JPH11146795A - 重炭酸ナトリウム共輸送体ファミリーのメンバーである ｈｎｂｃ１ａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 HNBC1Aポリペプチドおよびポリヌクレオチド
並びに前記ポリペプチドの組換え法による生産方法を提
供する。 【解決手段】 配列番号２のHNBC1Aポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列、またはHNBC1Aヌクレオチド配
列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなるポリ
ヌクレオチドを単離する。 【効果】 HNBC1Aポリペプチドおよびポリヌクレオチド
は虚血性心疾患、不整脈、うっ血性心疾患、卒中および
腎不全を含む機能障害または疾病の治療と、このような
症状の診断アッセイに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
スプライス変異体ポリヌクレオチド、このポリヌクレオ
チドによりコードされるポリペプチド、前記のポリヌク
レオチドおよびポリペプチドの使用、並びにその生産方
法に関する。より詳細には、本発明のポリヌクレオチド
およびポリペプチドは重炭酸ナトリウム共輸送体(sodiu
m bicarbonate co-transporter)ファミリーに関係して
おり、以後NBC1Aと記す。本発明はまた、このようなポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドの作用を阻害または
活性化することに関する。

【０００２】

【従来の技術】本明細書中で「Na⁺/HCO₃ ^-共輸送体」と
称する重炭酸ナトリウム共輸送体は、細胞内pHの調節に
関与する機構の一つである。心筋虚血の最中に生じたア
シドーシスがこの系を刺激する。Na⁺/HCO₃ ^-共輸送体を
介したプロトンの排出はNa⁺の細胞内取り込みを伴い、N
a⁺/Ca²⁺交換輸送体の逆モードの機能によりさらに危険
なCa²⁺過負荷を引き起こす。このことは、Na⁺/HCO₃ ^-共
輸送体の特異的阻害が虚血時の細胞損傷を減少させると
いう点で有益でありうることを暗示している。最近にな
って、ヒト腎重炭酸ナトリウム輸送体(NBC)について記
載された(Burnhamら、J. Biol Chem, 272;19111-19114,
1997)。さらに、Ambystoma tigrinumの電気発生性重炭
酸ナトリウム共輸送体についても記載された(Romero
ら、Nature, 387; 409-413,1997)。こうしたことは、重
炭酸ナトリウム共輸送体ファミリーのメンバーに治療用
ターゲットとしての有用な使用法があることを示してい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】したがって、虚血性心
疾患、不整脈、うっ血性心疾患、卒中および腎不全を含
むがこれらに限らない、機能障害または疾病を予防し、
改善し、治療する上で何らかの役割を果たす重炭酸ナト
リウム共輸送体ファミリーの新たなメンバーを同定して
特性付ける必要性が存在している。本発明のHNBC1Aポリ
ヌクレオチドはヒトNBC遺伝子のスプライス変異体であ
る。配列番号2のポリペプチド配列は、C末端の994個の
アミノ酸残基において、発表されたNBCポリペプチド配
列(Burnhamら、J. Biol Chem, 272;1911 1-19114,1997)
と同一であるが、ただし発表された配列では256位がセ
リンであるのに対し、配列番号２では対応位置がフェニ
ルアラニンである。配列番号２のN末端の85個のアミノ
酸残基は発表されたNBCポリペプチド配列のN末端の41個
のアミノ酸残基とは異なる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、一つの態様に
おいて、HNBC1Aポリペプチドおよび組換え物質、並びに
その生産方法に関する。本発明のもう一つの態様はHNBC
1Aポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関
する。こうした使用には、とりわけ、虚血性心疾患、不
整脈、うっ血性心疾患、卒中および腎不全の治療が含ま
れる。他の態様では、本発明は、本発明により提供され
る物質を用いてアゴニストおよびアンタゴニストを同定
する方法、並びに同定された化合物を用いてHNBC1Aの平
衡異常と関連した状態を治療することに関する。本発明
のさらに他の態様は、不適当なHNBC1A活性またはHNBC1A
レベルと関連した疾病を検出するための診断アッセイに
関する。

【０００５】定義 下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理
解しやすくするためのものである。「HNBC1A」とは、特
に、一般的には配列番号２で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドまたはそのアレリック変異体を意味す
る。「HNBC1A活性もしくはHNBC1Aポリペプチド活性」ま
たは「HNBC1AもしくはHNBC1Aポリペプチドの生物学的活
性」とは、類似の活性、向上した活性、または望ましく
ない副作用が低下したこれらの活性を含めて、HNBC1Aの
代謝的または生理的機能を意味する。さらに、前記HNBC
1Aの抗原的および免疫原的活性も含まれる。「HNBC1A遺
伝子」とは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドまたはそのアレリック変異体お
よび／またはそれらの相補体を意味する。

【０００６】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロ
ブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメン
トが含まれる。「単離された」とは、天然の状態から
「人間の手によって」改変されたことを意味する。「単
離された」組成物または物質が天然に存在するのであれ
ば、それはそのもとの環境から変化しているか移動して
おり、またはその両方である。例えば、生存している動
物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然
状態の共存物質から分離されたポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単
離された」ものである。

【０００７】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意の
ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオ
チドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤ
ＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得
る。「ポリヌクレオチド」には、制限するものではない
が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、
一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡ
とＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、または
より典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。加えて、
「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮ
ＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポ
リヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩
基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または
他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたは
ＲＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチ
ル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基があ
る。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾が行わ
れてきた。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界
に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的
または代謝的に修飾された形態、並びにウイルスおよび
細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含
する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴ
ヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドも
包含する。

【０００８】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合また
は修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソ
スター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任
意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプ
チド」は短鎖（通常はペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質とい
う）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コ
ード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリ
ペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロ
セスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいず
れかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾
は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究文献
に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側
鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含めてポリペプチ
ドのどこでも行うことができる。同じタイプの修飾が所
定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさ
まざまに異なる程度で存在してもよい。また、所定のポ
リペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。
ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、
分枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝
した、または分枝した環状のポリペプチドは翻訳後の天
然プロセスから生じることがあり、また、合成法によっ
て製造することもできる。修飾としては、アセチル化、
アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの
共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌ
クレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の
共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架
橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有
架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形
成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、
ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチ
ル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リ
ン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転
移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。例えば、
PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd
Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Ne
w York, 1993; POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICAT
ION OF PROTEINS, B.C. Johnson 編, Academic Press,
New York,1983中のWold, F., Posttranslational Prote
in Modifications: Perspectivesand Prospects, pgs.
1-12; Seifter ら, “Analysis for protein modificat
ions and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (199
0) 182:626-646;および Rattan ら, “Protein Synthes
is: Posttranslational Modifications and Aging",Ann
NY Acad Sci (1992) 663:48-62を参照のこと。

【０００９】本明細書中で用いる「変異体」とは、基準
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不
可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変
異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で
相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基
準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。ヌクレ
オチドの変化は、以下で述べるように、基準配列により
コードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付
加、欠失、融合および末端切断（トランケーション）を
生じさせることができる。典型的なポリペプチドの変異
体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。
一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列が
全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるよ
うな相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意
に組み合わせた１以上の置換、付加、欠失によりアミノ
酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミ
ノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであっ
ても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドの変異体はアレリック変異体のように天然に存在す
るものでも、天然に存在することが知られていない変異
体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法または
直接合成により調製することができる。

