ES2274655T3 - Radioconjugacion de anticuerpos de internalizacion. - Google Patents
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Abstract
Composición para marcaje interno de una célula, que comprende un ligando que se une específicamente a EGFRvIII y es internalizado por la célula, en la que el ligando se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, y un polipéptido sintético; un oligopéptido que comprende, como mínimo, un residuo de aminoácido cargado positivamente y, como mínimo, un residuo D-aminoácido, de manera que el oligopéptido no comprende dos o más L-aminoácidos contiguos, en la que dicho oligopéptido está unido covalentemente al ligando; y un marcador que está unido covalentemente al oligopéptido.
Description
Radioconjugación de anticuerpos de
internalización.
La presente invención se refiere al área de la
tecnología de la radioconjugación. En particular, se refiere a la
utilización de anticuerpos de internalización en
radioinmunoterapia.
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) son
vehículos atractivos para dirigir la radiación a tumores debido a
su capacidad de reaccionar específicamente con determinantes
moleculares en células cancerígenas. Sin embargo, el impacto
anticipado de mAbs marcados en el tratamiento clínico del cáncer aún
no se ha alcanzado; la pérdida de la marca del mAb in vivo y
la captación de radioactividad en tejidos normales han dificultado
su aplicación clínica. El yodo-131 es el nucleido
utilizado más frecuentemente en la radioinmunoterapia clínica, pero
su utilidad está comprometida por la deshalogenación in vivo
de mAbs marcados mediante procedimientos convencionales.
Los mAbs radiomarcados podrían jugar un papel
importante en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer si la
especificidad molecular inherente en la interacción
mAb-antígeno se puede explotar de manera
satisfactoria para liberar selectivamente radionucleidos a tumores.
Para muchos tipos de cáncer, la radioinmunoterapia es una
alternativa atractiva a la terapia de radiación con rayos externos y
quimioterapia administrada sistémicamente, tratamientos que son
frecuentemente inefectivos a causa de las toxicidades limitantes de
la dosis para tejidos normales. La radioimmunoescintilografía es
atractiva no sólo para la detección de la lesión, sino también como
medio para determinar qué pacientes son candidatos adecuados para la
terapia de mAb con marcado. Numerosos estudios clínicos han
confirmado la capacidad de los mAbs marcados para localizarse tanto
en cánceres primarios como metastáticos (revisión en Britton y
Granowska, 1996; Larson, 1995), y en pacientes con tumores
radiosensibles, se han obtenido respuestas terapéuticas
significativas con mAbs marcados con ^{131}-I
(Press y otros, 1995; Kaminski y otros, 1996). Sin embargo, se ha
demostrado que otros tumores son menos radiosensibles,
presumiblemente debido al bajo nivel de radionucleido retenido en
el tumor y la acumulación significativa de radioactividad en
órganos normales (Kairemo, 1996; Bast y otros, 1997). Existe la
necesidad en la técnica de técnicas y reactivos mejorados para
dirigir selectivamente radiomarcadores terapéuticos y de diagnóstico
a células tumorales.
Un objetivo de la presente invención es dar a
conocer ligandos radioconjugados y métodos para su utilización en
la localización y tratamiento de tumores. Estos y otros objetivos de
la presente invención se disponen mediante una o más de las
realizaciones descritas a continuación.
Una realización de la presente invención da a
conocer una composición para marcar internamente una célula. La
composición comprende un ligando, un oligopéptido, y un marcador. El
ligando es cualquier fracción que se une específicamente a un
antígeno o receptor de la superficie celular y es internalizado por
la célula. El ligando se selecciona del grupo que consiste en un
anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, y un polipéptido
sintético. El oligopéptido comprende, como mínimo, un residuo de
aminoácido cargado positivamente y, como mínimo, un residuo de
D-aminoácido. El oligopéptido no comprende dos o más
residuos de L-aminoácidos contiguos. El
oligopéptido está unido covalentemente al ligando. El marcador está
unido covalentemente al oligopéptido.
Otra realización de la presente invención da a
conocer un método para incorporar un marcador a una célula. El
método comprende la etapa de poner en contacto la célula con la
composición descrita en el párrafo anterior, a través de lo cual el
marcador es internalizado por la célula.
Otra realización adicional de la presente
invención da a conocer un método para localizar células tumorales
en un mamífero. El método comprende las etapas de introducir una
cantidad diagnósticamente efectiva de la composición anterior en el
cuerpo de un mamífero que comprende células tumorales, escanear el
cuerpo con un detector de escintilación, y generar una imagen que
representa las células tumorales en el cuerpo de un mamífero.
Otra realización adicional de la presente
invención da a conocer la utilización de la composición anterior en
radioterapia, que comprende la etapa de introducir una cantidad
terapéuticamente efectiva de la composición anterior en el cuerpo
de un mamífero que comprende un tumor, a través de lo cual se reduce
el crecimiento del tumor.
Una realización adicional de la presente
invención da a conocer un compuesto para marcar un ligando que se
une a un antígeno de la superficie celular. El compuesto comprende
una molécula de fórmula (I):
(I)R_{1} ---
NH --- (AA)_{n} ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
--- O ---
R_{2}
El grupo -NH- representa el extremo amino y el
grupo
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} --- O
---
representa el extremo carboxilo de
la molécula. AA representa una aminoácido y n es un número entero
que tiene un valor mínimo de 1, y como máximo, aproximadamente, 10,
15 ó 20. R_{1} es H o un grupo protector de amino y R_{2} es H
o un grupo protector de carboxilo, con la condición de que R_{1} =
R_{2} = H es una condición poco apropiada para esta molécula. O
bien R_{1} o bien R_{2} es H. Como mínimo, un residuo de
aminoácido está positivamente cargado y, como mínimo, un residuo de
aminoácido es D-aminoácido. La molécula no comprende
dos o más L-aminoácidos contiguos. Como mínimo, un
aminoácido es suficiente para acoplarse a un marcador. La molécula
es suficiente para acoplarse a un ligando en uno de su extremo amino
o su extremo
carboxilo.
La presente invención da a conocer así en la
técnica herramientas novedosas para introducir ligandos marcados en
una célula.
Las figuras 1A y 1B ilustran la forma en la que
se conforman las dos composiciones preferentes de la presente
invención. En la figura 1A, el oligopéptido de la izquierda
(D-Lys-D-Arg-D-Arg-D-Arg,
SEC ID No: 1) se acopla en la primera reacción a través del grupo
\varepsilon-amino de D-Lys a una
fracción química (por ejemplo,
5-yodo-3-piridincarboxilato)
que comprende un marcador (por ejemplo, ^{131}I). En la segunda
reacción, el terminal carboxilo libre del oligopéptido marcado se
acopla a un grupo amino libre en un anticuerpo monoclonal. En la
figura 1B, se llevan a cabo dos reacciones similares, pero el
oligopéptido es
D-Tyr-D-Arg-D-Arg-D-Arg
(SEC ID No: 2); y el marcador (por ejemplo, ^{131}I) se acopla
directamente a D-Tyr.
Las figuras 2A y 2B muestran la actividad
intracelular y del sobrenadante del cultivo celular,
respectivamente, tras la incubación de mAb L8A4 marcado utilizando
SIPC (barras coloreadas) y SIB (barras en blanco) con células HC2 20
d2 positivas de EGFRvIII.
La figura 3 representa la unión y la
internalización de L84A murino marcado a la línea celular
U87MG\DeltaEGFR, que expresa el receptor EGFRvIII mutante. El
anticuerpo marcado se preparó mediante marcaje directo de Yodógeno
utilizando ^{131}I o utilizando un oligopéptido
(\alpha-N-Ao-D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Arg-D-Arg,
SEC ID No: 3) que se habían marcado de Yodógeno con ^{125}I en su
residuo de D-Tyr y acoplado al anticuerpo, tal como
se describe en el Ejemplo 8.
La figura 4 muestra el transcurso con el tiempo
de la captación en el tumor de radioyodo, expresado como el
porcentaje de la dosis inicial por gramo de tumor. L8A4 murino se
marcó con ^{125}I utilizando el método del oligopéptido y con
^{131}I utilizando el marcaje directo con Yodógeno. El experimento
se realizó en ratones atímicos que llevaban xenoinjertos
subcutáneos de glioma humano U87MG\DeltaEGFR que expresa
EGFRvIII.
La figura 5 muestra el nivel de acumulación en
la tiroides de radioyodo en condiciones del experimento representado
en la figura 3. La acumulación en la tiroides es un indicador de la
deshalogenación de compuestos radioyodados in vitro.
La figura 6 presenta la proporción de la
captación de radioyodo en el tumor con respecto a sangre en las
condiciones del experimento representado en la figura 3.
Es un descubrimiento de la presente invención
que la conjugación de radiomarcadores a ligandos que se unen a
antígenos de la superficie celular a través de oligopéptidos
resistentes a la proteolisis, cargados positivamente, mejore la
eficacia de la radioinmunoterapia. La localización selectiva y
retención del radiomarcador en una clase de células diana se
incrementa utilizando dichos oligopéptidos.
Un marcador está unido covalentemente a un
oligopéptido que comprende, como mínimo, un residuo de
D-aminoácido y, como mínimo, un residuo de
aminoácido cargado positivamente. El marcador puede estar unido
covalentemente directamente al oligopéptido, o puede estar unida
covalentemente a un grupo químico, que a su vez está unido
covalentemente al oligopéptido. El oligopéptido está unido
covalentemente al ligando.
Un ligando, según se aplica el término en la
presente invención, es cualquier molécula que se une específicamente
a un antígeno de la superficie celular. Un antígeno de la
superficie celular es cualquier antígeno o receptor de la
superficie celular que está internalizado por la célula. Los
ligandos se pueden internalizar por las células durante segundos,
minutos, horas o días. Los ligandos preferentes de la presente
invención se internalizan rápidamente, es decir, la mayoría del
ligando se internaliza después de minutos a horas. Se considera que
un ligando se une específicamente cuando se une con una constante de
afinidad de 10^{6} M^{-1} o más, preferentemente 10^{8}
M^{-1} o más. Si el antígeno de la superficie celular es un
receptor, entonces el receptor se puede internalizar con o sin un
ligando unido. Un ejemplo de un receptor de internalización es el
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que es un
antígeno de la superficie celular que se internaliza mediante el
proceso de endocitosis mediada por el receptor. Los antígenos o
receptores que son internalizados por la célula se pueden localizar
finalmente dentro de endosomas o lisosomas.
