ES2273501T3

ES2273501T3 - Cristales de germinacion para la preparacion de peptidos o proteinas.

Info

Publication number: ES2273501T3
Application number: ES99931016T
Authority: ES
Inventors: Flemming Manique; Christian Ilsoe
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1998-06-30
Filing date: 1999-06-30
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2019-06-30
Also published as: WO2000001727A1; AU4768599A; NO20006701D0; BR9911678A; JP2002519437A; EP1091979B1; HUP0102577A2; ATE340189T1; CN1307589A; KR20010071666A; AU758496B2; DE69933296T2; DE69933296D1; HUP0102577A3; CA2336112A1; PL345260A1; IL140341A0; EP1091979A1; NO20006701L

Abstract

Método de producción de microcristales de germinación para producir un péptido o proteína, donde el péptido o proteína es seleccionado del grupo compuesto de insulina y análogos o derivados de ésta, comprendiendo el suministro de una suspensión no germinada de dicho péptido o proteína y la homogenización de dicha suspensión bajo presión para producir microcristales peptídicos o proteicos adecuados para un uso en forma de microcristales de germinación para la producción de dicho péptido o proteína.

Description

Cristales de germinación para la preparación de péptidos o proteínas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para producir microcristales de germinación para la producción de un péptido o proteína, donde el péptido o la proteína es seleccionado del grupo compuesto de insulina y análogos o derivados de ésta, comprendiendo el suministro de una suspensión no germinada de dicho péptido o proteína y la homogenización de dicha suspensión bajo presión para producir microcristales peptídicos o proteicos adecuados para un uso en forma de microcristales de germinación para la producción de dicho péptido o proteína.

Antecedentes de la invención

La familia "Lente" de productos de insulina cíncica son suspensiones de insulina cíncica del tipo desarrollado originalmente en 1950 con el objetivo de producir preparaciones de insulina capaces de cubrir, con una única inyección diaria, las necesidades de insulina de los diabéticos (véase por ejemplo Jens Brange, Galenics of Insulin, 1987). Varios productos de insulina Lente con diversos perfiles de acción son comercializados en forma de diferentes combinaciones de partículas de insulina amorfa y/o cristalina por Novo Nordisk A/S, Dinamarca. Estas incluyen SEMILENTE, una suspensión de partículas de insulina amorfa, ULTRALENTE, una suspensión de partículas de insulina cristalina, y LENTE, que es una mezcla de 30% de partículas de insulina amorfa y 70% cristalina.

Durante varias décadas, los cristales de germinación para la preparación de productos de insulina cíncica "Lente" han sido preparados según el mismo método de liofilización de base desarrollado y patentado a principios de 1950. Este método, que está descrito en la descripción de patente GB N° 766,994, se refiere a la adición de insulina amorfa liofilizada, normalmente insulina bovina, en un medio de cristalización que contiene insulina para producir la formación de una suspensión de microcristales de insulina de un tamaño de aproximadamente 2-7 \mum. Con esta suspensión, que es utilizada finalmente para la preparación del producto de insulina cíncica cristalina final, se rellenan unos pequeños viales (por ejemplo de 10 ml), y éstos son congelados en una mezcla de alcohol/dióxido de carbono y almacenados congelados a una temperatura de o inferior a -18°C.

Aunque se siga usando, este método presenta varias desventajas:

1.: Se basa en el uso de insulina bovina, puesto que hasta ahora no se ha conseguido producir microcristales aceptables de insulina humana pura. El resultado del uso de núcleos de insulina bovina para la formación de los microcristales es que el producto final contiene una pequeña cantidad de insulina bovina no deseada.

2.: El método de liofilización requiere un liofilizador y el transporte y almacenamiento posteriores a una temperatura máxima de -18°C. Esta operación es cara y requiere mucho espacio.

3.: El método de preparación es extremadamente difícil de realizar de una manera suficientemente aséptica.

