ES2274656T3 - Factor inductor de apoptosis. - Google Patents
Factor inductor de apoptosis. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2274656T3 ES2274656T3 ES99968001T ES99968001T ES2274656T3 ES 2274656 T3 ES2274656 T3 ES 2274656T3 ES 99968001 T ES99968001 T ES 99968001T ES 99968001 T ES99968001 T ES 99968001T ES 2274656 T3 ES2274656 T3 ES 2274656T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- aif
- apoptosis
- inducing factor
- polynucleotide
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Polinucleótido aislado que codifica un factor inductor de apoptosis de mamífero, seleccionándose dicho polinucleótido de entre el grupo constituido por ADNc y ADN sintetizado químicamente, en el que el factor inductor de apoptosis de mamífero es el factor inductor de apoptosis murino, y en el que el factor inductor de apoptosis murino comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC. ID. nº: 2 o en la SEC. ID. nº: 3.
Description
Factor inductor de apoptosis.
La presente invención se refiere generalmente a
nuevos polipéptidos con factor inductor de apoptosis (AIF) de
mamífero, a los ADN que codifican los polipéptidos con AIF y a sus
utilizaciones.
La apoptosis es esencial para el mantenimiento
de las dimensiones del tejido y de la homeostasis del número de
células de los organismos pluricelulares, y se cree que las
anomalías apoptósicas desempeñan una función importante en el
desarrollo de varias enfermedades neoplásicas así como de numerosas
enfermedades neurodegenerativas.
Las mitocondrias desempeñan una función clave en
la regulación de la apoptosis. Una variedad de fenómenos clave en la
apoptosis involucran a las mitocondrias, incluyendo la liberación de
activadores de caspasa (como por ejemplo el citocromo c), cambios en
el transporte de electrones, pérdida del potencial de transmembrana
de las mitocondrias (permitiendo de este modo que varias proteínas
que se encuentren en el espacio de la intermembrana mitocondrial se
liberen a través de la membrana de la mitocondria externa,
participando por esta razón en la fase de degradación apoptósica),
oxidación-reducción celular alterada y que involucra
a la familia de proteínas Bcl-2 pro- y
anti-apoptósica. Las diferentes señales que
convergen en las mitocondrias para activar o inhibir estos fenómenos
y sus efectos corriente abajo esbozan varias de las series de
reacciones principales en la muerte celular fisiológica.
Debido a que la apoptosis y su regulación
desempeñan una función crítica en el mantenimiento de la homeostasis
celular y tisular, existe necesidad de desarrollar el material y los
métodos para estimular o inhibir la apoptosis así como para
proporcionar sistemas para el cribado de sustancias experimentales
adicionales que estimulen o inhiban la apoptosis.
La presente invención se refiere a los
polinucleótidos aislados que codifican un factor inductor de
apoptosis de mamífero. Los polinucleótidos se seleccionan de entre
el grupo constituido por ADNc y ADN sintetizado químicamente, en el
que el factor inductor de apoptosis de mamífero es el factor
inductor de apoptosis murino o isoformas del mismo. La invención se
refiere también al factor inductor de apoptosis humano que codifica
polinucleótidos aislados o a isoformas del mismo. Todavía como otro
aspecto, la presente invención se refiere a polinucleótidos
aislados que codifican un polipéptido que presenta por lo menos del
70 al 95 por ciento de identidad con los polipéptidos que comprenden
las secuencias de aminoácidos indicadas en las SEC. ID nº: 2, nº 3,
nº 5, nº 6, nº 8, nº 9, nº 11, nº 12, nº 14, y nº 15.
La presente invención se refiere también a
polinucleótidos aislados que codifican un factor inductor de
apoptosis de mamífero, seleccionándose el polinucleótido de entre el
grupo constituido por: (a) las moléculas de ADN indicadas en las
SEC. ID nº: 1, nº 4, nº 7, nº 10, y nº 13; (b) las moléculas de ADN
que se hibridan, en condiciones de alta severidad, con las moléculas
de ADN definidas en (a); y (c) las moléculas de ADN que codifican
una expresión para los aminoácidos codificados por cualquiera de las
moléculas de ADN anteriores.
En otro de sus aspectos, la presente invención
se refiere a vectores de expresión o vectores de clonación que
comprenden cualquiera de los polinucleótidos que codifican a AIF
descrito así como a las células huésped transformadas con cualquiera
de los polinucleótidos descritos que codifican a AIF.
La presente invención se refiere también a
células de mamífero que contienen un factor inductor de apoptosis de
mamífero que codifica un ADN modificado de modo que permite una
expresión mayor del factor inductor de apoptosis por medio de un
fenómeno recombinatorio homólogo consistente en insertar una
secuencia reguladora de la expresión en proximidad operativa al ADN
que codifica el factor inductor de apoptosis, en la que la secuencia
reguladora de la expresión insertada no es una secuencia reguladora
de la expresión del factor inductor de apoptosis natural.
Aún en otro aspecto, la presente invención se
refiere a los métodos para la producción de un polipéptido del
factor inductor de apoptosis codificado por el polinucleótido según
la presente invención, comprendiendo el método las etapas
siguientes: (a) cultivar una célula huésped según las
reivindicaciones 18 ó 21 en condiciones adecuadas para la expresión
del polipéptido del factor inductor de apoptosis; y (b) recuperar el
polipéptido del factor inductor de apoptosis expresado.
La presente invención se refiere asimismo a un
factor inductor de apoptosis purificado de mamífero codificado por
el polinucleótido según la presente invención, más particularmente a
un factor inductor de apoptosis murino aislado y purificado y a las
isoformas del mismo. La presente invención se refiere además a un
factor inductor de apoptosis humano aislado y purificado y a las
isoformas del mismo.
Todavía un aspecto más de la presente invención
se refiere a las sustancias del anticuerpo que se unen
específicamente a los factores estimulantes de apoptosis descritos
anteriormente.
La presente invención se refiere también a los
derivados de los factores estimulantes de apoptosis, descritos, que
presentan una o más fracciones químicas unidas a éstos opcionalmente
en un vehículo aceptable.
La presente invención se refiere asimismo a los
métodos para la determinación de la presencia del factor inductor de
apoptosis de mamífero en una muestra biológica que comprende las
etapas siguientes: (a) obtener una muestra biológica; (b) exponer
dicha muestra biológica a un anticuerpo específico para el factor
inductor de apoptosis de mamífero según la presente invención; y (c)
detectar la unión del anticuerpo específico para el factor inductor
de apoptosis de mamífero en dicha muestra biológica. La presente
invención se refiere también a los procedimiento para determinar la
presencia de moléculas de polinucleótido específicas para el factor
inductor de apoptosis del mamífero en una muestra biológica que
comprende las etapas siguientes: (a) recoger una muestra biológica;
(b) aislar las moléculas de polinucleótido de dicha muestra
biológica; (c) hibridar a dichas moléculas de polinucleótido un
reactivo de diagnóstico según la reivindicación 39 ó 40; y (d)
detectar la unión de las moléculas de polinucleótido específicas
para el factor inductor de apoptosis de mamífero en dichas muestras
biológicas.
La presente invención se refiere asimismo a los
métodos para determinar la presencia de una molécula de
polinucleótido específica para el factor inductor de apoptosis de
mamífero en una muestra de tejido o celular que comprende las etapas
siguientes: (a) tomar una muestra de tejido o celular; (b) hibridar
dicha muestra de tejido o celular con un reactivo de diagnóstico
según la reivindicación 39 ó 40; y (c) detectar la unión de las
moléculas de polinucleótido específicas para el factor inductor de
apoptosis de mamífero en la muestra de tejido o celular a dicho
reactivo de diagnóstico.
La presente invención se refiere asimismo a una
composición que comprende un factor inductor de apoptosis de
mamífero aislado y purificado según la presente invención y a un
vehículo aceptable, diluyente y/o adyuvante, siendo el factor
inductor de apoptosis de mamífero aislado un factor inductor de
apoptosis murino o las isoformas del mismo o un factor inductor de
apoptosis humano o las isoformas del mismo.
Todavía otro aspecto de la invención se refiere
a la utilización de la composición descrita, a la preparación de un
medicamento para inhibir la proliferación celular.
Otros objetivos y ventajas de la invención
resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de la
descripción detallada siguiente, que hace referencia a los dibujos,
así como las reivindicaciones adjuntas.
Las Figs. 1A a 1E presentan la estructura
primaria y la distribución en el tejido de la proteína AIF.
Específicamente, la Fig. 1A describe la alineación de la secuencia
de aminoácidos del AIF de ratón y humana con el sistema ferredoxina
NADH reductasa de benceno 1,2 dioxigenasa en Pseudomonas
putida (BDSF). La secuencia subrayada en el AIF de ratón (mAIF)
iguala los datos de la espectroscopía de masas obtenidos con el mAIF
purificado digerido con tripsina. Los guiones indican la identidad
del aminoácido; las casillas rayadas señalan la similitud de los
aminoácidos; las casillas negras destacan las secuencias con
localización de mitocondrias (MLS) y las supuestas secuencias con
localización nuclear (NLS). Los números de registro en el GenBank
para AIF de ratón y humana son It232169 (AF100927) e It232173
(AF100928), respectivamente.
La Fig. 1B presenta la hibridación fluorescente
in situ (FISH) de la sonda de ADN del AIF (fluorescencia
roja) en un cariograma de ratón macho teñido por contraste con DAP1
(fluorescencia azul). La posición detallada del gen del AIF fue
cartografiada para la zona A6 del cromosoma X (10 determinaciones
con resultados idénticos).
La Fig. 1C presenta el modelo de la expresión de
ARNm tisular del AIF. Se hibridó una sonda de ADNc del AIF con una
transferencia Northern de ARN poliadenilado de páncreas humano (1),
riñón (2), músculo esquelético (3), hígado (4), cerebro (6),
placenta (5) y corazón (7).
La Fig. 1D presenta el modelo de escisión
proteica del AIF. Un antisuero producido contra los aminoácidos nº
151 a 200 de AIF de ratón (mAIF) se utilizó para detectar la
proteína AIF contenida en las mitocondrias del hígado (1), riñón
(2), corazón (3), cerebro (5) o bazo (6) de ratón. Las
transferencias de referencia realizadas en presencia de péptidos
inmunógenos que comprenden los aminoácidos nº 151 a 200
proporcionaron resultados negativos para las mitocondrias del
hígado.
La Fig. 1E presenta la importación de
mitocondrias de AIF. Se realizó la transcripción y la traducción
in vitro utilizando el kit de transcripción/traducción
acoplado al lisado de TNT (Promega) y [^{35}S]metionina en
ausencia (1) o presencia (2) de ADNc con mAIF. Se midió la retención
de este producto utilizando las mitocondrias que se dejaron sin
tratar (3), se digirieron con proteinasa K para eliminar la proteína
unida en la superficie (4) se desenergizaron con CCCP 100 \muM (5)
o se trataron tanto con proteinasa K como CCCP (6). Obsérvese la
maduración de AIF en una proteína de 57 kDa que está retenida por
las mitocondrias de un modo que puede ser inhibido por CCCP y que
está protegido contra la proteólisis.
Las Figs. 2A a 2F presentan la distribución
submitocondrial y subcelular en AIF en células normales y
apoptósicas. Específicamente, la Fig. 2A presenta la localización
submitocondrial de AIF, de la liberación de AIF por apertura de
poros de PT y neutralización mediada por anticuerpos de la
bioactividad de AIF contenida en el espacio de la intermembrana
mitocondrial. Se realizaron transferencias Western en el lisado de
mitocondrias de hígado de ratón (1), proteínas de la matriz (2),
membrana interna (3), espacio de la intermembrana (4), membrana
externa (5), el sobrenadante de las mitocondrias no tratadas (6) o
el de las mitocondrias tratadas con atractilosida 5 mM (7),
Ca^{2+} 200 \muM (8), ciclosporina A 1 \muM (9), atractilosida
+CsA (10) o Ca^{2+} + ciclosporina A (11). Además, el sobrenadante
de las mitocondrias tratadas con atractilosida se
pseudoinmunosuprimió utilizando un suero preinmune (12), o AIF
inmunosuprimido en ausencia (13) o presencia (14) de péptidos
inmunógenos derivados de AIF (véase el Ejemplo 2, a continuación)
capaz de bloquear el antisuero de AIF. Se determinó la capacidad de
las alícuotas de cada preparación para estimular la hipoploidia
nuclear en núcleos aislados de HeLa.
La Fig. 2B presenta la localización subcelular
de AIF en comparación con citocromo c. El hibridoma 2B4,11 de
linfocito T que expresa un vector de referencia (Neo) o
Bcl-2 humano se cultivaron durante 12 horas en
ausencia o presencia del análogo de dexametasona (DEX, 1 \muM) de
glucocorticoide sintético, seguido de la detección por
inmunotransferencia de AIF o de citocroma c en los lisados de
células completas o de fracciones subcelulares diferentes
(anticuerpo contra citocromo c está disponible en el mercado;
véase el Ejemplo 2 a continuación para anticuerpos contra AIF).
La Fig. 2C presenta la detección por
inmunofluorescencia de AIF en fibroblastos de rata-1
transfectados con un vector de referencia (Neo) o
Bcl-2 y tratados con estaurosporina (Stauro, 1
\muM, 2 h.) o sin tratar. Se fijaron las células, se
permeabilizaron y se tiñeron con un anticuerpo
anti-AIF (véase el Ejemplo 2) revelado mediante un
conjugado marcado con FITC secundario. En las células Neo, el
tratamiento con estaurosporina conduce a la generación de dos
fenotipos, uno con condensación parcial de cromatina (\sim80% de
células, etapa I) y otro con condensación más avanzada de cromatina
y fragmentación nuclear (\sim20% de células, etapa II),
identificada por microscopía en contraste de fase o
contador-tinción con Hoechst 33342 (no mostrado).
Las puntas de flecha están colocadas en el centro del núcleo.
La Fig. 2D presenta la detección por
inmunofluorescencia del citocromo c. El citocromo c se
detectó mediante un anticuerpo monoclonal específico puesto de
manifiesto con un anticuerpo marcado con PE secundario. Se trataron
las células y se clasificaron como en la Fig. 2C.
La Fig. 2E presenta la morfología nuclear y
DY_{m}. Se tiñeron células de hígado con el colorante Hoechst
33342 (fluorescencia azul) intercalador de ADN o el colorante CMXRos
(fluorescencia roja) sensible a DY_{m}. Los resultados son
representativos de cinco experimentos independientes.
La Fig. 2F presenta la microscopía
inmunoelectrónica de localización de AIF en células de linfoma de
linfocitos T de Jurkat normales (referencia) y en células tratadas
con ceramida (25 \muM, 16 horas) que ponen de manifiesto el
esponjamiento de mitocondrias y la condensación de cromatina. Se
detectó el AIF utilizando antisuero específico revelado mediante un
anticuerpo marcado con partículas de Immunogold (5 nm) secundario
(flechas blancas). Se presentan las secciones representativas de
mitocondrias (mito, M) o de los núcleos (N) cerca de la envoltura
(e).
Las Figs. 3A a 3G presentan los efectos del AIF
en núcleos aislados y mitocondrias. Específicamente, la Fig. 3A
presenta los efectos de la pérdida de ADN estimulada por AIF y la
condensación de cromatina en núcleos aislados. Se cultivaron núcleos
de HeLa a 37ºC en ausencia (referencia) o presencia de 100 ng/ml de
AIF recombinante durante 90 min., seguido de tinción con un
colorante de yoduro de propidio (PI) intercalador de ADN y análisis
citométrico de flujo del contenido de ADN nuclear. Las inserciones
demuestran las fotografías típicas obtenidas mediante tinción con
DAPI.
La Fig. 3B presenta la determinación por
microscopía electrónica de la condensación de cromatina de las
células tratadas como en A y fijadas con tetróxido de osmio.
La Fig. 3C presenta la concentración y la
dependencia del tiempo de los efectos de AIF en núcleos aislados. Se
cultivaron núcleos de HeLa durante 90 min. con la concentración
indicada de AIF rec. o de varios mutantes por deleción de AIF (panel
izquierdo). Alternativamente, se trataron los núcleos en diferentes
periodos con la dosis indicada de AIF (panel derecho). Se determinó
la hipoploidia nuclear mediante tinción con PI y citometría de flujo
como en A.
La Fig. 3D presenta la electroforesis en gel de
campo pulsado de los núcleos de HeLa que se dejaron sin tratar
(banda 1) o se cultivaron durante 5 min. (2), 15 min. (3), 30 min.
(4), 60 min. (5) o 90 min. (6) con 100 ng/ml de AIF sola, 90 min.
con 100 ng/ml de AIFD1-377 (7) o 90 min. con 100 ng
de AIF (8-11) en presencia de 200 \muM de ácido
p-cloromercurifenil-sulfónico (8), 200 \muM
del inhibidor caspasa de amplio espectro, Z-VAD.fmk
(9), EDTA 5 mM (10) o EGTA 5 mM (11). Además, en cada preparación
nuclear se evaluó la frecuencia de núcleos hipoploides como en
A.
La Fig. 3E presenta el esponjamiento
mitocondrial estimulado por AIF. Se controlaron en continuo
mitocondrias de hígado de rata purificados para esponjamiento de
gran amplitud. Las flechas indican la adición de Ca^{2+} (200
\muM; referencia positiva), AIF (100 ng/ml), citosol (100 \mug
de proteína por ml) y/o Z-VAD.fmk (100 \muM,
añadido previamente a la mezcla citosol/AIF). Obsérvese que
únicamente la adición combinada de AIF más citosol (panel derecho)
produce esponjamiento mitocondrial. Las mutaciones
(D180-638, D1-377,
D563-638) por deleción de AIF fueron inactivas en
este ensayo.
La Fig. 3F presenta la liberación inducida por
AIF del citocromo c y caspasa-9 de
mitocondrias. Se sometieron mitocondrias aisladas a lisis osmótica
(1) o se trataron como en A (15 min.) solamente con tampón (2), AIF
rec. (3), citosol (4), AIF rec. + citosol (5), o AIF rec. + citosol
+ Z-VAD.fmk (6) y sus sobrenadantes se sometieron a
análisis por inmunotransferencia de citocromo c y
caspasa-9. Obsérvese que Z-VAD.fmk
no inhibe la liberación de caspasa-9 pero interfiere
algo con su activación proteolítica.
La Fig. 3G presenta la activación estimulada por
AIF de una caspasa. Se determinó la capacidad de los mismos
sobrenadantes mitocondriales que en la Fig. 3F para escindir el
sustrato Z-VAD.afc de caspasa, que conduce a la
generación del fluorocromo afc. El valor 100% se refiere a la
activación enzimática obtenida por lisis osmótica de las
mitocondrias.
Las Figs. 4A a 4D presentan los efectos del AIF
en células sanas. Específicamente, la Fig. 4A presenta el efecto de
la microinyección de AIF en las células. Se inyectó tampón solamente
o AIF recombinante (10 \muM) en el citoplasma de células
Rat-1, que se cultivaron durante 90 min. en ausencia
o presencia de Z-VAD.fmk 100 \muM (añadida 15 min.
antes de la inyección). Las células microinyectadas pudieron
identificarse porque el inyectado contenía dextrano con FITC
(fluorescencia verde no mostrada). Microfotografías representativas
(tres experimentos independientes, 100 a 200 células microinyectadas
por sesión) de células viables teñidas con el colorante CMXRos
sensible a DY_{m} y Hoechst 33342 (como en la Fig. 2E, paneles
superiores) o Anexina-V, que marca los restos de
fosfatidilserina expuestos en superficie (fluorescencia roja en los
paneles inferiores).
La Fig. 4B presenta la apoptosis estimulada por
la sobreexpresión de AIF reforzada por transfección. Se
transfectaron transitoriamente células de Jurkat con vector pcADN3.1
solamente (referencia) o ADNc con AIF de ratón (bajo la referencia
de un activador de citomegalovirus (véase el vector pcADN3.1 de
Invitrogen). Tras de 24 horas de cultivo, las células se tiñeron con
los fluorocromos indicados para determinar la frecuencia y
alteraciones asociadas a la apoptosis: pérdida de DY_{m}
(fluorocromo: DiOC_{(6)}3), exposición a fosfatidilserina
(fluorocromo: Anexina V-FITC) o pérdida del ADN
nuclear (fluorocromo: yoduro de propidio, PI, tras permeabilización
con etanol). Los números se refieren al porcentaje de células con
características apoptósicas. Los resultados son representativos de 3
experimentos diferentes.
La Fig. 4C presenta la cuantificación de la
apoptosis nuclear estimulada por microinyección (100 células mínimo,
2 a 3 determinaciones, X±SEM) de AIF recombinante, un mutante de AIF
inactivo por deleción, citocromo c o atractilosida en células
Neo o Rat-1 transfectadas con
Bcl-2.
La Fig. 4D presenta la inhibición de la
apoptosis nuclear estimulada por atractilosida y estaurosporina
mediante microinyección de un antisuero anti-AIF. Se
microinyectaron células Rat-1 con atractilosida
(ATR, 50 \muM) sola o atractilosida diluida en suero de
referencia, antisuero anti-AIF y/o péptidos
inmunógenos derivados de AIF 100 \muM. 180 min. después de la
microinyección, se tiñeron las células con Hoechst 33342 y CMXRos
(como en la Fig. 4A, panel superior). Alternativamente, se
cultivaron las células durante 120 min. con estaurosporina (1
\muM, como en las Figs. 2C-2E), se añadieron al
medio de cultivo tras la microinyección de antisuero de referencia o
anti-AIF. Obsérvese que las células inyectadas con
atractilosida y tratadas con estaurosporina no conservan el
colorante CMXRos sensible a DY_{m}.
Tanto la muerte celular fisiológica (apoptosis)
como, en algunos casos, la muerte celular accidental (necrosis)
entrañan un procedimiento en dos etapas. En el primer nivel,
numerosos estímulos fisiológicos y algunos patológicos desencadenan
un aumento de permeabilidad de la membrana mitocondrial. Las
mitocondrias liberan factores apoptógenos a través de la membrana
externa y disipan el gradiente electroquímico de la membrana
interna. La transición de la permeabilidad mitocondrial (PT)
implica un complejo dinámico de multiproteína formado en el punto de
contacto entre las membranas mitocondriales interna y externa. El
complejo PT puede funcionar como un detector de tensión y lesión,
así como para determinadas señales conectadas con los receptores. La
inhibición de PT por intervención farmacológica en las estructuras
mitocondriales o en la expresión mitocondrial de la oncoproteína
BcI-2 inhibidora de apoptosis impide la muerte
celular, lo que sugiere que PT es un fenómeno limitativo de
velocidad del proceso de muerte. En un segundo nivel, las
consecuencias de la disfunción mitocondrial (colapso del potencial
de la transmembrana interna mitocondrial, desacoplamiento de la
cadena respiratoria, hiperproducción de aniones superóxido,
destrucción de la biogénesis mitocondrial, pérdida del calcio y del
glutatión de la matriz y liberación de proteínas de la intermembrana
solubles) entraña una catástrofe bioenergética que culmina en la
destrucción de la integridad de la membrana plasmática (necrosis)
y/o la activación de la proteasa apoptógena específica (caspasa) por
las proteínas mitocondriales que se filtran en el citosol (citocromo
c, factor inductor de apoptosis) con la activación de
endonucleasa secundaria (apoptosis). La velocidad relativa de estos
dos procesos (catástrofe bioenergética frente a activación de la
proteasa y de la endonucleasa) determina si una célula experimentará
necrosis primaria o apoptosis. La adquisición de las propiedades
bioquímicas ultraestructurales de la apoptosis se basa críticamente
en la liberación de proteasas apoptógenas o de activadores de
proteasa en las mitocondrias. El hecho de que los fenómenos
mitocondriales controlan la muerte celular presenta mayores
implicaciones para el desarrollo de fármacos citoprotectores y
citotóxicos.
La apertura del poro de transición de
permeabilidad (PT) mitocondrial, que está bajo el control de los
miembros de la familia Be1-2, es uno de los
fenómenos decisivos del proceso apoptósico [Kroemer, Nature
Medicine, 3:614-620 (1997); Green et
al., Science 281 (28 de agosto, 1998)]. La
apertura del poro de PT puede producir la destrucción física de la
membrana mitocondrial externa (vander Heiden et al., Cell
91:627-637 (1997)], que conduce a la
liberación de proteínas solubles del espacio de la intermembrana. La
fracción de intermembrana mitocondrial contiene numerosos factores
diferentes, potencialmente apoptógenos que incluyen el citocromo
c [Liu et al., Cell 86:147-157
(1996); Kluck et al., Science
275:1132-1136 (1997)], procaspasas 2, 3 y 9
[Mancini et al., J. Cell Biol.
140:1485-1495 (1998); Susin et al., J.
Exp. Med., en imprenta], y un factor inductor de apoptosis (AIF)
que basta para forzar a los núcleos aislados para que adopten una
morfología apoptósica [Zamzami et al., J. Exp. Med.
183; 1533-1544 (1996); Susin et al., J.
Exp. Med. 184; 1331-1342 (1996)]. Una
actividad de AIF que mantiene su bioactividad en presencia del
inhibidor Z-VAD.fmk de caspasa [Susin et al., J.
Exp. Med., en imprenta] se purificó a partir del sobrenadante de
mitocondrias de hígado de ratón sometidas a apertura de poros de PT.
Los datos espectrométricos de masas en serie obtenidos en la
digestión tríptica de una sola banda de SDS-PAGE
teñida con plata [Ducret et al., Protein Sci.
7:706-719 (1998)] se utilizó para identificar
una etiqueta de la secuencia expresada (EST GenBank nº: 1595214;
secuencia de aminoácidos (aa) subrayada en la Fig. 1A), que permite
la clonación del clon de los ADNc completos correspondientes de
ratón y de hombre (Fig. 1A). El AIF se conserva muy bien entre las
dos especies de mamífero (92% de identidad de aminoácidos) y lleva
una homología muy significativa con varias ferredoxinas
eurobacterianas y arqueobacterianas u oxidorreductasas de NADH en
su parte del terminal C (aminoácidos nº 128 a nº 613 para mAIF), lo
que sugiere firmemente que AIF se conserva a través de todas las
especies de mamífero. Su porción del terminal N no presenta dicha
homología con las oxidorreductasas y en su lugar lleva una secuencia
de direccionamiento mitocondrial (encasillada en la Fig. 1A) [Claros
et al., Eur. J. Biochem. 241:779-786
(1996)]. Solamente un cromosoma de ratón se hibrida con el ADNc con
AIF in situ (Fig. 1B). Este gen está situado en la zona A6
del cromosoma X de ratón, que es sinténica con la zona
Xq25-26 del cromosoma X humano, donde está
localizado el gen AIF humano (número de registro en EMBL nº Z81364).
Basada en el análisis por transferencia Northern, una especie de
ARNm del AIF de 2,4 kb se expresa de modo omnipresente en el tejido
humano (Fig. 1C). Este descubrimiento fue confirmado en el contexto
proteico para los tejidos de ratón que utilizan un anticuerpo
producido contra los aminoácidos nº 151 a 200 de AIF, que reconocen
una proteína única de \sim57 kDa (Fig. 1D).
El producto principal de la
transcripción/traducción de ADNc de AIF obtenido in vitro
presenta un peso molecular aparente próximo al esperado de 66,8 kDa.
Cuando se importa en mitocondrias in vivo, da lugar a una
proteína más corta correspondiente al AIF maduro (Fig. 1E). La
bioactividad e inmunorreactividad del AIF se encuentra
exclusivamente en el espacio de la intermembrana mitocondrial, como
se puso de manifiesto por fraccionamiento submitocondrial (Fig. 2A).
La proteína AIF de 57 kDa se libera en la apertura de poros de PT
por agentes tales como actilosida (ATR), calcio o
terc-butilhidroperóxido, y esta liberación es
evitada por el inhibidor ciclosporina A del poro PT (Fig. 2A). La
inmunorreducción del AIF del grupo completo de proteínas de la
intermembrana mitocondrial también elimina la actividad biológica
que estimula la apoptosis nuclear in vitro, lo que indica que
el AIF es el principal factor mitocondrial que produce apoptosis
nuclear (Fig. 2A). El fraccionamiento subcelular (Fig. 2B), el
análisis de inmunofluorescencia (Fig. 2C) y la microscopía
inmunoelectrónica (Fig. 2F) confirman que el AIF se encuentra
exclusivamente en las mitocondrias de las células normales no
tratadas. Tras la estimulación de la apoptosis por estaurosporina,
el AIF se traslada por lo menos parcialmente al citosol y al núcleo
(Fig. 2C) al mismo tiempo que la DY_{m} se reduce y los núcleos se
vuelven traslúcidos con DAPI o tinción con Hoechst 33342 y
manifiestan la condensación de cromatina periférica (etapa I en la
Fig. 2C-2E). En las células Rat I, la liberación
total de citocromo c de la mitocondria al citosol es
únicamente visible en una etapa posterior, a saber cuando se produce
la condensación avanzada de cromatina y la fermentación nuclear
(cariorexis) (etapa II en la Fig. 2C a 2E) y el AIF aparece
concentrado en el núcleo (Fig. 2C). La localización nuclear del AIF
es compatible con la composición global de aminoácidos [Cedano
et al., J. Mol. Biol. 266 (1997)] y la presencia de
varias señales supuestas de localización nuclear (Fig. 1A)
[Boulikas, Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression
3:193-227 (1993)]. La sobreexpresión de
Bcl-2 impide la liberación mitocondrial activada por
estaurosporina de AIF y el citocromo c y estabiliza la
DY_{m} (Fig. 2C a 2E) de acuerdo con las observaciones anteriores
[Zamzami et al., J. Exp. Med.