Un ligando puede ser un anticuerpo, un fragmento
de un anticuerpo, o un péptido sintético que se une específicamente
a un antígeno de la superficie celular. En una realización
preferente, el ligando es un anticuerpo de internalización.
Cualquier anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de la
superficie celular y está internalizado por la célula es un
anticuerpo de internalización. El anticuerpo puede ser una
inmunoglobulina de cualquier clase, es decir, IgG, IgA, IgD, IgE o
IgM, y se puede obtener por inmunización de un mamífero, tal como un
ratón, rata, conejo, cabra, oveja, primate, humano u otra especie
adecuada. El anticuerpo puede ser policlonal, es decir, obtenido
del suero (también denominado antisuero) o un animal inmunizado con
un antígeno de la superficie celular o un fragmento del mismo. El
anticuerpo también puede ser monoclonal, es decir, formado mediante
inmunización de un mamífero que utiliza el ligando o antígeno de la
superficie celular o un fragmento de los mismos, la fusión de
células de linfa o bazo del mamífero inmunizado con una línea de
células de mieloma, y aislamiento de clones de hibridomas
específicos, tal como se conoce en la técnica. Entre los ejemplos de
anticuerpos monoclonales de internalización que son adecuados para
su utilización de la presente invención se incluyen L8A4, Y10 y H10
(Reist y otros, 1995). El anticuerpo también puede ser un anticuerpo
recombinante, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o de
interespecie producido mediante métodos de ADN recombinantes. Un
anticuerpo de internalización preferente es un anticuerpo
humanizado que comprende regiones constantes de inmunoglobulina
humana junto con regiones variables murinas que poseen
especificidad para la unión a un antígeno de superficie celular
(ver, por ejemplo, Reist y otros, 1997). Si se utiliza un fragmento
de un anticuerpo, el fragmento debería ser capaz de unirse
específicamente a un antígeno de la superficie celular. El fragmento
puede comprender, por ejemplo, como mínimo, una parte de una región
variable de cadena ligera de inmunoglobulina y, como mínimo, una
parte de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina.
Un ligando también puede ser un polipéptido sintético que se une
específicamente a un antígeno de la superficie celular. Por ejemplo,
el ligando puede ser un polipéptido sintético que comprende, como
mínimo, una parte de una región variable de cadena ligera de
inmunoglobulina y, como mínimo, una parte de una región variable de
cadena pesada de inmunoglobulina, tal como se describe en la
Patente de U.S.A. 5.260.203 o en cualquier otro documento conocido
en la técnica.
El oligopéptido comprende, como mínimo, un
aminoácido cargado positivamente y, como mínimo, un
D-aminoácido. El aminoácido cargado positivamente
puede ser un D- o un L-aminoácido. Los aminoácidos
cargados positivamente utilizados en el oligopéptido son aquellos
que transportan una carga neta positiva en su cadena lateral al pH
del medio extracelular (aproximadamente 7,4) o al pH del medio
intracelular (aproximadamente 6,8-7,2) o
preferentemente al pH de los contenidos lumenales de los endosomas
(aproximadamente 5-6) o lisosomas (aproximadamente
5). Entre los ejemplos de dichos aminoácidos cargados positivamente
se incluyen la histidina, más preferentemente lisina, y más
preferentemente arginina. Se prefieren los aminoácidos que tienen la
configuración de D-estereoisómero para la
utilización en el oligopéptido, aunque también se pueden utilizar
aminoácidos que tienen configuración L. Los
D-aminoácidos hacen que el oligopéptido sea más
resistente a proteasas lisosomales (Ehrenreich y Cohn y otros,
1969), mejorando así la retención del marcador en las células diana
y limitando la liberación del marcador, y su posterior recaptación
por otras células. El oligopéptido no contiene dos o más
L-aminoácidos contiguos. En una realización
preferente, si el oligopéptido comprende dos o más
L-aminoácidos, los L-aminoácidos
están separados entre sí por uno o más aminoácidos cargados
positivamente. En otra realización preferente, el oligopéptido
comprende, como mínimo, un residuo de D-Tyr. En aún
otra realización preferente, el oligopéptido comprende, como
mínimo, un residuo de D-Lys.
Se puede utilizar cualquier marcador que permita
detectar o afectar por el marcador las células que captan la
composición. Por ejemplo, para permitir la detección de un grupo de
células diana, el marcador puede ser fluorescente o radioactivo.
También se puede utilizar un marcador o etiqueta fluorescente cuando
las células diana específicas se detectarán fuera del cuerpo, es
decir, ex vivo. Se puede utilizar cualquier molécula
fluorescente que sea adecuada para la detección mediante métodos
estándar, incluyendo, por ejemplo, espectroscopia de fluorescencia
y microscopia por fluorescencia. Se puede utilizar un marcador o
etiqueta radioactiva cuando las células se detectarán en el
interior o en el exterior del cuerpo, es decir, in vivo o
ex vivo. La detección se puede realizar mediante métodos
radiológicos estándar, incluyendo, por ejemplo, el escaneo del
cuerpo con un detector de escintilación (radioescintilografía) y
tomografía por emisión de positrones (PET) (ver, por ejemplo,
Bradwell y otros, 1985). Para una utilización in vivo, el
marcador debería ser un marcador farmacológicamente aceptable y
debería administrarse en cantidades diagnóstica o terapéuticamente
aceptables. Una cantidad terapéuticamente aceptable es una cantidad
que, cuando se administra en una o más dosis, produce el efecto
terapéutico deseado, por ejemplo, la disminución de un tumor, con
un nivel de toxicidad aceptable para el tratamiento clínico. Tanto
la dosis de una composición particular como los medios de
administración de la composición se pueden determinar en base a
cualidades específicas de la composición, la condición, edad, y el
peso del paciente, la progresión de la enfermedad particular en
tratamiento, y otros factores relevantes. Si la composición contiene
anticuerpos, las dosis eficaces de la composición están en el
intervalo de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 50
\mug/kg de peso corporal del paciente, de aproximadamente 50
\mug a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 100 \mug a
aproximadamente 500 \mug/kg de peso corporal del paciente, y de
aproximadamente 200 a aproximadamente 250 \mug/kg. Una cantidad
diagnósticamente aceptable es una cantidad que permite la detección
del marcador según se requiera para la diagnosis, con un nivel de
toxicidad aceptable para la diagnosis. Los radiomarcadores que se
pretenden utilizar para el objetivo de detectar células diana
emitirían preferentemente radiación que es detectable por fuera del
cuerpo, por ejemplo, radiación gamma, cuando se administra en
cantidades diagnósticamente aceptables. Entre dichos
radiomarcadores se incluyen, pero no se limitan a, los
radionucleidos ^{18}F, ^{76}Br, ^{75}Br, ^{123}I,
^{124}I, ^{125}I, y ^{131}I. Los radiomarcadores que se
pretenden utilizar para disminuir el crecimiento de un tumor
deberían emitir preferentemente radiación que se absorbe en la
célula tumoral para dañar la célula, por ejemplo, mediante la
interrupción del ADN de la célula. Dichos radiomarcadores deberían
provocar preferentemente un daño mínimo a las células sanas
adyacentes. Los radiomarcadores que interrumpen en la célula pueden
emitir, por ejemplo, radiación alfa, beta, y/o gamma. Entre dichos
radiomarcadores se incluyen, pero no se limitan a, los
radionucleidos ^{18}F, ^{75}Br, ^{76}Br, ^{77}Br, ^{123}I,
^{124}I, ^{125}I, ^{131}I y ^{211}At. Los radiomarcadores
se pueden unir covalentemente al oligopéptido mediante cualquier
medio conocido en la técnica, incluyendo la yodación de un residuo
de tirosina (ver, por ejemplo, Fraker y Speck, 1978), la
yododestanilación (Zalutsky y Narula, 1987) y astatodestanilación
(ver Ejemplo I y Foulon y otros, 1998).
El marcador puede ser un grupo químico que se
une covalentemente al oligopéptido. El grupo químico tiene la
estructura de la fórmula (II). Para el grupo químico en la fórmula
(II), X puede ser un grupo amino, un grupo carboxilo, o
(CH_{2})_{n}SH, en la que n es un número entero de 0 a
10. Y puede ser C ó N, y Z puede ser F, Br, I, At ó
M(Alk)_{3}, en la que M puede ser Si, Sn ó Hg, y en
la que Alk es un grupo alquilo, tal como metilo, etilo, propilo,
butilo, pentilo, o hexilo. El grupo químico puede ser un compuesto
de ácido carboxílico unido a un grupo amino en el oligopéptido.
Alternativamente, el grupo químico puede ser un compuesto amino
unido a un grupo carboxilo en el oligopéptido. Los compuestos de
ácido carboxílico preferentes son, por ejemplo,
5-yodo-3-piridincarboxilato,
3-yodobenzoato,
3-(tri-n-butilestanil)benzoato,
5-(tri-n-butilestanil)-3-piridincarboxilato,
o
5-astato-3-piridincarboxilato.
Los compuestos de piridincarboxilato son preferentes porque están
positivamente cargados a pH lisosomal. La D-Lys se
prefiere como un aminoácido para el oligopéptido en esta
composición, ya que el compuesto de ácido carboxílico se puede unir
a través del grupo \varepsilon-amino de Lys. Se
puede incorporar un radionucleido, por ejemplo, ^{18}F,
^{75}Br, ^{76}Br, ^{77}Br, ^{123}I, ^{124}I, ^{125}I,
^{131}I y ^{211}At al compuesto de ácido carboxílico utilizando
métodos disponibles en la técnica. Ver Zalutsky y Narula (1987).
Las composiciones según la presente invención se
pueden utilizar para marcar internamente una célula. Un marcador se
puede incorporar a una célula o un grupo de células mediante el
contacto de la célula con una composición de la presente invención.