Por lo tanto sería ventajoso producir cristales de germinación de insulina usando un método que no presente las desventajas de los métodos conocidos. Se ha descubierto ahora de manera inesperada que es posible, mediante el uso de un proceso relativamente simple y de bajo costo, producir cristales de germinación de insulina sin insulina bovina, los cuales pueden ser almacenados a temperatura ambiente y producir preparaciones de insulina que tienen unas propiedades ventajosas con respecto por ejemplo, al tamaño de partícula del cristal y a su uniformidad. Además, se ha comprobado también que este proceso puede ser aplicado a la producción de cristales de germinación para otros péptidos y proteínas, en particular péptidos o proteínas usados en forma de preparaciones farmacéuticas.

Resumen de la invención

Por lo tanto es un objeto de la presente invención proporcionar un nuevo método para la producción de cristales de germinación peptídicos o proteicos. Más particularmente, es un objeto de la invención proporcionar un método para producir cristales de germinación de insulina que no requiera el uso de insulina bovina, lo cual hace posible el almacenamiento y el transporte sin necesitar liofilización cara ni almacenamiento a temperaturas bajo cero, y que pueda realizarse en un sistema cerrado para permitir más fácilmente el uso de métodos de producción aséptica.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar un método para la preparación de cristales de germinación de insulina para la producción de suspensiones de insulina cíncica cristalina con una distribución reducida del tamaño de partículas.

En su aspecto más amplio, la presente invención se refiere por consiguiente a un método de producción de microcristales de germinación para la producción de un péptido o proteína, donde el péptido o proteína es seleccionado del grupo que consiste en insulina y análogos o derivados de ésta, comprendiendo el suministro de una suspensión no germinada de dicho péptido o proteína y la homogenización de dicha suspensión bajo presión para producir microcristales peptídicos o proteicos adecuados para un uso en forma de microcristales de germinación para la producción de dicho péptido o proteína.

En una forma de realización particular, la invención se refiere a un método de producción de microcristales de germinación para la producción de insulina humana, donde dichos microcristales no contienen insulina pancreática no humana, comprendiendo la adición de una suspensión no germinada de insulina humana, donde dicha suspensión no contiene insulina pancreática no humana, y la homogenización de dicha suspensión de insulina bajo presión para producir microcristales de insulina humana adecuados para un uso en forma de microcristales de germinación para la producción de productos de insulina cíncica.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de producción de un producto peptídico o proteico donde el péptido o proteína es seleccionado del grupo compuesto de insulina y análogos o derivados de ésta, dicho método comprendiendo (i) el suministro de una primera suspensión no germinada de dicho péptido o proteína; (ii) la homogenización de dicha suspensión no germinada bajo presión para producir microcristales de dicho péptido o proteína; y (iii) la germinación de una segunda suspensión no germinada de dicho péptido o proteína con unos microcristales producidos en la fase ii.

En una forma de realización particular de este aspecto de la invención, el producto peptídico o proteico que debe ser producido es un producto de insulina cíncica, las primeras y las segundas suspensiones no germinadas son suspensiones de insulina humana, y los microcristales de germinación son microcristales de insulina humana.

Descripción detallada de la invención

Como se ha indicado anteriormente, el método de la invención se refiere a la producción de microcristales de germinación para péptidos y proteínas seleccionados del grupo compuesto de insulina, análogos y derivados de ésta. El péptido o proteína es en particular insulina humana o un análogo o derivado tal y como se describe a continuación.

Como se utiliza en el presente texto, el término "insulina humana" es empleado para designar insulina humana de origen natural así como análogos insulínicos y derivados insulínicos. El término "análogo insulínico" es empleado para designar un péptido de actividad insulínica, derivado de una insulina de origen natural debido a la sustitución de uno o más residuos aminoácidos, la eliminación de uno o más residuos aminoácidos y/o la adición de uno o más residuos aminoácidos. Una insulina o análogo insulínico puede opcionalmente tener la formar de un "derivado insulínico", el término "derivado" se refiere a un péptido donde uno o más residuos aminoácidos del péptido padre han sido modificados químicamente, por ejemplo por alquilación, acilación, formación del éster o formación de la amida. Una "insulina acilada" (o análogo insulínico) es una insulina (o análogo insulínico) que posee un grupo acilo del grupo \varepsilon-amino de uno o más residuos aminoácidos, frecuentemente un residuo de lisina.

