующую" среду, содержащую М5 среду, 395 сахарозь, 2мг/л 65 индолмасляной кислоть, 0,796 фитагара и 500мг/л карбенициллина. На зтой стадии не используют канамицин, так как било обнаружено, что без селектирующего агента происходит более бьістрое корнеобразование, тогда как очень мало "промахов" реально наблюдаєется на корнеобразований после двух раундов отбора на регенерационной и удлиняющей корни среде.
І. Стабильная интеграция ОВРІЇ Т в геномь! табака и В. париз
Предположительно трансформированнье растения тестируют на активность неомицин-фосфотрансферазь.
Вьіделяют геномную ДНК из растений, демонстрирующих такую активность. Саузерн-блоттинг осуществляют для демонстрации отого, что последовательности между Т-ДНК ограницами (ОВРІ,/Т и геном неомицин-фосфотрансферазь) стабильно интегрированьі в геномь! В. париз и табака. Саузерн табака зондируют А. ТНпаІйапа олеозиновнм геном, а геном неомицин-фосфотрансферазь, В. париз Саузерн зондируют 7/0 геном неомицин-фосфотрансферазь!.
У. Зкспрессия олеозин-ІІ-І- Я слияния в растениях табака РЖ вьіделяют из развивающихся змбрионов, полученньїх из трансформированньїх и нетрансформированньїх растений. Нозерн-блоттинг осуществляют, используя А. ІпаІМапа олеозин в качестве генного зонда. Во всех тестированньїх трансформированньїх растениях можно обнаружить 850-нуклеотвдньій транскрипт. Размерь зтих транскриптов соответствуют ожидаемьм 7/5 размерам мРНК олеозин-ЇіІ--І-В. Зти транскрипть! обнаруживаются в не трансформированньх растениях.
К. Накопление олеозин- ІІ -1-В8 протеина
Протеиньі масляньїх тел вьіделяют из трансформированньїх севіян табака. (НоїбгоокК еї аї., (1991) Ріапі
РПузіса! 97: 1051 - 1058. Осуществляют РАСЕ, и протеийн переносят из геля на РМОЄ мембраньі. Для определения слияния олеозин-ЇЇ -І- Д в семенах табака используют антитела, которье внірабатьіваются против 22кДа олеозина В. паривз. Зти антитела распознают все основньсе олеозиньі в В. париз и А. ІНаІІапа. Кроме того, зти антитела распознают олеозинь! табака. Олеозиньі! табака имеют размерьі, отличающиеся от олеозинов А.
ІнаПйапа и В. париз. В трансформированньїх семенах табака анти-22кДа анитела распознают 20кДа - протеийн, которьій отсутствует в семенах нетрансформированньїх растений. Предсказанньй размер олеозин-їЇ -І-В слияния составляет 20,1кДа. Полученнье результать! представлень в таблице 2. Ге
Таблица 2 о
Реазультатн зкопресони"?
Стабильная Зкопрессия Определение интеграция олеозин- 20 кДа протеина Ф зо Саузерн- 0 ІТ1-1-8 Веотерн-блоттинг блоттинг 0 Нозерн- со
Олоттине со
І 2 З 4 ---- --- - ----- --- 44 т нт ння ня Ге)
ВЗ, парйв де транобормировано - пт Мт ч траноформант КЕ І2 Ех тт не
І а З 4а- ч у п Пет и о о о и а т ж ж ж чл т мл ж ж Тина нити шщ с Табак: . «» не транеформирорано - ж Кк траноФормант А ня ж ж ї» 175 траноформант В нх Ж н б» траноформант а - Ки ж о транобормант Її, - ня ки ху Стабильная интеграция, определенная кар; описано в І. со Зкспрессию олеозин-іІ-І-д слияния определяют по способу У. Детектирование предполагаемого протейина (Че) слияния олеозин-іЇ--І-Д ведут по способу К. МТ « не тестировали.
За счет зкспрессии представляющего интерес пептида, коньюгированного с протеином масляного тела, или его частью, достаточной для обеспечения его направленного транспорта к масляньм телам, представляющий мнтерес пептид можно легко очистить, то есть, практически отделить его от других клеточньїх компонентов.
Протеийн слияния можно расщепить после очистки, или его можно использовать далее без расщепления. о Рассматриваемьсе способь и композиции обеспечивают бьістрьій, простой способ очистки представляющего ко интерес полипептида.