Tal como se describe en los párrafos anteriores, una composición de
la presente invención comprende un ligando que está unido
covalentemente a un oligopéptido, que, a su vez, está unido
covalentemente a un marcador. La célula se pone en contacto con la
composición descrita anteriormente, de manera que el marcador se
internaliza en la célula. La célula se puede localizar en el
interior del cuerpo de un humano o un animal, o se puede aislar del
cuerpo y contacta con la composición ex vivo. La composición
se puede poner en contacto con la célula mediante cualquier medio
compatible con los requisitos terapéuticos o diagnósticos del
método. Por ejemplo, la composición se puede inyectar o infusionar
en un paciente o animal mediante una ruta intravenosa, subcutánea,
intramuscular o intraperitoneal. Para una aplicación in vitro
del método, la composición se puede añadir al medio que baña la
célula. Tras la internalización del marcador, las células marcadas
se pueden detectar utilizando cualquiera de los métodos descritos
anteriormente. El contacto de una célula con la composición
significa contactar la célula tan frecuentemente o tanto tiempo como
se requiera para el objetivo de análisis, diagnóstico o terapia.
Por ejemplo, la célula se puede poner en contacto con la
composición en intervalo de minutos, horas, días, semanas,
meses
o años.
o años.
Los compuestos adecuados para acoplarse a un
ligando que se une específicamente a un antígeno de la superficie
celular puede comprender una molécula de fórmula (I):
(I)R_{1} ---
NH --- (AA)_{n} ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
--- O ---
R_{2}
El grupo -NH- representa el extremo amino y el
grupo
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
--- O
---
representa el extremo carboxilo de
la molécula. AA representa un aminoácido y n es un número entero que
tiene un valor mínimo de 1. R_{1} es H o un grupo protector de
amino y R_{2} es H o un grupo protector de carboxilo, con la
condición de que R_{1} = R_{2} = H es una condición poco
apropiada para esta molécula. O bien R_{1} o bien R_{2} es H.
Como mínimo, un residuo de aminoácido es un
D-aminoácido y, como mínimo, un residuo de
aminoácido está positivamente cargado a pH liposomal. La molécula no
comprende dos o más L-aminoácidos contiguos. En una
realización preferente, si se utilizan dos o más
L-aminoácidos, están separados entre sí por uno o
más aminoácidos cargados positivamente. La estructura es suficiente
para acoplarse a un ligando en sólo uno de su extremo amino o su
extremo
carboxilo.
Los compuestos se pueden marcar de varias
maneras. En primer lugar, un aminoácido en el oligopéptido, por
ejemplo, tirosina, se puede yodar directamente. En segundo lugar, un
grupo químico de fórmula II se puede acoplar a un grupo amino o
carboxilo libre en un residuo de aminoácido del oligopéptido, por
ejemplo, al grupo \varepsilon-amino de
D-Lys. En tercer lugar, un grupo químico de fórmula
II se puede acoplar al extremo amino o carboxilo libre del
compuesto de fórmula I. Se puede utilizar cualquier método conocido
en la técnica para el marcaje. El marcador puede ser cualquier
cualquiera de los marcadores descritos anteriormente. Por ejemplo,
el marcador puede ser un radionucleido seleccionado del grupo,
^{18}F, ^{75}Br, ^{76}Br, ^{77}Br, ^{123}I, ^{124}I,
^{125}I, ^{131}I y ^{211}At, o el marcador puede ser un
marcador fluorescente. El marcador se puede añadir antes o después
del acoplamiento del grupo químico de fórmula (II) al oligopéptido,
o antes o después del acoplamiento del oligopéptido al ligando.
Los compuestos se pueden acoplar con un ligando
en su extremo amino o extremo carboxilo. A efectos de estar tan
acoplado, en primer lugar, deben protegerse en cualquier extremo,
que no reaccionará con el ligando. Los grupos amino o carboxilo
libres se pueden proteger con cualquier grupo protector adecuado.
Los grupos amino se pueden proteger mediante la conversión a una
amida (ver, por ejemplo, J. March, 1977, en la página 383); el
grupo protector correspondiente sería entonces, por ejemplo, un
grupo alquilcarbonilo, arilcarbonilo, o aralquilcarbonilo. Los
grupos carboxilo se pueden proteger mediante la conversión a un
éster (ver, por ejemplo, J. March, 1977, en la página 431); el
grupo protector correspondiente sería entonces, por ejemplo, un
grupo alquilo, arilo, aralquilo o alquenilo. Los grupos
bloqueadores se pueden añadir o eliminar mediante métodos estándar
en la técnica.
Muchas de los objetivos moleculares conocidos
para mAbs marcados son antígenos y receptores que se internalizan.
El linfoma de células B (Press y otros, 1994; Hansen y otros, 1996),
leucemia de células T (Geissler y otros, 1991) y células de
neuroblastoma (Novak-Hofer y otros, 1994) poseen
todos antígenos que se internalizan rápidamente. Las pruebas de
inmunoterapia clínica con mAbs específicos para estos antígenos
están en proceso. Los receptores de internalización se han
utilizado para dirigir los mAbs a los tumores. Entre estos se
incluyen el receptor del factor de crecimiento epidérmico de tipo
salvaje (EGFR; gliomas y carcinoma de células escamosas; Brady y
otros, 1992; Baselga y otros, 1994), el producto del oncógeno p185
c-erbB-2 (carcinomas de mama y ovario; De
Santes y otros, 1992; Xu y otros, 1997), y el receptor de
transferrina (gliomas y otros tumores; Laske y otros, 1997). De
hecho, se ha sugerido que la internalización tiene lugar con
prácticamente cualquier mAb que se une a un antígeno de la
superficie celular (Mattes y otros, 1994; Sharkey y otros,
1997a).
Una ventaja de la internalización de mAb para la
radioinmunoterapia es el potencial para incrementar la dosis
absorbida de radiación suministrada al núcleo de la célula. Los
cálculos de la dosimetría sugieren que incluso con ^{131}I emisor
\beta en el rango multicelular, que desplaza el sitio de
descomposición desde la membrana celular a las vesículas
citoplasmáticas, podría aumentar la dosis recibida por el núcleo
celular en un factor de dos (Daghighian y otros, 1996). Por otro
lado, un inconveniente de la internalización de mAb es que este
hecho expone el mAb a procesos catabólicos adicionales que pueden
dar lugar a la liberación de radioactividad de la célula
tumoral.
La sobreexpresión del receptor de EGFR de tipo
salvaje tiene lugar en una variedad de cánceres. Sin embargo, EGFR
está también presente en muchos tejidos normales, eliminando la
ventaja de marcar el tumor. Además de provocar la sobreexpresión,
la transformación oncogénica también puede conducir a la
redistribución de genes de EGFR, incluyendo algunos que se
caracterizan por las mutaciones de deleción en el dominio
extracelular del receptor (Wong y otros, 1992). Uno de éstos,
EGFRvIII, tiene una deleción en el marco de 801 pares de bases,
dando lugar a la eliminación de los aminoácidos NH_{2} terminal 6
a 273 y la generación de un residuo de glicina novedoso en el punto
de fusión. Esto produce un receptor mutante 145 kDa, en comparación
con 170 kDa para EGFR de tipo salvaje (Humphrey y otros, 1990). La
expresión de EGFRvIII se ha observado en la mayoría de gliomas,
meduloblastomas, carcinomas de mama y ovario, así como en el 16% de
carcinomas de pulmón de células pequeñas (Garcia de Palazzo y
otros, 1993; Moscatello y otros, 1995; Wikstrand y otros, 1995). El
EGFRvIII no se ha encontrado en tejidos normales, incluyendo
aquellos que expresan el EGFR de tipo salvaje. Dado que el EGFRvIII
sólo se expresa en células que experimentan una transformación
maligna, esta molécula parece ser realmente específica de tumor y,
de este modo, de gran valor para aplicaciones diagnósticas y
terapéuticas. La citometría de flujo cuantitativa de biopsias de
pacientes de glioma ha revelado un promedio de 3 x 10^{5} a 7 x
10^{5} receptores EGFRvIII por célula (Wikstrand y otros, 1997),
un nivel que debería ser más que suficiente para marcar tumores.
Los anticuerpos que son específicos para EGFRvIII se desarrollaron
utilizando un péptido de 14-mer que corresponde a
la unión de fusión como inmunógeno (Humphrey y otros, 1990;
Wikstrand y otros, 1995). Varios mAbs, incluyendo L8A4, Y10 y H10
tienen constantes de afinidad (K_{A}) para unirse a células HC2
20 d2 positivas de EGFRvIII de entre 1,3 x 10^{9} y 2,5 x 10^{9}
M^{-1} tras la radioyodación (Reist y otros, 1995).
El mAb anti-EGFRvIII murino L8A4
IgG1 se desarrolló utilizando los protocolos que implican la
inmunización de ratones BALB/c con un péptido sintético que
representa la única secuencia de EGFRvIII, así como células HC2 20
d2 positivas de EGFRvIII (Wikstrand y otros, 1995). Este mAb
precipita específicamente EGFRvIII mutante de 145 kDa, pero no EGFR
de tipo salvaje de 170 kDa, y se internaliza en células que expresan
EGFRvIII en los 5 minutos después de la unión al receptor (Reist y
otros, 1995). La constante de afinidad para la unión de L8A4
murino al neoepítopo de EGFRvIII, determinada mediante la resonancia
por plasmón de superficie, es de 2,0 \pm 1,0 x 10^{9} M^{-1}
(Reist y otros, 1997). Las construcciones de Fv de cadena única
(scFv), basadas en la región variable de L8A4, también se pueden
utilizar en lugar del anticuerpo L8A4 completo. Un monómero de scFv
se marcó con SIPC y se encontró que tenía un K_{A} de 1,5 x
10^{8} M^{-1} y una fracción inmunorreactiva de
65-80%. Las construcciones multivalentes se crearon
mediante la variación de la longitud del enlazador entre los
dominios V_{L} y V_{H}; con un enlazador de 5 aminoácidos, se
generó un dímero con una K_{A} de 5,5 x 10^{9} M^{-1} medido
mediante la resonancia por plasmón de superficie.