Como se utiliza en este caso, el término "insulina pancreática no humana" se refiere a una insulina de origen natural de origen no humano, por ejemplo insulina bovina o porcina.

El principio básico de una forma de realización actualmente preferida de la invención está mostrado esquemáticamente en la Fig. 1. El aparato de la Fig. 1 comprende un recipiente receptor 1, desde el cual la suspensión de insulina es transferida mediante una bomba 2 al interior de un homogeneizador 3. El homogeneizador 3 comprende una válvula que posee una abertura muy pequeña a través de la cual la suspensión de insulina es bombeada a alta presión, por ejemplo a aproximadamente 1000 bares o más. Después de salir de la válvula, la suspensión de insulina es sometida a una caída de presión repentina, lo que produce la rotura de los cristales de insulina, es decir un efecto de homogenización. Puesto que la suspensión de insulina es sometida preferiblemente a múltiples ciclos de homogenización para producir una suspensión suficientemente homogénea de microcristales con el tamaño de partícula y la distribución de tamaño deseados, y que la alta presión empleada en el homogeneizador 3 produce un aumento de temperatura de la suspensión, el aparato comprende también preferiblemente un intercambiador térmico 4 corriente abajo del homogeneizador 3 con el fin de reducir la temperatura de la suspensión. Desde el intercambiador térmico 4, la suspensión de insulina vuelve al recipiente receptor 1 para efectuar los otros ciclos de homogenización necesarios.

La temperatura de la suspensión aumenta según la ecuación siguiente:

\DeltaT = P/(c x \delta)

donde:

\DeltaT = aumento de temperatura (°C)

P = presión de suspensión (N x m^{-2})

\delta = densidad de suspensión (g x m^{-3})

c = calor específico (J x g^{-1} x °C^{-1})

La presión y temperatura son controladas durante el proceso, y la ecuación mencionada arriba puede ser empleada en relación al diseño del aparato y la regulación del proceso.

En el método según la invención, la homogenización es realizada normalmente a una presión de al menos aproximadamente 500 bares, preferiblemente de al menos aproximadamente 800 bares, más preferiblemente de al menos aproximadamente 1000 bares. En ciertos casos, la presión puede por ejemplo ser de al menos aproximadamente 1200 bares, por ejemplo hasta aproximadamente 1500 bares o más, aunque estas altas presiones de aproximadamente más de 1000 bares en general son consideradas innecesarias.

En una forma de realización preferida, la homogenización de la suspensión es realizada usando múltiples ciclos de homogenización, es decir, al menos 2 ciclos, ya que se ha comprobado que el uso de múltiples ciclos de homogenización aportan mejores resultados, es decir, la optimización del tamaño y la uniformidad del cristal de germinación. Por lo tanto se considera que normalmente sería ventajoso emplear más de 2 ciclos, como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 ciclos o incluso más, por ejemplo en ciertos casos hasta 15 ó 20 ciclos o quizás incluso más de 20 ciclos. El número de ciclos de homogenización más ventajoso será determinado por el experto en la materia según cada caso individual en base a factores tales como la naturaleza de la suspensión de insulina, la naturaleza del aparato de homogenización utilizado, la presión utilizada para la homogenización, y el tamaño de partícula y la distribución del tamaño deseados del microcristal de insulina.

Puesto que, como se ha indicado anteriormente, la alta presión empleada en el homogeneizador produce un aumento de temperatura de la suspensión, el uso de múltiples ciclos de homogenización está asociado preferiblemente al uso de un intercambiador térmico con el fin de reducir la temperatura de suspensión, de tal manera que la suspensión sea mantenida a una temperatura adecuada a lo largo del proceso de homogenización. Tales intercambiadores térmicos son conocidos en la técnica, y el experto en la materia sabrá adaptar fácilmente las características del intercambiador térmico para adaptar el proceso y aparato previstos. Preferiblemente, la temperatura de la suspensión de insulina reciclada es mantenida en un intervalo de aproximadamente 10-40°C, por ejemplo de aproximadamente
20-35°C.

