ES2275005T3 - Tieno (2,3-d) pirimidinas con actividad agonista lh y fsh combinada. - Google Patents

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Abstract

Un derivado de tieno[2, 3-d]pirimidina de acuerdo con la fórmula general I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, donde R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo que tiene 2-6 átomos de carbono, conteniendo opcionalmente uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y/o S.

Description

Tieno[2,3-d]pirimidinas con actividad agonista LH y FSH combinada.
La invención se refiere a compuestos que tienen actividad agonista de hormonas glicoproteicas, en particular a compuestos que tienen actividad agonista de la Hormona Luteinizante (LH) y de la Hormona Estimulante del Folículo (FSH). La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen los mismos así como a la utilización de estos compuestos en terapia médica, particularmente para utilización como control de la fertilidad.
Las gonadotropinas desempeñan importantes funciones en una variedad de funciones corporales incluyendo el metabolismo, la regulación de la temperatura y el proceso reproductivo. Las gonadotropinas hipofisarias FSH y LH desempeñan, por ejemplo, un papel fundamental en la estimulación del desarrollo y la maduración del folículo, mientras que la LH está implicada en la inducción del proceso ovulatorio (Sharp, R.M., Clin. Endocrinol. 33, 787-807, 1990; Dorrington y Armstrong, Recent Prog. Horm. Res. 35, 301-342, 1979; Levy y col., Human Reproduction 15, 2258-2265, 2000).
Actualmente, la LH es aplicada clínicamente, en combinación con la FSH, para la estimulación ovárica, esto es para la hiperestimulación ovárica para fertilización in vitro (FIV) y para la inducción de ovulación en mujeres anovulatorias infértiles (Insler, V., Int. J. Fertility 33, 85-97, 1988; Navot y Rosenwaks, J. Vitro Fert. Embryo Transfer. 5, 3-13, 1988), así como para el hipogonadismo masculino y la infertilidad masculina.
Las gonadotropinas actúan sobre tipos celulares específicos de las gónadas para iniciar la diferenciación ovárica y testicular y la esteroidogénesis. Las acciones de estas hormonas hipofisarias y placentarias están mediadas por receptores específicos de la membrana plasmática que son miembros de la gran familia de receptores acoplados a proteína G. Constan de un único polipéptido con siete dominios transmembranales y son capaces de interaccionar con la proteína Gs, dando lugar a la activación de la adenil ciclasa.
Las gonadotropinas destinadas a fines terapéuticos pueden ser aisladas de fuentes de orina humana y tienen baja pureza (Morse y col., Amer. J. Reproduct. Immunol. and Microbiology 17, 143, 1988). Alternativamente, pueden ser preparadas como gonadotropinas recombinantes. Además de por estas proteínas, los receptores de gonadotropinas pueden ser activados o desactivados por compuestos sintéticos de bajo peso molecular. Compuestos heteroaromáticos bicíclicos han sido descritos en WO 00/61556. Mediante experimentos in vitro e in vivo han demostrado ser útiles como agonistas de la LH.
En las mujeres normales, la liberación de la LH y la FSH hipofisarias se caracteriza por una aparición a mitad del ciclo que precede a la ovulación. La ovulación se caracteriza por tres fenómenos fisiológicos distintos, esto es, la maduración del oocito, la ruptura folicular y la luteinización. Mientras que la función del aumento de la LH en la inducción in vivo de estos fenómenos es indiscutible, el papel del aumento de la FSH está menos claro. Sin embargo, se ha demostrado recientemente que la FSH induce la maduración del oocito in vitro induciendo la producción por las células del cúmulo de un factor que resuelve positivamente la parada meiótica inducida por hipoxantina (Lu y col., Mol. Cell. Endocrinol. 164, 191-196, 2000). Se cree que este factor es un esterol activador de la meiosis (MAS).
En la inducción de la ovulación, es deseable proporcionar como componente principal los efectos de la LH. De acuerdo con la presente invención, se han encontrado compuestos con propiedades particulares ventajosas cuando son utilizados en protocolos para incrementar la fertilidad. En estos compuestos, la actividad LH está acompañada por una actividad FSH.
Por tanto, la presente invención proporciona compuestos de bajo peso molecular que además de actividad LH tienen también inesperadamente actividad FSH. En general, estos compuestos son tieno[2,3-d]pirimidinas que están sustituidas en la posición 4 del anillo de pirimidina por un grupo fenilo que, a su vez, está sustituido en la posición meta.
La presente invención reside en derivados de tieno[2,3-d]pirimidina de acuerdo con la fórmula general I,
1
o una sal de los mismos farmacéuticamente aceptable, en los que N(R1)R2 están unidos en un anillo heterocicloalquilo(2-6C).
Los compuestos más preferidos son ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(azetidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(morfolin-4-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(tiomorfolin-4-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(pirrolidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida y ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperazin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida.
El término "unidos en un anillo heterocicloalquilo(2-6C)" en la definición de la Fórmula I, significa que R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo que tiene 2-6 átomos de carbono, que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y/o S. Ejemplos de tales anillos son azetidina, pirrolidina, piperidina, piperazina, morfolina y tiomorfolina.