Las dosis repetidas de anticuerpos murinos en
humanos según se requiere para una eficacia terapéutica óptima
conducen al desarrollo de respuestas de anticuerpo
anti-ratón humano (Tjandra y otros, 1990) que pueden
causar reacciones alérgicas o inhibir el marcaje del anticuerpo
murino al tumor. Este problema se puede resolver mediante la
producción de anticuerpos recombinantes humanos/murinos (también
denominados anticuerpos humanizados), que contienen las regiones
variables murinas específicas de tumor, unidas a una región
constante de inmunoglobulina humana. Se produjo una versión
recombinante quimérica de L8A4 (chL8A4), que posee la especificidad
anti-EGFRvIII del anticuerpo L8A4 murino junto con
los dominios constantes de IgG_{2} humanos (para los detalles de
la generación de chL8A4, ver Reist y otros, 1997, y referencias en
la misma). La IgG_{2} humana tiene una afinidad baja para los
receptores de Fc; la utilización de sus regiones constantes minimiza
de este modo la captación no específica. Después de marcar con
^{125}I- o ^{131}I-SIPC, las propiedades de
captación en el tumor de chL8A4 eran similares a las de L8A4
murino. Sin embargo, la captación en tejido normal aumentó 2 veces
en 72-120 horas (Reist y otros, 1997), sugiriendo
algunas diferencias en el proceso y en la captación en tejido
normal en comparación con el anticuerpo murino. Algunos detalles
adicionales sobre la producción de anticuerpos quiméricos mediante
métodos de recombinación se pueden encontrar en Hoogenboom y otros,
1996, Patente U.S.A. 5.565.332.
Un número de grupos han demostrado que el
catabolismo de mAbs marcados y fragmentos es un proceso complejo,
dando lugar a la generación de catabolitos marcados múltiples (Garg
y otros, 1995; Rogers y otros, 1996; Wu y otros, 1997). Con mAbs
radioyodados, una consideración importante es la extensión de la
deshalogenación que tiene lugar in vivo, un fenómeno que se
cree generalmente que está mediado por los enzimas implicados
normalmente en el metabolismo de la hormona tiroides. El hígado, el
riñón, tiroides y otros tejidos normales poseen múltiples
desyodinasas de especificidad variante para yodotirosinas y
yodotironinas (Leonard y Rosenbert, 1977; Visser y otros, 1988;
Boye y Laurberg, 1984). De potencial relevancia para el tratamiento
de tumores del SNC es el hecho de que las desyodinasas de la
hormona tiroides también se han encontrado en cerebros humanos
normales (Campos-Barros y otros, 1996) y en tumores
cerebrales humanos (Mori y otros, 1993). Las proteasas también
tienen una función en la degradación de mAbs marcados. Las
propiedades de la región constante de mAb pueden influir en su
resistencia a la proteolisis y a la naturaleza de los catabolitos
que se generan. La degradación proteolítica acelerada de mAbs
podría tener lugar en tumores debido a las acciones de las proteasas
implicadas en la invasión metastática (Liotta y Kohn, 1997). Por
ejemplo, la catepsina B se expresa en gliomas humanos a niveles que
parecen correlacionarse con el grado de malignidad (Rempel y otros,
1994; Mikkelsen y otros, 1995; Sivaparvathi y otros, 1995). Esta
proteasa tiene una amplia especificidad de sustrato y se ha
observado que divide los enlaces peptídicos en conjugados de mAb (Li
y Meares, 1993).
La internalización de mAbs crea un problema
adicional desde la perspectiva del marcaje ya que generalmente da
lugar a la exposición del mAb marcado a las numerosas proteasas
encontradas en lisosomas. La degradación lisosomal de una
diversidad de mAbs marcados utilizando métodos de radioyodación
convencionales se caracteriza por la rápida liberación de radioyodo
de la célula tumoral in vitro, principalmente como
yodotirosina (Geissler y otros, 1991, 1992;
Novak-Hofer y otros, 1995; Press y otros, 1996;
Reist y otros, 1996), y una escasa retención de la radioactividad
en xenoinjertos de tumores in vivo (van der Jagt y otros,
1992; Reist y otros, 1995; Sharkey y otros, 1997a). El desarrollo
de mejores métodos para internalizar mAbs con marcaje requiere una
evaluación de catabolitos marcados creados en el compartimento
lisosomal, y la capacidad de estas moléculas marcadas para atravesar
la membrana lisosomal.
Muchos protocolos clínicos actuales implican la
administración de mAbs marcados con ^{131}I en gliomas quísticos
espontáneos y cavidades de resección de gliomas creados
quirúrgicamente, y mediante la ruta intratecal para meningitis
neoplásicas (Brown y otros, 1996; Bigner y otros, 1995, 1998). La
presencia de enfermedad residual mínima hace que estos ajustes sean
favorables para la radioinmunoterapia (Sautter-Bihl
y otros, 1996) mediante la minimización del impacto de no
uniformidades en la expresión de antígenos, el flujo sanguíneo, la
permeabilidad y la presión intersticial, así como la barrera del
sitio de unión, en la heterogeneidad de la dosis en el tumor (Jain,
1996; Zhu y otros, 1997). Debido a su corto rango en el tejido, las
partículas \beta de baja energía de ^{131}I y las partículas
\alpha de ^{211}At se deberían corresponder bien con
aplicaciones terapéuticas, tales como las que implican focos de
tumores pequeños, láminas delgadas de tumores compartamentales, y
células tumorales flotantes. Aunque los emisores \beta de energía
elevada, tales como ^{90}Y, son atractivos para otras
aplicaciones terapéuticas, ^{131}I debería ser más útil para
tratar micrometástasis ya que puede depositar un fracción más
elevada de su energía de descomposición en el tumor (O'Donoghue y
otros, 1995; O'Donoghue, 1996; Nahum, 1996).
El diagnóstico inicial y las pruebas clínicas
terapéuticas con mAbs marcado se realizaron con ^{131}I. Desde
entonces, se han desarrollado métodos para marcar mAbs con muchos
otros nucleidos. No obstante, la mayoría de pruebas de
radioinmunoterapia clínicas aún utilizan ^{131}I, y existe una
fuerte lógica para seguir haciéndolo. Incluso cuando su rayo
\gamma de 364 keV no es ideal para la imagen, permite la
monitorización directa de la farmacocinética de una dosis de
terapia de mAb marcado con ^{131}I, que proporciona información
valiosa que se refiere a la dosimetría específica del paciente
(Brown y otros, 1996). Además, se están desarrollando mejores
métodos para la imagen de niveles terapéuticos de ^{131}I en
tumores (Smith y otros, 1997a, 1997b). Otros nucleidos de radioyodo
son más apropiados para la formación de imágenes. Particularmente
para aplicaciones cuantitativas, el ^{123}I es un nucleido más
atractivo para la imagen de mAbs a través de SPECT (Buchegger y
otros, 1995). La imagen por SPECT se realizó tras la administración
intravenosa de 81C6 marcado con ^{123}I para determinar el efecto
de dosis de proteína mAb en proporciones de tejido con tumor con
respecto a tejido normal (Schold y otros, 1993). El
yodo-124 se puede utilizar para combinar la
radioinmunoescintilacióngrafía con PET (Arbit y otros, 1995). La
disponibilidad de múltiples nucleidos de radioyodo que emiten rayos
\gamma adecuados para la detección externa es una ventaja
principal no sólo para aplicaciones clínicas sino también para
estudios preclínicos. Los experimentos de marcadores emparejados que
utilizan mAbs ^{131}I y ^{125}I (ver Ejemplos
2-4) pueden comparar directamente diferentes métodos
de marcaje o mAbs en los mismos animales, y obteniendo así las
diferencias en la expresión de antígenos, tamaño del tumor, la
hemodinámica, y la velocidad catabólica que pueden existir entre
grupos de animales.
Se ha considerado generalmente que la
astatina-211 es el emisor \alpha más prometedor
para la radioinmunoterapia. En la mayoría de ajustes, su vida media
de 7,2 horas es más compatible con la farmacocinética de mAbs y
fragmentos de mAbs que los emisores \alpha alternativos
^{212}Bi (61 min) y ^{213}Bi (47 min). Cada descomposición de
^{211}At produce una partícula \alpha de 5,87 a 7,45 MeV, sin
emisiones \beta acompañantes. Una consecuencia accidental de la
disminución de la captura de electrones de ^{211}At es la emisión
de rayos x de polonio K de 77-92 keV que tienen
suficiente energía para permitir el recuento gamma y la formación de
imagen externa de distribuciones de ^{211}At mediante métodos de
planaridad y SPECT (Turkington y otros, 1993; Johnson y otros,
1995). Un problema significativo que ha dificultado la investigación
clínica de mAbs marcados con ^{211}At ha sido la disponibilidad
fiable de niveles de actividad suficientes de ^{211}At. Utilizando
objetivos de ciclotrones internos desarrollados recientemente, se
pueden producir entonces más de 40 mCi/h de ^{211}At (Larsen y
otros, 1996; Schwarz y otros, 1998), permitiendo la preparación de
niveles suficientes de ^{211}At para permitir estudios clínicos
con mAbs marcados con ^{211}At. Las partículas \alpha de
^{211}At tienen un intervalo de 55-70 \mum de
tejido, una característica que encaja satisfactoriamente con el
tratamiento de cánceres extendidos compartimentalmente, incluyendo
la meningitis neoplásica, enfermedad micrometastática, y tumores en
la circulación, tales como linfomas.