Aunque el tamaño de partícula de los microcristales de insulina obtenidos varían en función del uso previsto, es frecuente que los microcristales adecuados tengan un tamaño medio de partícula, tal como lo definen las diagonales más largas de los cristales, en la gama de aproximadamente 0,5-4 \mum, por ejemplo de aproximadamente 1-3 \mum.

El resultado del proceso de homogenización es la formación de unos microcristales de insulina humana adecuados para un uso en forma de microcristales de germinación para la producción de productos de insulina cíncica, microcristales cuya característica esencial consiste en no contener insulina pancreática no humana. Para la producción de productos de insulina cíncica, los microcristales de germinación de la invención serán empleados de manera convencional, es decir, que una suspensión no germinada de insulina humana es germinada con la suspensión de microcristales producidos según el modo descrito anteriormente, y se deja proceder la cristalización de manera conocida en sí según la técnica. Como es habitual en la técnica, la cantidad precisa de microcristales a añadir a una suspensión determinada de insulina no germinada puede ser determinada empíricamente.

La invención será ilustrada además por los ejemplos siguientes no limitativos.

Ejemplos Materiales y métodos

Mediante el uso del proceso de homogenización básico y el aparato descrito anteriormente, es decir un homogeneizador de recirculación equipado con un intercambiador térmico, se realizaron varios experimentos para examinar el efecto del número de ciclos de homogenización así como la presión y el tiempo de homogenización.

El aparato empleado era un homogeneizador de alta presión Rannie, modelo LAB 10,51 VH (serie 1.89239), equipado con una válvula cerámica, tipo SEO 719685. La capacidad del homogeneizador era de 80 l/h a una presión de 1000 bares. Una bomba centrífuga proporcionaba una presión de entrada de 4.5-5 bares. El intercambiador térmico para estos experimentos empleó una temperatura del agua de refrigeración de aproximadamente 20°C. No obstante, puesto que la capacidad del intercambiador térmico era insuficiente en relación con este homogeneizador particular, la temperatura de salida de la suspensión de insulina era bastante superior a la salida máxima del homogeneizador, es decir de aproximadamente 28-29°C, pero ligeramente inferior a una salida inferior del homogeneizador de aproximadamente 65 l/h, es decir de aproximadamente 24-28°C. El recipiente receptor comprendía un tanque de presión de
100 l y un pequeño recipiente cónico con un volumen de aproximadamente 3 l.

La suspensión de insulina empleada para producir los microcristales era un lote agrupado (2 x 20 l) de ULTRALENTE no germinado HM(ge), 100 U/ml, de Novo Nordisk A/S.

Ejemplo 1

Una porción de 10 l del lote agrupado de la suspensión de insulina ULTRALENTE fue homogenizada a una presión de 1000 bares, dicha suspensión fue recirculada por múltiples ciclos de homogenización tal como se ha descrito anteriormente, produciendo un grado de aumento gradual de homogenización. Se utilizó un caudal de 80 l/h. Se realizó un total de 18 ciclos de homogenización, y se tomaron muestras de los 10 primeros ciclos y después del ciclo final. La temperatura de la suspensión de insulina fue medida en el conducto de salida entre el homogeneizador y el intercambiador térmico. Los periodos de tiempo y las temperaturas medidas para los diversos ciclos fueron los indicados a continuación en la Tabla 1:

TABLA 1

1

Se examinaron varias muestras al microscopio, y se hicieron las siguientes observaciones:

: Ejemplo 1-0: la mayoría de los cristales romboédricos enteros y afilados tienen un tamaño de aproximadamente 3-80 \mum; algunos cristales rotos y fragmentos de cristal.

: Ejemplo 1-1: aún hay muchos cristales enteros romboédricos con un tamaño de aproximadamente 20-40 \mum, pero también muchos pequeños fragmentos de cristal con un tamaño de 3 \mum o menos.

: Ejemplo 1-2: aún hay algunos cristales enteros romboédricos con un tamaño de hasta aproximadamente 20 \mum así como algunas aglomeraciones de cristal de hasta aproximadamente 40 \mum; incluso más fragmentos pequeños de cristal de 3 \mum o menos.

