ES2274977T3 - Peptidilarginina deiminasa 6. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la peptidilarginina deiminasa humana que se expresa exclusivamente en órganos reproductores y donde dicho polinucleótido hibrida en condiciones rigurosas con los nucleótidos 464-1052 de la SEC ID Nº: 4.
Description
Peptidilarginina deiminasa 6.
La presente invención se refiere a
polinucleótidos que codifican peptidilarginina deiminasa 6, a
células transfectadas con estos polinucleótidos, a proteínas
producidas por estas células así como a un método para producir
estas proteínas y sus moduladores.
Las peptidilarginina deiminasas (PAD) son una
familia de enzimas de modificación
post-traduccional que convierten peptidilarginina
en citrulina de una manera dependiente de Ca^{2+}. La deiminación
enzimática in vitro cambia las propiedades funcionales de
diversas proteínas y altera sus estructuras secundaria y
terciaria.
Hasta ahora, se han identificado cinco isoformas
de PAD que muestran una amplia distribución de tejido. La PAD1 de
ratón se detecta en la epidermis y útero (Rus'd, A.A. et al.
1990, Eur. J. Biochem. 259, 660-669); la
PAD2 de ratón se expresa ampliamente en diversos tejidos tales como
cerebro, pituitaria, médula espinal, glándulas salivales, páncreas,
músculo esquelético, útero, bazo, estómago y timo (Takahara, H.
et al. 1989, J. Biol. Chem. 264,
13361-13368); la PAD3 de ratón se expresa en la
epidermis y folículos capilares (Terakawa, H. et al, 1991,
J. Biochem (Tokio) 110, 661-666); la PAD4
(rata) es una enzima ubicua que se expresa en el páncreas, bazo,
ovario, hígado, pulmón, estómago, riñón, útero, dermis, cerebro,
corazón y epidermis (Yamakoshi, A et al. 1998, Biochim.
Biophys. Acta 1386, 227-232); finalmente se
ha aislado la PAD5 humana como un nuevo miembro de la familia a
partir de una línea celular de leucemia mieloide, pero no se ha
determinado además su distribución en el tejido (Nakashima, K.
et al. 1999, J. Biol. Chem. 274,
27786-27792).
Se conoce poco sobre las funciones fisiológicas
de la PAD. En el cerebro, la proteína básica de la mielina es un
sustrato natural y por lo tanto, la PAD juega un papel importante en
el sistema nervioso central. Además, cuando la PAD se desregula,
juega un papel en la etiología de la esclerosis múltiple
(Mastronardi, F.G. et al. 1996, Clin. Invest. 97,
349-358). Parece que la PAD está implicada en la
dermis en el procesamiento terminal de la filagrina, que de forma
indirecta es importante para mantener la humedad en el estrato
córneo superior (Senshu, T. et al. 1996, Biochem. Biophys.
Res. Commun. 225, 712-719). De nuevo, la
desregulación de esta PAD juega un papel en la etiología de la
artritis reumatoide (Girbal-Neuhauser, E. et
al. 1999, J. Immunol. 162, 585-594). En
los folículos capilares finalmente la solubilidad de la tricohialina
parece estar influenciada por la PAD; la función de esto permanece
por determinar (Rogers, G.E. et al. 1997, J. Invest.
Dermatol. 108, 700-707).
Los autores han descubierto una nueva PAD,
llamada PAD6. El transcripto se ha encontrado en ovocitos de ratón.
Su homóloga humana se describe también en este documento. Se
descubrió que la proteína se expresaba exclusivamente en
ovocitos/ovarios y testículos.
Los genes que se expresan específicamente en los
gametos masculinos y/o femeninos pueden proporcionar nuevas dianas
moleculares para la contracepción masculina y femenina. Para
testículos, se ha descrito un gran número de secuencias de genes
expresados únicamente en células germinales (Pawlak, A. et
al. 1995 Genomics 26, 151-1588;
Wolgemuth D.J. y Watrin F. 1991 Mamm Genome 1,
283-817). Por el contrario, sólo se han identificado
unos pocos genes expresados específicamente en ovocitos de ese
modo. La mayoría de las secuencias de genes específicos de gametos
identificados tienen probablemente una función esencial debido a su
expresión específica en gametos. Lo último se confirma con estudios
que usan animales knockout que indican que la inactivación génica de
genes específicos de testículos y ovocitos produce generalmente
infertilidad en el macho y/o hembra pero no produce patología
adicional en otros órganos y tejidos (Dong, J. et al. 1996
Nature 383, 531-535; Nantel, F. et al.
1996, Nature 380, 159-162). Estos datos
proporcionan evidencia adicional del papel específico y esencial de
estos genes durante la gametogénesis. Esto subraya la importancia de
la especificidad de tejido como un criterio de selección de dianas
moleculares para la regulación de la fertilidad.
Estará claro que existe una gran necesidad de
aclaración de los genes implicados en la regulación de la fertilidad
para desenredar los diversos papeles que estos genes juegan en la
infertilidad. Un mejor conocimiento de estos genes implicados en
diferentes fases de la fertilidad femenina y masculina, por ejemplo
en la gametogénesis y su regulación de la actividad y expresión,
podrían ayudar a crear una mejor percepción de los trastornos de
infertilidad. Esto podría conducir eventualmente a la identificación
de moduladores de la actividad para usar en protocolos terapéuticos
in vivo o in vitro.
La presente invención proporciona tal gen. Más
específicamente, la presente invención proporciona una secuencia
polinucleotídica que codifica la peptidilarginina deiminasa 6
(PAD6). Preferiblemente, el polinucleótido es de origen mamífero,
preferiblemente un ser humano. El ARN se expresa exclusivamente en
órganos reproductores.
La secuencia polinucleotídica más preferida en
la que codifica la SEC ID Nº: 3.
