ES2273664T3 - Preparaciones microbianas mejoradas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para preparar una preparación microbiana que tiene un incrementado porcentaje de supervivencia/recuperación en un producto, comprendiendo el procedimiento los pasos de producir o cultivar microbios en medios basados en almidón resistente o que lo contengan, y recolectar los microbios cultivados, teniendo los microbios recolectados un incrementado porcentaje de supervivencia/recuperación al ser posteriormente incorporados a un producto en comparación con los mismos microbios producidos o cultivados en un medio carente de almidón resistente.
Description
Preparaciones microbianas mejoradas.
La presente invención se refiere en general a un
procedimiento para preparar una preparación microbiana que contiene
microbios que tienen incrementados porcentajes de
supervivencia/recuperación en uso. Las preparaciones microbianas
que pueden ser obtenidas mediante el procedimiento son
particularmente adecuadas para su inclusión en preparaciones
prebióticas y probióticas y en productos entre los que se incluyen
los productos alimentarios, los productos de alimentación animal,
los productos nutracéuticos y los productos farmacéuticos que
contienen microorganismos probióticos y los productos fermentados
por microorganismos añadidos a los mismos.
Los productos probióticos realizados por ejemplo
en forma de soluciones, polvos, tabletas y cápsulas son
administrados oralmente para mejorar la salud. Análogamente, los
comestibles son consumidos no tan sólo para el sustento, sino
también para obtener adicionales beneficios para la salud tal como
mediante la adición de microorganismos probióticos. Los piensos
para animales están también siendo preparados con microorganismos
probióticos añadidos a los mismos a fin de contribuir al desarrollo
y al rendimiento de los animales. Las recientes tendencias al
consumo de composiciones probióticas para obtener beneficios para la
salud han conducido al uso de microorganismos probióticos en las de
una variedad de preparaciones, así como a la inclusión de los mismos
en los de una extensa gama de productos alimentarios y de
alimentación animal elaborados entre los que se incluyen los
productos lácteos elaborados. Los microorganismos son también
añadidos como cultivos de arranque a fin de producir una serie de
comestibles fermentados, como p. ej. productos lácteos, cárnicos y
vegetales.
En el sentido que se le da en esta descripción,
un probiótico o microorganismo probiótico es un suplemento
microbiano vivo para el pienso que afecta beneficiosamente al animal
huésped mejorando su equilibrio microbiano intestinal. Ésta es la
definición que da R. Fuller (AFRC Institute of Food Research,
Reading Laboratory, R.U.) en el Journal of Applied Bacteriology,
1989, 66, pp. 365-378 "Probiotics in Man and
Animals - A Review", y la misma se ha hecho posteriormente
extensiva a los suplementos y a los comestibles para los humanos. Un
probiótico o microorganismo probiótico también incluye a un
suplemento microbiano o a una preparación farmacéutica microbiana
que puede ser administrado(a) a la cavidad nasal o al tracto
vaginal y afecta beneficiosamente al animal huésped mejorando su
equilibrio microbiano en el respectivo sitio de administración.
La constitución y la cantidad de la microflora
intestinal pueden verse influenciadas por estados de estrés
inducido por enfermedad, por el estilo de vida, por los viajes y por
otros factores. Si los microorganismos que afectan positivamente a
la salud y al bienestar del individuo pueden ser estimulados a
poblar el intestino grueso, esto debería mejorar el bienestar
fisiológico del huésped.
La introducción de microorganismos beneficiosos
o probióticos es normalmente llevada a cabo mediante la ingestión
de los microorganismos en comestibles, bebidas, productos lácteos
fermentados tales como yogures, cápsulas, dulces y otras formas de
tal manera que el organismo llega en estado viable al intestino
grueso o a otro sitio de interés en el huésped.
Un problema que se tiene con la inclusión de
microorganismos probióticos en productos alimentarios elaborados es
el de que los microorganismos a menudo no pueden sobrevivir en el
producto alimentario por espacio de cualquier periodo de tiempo.
Durante la producción y el almacenamiento de los productos
alimentarios, a menudo se produce una considerable disminución de
los números de microorganismos viables. Por ejemplo, la habitual
duración de conservación de los productos lácteos se calcula sobre
la base del periodo de tiempo que puede transcurrir antes de que se
estropee el producto. Cuando se añaden microorganismos probióticos a
estos productos, la duración de conservación que se indica para el
producto puede no ser aplicable con respecto al suministro del
deseado número de microorganismos al intestino para obtener el
efecto beneficioso requerido.
Brown et al. han descrito que si ratones
ingieren microorganismos beneficiosos junto con almidón de maíz rico
en amilosa (un prebiótico), pueden encontrarse en sus heces mayores
números de organismos beneficiosos; en "High amylose maize starch
as a versatile prebiotic for use with probiotic bacteria" Food
Australia, 50(12) 1998 pp. 603-610. Sus
experimentos indican que los gránulos de almidón actúan como un
vehículo para proteger a los microorganismos frente a los estados
hostiles/estreses que se dan en el tracto gastrointestinal.
Otros usos de microbios incluyen el biocontrol y
la biorremediación. Preparaciones microbianas que incluyesen
microbios que fuesen adecuados para estos usos y tuviesen un
incrementado potencial de producción/desarrollo o unos
incrementados porcentajes de supervivencia/recuperación
constituirían una ventaja. Por ejemplo, ciertas cepas de
Bifidobacterium y L. acidophilus son activas contra
Escherichia coli y Salmonella spp, lo cual significa
que las bacterias tienen aplicaciones como agentes de biocontrol.
Otros microbios también tienen aplicaciones de biocontrol, como por
ejemplo varias especies de hongos y Bacillus. Además, se sabe
de las Pseudomonadas que son eficaces para la biorremediación, y la
presente invención es aplicable para promover su supervivencia.
Otro microbio de biorremediación que es usado comúnmente es el del
género Alcaligenes.
Los presentes inventores han hecho el
sorprendente descubrimiento de que la inclusión de almidón
resistente que esté en forma de o haya sido sacado de almidones que
contengan fibra dietaria en el medio de cultivo para los
microorganismos puede incrementar el desarrollo y la producción de
los microorganismos, así como incrementar la supervivencia de los
microorganismos en preparaciones microbianas o cultivos de arranque
y en productos alimentarios y de alimentación animal durante la
producción y durante la duración de conservación de estos
productos, y mejorar el porcentaje de supervivencia de los microbios
durante el tránsito por el tracto digestivo.
La fibra dietaria está definida según la
medición de la AOAC (Asociación (Internacional) de la Química
Analítica Oficial) para la fibra dietaria Total en los comestibles:
método enzimo-gravimétrico (Método 985.29). Assoc.
Off. Anal. Chemists, Offical Methodos of Analysis, 16ª Ed.,
Arlington VA, EE.UU., 1995. La adicional adición de almidón
resistente a las preparaciones microbianas tras el cultivo del
microbio también acrecienta adicionalmente la robustez de los
microbios, conduciendo por consiguiente a una acrecentada
supervivencia de los microorganismos. El descubrimiento es también
aplicable a las preparaciones de biocontrol y biorremediación, así
como a los comestibles fermentados mediante la adición de
microorganismos y a los cultivos de arranque, puesto que pueden
también producirse cultivos de arranque más robustos mediante el
cultivo sobre medio con almidón resistente y/o mediante la adición
de almidón resistente a los productos subsiguientes que se han
descrito anteriormente.
Según un primer aspecto de la presente
invención, se aporta un procedimiento para preparar una preparación
microbiana que tiene un incrementado porcentaje de
supervivencia/recuperación en un producto, comprendiendo el
procedimiento los pasos de producir o cultivar microbios en medios
basados en almidón resistente o que lo contengan, y recolectar los
microbios cultivados, teniendo los microbios recolectados un
incrementado porcentaje de supervivencia/recuperación al ser
posteriormente incorporados a un producto en comparación con los
mismos microbios producidos o cultivados en un medio carente de
almidón resistente.