183:1533-1544 (1996); Liu et al.,
Cell 86:147-157 (1996); Susin et al.,
J. Exp. Med. 184:1331-1342 (1996); Kluck
et al., Science 275:1132-1136 (1997);
vander Heiden et al., Cell 91;
627-637 (1997); Susin et al., J. Exp. Med.,
en imprenta; y Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95:1455-1459 (1998)]. La relocalización
diferencial de las dos proteínas de la intermembrana citocromo
c y AIF, que se trasladan al citosol y al núcleo,
respectivamente, se ha confirmado para otros tipos de células y en
respuesta a otros estimulantes de apoptosis, por ejemplo para las
células del hibridoma de linfocitos T tratadas con un agonista
receptor de grupo corticoide (Fig. 2B). La sobreexpresión de
Bcl-2 impide asimismo la liberación mitocondrial del
AIF en esta línea celular (Fig. 2B). La inmunoelectromicroscopía
confirma la redistribución del AIF aún en otro modelo de apoptosis,
a saber las células de linfoma de Jurkat tratadas con ceramida y
pone de manifiesto un enriquecimiento particular de AIF en áreas de
densidad electrónica de la condensación de cromatina periférica
(Fig. 2F). En conjunto, estos datos indican una transposición
mitocondrio-nuclear del AIF durante la
apoptosis.
Cuando se añade a los núcleos purificados de las
células HeLa, la proteína AIF recombinante estimula la pérdida de
ADN (es decir, escisión en bruto de 50 kbp, que conduce a la pérdida
de ADN), medida por citometría de flujo (Fig. 3A). Además, el AIF
provoca la condensación de cromatina periférica, determinada
mediante tinción con Hoechst 33342 (Fig. 3A) o por microscopía
electrónica (Fig. 3B). Estos efectos de AIF se observan para la
proteína completa pero no para varias mutaciones por deleción (D180
a 638, D1-377, D563-638) (Fig. 3C).
Es probable que sean independientes de su supuesta función de
oxidorreductasa, por lo que la AIF recombinante carece de los
grupos prostéticos FAD y NAD y no pone de manifiesto ninguna
actividad de oxidorreductasa en los análisis enzimáticos normales
(no mostrados). El efecto de AIF en los núcleos aislados no requiere
factores citoplásmicos adicionales, es dependiente de la dosis y es
rápido, con efectos en tan poco como 1 min. (Fig. 3C). Está
acompañado por la digestión de cromatina en fragmentos de \sim50
kbp (Fig. 3D). Esta fragmentación del ADN a gran escala está
inhibida por el EDTA quelante del Ca^{2+} y por el ácido
p-cloromercurifenilsulfónico pero no por el
inhibidor Z-VAD.fmk de caspasa de amplio espectro
(Fig. 3D). La AIF recombinante añadida a los núcleos purificados no
produce la fragmentación del ADN oligonucleosómico (es decir,
"escalonamiento" del ADN de los fragmentos de 120 kbp,
independientemente de la pérdida de ADN observada anteriormente con
los fragmentos en bruto de 50 kbp) ni escinde el ADN del plásmido
purificado (no mostrado). Además de sus efectos nucleares, el AIF
recombinante actúa en las mitocondrias. En presencia de citosol, el
AIF produce mitocondrias purificadas que experimentan esponjamiento
de gran amplitud indicativo de la permeabilización de la membrana
mitocondrial (Fig. 3D). Este efecto mitocondrial del AIF está
acompañado de la liberación de citocromo c y de
caspasa-9 (Fig. 3F). Ninguno de estos efectos del
AIF, en los núcleos aislados o en los mitocondrias, es impedido por
el inhibidor Z-VAD.fmk de caspasa de amplio espectro
(Fig. 3D a 3F), lo que sugiere que son independientes de la caspasa.
Sin embargo, el sobrenadante de mitocondrias tratado con AIF más
citosol contiene una actividad enzimática inhibible por
Z-VAD.fmk que escinde el sustrato
Z-VAD.fmk de caspasa (Fig. 3E). Esta actividad es
por lo menos debida en parte a la presencia de
caspasa-9 activada (Fig. 3G y Susin et al., J.
Exp. Med., en imprenta). Por lo tanto, AIF puede activar la
caspasa-9 (y supuestamente otras caspasas) mediante
un mecanismo indirecto, dependiente de la mitocondria.
En una serie más de experimentos, se determinó
si la localización ectópica (extramitocondrial) del AIF estimularía
la apoptosis in vivo. En la microinyección de AIF
recombinante en el citoplasma de las células vivas, el AIF estimula
rápidamente (60 a 90 min.) varias marcas de apoptosis: condensación
de cromatina nuclear y pérdida de ADN, disipación del DY_{m} y
exposición de fosfatidilserina en la hojilla externa de la membrana
plasmática (Fig. 4A). La sobreexpresión reforzada por transfección
de AIF natural también estimula el colapso de DY_{m}, la
exposición de fosfatidilserina y la hipoploidia (Fig. 4B). Ninguno
de los efectos mediados por el AIF microinyectado es inhibido por
Z-VAD.fmk (Fig. 4A y 4C), aunque
Z-VAD.fmk logró prevenir la apoptosis dependiente de
caspasa, estimulada por citocromo c (Fig. 4C) [Kluck et
al., Science 275:1132-1136 (1997); Li
et al., Cell 91:479-489 (1997)].
Además, la valoración cuidadosa del AIF puso de manifiesto una
diferencia no significativa en su eficacia para estimular la
apoptosis en las células de referencia y en las células
transfectadas con Bc1-2 (Fig. 4C). Como referencia
interna para su efecto citoprotector, Bcl-2 impide
la pérdida de DY_{m} [Zamzami et al., J. Exp. Med.
183:1533-1544 (1996); Susin et al., J.
Exp. Med. 184:1331-1342 (1996); y datos
no mostrados] y la apoptosis nuclear estimulada por microinyección
del agente atractilosida de apertura del poro de PT (Fig. 4C). La
microinyección del antisuero específico para el AIF elimina los
signos morfológicos de la apoptosis nuclear estimulada por
atractilosida, aunque no impide la disipación de DY_{m} estimulada
por atractilosida (Fig. 4D). Ninguno de dichos efectos inhibidores
se observa cuando el anticuerpo específico para AIF es neutralizado
mediante la inyección conjunta de un exceso de péptidos inmunógenos
(véase el Ejemplo 2 a continuación). El antisuero
anti-AIF no presenta tampoco ningún efecto sobre el
colapso de DY_{m} estimulado por estaurosporina, aunque impide
los cambios nucleares estimulados por estaurosporina (Fig. 4D),
puntuando por defecto de nuevo la contribución del AIF a la
apoptosis nuclear.
Los datos publicados en la presente memoria
demuestran que AIF es una proteína de la intermembrana mitocondrial
apoptógena. Como el citocromo c, es probable que el AIF sea
una proteína bifuncional, filogenéticamente vieja, con una función
de aceptor/donante de electrones (oxidorreductasa) y una segunda
función apoptógena independiente [Kluck et al., EMBO J.
16:4639-4649 (1997)]. El citocromo c
se redistribuye desde la mitocondria al citosol y estimula la
apoptosis nuclear con ayuda de varios factores adicionales
(Apaf-1, ATP y procaspasa-9), que
activan conjuntamente la caspasa-3, permitiendo la
activación de todavía otro factor, DFF/CAD, que activa la
fragmentación del ADN oligonucleosómico [Li et al., Cell
91:479-489 (1997); Liu et al., Cell
89:175-184 (1997); y Enari et al.,
Nature 391:43-50 (1998)]. Aunque se ha
considerado a DFF/ICAD como el principal efector citoplasmático
responsable de la apoptosis nuclear [Liu et al., Cell
89:175-184 (1997); y Enari et al.,
Nature 391:43-50 (1998)], no es el único
factor que estimula la condensación de la cromatina apoptósica
[Samejima et al., J. Cell. Biol.
143:225-239 (1998)]. En estricto contraste
con el citocromo c, el AIF presenta un efecto directo sobre
los núcleos aislados en los que se desencadena la condensación de
cromatina así como la fragmentación de cromatina a gran escala. Este
tipo de fragmentación de ADN precede a la degradación del ADN
oligonucleosómico en varios modelos celulares de apoptosis
[Oberhammer et al., EMBO J.
12:3679-3684 (1993); Lagarkova et al., J.
Biol. Chem. 270:20239-20241 (1995)] y
puede ser independiente de la caspasa (Fig. 3D y ref. 22). Además,
el AIF afecta la función barrera de las membranas mitocondriales
(Fig. 3E, 3F), lo que sugiere que puede involucrarse en un bucle de
autoampliación en el que el AIF liberado de algunos mitocondrias
actúa en otros mitocondrias para comprometer su función de membrana
[Susin, et al., J. Exp. Med. 186:25-37
(1997)]. Bcl-2 inhibe la liberación mitocondrial de
AIF (Fig. 2C y 2F) pero no presenta ningún efecto citoprotector, una
vez que el AIF está presente en el citosol (Fig. 4C). Por lo tanto,
es probable que el AIF actúe más allá o independientemente del
Bc1-2 y de los puntos de comprobación de la caspasa
del procedimiento de muerte celular. Por lo tanto, el AIF
proporciona una nueva conexión molecular entre la permeabilización
de la membrana mitocondrial y la muerte celular apoptósica.
La presente invención se refiere al
descubrimiento y la caracterización de un polipéptido, denominado
factores estimulantes de la apoptosis mitocondrial (AIF). Se dan a
conocer asimismo los AIF de mamíferos que codifican los ADN, que
desempeñan una función crítica en la estimulación de la
apoptosis.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a la identificación de materiales que funcionan como estimulantes de
apoptosis. En particular, la invención se refiere al aislamiento,
purificación y secuenciado de determinados ácidos nucleicos que
corresponden al gen del AIF de mamífero, así como a los polipéptidos
correspondientes codificados por estos ácidos nucleicos. La
invención por lo tanto comprende los polinucleótidos con las
secuencias indicadas en la SEC. ID nº: 1 (ADN que codifica el AIF de
ratón) y SEC. ID nº: 7 (ADN que codifica el AIF humano) y a los
polinucleótidos que codifican el AIF, mediante codones degenerados,
variantes degeneradas, variantes conservadas, variantes alélicas y
fragmentos de los mismos, que poseen todos una actividad asignada a
AIF, incluyendo pero sin limitarse a, la apoptosis por estimulación
(por ejemplo, pero no limitada a la isoforma de ratón: SEC. ID. nº:
4; isoformas humanas: SEC. ID. nº: 10 y nº 13). Los polinucleótidos
y polipéptidos de AIF de la invención son útiles en condiciones
relacionadas con la pérdida de estimulación de apoptosis (por
ejemplo varias enfermedades neoplásicas) en condiciones relacionadas
con el aumento de estimulación de la apoptosis (por ejemplo varias
enfermedades neurodegenerativas), así como otras enfermedades y
disfunciones que están relacionadas con las anomalías en el control
de la apoptosis. La invención se refiere asimismo a los polipéptidos
expresados por los polinucleótidos descritos, y particularmente a
los polipéptidos descritos en la SEC. ID. nº: 2 (completa de ratón),
nº 3 (madura de ratón), nº 8 (completa humana) y 9 (madura humana),
así como a las variantes conservadas, a los fragmentos
apoptósicamente activos (con una actividad asignada a AIF), a
moléculas pequeñas homólogas, a las isoformas de los polipéptidos
descritos [por ejemplo la isoforma de ratón: SEC. ID. nº: 5 y nº 6
(maduras); a una primera isoforma humana SEC. ID. nº: 11 y nº 12
(maduras) y a una segunda isoforma humana SEC. ID. nº: 14 y nº 15
(maduras) y a los fragmentos inmunológicamente activos de cualquiera
de los polipéptidos dados a conocer en la presente memoria (por
ejemplo véase el Ejemplo 2 a continuación).
Los términos "proteína" que se refiere al
polipéptido natural y "polipéptido" se utilizan en la presente
memoria indistintamente con respecto al producto génico AIF y a las
variantes del mismo. La expresión "proteína madura" o
"polipéptido maduro" se refiere particularmente al producto
génico AIF con la secuencia señal (o una proteína de fusión
asociada) eliminada.
Como se indicó anteriormente, en las formas de
realización específicas de los polipéptidos del AIF de la invención
se incluyen las que presentan las secuencias de aminoácidos
publicadas en la presente memoria por ejemplo las SEC. ID nº: 2
(ratón), nº: 3 (madura de ratón), nº: 8 (humana) y nº: 9 (madura
humana), incluyendo el polipéptido de AIF modificado con las
secuencias conservadoras de aminoácidos, así como los fragmentos,
análogos y derivados de los mismos biológicamente activos
(incluyendo las isoformas expuestas anteriormente). La expresión
"biológicamente activo", se utiliza en la presente memoria para
referirse a un efecto específico del polipéptido, que incluye pero
no se limita a la unión específica, por ejemplo, a un compañero del
enlace, anticuerpo u otra molécula de reconocimiento; a la
activación de la serie de reacciones de transducción de señal en un
contexto molecular; y/o a la producción (o inhibición por
antagonistas) de los efectos fisiológicos mediados por el
polipéptido de AIF natural in vivo. Los polipéptidos del AIF,
incluyendo los fragmentos, análogos y derivados, pueden prepararse
por síntesis, por ejemplo, utilizando técnicas bien conocidas de
síntesis de péptidos en fase sólida o en fase solución.
Alternativamente, los polipéptidos de AIF de la invención pueden
prepararse utilizando técnicas de ingeniería genética bien
conocidas, como las descritas anteriormente. En otra forma de
realización todavía, el polipéptido de AIF puede purificarse, por
ejemplo, mediante purificación por inmunoafinidad, a partir de un
fluido biológico, tal como pero no limitado al plasma, suero u
orina, preferentemente plasma, suero u orina humanos, y más
preferentemente de un paciente que sobreexprese el polipéptido, tal
como un individuo que padezca por ejemplo de una variedad de
enfermedades neurodegenerativas.
En una forma de realización determinada, la
presente invención contempla que los fragmentos naturales del
polipéptido del AIF pueden ser importantes. La secuencia peptídica
incluye numerosos puntos que frecuentemente son el objetivo de la
escisión proteolítica, por ejemplo, restos de arginina. Es posible
que el polipéptido completo pueda escindirse en uno o más de dichos
puntos para formar fragmentos biológicamente activos (que incluirían
necesariamente las partes del polipéptido que permitirían al
fragmento permanecer activo). Dichos fragmentos biológicamente
activos pueden agonizar o antagonizar la actividad operativa del
polipéptido del AIF para estimular o impedir la estimulación de la
apoptosis, respectivamente.
Como se describe en la presente memoria,
determinadas zonas de la molécula del AIF, que son importantes para
una o más de las actividades del AIF han sido identificadas y por lo
tanto esta información proporciona a una persona experta en la
materia instrucciones para el diseño de fragmentos, análogos y
derivados, que son útiles para la puesta en práctica de la invención
[véase a continuación para los mutantes BamH1
(D180-638), NcoI (D1-377) o HindIII
(D563-638) por deleción del AIF así como las Figs. 3
y 4 para los datos que entrañan los mutantes siguientes].
La presente invención contempla específicamente
la preparación de análogos del polipéptido del AIF, que se
caracterizan porque son capaces de una actividad biológica del
polipéptido del AIF, por ejemplo de enlace al compañero del enlace
específico del polipéptido del AIF (por ejemplo, una enzima o
efectores similares). En una forma de realización, el análogo
agoniza la actividad del AIF, es decir, opera de manera similar al
polipéptido del AIF. Preferentemente, un agonista del AIF es más
eficaz que la proteína natural. Por ejemplo, un análogo del agonista
del AIF puede fijarse al compañero de enlace del AIF específico con
mayor afinidad o demostrar una vida media más prolongada in
vivo, o ambas. No obstante, también se contemplan los análogos
agonistas del polipéptido del AIF que son menos eficaces que la
proteína natural.
En otra forma de realización, el análogo
antagoniza la actividad del AIF. Por ejemplo, un análogo del AIF que
se fija al compañero del enlace del AIF específico pero no produce
transducción de señal puede inhibir competitivamente el enlace el
AIF natural a su compañero de enlace, disminuyendo de este modo la
actividad del AIF in vivo. Dicho análogo antagonista del AIF
puede también demostrar diferentes propiedades del polipéptido AIF,
por ejemplo, vida media más prolongada (o más corta) in vivo,
mayor (o menor) afinidad de enlace para el compañero de enlace del
AIF específico, o ambas.
En una forma de realización, un análogo del
polipéptido del AIF es un polipéptido del AIF modificado por la
sustitución de aminoácidos en las posiciones en el polipéptido que
no son esenciales para la estructura o el funcionamiento. Por
ejemplo, la sustitución de restos divergentes de aminoácidos en la
secuencia humana en comparación con la secuencia de aminoácidos
murina (y viceversa) proporcionará probablemente análogos útiles del
polipéptido del AIF (es decir intercambios de aminoácidos entre el
ratón y el hombre). Por ejemplo, alineando la secuencia madura de
aminoácidos del AIF de ratón (SEC. ID nº: 3) con la secuencia madura
de aminoácidos del AIF humana (SEC. ID nº: 9), comenzando en la
posición 1 (uno), que pone de manifiesto diferencias de aminoácidos
en las siguientes posiciones: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,
55, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,
91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105,
106, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 119, 121,
123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136,
137, 140, 141, 143, 144, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154,
155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167,
168, 169, 170, 171, 172, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181,
182, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195,
196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 208, 209,
210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222,
224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 232, 234, 235, 236, 237, 238,
239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251,
252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 262, 263, 264, 265,
266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278,
279, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292,
293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306,
309, 310, 311, 312, 313, 314, 3115, 316, 317, 318, 319, 320, 321,
322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334,
335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347,
348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 358, 359, 360, 361,
362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374,
375, 376, 377, 378, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388,
389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 397, 398, 399, 400, 401, 402,
403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 414, 415, 416,
417, 418, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430,
431, 432, 433, 435, 436, 437, 438, 440, 441, 442, 443, 444, 445,
446, 447, 448, 451, 452, 453, 455, 456, 457, 458, 460, 461, 462,
463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 473, 474, 475, 476,
477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489,
490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 501, 502, 503,
504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516,
517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529,
530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542,
543, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556,
557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 5569,
570, 571, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584,
585, 586, 587, 588, 589, 590, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598,
599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611 y
612.
Asimismo se contemplan las sustituciones de
aminoácidos conservadoras entre los polipéptidos del AIF de ratón y
humano como se determina por determinadas propiedades químicas o
físicas compartidas en común entre las especies, hidrofobia de carga
y/o aminoácidos ácidos frente a aminoácidos básicos.
Los análogos, tales como los fragmentos, pueden
producirse, por ejemplo, por digestión en pepsina del polipéptido
del AIF. Otros análogos, tales como las muteínas, pueden ser
producidos por mutagénesis normal dirigida al punto de las
secuencias de codificación del polipéptido de AIF. Los análogos que
presentan actividad estimulante de apoptosis tales como pequeñas
moléculas, si funcionan como activadores o inhibidores, pueden ser
identificados por una variedad conocida de análisis in vitro
descritos en la presente memoria y otros que son bien conocidos en
la materia.
La estructura del polipéptido del AIF, se
analiza por varios procedimientos conocidos en la materia. La
secuencia de la proteína puede ser caracterizada por un análisis de
hidrofilia [por ejemplo, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 78:3824 (1981)]. Un perfil de hidrofilia se utiliza
para identificar las zonas hidrófoba e hidrófila del polipéptido del
AIF, que pueden indicar las zonas ocultas en el interior del
polipéptido plegado, y las zonas accesibles en el exterior del
polipéptido. Además, puede emprenderse también el análisis
estructural secundario [por ejemplo, Chou et al., Biochem.,
13:222 (1974)], para identificar las zonas del polipéptido
del AIF que adoptan estructuras secundarias específicas. La
manipulación de la estructura prevista o determinada, que incluye la
predicción de la estructura secundaria, puede ser realizada
utilizando programas informáticos fácilmente disponibles en la
técnica.
Al proporcionar una fuente abundante de
polipéptido del AIF recombinante, la presente invención permite la
determinación estructural cuantitativa del polipéptido. En
particular, se proporciona suficiente material para la resonancia
magnética nuclear (RMN), infrarrojo (IR), Raman y ultravioleta (UV)
y dicroísmo circular (CD), análisis espectroscópico. En particular
la RMN proporciona análisis estructurales muy potentes de moléculas
en solución, que se aproxima más estrechamente a su media natural
[Marion et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.,
113:967-974 (1983); Bar et al., J. Magn.
Reson., 65:355-360 (1985); Kimura et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:1681-1685 (1980)]. Pueden emplearse
también otros métodos de análisis estructural. Éstos incluyen pero
no se limitan a la cristalografía de rayos X [Engstom, Biochem.
Exp. Biol., 11:7-13 (1974)].
Todavía en una forma de realización adicional,
puede probarse un polipéptido análogo del AIF para determinar si
interreacciona con un anticuerpo específico para el polipéptido del
AIF natural o los fragmentos específicos del mismo. El grado de
interreactividad proporciona información acerca de la homología
estructural o similitud de proteínas, o acerca de la accesibilidad
de las zonas correspondientes a los fragmentos del polipéptido que
se utilizaron para generar anticuerpos específicos para el
fragmento.
Se conocen varias técnicas de cribado en la
materia para el cribado de análogos de polipéptidos. Están
disponibles varios bancos de productos químicos. Por consiguiente,
la presente invención contempla el cribado de dichos bancos, por
ejemplo, bancos de compuestos sintéticos generados durante años de
investigación, bancos de compuestos naturales y bancos
combinatorios, como los descritos con mayor detalle, anteriormente,
para los análogos del polipéptido del AIF. En una forma de
realización, la invención contempla el cribado de dichos bancos para
los compuestos que se unen a anticuerpos del polipéptido
anti-AIF. En otro aspecto, una vez se identifica el
compañero de enlace del AIF (véase anteriormente), puede utilizarse
cualquier técnica de cribado conocida en la materia para cribar
agonistas o antagonistas del compañero de enlace del AIF. La
presente invención contempla cribados para pequeñas moléculas de
ligandos o análogos de ligando y mímicos, así como cribados para
ligandos naturales que se unen para activar y agonizar o antagonizar
el compañero de enlace del AIF in vivo.
El conocimiento de la estructura primaria del
compañero de enlace del AIF y la similitud de esta secuencia con las
proteínas de función conocida, pueden proporcionar una indicación
inicial como agonistas o antagonistas de la proteína. La
identificación y cribado de los antagonistas se facilita además
determinando las propiedades estructurales de la proteína, por
ejemplo, utilizando cristalografía de rayos X, difracción de
neutrones, espectrometría de resonancia magnética nuclear y otras
técnicas para la determinación de estructuras. Estas técnicas
proporcionan el diseño racional o la identificación de agonistas y
antagonistas.
Otro método utiliza un bacteriófago recombinante
para producir grandes bancos. Utilizando el "método del fago"
[Scott et al., Science, 249:386-390
(1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87:6378-6382 (1990); Devlin et al.,
Science, 249:404-406 (1990)], pueden
construirse bancos muy grandes (entidades químicas de 10^{6} a
10^{8}). Un segundo método utiliza métodos químicos primarios, del
cual son ejemplos el método Geysen [Geysen et al., Molecular
Immunology, 23:709-715 (1986); Geysen
et al., J. Immunologic Method,
102:259-274 (1987)] y el reciente método de
Fodor et al., Science, 251:767-773
(1991). Furka et al., 14th International Congress of
Biochemistry, volumen 5, resumen FR:013 (1988); Furka, Int. J.
Peptide Protein Res., 37:487-493 (1991);
Houghton (patente US nº 4.631.211, publicada en diciembre de 1986);
y Rutter et al. (patente US nº 5.010.175, publicada el 23 de
abril de 1991) describen métodos para producir una mezcla de
péptidos que pueden ser probados como agonistas o antagonistas. En
otro aspecto, los bancos sintéticos [Needels et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90:10700-10704 (1993);
Lam et al., publicación de la patente internacional nº WO
92/00252, cada una de las cuales está incorporada a la presente
memoria en su totalidad como referencia] y similares pueden
utilizarse para cribar los ligandos del compañero de enlace del AIF
según la presente invención. Con dichos bancos, pueden detectarse
los antagonistas del compañero de enlace utilizando células que
expresan el o los compañero(s) de enlace sin clonar realmente
el compañero de enlace del AIF.
En otro aspecto todavía, los análogos del
polipéptido del AIF pueden cribarse mediante la utilización de un
sistema químico combinatorio como el dado a conocer en la patente US
nº 5.723.232 de Kauffman y Ballivet.
Los polipéptidos dados a conocer en la presente
memoria pueden modificarse mediante el acoplamiento de una o más
fracciones químicas a la fracción de la proteína. Los derivados
verificados químicamente pueden formularse además para las vías de
administración intraarterial, intraperitoneal, intramuscular,
subcutánea, intravenosa, oral, nasal, rectal, bucal, sublingual,
pulmonar, tópica, transdérmica u otras. Se ha observado que la
modificación química de las proteínas biológicamente activas aporta
ventajas adicionales en determinadas circunstancias, tales como el
aumento de estabilidad y de tiempo de circulación de la proteína
terapéutica y la disminución de inmunogenicidad [patente US nº
4.179.337; Abuchowski et al., "Soluble
Polymer-Enzyme Adducts", en Enzymes as
Drugs, págs. 367-383, Holcenberg y Roberts,
eds., Wiley-Interscience, Nueva York, NY, (1981);
Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10
(1992)].
Las fracciones químicas adecuadas para la
modificación pueden seleccionarse de entre los polímeros solubles en
agua. El polímero seleccionado debería ser soluble en agua de modo
que la proteína a la que se acopla no precipite en un medio acuoso,
tal como un medio fisiológico. Preferentemente, el polímero será
farmacéuticamente aceptable para la utilización terapéutica de la
preparación del producto final. Un experto en la materia será capaz
de seleccionar el polímero deseado basándose en consideraciones
tales como si el conjugado polímero/polipéptido se utilizará
terapéuticamente y si es así, la dosificación deseada, el tiempo de
circulación, la resistencia a la proteólisis y otras
consideraciones. Para las presentes proteínas y polipéptidos, éstas
pueden determinarse utilizando los análisis proporcionados en la
presente memoria.
El polímero soluble en agua puede seleccionarse
de entre el grupo constituido, por ejemplo, por polietilenglicol,
copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa,
dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona,
poli-1,3-dioxolano,
poli-1,3,6-trioxano, copolímero de
etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o
copolímeros aleatorios) y dextrano o
poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol,
homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de
polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcohol
polivinílico. El propionaldehído de polietilenglicol puede aportar
ventajas en la preparación debido a su estabilidad en agua.
El polímero puede ser de cualquier peso
molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Para el
polietilenglicol, el peso molecular preferido está comprendido entre
aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término
"aproximadamente" indica que en las preparaciones de
polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que
el peso molecular estipulado) para su facilidad de manejo y
preparación. Pueden utilizarse otros tamaños, dependiendo del perfil
terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación lenta
deseada, los efectos, si existen sobre la actividad biológica, la
facilidad de manipulación, el grado de falta de antigenicidad y
otros efectos conocidos del polietilenglicol para una proteína o
análogo terapéutico).
El número de moléculas de polímero unidas de
este modo puede variar, y un experto en la materia será capaz de
determinar el efecto sobre la función. Una puede monoderivarse, o se
puede proporcionar una o alguna combinación di-, tri-, tetra- de
modificación, con la misma o diferentes fracciones químicas (por
ejemplo, polímeros, tales como diferentes pesos de
polietilenglicoles). La proporción de moléculas de polímero a
moléculas de proteína (o péptido) variará, como sus concentraciones
en la mezcla de reacción. En general, la relación óptima (desde el
punto de vista de eficacia de la reacción en la que no existe ningún
exceso de proteína o polímero sin reaccionar) se determinará
mediante factores tales como el grado de modificación deseado (por
ejemplo, mono, di-, tri-, etc.), el peso molecular del polímero
seleccionado, si el polímero está ramificado o no ramificado y las
condiciones de la reacción.
Las moléculas de polietilenglicol (u otras
fracciones químicas) deberían acoplarse a la proteína en
consideración de los efectos sobre los dominios operativos o
antigénicos de la proteína. Existen numerosos procedimientos de
acoplamiento disponibles para los expertos en la materia, por
ejemplo el documento EP 0 401 384 (que acopla PEG a
G-CSF); Malik et al., Exp. Hematol.,
20:1028-1035 (1992) (que describe la
pegilación de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo).
Por ejemplo, el polietilenglicol puede estar unido por enlaces
covalentes mediante restos de aminoácidos por un grupo reactivo,
tal como un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son
a los que puede unirse una molécula activada de polietilenglicol.