Las proteínas marcadas utilizando aproximaciones
de yodación directa experimentan frecuentemente una rápida pérdida
de marcador in vivo. Esos métodos generan principalmente
residuos de tirosina marcados, dando lugar al reconocimiento de
estas yodotirosinas mediante las desyodinasas implicadas normalmente
en el metabolismo de la hormona tiroides. Los grupos químicos de
fórmula (II) se pueden utilizar para evitar este problema. Por
ejemplo, el reactivo N-succinimidil
3-yodobenzoato (SIB) se puede sintetizar con un alto
rendimiento mediante la yododestanilación (Zalutsky y Narula,
1987). SIB explota la rápida eliminación de catabolitos de
yodobenzoato del cuerpo, reduciendo una menor captación de
radioactividad por los tejidos normales en comparación con el yodo
(Zalutsky y Narula, 1988). El grupo relacionado
N-succinimidil 3-[^{211}At] astatobenzoato (SAP)
se puede preparar de forma similar. Cuando las proteínas se marcan
con ^{211}At utilizando métodos de sustitución electrofílica
directa, tiene lugar una rápida deshalogenación, incluso bajo
condiciones in vitro (Aaij y otros, 1975). Utilizando SAP, ha
sido posible marcar mAbs con el mantenimiento de su capacidad
localizadora de tumores (Zalutsky y otros, 1989b).
SIB y SAB se pueden utilizar para radiohalogenar
directamente un ligando, tal como mAb. Aunque la radiohalogenación
directa utilizando SIB o SAP disminuye la desyodación, no evitan la
pérdida de marcador de las células tumorales después de la
internalización de mAbs (Reist y otros, 1996). La estrategia más
ampliamente investigada para marcar mAbs de internalización intenta
explotar la resistencia de ciertos oligosacáridos a la degradación
por hidrolasas lisosomales (Thorpe y otros, 1993). Se han descrito
evaluaciones preclínicas con mAbs marcados utilizando conjugados
tiramina de celobiosa (TCB) (Ali y otros, 1990; Reist y otros,
1995), inulina (Thorpe y otros, 1993) y dilactitol (Stein y otros,
1995, 1997). En comparación con otros métodos de yodación, la
utilización de estos conjugados para marcar mAbs de internalización
aumentaba generalmente la retención de radioyodo en células
tumorales in vitro y en xenoinjertos en tumores in
vivo. Desafortunadamente, la traducción de estos métodos de
marcaje en el dominio clínico se ha visto dificultada por un
conjunto de problemas, incluyendo la reticulación y agregación de
mAbs, la inmunoreactividad comprometida, la especificidad disminuida
en el marcaje de tumores, bajas eficacias de conjugación y
actividades específicas, y una mayor retención en tejidos normales,
tal como hígado, bazo y riñones (Pittman y otros, 1983; Ali y otros,
1990; Reist y otros, 1995; Press y otros, 1996; Stein y otros, 1995,
1997).
Una estrategia alternativa para marcar mAbs de
internalización implica el acoplamiento de un grupo prostético
marcado al mAb que está cargado positivamente a pH lisosomal. Las
moléculas cargadas positivamente, tales como el Rojo Neutro y la
cloroquina son acumuladas rápidamente por los lisosomas (Holtzman,
1989). De este modo, si los catabolitos marcados creados durante la
degradación proteolítica de mAbs están cargados positivamente a pH
lisosomal, entonces también deberían retenerse en el lisosoma. A
efectos de aplicar esta estrategia, se desarrollaron dos grupos
químicos cargados positivamente, carboxilato de
succinimidil-yodo-piridina (SIPC) y
carboxilato de
succinimidil-astato-piridina (SAPC)
(Garg y otros, 1991, 1993). La utilización de SIPC para marcar mAb
L84A dio lugar a una retención intracelular significativamente
aumentada de radioactividad en comparación con otros métodos, con
un descenso concomitante en la radioactividad liberada de la célula
(ver Ejemplo 1). Esto verificó que un marcador radiohalógeno
cargado positivamente unido a un mAb apropiado tiene una retención
y resistencia superiores a la degradación en comparación con los
marcadores que no están cargados positivamente.
La degradación proteolítica de proteínas en
lisosomas dio lugar a una rápida liberación de
L-aminoácidos constituyentes de la célula
(Reijngoud y Tager, 1977). Esto justifica presumiblemente la
liberación de monoyodotirosina de células tumorales tras la
internalización de mAbs que han sido marcados mediante métodos
convencionales (Geissler y otros, 1991). Los
D-aminoácidos no son sustratos naturales para
enzimas endógenas (Milton y otros, 1992), incluyendo las presentes
en lisosomas (Ehrenreich y Cohn, 1969). Esta invención utiliza uno o
más D-aminoácidos en un oligopéptido enlazador
entre el mAb y el grupo prostético marcado, que potencia la captura
de radioactividad en el interior de la célula tumoral tras la
internalización de mAb.
Los estudios de Ehrenreich y Cohn (1969) ofrecen
algunas guías con respecto a la naturaleza del enlazador de
D-aminoácido. Tras la captación endocítica en
lisosomas, se capturaron un dipéptido cargado y un tripéptido
neutro, mientras que no fueron captados 6 dipéptidos neutros. Por lo
tanto, a efectos de maximizar la retención en lisosomas, el péptido
enlazador debería contener múltiples aminoácidos cargados
positivamente, preferiblemente acoplados a SIPC o SAPC cargados
positivamente.
Los esquemas para preparar dos realizaciones
preferentes se muestran en las figuras 1A y 1B. En la figura 1A, el
tetrapéptido
\alpha-N-Ac-D-Lys-D-Arg-D-Arg-D-Arg
(SEC ID No. 1) protegido en el N-terminal, que se
puede obtener de un laboratorio de síntesis convencional se marca
mediante la reacción con SIPC en presencia de trietilamina y DMF
utilizando condiciones previamente descritas (Garg y otros, 1996;
Vaidyanathan y Zalutsky, 1997). La arginina se seleccionó para este
objetivo porque su cadena lateral es la más básica (pKa = 13,2) de
los aminoácidos naturales. El péptido marcado se acopla a
continuación al mAb utilizando
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC) soluble en agua y sulfo N-hidroxisuccinimida
en tampón de ácido 4-morfolinoetanosulfónico (MES),
pH 4,5-5 (Staros y otros, 1986; Gilles y otros,
1990). El grupo amino terminal se puede dejar en la forma protegida
y se podría dividir in vivo.
Un procedimiento alternativo implica la adición
de un D-Tyr al N-terminal del
péptido y el marcaje del péptido utilizando directamente yodógeno
(figura 1B). En este caso, el péptido protegido en
N-terminal podría consistir, por ejemplo, en
\alpha-N-Ac-D-Tyr-D-Arg-D-Arg-D-Arg
(SEC ID No. 2). La
monoyodo-D-tirosina es más estable
a la desyodación in vivo que su enantiómero L (Kawai y otros,
1990). Esto está relacionado probablemente con el reconocimiento de
la desyodinasa estereoespecífica (Dumas y otros, 1973). Sin embargo,
SIPC y SIB son incluso más resistentes a la desyodación, haciendo
que el péptido de D-Tyr sea menos útil a pesar de su
conveniencia potencial.
La descripción anterior describe, de forma
general, la presente invención. Se puede obtener una comprensión
más completa haciendo referencia a los siguientes ejemplos
específicos, que se dan a conocer en la presente invención con
propósitos únicamente de ilustración y sin pretender limitar el
alcance de la presente invención.
Preparación de SIPC. A partir de ácido
5-bromonicotínico se sintetiza STPC en tres etapas
tal como se ha descrito (Garg y otros, 1991) y se utiliza como
precursor para la preparación de SIPC y SAPC. Aunque los métodos
publicados de marcaje de SIPC han sido efectivos, implican niveles
relativamente altos del precursor de estaño, a una temperatura de
reacción de 60-65ºC y purificación de HPLC. Estas
características pueden ser menos que ideales para preparaciones de
un nivel de actividad más elevado, particularmente aquellas
destinadas a uso clínico. Utilizando un nuevo procedimiento, se
puede llevar a cabo la radioyodación de SIPC a temperatura ambiente
con un rendimiento mayor a 80% utilizando bastante menos STPC. En
este nuevo procedimiento, se añaden 10 \mug de STPC en 10 \mul
de CHCl_{3} en un vial de cristal, y se añaden 2 \mul de HCl 1
N, yoduro [^{131}I] sódico y 20 \mul de N- clorosuccinimida (2
mg/ml en CHCl_{3}). Se centrifuga la mezcla y se hace reaccionar
durante 30 minutos. Después de añadir 100 \mul de CHCl_{3}, se
purifica el [^{131}I]SIPC mediante HPLC utilizando una
columna de sílice eluida con hexano:acetato de etilo:AcOH
(65:35:2).
Producción de
astatina-211. La astatina-211 se
puede producir en un ciclotrón mediante el bombardeo de dianas de
metal de bismuto natural con partículas \alpha de
28-MeV a través de la reacción ^{209}Bi
(\alpha,2n)^{211}At. Se ha descrito detalladamente en
una publicación reciente (Larsen y otros, 1996) un sistema interno
de diana específicamente diseñado para la producción de ^{211}At.
Las características del diseño de esta diana, que han permitido la
producción de altos niveles de ^{211}At, incluyen una cara diana
curvada, ángulos de incidencia pequeños y monitores de rastreo y
conducción de grafito aislados eléctricamente para una
monitorización continua de la corriente de haz. Ha sido posible
utilizar corrientes de haz altas del ciclotrón sin una excesiva
deposición de calor local, lo cual causaría la pérdida de
^{211}At de la diana. Utilizando esta diana, la eficacia de la
producción de ^{211}At ha sido aproximadamente de 1 mCi por
\muA-hr, un nivel considerablemente más alto que
aquellas obtenidas con una diana externa. Corrientes de haz de 75
\muA o más han sido utilizadas de forma rutinaria. Puede
utilizarse un procedimiento de destilación seca para separar
^{211}At de la diana del ciclotrón, y se puede atrapar el
^{211}At con un rendimiento superior al 50% en pequeños volúmenes
de NaOH, CHCl_{3}, u otros disolventes (Larsen y otros, 1996).
Utilizando este método, puede producirse ^{211}At a niveles que
son suficientes para permitir el uso clínico de los radiofármacos
marcados con ^{211}At.