Preferiblemente, el producto es un producto
alimentario, un producto de alimentación animal, un producto
nutracéutico, un producto farmacéutico, un producto de biocontrol o
un producto de biorremediación.
Una forma de almidón resistente que es
particularmente adecuada para la presente invención es la del
almidón que contiene almidón resistente, y particularmente la de
los almidones de maíz ricos en amilosa o los materiales derivados
de almidones de maíz ricos en amilosa.
Se ha descubierto que el cultivo en medios
basados en almidón resistente o que lo contengan parece acrecentar
la capacidad de los microbios para fijarse al almidón resistente
adicional añadido al producto, acrecentando por consiguiente el
potencial de desarrollo/producción, o dando lugar a un incrementado
porcentaje de supervivencia/recuperación de los microbios.
Los microbios que se usan en el procedimiento de
la presente invención o los microbios que están presentes en la
preparación microbiana mejorada que puede ser obtenida mediante un
procedimiento de la presente invención pueden ser particularmente
resistentes a la aireación, al cizallamiento, al secado por
congelación, a la congelación, al secado incluyendo la alta, la
mediana y la baja hidroactividad, a las temperaturas elevadas, a las
bajas temperaturas, a la presión y a las fluctuaciones de presión,
al bajo pH, al alto pH, a los ácidos biliares, a la humedad, a la
alta o baja osmolaridad, a las condiciones altamente salinas o a
combinaciones de dichas condiciones.
Los microbios que se usan en el procedimiento de
la presente invención o la preparación microbiana que puede ser
obtenida mediante un procedimiento según la presente invención son
particularmente adecuados para ser usados en probióticos, cultivos
de arranque y agentes de biocontrol o biorremediación.
Según un segundo aspecto de la presente
invención, se aporta una preparación microbiana que contiene
microbios que tienen un incrementado porcentaje de
supervivencia/recuperación en el producto en comparación con los
mismos microbios producidos o cultivados en un medio carente de
almidón resistente y que puede ser preparada mediante el
procedimiento según el primer aspecto de la presente invención.
Según un tercer aspecto de la presente
invención, se aporta un producto que contiene microbios que tienen
un incrementado porcentaje de supervivencia/recuperación en
comparación con los mismos microbios producidos o cultivados en un
medio que carezca de almidón resistente, incluyendo el producto una
preparación microbiana según el segundo aspecto de la presente
invención.
Preferiblemente, el producto es un producto
alimentario, un producto de alimentación animal, un producto
nutracéutico, un producto farmacéutico o un producto de biocontrol
o biorremediación.
Según un cuarto aspecto de la presente
invención, se aporta el uso de almidón resistente en medios de
cultivo microbiano para producir microbios que al ser
posteriormente usados en un producto tras haber sido recolectados a
partir del medio tienen un incrementado porcentaje de supervivencia
en comparación con los mismos microbios producidos o cultivados en
medios carentes de almidón resistente.
Una forma de almidón resistente que es
particularmente adecuada para la presente invención es la del
almidón que contiene almidón resistente. Preferiblemente, los
almidones tienen un contenido de amilosa de al menos un 40% (en
peso). En una forma preferida, el almidón es de maíz que tiene un
contenido de amilosa de al menos un 70% (en peso), al menos un 80%
(en peso) o al menos un 90% (en peso). El almidón puede también ser
tratado o modificado químicamente, físicamente o enzimáticamente.
La modificación química puede ser por oxidación, reticulación,
eterificación, esterificación, acidificación, dextrinización o
mezclas de estos procesos.
Los almidones pueden también ser tratados para
incrementar el contenido de almidón resistente utilizando para ello
una serie de medios físicos o químicos. Unos medios preferidos son
los que consisten en calentar el almidón en presencia de humedad
(tratamiento con calor y humedad), lo cual puede lograrse mediante
una serie de procedimientos entre los cuales se incluye el de
efectuar un calentamiento bajo presión negativa, atmosférica o
positiva y en condiciones de elevada humedad, o las técnicas de
ciclación pasando por distintas temperaturas y presiones. El
calentamiento puede ser efectuado a temperaturas del orden de 100 a
180ºC, y preferiblemente de poco más o menos 120 a 150ºC, y los
niveles de humedad pueden ser de un 10 a un 80%, y preferiblemente
de un 20 a un 60%. Puede también usarse para incrementar el
contenido de almidón resistente de los almidones el repetido
autoclaveado y el enfriamiento rápido. Se comprenderá que estos
procedimientos y condiciones pueden ser modificados para alcanzar
el deseado incremento del nivel de almidón resistente en el almidón
que se trate.
El tratamiento puede también ser el consistente
en la técnica de extracción con disolvente para retirar del almidón
las grasas y/o los minerales.
Hay una variedad de microorganismos probióticos
que son adecuados para ser usados en esta invención, estando
incluidos entre los mismos levaduras tales como Saccharomyces
y bacterias tales como las de los géneros Bifidobacterium,
Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Propionibacterium,
Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus,
Leuconostoc, Peptostreptococcus y Lactobacillus. La
invención no queda sin embargo limitada a estos microorganismos
específicos.
Aunque sin quedar limitados a las mismas, los
cultivos de arranque preferiblemente incluyen bacterias del ácido
láctico incluyendo los géneros lactobacillus, lactococcus y
streptococcus, leuconostoc y levaduras.
Preferiblemente, los microorganismos que son
adecuados para ser usados en productos de biocontrol o
biorremediación incluyen bifidobacterias, acidophilus,
hongos, especies de Bacillus, pseudomonadas y Alcaligenes. Se
entenderá, sin embargo, que otras especies de microorganismos
serían también candidatos adecuados para el uso según la presente
invención.
Tales sistemas pueden también incluir
microorganismos de distintas cepas o especies, incluyendo a no
utilizadores de almidón, para interactuar y demostrar un mejorado
desarrollo y/o actividad en el intestino grueso, el tracto nasal o
el tracto vaginal.
En una realización preferida de los aspectos
primero, segundo, tercero y cuarto de la presente invención, las
preparaciones microbianas son cultivos de arranque o preparaciones
probióticas que pueden ser líquidos, congelados o secados. Las
preparaciones pueden también incluir productos alimentarios y de
alimentación animal que contengan otros aditivos microbianos. Estos
productos incluyen productos de base fluida o de base sólida. Los
productos alimentarios de base fluida incluyen productos lácteos en
los que el ingrediente comestible es uno o varios ingredientes
lácteos entre los que se incluyen la leche entera, los sólidos de la
leche, la grasa de leche, la crema, la leche secada sin grasa y
cualquier otro componente o derivado de la leche que pueda ser
usado en productos lácteos, fluidos basados en agua, extractos de
cereales y plantas tales como aditivos y bebidas basados en soja.
Los productos alimentarios de base sólida incluyen las barras de
tentempié, los cereales para desayuno, el pan, los dulces, los
productos alimentarios extrusionados, las barras de muesli, los
bollos, las galletas, las pellas de pienso, los productos
alimentarios recubiertos, las tabletas, los aditivos alimentarios,
los suplementos para la salud y las preparaciones farmacéuticas.
Los productos alimentarios según el tercer
aspecto de la presente invención incluyen todo producto alimentario
que sea adecuado para contener y suministrar microorganismos
probióticos. Aunque sin quedar limitados a los mismos, los ejemplos
incluyen los comestibles, las bebidas frutales, los cubitos de agua,
los dulces, los recubrimientos o coberturas, los yogures, las
bebidas de yogur, las bebidas no fermentadas, las bebidas lácteas
saborizadas, las bebidas lácteas modificadas, los helados y los
postres lácteos.