Los restos de aminoácido con un grupo amino libre pueden incluir
restos de lisina y restos de aminoácidos N-terminal,
que tienen un grupo carboxilo libre, pueden incluir restos de ácido
aspártico y restos de ácido glutámico y el resto aminoácido
C-terminal. Pueden utilizarse también grupos
sulfhidrilo como grupo reactivo para el acoplamiento de
molécula(s) de polietilenglicol. Con fines terapéuticos se
prefiere el acoplamiento a un grupo amino, tal como el acoplamiento
al terminal N o al grupo lisina. Debería evitarse el acoplamiento a
restos importantes para la fijación al receptor si se desea la
fijación al receptor.
Se puede desear específicamente la proteína
modificada químicamente en el terminal N. Utilizando
polietilenglicol como ilustración de las presentes composiciones, se
puede seleccionar de entre una variedad de moléculas de
polietilenglicol (por peso molecular, ramificación, etc.), la
proporción de moléculas de polietilenglicol a moléculas de proteína
(o péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de
pegilación que debe realizarse y el procedimiento de obtención de la
proteína pegilada seleccionada en el terminal N. El procedimiento de
obtención de la preparación pegilada en el terminal N (es decir, la
separación de esta fracción de otras fracciones monopegiladas si es
necesario) puede realizarse mediante la purificación del material
pegilado en el terminal N de una población de moléculas de proteína
pegiladas. La modificación química del terminal N selectiva puede
realizarse mediante la alquilación reductora que aprovecha la
reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino
primarios (lisina frente al terminal N) disponibles para la
modificación en una determinada proteína. En las condiciones de
reacción apropiadas, se consigue la modificación sustancialmente
selectiva de la proteína en el terminal N con un grupo carbonilo que
contiene polímero. Por ejemplo, se puede pegilar selectivamente en
el terminal N la proteína realizando la reacción a un pH que permita
aprovecharse de las diferencias de pK_{a} entre los grupos
\varepsilon-amino de los restos de lisina y las
del grupo \alpha-amina del resto
N-terminal de la proteína. Mediante dicha
modificación selectiva se controla el acoplamiento de un polímero
soluble en agua a una proteína: la conjugación con el polímero tiene
lugar principalmente en el terminal N de la proteína y no se produce
ninguna modificación significativa de otros grupos reactivos, tales
como los grupos amino con cadena lateral de lisina. Utilizando la
alquilación reductora, el polímero soluble en agua puede ser del
tipo descrito anteriormente, y debería tener un único aldehído
reactivo para el acoplamiento a la proteína. Puede utilizarse el
propionaldehído de polietilenglicol, que contiene un único aldehído
reactivo.
Como se indicó anteriormente, la presente
invención se refiere a los ADN que codifican los polipéptidos del
AIF así como a los ADN que se hibridan a los ADN que codifican a los
polipéptidos del AIF (véanse a continuación las condiciones de
solubilidad). Por lo tanto, según la presente invención pueden
emplearse técnicas convencionales de biología molecular,
microbiología y de ADN recombinante dentro de la experiencia en la
materia. Dichas técnicas se explican completamente en la
bibliografía científica [por ejemplo, Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989);
Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y
II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985); Gait ed., Oligonucleotide
Synthesis, Oxford University Press (1984); Hames et al.,
eds., Nucleic Acid Hybridization,
Springer-Verlag (1985); Hames et al., eds.
Transcription And Translation, Oxford University Press
(1984)]; Freshney ed., Animal Cell Culture, Oxford
University Press (1986); Immobilized Cell And Enzymes, IRL
Press (1986)]; Perbal, A Practical Guide to Molecular
Cloning, Wiley, Nueva York (1984)]. De particular importancia en
la presente invención son las estrategias para el aislamiento,
clonación, secuenciado, análisis y caracterización de un gen o ácido
nucleico basadas en las técnicas bien conocidas de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR).
Para los fines de esta exposición, son
importantes las siguientes definiciones. Un "replicón" es
cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma,
virus) que opere como una unidad autónoma de replicación del ADN
in vivo, es decir, capaz de replicación bajo su propio
control.
Un "vector" es un replicón, como por
ejemplo un plásmido, fago o cósmido, al que puede acoplarse otro
segmento de ADN con el fin de que lleve aproximadamente la
replicación del segmento acoplado.
Un "casete" se refiere a un segmento de ADN
que puede insertarse en un vector en las secuencias de restricción
específicas. El segmento de ADN codifica un polipéptido de interés,
y el casete y las secuencias de restricción se diseñan para asegurar
la inserción del casete en el propio marco de lectura para la
transcripción y traducción.
ADN "heterólogo" se refiere al ADN no
situado de forma natural en la célula, o en un punto cromosómico de
la célula. Preferentemente el ADN heterólogo comprende un gen
extraño a la célula.
Una célula ha sido "transfectada" por ADN
exógeno o heterólogo cuando dicho ADN ha sido introducido en el
interior de la célula. Una célula ha sido "transformada" por
ADN exógeno o heterólogo cuando el ADN transfectado efectúa un
cambio fenotípico. Preferentemente, el ADN transformante estará
integrado (ligado por enlace covalente) en el ADN cromosómico
construyendo el genoma de la célula.
Un "clon" es una población de células
procedente de una sola célula o de un antecesor común por
mitosis.
Un "polinucleótido" se refiere a un ADN de
una sola cadena, ARN, o ADN modificado o ARN. Este término también
incluye el ADN de doble cadena encontrado, entre otras, en las
moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, fragmentos de
restricción), plásmidos y cromosomas. Al exponer la estructura de
determinadas moléculas de ADN de doble cadena, pueden describirse
las secuencias en la presente memoria según el acuerdo normal de
proporcionar solamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo
largo de la cadena de ADN no transcrita (es decir, la cadena con una
secuencia homóloga al ARNm). Una "molécula de ADN recombinante"
es una molécula de ADN que ha experimentado una manipulación
biológica molecular.
Una molécula de ácido nucleico es
"hibridable" con otra molécula de ácido nucleico, tal como un
ADNc, un ADN genómico o un ARN, cuando la forma de cadena única de
la molécula de ácido nucleico puede hibridarse con otra molécula de
ácido nucleico en condiciones apropiadas de temperatura y de fuerza
iónica de la solución (Sambrook et al., 1989, supra).
Las condiciones de temperatura y de fuerza iónica determinan la
"severidad" de la hibridación. La hibridación requiere que los
dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque
dependiendo de la severidad de la hibridación, son posibles
incompatibilidades entre las bases. La severidad apropiada para los
ácidos nucleicos hibridantes depende de la longitud de los ácidos
nucleicos y del grado de complementariedad, variables bien conocidas
en la materia. Cuanto mayor es el grado de similitud o de homología
entre dos secuencias nucleotídicas, mayor es el valor de T_{m}
para los híbridos de los ácidos nucleicos con estas secuencias. La
estabilidad relativa (correspondiente a la T_{m} mayor) de las
hibridaciones del ácido nucleico disminuye en el orden siguiente:
ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para los híbridos mayores de 100
nucleótidos de longitud, se han derivado las ecuaciones para
calcular la T_{m} (Sambrook et al., 1989, supra,
9.50-0.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos
más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de las
incompatibilidades se hace más importante, y la longitud del
oligonucleótido determina su especificidad (Sambrook et al.,
1989, supra, 11.7-11.8). Preferentemente, una
longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es de por lo menos
aproximadamente 10 nucleótidos; más preferentemente de por lo menos
aproximada-
mente 15 nucleótidos; todavía más preferentemente la longitud es de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos.
mente 15 nucleótidos; todavía más preferentemente la longitud es de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos.
"Recombinación homóloga" se refiere a la
inserción de una secuencia de ADN extraña de un vector en un
cromosoma. Preferentemente, el vector se dirige a un punto
cromosómico específico para la recombinación homóloga. Para la
recombinación homóloga específica, el vector contendrá zonas
suficientemente largas de homología con las secuencias del cromosoma
para permitir la unión e incorporación complementarias del vector en
el cromosoma. Las zonas más largas de homología y los grados mayores
de similitud de secuencia, pueden aumentar la eficacia de la
recombinación homóloga.
Una "secuencia de codificación" de ADN es
una secuencia de ADN que está transcrita y traducida en un
polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se
coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los
límites de la secuencia de codificación se determinan mediante un
codón de inicio en el terminal 5' (amino) y un codón de terminación
de la traducción en el terminal 3' (carboxilo). Una secuencia de
codificación puede incluir, pero no se limita a, secuencias
procarióticas, ADNc del ARNm eucariótico, secuencias del ADN
genómico del ADN eucariótico (por ejemplo, mamífero) e incluso
secuencias de ADN sintético. Si la secuencia de codificación se
desea para la expresión en una célula eucariótica, una señal de
poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción
estará situada normalmente en 3' con respecto a la secuencia de
codificación.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
termino "AIF" (factor inductor de apoptosis) de mamífero cuando
se utiliza para describir una molécula de ácido nucleico se refiere
a una molécula de ácido nucleico o a un fragmento de la misma que
(a) presenta la secuencia nucleotídica indicada en la SEC. ID nº: 1
(murina), SEC. ID nº: 4 (isoforma murina), SEC. ID nº: 7 (humana),
SEC. ID nº: 10 (isoforma humana) y SEC. ID nº: 13 (isoforma humana);
(b) presenta una secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido que es por lo menos 75 por ciento idéntico, pero puede
ser mayor del 75 por ciento, es decir 80 por ciento, 85 por ciento,
90 por ciento, 95 por ciento, o incluso mayor del 95 por ciento
idéntico, al polipéptido codificado por cualquiera de entre SEC. ID
nº: 1 (murina), SEC. ID nº: 4 (isoforma murina), SEC. ID nº: 7
(humana), SEC. ID nº: 10 (isoforma humana) y SEC. ID nº: 13
(isoforma humana); (c) es una variante alélica natural de (a) o (b);
(d) es una variante de ácido nucleico de (a)-(c) producida como se
proporciona en la presente memoria; (e) presenta una secuencia que
es complementaria de (a)-(d); y/o (f) se hibrida con cualquiera de
(a)-(e) en condiciones de alta severidad. La expresión
"condiciones de alta severidad" se refiere a la hibridación y
el lavado en condiciones que permitan únicamente el enlace de una
molécula de ácido nucleico tal como un oligonucleótido o una sonda
molecular de ADNc con secuencias muy homólogas. Las condiciones de
hibridación severas a título de ejemplo son las siguientes:
hibridación a 65ºC en 3 \times SSC, NaPO_{4} 20 mm pH 6,8
seguido de lavado a 55ºC-65ºC y lavado con NaCl
0,015 M, CitratoNa 0,005 M y SDS al 0,1 por ciento. Resulta evidente
para los expertos en la materia que la variación en estas
condiciones tiene lugar basándose en la longitud y contenido
nucleotídico de GC de las secuencias que deben hibridarse. Están
disponibles fórmulas estándar en la materia para la determinación de
las condiciones de hibridación exacta. Véase Sambrook et al.,
supra. Por ejemplo, otra solución de lavado severo es
0,2 \times SSC y SDS al 0,1 por ciento utilizado a una temperatura comprendida entre 50ºC y 65ºC. Cuando se utilizan sondas de oligonucleótidos para cribar bancos de ADNc o genómicos, pueden utilizarse las siguientes condiciones severas de lavado. Un protocolo utiliza 6 \times SSC con pirofosfato de sodio al 0,05 por ciento a una temperatura comprendida entre 35ºC y 62ºC, dependiendo de la longitud de la sonda de oligonucleótido. Por ejemplo, sondas de 14 pares de bases se lavan entre 35ºC y 40ºC, sondas de 17 pares de bases se lavan entre 45ºC y 50ºC, sondas de 20 pares de bases se lavan entre 52ºC y 57ºC, y sondas de 23 pares de bases se lavan entre 57ºC y 63ºC. La temperatura puede aumentarse 2 a 3ºC cuando el enlace no específico de fondo parece elevado. Un segundo protocolo utiliza cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para lavar sondas de oligonucleótido. Una solución severa de lavado es TMAC 3 M, Tris-HCl 50 mm, pH 8,0 y SDS al 0,2 por ciento. La temperatura de lavado que utiliza esta solución es función de la longitud de la sonda. Se lava aproximadamente entre 45 y 50ºC. Los ácidos nucleicos que codifican el AIF de mamífero incluyen también secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido del AIF de mamífero o un fragmento del mismo, a modo de codones degenerados.
0,2 \times SSC y SDS al 0,1 por ciento utilizado a una temperatura comprendida entre 50ºC y 65ºC. Cuando se utilizan sondas de oligonucleótidos para cribar bancos de ADNc o genómicos, pueden utilizarse las siguientes condiciones severas de lavado. Un protocolo utiliza 6 \times SSC con pirofosfato de sodio al 0,05 por ciento a una temperatura comprendida entre 35ºC y 62ºC, dependiendo de la longitud de la sonda de oligonucleótido. Por ejemplo, sondas de 14 pares de bases se lavan entre 35ºC y 40ºC, sondas de 17 pares de bases se lavan entre 45ºC y 50ºC, sondas de 20 pares de bases se lavan entre 52ºC y 57ºC, y sondas de 23 pares de bases se lavan entre 57ºC y 63ºC. La temperatura puede aumentarse 2 a 3ºC cuando el enlace no específico de fondo parece elevado. Un segundo protocolo utiliza cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para lavar sondas de oligonucleótido. Una solución severa de lavado es TMAC 3 M, Tris-HCl 50 mm, pH 8,0 y SDS al 0,2 por ciento. La temperatura de lavado que utiliza esta solución es función de la longitud de la sonda. Se lava aproximadamente entre 45 y 50ºC. Los ácidos nucleicos que codifican el AIF de mamífero incluyen también secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido del AIF de mamífero o un fragmento del mismo, a modo de codones degenerados.
La identidad de secuencia por ciento puede
determinarse mediante procedimientos normalizados que se utilizan
habitualmente para comparar la similitud en la posición de los
aminoácidos de dos polipéptidos. A título de ejemplo, utilizando un
programa informático tal como BLAST o FASTA, los dos polipéptidos
para los cuales la identidad de secuencia por ciento debe
determinarse están alineados para la compatibilidad óptima de sus
respectivos aminoácidos (el "intervalo compatible", que puede
incluir la longitud completa de una o ambas secuencias, o una parte
predeterminada de una o ambas secuencias). Cada programa informático
proporciona una penalización de apertura "por defecto" y una
penalización de hueco "por defecto" y una matriz de puntuación
tal como PAM 250. Puede utilizarse una matriz de puntuación patrón
(véase Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and
Structure, vol. 5, supl. 3 (1978)), junto con el programa
informático. La identidad por cien puede calcularse a continuación
utilizando un algoritmo contenido en un programa tal como FASTA
como:
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Número total de emparejamientos idénticos\+\cr
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
\+ \times 100\cr [longitud de la secuencia más larga en el tramo
emparejado] +\+\cr [número de huecos introducidos en la secuencia
más larga para alinear las dos
secuencias]\+\cr}
Los polipéptidos que son por lo menos 70 por
ciento idénticos presentarán típicamente una o más sustituciones,
deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con el AIF
natural. Normalmente, las sustituciones serán conservadoras de modo
que ejerzan poco o ningún efecto sobre la carga global neta, la
polaridad o la hidrofobia de la proteína pero opcionalmente pueden
aumentar la actividad de AIF. En la Tabla I se publican las
sustituciones conservadoras ejemplares a continuación.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Básicos: \+ arginina, lisina, histidina\cr Ácidos: \+ ácido
glutámico, ácido aspártico\cr Polar: \+ glutamina, asparagina\cr
Hidrófobos: \+ leucina, isoleucina, valina\cr Aromáticos: \+
fenilalanina, triptófano, tirosina\cr Pequeños: \+ glicina,
alanina, serina, treonina,
metionina\cr}
Pueden prepararse otras variantes del
polipéptido alineando una secuencia del polipéptido del AIF humano
con una secuencia de polipéptido del AIF murino (o del AIF de otras
especies) e identificando los aminoácidos divergentes. Uno o más de
los aminoácidos divergentes pueden sustituirse a continuación por el
aminoácido divergente o por otros aminoácidos. Dichas variantes por
consiguiente pueden ser un polipéptido compuesto que comprende
secuencias de aminoácidos procedentes de polipéptidos del AIF, que
proceden de dos o más especies.
Los ácidos nucleicos contemplados por la
presente invención se extienden como se indica, a otros ácidos
nucleicos que codifican la expresión de péptidos tales como los
indicados en la SEC. ID nº: 2 (completa de ratón), nº: 3 (madura de
ratón), nº: 8 (completa humana), nº: 9 (madura humana), así como
algunas isoformas [isoforma murina: SEC. ID nº: 5 (completa), SEC.
ID nº: 6 (completa); isoformas humanas: SEC. ID nº: 11 (completa),
SEC. ID nº: 12 (madura), y SEC. ID nº: 14 (completa), SEC. ID nº: 15
(madura)] de los polipéptidos anteriores. Por consiguiente, aunque
los ADN que codifican al AIF se han aislado y secuenciado debido a
homologías demostradas, cualquier célula animal puede servir
potencialmente como fuente de ácido nucleico para la clonación
molecular de un polinucleótido que codifica los péptidos de la
invención. El ADN puede obtenerse por procedimientos normalizados
conocidos en la tecnología del ADN clonado (por ejemplo, un
"banco" de ADN), por síntesis química, por clonación de ADNc o
por clonación de ADN genómico, o fragmentos del mismo, purificados a
partir de la célula deseada [Sambrook et al., 1989,
supra; Glover, 1985, supra]. Los clones procedentes
del ADN genómico pueden contener zonas de ADN reguladoras e
intrónicas además de zonas de codificación. Los clones procedentes
del ADNc no contendrán secuencias de intrones. Cualquiera que sea la
procedencia, el gen debería estar molecularmente clonado en un
vector adecuado para la propagación del gen.
En la clonación molecular del gen del ADN
genómico, el ADN genómico puede ampliarse utilizando cebadores
seleccionados de entre las secuencias de ADNc. Alternativamente, se
generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán el gen
deseado. El ADN puede escindirse en puntos específicos utilizando
varias enzimas de restricción. Se puede utilizar también
desoxirribonucleasa en presencia de manganeso para fragmentar el
ADN, o el ADN puede cizallarse físicamente, como por ejemplo,
mediante tratamiento con ultrasonidos. Los fragmentos del ADN lineal
pueden separarse a continuación por tamaño mediante técnicas
normalizadas, que incluyen pero no se limitan a, electroforesis en
gel de agarosa y poliacrilamida y cromatografía en columna.
Una vez generados los fragmentos de ADN, la
identificación del fragmento de ADN específico que contiene el AIF o
el gen similar al AIF deseado puede realizarse de numerosas maneras.
Por ejemplo, si una cantidad de un fragmento de un AIF o de un gen
similar al AIF o de su ARN específico, o de un fragmento del mismo,
está disponible y puede purificarse y marcarse, los fragmentos de
ADN generados pueden cribarse mediante hibridación del ácido
nucleico con una sonda marcada [Benton et al., Science,
196:180 (1977); Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 72:3961 (1975)]. La presente invención proporciona
dichas sondas de ácido nucleico, que pueden prepararse
convenientemente a partir de las secuencias específicas dadas a
conocer en la presente memoria, por ejemplo, una sonda hibridable
con una secuencia de nucleótidos correspondiente por lo menos a 10,
y preferentemente a 15, fragmentos nucleotídicos de las secuencias
descritas por las SEC. ID nº: 1 y nº: 7, así como el ADN (dado a
conocer en la presente memoria) que codifica las isoformas de los
presentes polipéptidos del AIF. Preferentemente se selecciona un
fragmento que es muy exclusivo para los polipéptidos del AIF de la
invención. Los fragmentos de ADN con homología sustancial a la sonda
se hibridarán. Como se indicó anteriormente, cuanto mayor sea el
grado de homología, más severas serán las condiciones de hibridación
que pueden utilizarse. En una forma de realización, se utilizan
condiciones de hibridación de baja severidad para identificar un
péptido de AIF homólogo. Sin embargo, en un aspecto preferido, y
como se demuestra experimentalmente en la presente memoria, un ácido
nucleico que codifica un péptido del AIF de la invención se
hibridará con un ácido nucleico que presenta una secuencia de
nucleótidos tal como la representada en la SEC. ID nº: 1 y nº: 7,
así como el ADN (dado a conocer en la presente memoria) que codifica
las isoformas de los presentes polipéptidos del AIF o un fragmento
hibridable de los mismos, en condiciones moderadamente severas; más
preferentemente, se hibridará en condiciones de alta severidad.
Alternativamente, la presencia del gen puede
detectarse mediante ensayos basados en las propiedades físicas,
químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, los
clones de ADNc o los clones de ADN que hibridan o seleccionan los
ARNm propios, pueden seleccionarse para que produzcan una proteína
que, por ejemplo, presente migración electroforética, comportamiento
de enfoque isoeléctrico, cartografía de digestión proteolítica,
actividad de tirosina fosfatasa o propiedades antigénicas similares
o idénticas a las conocidas para los presentes polipéptidos del AIF.
Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden
utilizarse convenientemente para cribar homólogos de los
polipéptidos del AIF de otras procedencias.
Un gen que codifica un polipéptido del AIF de la
invención puede también identificarse por selección del ARNm, es
decir, mediante hibridación del ácido nucleico seguida de traducción
in vitro. En este procedimiento, se utilizan fragmentos para
aislar los ARNm complementarios por hibridación. Dichos fragmentos
de ADN pueden representar ADN modulador purificado, disponible. El
análisis por inmunoprecipitación o el análisis funcional (por
ejemplo, actividad de tirosina fosfatasa) de los productos de
traducción in vitro de los productos de los ARNm aislados
identifica el ARNm y, por consiguiente, los fragmentos de ADN
complementarios, que contienen las secuencias deseadas. Además,
pueden seleccionarse ARNm específicos por adsorción de polisomas
aislados de las células para los anticuerpos inmovilizados
específicamente dirigidos contra un polipéptido del AIF.
Un ADNc del polipéptido del AIF radiomarcado
puede sintetizarse utilizando el ARNm seleccionado (procedente de
los polisomas adsorbidos) como plantilla. El ARNm o el ADNc
radiomarcado puede utilizarse a continuación como sonda para
identificar fragmentos de ADN del polipéptido del AIF homólogos
entre otros fragmentos de ADN genómicos.
Tal como se mencionó anteriormente, una
secuencia de ADN que codifica péptidos del AIF como los dados a
conocer en la presente memoria puede prepararse sintéticamente en
lugar de clonarse. La secuencia de ADN puede diseñarse con los
codones apropiados para las secuencias de aminoácidos del
polipéptido del AIF. En general, si la secuencia se utilizase para
la expresión se seleccionarán codones preferidos para el huésped
deseado. La secuencia completa se monta en oligonucleótidos
superpuestos preparados por métodos normalizados y montados en una
secuencia de codificación completa [por ejemplo, Edge,
Nature, 292:756 (1981); Nambair et al.,
Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol.
Chem., 259:6311 (1984)].
Las secuencias del ADN sintético permiten la
construcción conveniente de genes que expresen análogos de AIF, tal
como se describió anteriormente. Alternativamente, el ADN que
codifica análogos puede prepararse por mutagénesis dirigida al sitio
de genes del AIF o de los ADNc, y los análogos pueden prepararse
directamente utilizando síntesis de polipéptidos convencional.
Un método general para la incorporación
específica en el sitio de aminoácidos no naturales en proteínas se
describe en Noren et al., Science,
244:182-188 (1989). Este método puede
utilizarse para crear análogos del polipéptido del AIF con
aminoácidos no naturales.
La presente invención se extiende a la
preparación de nucleótidos de cadena complementaria y ribozimas que
pueden utilizarse para interferir con la expresión de las proteínas
del AIF en el contexto de la traducción. Este método entraña que el
ácido nucleico de cadena complementaria y los ribozimas bloqueen la
traducción de un ARNm específico, ya sea enmascarando este ARNm con
un ácido nucleico de cadena complementaria o escindiéndolo con una
ribozima.
Los ácidos nucleicos de cadena complementaria
son las moléculas de ADN o de ARN que son complementarias con por lo
menos una fracción de una molécula de ARNm específico [Weintraub,
Sci. Am., 262:40-46 (1990);
Marcus-Sekura, Anal. Biochem.,
172:289-295 (1988)]. En la célula, se
hibridan con este ARNm, formando una molécula de doble cadena no
traducible. Por consiguiente, los ácidos nucleicos de cadena
complementaria interfieren con la expresión de ARNm en la proteína.
Los oligómeros de aproximadamente quince nucleótidos y las moléculas
que se hibridan con el codón de iniciación AUG serán particularmente
eficaces, ya que son fáciles de sintetizar y son probablemente las
que plantean menos problemas cuando las introducen en las células
productoras del péptido del AIF. Se han utilizado métodos de cadena
complementaria para inhibir la expresión de muchos genes in
vitro [(Marcus-Sekura, 1988 supra; Hambor
et al., J. Exp. Med., 168:1237-1245
(1988)].
Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la
capacidad de escindir específicamente otras moléculas de ARN de una
sola cadena de manera algo análoga a las endonucleasas de
restricción del ADN. Las ribozimas se descubrieron a partir de la
observación de que determinados ARNm tienen capacidad para escindir
sus propios intrones. Al modificar la secuencia nucleotídica de
estos ARN, los investigadores han podido modificar genéticamente las
moléculas que reconocen las secuencias específicas nucleotídicas en
una molécula de ARN y escindirla [Cech, J. Am. Med.
Assoc., 260:3030-3034 (1988)]. Debido a
que son específicas de la secuencia, únicamente los ARNm con
determinadas secuencias se inactivan.
Los investigadores han identificado dos tipos de
ribozimas, el tipo Tetrahymena y el tipo "cabeza de
martillo". Las ribozimas del tipo Tetrahymena reconocen
secuencias de cuatro bases, mientras que las de tipo "cabeza de
martillo" reconocen secuencias de once a dieciocho bases. Cuanto
más larga sea la secuencia de reconocimiento, más probablemente
tendrá lugar exclusivamente en la especie de ARNm diana. Por
consiguiente, las ribozimas del tipo cabeza de martillo son
preferibles a las ribozimas del tipo Tetrahymena para
inactivar una especie de ARNm específico, y las secuencias de
reconocimiento de dieciocho bases son preferibles a las secuencias
de reconocimiento más cortas.
Las secuencias de ADN descritas en la presente
memoria pueden utilizarse por lo tanto para preparar moléculas de
cadena complementaria en contraste y las ribozimas que escinden los
ARNm para los polipéptidos del AIF y sus ligandos, inhibiendo de
este modo la expresión del gen del AIF y conduciendo a una menor
estimulación de apoptosis.
En otra forma de realización, la presente
invención aporta los oligonucleótidos cortos complementarios con las
cadenas de codificación y complementarias del ácido nucleico del
AIF, o con las zonas no codificantes del gen del AIF 5', 3' o
interna (intrónica) a la zona de codificación. Dichos ácidos
nucleicos son útiles como sondas, ya sea sondas oligonucleotídicas
marcadas directamente o como cebadores para la reacción en cadena de
la polimerasa, para evaluar la presencia de mutaciones en el gen del
AIF o el nivel de expresión de ARNm del AIF. En una forma de
realización específica, los ácidos nucleicos no codificantes
proporcionan la recombinación homóloga para la integración de un gen
ampliable y/o otras secuencias reguladoras en proximidad al gen del
AIF, por ejemplo, para proporcionar mayores niveles de expresión del
polipéptido del AIF o para superar una mutación en las secuencias
reguladoras del gen del AIF que eviten niveles apropiados de
expresión del polipéptido del AIF (publicación de patente
internacional WO 91/06666, por Skoultchi; publicación de patente
internacional nº WO 91/09955, publicada el 11 de julio de 1991 por
Chappel; publicación de patente internacional nº WO 90/14092, por
Kucherlapati y Campbell).
Las secuencias de control de transcripción y
traducción son secuencias reguladoras del ADN, tales como
activadores, potenciadores, terminadores y similares, que
proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una
célula huésped. En las células eucarióticas, las señales de
poliadenilación son secuencias de control.
Para los objetivos de esta exposición, son
importantes las siguientes definiciones. Una secuencia de
codificación está "bajo control" de las secuencias de
transcripción y de traducción en una célula cuando la ARN polimerasa
transcribe la secuencia de codificación en el ARNm, que es a
continuación el ARN-trans cortado y empalmado
transportado a la proteína codificada por la secuencia de
codificación.
Una "secuencia señal" está incluida al
principio de la secuencia de codificación de una proteína que debe
ser expresada en la superficie de una célula. Esta secuencia
codifica un péptido señal, N-terminal en el
polipéptido maduro, que se dirige a la célula huésped para trasladar
el polipéptido. La expresión "secuencia señal de transposición"
se utiliza también en la presente memoria para referirse a esta
especie de secuencia señal. Las secuencias señal de transposición
pueden encontrarse asociadas con una variedad de proteínas naturales
con eucariotas y procariotas, y con frecuencia son operativas en
ambos tipos de organismos.