Preparación de SAPC. Este procedimiento
fue descrito en una publicación reciente (Foulon y otros, 1998). Se
añaden 20 \mul de NaOH 0,01 N a un vial que contiene la actividad
^{211}At (1 mCi en 50 \mul de CHCl_{3}), y después de
centrifugar suavemente, la capa orgánica se evapora bajo una
corriente de nitrógeno. La actividad se transfiere a un segundo
vial y el pH de la solución se ajusta a menos de 5 mediante la
adición de ácido acético:cloroformo, 5:95. Se añaden
N-clorosuccinimida (10 \mul, 13,3 mg/ml en
CHCl_{3}) y STPC (500 \mug en 10 \mul de CHCl_{3}) y la
reacción continúa a 65ºC durante 5 minutos. Se purifica el SAPC
mediante HPLC utilizando el mismo sistema descrito que el descrito
para el SIPC. Los rendimientos para el SAPC han sido variables.
Entre los factores importantes para la optimización se incluyen los
niveles de precursor de estaño, tiempo de reacción y temperatura,
oxidante y disolvente. La última variable parece ser particularmente
importante; se obtuvo SAPC con un rendimiento del 70% cuando se
realizó el marcaje en una mezcla de diclorometano y THF.
Acoplamiento de SIPC y SAPC con mAbs. El
disolvente orgánico se evapora de las fracciones de HPLC que
contienen SIPC o SAPC, y se transfiere el residuo a un pequeño vial
de cristal y se evapora hasta sequedad con una corriente de
nitrógeno. Se añade el mAb en tampón borato de pH 8,5, y se incuba
la mezcla en un agitador rotativo durante 15 minutos. La reacción
se finaliza mediante la adición de 0,3 ml de glicina 0,2 M. El mAb
marcado se purifica utilizando una columna Sefadex
G-25 de 1 x 10 cm. A concentraciones de mAb de 3
mg/ml, se obtienen rutinariamente eficacias del 70% en los
acoplamientos.
HPLC. Se analiza una alícuota de mAb
marcado mediante HPLC de exclusión por tamaño en una columna TSK3000
para determinar el porcentaje de radioactividad presente como
agregados, IgG monomérico e impurezas de bajo peso molecular.
Fracción inmunorreactiva. Para los mAbs
anti-EGFRvIII, se almacenan homogenatos de
xenoinjerto de tumor EGFRvIII-positivo
(U87MG\DeltaEGFR o HC2 20 d2) y cerebro de rata normal
EGFRvIII-negativo a una temperatura de -135ºC hasta
que se necesite. Se incuban durante toda una noche aproximadamente 5
ng de mAb marcado a 4ºC por triplicado con 100, 300 y 500 mg de cada
homogenato y, a continuación, se lavan 3 veces con un 1% albúmina de
suero bovino (BSA) enfriada con hielo en una solución salina
tamponada de fosfato (PBS). Se calculan fracciones inmunorreactivas
de acuerdo con el método de Lindmo y otros (1984).
Constante de afinidad. Se utiliza el
análisis de Scatchard para medir tanto la afinidad de unión de mAbs
tras el marcaje como el número promedio de receptores/célula. Se
incuban a 4ºC durante toda la noche como mínimo 10 diluciones en
serie de mAb marcado (de 10 ng/ml a 10 \mug/ml) por cuadriplicado
con 1 x 10^{6} células U87MG\DeltaEGFR que expresan EGFRvIII o
células de control negativas del receptor NIH 3T3. Se agrupan las
células, se lavan tres veces con BSA/PBS al 1%, y se contabiliza la
actividad asociada a células en un contador gamma automatizado. Se
analizan los datos mediante el programa de unión de radioligandos
RADLIG (Biosoft, Ferguson, MO).
Internalización y procesamiento celular.
Se incuban mAbs radiomarcados con células U87MG\DeltaEGFR en
exceso de anticuerpos (3 mg/10^{6} células) durante 1 hora a 4ºC,
y el mAb no unido se extrae mediante un lavado con BSA/PBS al 1%.
Se ajusta la temperatura hasta 37ºC, y se extraen partes alícuotas
para analizar tras 0, 1, 2, 4, 8, y 20 horas. Las células son
peletizadas, y se saca el sobrenadante del cultivo para el recuento.
Las células se lavan dos veces con un medio Zinc Option (pH 2) para
determinar la actividad unida a la superficie. La actividad
asociada a las proteínas en el sobrenadante de cultivo se determina
mediante la precipitación con TCA al 12,5%, o para experimentos que
implican ^{211}At, metanol. Se representan en función de tiempo
(Reist y otros, 1995) la actividad asociada a células
internalizadas, células de la superficie, asociada a proteína del
sobrenadante y asociada a elementos no proteínicos del sobrenadante.
Se puede incluir 25 mM de cloroquina en el medio de incubación para
estudiar el efecto de la inhibición de la función lisosomal en el
procesamiento celular de los mAbs anti-EGFRvIII
marcados (Press y otros, 1990).
La citotoxicidad de los mAbs internalizados
marcados con emisores \beta y \alpha puede evaluarse in
vitro. Los cálculos de dosimetría sugieren que la citotoxicidad
de los electrones Auger, de las partículas \alpha y las
partículas \beta emitidas desde sitios intracelulares de
descomposición son mayores que aquellas que las existentes en la
membrana celular, y los datos experimentales in vitro
obtenidos con un mAb marcado con ^{125}I concuerdan con esta
predicción (Goddu y otros, 1994; Daghighian y otros, 1996). La
citotoxicidad de los mAbs marcados y otros compuestos para células
tumorales ha sido investigada bajo condiciones monocelulares
(Strickland y otros, 1994), como microcolonias (Larsen y otros,
1998) y en esferoides (Hauck y otros, 1998).
La capacidad de proliferación de las células
EGFRvIII-positivas se puede determinar mediante un
ensayo clonogénico de dilución limitante. Utilizando ese formato de
ensayo, se evaluó la citotoxicidad de
m-[^{211}At]astatobencilguanidina tan sólo en una fracción
de supervivencia de aproximadamente 10^{-5} (Strickland y otros,
1994). La línea celular preferente es U87MG\DeltaEGFR, ya que es
actualmente la línea primaria utilizada para la generación de
xenoinjertos de EGFRvIII positivos in vivo. No obstante,
otras líneas de expresión de EGFRvIII, tales como HC2 20 d2, NR6M y
D1105 también se pueden estudiar ya que difieren con respecto a la
velocidad y la extensión en las que se internalizan mAbs
anti-EGFRvIII (Reist y otros, 1997). En este ensayo,
se cultivan mecánicamente células en crecimiento exponencial, se
recuentan en un hemocitómetro y se incuban con concentraciones de
actividad variantes de mAb marcado durante 30 minutos en un
agitador rotativo a 37ºC. Se utiliza una densidad celular de
aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml para minimizar la
eliminación no específica de actividad no unida en el medio. Como
control no específico, se realizan incubaciones en las que, como
mínimo, un exceso de 100 veces de mAb no marcado se ha añadido a
las células. Tras la incubación, las células se centrifugan a 100 g
durante 10 minutos y se aspira el sobrenadante. Los gránulos de
células se resuspenden, se repite el proceso de lavado, y las
células se resuspenden a una concentración de 10^{6} células/ml en
medio esencial mínimo Zinc Option suplementado con un 15% de suero
de ternera fetal. A continuación, las células se pasan a través de
9 diluciones en serie diluidas cinco veces dando lugar a
concentraciones de células finales que varían de 10^{5} a 0,256
células depositadas por pocillo. Se realizan un total de seis
pocillos de replicados para cada concentración de células en
evaporación baja, tratados con cultivo de tejido y placas de 96
pocillos de poliestireno. Después de una incubación de 12 días a
37ºC en un incubador humidificado, los pocillos de cada placa se
califican como crecimiento positivo o crecimiento negativo en base a
la presencia o ausencia de, como mínimo, una colonia clonal de 30 o
más células. La media de la función de respuesta de las dosis para
cada terapia y el número estimado de unidades clonogénicas por ml se
calculan utilizando un estimado de Spearman (Johnson y Brown,
1961). La respuesta clonogénica de cada grupo de tratamiento,
expresado como el porcentaje de dos controles no tratados, a
continuación se representa frente a la actividad media añadida por
ml. En paralelo, la captación y retención de radioactividad por las
células diana en la superficie celular y los compartimentos
intracelulares se miden para permitir el cálculo de la dosimetría, y
para estudiar el efecto potencial de la internalización en la
citotoxicidad. Los sitios de localización intracelular se observan
mediante microscopía de inmunofluorescencia (Reist y otros,
1995).
Antes del inicio de los estudios de terapia en
animales con tumores, se determinaron la dosis máxima tolerada
(MTD) y LD_{10} (dosis letal para el 10% de los animales). Se
suministran a ratones o ratas atímicas normales solución salina o
bien incrementos medio-logarítmicos de mAb marcado
y, a continuación, siguió una pérdida de peso, síntomas
neurológicos y muerte. El peso promedio se monitoriza diariamente, y
la autopsia se practica a los animales dentro de las 12 horas
después de la muerte para buscar una evidencia histológica de la
toxicidad de órganos normales. Los estudios de radioterapia en
animales con tumores se realizan a un 80% de la MTD.
Xenoinjertos subcutáneos. Estos estudios
se pueden realizar utilizando protocolos descritos previamente
(Schuster y otros, 1991). Los ratones con xenoinjertos
U87MG\DeltaEGFR subcutáneos progresivamente crecientes se asignan
al azar en grupos de 10 animales cuando los tumores alcanzan los
150-200 mm^{3}. A los grupos de 10 animales se
administra solución salina, L8A4 no marcado, o dos niveles de
actividad de mAb L8A4 marcado y mAb de control no específico
P3X63Ag8. La respuesta se evalúa en términos del retraso en el
crecimiento y la regresión del tumor. El retraso del crecimiento se
define como la diferencia en días entre cuando el tratamiento y los
grupos de control alcanzan los 1000, 2000, 3000, 4000 y 5000
mm^{3}. La regresión del tumor se define como dos mediciones
consecutivas del volumen menores que el volumen del tumor en el día
de tratamiento. La significancia estadística se determina
utilizando el test de la suma de rangos de Wilcoxon. Para los
cálculos de la dosis de radiación absorbida, las distribuciones en
el tejido se miden en grupos paralelos de 5 animales que reciben
dosis terapéuticas de mAbs marcados. Estos estudios son necesarios
ya que los estudios de distribución de mAb a nivel traza pueden
subestimar la dosis de radiación recibida por el tumor debido al
crecimiento rápido del xenoinjerto (Lee y otros, 1988). En base a
los resultados de las pruebas con dosis únicas, se pueden investigar
las pautas terapéuticas con dosis múltiples tal como se ha descrito
(Colapinto y otros, 1990).