Los métodos estándar que se emplean en la
técnica pueden ser usados para preparar los productos alimentarios,
de alimentación animal, nutracéuticos o farmacéuticos según el
cuarto aspecto de la presente invención. El almidón resistente
puede ser añadido por separado, en combinación con uno o varios de
los ingredientes que formen parte del producto alimentario. Al ser
añadido por separado, el almidón resistente puede interactuar
positivamente y/o sinérgicamente con otros ingredientes de los
productos alimentarios, de alimentación animal, nutracéuticos
o
farmacéuticos.
farmacéuticos.
\newpage
El incremento del porcentaje de supervivencia de
los microbios en el producto se refiere a un incremento sobre el
previsto porcentaje de supervivencia del mismo microbio en un
producto similar que no contiene los microbios cultivados en
almidón resistente.
En una forma preferida, el almidón resistente es
de la gama de productos de almidón resistente
Hi-maize^{MF} y Culture Pro^{MF} (MF = Marca de
Fábrica). El almidón resistente puede ser usado en medios de cultivo
a una concentración de aproximadamente un 0,01 a un 10% (en peso) y
en subsiguientes adiciones durante la preparación de las
preparaciones microbianas y en productos alimentarios, de
alimentación animal, nutracéuticos o farmacéuticos líquidos.
Preferiblemente, el almidón resistente es usado a una concentración
de un 0,1 a un 5% (en peso), y más preferiblemente a una
concentración de poco más o menos un 1% (en peso). El almidón que
contiene almidón resistente y/o fibra dietaria puede ser usado en
productos alimentarios, de alimentación animal, nutracéuticos o
farmacéuticos secos y en preparaciones microbianas secas a una
concentración de aproximadamente un 0,1 a un 90% (en peso) de la
preparación o del producto total. Preferiblemente, el almidón es
usado a una concentración de aproximadamente un 1 a un 10% (en
peso).
El almidón resistente ha resultado ser
particularmente adecuado en comestibles basados en fluido a una
concentración de un 0,1 a un 5% en peso/volumen, en comestibles de
base sólida a una concentración de un 0,1 a un 15% (en peso), y en
productos de alimentación animal, nutracéuticos o farmacéuticos a
una concentración de un 0,1 a un 95% (en peso).
Una ventaja adicional del uso de almidón
resistente es la de que también puede añadirse almidón resistente
adicional en cualquier etapa durante la elaboración del producto
alimentario, de alimentación animal, nutracéutico o farmacéutico.
Las propiedades del almidón resistente no se ven afectadas
negativamente por los procesos que intervienen en la producción de
los productos elaborados. Una clara ventaja es la de que no hay
necesidad de añadir el almidón resistente en forma estéril al final
del proceso. El producto puede ser sometido a pasteurización o a un
tratamiento similar sin la preocupación de afectar negativamente las
propiedades de los almidones.
En el sentido en el que se la utiliza en esta
descripción, la expresión "almidón resistente" incluye las
formas definidas como RS1, RS2, RS3 y RS4 según se define en Brown,
McNaught and Moloney (1995) Food Australia 47:
272-275. Pueden usarse en la presente invención
almidones resistentes modificados o no modificados o mezclas de los
mismos.
En los documentos WO 94/03049 y WO 94/14342 se
describen almidones ricos en amilosa que son almidones resistentes
e incluyen almidón de maíz que tiene un contenido de amilosa de un
50% (en peso) o más, y en particular de un 80% (en peso) o más,
almidón de arroz que tiene un contenido de amilosa de un 27% (en
peso) o más, o un almidón de trigo que tiene un 35% (en peso) o
más. Están además incluidas determinadas gamas de tamaños granulares
de almidones que tienen un contenido de amilosa de un 50% o más y
un acrecentado contenido de almidón resistente, incluyendo estos
almidones los de maíz, cebada y legumbres. Sin embargo, esta
invención no queda limitada a estas formas de almidón resistente.
Por ejemplo, otras formas de almidón resistente se derivan de
fuentes tales como los plátanos y tubérculos tales como patatas y
formas modificadas de los mismos.
Las modificaciones químicas tales como las que
se efectúan por oxidación, reticulación, eterificación,
esterificación, acidificación, dextrinización y procesos similares
son perfectamente conocidas en este ramo de la técnica como
adecuados tratamientos químicos. Análogamente, otras modificaciones
pueden ser inducidas físicamente, enzimáticamente o bien por otros
medios que son perfectamente conocidos para los expertos en la
materia.
Puede también ser útil modificar el grado de
susceptibilidad enzimática del almidón resistente a base de alterar
la conformación o la estructura del almidón. Los ejemplos incluyen
la dilución con ácidos o enzimas y la reticulación usando reactivos
difuncionales, el tratamiento con calor y humedad y la
recristalización térmica. La modificación del almidón puede ser
también efectuada mediante una manipulación de la naturaleza
cristalina del almidón. Tales métodos de modificación son conocidos
en la técnica, y los almidones producidos por estos métodos serían
adecuados para la presente invención.
Preferiblemente, los almidones resistentes se
sacan o se obtienen del maíz. Se entenderá, sin embargo, que en la
presente invención podrían usarse otras fuentes de almidón
resistente. Los ejemplos incluyen cereales tales como sorgo, trigo,
cebada, avena y arroz, tubérculos tales como patatas y tapioca,
legumbres tales como guisantes, y otros incluyendo almidones
sacados de especies vegetales modificadas genéticamente.
En el sentido en el que se les utiliza en la
presente, los vocablos "Hi-maize^{MF}" y
"Culture Pro^{MF}" se refieren a productos que son obtenidos
de almidón rico en amilosa que contiene más de un 70% de amilosa y
son suministrados por la Starch Australasia Limited. Están descritos
en el documento AU 660560 almidones ricos en amilosa que contienen
almidón resistente adecuado para la presente invención.
En toda esta descripción y a no ser que el
contexto requiera otra cosa, se entenderá que el vocablo
"comprenden" o variaciones del mismo tales "comprende" o
"comprendiendo" implican la inclusión del elemento, entero o
paso que se indique o del correspondiente grupo de elementos,
enteros o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro elemento,
entero o paso o grupo de elementos, enteros o pasos.
A fin de que pueda entenderse más claramente la
presente invención, se describen a continuación formas preferidas
de la misma haciendo referencia a los siguientes ejemplos y
dibujos.
La Figura 1 muestra el cultivo de
Bifidobacterium de la cepa D con y sin almidón.
La Figura 2 muestra el cultivo de
Bifidobacterium de la cepa E con y sin almidón.
La Figura 3 muestra el cultivo de
Bifidobacterium de la cepa C con y sin almidón.
La Figura 4 muestra la
supervivencia/recuperación de microbios cultivados en almidón en una
bebida de base probiótica evaluada para Bifidobacterium de
la cepa C que había sido cultivada en presencia de glucosa (0,5%) o
de Almidón 1 (0,25%) + glucosa (0,25%) o de Almidón 2 (0,5%) o de
Almidón 2 (0,25%) + glucosa (0,25%).
La Figura 5 muestra la
supervivencia/recuperación de microbios cultivados en almidón en una
bebida láctea fermentada tipo yogur evaluada para
Bifidobacterium de la cepa C que había sido cultivada en
presencia de glucosa (0,5%) o de Almidón 1 (0,25%) + glucosa
(0,25%) o de Almidón 2 (0,5%) o de Almidón 2 (0,25%) + glucosa
(0,25%).