Все публикации и патентнье заявки, указанньсе в зтом описаний, включень! сюда по ссьлке. во Далее настоящее изобретение раскрьїто полностью, но специалистам должно бьїть ясно, что не вніходя за рамки обьема и сути прилагаемой формульй изобретения можно осуществить множество измерений и модификаций.
Claims (1)
- Формула винаходу б51. Способ зкспрессиий рекомбинантного полипептида растительной или бактериальной клеткой-хозяином, отличающийся тем, что указанньйй способ включает: а) введение в растительную или бактериальную клетку-хозлина химерной ДНК, включающей первую последовательность ДНК, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке-хозяине второй последовательности ДНК, где указанная вторая последовательность кодирует рекомбинантньй слитьй полипептид и содержит (ї) последовательность ДНК, кодирующую часть белка олеозина, достаточную для обеспечения перевода рекомбинантного слитого полипептида в липидную фазу, соединенную в рамке считьівания с (ІІ) последовательностью ДНК, кодирующей указанньй рекомбинантньій полипептид, и третью /р0 последовательность ДНК, кодирующую терминирующую область, функциональную в клетке-хозяйне, и р) культивирование указанной клетки-хозяина для получения рекомбинантного слитого полипептида.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно включает отделение рекомбинантного слитого полипептида от компонентов клетки-хозяина путем селективного распределения в липидную фазу.З. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно включает отделение рекомбинантного слитого /5 Пполипептида от компонентов клетки-хозяина путем селективного распределения в липидную фазу, содержащую масляньсе тела.4. Способ по п. З, отличающийся тем, что указанньій рекомбинантньій слитьій полипептид отделяют путем добавления компонентов масляного тела и восстановления масляньх тел.5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что дополнительно включает вьісвобождение рекомбинантного полипептида из рекомбинантного слитого полипептида, связанного с липидной фазой, отличающийся тем, что включает: с) встраивание в указанную вторую последовательность ДНК между указанной последовательностью ДНК (), кодирующей белок олеозин, и последовательностью ДНК (Ії), кодирующей указанньй рекомбинантньй полипептид, линкерной последовательности ДНК (ІІ), кодирующей аминокислотную последовательность, сч которая может бьіть специфично расщеплена ферментньї!м или химическим агентом, и а) контактирование липидной фазьї с указанньім ферментньім или химическим агентом таким образом, что і) указанньій рекомбинантньїй полипептид вьісвобождается из рекомбинантного слитого полипептида.6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанная аминокислотная последовательность, кодируемая указанной линкерной последовательностью ДНК, может бьіть расщеплена ферментньм агентом. б зо 7. Способ по п. б, отличающийся тем, что указанная линкерная последовательность ДНК кодирует аминокислотную последовательность, распознаваемую с помощью протеолитического действия фермента, со вьібранного из группь, состоящей из тромбина, фактора Ха, коллагеназь и химозина. «о8. Способ по п. б, отличающийся тем, что указанньій ферментньй агент содержит иммобилизованньй фермент. ісе)9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанньій фермент иммобилизован путем связьнвания белка «г олеозина, которьій ассоциирован с масляньм телом.10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанньій рекомбинантньій полипептид представляет собой фермент.11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что указанньій рекомбинантньй полипептид представляет собой « Фермент, которьій сохраняет свои ферментативнье свойства, будучи частью рекомбинантного слитого в с полипептида, связанного с маслянь/м телом.12. Способ получения и вьісвобождения рекомбинантного полипептида из рекомбинантного слитого ;» полипептида, связанного с фракцией масляньїх тел растений во