La invención incluye la secuencia de ARNm humano
completa como se indica en la SEC ID Nº: 4 y la fase de lectura
abierta correspondiente a la secuencia de nucleótidos
20-2077 de la SEC ID Nº: 4. Esta secuencia codifica
una proteína de 686 aminoácidos (SEC ID Nº: 3). Para adaptar la
variabilidad del codón, la invención incluye también secuencias
polinucleotídicas que codifican las mismas secuencias de aminoácidos
que las secuencias descritas en este documento. La información de
secuencia como se proporciona en este documento no debe construirse
de forma tan estrecha como para requerir la exclusión de bases
identificadas erróneamente. La secuencia específica descrita en
este documento puede usarse fácilmente para aislar los genes
completos de varias otras especies o variantes alélicas. La
secuencia puede usarse por ejemplo para preparar sondas o como una
fuente para preparar oligonucleótidos sintéticos para usar como
cebadores en reacciones de amplificación de ADN que permitan el
aislamiento e identificación de los genes completos de la variante.
En particular, los polinucleótidos que hibridan en condiciones de
lavado rigurosas con una sonda preparada por PCR en condiciones
convencionales usando la SEC ID Nº: 14 y la SEC ID Nº: 15 con ADNc
de origen mamífero como molde, preferiblemente de ser humano, son
parte de la invención. Tal sonda (y su secuencia complementaria) se
identifica por ejemplo por los nucleótidos 464-1052
de la SEC ID Nº: 4.
La secuencia genética completa puede usarse en
la preparación de moléculas de vector para la expresión de la
proteína en células hospedadoras adecuadas.
De ese modo, en un aspecto, la presente
invención proporciona polinucleótidos aislados que codifican la
nueva proteína PAD6. Preferiblemente la PAD6 es de origen humano,
pero también los ortólogos forman parte de la invención.
El ADN de acuerdo con la invención puede
obtenerse a partir de ADNc. Los tejidos son preferiblemente de
origen mamífero, más preferiblemente de origen humano.
Preferiblemente, los ácidos ribonucleicos se aíslan de ovocitos o
testículos. Como alternativa, la secuencia codificante puede ser ADN
genómico, o prepararse usando técnicas de síntesis de ADN. El
polinucleótido puede también estar en forma de ARN. Si el
polinucleótido es ADN, puede estar en forma de cadena única o
cadena doble. La cadena única puede ser la cadena codificante o la
cadena no codificante (antisentido).
El ADN de acuerdo con la invención será muy útil
para la expresión in vivo o in vitro de la nueva
proteína de acuerdo con la invención en cantidades suficientes y en
forma sustancialmente pura.
La presente invención refiere además a
polinucleótidos que tienen ligeras variaciones o que tienen sitios
polimórficos. Los polinucleótidos que tienen ligeras variaciones
pueden codificar variantes de polipéptidos que mantienen la misma
función o actividad biológica que la proteína natural, madura. Los
sitios polimórficos son útiles para propósitos de diagnóstico.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método para aislar un polinucleótido que comprende las etapas de:
a) hibridar un polinucleótido de acuerdo con la presente invención,
o su complementario, en condiciones rigurosas frente ácidos
nucleicos que son ADN (genómico), ARN o ADNc aislados
preferiblemente de tejidos que expresan altamente el polinucleótido
de interés y b) aislar dichos ácidos nucleicos por métodos conocidos
por el especialista en la técnica. Los tejidos son preferiblemente
de origen humano. Preferiblemente, los ácidos ribonucleicos se
aíslan de ovocitos, ovarios o testículos. Las condiciones de
hibridación son preferiblemente altamente rigurosas.
De acuerdo con la presente invención, el término
"riguroso" significa condiciones de lavado de 1 x SSC, SDS al
0,1% a una temperatura de 65ºC; condiciones altamente rigurosas se
refieren a una reducción en SSC alrededor de 0,3 x SSC, más
preferiblemente a 0,1 x SSC. Preferiblemente, los primeros dos
lavados se realizan posteriormente dos veces cada uno durante
15-30 minutos. Si se necesita lavar en condiciones
altamente rigurosas, se realiza un lavado adicional con 0,1 x SSC
una vez durante 15 minutos. La hibridación puede realizarse por
ejemplo durante toda la noche en tampón fosfato 0,5 M pH 7,5/SDS al
7% a 65ºC.
Como una alternativa, el método de aislamiento
del gen puede comprender metodología de amplificación génica usando
cebadores derivados del ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Pueden obtenerse también ADNc completo combinando clones obtenidos
por ejemplo por hibridación con por ejemplo clones RACE de ADNc.
También son parte de la invención porciones de
las secuencias codificantes que codifican un polipéptido funcional,
así como variaciones alélicas y de especie de las mismas. Algunas
veces, se expresa un gen en un cierto tejido como una variante de
empalme, produciendo un ARNm alterado en 5' ó 3' o la inclusión o
exclusión de una o más secuencias de exones. Se espera que todas
estas secuencias así como las proteínas codificadas por estas
secuencias realicen la misma o similares funciones y forman parte de
la invención.
La invención proporciona también
peptidilarginina deiminasa 6 (PAD6). Preferiblemente, la proteína
tiene una secuencia de aminoácidos de mamíferos, más
preferiblemente una secuencia humana. Lo más preferido es la
secuencia descrita en la SEC ID Nº: 3. Puede obtenerse la expresión
por introducción de moléculas de vector que comprenden un
polinucleótido que codifica PAD6 dentro de células hospedadoras
adecuadas. Las células pueden cultivarse y la proteína aislarse
usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
En otro aspecto más de la invención, se
proporcionan equivalentes funcionales, es decir, polipéptidos que
codifican actividades de la PAD6 y que comprenden esencialmente la
misma secuencia SEC ID Nº: 3 o partes de la misma que tienen
variaciones en la secuencia mientras que mantienen todavía las
características funcionales.
Las variaciones que pueden ocurrir en una
secuencia pueden demostrarse por una diferencia o diferencias de
aminoácidos en la secuencia total o por deleciones, sustituciones,
inserciones, inversiones o adiciones de un aminoácido o aminoácidos
en dicha secuencia. Se han descrito las sustituciones de aminoácidos
que no se espera que alteren esencialmente las actividades
biológicas e inmunológicas. Los reemplazamientos de aminoácidos
entre aminoácidos relacionados o reemplazamientos que han ocurrido
frecuentemente en la evolución son, entre otros, Ser/Ala, Ser/Gly,
Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (véase el documento de Dayhof, M.D., Atlas
of protein secuence and structure, Nat. Biomed. Res. Found.,
Washington D. C., 1978, vol 5, supl. 3). Basándose en esta
información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la
comparación rápida y sensible de proteínas (Science, 1985 227,
1435-1441) y para determinar la semejanza funcional
entre polipéptidos homólogos. Estará claro que también los
polinucleótidos que codifican tales variantes son parte de la
invención.