La Figura 6 muestra la
supervivencia/recuperación de microbios cultivados en almidón en
zumo de naranja evaluado para Bifidobacterium de la cepa C
que había sido cultivada en presencia de glucosa (0,5%) o de Almidón
1 (0,25%) + glucosa (0,25%) o de Almidón 2 (0,5%) o de Almidón 2
(0,25%) + glucosa (0,25%).
La Figura 7 muestra la
supervivencia/recuperación de microbios cultivados en almidón en
bebida de base probiótica con la inclusión de almidón resistente
adicional evaluada para Bifidobacterium de la cepa C que
había sido cultivada en presencia de glucosa (0,5%) o de Almidón 1
(0,25%) + glucosa (0,25%) o de Almidón 2 (0,5%) o de Almidón 2
(0,25%) + glucosa (0,25%).
La Figura 8 muestra la
supervivencia/recuperación de microbios cultivados en almidón en
producto lácteo fermentado tipo yogur con inclusión de almidón
resistente adicional evaluado para Bifidobacterium de la cepa
C que había sido cultivada en presencia de glucosa (0,5%) o de
Almidón 1 (0,25%) + glucosa (0,25%) o de Almidón 2 (0,5%) o de
Almidón 2 (0,25%) + glucosa (0,25%).
La Figura 9 muestra la
supervivencia/recuperación de microbios cultivados en almidón en
zumo de naranja con la inclusión de almidón resistente adicional
evaluado para Bifidobacterium de la cepa C que había sido
cultivada en presencia de glucosa (0,5%) o de Almidón 1 (0,25%) +
glucosa (0,25%) o de Almidón 2 (0,5%) o de Almidón 2 (0,25%) +
glucosa (0,25%).
La Figura 10 muestra la
supervivencia/recuperación de las cepas expuestas a un ciclo de
congelación-descongelación tras el cultivo en
presencia de almidón resistente. La Bifidobacterium de la
cepa C había sido cultivada en presencia de glucosa (0,5%) o de
Almidón 1 (0,5%) o de Almidón 1 (0,25%) + glucosa (0,25%).
La Figura 11 muestra la
supervivencia/recuperación de las cepas expuestas a un ciclo de
congelación-descongelación tras el cultivo en
presencia de almidón resistente. La Bifidobacterium de la
cepa C había sido cultivada en presencia de Almidón 1 (0,25%) +
glucosa (0,25%) con adición de adicional Almidón 1.
La Figura 12 muestra la
supervivencia/recuperación de las cepas expuestas a un ciclo de
congelación-descongelación tras el cultivo en
presencia de almidón resistente. La Bifidobacterium de la
cepa C había sido cultivada en presencia de Almidón 2 (0,5%) con
adición de adicional Almidón 1.
La Figura 13 muestra la supervivencia de
Bifidobacterium de la cepa C cultivada en presencia de
glucosa (0,5%) o de Almidón 1 (0,25%) + glucosa (0,25%) o de
Almidón 2 (0,5%) o de Almidón 2 (0,25%) + glucosa (0,25%) y puesta
luego en varios tipos de yogures sin almidón añadido.
La Figura 14 muestra la supervivencia de
Bifidobacterium de la cepa C cultivada en presencia de
glucosa (0,5%) o de Almidón 1 (0,25%) + glucosa (0,25%) o de
Almidón 2 (0,5%) o de Almidón 2 (0,25%) + glucosa (0,25%) y puesta
en varios tipos de yogures con almidón añadido.
Los presentes inventores han descubierto que la
inclusión de almidón resistente en medios de cultivo microbiano y
opcionalmente en subsiguientes etapas de la producción de
preparaciones microbianas que contienen los microbios cultivados en
presencia de almidón resistente redundaba en un sorprendente e
inesperado incremento del crecimiento, de la recuperación y/o de la
supervivencia de los microbios durante la producción y el
almacenamiento de las preparaciones y los productos.
Bacterias del género Bifidobacterium y de la
cepa Lafti^{MF} 13B fueron cultivadas anaeróbicamente en un medio
de agar basal (BM) suplementado con un 1% (en peso) de glucosa o de
almidón resistente (Culture Pro^{MF}). Tras el cultivo, las
células fueron recolectadas de las placas usando salina tamponada
con fosfato (PBS), y se procedió a mezclar partes alícuotas con PBS
o bien con PBS que contenía los gránulos de almidón (10% en peso).
Fueron secadas por congelación partes alícuotas de las mezclas. La
susceptibilidad de las células Lafti^{MF} 13B al bajo pH fue
evaluada añadiendo las mezclas bacterianas antes del secado por
congelación y rehidratadas después del secado por congelación a
tampón de glicina a un pH de 3,5. Las células viables fueron
contadas determinando las unidades formadoras de colonias usando
placas de Triptona-Extracto de
Levadura-Pectona (TYP) al ser efectuada la adición a
un pH de 3,5 y tras 3 horas. Se presenta en la Tabla 1 la reducción
de la viabilidad a lo largo de las 3 horas. Se observó que las
células cultivadas en presencia de almidón eran más resistentes, y
que la inclusión del almidón acrecentaba adicionalmente la
resistencia.
| Presencia de almidón tras el cultivo | Reducción de la viabilidad | |
| Células cultivadas con glucosa | - | 26 x 10^{2} |
| células cultivadas con glucosa | + | 15 x 10^{2} |
| Células cultivadas con almidón | - | 26 |
| Células cultivadas con almidón | + | 5 |
Bacterias del género Bifidobacterium y de la
cepa Lafti^{MF} 13B fueron precultivadas en caldo Basal (BM)
suplementado con un 1% en peso/volumen de glucosa o gránulos de
almidón de maíz rico en amilosa (Culture Pro^{MF}). Los cultivos
cultivados anaeróbicamente fueron inoculados (10 \mul) en agar BM
o en caldo, conteniendo ambos medios un 1% (en peso/volumen) de
glucosa o Culture Pro^{MF}. Las placas fueron inoculadas
puntualmente o extendidas, y fueron luego incubadas anaeróbicamente
por espacio de 48 horas. El cultivo en caldo o las células
recolectadas de las placas extendidas fueron cuantificados contando
las unidades formadoras de colonias (CFU). El cultivo en placas
inoculadas puntualmente fue cuantificado midiendo el tamaño de la
colonia, así como el tamaño de la zona despejada en torno a la
colonia, que era indicativo de la utilización del almidón por parte
de las células de Bifidobacterium. Se observó que la cepa
Lafti^{MF} 13B crecía más rápidamente en medio con contenido de
almidón al ser precultivada usando medio con contenido de almidón, y
producía mayores colonias y zonas despejadas en las placas de agar
que contenían almidón. Además, era mayor la producción de los medios
con contenido de almidón, en comparación con los medios con glucosa,
para las células precultivadas tanto en caldo de control (glucosa)
como en caldo con almidón.
La recuperación de microorganismos viables tras
el cultivo en presencia de almidón era más alta y más rápida que la
correspondiente a los controles de glucosa.
El cultivo en medios con almidón acrecentaba la
producción de microorganismos tras la exposición a condiciones de
estrés, como es por ejemplo el caso de la exposición a un bajo pH, a
los ácidos biliares, a ácidos, al calor, a la humedad, a la presión,
al secado por congelación o al secado por pulverización ya sea en
solitario o bien en combinación.
El precultivo en medio con almidón antes del
cultivo en medio con almidón acrecentaba la
recuperación/supervi-
vencia tras una exposición a condiciones de estrés como las perfiladas anteriormente, además de acrecentar la producción.
vencia tras una exposición a condiciones de estrés como las perfiladas anteriormente, además de acrecentar la producción.
El cultivo en medio con almidón y luego la
adición de almidón incrementaban la resistencia a condiciones de
estrés como las perfiladas anteriormente.