【００１０】「同一性」はヌクレオチド配列またはアミ
ノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最大級の整合
（一致）が得られるように配列を並べる。「同一性」そ
れ自体は当技術分野で認識された意味をもち、発表され
た技法を使って計算することができる。例えば、COMPUT
ATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M. 編, OxfordUn
iversity Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFO
RMATICS AND GENOMEPROJECTS, Smith, D.W. 編, Academ
ic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQ
UENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin, H.
G. 編, HumanaPress, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANA
LYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academ
ic Press, 1987; および SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, G
ribskov, M. and Devereux, J.編, M Stockton Press,
New York, 1991を参照のこと。２つのポリヌクレオチド
またはポリペプチド配列間の同一性を決定する方法は多
数存在していると同時に、「同一性」なる用語は当業者
には公知である (Carillo, H. and Lipton, D., SIAM J
Applied Math (1988) 48:1073) 。２つの配列間の同一
性または類似性を決定するために汎用される方法として
は、Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop 編,
Academic Press, San Diego, 1994 およびCarillo, H.
and Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48:1073
に記載される方法があるが、これらに限らない。同一
性および類似性の決定方法はコンピュータプログラムに
集成されている。２つの配列間の同一性および類似性を
決定するための好適なコンピュータプログラム法として
は、GCGまたはLasergene ソフトウェアパッケージがあ
るが、これらに限らない。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチド 一つの態様において、本発明はHNBC1Aポリペプチド（ま
たはHNBC1Aタンパク質）に関する。このHNBC1Aポリペプ
チドには、配列番号２のポリペプチドだけでなく、配列
番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。
HNBC1AポリペプチドはHNBC1Aの少なくとも１つの生物学
的活性を示すことが好ましい。

【００１２】HNBC1Aポリペプチドは「成熟」タンパク質
の形であっても、融合タンパク質のような、より大きい
タンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のア
ミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミ
ノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ配
列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、ま
たは組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列など
がある。

【００１３】また、HNBC1Aポリペプチドの断片も本発明
に含まれる。こうした断片は全体的に前記HNBC1Aポリペ
プチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部とは
同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
HNBC1Aポリペプチドと同様に、断片は「フリースタンデ
ィング」（それ自体で独立）していても、より大きいポ
リペプチド内に含まれていてもよく、つまりその大きい
ポリペプチドの一部または一領域、最も好ましくは一つ
の連続領域、を断片が構成していてもよい。本発明のポ
リペプチド断片の代表的な例として、およその見当でア
ミノ酸番号１−２０、２１−４０、４１−６０、６１−
８０、８１−１００、および１０１からHNBC1Aポリペプ
チドの末端までの断片が挙げられる。ここで、「およ
そ」とは、上記の範囲の一端または両端で数個、５個、
４個、３個、２個または１個のアミノ酸が増えたり減っ
たりした範囲を含むものである。

【００１４】好適な断片としては、例えば、アミノ末端
を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連
の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキ
シル末端を含むものとの二連の残基の欠失を除いた、HN
BC1Aポリペプチドのアミノ酸配列を有するトランケーシ
ョン(truncation)ポリペプチドが含まれる。また、αヘ
リックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシート
形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル形
成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β
両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合領
域、および高抗原指数領域を含む断片のような、構造的
または機能的特性により特徴づけられる断片も好適であ
る。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片であ
る。生物学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、
その活性が向上した断片、または望ましくない活性が減
少した断片を含めて、HNBC1A活性を媒介するものであ
る。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫
原性がある断片も含まれる。

【００１５】これらのポリペプチド断片はどれも、抗原
活性を含めたHNBC1Aの生物学的活性を保持することが好
ましい。特定された配列および断片の変異型も本発明の
一部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置換によ
り対象物と異なるもの、すなわち、ある残基が同様の性
質の他の残基で置換されているものである。典型的なこ
うした置換は、Ala, Val, Leu と Ileの間；Ser とThr
の間；酸性残基 AspとGlu の間；Asn とGln の間；塩基
性残基 LysとArg の間；または芳香族残基 PheとTyr の
間で起こる。特に、数個、５〜１０個、１〜５個または
１〜２個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失または
付加されている変異型が好適である。

【００１６】本発明のHNBC1Aポリペプチドは任意の適当
な方法で製造することができる。このようなポリペプチ
ドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組換
え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造されたポ
リペプチド、またはこれらの方法の組合せにより製造さ
れたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチド
の製造のための手段は当業界でよく理解されている。

【００１７】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう一つの態様はHNBC1Aポリヌクレオチドに関
する。HNBC1Aポリヌクレオチドには、HNBC1Aポリペプチ
ドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレオチ
ド、並びにこれらと密接に関連したポリヌクレオチドが
含まれる。さらに特定すると、本発明のHNBC1Aポリヌク
レオチドとしては、配列番号２のHNBC1Aポリペプチドを
コードする配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列を
含むポリヌクレオチド、および配列番号１の特定配列を
有するポリヌクレオチドがある。本発明はまた、このよ
うなHNBC1Aポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチ
ドを提供する。

【００１８】本発明のHNBC1Aは、ヒトHNBC1Aをコードす
るｃＤＮＡの配列決定の結果により示されるように、重
炭酸ナトリウム共輸送体ファミリーの他のタンパク質と
構造的に関連している。HNBC1Aはヒト腎NBC(Burnham
ら、J. Biol Chem, 272;19111-19114,1997)のスプライ
ス変異体である。さらに、配列番号2のアミノ酸配列
は、1014個のアミノ酸残基においてAmbystoma tigrinum
の電気発生性重炭酸ナトリウム共輸送体と87.3％の同一
性を有する。したがって、本発明のHNBC1Aポリペプチド
およびポリヌクレオチドは、とりわけ、それらの相同ポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機
能／特性をもつことが予測され、それらの有用性は当業
者には自明である。

【００１９】HNBC1Aをコードする本発明の一つのポリヌ
クレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニ
ングにより、ヒト心臓組織の細胞中のｍＲＮＡから誘導
されたｃＤＮＡライブラリーから、エクスプレスド・シ
ークエンス・タグ（expressed sequence tag: EST)分析
(Adams, M.D. ら, Science (1991) 252:1651-1656;Ada
ms, M.D. ら, Nature (1992) 355:632-634; Adams, M.
D.ら, Nature (1995)377 Supp:3-174) を用いて得るこ
とができる。また、本発明のポリヌクレオチドはゲノム
ＤＮＡライブラリーのような天然源から得ることがで
き、商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成するこ
ともできる。

【００２０】配列番号２のHNBC1Aポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列は、配列番号1中に含まれるポリ
ペプチドコード配列（配列番号１のヌクレオチド番号45
−3284）と同一であっても、遺伝子コードの重複性（縮
重）のため、やはり配列番号２のポリペプチドをコード
する配列であってもよい。