De ese modo, en otro aspecto de la invención, se
proporcionan polipéptidos que comprenden la SEC ID Nº: 3 pero
también polipéptidos con una semejanza del 80%, preferiblemente del
90%, más preferiblemente del 95%.
Como se usa en este documento, el término
semejanza se defina en el documento NCBI-BLAST
2.0.10 [26 de agosto de 1999] (Altschul, Stephen F., Thomas L.
Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb
Miller, y David J. Lipman (1997) "Grapped BLAST and
PSI-BLAST: a new generation o protein database
search programs", Nucleic Acids Res. 25,
3389-3402). El programa se usa para buscar
alineamientos de secuencia usando ajustes por defecto. Para
alineamientos de aminoácidos se usa la matriz BLOSUM62 por defecto y
la semejanza se indica como el número de positivos. No se incluye
filtración de complejidad composicional baja.
También se incluyen porciones de tales
polipéptidos capaces todavía de conferir efectos biológicos.
Especialmente, las porciones que son todavía capaces de convertir
la arginina en citrulina forman parte de la invención. Tales
proteínas o partes funcionales de las mismas pueden ser funcionales
per se, por ejemplo en forma solubilizada o pueden unirse a
otros polipéptidos (por ejemplo para dirigirlos a compartimientos
subcelulares específicos, para aumentar su solubilidad o para
facilitar su purificación), por medios biotecnológicos conocidos o
por síntesis química, para obtener proteínas quiméricas.
Estará claro que también los polinucleótidos que
codifican tales variantes están incluidos en la invención.
Pueden emplearse de forma útil una gran variedad
de combinaciones de células hospedadoras y vehículos de clonación
para clonar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el
polipéptido de acuerdo con la invención.
Los vectores de expresión adecuados son por
ejemplo plásmidos bacterianos o de levaduras, plásmidos de intervalo
de hospedador amplio y vectores derivados de combinaciones de
plásmidos y ADN de fagos o virus. Se incluyen también vectores
derivados de ADN cromosómico. Además, puede estar presente un origen
de replicación y/o un marcador de selección dominante en el vector
de acuerdo con la invención. Los vectores de acuerdo con la
invención son adecuados para trasformar una célula hospedadora.
Los vehículos para usar en la expresión de la
proteína o partes de la misma de la presente invención comprenderán
además secuencias de control unidas funcionalmente a la secuencia de
ácido nucleico que codifica la proteína. Tales secuencias de
control comprenden generalmente una secuencia promotora y secuencias
que regulan y/o potencian los niveles de expresión. Por supuesto
que las secuencias de control y otras pueden variar dependiendo de
la célula hospedadora seleccionada.
Los vectores de expresión recombinantes que
comprenden el ADN de la invención así como células transfectadas
con dicho ADN o dicho vector de expresión, de forma transitoria o
estable, también forman parte de la presente invención.
Las células hospedadoras adecuadas de acuerdo
con la invención son células hospedadoras bacterianas, levaduras y
otras hospedadoras de hongos, plantas o animales tales como células
de ovario de hámster chino, células de mono o células humanas. De
ese modo, una célula hospedadora que comprenda el ADN o el vector de
expresión de acuerdo con la invención está también dentro del
alcance de la invención. Las células hospedadoras modificadas
pueden cultivarse en medio con nutrientes convencionales que pueden
modificarse por ejemplo por selección apropiada, amplificación o
inducción de la transcripción. Las condiciones de cultivo tales como
temperatura, pH, nutrientes, etc. las conocen bien los
especialistas en la técnica.
Las técnicas para la preparación del ADN o del
vector de acuerdo con la invención así como la transformación o
transfección de una célula hospedadora con dicho ADN o vector son
convencionales y se conocen bien en la técnica, véase por ejemplo
el documento de Sambrook et al., Molecular Cloning: A
laboratory Manual. 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY, 1989.
La proteína de acuerdo con la invención puede
recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares
recombinantes por métodos de purificación bioquímicos comunes (como
los descritos en el documento Guide to Protein purification.
Editado por Murray P. Deutscher (1990) Methods in Enzimology. Vol
182. Academic Press, inc. San Diego CA 92101. Harcourt Brace
Jovanovich, Publishers) incluyendo precipitación con sulfato de
amonio, extracción, cromatografía tal como cromatografía de
interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio catiónico o
aniónico o cromatografía de afinidad y cromatografía líquida de
alta resolución. Si es necesario, pueden incluirse también etapas de
replegamiento de la proteína. Como alternativa, la proteína puede
expresarse como una proteína de fusión que contiene
("señales") que pueden usarse para purificación por
afinidad.
La regulación de la actividad de la proteína de
acuerdo con la invención es útil in vivo para el control del
reclutamiento folicular, pero también del crecimiento y maduración
de los ovocitos y/o folículos. La inhibición de estos procesos
in vivo puede usarse para retrasar (prematura) la menopausia
y/o como un contraceptivo. Además, la proteína puede emplearse para
la maduración in vivo del crecimiento de los folículos, por
ejemplo a partir de tejido de ovarios congelado.
Los productos del gen de PAD de acuerdo con la
presente invención pueden usarse para la identificación in
vivo o in vitro de nuevos sustratos o análogos de los
mismos. Para este propósito, pueden realizarse por ejemplo estudios
de ensayo de la peptidilarginina deiminasa con células transformadas
con ADN de acuerdo con la invención o un vector de expresión que
comprende ADN de acuerdo con la invención, expresando dichas células
los productos del gen de PAD6 de acuerdo con la invención. Como
alternativa, pueden usarse también la proteína PAD6 por sí misma o
los dominios de unión al sustrato de la misma en un ensayo para la
identificación de sustratos o análogos funcio-
nales.
nales.