Se ilustra adicionalmente la invención mediante
los ejemplos siguientes usando dos almidones que contienen almidón
resistente y son los llamados Almidón 1 (con aproximadamente un 20%
(en peso) de almidón resistente) y Almidón 2 (con aproximadamente un
60% (en peso) de almidón resistente), siendo dichos almidones
almidones granulares de maíz rico en amilosa, así como una serie de
cepas de Bifidobacterium a las que se llama cepas A, B, C, D,
E y F.
Se estudió el crecimiento y la producción de
Bifidobacterium de la cepa D, Bifidobacterium de la
cepa E y Bifidobacterium de la cepa C en presencia de almidón
de maíz granular natural. Un precultivo de la cepa fue cultivado en
20 ml de caldo PYG por espacio de 18 horas y fue usado para inocular
(partes alícuotas de 0,1 ml) 20 ml de medio de cultivo PY que
contenía glucosa (0,5%), Almidón 1 (0,5%), Almidón 2 (0,5%) o una
mezcla de Almidón 1 (0,25%) + glucosa (0,25%). Los cultivos fueron
incubados en una cámara anaeróbica a 37ºC y muestreados a las 0, 4,
7, 12, 24, 31, 48 y 72 horas para supervisar el número de células
viables determinado como unidades formadoras de colonias por ml de
cultivo (CFU/ml^{-1}). Los resultados que se presentan en la
Figura 1 para Bifidobacterium de la cepa D ponen de
manifiesto que la inclusión de Almidón 1 (0,25%) junto con un 0,25%
de glucosa redundó en un acrecentado crecimiento y una acrecentada
producción de la cepa D en comparación con el 0,5% de glucosa en
solitario. Para Bifidobacterium de la cepa E (Figura 2) el
crecimiento fue más rápido en caldo con Almidón 2 en comparación con
el control de glucosa. El crecimiento de la cepa E fue también
acrecentado en el caldo con Almidón 1 + glucosa en comparación con
el control de glucosa. Para Bifidobacterium de la cepa C se
observó una distinta forma de crecimiento y producción. Como se
muestra en la Figura 3, mientras que la velocidad de crecimiento no
era marcadamente distinta para los distintos caldos, al ser
cultivada en glucosa esta cepa moría bastante rápidamente una vez
que había sido obtenida la producción máxima a las 18 horas
aproximadamente. La cepa mantenía una más alta producción cuando se
incluían Almidón 1 o Almidón 2.
La supervivencia/recuperación de microbios
cultivados en presencia de almidón en comestibles fue evaluada para
Bifidobacterium de la cepa C que había sido cultivada en
presencia de glucosa (0,5%) o de Almidón 1 (0,25%) + glucosa (0,25%)
o de Almidón 2 (0,5%) o de Almidón 2 (0,25%) + glucosa (0,25%). Las
células de bifidobacterium fueron recolectadas tras 40 horas de
cultivo anaeróbico y fueron diluidas en el producto alimentario para
así obtener aproximadamente 10^{5} CFU por ml de comestible. Los
comestibles sometidos a ensayo incluyen zumo de naranja, una bebida
de base probiótica y un producto lácteo fermentado tipo yogur. Los
productos alimentarios que contenían las células de
Bifidobacterium de la cepa C fueron almacenados a temperatura
ambiente (para condiciones de almacenamiento acelerado) y
muestreados a los 0, 1, 2, 5 y 6 días para cuantificar la
supervivencia de las células de Bifidobacterium de la cepa C.
Según los resultados que se presentan en la Figura 4, se produjo una
acrecentada supervivencia de la cepa C en la bebida de base
probiótica cuando la cepa fue previamente cultivada en presencia de
Almidón 1 y 2. Análogamente, en el producto lácteo fermentado tipo
yogur se observó una acrecentada supervivencia de la cepa C. Para
las células cultivadas en presencia de almidón (Figura 5) y en zumo
de naranja para las células cultivadas en presencia de almidón
(Figura 6).
La inclusión de almidón resistente adicional a
microorganismos cultivados en presencia de almidón resistente
redundó en una acrecentada supervivencia cuando los microorganismos
fueron añadidos a productos alimentarios. Esto fue investigado
usando Bifidobacterium de la cepa C que había sido cultivada
en presencia de glucosa (0,5%) o de Almidón 1 (0,25%) + glucosa
(0,25%) o de Almidón 2 (0,5%) o de Almidón 2 (0,25%) + glucosa
(0,25%). Las células de bifidobacterium fueron recolectadas tras 40
horas de cultivo anaeróbico y mezcladas con un 2,5% de Almidón 1 por
espacio de 1 hora. Las células más los gránulos de almidón fueron
entonces recolectados mediante centrifugación y añadidos al
producto alimentario para así obtener aproximadamente 10^{5} CFU
por ml de comestible. Los productos sometidos a ensayo incluían zumo
de naranja, una bebida de base probiótica y un producto lácteo
fermentado tipo yogur. Los productos alimentarios que contenían las
células de Bifidobacterium de la cepa C con almidón adicional
fueron almacenados a temperatura ambiente (para condiciones de
almacenamiento acelerado) y muestreados a los 0, 1, 2, 5 y 6 días
para cuantificar la supervivencia de las células de
Bifidobacterium de la cepa C. Como se ilustra en la Figura
7, la inclusión de Almidón 1 adicional prolongó la supervivencia de
las bacterias en una bebida de base probiótica independientemente
del medio de cultivo que se usase, y, como se ve en la Figura 8, en
el producto lácteo fermentado tipo yogur. El almidón adicional
también prolongó la supervivencia de la cepa C en zumo de naranja
(Figura 9).
Usando Bifidobacterium de la cepa C,
ratones hembra de 20 g fueron intubados orogástricamente con una
suspensión de células recolectadas de placas basadas en glucosa o
placas basadas en Almidón 1 o Almidón 2. Las suspensiones
bacterianas fueron estandarizadas a una consistente densidad óptica
que correspondía a aproximadamente 10^{8} por ml de diluyente. Las
células de bifidobacterium en las muestras fecales recién evacuadas
fueron contadas usando placas de agar PAM, y la identificación fue
confirmada usando la reacción en cadena de la polimerasa. Las
muestras fecales fueron recolectadas a las 4, 10, 24 y 48 horas de
la administración de la bifidobacterium. No fueron detectadas
células de bifidobacterium en los ratones que habían recibido las
dosis de células cultivadas en presencia de glucosa (Tabla 2). En el
caso de los ratones que habían recibido las dosis de cepa C
cultivada en agar con Almidón 1, a las 4 y a las 10 horas de la
administración oral la detección en las heces era de aproximadamente
log 7 de CFU por gramo de peso en húmedo. Los números disminuían en
las muestras obtenidas a las 24 y 48 horas, pero eran aún
detectables. Cuando fueron administradas orogástricamente a ratones
dosis de Bifidobacterium de la cepa C cultivada en agar con
Almidón 2, fue detectada una cantidad de aproximadamente log 8 de
CFU por gramo de peso en húmedo de las heces a las 4 y a las 10
horas de la administración, con una disminución para las muestras
tomadas a las 24 y 48 horas. Se sacó la conclusión de que el cultivo
en agar basado en almidón resistente redunda en células de
bifidobacterium que eran más resistentes a condiciones in
vivo que incluirían las de un bajo pH estomacal, los ácidos
biliares y las enzimas pancreáticas.