Una secuencia de ADN está "operativamente
ligada" a una secuencia de control de expresión cuando la
secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción
y la traducción de esta secuencia de ADN. La expresión
"operativamente ligada" comprende las que presentan una señal
de iniciación apropiada (por ejemplo, ATG) frente a la secuencia de
ADN que debe expresar y mantener el marco de lectura correcto que
permita la expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la
secuencia de control de expresión y la producción del producto
deseado codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que se desea
insertar en una molécula de ADN recombinante no contiene una señal
de iniciación apropiada, dicha señal inicial puede insertarse
corriente arriba (5') del marco de lectura y en éste con el gen.
Una "secuencia activadora" es una zona
reguladora del ADN capaz de unir la ARN polimerasa en una célula e
iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente
abajo (dirección 3'). Para los objetivos de definición de la
presente invención, la secuencia activadora está unida en su
terminal 3' mediante la secuencia de iniciación de la transcripción
y se prolonga corriente arriba (dirección 5') para incluir el número
mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción
en los niveles de fondo detectables anteriores. En la secuencia
activadora se encontrará una secuencia de iniciación de la
transcripción (convenientemente definida por ejemplo, por
cartografía con la nucleasa S1), así como los dominios de fijación
de la proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de
ARN polimerasa.
Otra característica de la presente invención
consiste en la expresión de las secuencias de ADN dadas a conocer en
la presente memoria. Como es bien conocido en la materia, las
secuencias de ADN pueden ser expresadas ligándolas operativamente a
una secuencia de control de la expresión en un vector de expresión
apropiado y empleando este vector de expresión para transformar un
huésped unicelular apropiado.
Dicho enlace operativo de una secuencia de ADN
de la presente invención a una secuencia de control de la expresión,
desde luego, incluye, si no ya parte de la secuencia del ADN, el
aporte de un codón de iniciación, ATG, en el marco de lectura
correcto corriente arriba de la secuencia del ADN.
Puede emplearse una amplia variedad de
combinaciones huésped/vector de expresión para expresar las
secuencias del ADN de la presente invención. Los vectores de
expresión útiles, por ejemplo, pueden estar constituidos por
segmentos de secuencias cromosómicas, no cromosómicas y de ADN
sintético. Los vectores adecuados comprenden derivados de SV40 y
plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, derivados plasmídicos
co1 E1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC o pUC de los plásmidos de E.
coli, por ejemplo, vectores de pGEX, vectores de pET,
pmal-c, pFLAG, etc., y sus derivados, plásmidos tal
como RP4; los ADN del fago, por ejemplo, los numerosos derivados del
fago \lambda, por ejemplo NM989, y otro ADN del fago, por
ejemplo, M13 y el ADN filamentoso del fago de una sola cadena,
plásmidos de levaduras tal como el plásmido 2 \mu o derivados del
mismo; vectores útiles en las células eucarióticas, tales como los
vectores útiles en células de insecto o de mamífero; vectores
procedentes de combinaciones de plásmidos y de los ADN del fago,
tales como los plásmidos que han sido modificados para emplear ADN
del fago u otras secuencias de control de la expresión; y similares.
Asimismo puede conseguirse la expresión del AIF en levadura
metilótrofa, por ejemplo, levadura de Pichia pastoris (por
ejemplo, publicación de la patente internacional nº WO 90/03431, de
Brierley et al.; publicación de la patente internacional nº
WO 90/10697, por Siegel et al.).
Cualquier variedad amplia de las secuencias de
control de la expresión (secuencias que controlan la expresión de
una secuencia de ADN operativamente ligada a ella) puede utilizarse
en estos vectores para expresar las secuencias de ADN de la presente
invención. Dichas secuencias útiles de control de expresión
comprenden, por ejemplo, los activadores precoces o tardíos de SV40,
CMV, vacunas, poliomas o adenovirus, el sistema lac, el
sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el
sistema LTR, el operador principal y las zonas activadoras
del fago \lambda, las zonas de control de la proteína de
recubrimiento fd, el activador de la
3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas
glucolíticas, los activadores de la fosfatasa ácida (por ejemplo,
Pho5), el activador AOX 1 de la levadura metilótrofa, los
activadores de los factores de
\alpha-emparejamiento de levaduras y otras
secuencias conocidas para controlar la expresión de los genes de
células procarióticas o eucarióticas o sus virus y varias
combinaciones de las mismas.
Una amplia variedad de células huésped
unicelulares son también útiles para expresar las secuencias de ADN
de la presente invención. Estos huéspedes pueden incluir huéspedes
eucarióticos y procarióticos bien conocidos, tales como las cepas de
E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces; hongos tales
como las levaduras (Saccharomyces, y levadura metilótrofa tal
como Pichia, Candida, Hansenula y Torulopsis); células
animales, tales como las células CHO, R11, B-W y
LM, células de riñón del mono verde africano (por ejemplo, COS 1,
COS 7, BSC1, BSC40 y BMT10), células de insecto (por ejemplo,
Sf9) y células humanas y células vegetales en cultivo
tisular.
Debe entenderse que no todos los vectores, las
secuencias de control de la expresión y los huéspedes funcionarán
igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la presente
invención. Ni todos los huéspedes funcionarán igualmente bien con el
mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la materia
podrá seleccionar los vectores, las secuencias de control de la
expresión y los huéspedes apropiados sin experimentación indebida
para realizar la expresión deseada sin apartarse del alcance de la
presente invención. Por ejemplo, al seleccionar un vector, puede
considerarse el huésped porque el vector debe operar en él. El
número de copias del vector, la capacidad para controlar este número
de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por
el vector, tales como los marcadores de antibióticos, se
considerarán también.
Al seleccionar una secuencia de control de la
expresión, se considerará normalmente una variedad de factores.
Éstos comprenden, por ejemplo, la resistencia relativa del sistema,
su capacidad de control y su compatibilidad con la secuencia de ADN
determinada o del gen para expresarse, particularmente con respecto
a las estructuras secundarias potenciales. Los huéspedes
unicelulares adecuados se seleccionarán en consideración, por
ejemplo, a su compatibilidad con el vector seleccionado, a sus
características de secreción, a su capacidad para plegar las
proteínas correctamente y a sus requisitos de fermentación, así como
a la toxicidad para el huésped del producto codificado por las
secuencias de ADN que deben expresarse, y a la facilidad de
purificación de los productos de la expresión.
Considerando estos y otros factores, un experto
en la materia podrá construir una variedad de combinaciones
vector/secuencia de control de la expresión/puente que expresarán
las secuencias del ADN de la presente invención en la fermentación o
en cultivo animal a gran escala.
En una forma de realización específica, puede
expresarse una proteína de fusión del AIF. Una proteína de fusión
del AIF comprende por lo menos una fracción operativamente activa de
un polipéptido del AIF. Las secuencias que no son del AIF pueden ser
secuencias con terminal carboxi del AIF. Además, para la expresión
estable de una proteína de fusión del AIF proteolíticamente
inactiva, la fracción de la proteína de fusión que no es del AIF se
une mediante un enlace peptídico al terminal amino de la proteína
del AIF. Una molécula de ADN recombinante que codifica dicha
proteína de fusión comprende una secuencia que codifica por lo menos
una fracción operativamente activa de una proteína que no es del
AIF unida en la estructura a la secuencia de codificación del AIF y
codifica preferentemente una secuencia de escisión para una proteasa
específica, por ejemplo, trombina o factor Xa, preferentemente en la
unión AIF-no AIF.
Con respecto a las proteínas de fusión del AIF,
un aspecto adicional incluye la fusión del polipéptido del AIF o un
fragmento biológicamente activo del mismo con anticuerpos o
fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, F_{c}, S_{c}F_{v}).
Dicho montaje sería útil para dirigir el AIF a las células que
expresan antígenos que se unen a anticuerpos o a fragmentos de los
mismos acoplados al AIF (es decir, la proteína de fusión).
En otro aspecto, puede utilizarse el vector pGEX
[Smith et al., Gene 67:31-40 (1988)]. Este
vector fusiona el ADNc de la glutatión S-transferasa
de Schistosoma japonicum con la secuencia de interés. Las
proteínas bacterianas se recogen y las proteínas recombinantes
pueden purificarse rápidamente en una columna de afinidad de
glutatión reducido. El transportador de GST puede escindirse
posteriormente de las proteínas de fijación por digestión con
proteasas específicas para la secuencia. Después de la escisión, el
transportador y la proteína de fusión no escindida puede eliminarse
por absorción en glutatión agarosa. Ocasionalmente aparecen
dificultades con el sistema cuando la proteína codificada es
insoluble en soluciones acuosas.
La expresión de proteínas recombinantes de
sistemas bacterianos puede producir el plegamiento incorrecto de la
proteína expresada, lo que requiere replegamiento. La proteína
recombinante puede replegarse antes o después de la escisión para
formar un polipéptido del AIF operativamente activo. El polipéptido
del AIF puede replegarse mediante las etapas de (i) incubación de la
proteína en un tampón desnaturalizado que contiene un agente
reductor, y a continuación (ii) incubación de la proteína en un
tampón que contiene un agente oxidante, y preferentemente contiene
además un agente estabilizante de la proteína o un agente caótropo o
ambos. Las parejas de agentes redox (reductor/oxidante) adecuadas
comprenden, pero no se limitan a, glutatión reducido/disulfuro de
glutatión, cistina/cisteína, cistamina/cisteamina y
2-mercaptoetanol/disulfuro de
2-hidroxieltilo. En un aspecto particular, la
proteína de fusión puede solubilizarse en un desnaturalizante, tal
como la urea, antes de intercambiar en el tampón de reducción. En
una forma de realización preferida, la proteína se purifica también,
por ejemplo, por intercambio iónico o cromatografía de quelación con
Ni, antes de intercambiar en el tampón de reducción. Los agentes
desnaturalizantes comprenden pero no se limitan a la urea y a la
guanidina-HCl^{-}. La proteína recombinante se
diluye a continuación aproximadamente por lo menos 10 veces, más
preferentemente aproximadamente 100 veces, en un tampón de oxidación
que contiene un agente oxidante, tal como, pero no limitado a
Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 0,15 M,
glutatión oxidado 0,3 M. La proteína de fusión se incuba a
continuación durante aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas,
preferentemente aproximadamente 2 a aproximadamente 16 horas, a
temperatura ambiente en el tampón oxidante. El tampón oxidante puede
comprender un agente estabilizante de proteínas, por ejemplo, un
azúcar, un alcohol o un sulfato amónico. El tampón oxidante puede
comprender además un agente caótropo a baja concentración, para
desestabilizar las interacciones intermoleculares incorrectas y
favorecer de este modo el plegamiento apropiado. Los agentes
caótropos adecuados incluyen pero no se limitan a un detergente, un
poliol, L-arginina, guanidina-HCl y
polietilenglicol (PEG). Es importante utilizar una concentración
suficientemente baja del agente caótropo para impedir la
desnaturalización de la proteína. La proteína replegada puede
concentrarse por lo menos unas 10 veces, más preferentemente en la
cantidad en que se diluyó en el tampón oxidante.
Pueden producirse asimismo procesos de
fermentación bacteriana en una preparación de proteínas
recombinantes que contenga niveles inaceptables de endotoxinas. Por
ejemplo, la invención contempla la eliminación de dichas
endotoxinas, por ejemplo, utilizando anticuerpos específicos para la
endotoxina u otras moléculas de unión a la endotoxina. La presencia
de endotoxinas puede ser determinada mediante técnicas normalizadas,
tales como las que emplean reactivos E-TOXATE
(Sigma, St. Louis, Missouri), o con bioanálisis.
Además del ejemplo específico, los presentes
inventores contemplan la utilización de sistemas de expresión de
baculovirus, mamíferos y levaduras para expresar los polipéptidos
del AIF. Por ejemplo, en los sistemas de expresión de baculovirus,
ambos vectores de transferencia sin fusión, tales como pero no
limitados a pVL941 (secuencia de clonación de BamH1);
pVL1393 (secuencia de clonación de BamH1, SmaI,
XbaI, EcoR1, NotI, XmaIII, BglII
y Pst1; Invitrogen), pVL1392 (secuencia de clonación de
BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI,
XbaI, SmaI y BamH1; Summers e Invitrogen) y
pBlueBacIII (secuencia de clonación de BamH1,
BglII, PstI, NcoI y HindIII, con posible
cribado recombinante azul/blanco; Invitrogen) y vectores de
transferencia de fusión, tales como pero no limitados a pAc700
(secuencia de clonación de BamH1 y KpnI, en la que la
secuencia del reconocimiento BamH1 comienza en el codón de
iniciación; Summers), pAc701 y pAc702 (igual que pAc700, con
diferentes marcos de lectura), pAc360 (36 pares de bases de la
secuencia de clonación BamH1 corriente abajo de un codón de
iniciación de polihedrina; Invitrogen) y pBlueBacHisA, B, C (tres
marcos de lectura diferentes, con secuencia de clonación de
BamH1, BglII, PstI, NcoI y
HindIII, un péptido N-terminal para la
purificación de ProBond y el cribado recombinante azul/blanco de
placas; Invitrogen).
Los vectores de expresión de mamífero
contemplados para su utilización en la invención comprenden vectores
con activadores inducibles, tales como el activador de dihidrofolato
reductasa (DHRF), por ejemplo, cualquier vector de expresión con un
vector de expresión DHFR, o DHFR/metotrexato, tal como
pED (secuencia de clonación de PstI, SalI,
SbaI, SmaI y EcoRI, con el vector que expresa
tanto al gen clonado como a DHFR; Kaufman, Current
Protocols in Molecular Biology, 16:12 (1991).
Alternativamente, un vector de coampliación de glutamina
sintetasa/metionina sulfoximina, tal como pEE14 (secuencia de
clonación de HindIII, XbaI, SmaI, SbaI,
EcoRI y BclI, en la que el vector expresa la
glutamina sintetasa y el gen clonado; Celltech). En otra forma de
realización, puede utilizarse un vector que dirige la expresión
episómica bajo el control del virus de Epstein Barr (EBV), tales
como pREP4 (secuencia de clonación de BamH1, SfiI,
XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI,
PvuII y KpnI, el activador constitutivo de
RSV-LTR, el marcador seleccionable de higromicina,
Invitrogen), pCEP4 (secuencia de clonación de BamH1,
SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII,
NheI, PvuII y KpnI, el gen precoz inmediato de
hCMV constitutivo, el marcador seleccionable de higromicina;
Invitrogen), pMEP4 (secuencia de clonación de KpnI,
PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI,
SfiI, BamH1, el activador inducible del gen IIa de
metalotioneína, el marcador seleccionable de higromicina;
Invitrogen), pREP8 (secuencia de clonación de BamH1,
XhoI, NotI, HindIII, NheI y KpnI,
activador de RSV-LTR, marcador seleccionable de
histidinol; Invitrogen), pREP9 (secuencia de clonación de
KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI,
SfiI y BamH1, activador de RSV-LTR,
marcador seleccionable de G418; Invitrogen) y pEBVHis (activador de
RSV-LTR, marcador seleccionable de higromicina,
péptido N-terminal purificable por la resina
ProBond y escindido por enterocinasa; Invitrogen). Los vectores de
expresión de mamífero seleccionables para su utilización en la
invención comprenden pRc/CMV (secuencia de clonación de
HindIII, BstXI, NotI, SbaI y
ApaI, selección G418; Invitrogen), pRc/RSV (secuencia de
clonación de HindIII, SpeI, BstXI, NotI,
XbaI, selección G418; Invitrogen) y otros. Los vectores de
expresión de mamífero del virus de la vacuna (Kaufman, 1991,
supra) para su utilización según la invención comprenden pero
no se limitan a pSC11 (secuencia de clonación SmaI, selección
TK y \beta-gal), pMJ601 (secuencia de clonación de
SalI, SmaI, AflI, NarI, BspMII,
BamHI, ApaI, NheI, ScaII, KpnI y
HindIII; selección TK y \beta-gal) y
pTKgptF1S (secuencia de clonación de EcoRI, PstI,
SalI, AccI, HindII, SbaI, BamHI y
Hpa, selección TK o XPRT).
Pueden utilizarse asimismo sistemas de expresión
de levadura según la invención para expresar polipéptidos del AIF.
Por ejemplo, el vector pYES2 no de fusión (secuencia de clonación de
XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI,
EcoRI, BstXI, BamH1, SacI, KpnI y
HindIII; Invitrogen) o la fusión pYESHisA, B, C (secuencia de
clonación de XbaI, SphI, ShoI, NotI,
BstXI, EcoRI, BamH1, SacI, KpnI y
HindIII, péptido N-terminal purificado con la
resina ProBond y escindido con enterocinasa; Invitrogen) por
mencionar sólo dos, pueden emplearse según la invención.
Es más deseable que los análogos del AIF puedan
prepararse a partir de las secuencias nucleotídicas derivadas del
alcance de la presente invención.
Además de la expresión recombinante del
polipéptido del AIF, la presente invención contempla y permite
totalmente la preparación del polipéptido del AIF, o de fragmentos
del mismo, utilizando las técnicas bien conocidas y muy
desarrolladas de la síntesis de péptidos en fase sólida. La
invención contempla utilizar tanto el Boc ocular como el Fmoc, así
como otras estrategias de grupos protectores, para preparar el
polipéptido del AIF o fragmentos del mismo. Varias técnicas de
replegamiento y oxidación de las cadenas laterales de cisteína para
formar un enlace disulfuro son también bien conocidas en la
materia.
Según la invención, el polipéptido del AIF
producido de manera recombinante o por síntesis química y los
fragmentos u otros derivados o análogos del mismo, incluyendo las
proteínas de fusión, pueden utilizarse como inmunógeno para generar
anticuerpos que reconozcan el polipéptido del AIF. Dichos
anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab de una
sola cadena, híbridos, policlonales o monoclonales y un banco de
expresión de Fab.
Para los objetivos de esta exposición, son
importantes las siguientes definiciones. Una molécula es
"antigénica" cuando es capaz de interactuar de manera
específica con una molécula de reconocimiento del antígeno del
sistema inmunitario, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o un
receptor del antígeno de linfocito T. Un polipéptido antigénico
contiene por lo menos aproximadamente 5, y preferentemente por lo
menos aproximadamente 10 aminoácidos. Un fragmento antigénico de
una molécula puede ser esa parte que es inmunodominante para el
reconocimiento del receptor del anticuerpo o del linfocito T, o
puede ser un fragmento utilizado para generar un anticuerpo contra
la molécula conjugando el fragmento antigénico con una molécula
portadora para la inmunización. Una molécula que es antigénica no
necesita ser la propia inmunógena, es decir, capaz de provocar una
respuesta inmunitaria sin un portador.
Un "anticuerpo" es cualquier
inmunoglobulina, incluyendo los anticuerpos y los fragmentos de los
mismos, que se unen a un epítopo específico. El término comprende
los anticuerpos policlonales, monoclonales e híbridos, mencionados
últimamente descritos con más detalle en las patentes US nº
4.816.397 y nº 4.816.567, así como los fragmentos de unión al
antígeno de anticuerpos, incluyendo Fab, F(ab')_{2} y
F(v) (incluyendo los anticuerpos con una sola cadena). Por
consiguiente, la frase "molécula de anticuerpo" en sus varias
formas gramaticales tal como se utiliza en la presente memoria
contempla tanto una molécula de inmunoglobulina intacta como un
fragmento inmunológicamente activo de una molécula de
inmunoglobulina que contiene la secuencia de combinación del
anticuerpo. Una "secuencia de combinación del anticuerpo" es la
parte de la estructura de una molécula de anticuerpo compuesta por
zonas variables e hipervariables con cadena pesada y ligera que se
unen específicamente al antígeno.
A título de ejemplo las moléculas de anticuerpo
son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de
inmunoglobulina sustancialmente intactas y las partes de una
molécula de inmunoglobulina que contienen el paratopo, incluyendo
las fracciones conocidas en la materia como Fab, Fab',
F(ab')_{2} y F(v) cuyas fracciones son preferidas
para su utilización en los métodos terapéuticos descritos en la
presente memoria.
Las fracciones Fab y F(ab')_{2} de
moléculas de anticuerpo se preparan mediante la reacción
proteolítica de la papaína y pepsina, respectivamente, en las
moléculas de anticuerpo intactas en gran parte por métodos que son
bien conocidos. Véase por ejemplo, la patente US nº 4.342.566 de
Theofilopoulos et al. Son asimismo bien conocidos los
fragmentos de molécula de anticuerpo Fab' y se producen a partir de
los fragmentos F(ab')_{2} seguido de reducción de los
enlaces disulfuro que unen las dos partes de la cadena pesada como
en el mercaptoetanol, y seguido de alquilación de mercaptano de la
proteína resultante con un reactivo tal como yodoacetamida. En la
presente memoria se prefiere un anticuerpo que contiene moléculas
intactas del anticuerpo.
La frase "anticuerpo monoclonal" en sus
varias formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que presenta
únicamente una especie de secuencia de combinación del anticuerpo
capaz de inmunorreaccionar con un antígeno determinado. Un
anticuerpo monoclonal por lo tanto presenta típicamente una sola
afinidad de unión para cualquier antígeno con el que
inmunorreacciona. Un anticuerpo monoclonal puede contener por
consiguiente una molécula de anticuerpo con muchas secuencias de
combinación del anticuerpo, cada una inmunoespecífica para un
antígeno diferente; por ejemplo, un anticuerpo monoclonal
bioespecífico (híbrido).
El término "adyuvante" se refiere a un
compuesto o a una mezcla que potencia la respuesta inmunitaria a un
antígeno. Un adyuvante puede servir como depósito de tejido que
libera lentamente el antígeno y también como activador del sistema
linfoide que potencia la respuesta inmunitaria de manera no
específica [Hood et al., en Immunology, pág. 384,
segunda ed., Benjamín/Cummings, Menlo Park, California (1984)]. Con
frecuencia, una prueba de provocación primaria con un antígeno solo,
en ausencia de un adyuvante, no podrá provocar una respuesta
inmunitaria humoral o celular. Los adyuvantes comprenden, pero no se
limitan a, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de
Freund, saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio,
sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles
plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o
hidrocarburos, hemocianinas de la lapa californiana, dinitrofenol y
adyuvantes humanos potencialmente útiles tal como BCG (bacilo
Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum. Preferentemente, el adyuvante es farmacéuticamente
aceptable.
Pueden utilizarse varios procedimientos
conocidos en la materia para la producción de anticuerpos
policlonales contra el polipéptido del AIF, o el fragmento, derivado
o análogo del mismo. Para la producción de anticuerpos, pueden
inmunizarse varios animales huésped mediante la inyección con el
polipéptido del AIF, o un derivado (por ejemplo, fragmento o
proteína de fusión) del mismo, incluyendo pero sin limitarse a
conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. En una forma de
realización, el polipéptido del AIF o un fragmento del mismo puede
conjugarse con un portador inmunógeno, por ejemplo, albúmina de
suero bovino (BSA) o hemocianina de la lapa californiana (KLH).
Pueden utilizarse varios adyuvantes para aumentar la respuesta
inmunológica, dependiendo de la especie del huésped, incluyendo
pero sin limitarse a adyuvante de Freund (completo e incompleto),
geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias
tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos,
polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de la lapa
californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente
útiles tal como BCG (bacilo Calmette-Guerin)
y Corynebacterium parvum.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales
dirigidos contra el polipéptido del AIF o el fragmento, análogo o
derivado del mismo, puede utilizarse cualquier técnica que
proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas
celulares continuas en cultivo. Éstas comprenden pero no se limitan
a la técnica del hibridoma originalmente desarrollada por Kohler
et al. [Nature, 256:495-497 (1975)],
así como la técnica del trioma, la técnica de hibridoma de linfocito
B humano [Kozbor et al., Immunology Today, 4:72
(1983)] y la técnica de EBV-hibridoma para producir
anticuerpos monoclonales humanos [Cole et al., en Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, págs. 77-96, Alan
R. Liss, Inc., (1985)]. Pueden crearse líneas celulares inmortales
que producen anticuerpos mediante técnicas distintas de la fusión,
tales como la transformación directa de linfocitos B con ADN
oncogénico, o la transfección con virus de
Epstein-Barr, por ejemplo, M. Schreier et al.,
Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal
Antibodies And T-cell Hybridomas (1981); Kennett
et al., Monoclonal Antibodies (1980); también en las patentes
US nº 4.341.761; nº 4.399.121; nº 4.427.783; nº 4.444.887; nº
4.451.570; nº 4.466.917; nº 4.472.500; nº 4.491.632 y nº
4.493.890.
En una forma de realización adicional de la
invención, pueden producirse anticuerpos monoclonales en animales
exentos de gérmenes que utilizan tecnología reciente (solicitud
internacional nº PCT/US 90/02545). Según la invención, pueden
utilizarse anticuerpos humanos y pueden obtenerse utilizando
hibridomas humanos [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
80:2026-2030 (1983)] o transformando los
linfocitos B humanos con virus EBV in vitro [Cole et
al., 1985, supra]. De hecho, según la invención, pueden
utilizarse las técnicas desarrolladas para la producción de
"anticuerpos híbridos" [Morrison et al., J. Bacteriol.,
159-870 (1984); Neuberger et al., Nature,
312:604-608 (1984); Takeda et al.,
Nature, 314:452-454 (1985)] mediante
corte y empalme de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón
específica para un polipéptido del AIF junto con los genes de una
molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada;
dichos anticuerpos están comprendidos dentro el alcance de la
presente invención. Dichos anticuerpos híbridos humanos o
humanizados son preferidos para su utilización en la terapia de
enfermedades o trastornos humanos (descritos a continuación), ya que
los anticuerpos humanos o humanizados es mucho menos probable que
los anticuerpos xenógenos produzcan una respuesta inmunitaria, en
particular una respuesta alérgica, ellos mismos.
Según la invención, las técnicas descritas para
la producción de anticuerpos de una sola cadena (patente US nº
4.946.778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena
única específicos para el polipéptido del AIF. Una forma de
realización adicional de la invención utiliza las técnicas descritas
para la construcción de bancos de expresión de Fab [Huse et al.,
Science, 246:1275-1281 (1989)] que
permitan la identificación rápida y fácil de fragmentos monoclonales
de Fab con la especificidad deseada para un polipéptido del AIF o
sus derivados o análogos.
Pueden generarse por técnicas conocidas
fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de una molécula
de anticuerpo. Por ejemplo, dichos fragmentos comprenden, pero no se
limitan a: el fragmento F(ab')_{2} que puede producirse por
digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos
Fab' que pueden ser generados por reducción de los puentes disulfuro
del fragmento F(ab')_{2} y los fragmentos Fab que pueden
generarse tratando la molécula de anticuerpo con papaína y agente
reductor.
En la producción de anticuerpos, puede
realizarse la identificación del anticuerpo deseado por técnicas
conocidas en la materia, por ejemplo, radioinmunoanálisis, ELISA
(ensayo inmunosorbente con enzima ligada), inmunoanálisis
"sándwich", análisis inmunorradiométricos, reacciones de
precipitina con difusión en gel, análisis por inmunodifusión,
inmunoanálisis in situ (utilizando oro coloidal, enzimas o
marcadores radioisotópicos, por ejemplo), transferencias Western,
reacciones de precipitación, análisis por aglutinación (por ejemplo,
análisis por aglutinación en gel, análisis por hemoaglutinación),
análisis por fijación del complemento, análisis de
inmunofluorescencia, análisis con proteína A y análisis por
inmunoelectroforesis, etc. En una forma de realización, el enlace al
anticuerpo se detecta mediante la identificación de un marcador en
el anticuerpo primario. En otra forma de realización, el anticuerpo
primario se detecta identificando el enlace de un anticuerpo
secundario o de un reactivo al anticuerpo primario. En otra forma de
realización, el anticuerpo secundario está marcado. Se conocen
muchos medios en la materia para detectar el enlace en un
inmunoanálisis y están comprendidos en el alcance de la presente
invención. Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconozcan
a un epítopo específico de un polipéptido del AIF, se pueden
analizar los hibridomas generados para un producto que se une a un
fragmento del polipéptido del AIF que contiene dicho epítopo. Para
la selección de un anticuerpo específico contra un polipéptido del
AIF de una especie determinada de animal, se puede seleccionar
basándose en el enlace positivo con el polipéptido del AIF expresado
por las células de la especie de animal o aislado de las mismas.
Con respecto a la localización y actividad del
polipéptido del AIF pueden utilizarse los siguientes anticuerpos en
los métodos conocidos en la materia, por ejemplo, para la
transferencia Western, detección por la imagen del polipéptido del
AIF in situ, midiendo las concentraciones de éste en muestras
fisiológicas apropiadas.
En una forma de realización específica, pueden
generarse los anticuerpos que agonizan o antagonizan la actividad
del polipéptido del AIF. Dichos anticuerpos pueden analizarse
utilizando los análisis descritos a continuación para la
identificación de los ligandos.
En una forma de realización específica, los
anticuerpos se desarrollan inmunizando conejos con péptidos
sintéticos previstos por la secuencia proteica o con proteínas
recombinantes construidas utilizando vectores de expresión
bacteriana. La selección de péptidos sintéticos se realiza tras un
análisis minucioso de la estructura proteínica prevista, tal como se
describió anteriormente. En particular, se seleccionan secuencias
peptídicas entre las secuencias de escisión supuestas. Los péptidos
sintéticos se conjugan con un portador tal como la hemocianina de
KLH o BSA utilizando carbodiimida y se utilizan en adyuvantes de
Freund para inmunizar conejos. Con el fin de preparar la proteína
recombinante, puede utilizarse el vector pGEX para expresar el
polipéptido [Smith et al., 1988, supra].