Se conocen bien los métodos para determinar la
actividad de la peptidil arginina deiminasa de productos del gen
expresados en ensayos in vitro e in vivo para
determinar la actividad biológica de los productos del gen. Véase
por ejemplo el documento de Lamensa, F.E.W. y Moscarello, M.A. 1993
J. Neurochem. 61, 987-996. En este ensayo,
se convierte arginina en forma de
\alpha-Nbenzoil-L-arginina
etil éster (BAEE) en citrulina que puede medirse fácilmente después
de la precipitación con ácido perclórico.
Otro ejemplo de determinación de la actividad
enzimática de PAD6 hace uso de la inactivación de una proteína, por
ejemplo el inhibidor de la tripsina de la soja (STI) (Takahara, H.
et al. 1985, J. Biol. Chem 260,
8378-8383). Cuando una arginina esencial en STI se
transforma en citrulina, no es capaz ya de inhibir la actividad
proteolítica de la tripsina. Esto puede usarse como la base de un
ensayo en dos etapas para la determinación de la actividad de la
PAD. El ensayo consiste en dos etapas. En la primera reacción, PAD
convierte la arginina (posición 63) de STI en una citrulina,
inactivando el STI. En la segunda reacción, se añaden tripsina y un
sustrato fluorescente y se mide la actividad de la tripsina.
Como alternativa, puede obtenerse la modulación
de la actividad de PAD6 por regulación a la baja del nivel de
expresión de la proteína, por ejemplo usando ácidos nucleicos
anti-sentido por formación de triples hélices
(Cooney et al., 1988, Science 241,
456-459) o por unión al ARNm, o influenciando la
estabilidad del ARNm o interacciones de la proteína con moléculas
pequeñas. Esto por sí mismo puede conducir a la regulación de la
fertilidad, es decir, contracepción o tratamiento de la
infertilidad.
De ese modo, la presente invención proporciona
un método para identificar compuestos que afectan a la función
enzimática de la proteína de acuerdo con la invención. El método
comprende las etapas de
a) contactar la proteína PAD6 con un sustrato
que contiene arginina
b) contactar dicha mezcla con un compuesto de
ensayo
c) medir la conversión de arginina en citrulina
y
d) comparar dicha transformación con la
actividad de la peptidilarginina deiminasa en ausencia de un
compuesto de ensayo.
La transformación de arginina en citrulina puede
medirse fácilmente, por ejemplo por métodos analíticos como HPLC,
sensibilidad proteolítica del péptido alterada, cambio en las
propiedades de actividad del péptido o reconocimiento del
anticuerpo específico. Como sustrato pueden usarse péptidos o
proteínas que comprendan arginina, pero también compuestos
sintéticos como
\alpha-N-benzoil-L-arginina
etil éster. Sin embargo, tienen que sustituirse los grupos amino y
carboxilo o tienen que estar en forma de enlace peptídico.
Como alternativa, la presente invención
proporciona un método para identificar compuestos que modulan la
estabilidad del ARNm de PAD6 o los niveles de expresión de
PAD6.
La presente invención proporciona de ese modo un
método económico y rápido para detectar agentes terapéuticos para
el control de la fertilidad relacionado con la actividad de PAD6. El
método de acuerdo con la invención proporciona además la selección
de agentes terapéuticos selectivos que discriminan entre
peptidilarginina deiminasas diferentes conduciendo de ese modo a un
agente terapéutico más eficaz y/o a disminuir los efectos
secundarios. El método es especialmente adecuado para usarse en la
detección de alta capacidad de numerosos compuestos diana
poten-
ciales.
ciales.
Los compuestos que modulan la función de la
peptidilarginina deiminasa 6 pueden emplearse en tratamientos
terapéuticos modulando la PAD de la presente invención.
La invención proporciona también un método para
la formulación de una composición farmacéutica que comprende
mezclar los compuestos moduladores identificados con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables los
conocen bien los especialistas en la técnica e incluyen, por
ejemplo, solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de
calcio, gelatina, dextrina, agar, pectina, aceite de cacahuete,
aceite de oliva, aceite de sésamo y agua.
Además, las composiciones farmacéuticas pueden
comprender uno o más estabilizadores tales como, por ejemplo,
hidratos de carbono incluyendo sorbitol, manitol, almidón,
sacarodextrina y glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína,
y tampones tales como fosfatos alcalinos. Los métodos para fabricar
preparaciones y mezclas intravenosas se describen en el documento
Remingtons's Pharmaceutical Sciences, pp. 1463-1497
(16ª ed. 1980, Mack Publ. Co of Easton, Pa, USA).
De ese modo, los compuestos moduladores
identificados usando la peptidilarginina deiminasa de acuerdo con
la invención son útiles en la preparación de un producto
farmacéutico. El fármaco es para usarlo en el control de trastornos
de la fertilidad.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos para la
invención y no deben interpretarse de ningún modo como limitantes
del alcance de la invención.
Figura
1
Análisis por RT-PCR (30 ciclos)
de la expresión de PAD6 de ratón en diversos tejidos de ratón (grupo
superior). En el grupo inferior se muestran controles de GAPDH en
ausencia y presencia de RT.
Figura
2
Análisis por ISH (hibridación in situ)
usando el clon 1B11 como una sonda sobre ovarios de ratones jóvenes
(7 días) y adultos.
S=folículo secundario
\hskip0.5cmA=folículo antral.
Figura
3
Análisis por RT-PCR (30 ciclos)
de la expresión de PAD6 humana en diversos tejidos humanos (grupo
superior). En el grupo inferior se muestran controles de GAPDH en
ausencia y presencia de RT.
Figura
4
Transferencias de Northern (Clontech) de tejidos
múltiples humanos hibridados con una sonda de PAD6h.
Figura
5
Medida de fluorescencia para determinar la
actividad de PAD. Se preincubó STI (0,17 \mug) en ausencia
(cuadrado relleno) o presencia de 0,5 \mug de
GST-PAD6 (triángulo relleno), 1,0 \mug de
GST-PAD6 (triángulo abierto), o 0,1 \mug de PAD
de músculo de conejo (cuadrado abierto; Nº de cat. Sigma P1584)
respectivamente. Posteriormente, se añadió
N\alpha-benzoil-L-Arginina-7-amido-4-metilcumarina
(100 \muM; Nº de cat. Sigma B7260) y tripsina (0,25 \mug), y se
determinó la fluorescencia.