время прорастания семян и роста проростка растения, отличающийся тем, что включает: а) введение в растительную клетку первой химерной ДНК, содержащей первую последовательность ДНК, ї5» способную регулировать транскрипцию в указанной растительной клетке второй последовательности ДНК, где указанная вторая последовательность ДНК кодирует рекомбинантньій слитьій полипептид и содержит (і)Ме. последовательность ДНК, кодирующую часть белка олеозина, достаточную для обеспечения перехода б рекомбинантного слитого полипептида в масляное тело, соединенную в рамке считьмшвания с (ЇЇ) 5р последовательностью ДНК, кодирующей рекомбинантньй полипептид, и (ії) линкерную последовательность со ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность, которая может бьть специфично расщеплена Ге) ферментньїм агентом, где указанная линкерная последовательность ДНК (ії) расположена между указанной последовательностью ДНК (ї), кодирующей белок олеозин, и указанной последовательностью ДНК (ЇЇ), кодирующей рекомбинантньй полипептид, и третью последовательность ДНК, кодирующую терминирующую 5Б область, Б) последовательное или одновременное введение в геном указанного растения второй химерной ДНК, (Ф, содержащей первую последовательность ДНК, способную во время прорастания семян и роста проростка ка специфично регулировать транскрипцию второй последовательности ДНК, кодирующей специфичньйй фермент, которьій способен расщеплять линкерную последовательность ДНК из указанной первой химерной ДНК, и бо третью последовательность ДНК, кодирующую терминирующую область, с) регенерирование растения из указанной растительной клетки и вииращивание указанного растения с получением семян, посредством чего зкспрессируется и связьшвается с масляньми телами указанньй рекомбинантньй слитьїй полипептид, и а) обеспечение прорастания указанного семени, причем указанньій фермент, кодируемьй указанной второй б5 Химерной ДНК зкспрессируется и отщепляет рекомбинантньй полипептид от рекомбинантного слитого полипептида, связанного с масляньіми телами, во время прорастания семян и раннего роста проростка.13. Способ изготовления пищи на основе модифицированньїх семян путем получения рекомбинантного полипептида, связанного с фракцией масляньіх тел семян растения, отличающийся тем, что включает: а) введение в растительную клетку химерной ДНК, содержащей первую последовательность ДНК, способную регулировать транскрипцию в указанной растительной клетке второй последовательности ДНК, где указанная вторая последовательность ДНК кодирует рекомбинантньій слитьій полипептид и содержит (і) последовательность ДНК, кодирующую часть белка олеозина, достаточную для обеспечения перехода рекомбинантного слитого полипептида в масляное тело, соединенную в рамке считьівания с. (ії) последовательностью ДНК, кодирующей рекомбинантньй полипептид, и третью последовательность ДНК, 7/0 Кодирующую терминирующую область, Б) регенерирование растения из указанной растительной клетки и вьіращивание указанного растения с получением семян, посредством чего зкспрессируется и связьшвается с масляньми телами указанньй рекомбинантньй слитьїй полипептид, и с) измельчение указанньїх семян и изготовление пищи на основе модифицированньх семян.14. Способ получения фермента, связанного с масляньм телом, в растительной или бактериальной клетке-хозяине и вьісвобождения указанного фермента из масляного тела, отличающийся тем, что включает: а) трансформирование растительной или бактериальной клетки-хозяина химерной ДНК, содержащей первую последовательность ДНК, способную регулировать транскрипцию второй последовательности ДНК, где указанная вторая последовательность ДНК кодирует рекомбинантньій слитьій полипептид и содержит (і) го последовательность ДНК, кодирующую часть белка олеозина, достаточную для обеспечения перехода рекомбинантного слитого полипептида в масляное тело, (ії) последовательность ДНК, кодирующую фермент, и (її) линкерную