| Tiempo tras la dosificación (h) | Agar con glucosa | Agar con Almidón 1 | Agar con Almidón 2 |
| (CFU por g de peso en húmedo) | |||
| 4 | ND | 5.8 X 10^{6} | 2.5 x 10^{8} |
| 10 | ND | 2.5 X 10^{7} | 6.0 x 10^{7} |
| 24 | ND | > 10^{6} | > 10^{6} |
| 48 | ND | > 10^{5} | > 10^{5} |
| ND - no se detectó ninguna |
Se comprobó que los microorganismos cultivados
en presencia de almidón resistente eran más resistentes al estrés
físico como ilustra el ejemplo siguiente, en el cual cepas de
bifidobacterium fueron expuestas a un ciclo de
congelación-descongelación tras el cultivo en
presencia de almidón resistente. Bifidobacterium de la cepa
C que había sido cultivada en presencia de glucosa (0,5%) o de
Almidón 1 (0,25%) + glucosa (0,25%) o de Almidón 2 (0,5%) o de
Almidón 2 (0,25%) + glucosa (0,25%). Las células de bifidobacterium
fueron recolectadas tras 40 horas de cultivo anaeróbico, y las
muestras fueron divididas en dos. Una parte fue congelada
directamente (a -20ºC), y la otra parte fue mezclada un 2,5% de
Almidón 1 por espacio de 1 hora. Las células más los gránulos de
almidón fueron entonces recolectados por centrifugación, y fueron
también congelados a -20ºC. Las células de bifidobacterium viables
fueron cuantificadas tras 0, 1, 2, 3 y 4 ciclos de
congelación-descongelación que suponían descongelar
las muestras a temperatura ambiente cada día durante 4 días. Como se
ilustra en la Figura 10, el cultivo en presencia de almidón
resistente antes de la exposición al estrés físico acrecentaba la
supervivencia de la bifidobacterium. Además, la adición de más
almidón resistente antes de la congelación mejoraba adicionalmente
la supervivencia de las células de Bifidobacterium (Figuras 11 y
12).
Las bacterias cultivadas en presencia de almidón
resistente y posteriormente secadas por congelación antes del
almacenamiento a elevadas temperaturas eran más resistentes a las
elevadas temperaturas que las cultivadas en ausencia del almidón.
Tres cepas de Bifidobacterium, que eran concretamente las
cepas A, B y D, fueron cultivadas cada una en fermentadores con
control del pH. La biomasa celular fue recolectada y secada por
congelación. El polvo secado fue entonces almacenado a 42ºC por
espacio de 7 días y muestreado diariamente durante 4 días y luego
de nuevo el día 7 para cuantificar las bifidobacterias viables. Los
resultados están expresados como unidades formadoras de colonias por
gramo de polvo secado. Como se ilustra en la Tabla 3, las células
que fueron cultivadas en presencia de Almidón 1 sobrevivieron mejor
o fueron recuperadas a niveles más altos en comparación con las
cultivadas en ausencia del almidón resistente.
| Tiempo (d) | Cepa A | Cepa B | Cepa C | |||
| Sin almidón | Con almidón | Sin almidón | Con almidón | Sin almidón | Con almidón | |
| 0 | 10.52 | 10.59 | 10.58 | 10.56 | 10.65 | 10.58 |
| 1 | 10.30 | 10.23 | 10.23 | 10.40 | 10.11 | 10.20 |
| 2 | 9.11 | 10.11 | 7.83 | 10.08 | 7.76 | 9.83 |
| 3 | 7.26 | 10.00 | 5.00 | 9.53 | 5.00 | 8.53 |
| 4 | 4.60 | 9.48 | 4.00 | 8.08 | 4.00 | 5.68 |
| 7 | 0.00 | 804 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 1.30 |
Fue supervisada la supervivencia de
Clostridium butyricum tras el cultivo en caldo sin almidón
añadido. Las células fueron recolectadas y puestas nuevamente en
suspensión en tampón a un pH de 3,8 que contenía un 2,5% de Almidón
1, un 2,5% de Almidón 2, un 2,5% de celulosa o un 2,5% de Almidón 3,
y las células viables resultantes fueron cuantificadas tras haber
transcurrido 3 horas. Los resultados están expresados como
porcentaje referido a la cuenta viable inicial. Como puede verse en
la Tabla 4, la presencia de Almidón 2 acrecentó la supervivencia.
La celulosa no ofreció protección contra la pérdida de viabilidad
como se observó que lo hacía el almidón resistente.
| Adición de almidón | Porcentaje viable tras 3 horas a un pH de 3,8 |
| Sin almidón | 80.5 |
| Almidón 1 | 71.3 |
| Almidón 2 | 111.3 |
| Celulosa | ND |
| Almidón 3 | 66.0 |
| ND = no detectado porcentaje alguno |
Se demostró que hay sinergia entre ingredientes
del comestible tales como los polisacáridos y el efecto de
incremento de la supervivencia de los microorganismos cuando los
mismos son cultivados en presencia de almidón resistente y/o cuando
se incluye almidón resistente adicional con los microbios. Esto
puede demostrarse por medio del crecimiento de las bacterias
Bifidobacterium de la cepa C en presencia de glucosa (0,5%) o
de Almidón 1 (0,25%) + glucosa (0,25%) o de Almidón 2 (0,5%) o de
Almidón 2 (0,25%) + glucosa (0,25%). Las células de bifidobacterium
fueron recolectadas tras 40 horas de cultivo anaeróbico, y las
muestras fueron divididas en dos. Una parte fue usada directamente,
y la otra parte fue mezclada con un 2,5% de Almidón 1 por espacio de
1 hora. Las células en solitario o las células más los gránulos de
almidón fueron entonces recolectados mediante centrifugación y
fueron puestos de nuevo en suspensión en leches fermentadas tipo
yogur que fueron entonces almacenadas a temperatura ambiente y
muestreadas a los 0, 1, 2, 5 y 6 días para proceder a la
determinación de las células de bifidobacterium viables. Como puede
verse en las Figuras 13 y 14, había una sinergia demostrable entre
la presencia de polisacárido en el yogur B y el crecimiento en
presencia de almidón resistente en comparación con la glucosa.
Se estableció que las células bacterianas unidas
a una superficie sobreviven a los estados de estrés mejor que las
células no unidas. En este ejemplo se descubrió que las células de
bifidobacterium cultivadas en Almidón resistente 1 se adherían dos
veces mejor a los gránulos de Almidón 1 en comparación con lo que se
observó en el caso de las células cultivadas con glucosa. Células
de Bifidobacterium de la cepa C fueron cultivadas en PYG por
espacio de 24 horas, y tras su recolección por centrifugación fueron
puestas nuevamente en suspensión en una solución de Almidón 1 al
2,5% que estaba a un pH de 7,0 o a un pH de 2,5. Tras una hora de
incubación fue evaluada la adherencia a los gránulos de almidón, y
entonces el pH fue alterado para pasar de ser de 7,0 a ser de 2,5 y
también para pasar de ser de 2,5 a ser de 7,0. Como puede verse en
la Tabla 5, las células de la cepa C se adherían bien a un pH de
7,0 pero no a un pH de 2,5, y al ser el pH variado para pasar de
ser de 7,0 a ser de 2,5, las células permanecían unidas, mientras
que hubo un incremento de la adherencia cuando el pH fue
incrementado para pasar de un pH de 2,5 a un pH de 7,0.
| Medición tras 1 h | Medición a las 2 h | ||
| pH | Adherencia (%) | pH | Adherencia (%) |
| 7.0 | 88.8 | 7.0 | 86.7 |
| 2.5 | 18.3 | 2.5 | 13.4 |
| 7.0 | 88.1 | Cambio del pH a 2,5 | 75.5 |
| 2.5 | 19.51 | Cambio del pH a 2,5 | 72.8 |
(I) Determinadas realizaciones específicas de la
invención pueden ser aplicadas a situaciones para las cuales pueden
usarse microbios probióticos, incluyendo el uso de los mismos como
agentes profilácticos y terapéuticos, así como en composiciones
alimentarias y de alimentación animal para beneficiar al
huésped.