Ejemplo
1
Se aisló ARN total a partir de 2172 ovocitos de
ratón desnudos, tratados in vitro durante 15 h con
FF-MAS 50 \muM, de acuerdo con el protocolo de
aislamiento de ARN RNAzol B^{TM} (Campro scientific). Se añadió
RNAzol B directamente a los sedimentos de células congeladas que
contenían aproximadamente 100 ovocitos cada uno. Los homogenados se
agruparon y se extrajeron con 0,1 volúmenes de cloroformo, se
agitaron durante 15 segundos y se incubaron en hielo durante 10
minutos. Después de la centrifugación durante 15 minutos a 14000
rpm a 4ºC, se recogió la fase acuosa. Se precipitó el ARN total
añadiendo un volumen igual de isopropanol seguido por incubación
durante una noche a 4ºC. El ARN se centrifugó durante 45 minutos a
14000 rpm a 4ºC, el sedimento se lavó una vez con 700 \mul de
etanol al 70% seguido por centrifugación a 14000 rpm a 4ºC durante
30 minutos. El sedimento secado al aire se resuspendió finalmente en
7,5 \mul de agua libre de ARNasa (Ambion). La cantidad total de
ARN aislado usando este procedimiento se determinó usando el kit de
cuantificación de ARN Ribogreen^{TM} (Molecular Probes).
\newpage
Para síntesis de ADNc, se usó el kit de
construcción de bibliotecas de PCR SMART^{TM} (Clontech). Se
introdujeron las siguientes modificaciones. Se hibridó un cebador
de oligodT(18) con el sitio de restricción EcoRI (Pharmacia)
con el extremo 3' del ARNm y el oligo SMART^{TM} extendido con un
sitio de restricción EcoRI se hibridó con el extremo 5'del ARNm. La
primera reacción de síntesis de la cadena de ADNc fue en un tampón
de reacción que contenía Tris 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl_{2}
6 mM, DTT 2 mM, mezcla de NTPd 1 mM y 200 unidades de transcriptasa
inversa Superscript II RNasa H (Gibco BRL) durante 1 hora a 42ºC.
Posteriormente se amplificó la primera cadena de ADNc por PCR
usando un termociclador Perkin Elmer (9600). La PCR se realizó en un
volumen total de 100 \mul de tampón de reacción que contenía
tampón PCR Klen Taq 1x (Clontech), mezcla de NTPd 0,2 mM
(Clontech), cebador EcoRI-SMART 5' 0,2 mM, cebador
NotI-EcoRI-dT(18) 0,2 mM
(Pharmacia) y mezcla de polimerasa Taq Advantage Klen 1x (Clontech)
comenzando con 1 minutos de desnaturalización a 95ºC seguido por 28
ciclos de 15 segundos a 95ºC y 5 minutos a 68ºC.
Después de la purificación en una columna de
centrifugación Quaquick (QIAGEN), se digirió el ADNc con EcoRI
(Pharmacia) a 37ºC seguido por inactivación con calor a 70ºC durante
10 minutos. El ADNc se purificó dos veces usando dos columnas de
centrifugación Qiaquick posteriores y finalmente se resuspendió en
50 \mul de Tris-CL 10 mM (pH 8,5). Se determinó
la concentración de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm usando un
espectrofotómetro Genequant.
Se fraccionó el ADNc por tamaño usando
electroforesis en gel de agarosa y se extrajo de la matriz del gel
usando el kit de extracción del gel de agarosa QiaexII (Qiagen). Se
eluyó el ADN en 20 \mul de H_{2}O, se purificó en una columna
de centrifugación Qiaquick (Qiagen) y se eluyó en 50 \mul de
H_{2}O. Las muestras se precipitaron añadiendo 0,1 volúmenes de
acetato sódico 3 M, 10 \mug de glicógeno y 2,5 volúmenes de etanol
(96% v/v) seguido por 1 h de incubación a -20ºC. El ADNc
fraccionado por tamaño se recogió por centrifugación a 14000 rpm
durante 20 minutos a 4ºC. El sedimento de ADN se lavó con etanol al
70% y se secó al aire antes de disolverse en MQ. Se determinó la
concentración de ADN usando el kit de cuantificación de ADNds
PicoGreen^{TM} (Molecular Probes).
Después de la digestión con EcoRI, se ligaron
200 ng de ADNc de ovocitos dentro de 500 ng de brazos de fago
\lambdaGT11 predigeridos y desfosforilados en un tampón que
contenía Tris-Cl 50 mM pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM,
dihidrotreitol 10 mM, ATP 1 mM y 750 unidades/ml de ligasa T4
(Pharmacia). Las reacciones se incubaron durante una noche a 16ºC.
La reacción de ligación completa se empaquetó finalmente en un
extracto de empaquetado Max Plax^{TM} (Epicentre) como se
describe en la hoja de información del producto.
Ejemplo
2
Se incubaron placas únicas durante al menos una
hora en 100 \mul de tampón de fago \lambda
(Tris-HCl 10 mM pH 8,3, NaCl_{2} 100 mM y
MgCl_{2} 10 mM). De cada placa eluida se amplificaron por PCR 2,5
\mul usando cebadores de \lambdaGT11 (SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº:
6). Las reacciones de pCR se realizaron en el PE9700 (modo 9600,
Perkin Elmer), un ciclo de 5 min a 94ºC, 30 ciclos de 30 segundos a
94ºC, 30 segundos a 55ºC y 3 min a 72ºC, seguido de un ciclo de 5
min a 72ºC. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis
en gel de agarosa y se seleccionaron por tamaño, pureza y
concentración. Solamente se seleccionaron para secuenciación bandas
únicas de 500 pb o más.
Se analizaron 750 clones de la biblioteca de
ADNc de ovocitos de ratón por secuenciación del ADN después de
insertar la amplificación por PCR. El análisis de la secuencia se
realizó usando el protocolo de reacción preparado de secuenciación
del ADN Big Dye (Perkin Elmer) y las muestras se analizaron en el
secuenciador de ADN automático ABI377 (Perkin Elmer). Las
secuencias se compararon frente a varias bases de datos a.o.: bases
de datos gb111rod, genpept, EMrodESTs59 y EMhumanESTs59 usando
BLASTN o TBLASTN en un procedimiento automatizado y anotado en base
a la homología con un gen o genes de funciones conocidas.