Xenoinjertos intracraneales . El
protocolo seguido es similar al descrito previamente (Colapinto y
otros, 1990). En el día previo al tratamiento, los animales se
mezclan al azar según el peso corporal, y se utilizan 10 ratones por
grupo de tratamiento. Se sacrifican cinco ratones adicionales en el
día del tratamiento para confirmar la existencia de tumores y se
determina el volumen tumoral promedio presente en el inicio de la
terapia. Los experimentos se inician cuando el tamaño del tumor es
de 15-20 mm^{3}. Los animales se mantienen en
jaulas individuales en una habitación protegida con plomo y se
comprueban su supervivencia dos veces al día. Los animales se
examinan en su muerte para confirmar la presencia de un tumor
intracraneal. La respuesta terapéutica se evalúa como la
prolongación de la supervivencia utilizando el estimador límite del
producto de Kaplan y Meier (1958).
Meningitis neoplásicas. Estos estudios se
pueden realizar en un modelo de rata atímica de meningitis
neoplásticas utilizando los protocolos similares a los descritos en
una publicación reciente (Zalutsky y otros, 1994). Se colocan
catéteres subaracnoides en hembras, ratas atímicas
BIG:NIMR-mu[SPF] que pesan
200-250 mg (Fuchs y otros, 1990). Los animales se
anestesian con quetamina/xilacina y se colocan en un marco
esterotáctico. Se realiza una incisión sagital de media línea desde
el inion hasta el arco laminal de C1, se expone la membrana
atlanto-occipital, y la membrana externa y la
cisterna magna dura subyacente se abren con los aumentos utilizando
un microsocpio de trabajo. Se inserta un catéter
PE-10 en el espacio subaracnoide y se pasa a lo
largo de la parte posterior de la médula espinal hasta la región
lumbar. Después de fijar el catéter en el sitio con epoxi dental, se
pasa a través de la piel de forma lateral a la incisión y se cierra
la herida. Los animales se dejan recuperarse y sólo se utilizan
aquellos que muestran una función motora y sensorial normal. La
meningitis neoplástica se induce mediante la inyección de 5 x
10^{6} células U87MG\DeltaEGFR en 40 \mul a través del catéter
con una jeringa de Hamilton y se inician estudios de terapia
5-8 días después. Grupos de 10 animales reciben
dosis graduadas de mAbs marcados o de control. La respuesta
terapéutica se evalúa como prolongación de supervivencia utilizando
el estimador límite del producto de Kaplan y Meier (1958). Después
de la muerte, la columna vertebral y el cráneo se extraen intactos y
se procesan para histología tal como se ha descrito (Zalutsky y
otros, 1994).
Autorradiografía cuantitativa (QAR). Se
utilizó QAR para evaluar la distribución regional de radioactividad
en el tumor y el tejido normal adyacente. Se utilizó QAR para
estudiar la heterogeneidad del suministro de 81C6 murino en
xenoinjertos D-54 MG intracraneales y subcutáneos
(Blasberg y otros, 1987), así como para investigar los efectos de
la hipertermia localizada en el tumor en la homogeneidad de la
deposición de mAb en xenoinjertos subcutáneos (Zalutsky y otros,
1996). QAR se llevó a cabo en un formato de marcador único con
animales que reciben mAb marcado con ^{125}I o con ^{211}At. A
intervalos de tiempo seleccionados basados en los estudios de
distribución en los tejidos, se sacrifican los animales, y los
tumores se extraen y se congelan bruscamente en nitrógeno líquido.
Los tumores se montan sobre tablas de madera en un medio de montaje
M-1 y se cortan por etapas secciones de 20 \mum
en un criomicrotomo a -20ºC. Las secciones se colocan en un
portamuestras de vidrio, se secan en un calentador de portamuestras
a 65ºC y se colocan en cintas de película para un periodo de
exposición apropiado para el nivel de actividad en la sección.
Después de desarrollar la película, las secciones se manchan con
hematoxilina y eosina, y se genera una imagen digital para la
alineación con la imagen autorradiográfica. La concentración de
actividad en las regiones de autorradiografía se cuantifica por
comparación con patrones que se preparan mediante la adición de
cantidades conocidas de ^{125}I o ^{211}At a homogenatos de
cerebro de rata que se congelan y se tratan idénticamente a las
muestras del tumor. El análisis de imágenes se puede realizar
utilizando un sistema Amersham RAS R-1000 y se puede
obtener el programa de análisis de imagen en grano in situ
de Loats Associates. Dependiendo de la resolución espacial
necesaria, el análisis de la imagen se puede llevar a cabo
utilizando un dispositivo de formación de imágenes fosfóricas
Store
860.
860.
Cálculos de la dosis de radiación
absorbida. Se puede utilizar una aproximación MIRD modificada en
la que se presume una distribución uniforme de radioactividad.
Según se sugiere, en una revisión reciente de la dosimetría de
partículas \beta en tumores experimentales (Leichner y Kwok,
1993), debería considerarse el efecto de la fracción de partículas
\beta absorbidas, particularmente en tumores más pequeños, y la
distribución de fuentes heterogéneas en el tumor, que se puede
evaluar mediante QAR. Los cálculos para mAbs marcados con
^{211}At se pueden realizar tal como se han descrito (Zalutsky y
otros, 1997). Sin embargo, debido a la fluctuación estocástica de
dosis en volúmenes de diana pequeños, una valoración realista de la
dosis de radiación de ^{211}At absorbida requiere cálculos del
nivel microdosimétrico (Humm y otros, 1993). Recientemente se ha
descrito un método para calcular la dosimetría a pequeña escala de
^{211}At utilizando distribuciones de longitud de cuerda
obtenidas de imágenes histológicas digitalizadas (Akabani y
Zalutsky, 1997).
El SIPC se marcó con ^{125}I o ^{131}I
mediante la yododestanilación de STPC utilizando
N-clorosuccinimida como oxidante (Garg y otros,
1991). Después de 5 minutos de reacción a 60-65ºC y
purificación por HPLC, se obtuvo el producto con un rendimiento del
60-80%. La eficiencia para el marcaje de mAb L8A4
mediante la reacción con SIPC fue del 52-71% (Reist
y otros, 1996), valores que son casi el doble que los obtenidos para
la conjugación de TCB a este mAb (Reist y otros, 1995). No se
observó ninguna evidencia de la agregación de proteínas mediante
HPLC por exclusión de tamaño para L8A4 marcado utilizando SIPC,
mientras que un 10-20% del radioyodo estaba
presente como agregados en la mayoría de las preparaciones de TCB.
Las fracciones inmunorreactivas para L8A4 marcado utilizando SIPC
eran más elevadas que las obtenidas cuando este mAb se marcó
utilizando Yodógeno o TCB. Se realizaron ensayos in vitro
para comparar la internalización y el procesamiento celular de L8A4
marcado utilizando Yodógeno, SIPC y SIB (un reactivo que como el
SIPC, minimiza desyodación de mAb, pero a diferencia de SIPC, no
está cargado positivamente). La utilización de SIPC para marcar L8A4
dio lugar a una retención intracelular de radioactividad
significativamente aumentada en comparación con otros métodos, con
un descenso concomitante en recuentos de sobrenadante. Por ejemplo,
después de 4 horas de incubación a 37ºC, el compartimento
intracelular tenía un 24,0 \pm 0,9% de la actividad para el mAb
marcado utilizando SIPC en comparación con 13,2 \pm 0,5% con SIB,
mientras que un 12,2 \pm 0,3% (SIPC) y 36,1 \pm 1,6% (SIB) de la
actividad se encontró en el sobrenadante del cultivo celular
(figura 2). Los resultados sugieren que la mayor retención celular
para mAb marcada utilizando SIPC no está relacionada con la
desyodación disminuida.
Se sintetizó N-succinimidil
5-[^{211}At]astuto-3-piridincarboxilato
(SAPC) a partir de STPC utilizando
N-clorosuccinimida como oxidante. La eficacia para
marcar L8A4 con SAPC era idéntica a la observada con SIPC. Para L8A4
marcado con ^{211}At, las fracciones inmunorreactivas fueron del
69-89% y la afinidad (K_{A}) para la unión a la
línea celular U87MG\DeltaEGFR fue (9,7 \pm 1,3) x 10^{8}
M^{-1}. Los ensayos de internalización y procesamiento se
realizaron tal como se describe para mAbs radioyodados a excepción
de que la actividad asociada a la proteína para ^{211}At se midió
utilizando metanol en lugar de la precipitación con TCA porque se
encontró que el 98% de [^{211}At]astatida libre se
precipitó en el ensayo con TCA. Se observaron niveles comparables
de recuentos intracelulares para L8A4 marcado con ^{211}At y
^{131}I en los puntos de tiempo iniciales, pero había niveles más
elevados de actividad para ^{211}At en los sobrenadantes de los
cultivos celulares solubles en metanol, sugiriendo una liberación
más rápida de catabolitos marcados con ^{211}At. La distribución
en el tejido de L8A4 marcado con ^{211}At y ^{131}I se evaluó en
ratones atímicos que llevaban xenoinjertos subcutáneos
U87MG\DeltaEGFR. Ambos nucleidos mantuvieron los niveles en los
tumores constantes durante las 6 a 24 horas del periodo
experimental, con una captación ligeramente más elevada para
^{211}At (^{211}At, 21,6 \pm 2,7% ID/g; ^{131}I, 18,7 \pm
2,4% ID/g a las 12 horas). Los niveles de ^{211}At eran algo más
elevados que de ^{131}I en bazo, pulmones y estómago, tejidos
conocidos por acumular [^{211}At]astatida (Garg y otros,
1990).