(II) Determinadas realizaciones específicas de
la invención pueden ser aplicadas a situaciones para las cuales
pueden usarse microbios probióticos para aplicaciones en tractos no
digestivos tales como los tractos nasal y vaginal.
(III) Determinadas realizaciones específicas de
la invención pueden ser aplicadas a situaciones relativas al
biocontrol y la biorremediación.
(IV) Los microorganismos probióticos pueden ser
cultivados en el medio basado en almidón y pueden ser usados
directamente o bien en combinación con almidón adicional tras el
cultivo. Estas suspensiones probióticas pueden ser usadas
directamente o bien tras congelación y/o secado en ausencia o en
presencia de aditivos adicionales.
(V) Los microorganismos probióticos que han sido
descritos en el anterior punto (II) pueden ser añadidos a
comestibles y piensos ya sea durante la producción o bien al final
de la misma.
(VI) Además de a los comestibles y los piensos
que se han descrito anteriormente en el punto (III), el
almidón
puede ser también añadido al comestible o pienso antes o después de la adición de los microorganismos pro-
bióticos.
puede ser también añadido al comestible o pienso antes o después de la adición de los microorganismos pro-
bióticos.
(VII) Determinadas realizaciones específicas de
la invención pueden ser también de aplicación a microorganismos,
incluyendo cultivos de arranque, que se usen para la producción de
comestibles fermentados, siendo estos microorganismos cultivados en
medios basados en almidón y opcionalmente mezclados con almidón
adicional tras el cultivo, la congelación y/o el secado,
incrementando con ello la supervivencia de los microbios. Cuando
estos microbios son añadidos como ingrediente, puede añadirse al
comestible almidón adicional antes o después de la producción o
bien durante la misma.
Realizaciones específicas de la invención se
ocupan del hecho de que para muchos y distintos microorganismos
entre los que se incluyen bacterias probióticas tales como bacterias
del ácido láctico y bifidobacterias, la presencia de almidón
resistente en el medio de cultivo puede en preparaciones sólidas y
líquidas:
incrementar el crecimiento y/o la producción del
microorganismo; e
incrementar el porcentaje de supervivencia o el
porcentaje de recuperación de los microbios en comestibles,
comestibles beneficiosos para la salud entre los que se incluyen
comestibles nutracéuticos y/o funcionales, suplementos para la
salud, comestibles y formulaciones comestibles destinados a los
niños y a los ancianos, productos farmacéuticos, comestibles
médicos tales como preparaciones alimenticias enterales, piensos
para animales, piensos para animales de compañía, acuacultivo,
piensos y suplementos para pájaros y suplementos alimentarios para
el deporte y para incrementar el rendimiento.
A pesar de que los ejemplos que se han dado se
refieren principalmente a productos alimentarios y probióticos, se
entenderá que puede hacerse que tengan un incrementado potencial de
crecimiento/producción o un incrementado porcentaje de
supervivencia/recuperación en uso otros microorganismos que son
útiles para distintas aplicaciones como son por ejemplo las de
biocontrol y biorremediación.
El crecimiento y la supervivencia pueden ser
incrementados si se añade almidón resistente adicional a los
microorganismos tras el cultivo, e incluso cuando dicho almidón
resistente adicional es añadido a células cultivadas en ausencia de
almidón resistente y que son posteriormente mezcladas con
almidón.
Además, los microorganismos cultivados en
presencia de almidón resistente son más resistentes a los estados
de estrés in vivo tales como la aireación, el cizallamiento,
la congelación, el secado, el secado por congelación, las altas
temperaturas, las bajas temperaturas, las fluctuaciones de la
temperatura, las fluctuaciones de la presión, las altas presiones,
las bajas presiones, el bajo pH, el alto pH y la humedad.
El almidón resistente, incluyendo los tipos RS1,
RS2, RS3 y RS4, puede consistir en almidones naturales que
contengan almidón resistente y/o modificaciones de los mismos
incluyendo las modificaciones tanto químicas como enzimáticas, y/o
mezclas de los mismos. En los ejemplos se usaron ejemplos de dos
almidones distintos, pero un experto en la materia entendería que
también serían adecuadas para ser usadas en la presente invención
otras formas de almidón resistente.
El acrecentado nivel de crecimiento/producción
y/o supervivencia o recuperación que ha sido citado anteriormente
es también de aplicación a la producción y al almacenamiento de las
preparaciones de microorganismos.
Adicionalmente, fue sorprendente observar una
sinergia con otros ingredientes de los comestibles entre los que se
incluyen los disacáridos, los oligosacáridos y los polisacáridos
cuando se supervisó el crecimiento/producción y/o la supervivencia
o recuperación de los microorganismos. Sería comprensible que puedan
también actuar sinérgicamente otros ingredientes de los comestibles
tales como las proteínas y las grasas.
También se observó que las células cultivadas en
presencia de almidón resistente se adherían mejor a los gránulos de
almidón, lo cual a su vez aseguraría una mejor supervivencia o
recuperación. Puesto que el almidón resistente tiene una reducida
digestibilidad, sería comprensible que otros compuestos
indigestibles entre los que se incluyen proteínas y lípidos
pudieran también dar lugar a un acrecentamiento del crecimiento/de
la producción y/o de la supervivencia o recuperación de los
microorganismos.
El estado de la técnica ha demostrado que la
presencia de almidón resistente en las composiciones probióticas
acrecienta la supervivencia de los microorganismos probióticos
durante el consumo y después del mismo (AU 687253). Esta patente
anterior de los presentes solicitantes presenta datos obtenidos al
usar bifidobacterias con almidón adicional añadido. En contraste
con ello, la presente invención es el resultado del inesperado
descubrimiento de que las células cultivadas en presencia de almidón
resistente son más robustas sin la adición de más almidón.
Sorprendentemente, cuando los microorganismos son cultivados en
presencia de almidón resistente, pudiendo ser añadido a las células
cultivadas en presencia de almidón almidón adicional, se da un
acrecentado crecimiento/una acrecentada producción y/o una
acrecentada supervivencia o recuperación del microorganismo. Esto
quiere decir que las células microbianas cultivadas en presencia de
almidón resistente son más robustas. Además, la adición de almidón
resistente a las células cultivadas en ausencia de almidón puede
acrecentar la robustez de esas células.
Los expertos en la materia entenderán que las
realizaciones específicas de la presente invención pueden ser
objeto de numerosas variaciones y/o modificaciones. Las presentes
realizaciones deben ser por consiguiente consideradas en todos los
aspectos como realizaciones ilustrativas y no limitativas.
Claims (42)
1. Procedimiento para preparar una preparación
microbiana que tiene un incrementado porcentaje de
supervivencia/recuperación en un producto, comprendiendo el
procedimiento los pasos de producir o cultivar microbios en medios
basados en almidón resistente o que lo contengan, y recolectar los
microbios cultivados, teniendo los microbios recolectados un
incrementado porcentaje de supervivencia/recuperación al ser
posteriormente incorporados a un producto en comparación con los
mismos microbios producidos o cultivados en un medio carente de
almidón resistente.
2. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el producto es seleccionado de entre los miembros del grupo
que consta de un producto alimentario, de alimentación animal,
nutracéutico, farmacéutico, de biocontrol y de biorremediación.
3. Procedimiento según la reivindicación 2 o 3,
en el que el almidón resistente es del tipo RS1, RS2, RS3 o
RS4.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 o 3,
en el que el almidón resistente se deriva de almidón seleccionado
de entre los miembros del grupo que consta de almidón de maíz, de
arroz, de cebada, de trigo, de legumbres, de patatas y de
plátanos.