: Ejemplo 1-18: pequeños microcristales de aproximadamente 1 \mum o menos; unos pocos fragmentos de cristal de hasta aproximadamente 10 \mum; cristales romboédricos no enteros.

Ejemplo 2

Una porción de 5 l del lote agrupado de la suspensión de insulina ULTRALENTE fue homogenizada a una presión de 1000 bares, suspensión que es recirculada por múltiples ciclos de homogenización según el modo descrito anteriormente, usando un caudal de 65 l/h. Se realizó un total de 10 ciclos de homogenización y se tomaron unas muestras después de cada ciclo. En este caso, en vez de volver directamente al recipiente receptor del intercambiador térmico, la suspensión fue recogida después de cada ciclo. Se tomó una muestra de cada porción, y el resto de la porción fue devuelta al recipiente receptor para el siguiente ciclo de homogenización. Los tiempos y temperaturas medidos aparecen citados a continuación:

TABLA 2

2

Ejemplo 3

Para examinar el efecto de la presión de homogenización, se realizaron unas pruebas con 1400-1500 bares, con un total de 9 ciclos de homogenización. Debido a la elevada presión y a la elevada temperatura asociada de la suspensión, se redujo más el caudal a 54 l/h para que el intercambiador térmico pudiera proporcionar una temperatura suficientemente reducida. El tamaño de lote en este caso fue 3 1. La temperatura de la suspensión fue mantenida a aproximadamente 26-29°C.

TABLA 3

3

Ejemplo 4

Se empleó el mismo procedimiento que el del ejemplo 3, con la excepción en este caso de que la suspensión de insulina ULTRALENTE formó cristales divergentes ("rosas") durante la cristalización. El tamaño de lote era 2 1, y el tiempo de homogenización en consecuencia se redujo correspondiendo a un total de 21 minutos.

TABLA 4

4

Ejemplo 5 Experimentos de germinación con lotes seleccionados de microcristales

Los experimentos de germinación fueron realizados para probar los lotes seleccionados de microcristales de insulina humana preparados según el modo descrito anteriormente. Como referencia también se sometió a prueba un lote de germinación estándar de microcristales bovinos. Estos experimentos fueron realizados usando lotes de 1 l de ULTRALENTE (40 U/ml). Se realizó la cristalización usando una agitación con hélice durante un periodo de 20 horas. Los resultados son mostrados a continuación en la Tabla 5.

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TABLA 5

5

Se puede ver de los resultados de la Tabla 5 que los microcristales de insulina humana preparados según la invención proporcionan un tamaño de cristal de insulina y una desviación comparable a la que se obtiene usando microcristales bovinos estándares, y que los cinco lotes de germinación presentan resultados extremadamente idénticos.

Los cinco lotes de insulina preparados según el modo descrito anteriormente fueron analizados también con respecto a varios otros parámetros, incluyendo pH, resistencia a la insulina, componente A+M+B, porcentaje de insulina amorfa, contenido de parahidroxibenzoato metílico, contenido dimérico y polimérico, contenido de desamido insulina ácida y neutra, y contenido de zinc. Se descubrió que los lotes de insulina preparada mediante el uso de microcristales según la invención en general eran comparables a la insulina preparada usando microcristales bovinos estándares.

Desde que se conoce el hecho de que el tiempo de cristalización y el tipo de agitación pueden tener un efecto en la apariencia de los romboedros formados, un único lote preparado según la invención (ejemplo 3-9) fue empleado para las pruebas de germinación en las que se varió el tiempo de cristalización y el tipo de agitación. En cuanto a la agitación, no se observó ninguna diferencia sustancial entre los cristales obtenidos usando una agitación con hélice y una agitación de "vaivén". En referencia al tiempo de cristalización, se comprobó que 4 horas eran suficientes, es decir que un tiempo de cristalización de 20 horas era inútil. Existía una tendencia a obtener mejores resultados empleando una agitación con hélice y un tiempo de cristalización de 4 horas, ya que esto implicaba la cantidad mínima de cristales de desviación.