последовательность ДНК, расположенную между указанной последовательностью ДНК (Її), кодирующей белок олеозин, и указанной последовательностью ДНК (ії), коюодирующей фермент, где указанная последовательность ДНК (ії) кодирует аминокислотную последовательность, которая может бьіть расщеплена сч ов ферментом, кодируемьм последовательностью ДНК (її), и третью последовательность ДНК, кодирующую терминирующую область, функциональную в указанной клетке-хозяине, і) Б) культивирование клетки-хозяина с получением рекомбинантного слитого полипептида в условиях, при которьїх фермент неактивен, с) вьіделение масляньїх тел, содержащих рекомбинантньй слитьїй полипептид, и б зо а) изменение условий средьі, окружающей маслянье тела, таким образом, что фермент активируется и отщепляется от рекомбинантного слитого полипептида. со15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанньій фермент активируется путем понижения значения рн Ге средьі, окружающей маслянье тела.16. Способ зкспрессий рекомбинантного полипептида, связанного с масляньм телом, растительной или ісе) з5 бактериальной клеткой-хозяином и вьделения указанного рекомбинантного полипептида из масляного «г тела, отличающийся тем, что включает: а) трансформирование первой растительной или бактериальной клетки-хозяина первой химерной ДНК, содержащей первую последовательность ДНК, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке-хозяине второй последовательности ДНК, где указанная вторая последовательность кодирует первьй « рекомбинантньй слитьій полипептид и содержит (ї) последовательность ДНК, кодирующую часть белка ств) с олеозина, достаточную для обеспечения перехода рекомбинантного слитого полипептида в липидную фазу,. соединенную в рамке считьівания с (ІІ) последовательностью ДНК, кодирующей указанньій рекомбинантньй и?» полипептид, и (ІІ) линкерную последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность, которая может бьть специфично расщеплена ферментньм агентом, где указанная линкерная последовательность ДНК (Ії) расположена между указанной последовательностью ДНК (ї), кюодирующей белок їх олеозин, и указанной последовательностью ДНК (ІІ), кодирующей рекомбинантньій полипептид, и третью последовательность ДНК, кодирующую терминирующую область, функциональную в указанной клетке-хозяине, Ме, Б) трансформирование второй растительной или бактериальной клетки-хозяина второй химерной ДНК, б содержащей первую последовательность ДНК, способную во время прорастания семян и роста проростка 5о специфично регулировать транскрипцию второй последовательности ДНК, где »указанная вторая со последовательность кодирует второй рекомбинантньй слитьій полипептид и содержит (ї) последовательность Ге ДНК, кодирующую часть белка олеозина, достаточную для обеспечения перехода рекомбинантного слитого полипептида в липидную фазу, соединенную в рамке считьівания с (Ії) последовательностью ДНК, кодирующей специфичньій фермент, которьій способен расщеплять линкерную последовательность ДНК указанной первой химерной ДНК, и третью последовательность ДНК, кодирующую терминирующую область, с) культивирование указанной первой клетки-хозяина в условиях, при которьїх первьій рекомбинантньй (Ф, слитьІй полипептид зкспрессируется и связьшваєется с масляньми телами с получением первой фракции ка масляньїхх тел, содержащих первьій рекомбинантньй слитьй полипептид, а) культивирование указанной второй клетки-хозяина в условиях, при которьїх второй рекомбинантньй бо блитьій полипептид зкспрессируется и связьшваеєтся с масляньми телами с получением второй фракции масляньїхх тел, содержащих второй рекомбинантньй слитьй полипептид, е) взаимодействие первой фракции масляньх тел со стадии (с) со второй фракцией масляньх тел со стадийи (4) в таких условиях, что ферментная часть второго рекомбинантного слитого полипептида отщепляет первьй рекомбинантньїйй полипептид от первого рекомбинантного слитого полипептида. 