5. Procedimiento según cualquier reivindicación
precedente, en el que el almidón resistente se deriva de almidón
que tiene un contenido de amilosa de al menos un 40% (en peso).
6. Procedimiento según cualquier reivindicación
precedente, en el que el almidón resistente se deriva de almidón de
maíz.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que el almidón de maíz tiene un contenido de amilosa de al menos
un 70% (en peso).
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que el almidón de maíz tiene un contenido de amilosa de al menos
un 80% (en peso).
9. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que el almidón de maíz tiene un contenido de amilosa de al menos
un 90% (en peso).
10. Procedimiento según cualquier reivindicación
precedente, en el que el almidón está tratado o modificado química,
física y/o enzimáticamente.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que la modificación química es seleccionada de entre los
miembros del grupo que consta de oxidación, reticulación,
eterificación, esterificación, acidificación, dextrinización y
mezclas de tales procesos.
12. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que el tratamiento físico es un tratamiento con calor y humedad
para acrecentar o incrementar el contenido de almidón resistente del
almidón.
13. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que el tratamiento consiste en una extracción con disolvente
para retirar del almidón las grasas y/o los minerales.
14. Procedimiento según cualquier reivindicación
precedente, en el que el almidón resistente es usado en el medio a
una concentración de un 0,01 a un 10% (en peso).
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que el almidón resistente es usado en el medio a una
concentración de un 0,1 a un 5% (en peso).
16. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que el almidón resistente es usado en el medio a una
concentración de un 1% (en peso).
17. Procedimiento según cualquier reivindicación
precedente, en el que en uso los microbios son resistentes a la
aireación, al cizallamiento, al secado por congelación, a la
congelación, al secado incluyendo la alta, la mediana y la baja
hidroactividad, a las elevadas temperaturas, a las bajas
temperaturas, a la presión y a las fluctuaciones de presión, al
bajo pH, al alto pH, a los ácidos biliares, a la humedad, a la alta
osmolaridad, a la baja osmolaridad, a las condiciones altamente
salinas o a combinaciones de dichas condiciones.
18. Procedimiento según cualquier reivindicación
precedente, en el que la preparación microbiana es un probiótico,
un cultivo de arranque o un producto de biocontrol o de
biorremediación.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que los microbios son microorganismos probióticos de los géneros
seleccionados de entre los miembros del grupo que consta de los
géneros Saccharomyces, Bifidobacterium, Bacteroides,
Clostridium, Fusobacterium, Propionibacterium, Streptococcus,
Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus y
Lactobacillus.
20. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que los microbios son cultivos de arranque seleccionados de
entre los miembros del grupo que consta de bacterias del ácido
láctico entre las que se incluyen los géneros lactobacillus,
lactococcus y streptococcus, leuconostoc y levaduras.
21. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que los microbios son adecuados para ser usados en biocontrol o
biorremediación, siendo dichos microbios seleccionados de entre los
miembros del grupo que consta de bifidobacterias,
acidophilus, hongos, especies de Bacillus,
pseudomonadas y Alcaligenes.
22. Preparación microbiana que contiene
microbios que tienen un incrementado porcentaje de
supervivencia/recu-
peración en el producto en comparación con los mismos microbios producidos o cultivados en un medio carente de almidón resistente y que puede ser preparada por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
peración en el producto en comparación con los mismos microbios producidos o cultivados en un medio carente de almidón resistente y que puede ser preparada por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
23. Producto que contiene microbios que tienen
un incrementado porcentaje de supervivencia/recuperación en
comparación con los mismos microbios producidos o cultivados en un
medio carente de almidón resistente, incluyendo el producto una
preparación microbiana según la reivindicación 22.
24. Producto según la reivindicación 23,
seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de un
producto alimentario, un producto de alimentación animal, un
producto nutracéutico, un producto farmacéutico, un producto de
biocontrol y un producto de biorremediación.
25. Producto según la reivindicación 24, que es
un producto alimentario, un producto de alimentación animal, un
producto nutracéutico o un producto farmacéutico seleccionado de
entre los miembros del grupo que consta de productos alimentarios
basados en fluidos, fluidos basados en agua, productos alimentarios
basados en cereales y plantas, productos alimentarios basados en
sólidos, tabletas, aditivos alimentarios, suplementos para la salud
y preparaciones farmacéuticas.
26. Producto según la reivindicación 25, en el
que los productos alimentarios basados en fluidos incluyen
productos lácteos en los que el ingrediente comestible es uno o
varios ingredientes lácteos entre los que se incluyen la leche
entera, los sólidos de la leche, la grasa de leche, la crema, la
leche secada sin grasa y cualquier otro componente o derivado de la
leche que sea adecuado para ser usado en productos lácteos.
27. Producto según la reivindicación 25, en el
que los productos alimentarios basados en sólidos incluyen barras
de tentempié, cereales para desayuno, pan, dulces, productos
alimentarios extrusionados, barras de muesli, bollos, galletas,
pellas de pienso y productos alimentarios recubiertos.
28. Producto según la reivindicación 24, que es
un producto alimentario que es adecuado para contener y suministrar
microorganismos probióticos.
29. Producto alimentario según la reivindicación
28, seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de
comestibles, bebidas frutales, cubitos de agua, dulces,
recubrimientos o coberturas, yogures, bebidas de yogur, bebidas no
fermentadas, bebidas lácteas saborizadas, bebidas lácteas
modificadas, helados y postres lácteos.
30. Uso de almidón resistente en medios de
cultivo microbiano para producir microbios que al ser posteriormente
usados en un producto tras haber sido recolectados a partir del
medio tienen un incrementado porcentaje de supervivencia en
comparación con los mismos microbios producidos o cultivados en
medios carentes de almidón resistente.
31. Uso según la reivindicación 30, en el que el
producto es seleccionado de entre los miembros del grupo que consta
de un producto alimentario, un producto de alimentación animal, un
producto nutracéutico, un producto farmacéutico, un producto de
biocontrol y un producto de biorremediación.
32. Uso según la reivindicación 30 o 31, en el
que el almidón resistente es del tipo RS1, RS2, RS3 o RS4.
33. Uso según la reivindicación 32, en el que el
almidón resistente se saca de almidón seleccionado de entre los
miembros del grupo que consta de almidón de maíz, de arroz, de
cebada, de trigo, de legumbres, de patatas y de plátanos.
34. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
30-33, en el que el almidón resistente se saca de
almidón que tiene un contenido de amilosa de al menos un 40% (en
peso).
35. Uso según la reivindicación 34, en el que el
almidón resistente se saca de almidón de maíz.
36. Uso según la reivindicación 35, en el que el
almidón de maíz tiene un contenido de amilosa de al menos un 70%
(en peso).
37. Uso según la reivindicación 35, en el que el
almidón de maíz tiene un contenido de amilosa de al menos un 80%
(en peso).
38. Uso según la reivindicación 35, en el que el
almidón de maíz tiene un contenido de amilosa de al menos un 90%
(en peso).
39. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
30-38, en el que el almidón está tratado o
modificado química, física y/o enzimáticamente.
40. Uso según la reivindicación 39, en el que la
modificación química es seleccionada de entre los miembros del
grupo que consta de oxidación, reticulación, eterificación,
esterificación, acidificación, dextrinización y mezclas de dichos
procesos.
41. Uso según la reivindicación 39, en el que el
tratamiento físico es un tratamiento con calor y humedad para
acrecentar o incrementar el contenido de almidón resistente del
almidón.
42. Uso según la reivindicación 39, en el que el
tratamiento es por extracción con disolvente para retirar del
almidón las grasas y/o los minerales.
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