【００２１】本発明のポリヌクレオチドをHNBC1Aポリペ
プチドの組換え生産のために用いる場合、そのポリヌク
レオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列またはそ
の断片単独、他のコード配列（例えば、リーダーもしく
は分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タンパ
ク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするも
の）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプ
チドのコード配列またはその断片が含まれる。例えば、
融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコ
ードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例とし
て、マーカー配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen, Inc.)に
より提供されかつGentz ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA (1989) 86:821-824に記載されるようなヘキサ−ヒス
チジンペプチド、またはＨＡタグである。また、このポ
リヌクレオチドは5'および3'非コード配列、例えば、転
写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポ
リアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍ
ＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。

【００２２】さらに好適な具体例は、数個、５〜１０
個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミ
ノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されて
いる、配列番号２のHNBC1Aポリペプチドのアミノ酸配列
を含むHNBC1A変異型をコードするポリヌクレオチドであ
る。

【００２３】本発明はさらに、前記の配列とハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本
発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌク
レオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で用いる「ストリンジェントな条件」と
は、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも
９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好
ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性があるときだ
けハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。

【００２４】配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列
またはその断片と同一であるか実質的に同一である本発
明のポリヌクレオチドは、HNBC1Aポリペプチドをコード
する全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため
に、また、HNBC1A遺伝子との配列類似性が高い他の遺伝
子（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体
(ortholog)をコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして用
いることができる。このようなハイブリダイゼーション
技法は当業者には公知である。一般的に、これらのヌク
レオチド配列は対象物のヌクレオチド配列と８０％、好
ましくは９０％、より好ましくは９５％同一である。プ
ローブはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含み、好
ましくは３０個以上を含み、５０個以上のヌクレオチド
を有していてもよい。特に好ましいプローブは３０〜５
０個の範囲のヌクレオチドを有するものである。

【００２５】一実施態様において、HNBC1Aポリペプチド
（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体を
含む）をコードするポリヌクレオチドを得ることは、配
列番号１のヌクレオチド配列またはその断片を有する標
識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニン
グし、前記のポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡ
およびゲノムクローンを単離する各工程を含んでなる。
かくして、もう一つの態様では、本発明のHNBC1Aポリヌ
クレオチドはさらに、配列番号１のヌクレオチド配列ま
たはその断片とストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配
列を含むものである。HNBC1Aポリペプチドも、前記のハ
イブリダイゼーション条件により得られたヌクレオチド
配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリ
ペプチドを含む。このようなハイブリダイゼーション技
法は当業者に公知である。ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件は上で定義したとおりであるか、ま
たは、50% ホルムアミド、５×SSC (150mM NaCl, 15mM
クエン酸三ナトリウム) 、50mMリン酸ナトリウム (pH7.
6)、５×Denhardt溶液、10% デキストラン硫酸および20
μg/mlの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡを含有する溶液
中で４２℃で一夜インキュベートし、次いでフィルター
を 0.1×SSC中約６５℃で洗浄する条件である。

【００２６】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、動物およびヒトの疾病に対する治療薬および診
断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利
用することができる。

【００２７】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベ
クター、このベクターにより遺伝子操作された宿主細
胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの生産
に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ
を用いてこの種のタンパク質を生産するための無細胞翻
訳系も使用することができる。

【００２８】組換え体生産に関しては、本発明のポリヌ
クレオチドの発現系またはその一部を組み入れるため
に、宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌ
クレオチドの導入は、Davis ら, BASIC METHODS IN MOL
ECULAR BIOLOGY (1986) およびSambrook ら, MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.
Y. (1989) などの多くの標準的な実験室マニュアルに記
載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェ
クション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェク
ション、トランスベクション(transvection)、マイクロ
インジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェク
ション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレー
プローディング(scrape loading)、弾丸導入(ballistic
introduction)または感染により行うことができる。

【００２９】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞
（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸
菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵
母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ
２、スポドプテラＳｆ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ 29
3、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられ
る。

【００３０】多種多様な発現系を使用することができ
る。こうした発現系として、特に、染色体、エピソーム
およびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由
来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵
母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エ
レメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ
４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レ
トロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せ
に由来するベクター、例えば、コスミドやファージミド
のようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素
に由来するものがある。この発現系は発現を起こさせる
だけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよ
い。一般的に、宿主内でのポリペプチドの産生のために
ポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現するのに適し
た系またはベクターはどれも使用することができる。Sa
mbrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL
(前掲) に記載されるような、日常的に用いられる公知
の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発
現系に挿入することができる。

【００３１】翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、
細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるため
に、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込
むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチ
ドに対して内因性であっても、異種シグナルであっても
よい。

【００３２】スクリーニングアッセイで使用するためHN
BC1Aポリペプチドを発現させようとする場合、一般に、
そのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適
である。この場合は、スクリーニングアッセイでの使用
に先立って細胞を回収する。HNBC1Aポリペプチドが培地
に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製す
るために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、
その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収す
る必要がある。

【００３３】組換え細胞培養物からHNBC1Aポリペプチド
を回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノ
ール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマ
トグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、
疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグ
ラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公
知の方法を用いることができる。最も好ましくは、高速
液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリペプ
チドが単離および／または精製中に変性されるときは、
タンパク質を再生させるための公知の技法を用いて、活
性のあるコンフォメーションを復元することが可能であ
る。

【００３４】診断アッセイ 本発明はまた、診断薬としてのHNBC1Aポリヌクレオチド
の使用に関する。機能障害と関連したHNBC1A遺伝子の変
異型の検出は、HNBC1Aの過少発現、過剰発現または変化
した発現により生ずる疾病またはその罹病性の診断に追
加しうる、またはその診断を下しうる診断用ツールを提
供するだろう。HNBC1A遺伝子に変異がある個体を、さま
ざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すことができ
る。

【００３５】診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血
液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ること
ができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用して
も、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に
増幅してもよい。同様の方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを
使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常な
遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化によ
り検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識HNBC1Aヌ
クレオチド配列とハイブリダイズさせることで同定でき
る。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とはＲ
Ｎアーゼ消化により、または融解温度の差異により区別
できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を用いるも
しくは用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度
の変化により、または直接ＤＮＡ配列決定によっても検
出できる（例えば、Myers ら, Science (1985) 230:124
2 を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレアー
ゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよび
Ｓ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確
認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19
85) 85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様では、
例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを行う
ため、HNBC1Aヌクレオチド配列またはその断片を含むオ
リゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することがで
きる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有
し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含め
た分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用い
られている（例えば、M. Chee ら, Science, Vol.274,
pp.610-613 (1996) を参照のこと）。

【００３６】診断アッセイは、前記の方法によりHNBC1A
遺伝子の変異を検出することで、虚血性心疾患、不整
脈、うっ血性心疾患、卒中および腎不全への罹りやすさ
を診断または判定する方法を提供する。