Alternativamente, se puede utilizar solamente dominios hidrófilos
para generar la proteína de fusión. La proteína expresada se
preparará en cantidad y se utilizará para inmunizar conejos en
adyuvante de Freund.
En otra forma de realización específica, se
utiliza polipéptido del AIF recombinante para inmunizar pollos y los
anticuerpos del anti-AIF de pollo se recuperan de la
yema del huevo, por ejemplo, por purificación por afinidad en una
columna con AIF. Preferentemente, los pollos utilizados en la
inmunización se mantienen en condiciones exentas de patógenos
específicos (SPF).
Todavía en otra forma de realización, el
polipéptido del AIF recombinante se utiliza para inmunizar conejos,
y los anticuerpos policlonales se inmunopurifican antes de otra
utilización. Los anticuerpos purificados son particularmente útiles
para análisis semicuantitativos, particularmente para detectar la
presencia del polipéptido del AIF circulante en suero o plasma.
En los anticuerpos monoclonales producidos
contra polipéptidos del AIF pueden identificarse varias propiedades;
es decir, isótopo, epítopo, afinidad, etc. Son de particular interés
los anticuerpos monoclonales que neutralizan la actividad de los
polipéptidos del AIF. Dichos anticuerpos monoclonales pueden ser
fácilmente identificados en el análisis de actividad del AIF. Los
anticuerpos de alta afinidad son también útiles cuando es posible la
purificación por inmunoafinidad del modulador natural o
recombinante.
Preferentemente, el anticuerpo antimodulador
utilizado en los métodos de diagnóstico y terapéuticos de la
presente invención es un anticuerpo policlonal purificado por
afinidad. Más preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal (mAb). Además, es preferible que las moléculas del
anticuerpo antimodulador utilizadas en la presente memoria estén en
forma de fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} o F(v) de
moléculas de anticuerpo completas.
La presente invención se refiere además a una
variedad de aplicaciones para el diagnóstico, incluyendo los métodos
para detectar la presencia de las condiciones y/o estímulos que
impactan en las anomalías que implican la hipoestimulación o
hiperestimulación de la apoptosis, en relación con su capacidad para
producir las actividades que están mediadas por los presentes AIF.
Como se mencionó al principio, el polipéptido del AIF puede
utilizarse para producir anticuerpos contra ellos mismos mediante
una variedad de técnicas conocidas, y dichos anticuerpos pueden
aislarse a continuación y utilizarse en análisis para la presencia
de determinada actividad de transcripción en células diana
sospechosas. Alternativamente, los ácidos nucleicos de la invención
pueden emplearse en diagnóstico.
Como se sugirió al principio, un método de
diagnóstico útil en la presente invención comprende el examen de una
muestra o del medio celular por medio de un análisis incluyendo una
cantidad eficaz de un antagonista contra una proteína moduladora,
tal como un anticuerpo antimodulador, preferentemente un anticuerpo
policlonal purificado por afinidad, y más preferentemente un mAb.
Además, es preferible que las moléculas de anticuerpo antimodulador
utilizadas en la presente memoria estén en forma de fragmentos Fab,
Fab', F(ab')_{2} o F(v) o moléculas de anticuerpo
completas. Los pacientes capaces de beneficiarse de este método
comprenden los que padecen varias enfermedades neoplásicas,
enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, pero sin limitarse a
la neurodegeneración debida al ictus, enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica) u otras
enfermedades donde la estimulación anómala de la apoptosis (ya sea
hipoestimulación o hiperestimulación) es una característica o factor
[Science, 281(5381); 28 agosto 1998]. Los métodos para aislar
el modulador y producir anticuerpos antimoduladores y para
determinar y optimizar la capacidad de los anticuerpos
antimoduladores para ayudar en el examen de las células diana son
bien conocidos en la materia.
Asimismo, los anticuerpos que incluyen tanto los
anticuerpos policlonales como los monoclonales y los fármacos que
modulan la producción o actividad de los AIF y otros factores de
reconocimiento y/o sus subunidades pueden poseer determinadas
aplicaciones de diagnóstico y pueden, por ejemplo, ser utilizados
para detectar y/o medir enfermedades donde las anomalías en la
estimulación o falta de estimulación de la apoptosis es o puede ser
probable que se desarrolle. Por ejemplo, los polipéptidos del AIF o
sus fragmentos activos pueden utilizarse para producir anticuerpos
tanto policlonales como monoclonales contra ellos mismos en una
variedad de medios celulares, mediante técnicas conocidas, tales
como la técnica del hibridoma que utiliza, por ejemplo, linfocitos
de bazo de ratón y células de mieloma fusionadas. Estas técnicas se
describen con detalle a continuación. Asimismo, las moléculas
pequeñas que simulan o antagonizan la o las actividades de los
factores de reconocimiento del receptor de la invención pueden ser
descubiertas o sintetizadas y pueden ser utilizadas en los
protocolos de diagnóstico y/o terapéuticos.
La presencia de los AIF en las células puede
determinarse mediante procedimientos inmunológicos habituales
aplicables a dichas determinaciones. Se conocen numerosos
procedimientos útiles. Tres de dichos procedimientos que son
especialmente útiles utilizan ya sea el factor de reconocimiento del
receptor marcado con un marcador detectable, anticuerpo Ab_{1}
marcado con un marcador detectable o anticuerpo Ab_{2} marcado con
un marcador detectable. Los procedimientos pueden resumirse mediante
las siguientes ecuaciones en las que el asterisco indica que la
partícula está marcada y "AIF" se refiere al factor estimulador
de la apoptosis:
A. \
AIF\text{*} + Ab_{1} = AIF\text{*}Ab_{1}
\hskip1,5cm
B. \ AIF +
Ab\text{*}_{1} = AIFAb_{1}\text{*}
\hskip1,5cm
C. \ AIF +
Ab_{1} + Ab_{2}\text{*} =
Ab_{1}AIFAb_{2}\text{*}
Todos los procedimientos y su aplicación son
conocidos por los expertos en la materia y por consiguiente pueden
utilizarse dentro del alcance de la presente invención. El
procedimiento "competitivo", Procedimiento A, está descrito en
las patentes US nº 3.654.090 y nº 3.850.752. El procedimiento B es
representativo de técnicas de análisis competitivas muy conocidas.
El procedimiento C, procedimiento "sándwich", está descrito en
las patentes US nº RE 31.006 y nº 4.016.043. Todavía otros
procedimientos son conocidos tales como el procedimiento de "doble
anticuerpo" o "DASP".
En cada caso, los AIF forman complejos con uno o
más anticuerpo(s) o compañeros de enlace y un miembro del
complejo está marcado con un marcador detectable. El hecho de que se
haya formado un complejo y, la cantidad del mismo, puede
determinarse por métodos aplicables a la detección de
marcadores.
De lo anterior se observará que una propiedad
característica de Ab_{2} es que reaccionará con Ab_{1}. Esto es
debido a que Ab_{1}, producido en una especie de mamífero, se ha
utilizado en otras especies como antígeno para producir el
anticuerpo, Ab_{2.} Por ejemplo, Ab_{2} puede ser producido en
cabras utilizando anticuerpos de conejo como antígenos. Ab_{2} por
lo tanto sería el anticuerpo anticonejo producido en cabras. Para
los fines de esta descripción y las reivindicaciones, Ab_{1} se
denominará anticuerpo primario o anti-AIF y Ab_{2}
se denominará anticuerpo secundario o
anti-Ab_{1}.
Los marcadores más ampliamente empleados para
estos estudios son los elementos radioactivos, enzimas, productos
químicos que producen fluorescencia cuando se exponen a la luz
ultravioleta y otros.
Se conocen numerosos materiales fluorescentes
que pueden utilizarse como marcadores. Éstos comprenden, por
ejemplo, fluoresceína, rodamina y auramina. Un determinado material
de detección es el anticuerpo anti-conejo preparado
en cabras y conjugado con fluoresceína mediante un
isotiocianato.
Los AIF o sus compañeros de enlace pueden estar
marcados con un elemento radioactivo o con una enzima. El elemento
radioactivo puede ser detectado por alguno de los procedimientos de
recuento disponibles actualmente. El isótopo preferido puede
seleccionarse de entre ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S,
^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y,
^{125}I, ^{131}I y ^{186}Re.
Los marcadores enzimáticos son asimismo útiles,
y pueden detectarse por cualquiera de las técnicas colorimétricas,
espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o
gasométricas utilizadas actualmente. La enzima conjugada con la
partícula seleccionada mediante la reacción con las moléculas que
forman puente tales como carbodiimidas, diisocianatos,
glutaraldehído y similares. Muchas enzimas que pueden utilizarse en
estos procedimientos son conocidas y pueden utilizarse. Las
preferidas son peroxidasa, \beta-glucuronidasa,
\beta-D-glucosidasa,
\beta-D-galactosidasa, ureasa,
glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las patentes US
nº 3.654.090; nº 3.850.752 y nº 4.016.043 se citan a título de
ejemplo por su descripción del material y de los métodos de marcado
alternativos.
En una forma de realización adicional de la
presente invención, pueden prepararse kits de ensayo adecuados para
su utilización por un médico especialista para determinar la
presencia o ausencia de actividad de transcripción predeterminada o
de la capacidad para la actividad de transcripción predeterminada en
células diana sospechosas. Según las técnicas de experimentación
expuestas anteriormente, una clase de dichos kits contendrá por lo
menos el AIF marcado o su compañero de enlace, por ejemplo un
anticuerpo específico para éste, y direcciones, desde luego,
dependiendo del método seleccionado, por ejemplo,
"competitivo", "sándwich", "DASP" y similares. Los
kits pueden contener también reactivos periféricos tales como
tampones, estabilizantes, etc.
Por consiguiente, puede prepararse un kit de
ensayo para la demostración de la presencia o capacidad de las
células para la actividad predeterminada de la transcripción, que
comprende:
- (a)
- una cantidad predeterminada de por lo menos un componente reactivo marcado inmunoquímicamente obtenido mediante el acoplamiento directo e indirecto del presente AIF o un compañero de enlace específico a éste, para un marcador detectable;
- (b)
- otros reactivos; y
- (c)
- direcciones para la utilización de dicho kit.
Más específicamente, el kit de ensayo de
diagnóstico puede comprender:
- (a)
- una cantidad conocida del AIF descrito anteriormente (o de un compañero de enlace) generalmente ligado a una fase sólida para formar un inmunosorbente, o como alternativa, ligado a una etiqueta adecuada, o varios de dichos productos finales, etc. (o sus compañeros de enlace) uno de cada;
- (b)
- si es necesario, otros reactivos; y
- (c)
- direcciones para la utilización de dicho kit de ensayo.
En otra variación, el kit de ensayo puede
prepararse y utilizarse para los fines estipulados anteriormente, el
cual opera según un protocolo predeterminado (por ejemplo
"competitivo", "sándwich", "anticuerpo doble", etc.),
y comprende:
- (a)
- un componente marcado que ha sido obtenido por acoplamiento del AIF a un marcador detectable;
- (b)
- uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales de los cuales por lo menos un reactivo es un ligando o un ligando inmovilizado, el cual se selecciona de entre el grupo constituido por:
- (i)
- un ligando capaz de unirse con el componente (a) marcado;
- (ii)
- un ligando capaz de unirse con un compañero de enlace del componente (a) marcado;
- (iii)
- un ligando capaz de unirse con por lo menos uno de los componentes que han de determinarse; y
- (iv)
- un ligando capaz de unirse con al menos uno de los compañeros de enlace de por lo menos uno de los componentes que han de determinarse; y
- (c)
- direcciones para el funcionamiento de un protocolo destinado a la detección y/o determinación de uno o más componentes de una reacción inmunoquímica entre el AIF y el compañero de enlace específico a éste.
Los polipéptidos, ácidos nucleicos y anticuerpos
de la invención presentan un potencial terapéutico significativo.
Opcionalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho agente
se administra en un vehículo, diluyente o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Para los fines de esta descripción, son
importantes las siguientes definiciones. La expresión
"farmacéuticamente aceptable" se refiere a las entidades
moleculares y a las composiciones que son fisiológicamente
tolerables y no producen normalmente una reacción alérgica o
igualmente desfavorable, tal como trastorno gástrico, mareos y
similares, cuando se administran a un ser humano y que
preferentemente no interfieren en la administración de la proteína
administrada. Preferentemente, tal como se utiliza en la presente
memoria, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa
aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o
listada en la US Pharmacopeia u otra farmacopea generalmente
reconocida para su utilización en animales, y más particularmente en
seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente,
adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el
compuesto. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos
esterilizados, tal como agua y aceites, incluyendo los de origen
petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de
cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y
similares. El agua o las soluciones salinas y la dextrosa acuosa y
las soluciones de glicerol se emplean preferentemente como
portadores, particularmente para soluciones inyectables. Los
portadores farmacéuticos adecuados están descritos en Martin,
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing
Co., Easton, PA, (1990).
La expresión "cantidad terapéuticamente
eficaz" se utiliza en la presente memoria para significar una
cantidad suficiente para reducir por lo menos aproximadamente el
15%, preferentemente por lo menos el 50%, más preferentemente por lo
menos el 90% y lo más preferentemente impedir, una deficiencia
clínicamente significativa de la actividad, función y respuesta del
huésped. Alternativamente, una cantidad terapéuticamente eficaz es
suficiente para producir una mejora en una enfermedad clínicamente
significativa en el huésped.
La administración del polipéptido del AIF
recombinante (o fragmentos, análogos u homólogos de AIF descritos
anteriormente, que incorporan actividad de tipo AIF) a las células
produce la estimulación de la apoptosis. Dicha administración podría
ayudar en el tratamiento y control de numerosas enfermedades
neoplásicas, por ejemplo, pero sin limitarse al linfoma,
enfermedades neoplásicas del sistema nervioso central, sarcoma,
melanoma, mesotelioma o cualquier enfermedad neoplásica de los demás
órganos del cuerpo (por ejemplo, pero sin limitarse la próstata,
pulmones, músculos, hígado, estómago, vejiga, útero). El polipéptido
del AIF puede prepararse utilizando vectores de expresión normales
de bacterias y/o mamíferos, sintéticamente, o purificado a partir
del plasma o del suero, todo como se indica con detalle al principio
en la presente memoria. Alternativamente, el aumento de expresión
del polipéptido del AIF natural puede ser producido por técnicas de
recombinación homóloga, como se describió anteriormente.
La reducción de la actividad del polipéptido del
AIF (por desarrollo de antagonistas, inhibidores, utilización de
anticuerpos neutralizantes o moléculas de cadena complementaria,
producidas todas como se describe en la presente memoria) produciría
una disminución de la apoptosis. Dicha actividad puede ser deseable
para el tratamiento de varias enfermedades neurodegenerativas que se
han asociado a la estimulación de la apoptosis (a la
neurodegeneración debida al ictus, enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica). Por lo
tanto, la modulación de la actividad del AIF puede servir para
controlar o tratar enfermedades neoplásicas (aumentando su
actividad) o para tratar enfermedades neurodegenerativas
(disminuyendo su actividad).
En el análisis más simple, el producto génico
del AIF, y, consiguientemente, las moléculas homólogas, parecen
formar parte de la serie de reacciones apoptósicas de señalización,
en la que la apoptosis está estimulada por el AIF. El polipéptido
del AIF, o un fragmento del mismo operativamente activo, o un
antagonista del mismo, puede administrarse por vía oral o
parenteral, preferentemente por vía parenteral. Por ejemplo, el
polipéptido puede administrarse utilizando una infusión intravenosa,
una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas u
otros modos de administración. En una forma de realización, puede
utilizarse una bomba [Langer et al., eds., Medical Applications
of Controlled Release, CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974);
Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987);
Buchwald et al., Surgery, 88:507 (1980); Saudek et
al., N. Engl. J. Med., 321:574 (1989)]. En otra forma de
realización, pueden utilizarse materials poliméricos [Langer, 1974,
supra; Sefton, 1987, supra; Smolen et al.,
eds., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and
Performance, Wiley, Nueva York (1984); Ranger et al., J.
Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); Levy
et al., Science, 228:190 (1985); During et al.,
Ann. Neurol., 25:351 (1989); Howard et al., J.
Neurosurg., 71:105 (1989)]. En otra forma de realización
todavía, puede colocarse un sistema de liberación controlada en la
proximidad de la diana terapéutica, es decir, el cerebro,
necesitando de este modo únicamente una fracción de la dosis
generalizada [por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of
Controlled Release, vol. 2, págs. 115-138
(1984)]. Otros sistemas de liberación controlada son expuestos en el
estudio por Langer, Science,
249:1527-1533 (1990). En otra forma de
realización, el compuesto terapéutico puede administrarse en una
vesícula, en particular un liposoma (Langer, 1990 supra);
Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious
Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler
(eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989);
López-Berestein, ibid., págs.
317-327).
En un aspecto adicional, las células
recombinantes que han sido transformadas con el gen del AIF y que
expresan grandes concentraciones de polipéptido pueden ser
trasplantadas en un paciente que necesite del polipéptido del AIF.
Preferentemente las células autólogas transformadas con el gen del
AIF se trasplantan para impedir el rechace; alternativamente, está
disponible la tecnología para proteger las células no autólogas que
producen factores solubles dentro de una matriz polimérica que
impide el reconocimiento y el rechace inmunitario.
El polipéptido del AIF puede administrarse por
las vías de administración intravenosa, intraarterial,
intraperitoneal, intramuscular o subcutánea. Alternativamente, el
polipéptido del AIF, formulado apropiadamente, puede administrarse
mediante administración nasal u oral. Un aporte constante de AIF
puede acumularse proporcionando una dosis terapéuticamente eficaz
(es decir, una dosis eficaz que estimule la apoptosis en el área
objetivo) a intervalos necesarios, por ejemplo, a diario, cada 12
horas, etc. Estos parámetros dependerán de la gravedad de la
enfermedad que se está tratando, de otras actuaciones, del peso, la
edad y sexo del paciente y de otros criterios, que pueden
determinarse fácilmente según las buenas prácticas médicas
habituales por los expertos en la materia.
Todavía en otro aspecto de la presente invención
se proporcionan composiciones y composiciones farmacéuticas de las
anteriores. Dichas composiciones farmacéuticas pueden ser destinadas
a la administración por inyectables o por vía oral, pulmonar, nasal
u otras formas de administración. En general, las composiciones
farmacéuticas están comprendidas por la invención las cuales
comprenden cantidades eficaces de proteína (AIF) o de productos
derivados (por ejemplo, fragmentos, homólogos, variantes de AIF) de
la invención junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes,
emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente
aceptables. Dichas composiciones comprenden diluyentes de varios
contenidos en tampón (por ejemplo, Tris-HCl,
acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como
detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80,
polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico,
metabisulfito sódico), conservantes (por ejemplo, Thimersol, alcohol
bencílico) y sustancias para esponjamiento (por ejemplo, lactosa,
manitol); incorporación del material en preparaciones en partículas
de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido
poliglicólico, etc. o en liposomas. Puede utilizarse también el
ácido hialurónico. Dichas composiciones pueden influir en el estado
físico, estabilidad, ritmo de liberación in vivo y ritmo de
eliminación in vivo de las presentes proteínas y derivados,
por ejemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª
ed. [1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042] páginas
1435-1712 que están incorporadas a la presente
memoria como referencia. Las composiciones pueden prepararse en
forma líquida o pueden estar en polvo seco, tal como en forma
liofilizada.
Para su utilización en la presente memoria se
contemplan las formas de dosificación sólidas orales, que están
descritas generalmente en Martin, Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18ª ed. [1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042]
en el Capítulo 89, que se incorpora en la presente memoria como
referencia. Las formas de dosificación sólidas comprenden
comprimidos, cápsulas, píldoras, grageas o pastillas, sellos o
gránulos. Asimismo puede utilizarse la encapsulación liposómica o
proteinoide para formular las presentes formulaciones (como, por
ejemplo, microesferas proteinoides publicadas en la patente US nº
4.925.673). Puede utilizarse encapsulación liposómica y los
liposomas pueden modificarse con varios polímeros (por ejemplo,
patente US nº 5.013.556). Una descripción de las posibles formas de
dosificación sólida para la terapia es proporcionada por Marshall,
en Modern Pharmaceutics, Capítulo 10, Banker y Rhodes, ed.,
(1979), incorporada a la presente memoria como referencia. En
general, la formulación incluirá la proteína (o la proteína
modificada químicamente) e ingredientes inertes que permiten la
protección contra el medio del estómago y la liberación del material
biológicamente activo en el intestino.
Se contemplan también específicamente las formas
de dosificación oral de las proteínas modificadas anteriormente. La
proteína puede estar químicamente modificada de modo que sea eficaz
la administración oral del derivado. Generalmente, la modificación
química contemplada es el acoplamiento de por lo menos una fracción
a la propia molécula de proteína (o péptido), donde dicha fracción
permite (a) la inhibición de la proteólisis; y (b) la absorción en
el torrente sanguíneo del estómago o intestino. También se desea el
aumento de la estabilidad general de la proteína y el aumento del
tiempo de circulación en el tiempo. Ejemplos de dichas fracciones
comprenden: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y
propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol
polivinílico, polivinilpirrolidona y poliprolina [Abuchowski et
al., 1981, supra; Newmark et al., J. Appl.
Biochem.,4:185-189 (1982)]. Otros
polímeros que podrían utilizarse son el
poli-1,3-dioxolano y el
poli-1,3,6-tioxocano. Para la
utilización farmacéutica se prefiere, como se indicó anteriormente
las fracciones de polietilenglicol.
Para la proteína (o derivado) la posición de
liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el duodeno,
el yeyuno o el íleon) o el intestino grueso. Un experto en la
materia tiene formulaciones disponibles que no se disolverán en el
estómago, pero liberarán el material en el duodeno o en cualquier
parte del intestino. Preferentemente, la liberación impedirá los
efectos perjudiciales del medio estomacal, ya sea mediante la
protección de la proteína (o derivados) o mediante la liberación del
material biológicamente activo fuera del medio estomacal, tal como
en el intestino.
Para asegurar la resistencia gástrica completa,
es esencial un revestimiento impermeable a por lo menos pH 5,0.
Ejemplos de los ingredientes inertes más frecuentes que se utilizan
como revestimientos entéricos son el trimelitato acetato de celulosa
(CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50,
HPMCP 55, acetato ftalato de polivinilo (PVAP), Eudragit L30D,
Aquateric, acetato ftalato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S
y goma laca. Estos recubrimientos pueden utilizarse como películas
mixtas.
Un revestimiento o mezcla de revestimientos
puede también utilizarse en comprimidos, que no están destinados a
la protección contra el estómago. Éste puede incluir revestimientos
de azúcar o revestimientos que hacen que la tableta sea más fácil de
ingerir. Las cápsulas pueden estar constituidas por una carcasa dura
(tal como gelatina) para la administración del producto terapéutico
seco, es decir, en polvo, para formas líquidas, puede utilizarse una
carcasa blanda de gelatina. El material de la carcasa de los sellos
podría ser almidón espeso u otro papel comestible. Para las
píldoras, pastillas, comprimidos moldeados o triturados de
comprimidos, pueden utilizarse técnicas de amasado húmedas.
El producto terapéutico puede estar incluido en
la formulación como multipartículas finas en forma de gránulos o
bolitas de tamaño de partícula aproximadamente 1 mm. La formulación
del material para la administración de cápsula puede ser también en
forma de polvo, tampones ligeramente comprimidos o incluso como
comprimidos. El producto terapéutico podría ser preparado por
compresión.
Todos los colorantes y agentes potenciadores de
sabor pueden estar incluidos. Por ejemplo, la proteína (o derivados)
puede formularse (tal como por encapsulación del liposoma o
microesfera) y a continuación estar contenida después en un producto
comestible, puede diluirse o aumentar el volumen del producto
terapéutico con un material inerte. Estos diluyentes podrían incluir
carbohidratos, especialmente manitol,
\alpha-lactosa, lactosa anhidra, celulosa,
sacarosa, dextranos modificados y almidón. Determinadas sales
inorgánicas pueden utilizarse también como cargas incluyendo el
trifosfato cálcico, carbonato de magnesio y cloruro sódico. Algunos
diluyentes disponibles en el mercado son Fast-Flo,
Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.
\newpage
Pueden estar incluidos en la formulación
disgregadores del producto terapéutico en una forma galénica sólida.
Los materiales utilizados como disgregadores comprenden pero no se
limitan a almidón, incluyendo el disgregador comercial basado en
almidón, Explotab. Pueden también utilizarse almidón glicolato
sódico, carboximetilcelulosa sódica, ultramilopectina, alginato
sódico, gelatina, cáscara de naranja, carboximetilcelulosa ácida,
esponja natural y bentonita. Otra forma de disgregadores son las
resinas insolubles de intercambio catiónico. Pueden utilizarse
gomas en polvo como disgregadores y como aglutinantes y éstas pueden
incluir las gomas en polvo tal como agar-agar,
Karaya o tragacanto. El ácido algínico y su sal sódica sirven
asimismo como disgregadores.
Pueden utilizarse aglomerantes para mantener el
agente terapéutico unido para formar un comprimido duro o incluyen
materiales procedentes de productos naturales tales como acacia,
tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC),
etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC). La
polivinilpirrolidona (PVP) y la hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC)
podrían ser utilizadas ambas en soluciones alcohólicas para granular
el producto terapéutico.
Puede incluirse un agente antifricción en la
formulación del producto terapéutico para impedir la adherencia
durante el proceso de formulación. Pueden utilizarse lubricantes
como una capa entre el producto terapéutico y la pared del troquel,
y éstos pueden incluir pero no se limitan a: ácido esteárico
incluyendo sus sales de magnesio y de calcio, politetrafluoroetileno
(PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras. Pueden
utilizarse también lubricantes solubles tales como el lauril sulfato
sódico, lauril sulfato de magnesio, polietilenglicol de varios pesos
moleculares y Carbowax 4000 y 6000.
Pueden añadirse fluidificantes que pueden
mejorar las propiedades de flujo del fármaco durante la formulación
y ayudar a la reordenación durante la compresión. Los fluidificantes
pueden incluir almidón, talco, sílice pirógena y silicoaluminato
hidratado.
Para ayudar a la disolución del producto
terapéutico en el medio acuoso, puede añadirse un tensioactivo como
agente humectante. Los tensioactivos pueden comprender detergentes
aniónicos tales como laurilsulfato sódico, sulfosuccinato de
dioctilo sódico y sulfonato de dioctilo sódico. Pueden utilizarse
detergentes catiónicos y podrían incluir cloruro de benzalconio o
cloruro de bencetomio. La lista de detergentes potenciales no
iónicos que podrían incluirse en la formulaciones como tensioactivos
son lauromacrogol 400, estearato de polioxil 40, aceite de ricino
hidrogenado con polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de
glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso con
sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos tensioactivos
pueden estar presentes en la formulación de la proteína o derivado
ya sean solos o en mezcla en diferentes proporciones.
Los aditivos que aumentan potencialmente la
absorción de la proteína (o derivado) son por ejemplo los ácidos
grasos: ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.
Puede ser deseable una formulación de liberación
controlada. La composición podría incorporarse en una matriz inerte
que permita la liberación ya sea por mecanismos de difusión o
percolación, es decir, gomas. Pueden incorporarse también en la
formulación matrices que se degeneran lentamente. Otra forma de
liberación controlada de este producto terapéutico es mediante un
método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), es decir,
el fármaco está ocluido en una membrana semipermeable que permite
que entre el agua o impulse el fármaco a través de una pequeña
abertura única debido a efectos osmóticos. Algunos recubrimientos
entéricos también presentan un efecto de liberación retardada.
Pueden utilizarse otros recubrimientos para la
formulación. Éstos comprenden una variedad de azúcares que podría
aplicarse en un pan de recubrimiento. El agente terapéutico podría
también administrarse en un comprimido recubierto de película; los
materiales utilizados en este caso se dividen en dos grupos. El
primero son los materiales no entéricos e incluyen metilcelulosa,
etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa,
hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa,
carboxi-metilcelulosa sódica, providona y los
polietilenglicoles. El segundo grupo consiste en materiales
entéricos que normalmente son ésteres del ácido ftálico.
Podría utilizarse una mezcla de materiales para
proporcionar el revestimiento óptimo de la película. El
revestimiento de la película puede realizarse en una capa de pan o
en un lecho fluidizado o por revestimiento por compresión.
Se contempla también en la presente memoria la
administración pulmonar de la presente proteína (o de derivados de
la misma). La proteína (o derivado) se administra a los pulmones de
un mamífero mientras inhala y atraviesa el revestimiento epitelial
del pulmón hasta el torrente sanguíneo. Otros informes sobre esto
comprenden Adjei et al., Pharmaceutical Research,
7(6):565-569 (1990); Adjei et al.,
International Journal of Pharmaceutics,
63:135-144 (1990) (acetato de leuprolida);
Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology;
13 (supl. 5):143-146 (1989)
(endotelina-1); Hubbard et al., Annals of
Internal Medicine, 3(3):206-212 (1989)
(\alpha-antitripsina); Smith et al., J. Clin.