65 17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанньій рекомбинантньій полипептид представляет собой интерлейкин.18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанньій рекомбинантньій полипептид представляет собой ингибитор тромбина.19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанньій рекомбинантньій полипептид представляет собой пирудин.20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой растительную клетку.21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанное растение является двудольньм.22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанное растение относится к семейству Вгаззісасеае. 70 23. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.24. Способ по п. 71, отличающийся тем, что в указанной второй последовательности ДНК последовательность ДНК (ї) представляет собой ген олеозина, полученньй из растения семейства Вгаззісасеае.25. Способ по п. 71, отличающийся тем, что в указанной второй последовательности ДНК последовательность ДНК (ї) представляет собой ген олеозина, полученньй из Агарідорзіз ІпаІапа.26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанная первая последовательность ДНК получена из гена олеозина из растения Агарідорзів (НпаІапа.27. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанная ДНК (І) имеет следующую последовательность ЗЕС) 2о 10 МО 1: ССАТООСТАТ АСССААССТО ОСТСТТООТС АСАССАСбАА СТСТСТОСТА АОоСТАоСТоС 60 78. АСТОСССАСА ААСААССООС СССАААТТОС СОбААТТОСТ САССТОААСА СОСААСАТСА 120 тТостТоСоотТо СТТОООССАТ ТОССОСОСАА САТОССТСАС СТТОбОСТТО АССАСОСАСАС 180 СССААТССАС ТСТОТТОААА ССТТСОТТСАТ ТООСАТТТОТ АТАСОСАСАТ ТОСТОСТОСА 240 с САОСТТТСАС СОСАДАССАСА ААТОСОСТТТО ОСТСТОСАСА ААСАСАсТОС СОСТТТАСАс 300 Ге) АСАСААТТОА САССТТТАСА САСАСАТОСОо ОСОбСОАТСА СОБОСАССАСА САССАССАСсС 360 АССТОСАТТА ТСАААССАСТ САССОТОСТОА ААТТТОСААС ТТТТААСАСО САСАТАСАТТ 420 ТтТАТТАТТТОТ АТССАТТТТСО ТТСАТТОТТС ТАСААТСОТСО СОбААСАААТ ТТТААААСТА 480 ААТССТАААТ ТТТІСТААТТ ТІСТТОССАА ТАСТОСАТАТ СТОСбСССОТА ТАСААССААТ 540 б СТАТТСААОС СССАААСССА ТАСТОСАССАС СССАААССТТ ССТТТТОСсСТ ТТТАТСсТТТо 600 со ОСТТІССАТОС СААСОССАСА ТІСТОАОСТА СОСААААААС АААСОТОТСТ ТТСААТАСАС 660 ТОССТСТОСТТ ААСАСАТОСА ССООСТОСАТ СОТСАСОССА ТТААСАССТО СССТАСААТТ 720 ее, ССАТОАТОТС ТССАТТСАСА ССТОАСТТСТ ССТСТОСТТТ СТТААТАТАТ СТААСААДАСА 780 Ге) СТССТАССТО ТТССААААТА ТАТАСАСАТС ТТТТТСАТСА АТСТСТСАТТ СААААТСТСА 840 325 ТТІСТСТСТАС ТАААСААСАА САДААДАААТО ССОСАТАСАС СТАСАССААС ССАТСАССАТ 900 в АТСАТССОСА САСАССАСТА ССССАТСАТО СОСССАСАСС САСАССАСТА ССАСАТСТОС 960 ССАССАССАТ СТОАСТАСТО СААСТСТАСС САСАТТОСТА ААССТОСААС ТОСТОТСАСА 1020 остТостТостТтІ СССТоСтТТсТ ТСТСТоСАОС СТТАСОСТТОо ТТОСААСТОТ САТАОСТТТОо 1080 « АСТОТТОСАА САССТСТОСТ СОТТАТСТТС АССССААТОС ТТОТСССооС ТСТСАТСАСА 1140 СТТОСАСТОС ТСАТСАССОосС ТІТІСТТТСС ТСТОСАСОосСТ ТТОбСАТТОС СОСТАТААСС 1200 не) с СТТТТСТСТТ ССАТТТАСАА СТААССАСАС АТТТАТСАТС ТТАСТТСАТА АТТТТОСТОСА 1260 "з АТАТСОТОСАТ ССАТОТОТТО АСССАСТАОС ТТТОбАТСАА ТТТТТТТОСТ ССААТААСАА 1320 " АТСТААСААТ ААСАААТТОС АААТТІСТАСО СААСАТТТОС ТТААСТАААТ АССАААТТТОо 1380 АССТАСОСТАС СТТОААТОТоО ТСТОТОТАТА ТСАТСТАТАТ АССТААААТо СТТОСТАТОА 1440 ТАССТАТТОА ТТСТОААТАС СТАСССААСС ССАСАбСАСС САСАСОСАТС АСАСААСТТО 1500 т- САСАСТОСАА ССАТОААСТТ СОСААДССААА ССТСАССАТС ТОСАААСАСАС АОСТСАСТАС 1560 Ге» ТАСОСАСАСС ААСАТАСТОС ТОСОСААСАТ САСССОТСАСС СТАСТОСТОС ТОСССАССАС 1620 АСТАСТТААС ТТАССССАСТ САТОТСАТСО ТСАТАСТОСА АТААСТССАА ТОТСОбОоСАС 1680. іа ТТАСТТТАТО АОбААТАААС ТОТТТАСААТ ТТСАТСАСОС СбАСАТААТА АДАССССАСТ 1740 Го! 50 ТТСААТСТТТ ТТІСТТАТААС ТААТСОТТТАТ СТОТОТТТСТ АТАТОТТОТС АААТОСТАСС 1800. (Че) Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанная последовательность ДНК (ї) кодирует полипептид, имеющий следующую аминокислотную последовательность ЗЕО ІЮ МО 5: Ф) іме) 60 б5Меє Меє с1у Ак Авр Аку АвБр біп Ту б1іп Меє бек С1у Аку с1у бег 23. 