【００３７】さらに、被験者から得られたサンプルから
HNBC1AポリペプチドまたはHNBC1AｍＲＮＡのレベルの異
常な低下または増加を測定する方法により、虚血性心疾
患、不整脈、うっ血性心疾患、卒中および腎不全の診断
を下すことができる。発現の低下または増加は、当技術
分野で公知のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例え
ばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、
ノーザンブロット、その他のハイブリダイゼーション法
によりＲＮＡレベルで測定することができる。宿主から
得られたサンプル中のHNBC1Aポリペプチドのようなタン
パク質のレベルを測定するためのアッセイ法は当業者に
よく知られている。こうしたアッセイ法として、ラジオ
イムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロッ
ト分析、ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。

【００３８】かくして、もう一つの態様において、本発
明は、疾病（特に虚血性心疾患、不整脈、うっ血性心疾
患、卒中および腎不全）またはこのような疾病への罹り
やすさを診断するためのキットに関し、このキットは、
(a) HNBC1Aポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１
のヌクレオチド配列）もしくはその断片、(b) (a) のヌ
クレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、(c) HNBC
1Aポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチ
ド）もしくはその断片、または(d) HNBC1Aポリペプチド
（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対する抗
体、を含んでなる。このようなキットにおいて、(a) 、
(b) 、(c) または (d)が実質的な構成成分であることが
理解されよう。

【００３９】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも有
用である。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置
を標的指向し、その特定位置とハイブリダイズすること
ができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成
することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関さ
せる上で重要な第一段階である。ひとたび配列が正確な
染色体位置にマッピングされたら、その染色体上のその
配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることが
できる。この種のデータは、例えば、V. McKusick, Men
delian Inheritance in Man (Johns Hopkins Universit
yWelch Medical Library からオンラインで入手可能)
中に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマッピン
グされた遺伝子と疾患との関係を連鎖分析（物理的に隣
接した遺伝子の共遺伝）により同定する。

【００４０】患者と正常個体とのｃＤＮＡまたはゲノム
配列の差異も調べることができる。患者の一部または全
部に変異が観察されるが、どの正常個体にも観察されな
い場合は、その変異が疾病の原因である可能性がある。

【００４１】抗体 本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、
またはそれらを発現する細胞は、HNBC1Aポリペプチドに
免疫特異的な抗体を産生するための免疫原としても使用
することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従
来技術における他の関連ポリペプチドに対するその親和
性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い親
和性を有することを意味する。

【００４２】HNBC1Aポリペプチドに対する抗体は、慣用
のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）
に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類似体
もしくは細胞を投与することにより得られる。モノクロ
ーナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生
される抗体をもたらす任意の技法を用いることができ
る。例を挙げると、ハイブリドーマ技法 (Kohler, G.お
よびMilstein, C., Nature (1975) 256:495-497)、トリ
オーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法 (Kozbor
ら, Immunology Today (1983) 4:72) およびＥＢＶ−ハ
イブリドーマ技法 (Coleら, MONOCLONAL ANTIBODIES AN
D CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 19
85) などがある。

【００４３】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体
をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,94
6,778 号）を適応させることができる。また、ヒト化抗
体を発現させるために、トランスジェニックマウスまた
は他の哺乳動物を含む他の生物を利用することができ
る。前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する
クローンを単離・同定したり、アフィニティークロマト
グラフィーでそのポリペプチドを精製することもでき
る。HNBC1Aポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、虚
血性心疾患、不整脈、うっ血性心疾患、卒中および腎不
全の治療に使用できる可能性がある。

【００４４】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を
引き出す方法に関し、この方法は、特に虚血性心疾患、
不整脈、うっ血性心疾患、卒中および腎不全から前記動
物を防御するための抗体および／またはＴ細胞免疫応答
を生ずるのに十分なHNBC1Aポリペプチドまたはその断片
を哺乳動物に接種することを含んでなる。本発明のさら
に別の態様は、哺乳動物を疾病から防御する抗体を産生
させるような免疫学的応答を引き出すために、in vivo
でHNBC1Aポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを
介してHNBC1Aポリペプチドを供給することを含んでな
る、哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関
する。

【００４５】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導
入したとき、その哺乳動物においてHNBC1Aポリペプチド
に対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製
剤（組成物）に関し、この組成物はHNBC1Aポリペプチド
またはHNBC1A遺伝子を含有する。ワクチン製剤は適当な
担体をさらに含んでいてもよい。HNBC1Aポリペプチドは
胃の中で分解されうるので、非経口的（皮下、筋肉内、
静脈内、皮内等への注射を含む）に投与することが好ま
しい。非経口投与に適した製剤としては、酸化防止剤、
緩衝液、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液と等張に
する溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、並
びに懸濁化剤または増粘剤を含みうる水性および非水性
の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量容器または
数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で
提供することができ、また、使用直前に無菌の液状担体
を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保管することもで
きる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するた
めのアジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系
や当技術分野で公知の他のアジュバント系を含んでいて
もよい。投与量はワクチンの比活性で変化し、ルーチン
な実験操作により簡単に決定できる。

【００４６】スクリーニングアッセイ 本発明のHNBC1Aポリペプチドは、このポリペプチドを活
性化する化合物（アゴニスト）またはその活性を阻害す
る化合物（アンタゴニスト、または阻害剤ともいう）の
スクリーニング法において使用することができる。こう
して、本発明のポリペプチドは、例えば、細胞、無細胞
調製物、化学物質ライブラリーおよび天然産物の混合物
からアゴニストまたはアンタゴニストを評価し同定する
ためにも用いられる。これらのアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、本発明のポリペプチドの、場合によって、
天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、酵素
などであってよく、また、本発明のポリペプチドの構造
的または機能的な模擬物であってもよい（Coligan ら,
Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter5 (19
91)を参照のこと）。

【００４７】HNBC1Aポリペプチドは多くの病理を含めて
多数の生物学的機能に関与している。したがって、一方
ではHNBC1Aポリペプチドを刺激し、他方ではHNBC1Aポリ
ペプチドの機能を阻害し得る化合物および薬物を見つけ
出すことが望まれる。一般的に、アゴニストは虚血性心
疾患、不整脈、うっ血性心疾患、卒中および腎不全のよ
うな症状の治療および予防目的で用いられる。アンタゴ
ニストは虚血性心疾患、不整脈、うっ血性心疾患、卒中
および腎不全のような症状のさまざまな治療および予防
目的で使用しうる。

【００４８】一般に、こうしたスクリーニング法はHNBC
1Aポリペプチドを発現する適当な細胞、またはHNBC1Aポ
リペプチドに応答する適当な細胞を用いるものである。
この種の細胞には哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ由
来の細胞または大腸菌細胞が含まれる。次いで、HNBC1A
ポリペプチドを発現する細胞（もしくは発現されたポリ
ペプチドを含む細胞膜）またはHNBC1Aポリペプチドに応
答する細胞を試験化合物と接触させて、その結合または
機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。候補化合物
と接触させた細胞の能力を、接触させなかった同一細胞
とHNBC1A活性に関して比較する。