Conclusión

Se puede llegar a la conclusión de que se pueden producir microcristales puros de insulina humana por homogenización de alta presión de una preparación de ULTRALENTE no germinada HM(ge). Con este método se obtienen microcristales en forma de pequeños fragmentos de cristal con un tamaño de partícula de aproximadamente 1-2 \mum y unos fragmentos bastante más grandes con un tamaño de partícula de hasta aproximadamente 10 \mum.

El hecho de variar la presión de 1000 bares a aproximadamente 1500 bares no tuvo ningún efecto notable sobre los microcristales. En cambio, el número de ciclos de homogenización tiene un efecto, al menos hasta cierto punto, con un número en aumento de ciclos produciendo una suspensión de microcristales más uniforme con una proporción mayor de microcristales con un tamaño de aproximadamente 1-2 \mum y una proporción menor de fragmentos de cristal más grandes y cristales enteros romboédricos.

No obstante, el número de ciclos de homogenización requerido para obtener un grado determinado de homogenización también está relacionado con el tiempo de homogenización por ciclo.

El aumento de temperatura de la suspensión medido durante estos experimentos como resultado del proceso de homogenización no parecía tener efecto en los microcristales en relación con la degradación química. La regulación de la temperatura puede ser optimizada mediante unos cambios adecuados, por ejemplo del diseño y de la capacidad del intercambiador térmico.

La variación del tamaño de partícula de los microcristales producidos durante estas pruebas, así como la variación del tamaño de partícula del producto de insulina cíncica preparado mediante el uso de los microcristales, puede, si se desea o en caso de necesidad, reducirse mediante por ejemplo sedimentación o centrifugado.

Las cualidades de germinación de los microcristales producidos según la invención se han determinado aceptables, ya que los microcristales producen productos de insulina cíncica con cristales romboédricos que presentan un tamaño de cristal aceptable.

Claims

1. Método de producción de microcristales de germinación para producir un péptido o proteína, donde el péptido o proteína es seleccionado del grupo compuesto de insulina y análogos o derivados de ésta, comprendiendo el suministro de una suspensión no germinada de dicho péptido o proteína y la homogenización de dicha suspensión bajo presión para producir microcristales peptidicos o proteicos adecuados para un uso en forma de microcristales de germinación para la producción de dicho péptido o proteína.

2. Método según la reivindicación 1 para producir microcristales de germinación para la producción de insulina humana, donde dichos microcristales no contienen insulina pancreática no humana, comprendiendo el suministro de una suspensión no germinada de insulina humana, donde dicha suspensión no contiene insulina pancreática no humana, y la homogenización de dicha suspensión de insulina bajo presión para producir microcristales de insulina humana adecuados para un uso en forma de microcristales de germinación para la producción de productos de insulina cíncica.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, donde la homogenización se realiza a una presión de al menos 500 bares.

4. Método según cualquiera de reivindicaciones 1-3, donde la homogenización se realiza usando múltiples ciclos de homogenización.

5. Método según la reivindicación 4, donde la temperatura de la suspensión durante dicha fase de homogenización es controlada usando un intercambiador térmico.

6. Método según la reivindicación 5, donde la temperatura de la suspensión durante dicha fase de homogenización es mantenida en el intervalo de 10-40°C.

7. Método para la producción de microcristales con un tamaño medio de partícula, definido por la diagonal más larga de los cristales, en el intervalo de aproximadamente 0,5-4 \mum aplicando las fases tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Método para la producción de un producto peptídico o proteico donde el péptido o proteína es seleccionado del grupo compuesto de insulina y análogos o derivados de ésta, comprendiendo dicho método (i) el suministro de una primera suspensión no germinada de dicho péptido o proteína; (ii) la homogenización de dicha suspensión no germinada bajo presión para producir microcristales de dicho péptido o proteína; y (iii) la germinación de una segunda suspensión no germinada de dicho péptido o proteína con los microcristales producidos en la fase ii.

9. Método según la reivindicación 8, donde el producto peptídico o proteico a producir es un producto de insulina cíncica, las primeras y las segundas suspensiones no germinadas son suspensiones de insulina humana, y los microcristales de germinación son microcristales de insulina humana.