Invest., 84:1145-1146 (1989)
(\alpha1-proteinasa); Oswein et al.,
"Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on
Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (marzo 1990)
(hormona de crecimiento humano recombinante); Debs et al., J.
Immunol., 140:3482-3488 (1988) y Platz
et al., patente US nº 5.284.656 (factor inductor de colonias
de granulocito). Para su utilización en la puesta en práctica de la
presente invención se contempla una amplia gama de dispositivos
mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos
terapéuticos, incluyendo pero sin limitarse a nebulizadores,
inhaladores de dosis medidas o inhaladores de polvo, todos los
cuales son conocidos por los expertos en la materia.
Algunos ejemplos específicos de dispositivos
disponibles en el mercado adecuados para la puesta en práctica de la
presente invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por
Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II,
fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el
inhalador de dosis medidas Ventolin, fabricado por Glaxo Inc.,
Research Triangle Park, Carolina del norte; y el inhalador de polvo
Spinhaler, preparado por Fisons Corp., Bedford, Massachussets.
Todos estos dispositivos requieren la
utilización de formulaciones adecuadas para la administración de la
proteína (o derivado). Típicamente, cada formulación es específica
para el tipo de dispositivo empleado y puede entrañar la utilización
de un material propelente apropiado, además de los diluyentes,
adyuvantes y/o portadores habituales útiles en terapia. Asimismo, se
contempla la utilización de liposomas, microcápsulas o microesferas,
complejos de inclusión u otros tipos de portadores. Puede prepararse
también proteína modificada químicamente en diferentes formulaciones
dependiendo del tipo de modificación química o del tipo de
dispositivo empleado.
Las formulaciones adecuadas para su utilización
con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, comprenden
típicamente proteína (o derivado) disuelto en agua a una
concentración de aproximadamente 0,1 a 25 mg de proteína
biológicamente activa por ml de solución. La formulación puede
también incluir un tampón y un azúcar sencillo (por ejemplo, para la
estabilización de proteínas y regulación de la presión osmótica). La
formulación del nebulizador puede contener también un tensioactivo,
para reducir o impedir la agregación estimulada por la superficie de
la proteína producida por atomización de la solución en la formación
del aerosol.
Las formulaciones para su utilización con un
dispositivo inhalador de dosis medidas comprenderán generalmente un
polvo dividido finamente que contiene la proteína (o derivado)
suspendido en un propelente con ayuda de un tensioactivo. El
propelente puede ser cualquier material convencional empleado para
este fin, tal como un clorofluorocarburo, un
hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo o un hidrocarburo,
incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano,
diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano
o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen
trioleato de sorbitán y lecitina de soja. El ácido oleico puede ser
útil también como tensioactivo.
Las formulaciones para la administración con un
dispositivo inhalador de polvo comprenderán una proteína (o
derivado) que contiene el polvo seco dividido finamente y puede
también comprender un agente de esponjamiento, tal como lactosa,
sorbitol, sacarosa o manitol en cantidades que faciliten la
dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo, 50 a 90% en
peso de la formulación. La proteína (o derivado) debería prepararse
de manera más ventajosa en forma de partículas con un tamaño de
partícula medio inferior a 10 \muM (o micras), más preferentemente
de 0,5 a 5 \muM, para la administración más eficaz del pulmón
distal.
Se contempla asimismo la administración nasal de
la proteína (o derivado). La administración nasal permite el paso de
la proteína al torrente sanguíneo directamente tras la
administración del producto terapéutico a la nariz, sin necesidad de
deposición del producto en el pulmón. Las formulaciones para la
administración nasal incluyen las que contienen dextrano o
ciclodextrano.
Todavía en otro aspecto de la presente
invención, se proporcionan métodos de tratamiento y de preparación
de un medicamento. Las enfermedades aliviadas o moduladas por la
administración de los presentes derivados son las indicadas
anteriormente.
Para todas las moléculas anteriores, a medida
que se realizan más estudios, la información aparecerá con respecto
a las concentraciones de dosificación apropiadas para el tratamiento
de varias enfermedades en varios pacientes, y el especialista
ordinario, considerando el contexto terapéutico, la edad y la salud
general del receptor, será capaz de determinar la dosis apropiada.
Generalmente, para inyectables o infusión, la dosis estará
comprendida entre 0,01 \mug de proteína biológicamente activa/kg
de peso corporal, (calculando la masa de la proteína sola, sin
modificación química) y 10 mg/kg (referida a la misma). El programa
de dosificación puede variar, dependiendo de la vida media en
circulación de la proteína o derivado utilizado, si el polipéptido
se administra en dosis en inyección directa o en infusión continua,
y de la formulación utilizada.
Para la terapia asociada a anomalías
relacionadas con la falta de estimulación de la apoptosis, se puede
administrar la presente proteína (o derivados) junto con una o más
composiciones farmacéuticas utilizadas para el tratamiento de la
complicación clínica subyacente (es decir, cáncer: radioterapia y/o
quimioterapia). La administración puede ser simultánea o in
seriatim.
El polinucleótido del AIF puede introducirse en
las células para desarrollar la terapia génica para las anomalías
relacionadas con la falta de estimulación de la apoptosis (por
ejemplo, enfermedades neoplásicas). Dicha terapia es de esperar que
controle dichos cánceres. Por el contrario, la introducción de
montajes con cadena complementaria en células humanas con cantidades
anormalmente elevadas de apoptosis (por ejemplo, enfermedad
neurodegenerativa) reducirían las concentraciones de polipéptido
del AIF activo y serían predichas para aliviar los síntomas
subyacentes.
En una forma de realización, un gen que codifica
un polipéptido del AIF se introduce in vivo en un vector
vírico. Dichos vectores comprende un ADN virus atenuado o
defectuoso, tal como pero no limitado al virus del herpes simple
(HSV), papilomavirus, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, virus
adenoasociado (AAV) y similares. Dichos virus no son infecciosos
tras la introducción en una célula. La utilización de los vectores
víricos anteriores permite la administración a células en un área
específica, localizada, sin preocuparse de que el vector pueda
infectar otras células. Por lo tanto, por ejemplo el tejido
canceroso puede ser dirigido específicamente. Ejemplos de vectores
concretos comprenden, pero no se limitan a vector del herpes virus 1
(HSV1) [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci.,
2:320-330 (1991)], véase la patente US nº
5.288.641 de Roizman, un vector de adenovirus atenuado, tal como el
vector descrito por Stratford-Perricaudet et al.,
J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992) y un
vector adenoasociado defectuoso [Samulski et al., J. Virol.,
61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J.
Virol., 63:3822-3828 (1989)].
En otra forma de realización, el gen puede
introducirse en un vector retrovírico, por ejemplo, como se describe
en Anderson et al., patente US nº 5.399.346; Mann et al.,
Cell, 33:153 (1983); Temin et al., patente US nº
4.650.764; Temin et al., patente US nº 4.980.289; Markowitz
et al., J. Virol., 62:1120 (1988); Temin et
al., patente US nº 5.124.263; publicación de patente
internacional nº WO 95/07358, publicada el 16 de marzo de 1995, por
Dougherty et al.; y Kuo et al., Blood, 82:845
(1993).
Con respecto a la utilización de vectores
víricos para administrar una terapia a base de genes, es preferible
un polinucleótido del AIF o un fragmento del mismo bajo el control
de un activador capaz de expresarse en las células diana
(operativamente ligado a un activador que opera en el contexto de un
genoma vírico), por ejemplo, montajes con cadena complementaria
(véase anteriormente) para el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas o cualquier otra enfermedad caracterizada por la
hiperestimulación de la apoptosis.
Alternativamente, el vector puede introducirse
in vivo por lipofección. Durante la década pasada, se ha
incrementado la utilización de liposomas para encapsulación y
transfección de ácidos nucleicos in vitro. Los lípidos
catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y
riesgos encontrados con la transfección mediada por liposomas puede
utilizarse para preparar liposomas para la transfección in
vivo de un gen que codifica un marcador [Felgner et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417
(1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85:8027-8031 (1988)]. La utilización de
lípidos catiónicos puede estimular la encapsulación de ácidos
nucleicos cargados negativamente y también estimular la fusión con
las membranas celulares cargadas negativamente [Felgner et al.,
Science, 337:387-388 (1989)]. La
utilización de lipofección para introducir genes exógenos en órganos
específicos in vivo presenta determinadas ventajas prácticas.
El direccionamiento molecular de los liposomas a células específicas
representa un área de utilidad. Está claro que dirigir la
transfección a determinados tipos de células presentaría
particularmente ventajas en un tejido con heterogeneidad celular,
tales como el páncreas, hígado, riñón y cerebro. Los lípidos pueden
acoplarse químicamente a otras moléculas con fines de
direccionamiento [Mackey et al., 1988, supra]. Los
péptidos dirigidos, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y
proteínas tales como los anticuerpos o moléculas no peptídicas
podrían acoplarse químicamente a los liposomas.
Es posible también introducir el vector in
vivo como plásmido de ADN desprotegido. Los vectores de ADN
desprotegidos para la terapia génica pueden introducirse en las
célula huésped deseadas por los métodos conocidos en la materia, por
ejemplo, transfección, electroporación, microinyección,
transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con
fosfato de calcio, utilización de un acelerador de genes o
utilización de un transportador del vector del ADN [Wu et al., J.
Biol. Chem., 267:963-967 (1992); Wu et
al., J. Biol. Chem., 263:14621-14624
(1988); Hartmut et al., solicitud de patente canadiense nº
2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990].
El desarrollo de pequeñas moléculas agonistas y
antagonistas del AIF se facilitará en gran medida mediante el
aislamiento del o de los compañero(s) de enlace al AIF. Esto
puede realizarse preparando el polipéptido activo del AIF y
utilizándolo para identificar un banco de expresión que utiliza
métodología habitual. La unión del enlace del compañero en el banco
de expresión puede determinarse administrando polipéptido
recombinante preparado que utiliza vectores de expresión bacterianos
o de mamífero y observando los efectos a corto plazo y la
administración continua del polipéptido recombinante en las células
del banco de expresión.
Los bancos de ADNc procedentes de tejidos que se
cree que contienen AIF pueden ser construidos en vectores de
clonación de expresión normal. Estos clones de ADNc se introducirán
a continuación en las células COS en grupos y los transformantes
resultantes se determinarían con ligando activo para identificar las
células COS que se expresan el compañero de enlace al AIF. Los
clones positivos pueden aislarse a continuación con el fin de
recuperar el compañero de enlace clonado. El compañero de enlace
clonado se utilizaría junto con el ligando del AIF para desarrollar
los componentes necesarios para la identificación de pequeñas
moléculas de moduladores de AIF.
Un ensayo útil y complementado según la presente
invención se conoce como ensayo "cis/trans". En resumen, este
ensayo emplea dos montajes genéticos, uno de los cuales es
típicamente un plásmido que expresa continuamente un compañero de
enlace determinado de interés cuando se transfecta en una línea
celular apropiada, y el segundo de los cuales es un plásmido que
expresa un indicador tal como luciferasa, bajo el control de un
complejo receptor/ligando. Por lo tanto, por ejemplo, si se desea
evaluar un compuesto como ligando para un determinado compañero de
enlace, uno de los plásmidos debería ser un montaje que produzca la
expresión del compañero de enlace en la línea celular seleccionada,
mientras que el segundo plásmido poseería un activador ligado al
gen de luciferasa en el que el elemento de respuesta al compañero de
enlace determinado está insertado. Si el compuesto en ensayo es un
agonista para el compañero de enlace, el ligando se acomplejará con
el receptor y el complejo resultante unirá el elemento de respuesta
e iniciará la transcripción del gen de luciferasa. Se mide a
continuación fotométricamente la quimioluminiscencia resultante, y
se obtienen las curvas de respuesta a la dosis y se comparan con las
de los ligandos conocidos. El protocolo anterior está descrito con
detalle en la patente US nº 4.981.784 y en la publicación
internacional PCT nº WO 88/03168, con cuya intención se cita al
especialista. Una vez se identifica un recombinante que expresa la
secuencia génica del compañero de enlace al AIF, puede analizarse el
compañero de enlace al AIF recombinante. Esto se consigue mediante
los ensayos basados en las propiedades físicas u operativas del
compañero de enlace al AIF, incluyendo el marcado radioactivo del
compañero de enlace seguido de análisis por electroforesis en gel,
inmunoanálisis, fijación del ligando, etc. Además, pueden generarse
anticuerpos contra el compañero de enlace al AIF como se describió
anteriormente.
La estructura del compañero de enlace al AIF
puede analizarse por varios métodos conocidos en la materia.
Preferentemente, se analiza la estructura de varios dominios,
particularmente la secuencia de enlace al AIF. El análisis
estructural puede realizarse identificando la secuencia de manera
similar con otras proteínas conocidas, determinadas hormonas y
compañero de enlace a la proteína. El grado de similitud (u
homología) puede aportar una base para predecir la estructura y
función del compañero de enlace al AIF o un dominio del mismo. En
una forma de realización específica, las comparaciones de la
secuencia pueden realizarse con las secuencias halladas en el
GenBank, utilizando, por ejemplo, los programas FASTA y FASTP
[Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85:2444-2448 (1988)].
La secuencia proteica puede caracterizarse más
mediante un análisis de hidrofilia, por ejemplo, Hopp et al.,
1981, supra. Puede utilizarse un perfil de hidrofilia para
identificar las zonas hidrofóbica e hidrofílica del compañero de
enlace al AIF, que a su vez puede indicar las zonas
extracitoplásmicas, de enlace a la membrana o
intracitoplásmicas.
Puede emprenderse asimismo el análisis
estructural secundario, por ejemplo, Chou et al., 1974,
supra, para identificar zonas del compañero de enlace al AIF
que suponen estructuras secundarios específicas. La manipulación,
traducción y producción de la estructura secundaria, así como la
predicción y la representación del marco de lectura abierto, también
pueden realizarse utilizando programas informáticos disponibles en
la materia.
Al proporcionar una abundante fuente de
polipéptido del AIF recombinante y la oportunidad de aislar el
compañero de enlace al AIF, la presente invención permite la
determinación estructural cuantitativa de la conformación activa del
polipéptido del AIF y el compañero de enlace al AIF o los dominios
del mismo. En particular, se aporta material suficiente para
resonancia magnética nuclear (RMN), infrarrojo (RI), Raman y
ultravioleta (UV), especialmente dicroísmo celular (CD), análisis
espectroscópico. En particular la RMN proporciona análisis
estructural muy potente de moléculas en solución, que se aproxima
más estrechamente a su medio natural (Marion et al., 1983,
supra; Bar et al., 1985, supra; Kimura et
al., 1980, supra). Otros métodos de análisis estructural
pueden emplearse también. Éstos incluyen pero no se limitan a la
cristalografía por rayos X (Engstom, 1974, supra).
Más preferentemente, pueden estudiarse los
cristales conjuntos de polipéptido del AIF y del compañero de enlace
al AIF. El análisis de los cristales conjuntos proporciona
información detallada acerca del enlace, que a su vez permite el
diseño racional de agonistas y antagonistas del ligando. También
puede utilizarse modelado informático, especialmente en relación con
los métodos por RMN o por rayos X [Fletterick et al., eds.,
Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current
Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1986)].
La identificación y aislamiento de un gen que
codifica un compañero de enlace al AIF de la invención proporciona
la expresión del receptor en cantidades mayores que pueden aislarse
de fuentes naturales o en las células indicadoras que están
especialmente modificadas genéticamente para indicar la actividad
del compañero de enlace expresada tras la transfección o
transformación de las células. Por consiguiente, además del diseño
racional de agonistas y antagonistas basado en la estructura del
polipéptido del AIF, la presente invención contempla un método
alternativo para la identificación de ligandos específicos del
compañero de enlace al AIF utilizando varios ensayos de
identificación conocidos en la materia.
La invención se ilustra mediante los ejemplos
siguientes, que no pretenden limitar el alcance de la invención tal
como se describe en las reivindicaciones.
El Ejemplo 1 proporciona métodos para la
clonación y expresión del AIF de ratón.
El Ejemplo 2 proporciona métodos para la
producción de antisueros anti-AIF así como los
métodos para los protocolos experimentales de inmunofluorescencia,
microscopía inmunoelectrónica e inmunorreducción.
\newpage
El Ejemplo 3 proporciona métodos para protocolos
experimentales que entrañan el fraccionamiento subcelular y sistemas
de apoptosis exentos de células.
El Ejemplo 4 proporciona métodos para la
microinyección, transfección y cuantificación de la apoptosis.
El Ejemplo 5 describe las isoformas alternativas
del AIF de ratón.
El Ejemplo 6 describe la clonación del AIF
humano.
El Ejemplo 7 describe las isoformas alternativas
del AIF humano.
El Ejemplo 8 proporciona métodos para la
construcción del ADNc del AIF humano completo.
El Ejemplo 9 proporciona métodos para el cultivo
de células huésped y la estimulación subsiguiente de la proteína
recombinante (AIF).
El Ejemplo 10 describe la purificación de la
proteína de fusión del AIF recombinante completa.
El Ejemplo 11 describe la utilización de un
análisis híbrido de levadura para identificar los compañeros de
enlace al AIF.
Con el fin de determinar la secuencia del ADN
que codifica a mAIF, se sometió el polipéptido a purificación de
proteínas, seguido de análisis de la secuencia de aminoácidos y
alineamiento por análisis informático con los EST del GenBank.
Después de la determinación tanto del inicio 5' como de la
terminación 3' de mAIF, se emprendió el análisis
RT-PCT para verificar que el cóntigo de mAIF
obtenido formaba un marco de lectura abierto continuo (véase a
continuación los métodos existentes).
Se purificó el mAIF (AIF de ratón) a partir del
sobrenadante de mitocondrias de hígado de ratón tratadas con
atractilosida como se describió anteriormente [Wada et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:144-149 (1998)],
se sometió a SDS-PAGE, tinción con plata, escisión
de la banda de \sim 57 kDa, digestión in situ con tripsina,
extracción del péptido, inyección en una columna HPLC microcapilar
(50 micras i.d. \times 10 cm.) rellena con C-18
(YMC ODS-AQ) e ionización por electroatomización en
un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (Finnigan, San José,
CA) durante la elución a gradiente lineal de péptidos con
acetonitrilo.
Se analizaron los datos espectrométricos de
masas con el ordenador SEQUEST de rutina, permitiendo la correlación
de espectros de disociación producidos por colisiones de alta
energía de péptidos con todas las secuencias en las bases de datos
de proteínas públicas [Ducret et al., Protein Sci.
7:706-719 (1998)]. En resumen (véase a
continuación para detalles adicionales) una secuencia etiqueta
expresada (GenBank EST nº 1.595.214) que es compatible con los datos
de la electroatomización se alineó con varios otros EST de ratón en
la base de datos NCBI (por ejemplo nº AA106466 y nº AA068609 de
registro en el GenBank). Estos EST se obtuvieron del consorcio IMAGE
(Research Genetics, Huntsville, AL) y se secuenciaron para generar
un cóntigo del ADNc del AIF de ratón que se utilizó posteriormente
para clonar el ADNc completo de ratón y AIF humano por
RT-PCR. Se realizaron análisis por transferencia
Northern utilizando el ADNc del mAIF completo como sonda.
Más específicamente, los EST de ratón siguientes
se alinearon para formar el cóntigo del ADNc del AIF de ratón
preliminar: GenBank nº AA106466 (el clon más 5' EST), GenBank nº
AA572575, GenBank nº W77437, GenBank nº AA155062, GenBank nº
AA516860, GenBank nº AA088093, GenBank nº AA073449 y GenBank nº
AA134414.
La mayor parte del clon EST de ratón de 5'
(GenBank nº AA106466) y dos EST humanos (GenBank nº AA337888 y dbj
nº C03711), que se cree que corresponden a secuencias ortólogas de
AIF, comienzan todos en similares posiciones. Este fenómeno con
frecuencia es indicativo de los clones EST que representan el inicio
de la transcripción.
La alineación de los EST del AIF de ratón
(GenBank nº AA106466) y humano (obj nº C03711) pusieron de
manifiesto que eran más divergentes en los terminales del extremo 5'
y realmente contenían un hueco de 2 nucleótidos en la alineación en
el extremo 5'. Debido a que este hueco en la alineación destruiría
el marco de lectura, se sacó en conclusión que el área divergente de
la secuencia representaba la zona 5' no traducida. La traducción de
cada uno de estos EST en los 3 marcos puso de manifiesto que
solamente un marco de lectura continuaba en la dirección de 3' a 5'
sin codones de terminación y este marco era el mismo para los EST de
AIF tanto de ratón (GenBank nº AA106466) como humano (GenBank nº
AA337888 y dbj nº C03711). Además, las alineaciones de la especie de
cruce permitieron la verificación de este mismo marco de lectura del
extremo 5' de AIF porque las secuencias de AIF de ratón y humana
normalmente se diferenciaban en nucleótidos, que estaban localizados
en muchos de los 3 nucleótidos alejados entre sí y estaban por lo
tanto ocupando la posición "de oscilación" o el tercer
nucleótido del codón de tres letras. La traducción de los EST del
AIF de ratón y humano en este marco identificó el inicio de
metionina. La presencia de la g en la posición -3 del codón de
inicio (ATG) tanto en los clones EST de ratón como humano es
coherente con el consenso de Kozak de una A o una g en la posición
-3 de la metionina del inicio. Esto por consiguiente presta más
apoyo a que ésta sea la verdadera metionina de inicio del AIF.
La alineación del cóntigo del ADNc del mAIF con
otros EST en la base de datos N.C.B.I. identificó un EST de ratón
adicional (GenBank nº AA060609) que extendió el cóntigo del AIF de
ratón aun más de 3'. Se cree que este clon EST de ratón se perdió
supuestamente porque solamente se solapó con el cóntigo original en
37 nucleótidos.
Este clon EST de ratón adicional (GenBank nº
AA068609) estaba disponible y por lo tanto se adquirió en el
consorcio I.M.A.G.E. (ADNc ID nº 524752; situado en el vector
pBlueScript SK; el ADNc de EST se clonó procedente de un melanoma M2
de ratón de Stratagene (nº 937312). Una vez obtenido, la bacteria
que contiene el clon EST se sometió al siguiente protocolo.
Se utilizó un bucle esterilizado para inocular
3,5 ml de caldo de cultivo LB (que contiene 50 \mug de
carbenacilina/ml) y la bacteria se cultivó en un incubador con
agitación a 37ºC durante 16 horas. Se utilizó a continuación un kit
Plasmid Miniprep de Qiagen (Qiagen Inc. Mississauga, ON, catálogo nº
12125) para preparar el ADN del plásmido de este cultivo según las
instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido se puso en
suspensión en 30 \mul de 1 \times tampón T.E. (pH 8,0) y se
sometió a secuenciado de didesoxi-nucleótido
fluorescente y detección automática (AB1/Perkin Elmer, Foster City,
CA) con los cebadores T7 y T3.
El secuenciado de este clon EST que utiliza los
cebadores T3 y T7 puso de manifiesto que este clon contenía la
supuesta terminación 3' para AIF de ratón porque contenía
terminaciones en los 3 marcos de lectura (Figs.
8A-8G).
Para determinar el marco de lectura correcto del
extremo 3' del AIF de ratón, se realizó una búsqueda en BLAST frente
a la base de datos N.C.B.I. de EST utilizando los datos de la
secuencia recién generados. Estos nuevos datos de la secuencia
alineados con los EST de rata (GenBank nº AA891591) y los EST de los
tejidos humanos (por ejemplo GenBank nº AA570483). Las alineaciones
de la especie de cruce permitieron a los investigadores terminar el
marco de lectura del extremo 3' del AIF de ratón porque las
secuencias se diferenciaban normalmente en los nucleótidos que
estaban situados en múltiplos de 3 nucleótidos alejados entre sí y
estaban por consiguiente ocupando la posición "de oscilación"
o el tercer nucleótido del codón de tres letras (Figs.
5A-5H). Cuando se tradujo el EST del AIF de ratón en
3' en este marco fue posible la identificación del codón de
terminación en 3'.
Con el fin de comprobar que el cóntigo del mAIF
obtenido anteriormente formaba un marco de lectura abierto continuo,
se diseñaron cebadores al lado del marco de lectura abierto del ADNc
del AIF de ratón utilizando el programa de diseño de
oligonucleótidos que utiliza la versión Oligo 4.0. Específicamente,
los cebadores fueron los siguientes:
| Cebador transcrito: | 5'-ACGGTGCGTGGAAGGAAAAGGAAGG-3' | (SEC. ID nº: 16) |
| Cebador complementario: | 5'-CGCCAGGGATGGAAAAGTGCTTGTG-3' | (SEC. ID nº: 17). |
Basadas en la información del cóntigo anterior,
se predijo este conjunto de cebador para ampliar un fragmento de
aproximadamente 1,9 kb.
Se realizaron las ampliaciones por
RT-PCR en un volumen de 50 \mul que contenía y los
dNTP 200 \muM, cada cebador de 0,5 \muM,
Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50
mM, 2 ng de ADNc de cerebro de ratón (ADNc del "clon rápido" de
Clontech nº de catálogo 7130-1) y 5 unidades de
Expand^{TM} Hi-Fi ADN polimerasa (Boehringer
Mannheim GmbH, Alemania). Las reacciones por PCR se ampliaron
utilizando un protocolo de temperatura de hibridación
"Touch-down/Touch-up" (Snow
et al., Biochem. Biophy. Res. Comm.,
233:770-777 (1997) y Snow et al., Gene
206:247-253 (1998)) en un ciclador térmico
programable PTC-100 (MJ Research Inc.) en las
siguientes condiciones: desnaturalización inicial de 95ºC durante 40
s, 5 ciclos a 94ºC durante 20 s, 70ºC - 2º/ciclo durante 20 s, 72ºC
durante 1 minuto y 19 s + 1 s/ciclo, seguido de 5 ciclos a 94ºC
durante 25 s, 62ºC + 1ºC/ciclo durante 20 s, 72ºC durante 1 minuto
y 30 s + 1 s/ciclo, seguido de 20 ciclos a 94ºC durante 25 s, 66ºC
durante 20 s, 72ºC durante 1 minuto y 40 s + 1 s/ciclo y una
incubación final de 72ºC durante 5 minutos. Los productos de PCR de
\sim1,9 kb resultantes se purificaron en gel a continuación a
partir de un gel de agarosa al 1,0% utilizando el sistema de
purificación en gel QiaQuick (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA), TA
clonado en pCR2.1 utilizando el kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen,
San Diego, CA, nº de catálogo K4550-40) y se
transformaron en células TOP10F' de E. coli. Se preparó ADN
de plásmido utilizando el kit Plasmid Miniprep de Qiagen (Qiagen
Inc. Mississauga, ON, nº de catálogo 12125). Se obtuvo la secuencia
de la inserción utilizando el secuenciado del
didesoxi-nucleótido fluorescente y detección
automática (AB1/Perkin Elmer, Foster City, CA).
Se diseñaron también cuatro cebadores de
secuenciado, que ayudarían a secuenciar el marco de lectura abierto
del ADNc del AIF de ratón. Los cebadores de secuenciado fueron los
siguientes:
| Transcrito: | 5' TCAGTTCCTCAGATCAGGGCACC-3' | (SEC. ID nº: 18) |
| Complementario: | 5' AAAAACACCAACTGTGGGCAAAC-3' | (SEC. ID nº: 19) |
| Transcrito: | 5' CATCGATAGGGCTGGAGCAGAGG-3' | (SEC. ID nº: 20) |
| Complementario: | 5' TTTCCATGGTCCAGTTGCTGAGG-3' | (SEC. ID nº: 21) |
El
pCR2.1-mus-AIF.B1B (ADN nº
9.806.532) se secuenció y se determinó que era la secuencia perfecta
al 100% por alineación con el cóntigo EST del AIF de ratón, que se
había montado y por alineación con otro clon de AIF de cerebro de
ratón por RT-PCR independiente:
pCR2.1-musAIF.A1A (ADN nº 9.806.531). Se comprobaron
todos los nucleótidos en el clon pCR2.1-musAIF.B1B
debido a que estaban presentes en el cóntigo EST del AIF de ratón,
que había sido montado o en el pCR2.1-musAIF.A1A
que procedía de una reacción por RT-PCR
independiente. Se predijo el
pCR2.1-mus-AIF.B1B para codificar un
polipéptido de 612 aminoácidos con un peso molecular previsto de
66.689 kDa. La secuencia del ADNc se indica en la SEC. ID nº: 1,
mientras que la secuencia de aminoácidos prevista para el AIF de
ratón en la SEC. ID nº: 2, con la secuencia de aminoácidos de la
proteína madura indicada en la SEC. ID nº: 3.
El mAIF activado por tiorredoxina, así como
varios mutantes por deleción del AIF generados (con el fin de
determinar la secuencia activa de la proteína) por escisión de las
secuencias del ADN con BamH1 (aminoácidos nº
D180-638), NcoI (aminoácidos nº
D1-377) o HindIII (aminoácidos nº
D563-638) se expresaron en un vector de expresión
bacteriano pET32 de Novagen y se purificaron en cuerpos de inclusión
de E. coli (véanse las Figs. 3 y 4 para los datos que
implican la utilización de estos mutantes por deleción). Se
replegaron las proteínas en la matriz de afinidad de Nickel NTA y se
almacenaron en HEPES 50 mM, pH 7,9, NaCl 100 mM, EDTA 2 mM, DTT 1 mM
y glicerol al 10%.