【００４９】これらのアッセイでは候補化合物の結合を
簡単に試験することができ、そこでは候補化合物と直接
または間接に結合された標識により、または標識した競
合物質との競合を用いるアッセイにより、HNBC1Aポリペ
プチドを担持する細胞への付着が検出される。さらに、
これらのアッセイでは、HNBC1Aポリペプチドを担持する
細胞に適した検出系を用いて、候補化合物がHNBC1Aポリ
ペプチドの活性化により生ずるシグナルを結果的にもた
らすか否かを試験することができる。一般的に、活性化
の阻害剤は既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、
そして候補化合物の存在がアゴニストによる活性化に与
える影響が調べられる。

【００５０】さらに、これらのアッセイは、候補化合物
とHNBC1Aポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混合
物をつくり、この混合物中のHNBC1A活性を測定し、そし
てこの混合物のHNBC1A活性を標準と比較する各ステップ
を単に含むだけでよい。

【００５１】また、HNBC1AのｃＤＮＡ、タンパク質また
はこのタンパク質に対する抗体を用いて、細胞内でのHN
BC1AｍＲＮＡまたはタンパク質の生産に及ぼす添加化合
物の作用を検出するためのアッセイを組み立てることが
できる。例えば、当技術分野で公知の標準方法によりモ
ノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、HNBC
1Aタンパク質の分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定
するためのＥＬＩＳＡを構築することができ、これは適
切に操作された細胞または組織からのHNBC1Aの生産を抑
制または増強する物質（それぞれアンタゴニストまたは
アゴニストともいう）の探索に用いることができる。

【００５２】膜結合受容体または可溶性受容体が存在す
るのであれば、当技術分野で公知の標準的な受容体結合
法によりこの種の受容体を同定するためにHNBC1Aタンパ
ク質を用いることができる。こうした受容体結合法に
は、限定するものではないが、リガンド結合および架橋
アッセイがあり、このアッセイでは、HNBC1Aを放射性ア
イソトープ（例：¹²⁵I）で標識するか、化学的に修飾
（例：ビオチン化）するか、または検出や精製に適した
ペプチド配列に融合させ、そして推定上の受容体源（細
胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液など）とイン
キュベートする。その他の方法としては、表面プラズモ
ン共鳴および分光学のような生物物理的方法がある。受
容体の精製およびクローニングに用いることに加えて、
これらの結合アッセイは、もし存在するのであれば、HN
BC1Aのその受容体への結合と競合するHNBC1Aのアゴニス
トまたはアンタゴニストを同定するために用いることも
できる。スクリーニングアッセイを行うための標準的な
方法は当技術分野でよく理解されている。

【００５３】HNBC1Aポリペプチドの潜在的なアンタゴニ
ストの例としては、抗体、ある場合には、HNBC1Aポリペ
プチドのリガンド、基質、受容体、酵素などと密接な関
係があるオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（例え
ば、リガンド、基質、受容体、酵素などの断片）、また
は本発明のポリペプチドと結合するが応答を誘導しない
（それゆえポリペプチドの活性を妨げる）小分子などが
ある。

【００５４】かくして、他の態様において、本発明は、
HNBC1Aポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、リ
ガンド、受容体、基質、酵素など、またはHNBC1Aポリペ
プチドの生産を低下または増加させる化合物を同定する
ためのスクリーニングキットに関し、このキットは、
(a) HNBC1Aポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポ
リペプチド）(b) HNBC1Aポリペプチド（好ましくは、配
列番号２のポリペプチド）を発現する組換え細胞、(c)
HNBC1Aポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペ
プチド）を発現する細胞膜、または(d) HNBC1Aポリペプ
チド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対す
る抗体、を含んでなる。このようなキットにおいて、
(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成成分である
ことが理解されよう。

【００５５】予防および治療法 本発明は、HNBC1Aポリペプチド活性の過剰量と不足量の
どちらにも関係した虚血性心疾患、不整脈、うっ血性心
疾患、卒中および腎不全などの異常な状態の治療法を提
供する。HNBC1Aポリペプチドの活性が過剰である場合
は、いくつかのアプローチが利用可能である。一つのア
プローチは、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素な
どの結合をブロックすることにより、または第２のシグ
ナルを抑制することで異常な状態を軽減することによ
り、HNBC1Aポリペプチドの機能を阻害するのに有効な量
で、前記の阻害剤化合物（アンタゴニスト）を製剤学上
許容される担体とともに患者に投与することを含んでな
る。もう一つのアプローチでは、リガンド、基質、酵
素、受容体などと結合する能力がまだある可溶性形態の
HNBC1Aポリペプチドを、内因性のHNBC1Aポリペプチドと
の競合状態で投与する。このような競合剤の典型的な例
はHNBC1Aポリペプチドの断片である。

【００５６】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を
使って内因性HNBC1Aポリペプチドをコードする遺伝子の
発現を抑制することができる。こうした公知技術は、体
内で生成されるか別個に投与されるアンチセンス配列の
使用を必要とする。例えば、Oligodeoxynucleotides as
Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Pres
s, Boca Raton, FL (1988)中のO'Connor, J Neurochem
(1991) 56:560 を参照のこと。あるいはまた、この遺伝
子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供
給することもできる。例えば、Lee ら, Nucleic Acids
Res (1979) 6:3073; Cooney ら, Science (1988) 241:4
56; Dervanら, Science (1991) 251:1360 を参照のこ
と。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することもで
きるし、関連オリゴマーをin vivo で発現させることも
できる。

【００５７】HNBC1Aおよびその活性の過少発現に関係し
た異常な状態を治療する場合も、いくつかのアプローチ
を取ることができる。一つのアプローチは、治療上有効
な量のHNBC1Aポリペプチドを活性化する化合物（すなわ
ち、前記のアゴニスト）を製剤学上許容される担体とと
もに患者に投与して、異常な状態を緩和することを含ん
でなる。別法として、患者の関連細胞においてHNBC1Aを
内因的に産生させるために遺伝子治療を用いることがで
きる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロウイル
スベクターによる発現のために本発明のポリヌクレオチ
ドを遺伝子操作する。次にレトロウイルス発現構築物を
単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含
有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入さ
れたパッケージング細胞に導入する。その結果、パッケ
ージング細胞は対象の遺伝子を含有する感染性のウイル
ス粒子を産生するようになる。in vivo での細胞処理お
よびin vivo でのポリペプチド発現のために、これらの
産生細胞を患者に投与する。遺伝子治療の概論に関して
は、Human Molecular Genetics, T Strachanand AP Rea
d, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996) 中のChapt
er 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-ba
sed Therapeutic Approaches(およびその中の引用文献)
を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量のHNBC1
Aポリペプチドを適当な製剤学上の担体とともに投与す
ることである。

【００５８】製剤および投与 可溶性形態のHNBC1Aポリペプチドのようなペプチド、ア
ゴニストおよびアンタゴニストペプチド、または小分子
は適当な製剤学上の担体と組み合わせて製剤化すること
ができる。このような製剤は治療上有効な量のポリペプ
チドまたは化合物と、製剤学上許容される担体または賦
形剤を含有する。この種の担体としては、食塩水、生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ル、およびこれらの組合せがあるが、これらに限らな
い。製剤は投与様式に適合させるべきであり、これは当
技術分野の技量の範囲内である。本発明はさらに、前記
の本発明組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器
を含んでなる医薬用パックおよびキットに関する。本発
明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使用して
も、他の化合物、例えば治療用化合物と一緒に使用して
もよい。