1 5 10 15 Авр Тук бек Ппув бек Аку б1іп І1е А1а пуб Аїа Аїа Трх Аза Уа1ї тк 9 20 25 30 А1ї1а сіу сі1іу бек Ппем Пе Уа1ї Ппей Гец бек Геп ТБ Ппеп Уаї сС1у ТЬхг 35 40 45 уаї тІ1е Аї1а Гешп Тік Уа1ї АТа Тк Ркго Пейп Пеп Уаї І1е Ре бек Рго 70 50 55 6о І1е реп Уа1! Рко Аза Гєш І1е Тік Уа! АЗїа Гей Ппей І1е ТПх Сіу РіПе 65 70 75 80 Пес бек бек Сіу сіу Рпе сСі1у І1е Азї1а Аїа І1е Ті Ууаї Рібе бек Ткр 85 90 95 9 тІ1їе Тук пув Тук Пец пецп І1е Сій Нів Рго Сіп Сіу бек Авр цув Гей 100 105 110 Авр бек Аїа Акуд Меє Пув Гей С1у бек Гув А1ї1а сбіп Авр Гец Гув Авр 115 120 125 го Ак Аї1а біп Тук Тук сіу біп сбіп Нів ТПк с1і1у С1іу січ Нів Авр Агд 130 135 140 АБр Аку Тк Акур с1у с1у біп Нів Ток Тк 145 150. Химерная ДНК, способная зкспрессироваться в связи с масляньм телом растительной или бактериальной с 29 клетки-хозяйна, содержащая первую последовательность ДНК, способную регулировать в указанной Ге) растительной или бактериальной клетке-хозяине транскрипцию второй последовательности ДНК, где указанная вторая последовательность ДНК кодируеєт рекомбинантньй слитьій ополипептид и содержит (|і) последовательность ДНК, кодирующую часть белка олеозина, достаточную для обеспечения перехода рекомбинантного слитого полипептида в липидную фазу, соединенную в рамке считьшвания с. (ії) о последовательностью ДНК, кодирующей указанньй рекомбинантньій полипептид, и третью последовательность о ДНК, кодирующую терминирующую область, функциональную в указанной клетке-хозяине.30. Химерная ДНК по п. 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (ії) кодирует о фермент. Ге)З1. Химерная ДНК по п. 29, отличающаяся тем, что дополнительно включает (ії) линкерную последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность, которая может бьіть спедифично З расщеплена ферментньм агентом, где указанная линкерная последовательность ДНК (ії) расположена между указанной последовательностью ДНК (ї), кюддирующей белок олеозин, и указанной последовательностью ДНК (ії), кюсдирующей рекомбинантньїй полипептид. «32. Химерная ДНК по п. 31, отличающаяся тем, что указанная линкерная последовательность ДНК (ії) т0 кодирует сайт расщепления ферментом, вьібранньм из группьії, состоящей из тромбина, фактора Ха, 8 с коллагеназь и химозина. з» 33. Химерная ДНК по п. 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (ії) кодирует интерлейкин.34. Химерная ДНК по п. 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (ії) кодирует ингибитор тромбина. ве 35. Химерная ДНК по п. 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (ії) кодирует гирудин. Ге») 36. Химерная ДНК по п. 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (ії) представляет собой ген олеозина, полученньїй из растения семейства Вгаззісасеае. б 37. Химерная ДНК по п. 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (ії) представляет о 20 собой ген олеозина, полученньй из Агарідорзіз (паІапа.38. Химерная ДНК по п. 29, отличающаяся тем, что указанная первая последовательность ДНК получена из с гена олеозина из растения Агарідорзів (паІапа.39. Химерная ДНК по п. 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (і) представлена в ЗБОЮ МО 1.40. Химерная ДНК по п. 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (ії) кодирует ГФ) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность представленную в ЗЕО ІЮ МО 5.41. Зкспрессирующая кассета, содержащая химерную ДНК, охарактеризованную в п. 29. по 42. Способ получения трансгенного растения, которьій предусматривает регенерацию указанного растения из культурь растительньїх клеток, трансформированньх химерной опоследовательностью ДНК, 60 охарактеризованной в п. 29.43. Культура растительньхх клеток, содержащих химерную ДНК, охарактеризованную в п. 29. б5