Una de las secuencias obtenida muestra homología
fuerte con la peptidil arginina deiminasa III. Basándose en
búsquedas de homología se ha establecido que este clon, 1B11,
codifica una nueva peptidilarginina deiminasa que se ha denominado
PAD6.
El extremo 5' del ADNc de PAD6 de ratón pudo
amplificarse a partir de una biblioteca de ADNc de ovarios de
ratón. El ADNc de esta biblioteca se había clonado de forma
direccional en los sitios NotI-SaII
(5'-3') del vector pSPORT (Life Technologies). Este
vector contiene las secuencias 5' del promotor delantero M13 y SP6
del sitio NotI que se ha usado en la PCR RACE 5' en combinación con
dos cebadores inversos específicos de la PAD6. La primera PCR se
realizó con el cebador M13F (SEC ID Nº: 7) y el cebador inverso
específico del gen (SEC ID Nº: 8). Este producto de PCR se diluyó
cincuenta veces y se usó un microlitro de esta dilución como molde
en la PCR anidada con el cebador SP6 (SEC ID Nº: 9) y el cebador
inverso específico del gen anidado (SEC ID Nº: 10). Ambas
reacciones de PCR se realizaron en un volumen total de 50 \mul de
tampón de reacción que contenía tampón de PCR Klen Taq 1X
(Clontech), mezcla de NTPd 0,2 mM (Clontech) y mezcla de polimerasa
Taq Advantage Klen 1X (Clontech) comenzando con 5 minutos de
desnaturalización a 94ºC seguido por 30 ciclos de 30 segundos a
94ºC, 30 segundos a 56ºC, 3 minutos a 72ºC con una extensión final
de 5 minutos a 72ºC.
Se clonaron bandas en los productos de la PCR
anidada en el vector TA Topo PCR2,1 (Invitrogen), siguiendo la hoja
de información del producto, y se secuenciaron. Se descubrió que un
fragmento RACE 5' de 1800 pb completaba el clon PAD6 de ratón. La
secuencia del ADNc de ratón de longitud completa se da en la SEC ID
Nº: 2.
Basándose en la información de secuencia
obtenida, se diseñaron conjuntos de cebadores de PCR específicos
del gen y se usaron en experimentos de RT-PCR para
confirmar el perfil de expresión específico de tejido. Los datos
obtenidos (Figura 1) confirman la expresión específica del
ovocito/ovario-(y testículos) de la PAD6 de ratón. (se usaron la
SEC ID Nº: 8 y la SEC ID Nº: 13 como cebadores).
Para estudiar adicionalmente la expresión de la
PAD6 en las gónadas, se realizó hibridación in situ (ISH)
sobre secciones de ovarios y testículos de ratón.
Se fijaron ovarios de ratones de 7 días y
adultos en formalina tamponada al 4% durante 24 horas a temperatura
ambiente. Los tejidos se embebieron en parafina. Se cortaron
secciones de parafina (5 \mum), se montaron sobre portaobjetos de
microscopio Superfrost plus, y se dejaron secar durante toda la
noche a 37ºC. Los portaobjetos se endurecieron a 60ºC durante dos
horas.
Las secciones de tejido se desparafinaron en
xileno y se rehidrataron en concentraciones descendentes de etanol.
Los portaobjetos se lavaron durante 20 min en agitación en HCl 0,2
mM, seguido de dos lavados en DEPC
(di-etilpirocarbonato) tratado con Milli Q. Las
secciones se trataron con proteinasa K (1 \mug/ml) en tampón de
digestión (Tris 100 mM, EDTA 50 mM pH 8) durante 30 min a 37ºC. La
digestión se paró en glicina al 0,2% pre-enfriada
en PBS durante 10 min de agitación a temperatura ambiente (TA). Los
portaobjetos se acetilaron durante 25 min con anhídrido acético al
0,25% en tampón de trietanolamina 0,1 M, seguido por dos lavados en
DEPC tratado con Milli Q. Las secciones se prehibridaron a
temperatura de hibridación en una cámara húmeda con mezcla de
prehibridación, que contenía formamida al 52%, Tris 21 mM, EDTA 1
mM, NaCl 0,33 M, sulfato de dextrano al 10%, solución de Denhardt
1x, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, 100 \mug/ml de ARNt
y 250 \mug/ml de ARN total de levadura. Los portaobjetos se
cubrieron con un cubreobjetos de vidrio. Después de dos horas, los
cubreobjetos se reemplazaron por cubreobjetos que tenían 100 \mul
de mezcla de sonda de hibridación, que contenía mezcla de
prehibridación y las siguientes adiciones: DTT 0,1 mM, tiosulfato
sódico al 0,1%, SDS al 0,1% y 200 ng/ml de sonda marcada con
DIG.
Las sondas marcadas con DIG se generaron por
transcripción in vitro a partir de un molde de ADN lineal,
usando DIG-UTPd y ARN polimerasas dependientes de
ADN (SP6 y T7). El sitio del promotor de cada ARN polimerasa se
unió a las secuencias específicas del gen permitiendo la generación
de un fragmento de pCR que contenía el sitio promotor SP6 en el
sitio 5' y el promotor T7 en el sitio 3'. En general, se hicieron
sondas de aproximadamente 250-500 nucleótidos
situadas en el extremo 5' de la SEC ID Nº: 2. Después de la
transcripción in vitro, se analizó una pequeña cantidad de
la sonda en un gel de agarosa al 1,5% para confirmar la
transcripción in vitro exitosa. Las concentraciones de la
sonda se estimaron aplicando puntualmente diluciones en serie
(incluyendo DIG-ARN de control (100 ng/\mul))
sobre una membrana Hybond N^{+} seguido por fragmentos Fab' de
fosfatasa alcalina anti-DIG
(anti-DIG-AP) e incubación con el
sustrato de color NBT/BCIP.