【００５９】医薬組成物を全身投与するときの好ましい
形態は、注入（注射）、典型的には静注である。皮下、
筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用でき
る。全身投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、そ
の他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経
皮投与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として
適切に製剤化されているのであれば、経口投与も可能で
ある。これらの化合物は軟膏、ペースト、ゲルなどの剤
形で局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよ
い。

【００６０】必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与
経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左
右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１kgあた
り0.1 〜100 μg の範囲である。利用可能な化合物が多
種多様であり、それぞれの投与経路の効率も異なるた
め、必要とされる投与量は広範に変動することを予想す
べきである。例えば、経口投与は静注による投与よりも
高い投与量を必要とすることが予想される。こうした投
与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されている
ような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整するこ
とができる。

【００６１】治療に用いるポリペプチドは、上述したよ
うな「遺伝子治療」と称する治療法において、患者の体
内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞
を、ex vivo でポリペプチドをコードするＤＮＡまたは
ＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより、例えばレトロ
ウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的に
操作する。その後、この細胞を患者に導入する。

【００６２】本明細書中に引用された、特許および特許
出願明細書を含めた全ての刊行物は、あたかも各刊行物
が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体
を参考としてここに組み入れるものとする。

【００６３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SmithKline Beecham Laboratoires Pharmaceutiques Yale University School of Medicine <120> HNBC1A, A Member of Sodium Bicarbonate Co-Transporter Family <130> PA98-294 <150> EP97401947.3 <151> 1997-8-19 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 3284 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aggagaagtc tgagcattct ttttttcttt tttattacta taggatggag gatgaagctg 60 tcctggacag aggggcttcc ttcctcaagc atgtgtgtga tgaagaagaa gtagaaggcc 120 accataccat ttacatcgga gtccatgtgc cgaagagtta caggagaagg agacgtcaca 180 agagaaagac agggcacaaa gaaaagaagg aaaaggagag aatctctgag aactactctg 240 acaaatcaga tattgaaaat gctgatgaat ccagcagcag catcctaaaa cctctcatct 300 ctcctgctgc agaacgcatc cgattcatct tgggagagga ggatgacagc ccagctcccc 360 ctcagctctt cacggaactg gatgagctgc tggccgtgga tgggcaggag atggagtgga 420 aggaaacagc caggtggatc aagtttgaag aaaaagtgga acagggtggg gaaagatgga 480 gcaagcccca tgtggccaca ttgtcccttc atagtttatt tgagctgagg acatgtatgg 540 agaaaggatc catcatgctt gatcgggagg cttcttctct cccacagttg gtggagatga 600 ttgttgacca tcagattgag acaggcctat tgaaacctga acttaaggat aaggtgacct 660 atactttgct ccggaagcac cggcatcaaa ccaagaaatc caaccttcgg tccctggctg 720 acattgggaa gacagtctcc agtgcaagta ggatgtttac caaccctgat aatggtagcc 780 cagccatgac ccataggaat ctgacttcct tcagtctgaa tgacatttct gataaaccgg 840 agaaggacca gctgaagaat aagttcatga aaaaattgcc acgtgatgca gaagcttcca 900 acgtgcttgt tggggaggtt gactttttgg atactccttt cattgccttt gttaggctac 960 agcaggctgt catgctgggt gccctgactg aagttcctgt gcccacaagg ttcttgttca 1020 ttctcttagg tcctaagggg aaagccaagt cctaccacga gattggcaga gccattgcca 1080 ccctgatgtc tgatgaggtg ttccatgaca ttgcttataa agcaaaagac aggcacgacc 1140 tgattgctgg tattgatgag ttcctagatg aagtcatcgt ccttccacct ggggaatggg 1200 atccagcaat taggatagag cctcctaaga gtcttccatc ctctgacaaa agaaagaata 1260 tgtactcagg tggagagaat gttcagatga atggggatac gccccatgat ggaggtcacg 1320 gaggaggagg acatggggat tgtgaagaat tgcagcgaac tggacggttc tgtggtggac 1380 taattaaaga cataaagagg aaagcgccat tttttgccag tgatttttat gatgctttaa 1440 atattcaagc tctttcggca attctcttca tttatctggc aactgtaact aatgctatca 1500 cttttggagg actgcttggg gatgccactg acaacatgca gggcgtgttg gagagtttcc 1560 tgggcactgc tgtctctgga gccatctttt gcctttttgc tggtcaacca ctcactattc 1620 tgagcagcac cggacctgtc ctagtttttg agaggcttct atttaatttc agcaaggaca 1680 ataattttga ctatttggaa tttcgccttt ggattggcct gtggtccgcc ttcctatgtc 1740 tcattttggt agccactgat gccagcttct tggttcaata cttcacacgt ttcacggagg 1800 agggcttttc ctctctgatt agcttcatct ttatctatga tgctttcaag aagatgatca 1860 agcttgcaga ttactacccc atcaactcca acttcaaagt gggctacaac actctctttt 1920 cctgtacctg tgtgccacct gacccagcta atatctcaat atctaatgac accacactgg 1980 ccccagagta tttgccaact atgtcttcta ctgacatgta ccataatact acctttgact 2040 gggcattttt gtcgaagaag gagtgttcaa aatacggagg aaacctcgtc gggaacaact 2100 gtaattttgt tcctgatatc acactcatgt cttttatcct cttcttggga acctacacct 2160 cttccatggc tctgaaaaaa ttcaaaacta gtccttattt tccaaccaca gcaagaaaac 2220 tgatcagtga ttttgccatt atcttgtcca ttctcatctt ttgtgtaata gatgccctag 2280 taggcgtgga caccccaaaa ctaattgtgc caagtgagtt caagccaaca agtccaaacc 2340 gaggttggtt cgttccaccg tttggagaaa acccctggtg ggtgtgcctt gctgctgcta 2400 tcccggcttt gttggtcact atactgattt tcatggacca acaaattaca gctgtgattg 2460 taaacaggaa agaacataaa ctcaagaaag gagcagggta tcacttggat ctcttttggg 2520 tggccatcct catggttata tgctccctca tggctcttcc gtggtatgta gctgctacgg 2580 tcatctccat tgctcacatc gacagtttga agatggagac agagacttct gcacctggag 2640 aacaaccaaa gtttctagga gtgagggaac aaagagtcac tggaaccctt gtgtttattc 2700 tgactggtct gtcagtcttt atggctccca tcttgaagtt tatacccatg cctgtactct 2760 atggtgtgtt cctgtatatg ggagtagcat cccttaatgg tgtgcagttc atggatcgtc 2820 tgaagctgct tctgatgcct ctgaagcatc agcctgactt catctacctg cgtcatgttc 2880 ctctgcgcag agtccacctg ttcactttcc tgcaggtgtt gtgtctggcc ctgctttgga 2940 tcctcaagtc aacggtggct gctatcattt ttccagtaat gatcttggca cttgtagctg 3000 tcagaaaagg catggactac ctcttctccc agcatgacct cagcttcctg gatgatgtca 3060 ttccagaaaa ggacaagaaa aagaaggagg atgagaagaa aaagaaaaag aagaagggaa 3120 gtctggacag tgacaatgat gattctgact gcccatactc agaaaaagtt ccaagtatta 3180 aaattccaat ggacatcatg gaacagcaac