Se realizó un ensayo in vitro de
marcadores emparejados para comparar la internalización y
procesamiento celular de mAb L8A4 marcado con ^{131}I utilizando
Yodógeno y ^{125}I utilizando el método enlazador de oligopéptido
de la invención. El anticuerpo monoclonal L8A4 fue marcado
utilizando el enlazador de oligopéptidos descrito a continuación.
El péptido
\alpha-N-Ac-D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Arg-D-Arg
(KRYRR) se obtuvo de un laboratorio de síntesis convencional y se
marcó con ^{125}I utilizando el método de Yodógeno. Se utilizó
HPLC de fase inversa para aislar KRYRR marcado con ^{125}I con un
rendimiento superior al 97%, y el péptido marcado se activó
mediante reacciones con sulfa-SM-CC
a temperatura ambiente durante 30 minutos. El mAb L8A4
anti-EGFRvIII murino se hizo reaccionar con
2-imino tiolano para generar grupos tiol libres y, a
continuación, se hace reaccionar con el conjugado de
péptido-L8A4 marcado con ^{125}I activado y se
aisló sobre una columna Sefadex
G-25-PD10. El rendimiento es de
aproximadamente el 35%.
Se utilizó la línea celular U87MG\DeltaEGFR
que expresa EGFRvIII, y los resultados se muestran en la figura 3.
Los contajes internalizados y totales asociados a la célula fueron
significativamente más elevados que el método de marcaje del
oligopéptido en los tres puntos de tiempo examinados; las
diferencias entre los dos métodos de marcaje aumentaron con el
tiempo. Por ejemplo, después de 24 horas de incubación a 37ºC, el
porcentaje de actividad retenida como recuentos internalizados fue
casi cuatro veces más elevado con el oligopéptido (yodógeno, 5,0
\pm 1,2%; oligopéptido, 18,8 \pm 5,4%). Asimismo, la actividad
total asociada a la célula (internalizada + superficie celular) fue
5,3 veces más elevada para oligopéptido-L8A4 marcado
con ^{125}I en este tiempo (yodógeno, 11,1 \pm 1,0%; péptido,
58,3 \pm 12,4%). En comparación, cuando se utilizó el péptido
utilizado por Govindan y otros (1998) y Stein y otros (1998) para
marcar un mAb de internalización, se observó un incremento de dos o
tres veces en la actividad asociada a la célula en comparación con
el mAb marcado directamente.
La distribución del tejido de L8A4 murino
marcado con ^{125}I utilizando el método del oligopéptido y con
^{131}I utilizando Yodógeno se compararon directamente en ratones
atímicos que llevaban xenoinjertos subcutáneos de glioma humano
U87MG\DeltaEGFR que expresa EGFRvIII. El anticuerpo monoclonal
L8A4 se marcó tal como se describe en el Ejemplo 8. La captación en
el tumor de los dos mAbs marcados se muestra en la figura 4. A todos
los puntos de tiempo se observaron niveles de tumor
significativamente más elevados. El método de marcaje del péptido
aumentó la retención en el tumor de la actividad de radioyodo en un
194 \pm 38% a las 12 horas, 296 \pm 47% a las 24 horas, 468
\pm 91% a las 36 horas, 542 \pm 68% a las 48 horas, y 547 \pm
69% a las 72 horas. En comparación, el péptido descrito por
Govindan y otros (1998) y Stein y otros (1998) aumentó la captación
en el tumor en sólo un 170% a las 24 horas y un 270% a las 72 horas.
Además, la ventaja de liberación en el tumor conseguida con el
método del oligopéptido era considerablemente mayor que la observada
en los estudios previos con el marcaje de L8A4 murino utilizando
otros métodos (TCB y SIPC) desarrollados para la radioyodación de
mAbs de internalización (Reist y otros, 1995, 1996, 1997).
La acumulación en la tiroides se utiliza
generalmente como un indicador de la deshalogenación de compuestos
radioyodados in vitro. Tal como se muestra en la figura 5,
los niveles en la tiroides de L8A4 marcados utilizando el método
del oligopéptido de la presente invención (tal como se describe en
el Ejemplo 8) fueron 52 \pm 9%, 29 \pm 5%, 17 \pm 1%, 11
\pm 1%, y 11 \pm 2% de los de mAbs marcados utilizando yodógeno
a las 12, 24, 36, 48 y 72 horas, respectivamente.
Con las técnicas de marcaje previas, las
proporciones de captación de marcador en el tumor con respecto a la
sangre nunca fueron superiores a 1 con L8A4 murino marcado
utilizando yodógeno (Reist y otros, 1995). En cambio, las
proporciones del tumor con respecto a la sangre para el mAb marcado
utilizando el método de oligopéptido de la presente invención (tal
como se describe en el Ejemplo 8) aumentó desde 1,8 \pm 0,6 a las
12 horas hasta 7,2 \pm 1,0 a las 72 horas (figura 6). Estas
proporciones fueron significativamente más elevadas que las
obtenidas con otros métodos de marcaje desarrollados para la
utilización con mAbs de internalización (Reist y otros, 1995, 1996,
1997).
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Claims (29)
1. Composición para marcaje interno de una
célula, que comprende
un ligando que se une específicamente a EGFRvIII
y es internalizado por la célula, en la que el ligando se selecciona
del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de un
anticuerpo, y un polipéptido sintético;
un oligopéptido que comprende, como mínimo, un
residuo de aminoácido cargado positivamente y, como mínimo, un
residuo D-aminoácido, de manera que el oligopéptido
no comprende dos o más L-aminoácidos contiguos, en
la que dicho oligopéptido está unido covalentemente al ligando;
y
un marcador que está unido covalentemente al
oligopéptido.
2. Composición, según la reivindicación 1, en la
que, si el oligopéptido comprende dos o más
L-aminoácidos, los L-aminoácidos
están separados entre sí por uno o más aminoácidos cargados
positivamente.
3. Composición, según la reivindicación 1, en la
que el marcador es un grupo de fórmula (II):
en la que X es un grupo
seleccionado del grupo que consiste en un grupo amino, carboxilo, o
sulfhidrilo; en la que Y se selecciona del grupo que consiste en C
y N;
y
en la que Z se selecciona del grupo que consiste
en F, Br, I, At y M(Alk)_{3}; en la que M se
selecciona del grupo que consiste en Si, Sn y Hg; en la que Alk se
selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo,
butilo, pentilo, y hexilo.
4. Composición, según la reivindicación 3, en la
que el marcador se selecciona del grupo que consiste en
5-yodo-3-piridincarboxilato,
3-yodobenzoato,
3-(tri-n-butilestanil)benzoato,
5-(tri-n-butilestanil)-3-piridincarboxilato,
y
5-astato-3-piridincarboxilato,
3-yodoanilina, 4-yodoanilina,
3-astatoanilina, 4-astatoanilina,
3-tributilestannilanilina y
4-tributilestanilanilina.
5. Composición, según la reivindicación 1, en la
que el ligando es un anticuerpo monoclonal.
6. Composición, según la reivindicación 1, en la
que el ligando es un anticuerpo quimérico recombinante.
7. Composición, según la reivindicación 1, en la
que el ligando es un anticuerpo humanizado.
8. Composición, según la reivindicación 1, en la
que el ligando se une selectivamente a una célula tumoral.
9. Composición, según la reivindicación 1, en la
que el oligopéptido comprende D-Tyr.
10. Composición, según la reivindicación 9, en
la que el oligopéptido comprende adicionalmente
D-Arg.
11. Composición, según la reivindicación 9, en
la que el oligopéptido comprende adicionalmente, como mínimo, tres
residuos D-Arg.
12. Composición, según la reivindicación 1, en
la que el oligopéptido comprende D-Lys.
13. Composición, según la reivindicación 12, en
la que el oligopéptido comprende adicionalmente
D-Arg.
14. Composición, según la reivindicación 12, en
la que el oligopéptido comprende adicionalmente, como mínimo, tres
residuos D-Arg.
15. Composición, según la reivindicación 1, en
la que el marcador comprende un radionucleido.
16. Composición, según la reivindicación 8, en
la que el marcador comprende un radionucleido.
17. Composición, según la reivindicación 15, en
la que el radionucleido es un emisor alfa, beta o gamma.
18. Composición, según la reivindicación 15, en
la que el radionucleido se selecciona del grupo que consiste en
^{18}F, ^{75}Br, ^{76}Br, ^{77}Br, 123I, ^{124}I,
^{125}I, ^{131}I y ^{211}At.
19. Composición, según la reivindicación 1, en
la que el marcador es fluorescente.
20. Método in vitro de incorporación de
un marcador en una célula, que comprende la etapa de:
poner en contacto la célula con la composición
según la reivindicación 1, a través de lo cual el marcador se
internaliza en la célula.
21. Método, según la reivindicación 20, en el
que el marcador es fluorescente.
22. Método, según la reivindicación 20, en el
que el marcador es radioactivo.
23. Método, según la reivindicación 20, que
comprende además la etapa de detectar el marcador.
24. Utilización de la composición, según la
reivindicación 16, en la fabricación de un medicamento para
localizar células tumorales en un mamífero, y para introducir en el
cuerpo de un mamífero que comprende células tumorales; de manera
que el cuerpo se puede escanear con un detector de escintilación
para generar una imagen que representa las células tumorales en el
cuerpo del mamífero.
25. Utilización de la composición, según la
reivindicación 16, en la fabricación de un medicamento de
utilización en radioterapia.
26. Utilización, según la reivindicación 25, en
la que el medicamento está destinado al tratamiento de un tumor.
27. Composición, según la reivindicación 1, en
la que el oligopéptido comprende, como mínimo, dos residuos de
aminoácidos cargados positivamente.
28. Método, según la reivindicación 20, en el
que la composición comprende un oligopéptido que comprende, como
mínimo, dos residuos de aminoácidos cargados positivamente.
29. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19 y 27, para el uso en terapia.
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