Con el fin de determinar la expresión en la
proteína del AIF a través de una variedad de tejidos, se generaron
antisueros de conejo contra una mezcla de los tres péptidos del AIF
y se sometieron a los métodos de deleción indicados a
continuación.
Específicamente, se generó antisuero de conejo
contra una mezcla de 3 péptidos procedente de la secuencia de
aminoácidos del mAIF (aminoácidos nº 151-170,
166-185, 181-200, acoplados a KLH).
Este antisuero (título de ELISA \sim10.000) se utilizó en
inmunotransferencias (1/2.000) y en células 1 de rata (1/250)
fijadas con paraformaldehído/ácido picrílico
[Bossy-Wetzel et al., EMBO J.
17:37-49 (1998)] y se revelaron con un IgG
anticonejo de cabra conjugado con peroxidasa o FITC (fluorescencia
verde), respectivamente. El citocromo c se detectó por
inmunofluorescencia (mAb 6H2.B4 de Pharmingen) en células 1 de rata
fijadas transfectadas con un vector de referencia (Neo) o con
Bcl-2 humano [Zhu et al., EMBO J.
15:4130-4141 (1996)] descrita
[Bossy-Wetzel et al., EMBO J.
17:37-49 (1998)], mientras que el colorante
CMXRos sensible a DY_{m} (100 nM, fluorescencia roja) se utilizó
en células vivas [Marzo et al., Science 281,
2027-2031 (1998)]. Se tiñeron las células por
contraste con el colorante Hoechst 33342 (1 \muM, fluorescencia
azul). Se realizó la microscopía inmunoelectrónica utilizando una Ig
anti-conejo (5 nm) de Immunogold para revelar la
presencia de proteínas que reaccionan con el antisuero
anti-AIF. La inmunoeliminación de AIF se consiguió
inmovilizando el antisuero (o un suero preinmune) en perlas de
agarosa con proteína A y proteína g (Santa Cruz Biotechnology: 500
\mul de antisuero por ml de perlas) e incubación durante la noche
de proteínas de la intermembrana mitocondrial (100 \mug/ml) con
estas perlas (20 \mul de fluido con 10 \mul de perlas de
relleno) en presencia o ausencia de péptidos inmunógenos (5
\muM).
Se utilizaron los siguientes métodos en los
estudios para determinar la localización subcelular del AIF, así
como para la determinación del efecto de AIF sobre el orgánulo
celular en un sistema exento de células.
Células de hibridoma de linfocitos T 2B4.11
transfectadas de manera estable con el vector SFFV.neo que contenía
el gen bcl-2 humano o el gen con resistencia a la
neomicina (Neo) solamente [Susin et al., J. Exp. Med.
184:1331-1342 (1996)] se sometieron a lisis
mecánica y centrifugación diferencial para la recuperación
subsiguiente de núcleos, mitocondrias y citosoles exentos de
orgánulos [Liu et al., Cell 86:147-157
(1996)]. Se controló el fraccionamiento submitrocondrial de las
mitocondrias de hígado de ratón mediante la determinación de enzimas
marcadoras adecuadas [Susin et al., J. Exp. Med.
186:25-37 (1997); Pedersen et al., Meth.
Cell Biol. 20:411-481 (1978)]. Los
núcleos de las células HeLa purificadas se expusieron a diferentes
preparaciones de AIF, y se cuantificó la apoptosis nuclear mediante
tinción con yoduro de propidio intercalando ADN y determinación
citofluorométrica del contenido en ADN [Susin et al., J. Exp.
Med. 186:25-37 (1997)]. Alternativamente,
los núcleos se tiñeron con colorante 33342 de Hoechst o se
sometieron a extracción del ADN y electroforesis en gel con campo
pulsado. Se expusieron mitocondrias de hígado de rata aislados (0,5
mg de proteína mitocondrial/ml) a citosol exentos de mitocondrias
(100 \mug de proteína/ml) [Susin et al., J. Exp. Med.
186:25-37 (1997); Enari et al., EMBO
J. 14:5201-5208 (1995)] y/o AIF
recombinante (100 ng/ml), mientras se controla la dilatación de gran
amplitud a una DO_{540}. La liberación del citocromo c y
de caspasa-9 en el sobrenadante se midió por
inmunotransferencia utilizando un anticuerpo
anti-citocromo c monoclonal (7H8.2C12,
Pharmingen), o un anticuerpo de conejo dirigido contra la subunidad
grande de caspasa (Hazelton Research Products Inc., Denver, PA).
Se microinyectaron células de fibroblasto 1 de
rata (presión 150 hPa; 0,2 s; Marzo et al., Science
281:2027-2031 (1998)) con tampón solamente,
atractilosida (50 \muM), antisuero dializado, péptidos derivados
de AIF (100 \muM), citocromo c de caballo (Sigma), o la
dosis indicada de mAIF recombinante. Se añadió el inhibidor
Z-VAD.fmk de caspasa (100 \muM; Bachem, Basel,
Suiza) al medio de cultivo 30 min. antes de la microinyección en el
citoplasma (presión 150 hPa; 0,2 s). Tras la microinyección, se
cultivaron las células durante 90-180 min. y se
tiñeron durante 10 min. con colorante CMXRos, 33342 de Hoechst, o
anexina V conjugada con biotina (Boehringer Mannheim) y se revelaron
mediante un conjugado de avidina-ficoeritrina
(Sigma). Las células viables microinyectadas (100 a 200 por sesión,
dos a tres sesiones independientes de inyección) se identificaron
mediante la inclusión del FITC-dextrano
(fluorescencia verde) al 0,25% (p:v) en el inyectable. Únicamente se
registró la fluorescencia azul o roja. La transfección de células
de linfoma T de Jurkat se realizó utilizando AIF clonadas en el
vector pcADN3.1 (Invitrogen) y Lipofectamina® (Gibco Life
Technologies). Los análisis citofluorométricos de los parámetros
asociados a la apoptosis se realizaron como se describe [Kroemer
et al., "Detection of apoptosis and apoptosis associated
alterations" The Immunology Methods Manual (Lefkovitz, R.
ed.); Academic Press, capítulo 14.2, págs.
1111-1125 (1997)].
El análisis de la secuencia del otro clon EST
del AIF de ratón [CR2.1-musAIF.A1A (ADN nº 9.806.531
de Amgen) y de otro clon parcial de AIF de ratón:
pCR2.1-musAIF-ORF.B parcial (ADN nº
9.804.781 de Amgen) puso de manifiesto que el terminal N del AIF de
ratón contiene una secuencia de codificación alternativa que se
obtiene supuestamente por consumo de exón alternativo. El clon
pCR2.1-musAIF-ORF.B parcial del AIF
parcial de ratón (ADN nº 9.804.781 de Amgen) del AIF parcial de
ratón se amplió en el ADNc de cerebro de ratón utilizando los
cebadores:
cebador transcrito nº
1.874-21:
| 5'GAGCCACGTGGTCTGTTTGACCCGTTCG-3' | (SEC. ID nº: 22) |
\vskip1.000000\baselineskip
cebador complementario nº
1.874-22:
| 5'GGAGTTCTGCATTTACCCGGAAGCCACC-3' | (SEC. ID nº: 23) |
Se realizaron las ampliaciones por
RT-PCR en un volumen de 50 \mul que contenía y los
dNTP 200 \muM, cada cebador de 0,5 \muM,
Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50
mM, 2 ng de ADNc de cerebro de ratón (ADNc del "clon rápido" de
Clontech nº de catálogo 7130-1) y 5 unidades de
Expand^{TM} Hi-Fi ADN polimerasa (Boehringer
Mannheim GmbH, Alemania). Las reacciones por PCR se ampliaron
utilizando un protocolo de temperatura de hibridación
"Touch-down/Touch-up" (Snow
et al., Biochem. Biophy. Res. Comm.,
233:770-777 (1997) y Snow et al., Gene
206:247-253 (1998)) en un ciclador térmico
programable PTC-100 (MJ Research Inc.) en las
siguientes condiciones: desnaturalización inicial de 95ºC durante 40
s, 5 ciclos a 94ºC durante 20 s, 67ºC - 2º/ciclo durante 20 s, 72ºC
durante 59 segundos + 1 s/ciclo, seguido de 5 ciclos a 94ºC durante
25 s, 63ºC + 1ºC/ciclo durante 20 s, 72ºC durante 1 minuto y 20 s +
1 s/ciclo, seguido de 20 ciclos a 94ºC durante 25 s, 59ºC +
1ºC/ciclo durante 20 s, 72ºC durante 1 minuto y 7 s + 1 s/ciclo y
una incubación final de 72ºC durante minutos. Los productos de PCR
de \sim1,35 kb resultantes se purificaron en gel a continuación a
partir de un gel de agarosa al 1,0% utilizando el sistema de
purificación en gel QiaQuick (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA), TA
clonado en pCR2.1 utilizando el kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen,
San Diego, CA, nº de catálogo K4550-40) y se
transformaron en células TOP10F' de E. coli. Se preparó ADN
de plásmido utilizando el kit Plasmid Miniprep de Qiagen (Qiagen
Inc. Mississauga, ON, nº de catálogo 12125). Se obtuvo la secuencia
de la inserción utilizando el secuenciado del
didesoxi-nucleótido fluorescente y detección
automática (ABI/Perkin Elmer, Foster City, CA).
Aunque la función de este exón alternativo es
desconocida en el momento presente, no se cree que sea producto
artificial porque se obtuvieron dos clones de RT-PCR
idénticos independientes de este exón alternativo. La codificación
del ADNc para esta isoforma se indica en la SEC. ID nº: 4 con el
conjunto de aminoácidos previsto indicado en la SEC. ID nº: 5,
mientras que la secuencia de aminoácidos de la proteína madura se
indica en la SEC. ID nº: 6.
La búsqueda en BLAST de la base de datos no
redundante NCBI con el marco de lectura abierto de AIFm puso de
manifiesto que la secuencia de ADN genómica del AIF humano (AIFh)
ortólogo estaba presente en la base de datos en PAC 179D3 (EMBL nº
Z81364 y EMBL nº 81370). Utilizando la secuencia genómica como
plantilla, se diseñaron los cebadores de AIF que flanqueaban el
marco de lectura abierto y son los siguientes:
Cebador transcrito nº
1967-28:
| 5'-GAGAGGAAAGGGAAGGAGGAGGTC-3' | (SEC. ID nº: 24) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador complementario nº
1967-29:
| 5'-TTGCCAATTCCACTGTGGGGCTTC-3' | (SEC. ID nº: 25) |
Se clonó AIF humano del ADNc de la retina
humana. Se disecaron retinas humanas de ojos humanos completos
adquiridos en el banco de ojos de Canadá (Toronto, ON). Se preparó
ARN completo procedente del tejido de retina humana utilizando el
reactivo TRIzol^{TM} de aislamiento del ARN total (Gibco BRL, Life
Technologies Incorporated, nº de cat. 15596-018)
según las instrucciones del fabricante. ADNc de la primera cadena
procedente del ARN completo de la retina humana se preparó
utilizando cebadores oligo-dT y el kit de síntesis
SuperscriptII del ADNc de la primera cadena (Gibco BRL, Burlington,
OH) según las instrucciones del fabricante. Se realizaron las
ampliaciones por RT-PCR utilizando el sistema de PCR
(Boehringer Mannheim GmbH, Alemania nº de catalizador. 1732650) en
un volumen de 50 \mul que contenía los dNTP 200 \muM, cada
cebador de 0,5 \muM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3),
MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, 2 ng de oligo-dT
cebador de ADNc de retina humana y 5 unidades de Expand^{TM}
Hi-Fi ADN polimerasa (Boehringer Mannheim GmbH,
Alemania). Las reacciones por PCR se ampliaron utilizando un
protocolo de temperatura de hibridación
"Touch-down/Touch-up" (Snow
et al., Biochem. Biophy. Res. Comm.,
233:770-777 (1997) y Snow et al., Gene
206:247-253 (1998)) en un ciclador térmico
programable PTC-100 (MJ Research Inc.) en las
siguientes condiciones: desnaturalización inicial de 95ºC durante 40
s, 5 ciclos a 94ºC durante 20 s, 69ºC - 2º/ciclo durante 20 s, 72ºC
durante 2 minutos + 1 s/ciclo, seguido de 5 ciclos a 94ºC durante 25
s, 61ºC + 1ºC/ciclo durante 20 s, 72ºC durante 2 minuto y 33 s + 1
s/ciclo, y una incubación final de 72ºC durante 5 minutos. Los
productos de PCR de \sim1,9 kb resultantes se purificaron en gel a
continuación a partir de un gel de agarosa al 1,0% utilizando el
sistema de purificación en gel QiaQuick (QIAGEN Inc., Chatsworth,
CA), TA clonado en pCR2.1 utilizando el kit TOPO TA Cloning®
(Invitrogen, San Diego, CA, nº de catálogo K4550-40)
y se transformaron en células TOP10F' de E. coli. Se obtuvo
la secuencia de la inserción utilizando el secuenciado del
didesoxi-nucleótido fluorescente y detección
automática (ABI/Perkin Elmer, Foster City, CA).
Se secuenciaron dos clones de ADNc del AIF
humano: pCR2.1-hAIF-G.inferior.14
(ADN nº 9.812.239) y pCR2.1-hAIF.E11 (ADN nº
9.812.238). La alineación de los clones del ADNc del AIFh (que
procedían de reacciones RT-PCR independientes en la
retina humana) con cada otro y con las secuencias genómicas del AIFh
del cromosoma X (EMBL nº Z81364) permitió una determinación de la
secuencia de consenso correcta para ADNc del AIF humano que
comprende el marco de lectura abierto.
Se predijo que el ADNc del AIFh para codificar
un polipéptido de 613 aminoácidos con un peso molecular previsto de
66.824 kDa. La alineación de los polipéptidos del AIF humano y de
ratón puso de manifiesto que eran 92% idénticos. El ADNc que
codifica el AIFh se indica en la SEC. ID nº: 7, con la secuencia de
aminoácidos del AIFh prevista indicada en la SEC. ID nº: 8, mientras
que la secuencia de aminoácidos de la proteína hAIF madura se indica
en la SEC. ID nº: 9.
Una búsqueda en BLAST de la base de datos de EST
N.C.B.I. con la zona del AIFm que contiene la secuencia exónica
alternativa identificó un EST humano (GenBank nº H15605), que
también contenía una zona de codificación alternativa. La
codificación del ADNc para esta forma alternativa de AIFh se indica
en la SEC. ID nº: 10, con la secuencia de aminoácidos prevista
indicada en la SEC. ID nº: 11, mientras que la secuencia de
aminoácidos de la forma madura se indica en la SEC. ID nº::12.
La alineación de los dos clones humanos del ADNc
del AIF, que se secuenciaron,
pCR2.1-AIFh-Ginferior.14 (ADN nº
9.812.239) y pCR2.1-AIFh.E11 (ADN nº 9.812.238),
puso de manifiesto que era posible el salto del exón en
pCR2.1-AIFh-Glower.14 (ADN nº
9.812.239). Esta zona del salto del exón corresponde exactamente a
la zona donde tiene lugar el corte y empalme alternativo en los ADNc
del AIF tanto de ratón como humano. Dicho descubrimiento
significaría que el exón se corta y empalma completamente o se corta
y empalma alternativamente para contener una de las dos secuencias
exónicas tanto en el ratón como en el hombre. El ADNc que codifica
esta segunda forma alternativa de AIFh se indica en la SEC. ID nº:
13, con la secuencia de aminoácidos prevista indicada en la SEC. ID
nº: 14, mientras que la secuencia de aminoácidos de la forma madura
está indicada en la SEC. ID nº: 15.
La secuencia al 100% del ADNc del AIF humano
perfecto se montó en los dos clones de RT-PCT
independientes que se habían secuenciado como se describió en la
presente memoria.
pCR2.1-AIFh-G-inferior.14
(ADN nº 9.812.239), que mostraba el salto del exón del exón
alternativo en el terminal N, se cortó con 20 unidades de BamH1 en 1
\times tampón B (Boehringer Mannheim) durante 2 horas a 37ºC,
liberando de este modo un fragmento con terminal C de 1447 bp. El
pCR2.1-AIFh.E11, que contenía el terminal N de la
secuencia verificado del AIF humano, se cortó con 20 unidades de
BamH1 en 1 \times tampón B (Boehringer Mannheim) durante 2 horas,
se inactivó térmicamente durante 3 minutos a 85ºC, se enfrió a
temperatura ambiente durante 20 minutos, se diluyó con 400 \mul de
1 \times tampón T.E. en una unidad de filtración UltraFree®-MC
30.000 NMWL (nº de cat. Millipore UFC3LTKNB) y se centrifugó a 1960
\times g en una centrifugadora Eppendorf 5417C durante 6 minutos
hasta que quedó un volumen de \sim25 \mul.
Los 25 \mul del
pCR2.1-AIFh.E11 cortado con BamH1 se desfosforilaron
a continuación con 0,1 unidades de fosfatasa alcalina intestinal de
ternera (Pharmacia Biotech Inc., nº de catálogo
27-0620) durante 30 minutos a 37ºC. Las reacciones
se electroforizaron a continuación en un gel de agarosa al 1% y los
productos apropiados se cortaron a continuación en el gel y se
purificaron utilizando el sistema de purificación en gel de QiaQuick
(QIAGEN Inc., Chatsworth, CA). Se realizó la ligadura utilizando un
kit de ligadura de ADN rápido (nº de cat. De Boehringer Mannheim
1.635.379) según las instrucciones del fabricante. 7 \mul de la
reacción de ligadura se transformaron en 80 \mul de células
XLI-Blue MR supercompetentes de Epicurian Coli®
(Stratagene, La Jolla, CA, nº de catálogo 200.229) según las
instrucciones del fabricante.
El vector de expresión pET32a (Novagen) que
contenía el clon AIF de ratón se transformó en Ò BL21 (DE3) células
huésped competentes de Epicurian Coli (Escherichia coli,
Stratagene) descritas en el manual de instrucción de Stratagene. Se
colocaron las células en placas con
LB-agar-agar (placas de plástico de
9 mm) que contenían 50 \mug de carbenicilina (Sigma, análogo de
ampacilina) por ml de LB-agar-agar
(10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 1 ml de
NaOH 1 N, 15 g de agar-agar, QS hasta 1 l) y se
cultivaron durante la noche a 37ºC para seleccionar las células
transformadas. Una única colonia de células transformadas se desechó
de la placa y se cultivó en 50 ml de medio de
agar-agar con LB (10 g de tristona, 5 g de extracto
de levadura, 5 g de NaCl, 1 ml de NaOH 1 N, QS hasta 1 l) que
contenía 50 \mug/ml de carbenicilina en (LB-carb)
en un matraz Erlenmeyer tabicado de 500 ml, en agitación a 225 rpm
durante la noche a 37ºC. Cuando las células alcanzaron una densidad
óptica de 1,0 (a una longitud de onda de 600 nm, D.O._{600}) se
añadió glicerol a la suspensión celular hasta una concentración
final del 15% y las células se congelaron rápidamente en nitrógeno
líquido y se almacenaron a -80ºC. Una solución madre de glicerol se
utilizó para inocular los medios para todos los cultivos de células
huésped posteriores. Se inocularon 50 ml de medio
LB-cab en un matraz Erlenmeyer tabicado de 500 ml
con una pizca de la solución madre de glicerol y la suspensión
celular se agitó a 225 rpm toda la noche a 37ºC. Se transfirió el 50
ml de cultivo a un matraz Erlenmeyer de vidrio de 6 l y se diluyó
hasta 1,5 l de medio LB-carb y las células se
cultivaron a 37ºC en agitación a 200 rpm en una incubadora con
agitador. Se cultivaron las células hasta una D.O._{600} = 0,60
(D.O._{600} = 0,1 es equivalente a aproximadamente 10^{8}
células por ml de cultivo). A esta densidad la temperatura de la
incubadora disminuyó hasta 22ºC y se dejaron enfriar los cultivos
celulares a esta temperatura (con agitación) durante ½ hora. Después
de 1 hora a la temperatura de cultivo inferior las células
alcanzaron una D.O._{600} = 0,8 y la expresión de T7 polimerasa
se produjo añadiendo
isopropil-b-D-tiogalactopiranósido
(IPTG, Sigma) hasta una concentración final de 0,2 mM (el IPTG
conduce al activador lacUV5 corriente arriba del gen de T7
polimerasa en el lisogen DE3, a su vez la polimerasa conduce a la
expresión de la proteína de fusión tiorredoxina-AIF
a través del activador de T7 potenciador lac en el vector pET32a).
Las células estimuladas por IPTG se cultivaron durante 12 horas a
22ºC y se recogieron por centrifugación a 5.000 \times g durante
15 minutos a 4ºC. El sedimento celular recogido (con un peso en
número de aproximadamente 5,0 g) se lavó con 50 ml de PBS que
contenía un comprimido de la mezcla inhibidora de proteasa disuelto
(comprimidos exentos de EDTA completos de Boehringer
Mannheim^{TM}) y pepstatina A (Boehringer Mannheim) a una
concentración final de 2 \mug/ml. Se volvieron a sedimentar las
células y se congelaron en nieve carbónica.
Como referencia, el vector pET32a solo (menos el
gen del AIF) se transformó en células huésped de Escherichia
coli y la expresión de la etiqueta de tiorredoxina sola se
produjo como se describió anteriormente para el AIF activado por
tiorredoxina.
Los sedimentos celulares congelados (que
expresan la proteína de fusión tiorredoxina-AIF
(trx-AIF) se volvieron a poner en suspensión en 50
ml (10 ml por g de peso en húmedo del sedimento) de tampón de lisis
(HEPES-NaOH 25 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM,
\beta-mercaptoetanol 10 mM, imidazol 20 mM, 1
comprimido de la mezcla del inhibidor de proteasa disuelto por 50 ml
de tampón, pepstatina A a 2 \mug/ml y leupeptina a 2 \mug/ml) y
se homogeneizó con un homogeneizador de vidrio seguido de
tratamiento con ultrasonidos utilizando una sonda de 1/4 de pulgada
unida a un conjunto de procesador ultrasónico de 600 Watt
(Vibro-cell) a una amplitud del 60%, pulsaciones de
5 segundos durante un tiempo total de 1 minuto en hielo. A menos que
se indique de otro modo todas las etapas se realizaron a 4ºC o en
hielo. El desecho celular insoluble se recogió por centrifugación a
16.800 \times g durante 30 minutos. La proteína de fusión
tiorredoxina-AIF quedó en el sedimento de
centrifugación (únicamente una cantidad residual de
trx-AIF se detectó en el sobrenadante mediante
transferencia Western (utilizando un anticuerpo
anti-trx monoclonal, véase a continuación para más
detalles en SDS-PAGE y detalles de transferencia).
Se aspiró el sobrenadante del sedimento y el sedimento se volvió a
poner en suspensión en 50 ml de tampón de lisis
guanidina-HCl (HEPES-NaOH 25 mM, pH
8,0, guanidina-HCl 6 M, Tris-HCl 10
mM, \beta-mercaptoetanol 10 mM, imidazol 20 mM, 1
comprimido de la mezcla inhibidora de proteasa disuelta por 50 ml de
tampón, pepstatina A a razón de 2 \mug/ml y leupeptina a razón de
2 \mug/ml). El sedimento se volvió a poner en suspensión en un
tampón utilizando un homogeneizador Douce de vidrio y se mezcló el
homogeneizado durante 15 minutos utilizando un Neutator (Clay
Adams®). El material insoluble se sedimentó por centrifugación a
27.000 \times g durante 30 minutos. El sobrenadante se pasó sobre
una columna de afinidad superflow (QIAGEN) con
NiNTA-agarosa de 1,5 \times 3,0 cm equilibrada en
tampón de lisis guanidina-HCl. Se cargó la columna y
se resolvió a un caudal constante de 0,3 ml de solución por minuto.
La columna cargada se lavó con 50 ml (10 volumenes de lecho de
columna) de tampón de lavado de la columna NiNTA
(HEPES-NaOH 25 mM, pH 8,0,
guanidina-HCl 6 M, Tris-HCl 10 mM,
\beta-mercaptoetanol 10 mM e imidazol 40 mM). Se
utilizó un gradiente lineal de 50 ml para intercambiar el tampón de
la columna desde el tampón de lavado guanidina-HCl
hasta el tampón de urea (HEPES-NaOH 25 mM, pH 8,0,
urea 6 M, Tris-HCl 10 mM,
\beta-mercaptoetanol 10 mM e imidazol 50 mM).
La tiorredoxina-AIF se eluyó a
continuación con NiNTA-agarosa pasando 50 ml de
tampón de elución NiNTA (HEPES-NaOH 25 mM, pH 8,0,
urea 6 M, Tris-HCl 10 mM,
\beta-mercaptoetanol 10 mM, EDTA 50 mM, 1
comprimido de la mezcla inhibidora de proteasa disuelto por 50 ml de
tampón, pepstatina A a razón de 2 \mug/ml y leupeptina a razón de
2 \mug/ml). La fracción de elución recogida se diluyó añadiendo 5
volúmenes (v/v) de tampón de dilución (HEPES-NaOH 25
mM, pH 8,0, urea 3 M, Tris-HCl 10 mM,
\beta-mercaptoetanol 10 mM, EDTA 1 mM, 1
comprimido de la mezcla inhibidora de proteasa disuelto por 50 ml
de tampón, pepstatina A a razón de 2 \mug/ml y leupeptina a razón
de 2 \mug/ml) y se dializó en 1 l de tampón de diálisis
(HEPES-NaOH 25 mM, pH 7,0,
\beta-mercaptoetanol 5 mM, EDTA 1 mM y glicerol al
10%) utilizando entubado de membrana mwco Spectra/Por®
12-14. El tampón de diálisis se cambió cada 4 a 6
horas y se utilizó un total de 6 l de tampón de diálisis.
La muestra dializada se concentró por
ultrafiltración utilizando una célula a presión de ultrafiltración
Amicon y un filtro YM10 de Amicon bajo gas nitrógeno a 40 psi hasta
una concentración final entre 1 y 4 mg/ml de proteína determinada
utilizando el análisis BioRad de Bradford con IgG como referencia
patrón (realizado como describe el fabricante).
Se identificó la proteína de fusión
tiorredoxina-AIF como una banda de 98 kDa por
SDS-PAGE y colorante azul de Coomassie que utiliza
geles Tris/glicina con gradiente de archilamida del 10 al 20% de
Novex y el aparato con gel de Novex. Para confirmar la identidad de
la banda de 98 kDa, los geles resueltos se transfirieron a la
membrana de PVDF (Boehringer Mannheim), la membrana se bloqueó con
anticuerpos de tampón de bloqueo (crema de leche en polvo al 4%,
Carnation, BSA al 1%, fracción V de Sigma, Tween 20 al 0,1% en
solución salina tamponada con Tris) y proteína de fusión
trx-AIF anti-trx
(3H8-E11) de ratón o anti-AIF (J53)
de conejo seguido de conjugados de IgG-HRP
(peroxidasa de rábano picante) anti-ratón/conejo de
asno/cabra (Amersham). Los conjugados de HRP se detectaron en
película X-omatic Blue XB-1 de Kodak
utilizando reactivos para detección de transferencia Western ECL
como se esbozó por el fabricante (Amersham Life Sciences). Un total
de 1,0 mg de proteína soluble replegada se recuperó por cada 1 l de
cultivo celular.
Un polipéptido del factor inductor de la
apoptosis de mamífero (AIF), que basta para estimular la apoptosis
de núcleos aislados, se ha identificado y clonado. Este factor
omnipresente con homología con las oxidorreductasas bacterianas está
confinado normalmente con mitocondrias y se libera en la inducción
de la apoptosis como una proteína de 57 kDa que se traslada al
núcleo. El AIF recombinante produce núcleos aislados que
experimentan condensación de cromatina y fragmentación del ADN a
gran escala (\sim50 kbp). Además, produce mitocondrias purificadas
que liberan citocromo c y caspasa-9. La
microinyección de la proteína del AIF recombinante en las células
sanas o la sobreexpresión forzada por transfección de AIF produce la
condensación de cromatina, la disipación del potencial de
transmembrana mitocondrial (DY_{m}) y la exposición a la
fosfatidilserina de la membrana plasmática. Ninguno de estos efectos
evita el inhibidor Z-VAD.fmk de caspasa de amplio
espectro. La sobreexpresión de Bc1-2 impide la
liberación de AIF de las mitocondrias, pero no tiene efecto sobre la
capacidad de AIF para estimular la apoptosis nuclear. Estos datos,
dados a conocer en la presente memoria, demuestran a AIF como un
nuevo efector mitocondrial de la muerte celular apoptósica. En vista
de la capacidad de AIF para estimular la apoptosis, la
administración de AIF (o análogos, homólogos o variantes de los
mismos que posee actividad similar a AIF) es de esperar que sea útil
en el tratamiento y control de numerosas enfermedades neoplásicas.
La reducción de la actividad del polipéptido del AIF (desarrollando
antagonistas, inhibidores, utilización de anticuerpos neutralizantes
o moléculas complementarias, todas producidas como se describe en la
presente memoria) debería dar como resultado la disminución de la
apoptosis. Dicha actividad puede ser deseable para el tratamiento
de varias enfermedades neurodegenerativas que han sido relacionadas
con la estimulación de la apoptosis.