ctttcctaag cgatagcaaa ccttctgaca 3240 gagaaagatc accaacattc cttgaacgcc acacatcatg ctga 3284 <210> 2 <211> 1079 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Asp Glu Ala Val Leu Asp Arg Gly Ala Ser Phe Leu Lys His 1 5 10 15 Val Cys Asp Glu Glu Glu Val Glu Gly His His Thr Ile Tyr Ile Gly 20 25 30 Val His Val Pro Lys Ser Tyr Arg Arg Arg Arg Arg His Lys Arg Lys 35 40 45 Thr Gly His Lys Glu Lys Lys Glu Lys Glu Arg Ile Ser Glu Asn Tyr 50 55 60 Ser Asp Lys Ser Asp Ile Glu Asn Ala Asp Glu Ser Ser Ser Ser Ile 65 70 75 80 Leu Lys Pro Leu Ile Ser Pro Ala Ala Glu Arg Ile Arg Phe Ile Leu 85 90 95 Gly Glu Glu Asp Asp Ser Pro Ala Pro Pro Gln Leu Phe Thr Glu Leu 100 105 110 Asp Glu Leu Leu Ala Val Asp Gly Gln Glu Met Glu Trp Lys Glu Thr 115 120 125 Ala Arg Trp Ile Lys Phe Glu Glu Lys Val Glu Gln Gly Gly Glu Arg 130 135 140 Trp Ser Lys Pro His Val Ala Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu 145 150 155 160 Leu Arg Thr Cys Met Glu Lys Gly Ser Ile Met Leu Asp Arg Glu Ala 165 170 175 Ser Ser Leu Pro Gln Leu Val Glu Met Ile Val Asp His Gln Ile Glu 180 185 190 Thr Gly Leu Leu Lys Pro Glu Leu Lys Asp Lys Val Thr Tyr Thr Leu 195 200 205 Leu Arg Lys His Arg His Gln Thr Lys Lys Ser Asn Leu Arg Ser Leu 210 215 220 Ala Asp Ile Gly Lys Thr Val Ser Ser Ala Ser Arg Met Phe Thr Asn 225 230 235 240 Pro Asp Asn Gly Ser Pro Ala Met Thr His Arg Asn Leu Thr Ser Phe 245 250 255 Ser Leu Asn Asp Ile Ser Asp Lys Pro Glu Lys Asp Gln Leu Lys Asn 260 265 270 Lys Phe Met Lys Lys Leu Pro Arg Asp Ala Glu Ala Ser Asn Val Leu 275 280 285 Val Gly Glu Val Asp Phe Leu Asp Thr Pro Phe Ile Ala Phe Val Arg 290 295 300 Leu Gln Gln Ala Val Met Leu Gly Ala Leu Thr Glu Val Pro Val Pro 305 310 315 320 Thr Arg Phe Leu Phe Ile Leu Leu Gly Pro Lys Gly Lys Ala Lys Ser 325 330 335 Tyr His Glu Ile Gly Arg Ala Ile Ala Thr Leu Met Ser Asp Glu Val 340 345 350 Phe His Asp Ile Ala Tyr Lys Ala Lys Asp Arg His Asp Leu Ile Ala 355 360 365 Gly Ile Asp Glu Phe Leu Asp Glu Val Ile Val Leu Pro Pro Gly Glu 370 375 380 Trp Asp Pro Ala Ile Arg Ile Glu Pro Pro Lys Ser Leu Pro Ser Ser 385 390 395 400 Asp Lys Arg Lys Asn Met Tyr Ser Gly Gly Glu Asn Val Gln Met Asn 405 410 415 Gly Asp Thr Pro His Asp Gly Gly His Gly Gly Gly Gly His Gly Asp 420 425 430 Cys Glu Glu Leu Gln Arg Thr Gly Arg Phe Cys Gly Gly Leu Ile Lys 435 440 445 Asp Ile Lys Arg Lys Ala Pro Phe Phe Ala Ser Asp Phe Tyr Asp Ala 450 455 460 Leu Asn Ile Gln Ala Leu Ser Ala Ile Leu Phe Ile Tyr Leu Ala Thr 465 470 475 480 Val Thr Asn Ala Ile Thr Phe Gly Gly Leu Leu Gly Asp Ala Thr Asp 485 490 495 Asn Met Gln Gly Val Leu Glu Ser Phe Leu Gly Thr Ala Val Ser Gly 500 505 510 Ala Ile Phe Cys Leu Phe Ala Gly Gln Pro Leu Thr Ile Leu Ser Ser 515 520 525 Thr Gly Pro Val Leu Val Phe Glu Arg Leu Leu Phe Asn Phe Ser Lys 530 535 540 Asp Asn Asn Phe Asp Tyr Leu Glu Phe Arg Leu Trp Ile Gly Leu Trp 545 550 555 560 Ser Ala Phe Leu Cys Leu Ile Leu Val Ala Thr Asp Ala Ser Phe Leu 565 570 575 Val Gln Tyr Phe Thr Arg Phe Thr Glu Glu Gly Phe Ser Ser Leu Ile 580 585 590 Ser Phe Ile Phe Ile Tyr Asp Ala Phe Lys Lys Met Ile Lys Leu Ala 595 600 605 Asp Tyr Tyr Pro Ile Asn Ser Asn Phe Lys Val Gly Tyr Asn Thr Leu 610 615 620 Phe Ser Cys Thr Cys Val Pro Pro Asp Pro Ala Asn Ile Ser Ile Ser 625 630 635 640 Asn Asp Thr Thr Leu Ala Pro Glu Tyr Leu Pro Thr Met Ser Ser Thr 645 650 655 Asp Met Tyr His Asn Thr Thr Phe Asp Trp Ala Phe Leu Ser Lys Lys 660 665 670 Glu Cys Ser Lys Tyr Gly Gly Asn Leu Val Gly Asn Asn Cys Asn Phe 675 680 685 Val Pro Asp Ile Thr Leu Met Ser Phe Ile Leu Phe Leu Gly Thr Tyr 690 695 700 Thr Ser Ser Met Ala Leu Lys Lys Phe Lys Thr Ser Pro Tyr Phe Pro 705 710 715 720 Thr Thr Ala Arg Lys Leu Ile Ser Asp Phe Ala Ile Ile Leu Ser Ile 725 730 735 Leu Ile Phe Cys Val Ile Asp Ala Leu Val Gly Val Asp Thr Pro Lys 740 745 750 Leu Ile Val Pro Ser Glu Phe Lys Pro Thr Ser Pro Asn Arg Gly Trp 755 760 765 Phe Val Pro Pro Phe Gly Glu Asn Pro Trp Trp Val Cys Leu Ala Ala 770 775 780 Ala Ile Pro Ala Leu Leu Val Thr Ile Leu Ile Phe Met Asp Gln Gln 785 790 795 800 Ile Thr Ala Val Ile Val Asn Arg Lys Glu His Lys Leu Lys Lys Gly 805 810 815 Ala Gly Tyr His Leu Asp Leu Phe Trp Val Ala Ile Leu Met Val Ile 820 825 830 Cys Ser Leu Met Ala Leu Pro Trp Tyr Val Ala Ala Thr Val Ile Ser 835 840 845 Ile Ala His Ile Asp Ser Leu Lys Met Glu Thr Glu Thr Ser Ala Pro 850 855 860 Gly Glu Gln Pro Lys Phe Leu Gly Val Arg Glu Gln Arg Val Thr Gly 865 870 875 880 Thr Leu Val Phe Ile Leu Thr Gly Leu Ser Val Phe Met Ala Pro Ile 885 890 895 Leu Lys Phe Ile Pro Met Pro Val Leu Tyr Gly Val Phe Leu Tyr Met 900 905 910 Gly Val Ala Ser Leu Asn Gly Val Gln Phe Met Asp Arg Leu Lys Leu 915 920 925 Leu Leu Met Pro Leu Lys His Gln Pro Asp Phe Ile Tyr Leu Arg His 930 935 940 Val Pro Leu Arg Arg Val His Leu Phe Thr Phe Leu Gln Val Leu Cys 945 950 955 960 Leu Ala Leu Leu Trp Ile Leu Lys Ser Thr Val Ala Ala Ile Ile Phe 965 970 975 Pro Val Met Ile Leu Ala Leu Val Ala Val Arg Lys Gly Met Asp Tyr 980 985 990 Leu Phe Ser Gln His Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Val Ile Pro Glu 995 1000 1005 Lys Asp Lys Lys Lys Lys Glu Asp Glu Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1010 1015 1020 Gly Ser Leu Asp Ser Asp Asn Asp Asp Ser Asp Cys Pro Tyr Ser Glu 1025 1030 1035 104 Lys Val Pro Ser Ile Lys Ile Pro Met Asp Ile Met Glu Gln Gln Pro 1045 1050 1055 Phe Leu Ser Asp Ser Lys Pro Ser Asp Arg Glu Arg Ser Pro Thr Phe 1060 1065 1070 Leu Glu Arg His Thr Ser Cys 1075