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UA93003022A UA46689C2 (uk) | 1993-06-18 | 1993-06-18 | Спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду рослинною або бактеріальною клітиною-хазяїном, спосіб одержання та вивільнення рекомбінантного поліпептиду з рекомбінантного злитого поліпептиду, спосіб виготовлення їжі на основі модифікованого насіння, спосіб одержання ферменту, зв'язаного з масляним тілом, спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду, зв`язаного з масляним тілом, химерна днк, експресуюча касета, спосіб одержання трансгенної рослини, культура рослинних клітин |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UA93003022A UA46689C2 (uk) | 1993-06-18 | 1993-06-18 | Спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду рослинною або бактеріальною клітиною-хазяїном, спосіб одержання та вивільнення рекомбінантного поліпептиду з рекомбінантного злитого поліпептиду, спосіб виготовлення їжі на основі модифікованого насіння, спосіб одержання ферменту, зв'язаного з масляним тілом, спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду, зв`язаного з масляним тілом, химерна днк, експресуюча касета, спосіб одержання трансгенної рослини, культура рослинних клітин |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA46689C2 true UA46689C2 (uk) | 2002-06-17 |
Family
ID=74201296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA93003022A UA46689C2 (uk) | 1993-06-18 | 1993-06-18 | Спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду рослинною або бактеріальною клітиною-хазяїном, спосіб одержання та вивільнення рекомбінантного поліпептиду з рекомбінантного злитого поліпептиду, спосіб виготовлення їжі на основі модифікованого насіння, спосіб одержання ферменту, зв'язаного з масляним тілом, спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду, зв`язаного з масляним тілом, химерна днк, експресуюча касета, спосіб одержання трансгенної рослини, культура рослинних клітин |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA46689C2 (uk) |
-
1993
- 1993-06-18 UA UA93003022A patent/UA46689C2/uk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU773736B2 (en) | Novel expression cassette for expressing genes in plant seed | |
| CN1906296B (zh) | 在转基因植物中产生载脂蛋白的方法 | |
| JPH04502861A (ja) | 植物および植物細胞中での非相同タンパク類の生産 | |
| JPS60500438A (ja) | 植物細胞を形質転換するためのプラスミド | |
| JP3639592B2 (ja) | 植物中の高価値ペプチドの担体用の油体タンパク質 | |
| CN102753011B (zh) | 在植物中血管生成素的表达 | |
| JP2007325590A (ja) | 植物によって生産される組換え前十二指腸リパーゼおよびペプチド誘導体、それらの取得方法およびそれらの用途 | |
| KR20100132516A (ko) | 식물에서 인간 단백질, 특히 곡물 내배유에서 인간 재조합 리소좀 효소의 제조를 위한 방법 | |
| JP2002518055A (ja) | 植物選択マーカーおよび植物形質転換方法 | |
| JP5497353B2 (ja) | 外来タンパク質の分泌方法 | |
| CN118325926B (zh) | 二化螟唾液蛋白二硫键异构酶在提高烟草对草地贪夜蛾和蚜虫抗性中的应用及方法 | |
| US20080104725A1 (en) | Methods For The Modulation of Oleosin Expression In Plants | |
| CN102851306B (zh) | 用于生产蛋白的转基因芦荟植物及其相关的方法 | |
| CN103865936B (zh) | 控制植物叶片转绿的基因及其使用方法和应用 | |
| WO2002090386A2 (en) | Regulatory protein involved in pectin modification | |
| UA46689C2 (uk) | Спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду рослинною або бактеріальною клітиною-хазяїном, спосіб одержання та вивільнення рекомбінантного поліпептиду з рекомбінантного злитого поліпептиду, спосіб виготовлення їжі на основі модифікованого насіння, спосіб одержання ферменту, зв'язаного з масляним тілом, спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду, зв`язаного з масляним тілом, химерна днк, експресуюча касета, спосіб одержання трансгенної рослини, культура рослинних клітин | |
| RU2201449C2 (ru) | Слитый полипептид, способный к целенаправленному переносу к масляному телу, химерная днк-контрукция, экспрессирующая кассета | |
| CN115160422A (zh) | 甘薯耐盐抗旱相关蛋白IbMYB44及其编码基因与应用 | |
| JP3927975B2 (ja) | 植物中の高価値ペプチドの担体用の油体タンパク質 | |
| KR100974302B1 (ko) | 페투인이 발현된 감자 식물체 | |
| JP2001507928A (ja) | 植物により生成された膵リパーゼ及び／又は組換えコリパーゼ及び由来ポリペプチドとそれらの取得方法及び利用 | |
| KR100333315B1 (ko) | 식물에서 가치있는 펩타이드의 운반체인 기름체 단백질 | |
| AU678136C (en) | Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants | |
| WO2006095749A1 (ja) | 植物でのペプチドの発現・集積方法 | |
| KR20100073281A (ko) | 인간 락토페린 및 유산균 유래의 β-갈락토시다제 단백질을생산하는 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 식물체 |