La hibridación se realizó durante toda la noche
(16 horas) en una cámara húmeda a 42ºC o 50ºC. Los portaobjetos se
lavaron en SSC 2x, se agitaron durante 15 min, seguido por lavados
en SSC 2x, SSC 1x y SSC 0,1x durante 15 minutos de agitación a
temperatura de hibridación. Las secciones se digirieron con
Ribonucleasa A (20 \mug/ml) en tampón de ARNasa (NaCl 0,6 M, Tris
20 mM, EDTA 10 mM) durante 1 hora a 37ºC. Después de dos lavados (5
min de agitación a TA) en PBS pre-enfriado y un
lavado en tampón 1 (ácido maleico 100 mM, NaCl 150 mM), las
secciones se incubaron durante 30 min en solución de bloqueo (1 g/ml
de reactivo de bloqueo en tampón 1). Después las secciones se
incubaron con anti-DIG-AP, diluido
1:500 en solución de bloqueo, durante 1 hora a TA. Después de dos
lavados en tampón 1 (15 min de agitación a TA), los portaobjetos se
secaron con cuidado alrededor del tejido y las secciones se
rodearon con un DAKO-pen. Las secciones se cubrieron
con reactivo de desarrollo de color NBT/BCIP y se incubaron en una
cámara húmeda a TA. Después de dos horas, las secciones se
examinaron al microscopio. Si no se observó tinción o sólo tinción
débil, se continuó la incubación durante toda la noche a 4ºC y el
día siguiente a TA. Finalmente, los portaobjetos se aclararon con
agua y opcionalmente se tiñeron por contraste con hematoxilina de
Mayer 1:5 durante tres segundos. Los portaobjetos se montaron en
gelatina de glicerol Kaisers.
Como se muestra en la Figura 2, PAD6 se expresa
en el ovario exclusivamente en ovocitos.
El ARNm de PAD6 tiene altos niveles de expresión
en ovocitos de folículos primarios, secundarios y antrales, pero se
expresa también en ovocitos de folículos primordiales. Basándose en
los datos obtenidos hasta ahora, el nivel de expresión del ARNm de
PAD6 disminuye en ovocitos de folículos antrales, sugiriendo que la
función de PAD6 se requiere más probablemente durante las fases
tempranas de la ovogénesis. Aunque los datos de
RT-PCR revelan la expresión en los testículos de
PAD6, no se detectó expresión por encima del nivel de fondo de ARNm
de PAD6 usando análisis de ISH, sugiriendo niveles bajos de
expresión de PAD6 en los testículos.
Ejemplo
3
Una búsqueda BLAST usando el ADNc de PAD6 de
ratón de longitud completa como un interrogante frente a las bases
de datos EM63hsGeno(nuevo) identificó el homólogo humano de
PAD6. Esta búsqueda identificó sólo la región
C-terminal de la secuencia codificante de la PAD6
humana. Para extender la secuencia en dirección 5' se diseñaron
cebadores y se realizó una PCR RACE 5' sobre ADNc Marathon Ready de
ovarios humanos (Clontech) usando el manual de usuario de ADNc
Marathon Ready^{TM}. La primera PCR se realizó en las siguientes
condiciones: una desnaturalización de 30 segundos a 94ºC, 5 ciclos
de 5 segundos a 94ºC y 3 minutos a 72ºC, 5 ciclos de 5 segundos a
94ºC y 3 minutos a 70ºC y 25 ciclos de 5 segundos a 94ºC y 3
minutos a 68ºC. Una dilución de 50 veces de este primer producto de
PCR sirvió como molde en la segunda, la reacción de PCR anidada
usando las mismas condiciones de PCR. Se clonó una banda esperada
de \sim650 pb en el vector TA Topo PCR2.1 (Invitrogen) y se
secuenció. Este clon contenía (por homología) las primeras 500
pares de bases 5' de la secuencia codificante de la PAD6 humana,
completando de ese modo la secuencia codificante de la PAD6
humana.
Se seleccionaron cebadores de PCR para
amplificar el ARN de ovarios humanos de ADNc de PAD6 humana de
longitud completa. Para aislar ADNc de PAD6 se usaron los cebadores
de la SEC ID Nº: 11 y de la SEC ID Nº: 12 sobre ADNc de ovarios
Marathon Ready (Clontech). Las condiciones de PCR fueron:
desnaturalización durante 5 minutos a 94ºC seguido por 5 ciclos de
30 segundos a 94ºC y 3 minutos a 68ºC, 28 ciclos de 30 segundos a
94ºC, 30 segundos a 62ºC y 3 minutos a 72ºC con una extensión final
de 7 minutos a 72ºC.
Los amplificados de longitud completa de tres
reacciones de PCR independientes se clonaron dentro del vector
PCR2.1 Topo (Invitrogen) y se secuenciaron para determinar las
secuencias de nucleótidos consenso. Su secuencia se muestra en la
SEC ID Nº: 4.
Se diseñaron conjuntos de cebadores de PCR
específicos del gen (SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15) y se usaron en
experimentos de RT-PCR para determinar el perfil de
expresión de la PAD6 humana. La RT-PCR de ARN de
testículos, útero, riñón, timo, hígado, cerebro, corazón, pulmón y
bazo humanos reveló la expresión de PAD6 sólo en los testículos
(Figura 3).
Se hibridaron múltiples transferencias de
Northern de tejidos (Clontech) de tejidos humanos con el fragmento
de PCR de la PAD6 humana (aproximadamente 590 pb; producto de PCR de
los cebadores de la SEC ID Nº: 14 y la SEC ID Nº: 15 que se
extienden entre los nucleótidos 464-1052 en la SEC
ID Nº: 4). Las sondas se marcaron con [^{32}P]CTPd y
perlas Ready to Go Labellings (AP Biotech) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante usando un tiempo de incubación de 60
minutos a 37ºC. Los NTPd no incorporados se retiraron en una columna
de centrifugación de Sephadex G50 en un jeringa de 1 ml.