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＥＤ 48/00 ＡＥＤ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＮ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 アントワヌ ミシェル アレン ブリル フランス国 サン グレゴワール 35762, ビー ピー 58，ボーレガルド，ル ドゥ シェスネイ ４，スミスクライン ビー チャム ラボラトワール ファーマシュー ティック (72)発明者 ナッシラ カンドウディ フランス国 サン グレゴワール 35762, ビー ピー 58，ボーレガルド，ル ドゥ シェスネイ ４スミスクライン ビーチ ャム ラボラトワール ファーマシューテ ィック (72)発明者 ザビエル マルティン フランス国 サン グレゴワール 35762, ビー ピー 58，ボーレガルド，ル ドゥ シェスネイ ４スミスクライン ビーチ ャム ラボラトワール ファーマシューテ ィック (72)発明者 ウォルター エフ．ボーン アメリカ合衆国 コネチカット州，ニュー ヘブンシダー ストリート 333，エー ル ユニバーシティー スクール オブ メディシン

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のHNBC1Aポリペプチドをコー
   ドするヌクレオチド配列、またはHNBC1Aヌクレオチド配
   列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離
   されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記のポリヌクレオチドが、配列番号２
   のHNBC1Aポリペプチドをコードする配列番号１中に含ま
   れるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載の
   ポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 配列番号１のポリヌクレオチドである、
   請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１〜
   ３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 下記発現系が適合性の宿主細胞内に存在
   するとき配列番号２のアミノ酸配列を含むHNBC1Aポリペ
   プチドを産生することができる発現系を含んでなるＤＮ
   ＡまたはＲＮＡ分子。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の発現系を含有する宿主
   細胞。
7. 【請求項７】 HNBC1Aポリペプチドを産生させるのに十
   分な条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養し、この
   培養物から前記ポリペプチドを回収することを含んでな
   る、HNBC1Aポリペプチドの産生方法。
8. 【請求項８】 宿主細胞が適当な培養条件下でHNBC1Aポ
   リペプチドを産生するように、請求項５に記載の発現系
   を用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェクショ
   ンすることを含んでなる、HNBC1Aポリペプチドを産生す
   る細胞の作製方法。
9. 【請求項９】 配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる
   HNBC1Aポリペプチド。
10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列を含む、HN
    BC1Aのポリペプチド。
11. 【請求項１１】 請求項９または１０に記載のHNBC1Aポ
    リペプチドに免疫特異的な抗体。
12. 【請求項１２】 請求項９または１０に記載のHNBC1Aポ
    リペプチドの活性増加または発現増加を必要としている
    患者を治療するための医薬組成物であって、治療に有効
    な量の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアゴニスト、および／ま
    たは(b) 前記ポリペプチド活性のin vivo 生産をもたら
    す形の、配列番号２のヌクレオチド配列、または前記ヌ
    クレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含
    んでなる単離されたポリヌクレオチド、を含んでなる医
    薬組成物。
13. 【請求項１３】 請求項９または１０に記載のHNBC1Aポ
    リペプチドの活性または発現を抑制する必要がある患者
    を治療するための医薬組成物であって、治療に有効な量
    の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアンタゴニスト、および
    ／または(b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチ
    ド配列の発現を抑制する核酸分子、および／または(c)
    前記ポリペプチドのリガンド、基質または受容体に関し
    て前記ポリペプチドと競合するポリペプチド、を含んで
    なる医薬組成物。
14. 【請求項１４】 請求項９または１０に記載のHNBC1Aポ
    リペプチドの発現または活性と関連した被験者の疾病ま
    たはその罹病性の検出方法であって、 (a) 前記被験者のゲノム中にHNBC1Aポリペプチドをコー
    ドするヌクレオチド配列の突然変異があるかどうかを調
    べる、および／または(b) 前記被験者から得られたサン
    プル中のHNBC1Aポリペプチド発現の存在または量を分析
    する、ことを含んでなる方法。
15. 【請求項１５】 請求項９または１０に記載のHNBC1Aポ
    リペプチドを阻害（拮抗）または活性化する化合物の同
    定方法であって、 (a) HNBC1Aポリペプチドを発現している細胞（もしくは
    HNBC1Aポリペプチドを発現している細胞膜）またはHNBC
    1Aポリペプチドに応答する細胞と候補化合物とを接触さ
    せ、そして(b) その結合、または機能的応答の刺激もし
    くは抑制を観察するか、または候補化合物と接触させた
    細胞（または細胞膜）の能力を、接触させなかった同一
    の細胞と、HNBC1Aポリペプチド活性に関して比較する、
    ことを含んでなる方法。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法により同定さ
    れたアゴニスト。
17. 【請求項１７】 請求項１５に記載の方法により同定さ
    れたアンタゴニスト。
18. 【請求項１８】 請求項８に記載の方法により作製され
    た組換え宿主細胞、またはHNBC1Aポリペプチドを発現し
    ているその膜。