Para identificar compañeros de enlace destinados
al AIF de mamífero, puede utilizarse un sistema de ensayo híbrido
con dos levaduras. El ensayo híbrido con dos levaduras se basa en el
hecho de que muchos activadores eucarióticos de transcripción se
componen de dos dominios operativamente independientes, físicamente
separables. La proteína activadora de transcripción de la levadura
GAL4, por ejemplo, contiene un dominio de enlace al ADN
(GAL4-DB) y un dominio activador de la transcripción
(GAL4-TA). El GAL4-DB reconoce y se
une a una secuencia (UAS), en las zonas corriente arriba de los
genes sensibles a GAL4, mientras que GAL4-TA
interactúa con otros componentes de la maquinaria de transcripción
necesaria para iniciar la transcripción. Se requieren ambos dominios
para activar un gen y, normalmente, los dos dominios son parte de la
misma proteína. Sin embargo, si los dos dominios están físicamente
separados (por ejemplo, por medio de la tecnología del ADN
recombinante) y se expresan en la misma célula huésped, los péptidos
GAL4-DB y TA no interactúan directamente entre sí y
pueden activar genes sensibles (Ma et al., Cell
51:443-446 (1988)):
En un sistema híbrido de dos levaduras, se
utilizan dos vectores de clonación diferentes para generar fusiones
independientes de estos dominios GAL4 que potencialmente interactúan
entre sí. Las proteínas híbridas recombinantes (híbridas del dominio
GAL4 y una proteína de unión potencial) se expresan conjuntamente en
la levadura y se dirigen al núcleo de la levadura. Si los fragmentos
que no son de GAL4 de los dos tipos de híbrido interactúan entre sí,
el GAL4-DB estará ligado a GAL4-TA.
Como resultado de esta interacción el activador de transcripción
GAL4 se reconstituirá operativamente y activará la transcripción de
los genes indicadores que presentan puntos de fijación a GAL4
corriente arriba haciendo detectable fenotípicamente la interacción
proteína-proteína. El sistema híbrido de dos
levaduras se ha utilizado ya sea para cribar bancos para
un(os) gen(es) que codifica(n) una(s)
proteína(s) nueva(s)
que interactúa(n) con una proteína diana conocida o para analizar dos proteínas clonadas previamente, conocida para interacción (Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:9578-9583 (1991), incorporada a la presente memoria como referencia).
que interactúa(n) con una proteína diana conocida o para analizar dos proteínas clonadas previamente, conocida para interacción (Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:9578-9583 (1991), incorporada a la presente memoria como referencia).
Para utilizar el sistema de dos híbridos de
levadura para aislar e identificar nuevas proteínas de unión al AIF,
se clona un ADN del AIF de mamífero completo en el vector
pAS-1 para generar una fusión entre la proteína
diana, AIF, y el dominio de enlace al ADN de GAL4. Esto crea el
"señuelo", la proteína de fusión híbrida
GAL4-AIF. Esta cepa de levadura (Y153), (Bai y
Elledge, Methods in Enzymol.
273:331-347 (1996)) se utiliza para la
transformación y contiene ambos genes indicadors HIS3 y lacZ
dirigidos por activadores que contienen puntos de fijación a GAL4 y
se elimina para GAL4 endógeno (Bai et al., Methods in
Enzymol. 273:331-347 (1996)). Los clones
de levadura transformados con GAL4-AIF de
pAS-1, son cribados para la expresión de la proteína
de fusión GAL4-AIF mediante el análisis de
transferencia Western de los lisados de levadura utilizando los
anticuerpos anti-AIF monoclonales o policlonales
(véase anteriormente). En los clones que expresan a
GAL4-AIF se analiza la activación de la
transcripción del gen HIS3 basándose en su capacidad para
desarrollarse en el medio de His y se analiza la activación de la
transcripción de lacZ, midiendo la actividad de
b-gal utilizando un análisis colorimétrico. En un
intento para cribar las moléculas que se unen al "señuelo"
AIF-proteína, se obtiene un banco de ADNc del
plásmido de los restantes linfocitos T murinos (Staudinger et
al., J. Biol. Chem. 268:4608-4611 (1993).
En este banco, el ADNc obtenido de los linfocitos T restantes se
fusiona con el dominio de activación de la transcripción de GAL4,
GAL4-TA. Asimismo, se utiliza un banco de la fusión
GAL4-TA de embrión de ratón (Clontech, Palo Alto,
CA) para transformar los montajes de la fusión
GAL4-AIF DB que llevan levadura. Los bancos de ADNc
se transfectan en levaduras que llevan los montajes de la fusión
AIF-GAL4 DB y se seleccionan los clones en medio His
enriquecido con aminotriazol 20 mM. Tras 72 horas, se preparan las
réplicas de nitrocelulosa de las colonias transfectadas y se analiza
la actividad de b-galactosidasa directamente por un
método bien conocido en la técnica. Sambrook et al.,
supra. De los 6 \times 10^{6} clones cribados del banco
de linfocitos T y de los 3 \times 10^{6} clones cribados del
banco de embrión de ratón, se seleccionaron cuarenta y dos clones
positivos y los ADNc aislados. En los ADNc aislados se comprobó el
tamaño de la inserción y se introdujeron en una segunda cepa de
levadura (Y 187) (Bai y Elledge, Methods in Enzymol.
273:331-347 (1996)). La finalidad de esta
etapa es doble, en primer lugar en el ADNc aislado puede analizarse
la actividad de b-gal sola, o cuando se cruza con
una levadura que lleva GAL-AIF o GAL4 puede
fusionarse con otras proteínas no relacionadas. Esto elimina
cualquier falso positivo. Se analiza la actividad de
b-gal en los cruzamientos entre Y153 que lleva el
plásmido GAL4-AIF e Y187 que lleva la fusión
GAL4-ADNc para confirmar los clones positivos.
Después de este procedimiento, se eliminan los clones como falsos
positivos. Los clones se clasifican en falsos positivos si eran
positivos para la actividad de b-gal o de si mismos
o cuando se cruzan con Y153 que lleva el dominio de enlace del ADN
solo.
Los clones restantes aislados en esta primera
ronda de cribado se clasifican interactuando específicamente con el
AIF basándose en los siguientes criterios: 1) la levadura que
expresa tanto al ADNc como a las proteínas híbridas de AIF son
capaces de desarrollarse en el medio His y son positivas para la
actividad de b-gal; 2) el ADNc aislado transformado
en Y187 son negativos para la activación de HIS3 y lacZ
cuando se cruzan con la levadura que lleva el dominio de enlace del
ADN de GAL4 solo; y 3) cuando se cruzan con Y153, que contiene
GAL4-AIF, se reestablece la capacidad para
transactivar ambos montajes indicadores, pero el cruce de los
montajes de ADNc con otras fusiones de GAL4 no produjo la activación
de la transcripción.
Se realiza también el cribado de un banco cebado
al azar procedente de un embrión de ratón (día 11,5) (disponible en
el mercado en Clontech). La utilización de un banco cebado aleatorio
permite la detección de proteínas de enlace al AIF, que requieren
las secuencias con amino terminal para el enlace. Asimismo,
utilizando un banco de un tejido diferente, se detectaron los ADNc
no representados en el banco de linfocitos T. Por último, el
aislamiento con repetición de las moléculas relacionadas de dos
bancos diferentes apoya la legitimidad de la interacción que se está
detectando.
<110> AMGEN CANADÁ, INC.
\hskip1cm CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN
CIENTÍFICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> FACTOR INDUCTOR DE APOPTOSIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/109,595
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-11-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1932
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<231> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1887)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor inductor de apoptosis de
ratón (AIFm);
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 629
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 612
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor inductor de apoptosis en
ratones (mAIF); mAIF-Gold.B1B; polipéptido
maduro
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1920
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1875)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Factor inductor de apoptosis en
ratones (isoforma mAIF);
mAIF-alt-exon-Gold
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 625
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 608
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor inductor de apoptosis en
ratontes ( isoforma mAIF);
mAIF-alt-exon-Gold;
polipéptido maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1906
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1881)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor inductor de apoptosis en
humanos (hAIF); hAIF-Gold
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 627
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 613
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor inductor de apoptosis en
humanos (hAIF); hAIF-Gold; polipéptido maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1894
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1869)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor inductor de apoptosis en
humanos (isoforma hAIF # 1);
hAIF-alt-exon-Gold
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 623
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 609
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor inductor de apoptosis en
humanos (isofoma hIFA # 1);
hAIF-alt-exon-Gold;
pilipéptidos madura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1762
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (79)..(1737)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor inductor de apoptosis en
humanos (isoforma hAIF #2);
hAIF-exon-skip-Gold
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 526
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor inductor de apoptosis
(isoforma hAIF #2);
hAIF-exon-skip-Gold;
polipéptido maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggtgcgtg gaaggaaaag gaagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgccagggat ggaaaagtgc ttgtg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripció de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagttcctc agatcagggc acc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<219> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaacacca actgtgggca aac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripció de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcgatagg gctggagcag agg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripció de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttccatggt ccagttgctg agg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripció de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagccacgtg gtctgtttga cccgttcg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripció de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagttctgc atttacccgg aagccacc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripció de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaggaaag ggaaggagga ggtc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripció de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgccaattc cactgtgggg cttc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (54)
1. Polinucleótido aislado que codifica un factor
inductor de apoptosis de mamífero, seleccionándose dicho
polinucleótido de entre el grupo constituido por ADNc y ADN
sintetizado químicamente, en el que el factor inductor de apoptosis
de mamífero es el factor inductor de apoptosis murino, y en el que
el factor inductor de apoptosis murino comprende la secuencia de
aminoácidos presentada en la SEC. ID. nº: 2 o en la SEC. ID. nº:
3.
2. Polinucleótido aislado que codifica un factor
inductor de apoptosis de mamífero, seleccionándose dicho
polinucleótido de entre el grupo constituido por ADNc y ADN
sintetizado químicamente, en el que el factor inductor de apoptosis
de mamífero es una isoforma del factor inductor de apoptosis murino,
y en el que dicha isoforma del factor inductor de apoptosis murino
comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC. ID. nº:
5 o en la SEC. ID. nº: 6.
3. Polinucleótido aislado que codifica un factor
inductor de apoptosis de mamífero, seleccionándose dicho
polinucleótido de entre el grupo constituido por ADNc y ADN
sintetizado químicamente, en el que el factor inductor de apoptosis
de mamífero es el factor inductor de apoptosis humano, y en el que
el factor inductor de apoptosis humano comprende una secuencia de
aminoácidos presentada en la SEC. ID. nº: 8 o en la SEC. ID. nº:
9.
4. Polinucleótido aislado que codifica un factor
inductor de apoptosis de mamífero, seleccionándose dicho
polinucleótido de entre el grupo constituido por ADNc y ADN
sintetizado químicamente, en el que el factor inductor de apoptosis
de mamífero es una isoforma del factor inductor de apoptosis humano,
y en el que dicha isoforma del factor inductor de apoptosis humano
comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC. ID. nº:
11 o en la SEC. ID. nº: 12.
5. Polinucleótido aislado que codifica un factor
inductor de apoptosis de mamífero, seleccionándose dicho
polinucleótido de entre el grupo constituido por ADNc y ADN
sintetizado químicamente, en el que el factor inductor de apoptosis
de mamífero es una isoforma del factor inductor de apoptosis humano
y en el que dicha isoforma del factor inductor de apoptosis humano
comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC. ID. nº:
14 o en la SEC. ID. nº: 15.
6. Polinucleótido aislado según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polinucleótido codifica un
polipéptido que presenta por lo menos 70 por ciento de identidad
sobre la longitud total para los polipéptidos que comprenden las
secuencias de aminoácidos expuestas en una de las SEC. ID nº: 2, nº
3, nº 5, nº 6, nº 8, nº 9, nº 11, nº 12, nº 14, y nº 15.
7. Polinucleótido aislado según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polinucleótido codifica un
polipéptido que presenta por lo menos el 75 por ciento de identidad
sobre la longitud total para los polipéptidos que comprenden las
secuencias de aminoácidos expuestas en una de las SEC. ID nº: 2, nº
3, nº 5, nº 6, nº 8, nº 9, nº 11, nº 12, nº 14, y nº 15.
8. Polinucleótido aislado según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polinucleótido codifica un
polipéptido que presenta por lo menos el 80 por ciento de identidad
sobre la longitud total para los polipéptidos que comprenden las
secuencias de aminoácidos expuestas en una de las SEC. ID nº: 2, nº
3, nº 5, nº 6, nº 8, nº 9, nº 11, nº 12, nº 14, y nº 15.
9. Polinucleótido aislado según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polinucleótido codifica un
polipéptido que presenta por lo menos el 85 por ciento de identidad
sobre la longitud total para los polipéptidos que comprenden las
secuencias de aminoácidos expuestas en una de las SEC. ID nº: 2, nº
3, nº 5, nº 6, nº 8, nº 9, nº 11, nº 12, nº 14, y nº 15.
10. Polinucleótido aislado según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polinucleótido codifica un
polipéptido que presenta por lo menos el 90 por ciento de identidad
sobre la longitud total para los polipéptidos que comprenden las
secuencias de aminoácidos expuestas en una de las SEC. ID nº: 2, nº
3, nº 5, nº 6, nº 8, nº 9, nº 11, nº 12, nº 14, y nº 15.
11. Polinucleótido aislado según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polinucleótido codifica un
polipéptido que presenta por lo menos el 95 por ciento de identidad
para los polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos
expuestas en una de las SEC. ID nº: 2, nº 3, nº 5, nº 6, nº 8, nº 9,
nº 11, nº 12, nº 14, y nº 15.
12. Polinucleótido aislado que codifica un
factor inductor de apoptosis de mamífero, seleccionándose el
polinucleótido de entre el grupo constituido por:
- (a)
- las moléculas de ADN expuestas en las SEC. ID nº: 1, nº 4, nº 7, nº 10, y nº 13;
- (b)
- las moléculas de ADN que se hibridan, en condiciones de alta severidad, con las moléculas de ADN definidas en (a); y
- (c)
- las moléculas de ADN que codifican una expresión para los aminoácidos codificados por cualquiera de las moléculas de ADN anteriores.
13. Ácido nucleico hibridable marcado de manera
detectable, en condiciones de alta severidad con un polinucleótido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Vector de clonación que comprende un
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
15. Vector de expresión que comprende un
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
16. Vector de expresión que comprende un
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,
asociado operativamente a una secuencia de control de expresión.
17. Vector de expresión según la reivindicación
16, en el que dicha secuencia de control de expresión se selecciona
de entre el grupo constituido por activadores precoces inmediatos de
citomegalovirus humano (CMVh), activadores precoces de
SV-40, activadores precoces de adenovirus,
activadores precoces de polioma virus, activadores tardíos de
SV-40, activadores tardíos de virus de la vacuna,
activadores tardíos de polioma virus, LTR retrovírico, activadores
inducibles, activadores del sistema TAC, activadores del
sistema trp, activadores del sistema TRC, operadores
principales y las zonas activadoras del fago lambda, zonas de
control de la proteína de recubrimiento fd, activador de la
3-fosfoglicerato cinasa, activador de la fosfatasa
ácida, activadores del factor de
\alpha-emparejamiento de levadura.
18. Célula huésped unicelular transformada con
un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
12.
19. Huésped unicelular según la reivindicación
18, en el que la célula huésped se selecciona de entre el grupo
constituido por E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces;
levadura, y células CHO, R11, B-W, LM, CO5 1, CO5
7, BSC1, BSC40, BMT10 y SF9.
20. Huésped unicelular según la reivindicación
19, en el que el huésped unicelular es una levadura seleccionada de
entre el grupo constituido por Saccharomyces, Pichia, Candida,
Hansenula y Torulopsis.
21. Célula de mamífero que contiene un factor
inductor de apoptosis de mamífero que codifica un ADN según las
reivindicaciones 1 a 12, modificada con el fin de permitir la
expresión superior de un factor inductor de apoptosis mediante un
episodio recombinatorio homólogo que consiste en insertar una
secuencia reguladora de la expresión en proximidad funcional al
factor inductor de apoptosis de mamífero que codifica un ADN.
22. Célula de mamífero según la reivindicación
21, en la que la secuencia reguladora de la expresión insertada no
es una secuencia reguladora de la expresión del factor inductor de
apoptosis.
23. Procedimiento para la producción de un
polipéptido del factor inductor de apoptosis codificado por el
polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo el
procedimiento las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar una célula huésped según las reivindicaciones 18 ó 21 en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido del factor inductor de apoptosis; y
- (b)
- recuperar el polipéptido del factor inductor de apoptosis expresado.
24. Ácido nucleico aislado que codifica un
análogo de por lo menos el 70 por ciento de identidad con un factor
inductor de apoptosis de mamífero que comprende la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC. ID. nº: 3 o SEC. ID. nº: 9, en el
que uno o más aminoácidos, en las posiciones del polipéptido que no
son esenciales para la estructura o función, se seleccionan de
entre el grupo constituido por los aminoácidos 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31,
32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,
50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,
69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,
86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,
102, 103, 104, 105, 106, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 116,
117, 118, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131,
132, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 147, 148, 149, 150,
151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163,
164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 174, 175, 176, 177,
178, 179, 180, 181, 182, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191,
192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204,
205, 206, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218,
219, 220, 221, 222, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 232, 234,
235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 24, 245, 246, 247,
248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260,
262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274,
275, 276, 277, 278, 279, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288,
289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301,
302, 303, 304, 306, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 3115, 316, 317,
318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330,
331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343,
344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356,
358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370,
371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 380, 381, 382, 383, 384,
385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 397, 398,
399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 411, 412,
413, 414, 415, 416, 417, 418, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426,
427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 440,
441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 451, 452, 453, 455, 456,
457, 458, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470,
471, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484,
485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497,
498, 499, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511,
512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524,
525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537,
538, 539, 540, 541, 542, 543, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551,
552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564,
565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 574, 575, 576, 577, 578, 579,
580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 592, 593,
594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606,
607, 608, 609, 610, 611 y 612, se sustituye por otro
aminoácido.
25. Factor inductor de apoptosis de mamífero
purificado y aislado, codificado por el polinucleótido según la
reivindicación 1.
26. Factor inductor de apoptosis de mamífero
purificado y aislado, codificado por el polinucleótido según la
reivindicación 2.
27. Factor inductor de apoptosis de mamífero
purificado y aislado, codificado por el polinucleótido según la
reivindicación 3.
28. Factor inductor de apoptosis de mamífero
purificado y aislado, codificado por el polinucleótido según la
reivindicación 4.
29. Factor inductor de apoptosis de mamífero
purificado y aislado, codificado por el polinucleótido según la
reivindicación 5.
30. Factor inductor de apoptosis de mamífero
purificado y aislado, que comprende la secuencia de aminoácidos
expuesta en la SEC. ID. nº: 9, en la que uno o más aminoácidos de
entre las posiciones 1 a 612 se sustituye por el aminoácido en las
posiciones 1 a 612 alineadas de la SEC. ID. nº: 3.
31. Anticuerpo que se une específicamente al
factor inductor de apoptosis humano según las reivindicaciones 27,
28, 29 ó 30.
32. Anticuerpo que se une específicamente al
factor inductor de apoptosis murino según las reivindicaciones 25 ó
26.
33. Anticuerpo según la reivindicación 31, que
es un anticuerpo monoclonal.
34. Anticuerpo según la reivindicación 32, que
es un anticuerpo monoclonal.
35. Derivado del factor inductor de apoptosis de
mamífero según las reivindicaciones 25 a 30, que presenta una o más
fracciones químicas unidas a éste opcionalmente en un vehículo
aceptable.
36. Derivado según la reivindicación 35, en el
que uno o más de dichas fracciones químicas es un polímero soluble
en agua.
37. Derivado según la reivindicación 36, en el
que pol soluble en agua se selecciona de entre el grupo constituido
por polietilenglicol (PEG),
monometoxi-polietilenglicol, homolímeros de
propilenglicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de
etileno, polioles polioxietilados, polivinilpirrolidona,
poli-1,3-dioxolano,
poli-1,3,6-trioxano, copolímero de
etileno/anhídrido maleico, homopolímeros de poliaminoácidos,
copopolímeros aleatorios de poliaminoácidos,
poli(n-vinilpirrolidona)-polietilenglicol
y alcohol polivinílico.
38. Procedimientos para la determinación de la
presencia del factor inductor de apoptosis de mamífero según las
reivindicaciones 25 a 30 en una muestra biológica que comprende las
etapas siguientes:
- (a)
- obtener una muestra biológica;
- (b)
- exponer dicha muestra biológica a un anticuerpo específico para el factor inductor de apoptosis de mamífero según las reivindicaciones 31 a 34; y
- (c)
- detectar el enlace del anticuerpo específico para el factor inductor de apoptosis de mamífero en dicha muestra biológica.
39. Reactivo de diagnóstico que comprende un
polinucleótido marcado de manera detectable que codifica parte o la
totalidad del factor estimulante de apoptosis humano según las
reivindicaciones 27 a 29.
40. Reactivo de diagnóstico que comprende un
polinucleótido marcado de manera detectable que codifica parte o la
totalidad del factor estimulante de apoptosis murino según las
reivindicaciones 25 y 26.
41. Reactivo para diagnóstico según la
reivindicación 39 ó 40, en el que dicho polinucleótido marcado es
un ADN.
\newpage
42. Reactivo para diagnóstico según la
reivindicación 39 ó 20, en el que dicho polinucleótido marcado es
un ADN de primera cadena.
43. Procedimiento para la determinación de la
presencia de una molécula de polinucleótido específica para el
factor inductor de apoptosis de mamífero en una muestra biológica
que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- recoger una muestra biológica;
- (b)
- aislar las moléculas de polinucleótido de dicha muestra biológica;
- (c)
- hibridar a dichas moléculas de polinucleótido un reactivo de diagnóstico según la reivindicación 39 ó 40; y
- (d)
- detectar el enlace de las moléculas de polinucleótido específicas para el factor inductor de apoptosis de mamífero en dichas muestras biológicas.
44. Procedimiento para la determinación de la
presencia de una molécula de polinucleótido específica para el
factor inductor de apoptosis de mamífero en una muestra tisular o
celular que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- recoger una muestra tisular o celular;
- (b)
- hibridar dicha muestra tisular o celular con un reactivo de diagnóstico según la reivindicación 39 ó 40; y
- (c)
- detectar el enlace de las moléculas de polinucleótido específicas para el factor inductor de apoptosis de mamífero en la muestra tisular o celular a dicho reactivo de diagnóstico.
45. Procedimiento según la reivindicación 43 ó
44, en el que dicha molécula de polinucleótido es el ADN.
46. Procedimiento según la reivindicación 43 ó
44, en el que dicha molécula de polinucleótido es el ARN.
47. Composición que comprende un factor inductor
de apoptosis de mamífero purificado y aislado según la
reivindicación 25 y un vehículo aceptable, diluyente y/o
adyuvante.
48. Composición que comprende un factor inductor
de apoptosis de mamífero purificado y aislado según la
reivindicación 26 y un vehículo aceptable, diluyente y/o
adyuvante.
49. Composición que comprende un factor inductor
de apoptosis de mamífero purificado y aislado según la
reivindicación 27 y un vehículo aceptable, diluyente y/o
adyuvante.
50. Composición que comprende un factor inductor
de apoptosis de mamífero purificado y aislado según la
reivindicación 28 y un vehículo aceptable, diluyente y/o
adyuvante.
51. Composición que comprende un factor inductor
de apoptosis de mamífero purificado y aislado según la
reivindicación 29 y un vehículo aceptable, diluyente y/o
adyuvante.
52. Utilización de cualquiera de las
composiciones según las reivindicaciones 47 a 51 como
medicamento.
53. Utilización de cualquiera de las
composiciones según las reivindicaciones 47 a 51 para la preparación
de un medicamento destinado a inhibir la proliferación celular.
54. Utilización del factor inductor de apoptosis
de mamífero purificado y aislado según las reivindicaciones 25 a 30
para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la
proliferación celular.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10959598P | 1998-11-23 | 1998-11-23 | |
| US109595P | 1998-11-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2274656T3 true ES2274656T3 (es) | 2007-05-16 |
Family
ID=22328524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99968001T Expired - Lifetime ES2274656T3 (es) | 1998-11-23 | 1999-11-23 | Factor inductor de apoptosis. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1131434B1 (es) |
| AT (1) | ATE342975T1 (es) |
| AU (1) | AU2455600A (es) |
| CA (1) | CA2352467C (es) |
| DE (1) | DE69933690T2 (es) |
| ES (1) | ES2274656T3 (es) |
| WO (1) | WO2000031254A2 (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001016373A2 (en) * | 1999-08-27 | 2001-03-08 | Mitokor | Assaying of mitochondrial intermembrane space protein translocation |
| US20030077826A1 (en) * | 2001-02-02 | 2003-04-24 | Lena Edelman | Chimeric molecules containing a module able to target specific cells and a module regulating the apoptogenic function of the permeability transition pore complex (PTPC) |
| US20040106119A1 (en) * | 2002-04-19 | 2004-06-03 | Pedro Alzari | Crystal structure of the mouse apoptosis-inducing factor AIF and applications of such structural data to structure-based identification, screening, or design of AIF agonists or antagonists as well as AIF fragments, mutants or variants |
| WO2004046180A2 (en) * | 2002-11-15 | 2004-06-03 | Institut Gustave-Roussy | Chemosensitization by a non-apoptogenic heat shock protein 70-binding apoptosis inducing factor mutant add70 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5750653A (en) * | 1995-06-07 | 1998-05-12 | The Regents Of The University Of California | Protein, FAF1, which potentiates Fas-mediated apoptosis and uses thereof |
| US6030945A (en) * | 1996-01-09 | 2000-02-29 | Genentech, Inc. | Apo-2 ligand |
| US5712115A (en) * | 1996-03-19 | 1998-01-27 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human cell death-associated protein |
| WO2000020604A2 (en) * | 1998-10-06 | 2000-04-13 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Oxidoreductase molecules |
-
1999
- 1999-11-23 ES ES99968001T patent/ES2274656T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-23 WO PCT/IB1999/002109 patent/WO2000031254A2/en not_active Ceased
- 1999-11-23 AU AU24556/00A patent/AU2455600A/en not_active Abandoned
- 1999-11-23 CA CA2352467A patent/CA2352467C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-23 AT AT99968001T patent/ATE342975T1/de active
- 1999-11-23 DE DE69933690T patent/DE69933690T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-23 EP EP99968001A patent/EP1131434B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000031254A9 (en) | 2001-04-05 |
| WO2000031254A3 (en) | 2000-11-30 |
| WO2000031254A2 (en) | 2000-06-02 |
| DE69933690T2 (de) | 2007-08-23 |
| EP1131434B1 (en) | 2006-10-18 |
| CA2352467C (en) | 2011-07-26 |
| AU2455600A (en) | 2000-06-13 |
| ATE342975T1 (de) | 2006-11-15 |
| DE69933690D1 (de) | 2006-11-30 |
| EP1131434A2 (en) | 2001-09-12 |
| CA2352467A1 (en) | 2000-06-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2000515734A (ja) | ヒトｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼインヒビターホモログ | |
| CN116785403A (zh) | 用于阻止或减缓前列腺癌的进展的神经丝肽 | |
| US20030050236A1 (en) | Compounds that enhance tumor death | |
| US7371834B2 (en) | Apoptosis-inducing factor | |
| AU760466B2 (en) | A novel inhibitor of programmed cell death | |
| JP2002523089A (ja) | タンパク質輸送関連分子 | |
| US6472508B1 (en) | Human tumor suppressor | |
| US6545129B1 (en) | Human selenoprotein | |
| US6534275B1 (en) | Cellubrevin homologs | |
| EP1131434B1 (en) | Apoptosis-inducing factor | |
| US20020102649A1 (en) | Human transport protein homologs | |
| US20040208880A1 (en) | Targeting cellular entry, cell survival, and pathogenicity by dynein light chain 1/PIN in human cells | |
| JP2001515352A (ja) | タンパク質キナーゼｃインヒビタ様タンパク質（ｉｐｋｃ−２） | |
| US7404952B2 (en) | Protein disulfide isomerase and ABC transporter homologous proteins involved in the regulation of energy homeostasis | |
| US5759812A (en) | Human selenium-binding protein | |
| JP2003521902A (ja) | 卵特異的表面タンパク質 | |
| US6280733B1 (en) | Microtubule-associated protein | |
| AU2003231196C1 (en) | Androgen-regulated PMEPA1 and cancer | |
| JP2001521385A (ja) | ヒト腫瘍関連膜タンパク質 | |
| JPH11146795A (ja) | 重炭酸ナトリウム共輸送体ファミリーのメンバーである ｈｎｂｃ１ａ | |
| CA2340617A1 (en) | Genes associated with neurotransmitter processing | |
| US20120213789A1 (en) | New Molecular Target for Treatment of Cancer | |
| JP2005502301A (ja) | ヒトｉｓｒｅ結合タンパク質 | |
| WO2003072712A2 (en) | A novel protein for inhibiting tumor progression and increasing nerve regeneration | |
| AU2002308110A1 (en) | Protein disulfide isomerase and ABC transporter homologous proteins involved in the regulation of energy homeostasis |