Las transferencias se prehibridaron en Express
hybmix (Clontech) durante al menos una hora a 65ºC. Para la
hibridación, se añadieron 4-8 x 10^{7} cpm de las
sondas desnaturalizadas a la mezcla de prehibridación. Las
transferencias se hibridaron a 65ºC durante toda la noche y se
lavaron una vez con SSC 2X, SDS 0,1% a temperatura ambiente, dos
veces con SSC 1X, SDS al 0,1% a 65ºC y una vez con SSC 0,1X, SDS al
0,1% a 65ºC. Las transferencias hibridadas se analizaron con la
cámara de fósforo STORM 840 (Molecular Dynamics), se escanearon a
200 micrómetros y se imprimieron con un intervalo de
0-50 después de la exposición de tres días a
pantallas GP de fósforo de almacenamiento Kodak (Molecular
dynamics).
En la Figura 4 puede verse una banda única de un
ovario con una longitud estimada de aproximadamente 3 kB que
aparece solo en ovarios. No pudo detectarse señal en testículos, lo
más probable debido a que el nivel de expresión de PAD6 en
testículos es demasiado bajo para detectarse en transferencias de
Northern. Los análisis de hibridación in situ corroboran
estos resultados: la expresión de PAD6 pudo detectarse en todos los
tipos de folículos de ovarios humanos y de mono y en este aspecto
son similares a los datos in situ en ratón. No se detectó
expresión en testículos por hibridación in situ (datos no
mostrados).
Ejemplo
4
Se clonó PAD6 humana de longitud completa dentro
del vector de expresión bacteriano pGEX4T1 (AP Biotech) usando el
kit de ligación de ADN Rapid (Boehringer). La construcción
recombinante (pGEXhPAD6) se caracterizó por digestión con enzimas
de restricción.
Se crecieron células de E. coli
BL-21 transformadas con pGEXhPAD6 en medio YT 2 x a
25ºC hasta una densidad celular de 1,0 a 650 nm. Después de la
adición de 0,1 ml de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido,
se creció el cultivo durante 5 horas adicionales a 25ºC. Las
células se centrifugaron y se resuspendieron en 0,1 volúmenes del
volumen de cultivo original de Tris-HCl 20 mM, pH
7,6, EDTA 1 mM y se lisaron por sonicación en hielo. El sonicado se
centrifugó a 15000 X g durante 30 min a 4ºC (Sorvall, rotor SS34) y
al sobrenadante se le añadió NaCl 1 M, 0,1%
deTritonX-100 y perlas de
glutatión-Sepharose 4B al 50% en PBS (Pharmacia
Biotech, 1 ml a un equivalente de 250 ml del cultivo inicial),
seguido por incubación a 4ºC durante 60 minutos con agitación
suave. Las perlas se lavaron después tres veces con 10 volúmenes de
lecho de un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM pH
7,6, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 0,1% y NaCl 0,1 M a
TA durante 5 minutos con agitación suave. La proteína de fusión
PAD6h-gst recombinante se eluyó de las perlas en
varias etapas con glutatión reducido de 10 a 100 mM en
Tris-Cl 50 mM pH 8,0, NaCl 0,1 M y Triton
X-100 al 0,1% a 4ºC durante 30 minutos con agitación
suave. Los eluidos se almacenaron con glicerol al 10% a -20ºC para
la determinación de la actividad enzimática. Se estimó que la
pureza de la proteína era del 90% basándose en análisis de SDS
PAGE.
Se determinó la actividad de la PAD por la
formación de citrulina en inhibidor de tripsina de soja (STI) como
sustrato. Al contrario que la STI original, la STI citrulinada es
incapaz de inhibir la actividad de la tripsina. Por lo tanto, un
aumento en la actividad de la tripsina, detectada con un sustrato
fluorescente de la tripsina, indica actividad de PAD.
Para la actividad de PAD, la mezcla de reacción
consistía en HEPES 10 mM (pH 7,5), CaCl_{2} 5 mM, DTT 2 mM, 0,17
\mug de STI y una alícuota de la solución de la enzima purificada
[GST-PAD6 o PAD disponible en el mercado (Sigma),
derivada de músculo de conejo] en un volumen final de 20 \mul.
Después de la incubación de la mezcla de ensayo durante 30 minutos
a 37ºC, se añadieron posteriormente 10 \mul del sustrato
fluorescente
N\alpha-benzoil-L-Arginina-7-amido-4-metilcumarina
[400 \muM en HEPES 100 mM (pH 7,5), EDTA 50 mM] y 10 \mul de
solución de tripsina [0,25 \mug en HEPES 100 mM (pH 7,5)]. Las
medidas de fluorescencia (excitación a 360 nm, emisión a 460 nm)
comenzaron directamente en un Victor V a temperatura ambiente, y
continuaron durante una hora.
Pudo detectarse actividad de PAD6 como se puede
ver en la Figura 5.
<110> Akzo Nobel N. V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Peptidilarginina deiminasa 6
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 682
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2055
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 686
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2092
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (9)
1. Un polinucleótido que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica la peptidilarginina deiminasa humana
que se expresa exclusivamente en órganos reproductores y donde dicho
polinucleótido hibrida en condiciones rigurosas con los nucleótidos
464-1052 de la SEC ID Nº: 4.
2. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 1, codificando dicho polinucleótido la SEC ID Nº:
3.
3. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 2, comprendiendo dicho polinucleótido los nucleótidos
20-2077 de la SEC ID Nº: 4.
4. Un vector de expresión recombinante que
comprende el polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones
1-3.
5. Un polipéptido que tiene actividad
peptidilarginina deiminasa codificado por el polinucleótido de
acuerdo con las reivindicaciones 1-3 o un vector de
expresión de acuerdo con la reivindicación 4.
6. Una célula aislada transfectada con el
polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones
1-3 o un vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 4.
7. Una célula de acuerdo con la reivindicación 6
que es una célula transfectada estable que expresa el polipéptido
de acuerdo con la reivindicación 5.
8. Un método para producir el polipéptido de la
reivindicación 5 que comprende cultivar las células de la
reivindicación 6 en condiciones en las que se produce dicha proteína
y recuperar dicha proteína del cultivo.
9. Un método para identificar compuestos que
afectan a la función enzimática de un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 5, comprendiendo el método las etapas de
a) contactar dicho polipéptido con un sustrato
que contiene arginina;
b) contactar dicha mezcla con un compuesto de
ensayo;
c) medir la conversión de arginina en citrulina;
y
d) comparar dicha transformación con la
actividad de la peptidilarginina deiminasa en ausencia de un
compuesto de ensayo.
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