Se ha demostrado que compuestos con la Fórmula I anteriormente mencionada presentan actividad agonista de LH y FSH. En un bioensayo in vitro utilizando células CHO transfectadas de manera estable con el receptor de la LH o de la FSH humano, respectivamente, se encontró que la CE_{50} con respecto al receptor de LH era menor de 5\cdot10^{-8} M, mientras que con respecto al receptor de FSH la CE_{50} era menor de 10^{-5} M. Típicamente, la actividad FSH varía desde una actividad del 1% aproximadamente de la estimulación por el agonista de LH hasta un 10% aproximadamente de la estimulación por el agonista de LH.
La invención reside además en una composición farmacéutica que comprende un compuesto derivado de tieno[2,3-d]pirimidina o sales del mismo que tiene la Fórmula general I.
Por tanto, los compuestos de acuerdo con la presente invención pueden ser utilizados en terapia. Un aspecto adicional de la invención reside en la utilización de un compuestos tieno[2,3-d]pirimidina que tiene la Fórmula general I para la fabricación de un medicamento para el control de la fertilidad, más preferiblemente para la inducción de ovulación. Los presentes compuestos son utilizados para activar los receptores de LH y FSH. El compuesto de la presente invención puede ser por tanto utilizado en un método para tratar a mujeres con problemas de fertili-
dad.
Para uso terapéutico, las sales de los compuestos de Fórmula I son aquéllas en las que el contraión es farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, las sales de adición de ácido de bases de acuerdo con la Fórmula I pueden ser también útiles, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable. Todas las sales, sean o no farmacéuticamente aceptables, están incluidas en el ámbito de la presente invención.
Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos minerales tales como ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, preferiblemente ácido clorhídrico, y de ácidos orgánicos tales como ácido cítrico, ácido tartárico, ácido acético, ácido láctico, ácido maleico, ácido malónico, ácido fumárico, ácido glicólico, ácido succínico, etcétera.
Las vías de administración adecuadas para los compuestos de Fórmula I, o para las sales de los mismos farmacéuticamente aceptables, referidos también en la presente como el ingrediente activo, son inyecciones intramusculares, inyecciones subcutáneas, inyecciones intravenosas o inyecciones intraperitoneales, administración oral e intranasal. Preferiblemente, los compuestos pueden ser administrados oralmente. La dosis exacta y el régimen de administración exacto del ingrediente activo, o de una composición farmacéutica del mismo, dependerán necesariamente del efecto terapéutico que se quiera conseguir (tratamiento de la infertilidad; anticoncepción), y pueden variar con el compuesto particular, la vía de administración y la edad y condición del sujeto individual al que se vaya a administrar el medicamento.
En general, la administración parenteral requiere dosis menores que otros métodos de administración que son más dependientes de la absorción. Sin embargo, una dosificación para humanos contiene preferiblemente 0,0001-25 mg por kg de peso corporal. La dosis deseada puede ser presentada como una sola dosis o como múltiples subdosis administradas a intervalos apropiados a lo largo del día. En el caso de receptoras femeninas, las dosis pueden ser administradas a intervalos diarios apropiados a lo largo del ciclo menstrual para soporte folicular, o como una única dosis para la inducción de ovulación. La dosificación, así como el régimen de administración, pueden diferir entre un receptor femenino y un receptor masculino.
En el caso de aplicaciones in vitro o ex vivo, como en aplicaciones para FIV, los compuestos de la invención han de ser utilizados en el medio de incubación a una concentración de 0,01-5 \mug/ml aproximadamente.
La presente invención se refiere también, por tanto, a composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto tieno[2,3-d]pirimidina de acuerdo con la Fórmula I en mezcla con agentes auxiliares farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, con otros agentes terapéuticos. Los agentes auxiliares deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la composición y no ser nocivos para los receptores de la misma.
Las composiciones farmacéuticas incluyen las que son adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo transdérmica, bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las composiciones pueden ser preparadas mediante cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia, utilizando por ejemplo métodos tales como los descritos en Gennaro y col., Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª ed., Mack Publishing Company, 1990; ver especialmente Parte 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture).
Tales métodos se incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con cualquier agente auxiliar. El(los) agen-
te(s) auxiliar(es), denominado(s) también ingrediente(s) accesorio(s), incluye(n) los convencionales en la técnica
(Gennaro, supra), tales como agentes de carga, aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubricantes, colorantes, agentes aromatizantes y agentes humectantes.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración oral pueden ser presentadas como unidades de dosificación discretas tales como píldoras, tabletas o cápsulas, o como polvo o gránulos, o como una solución o suspensión. El ingrediente activo puede ser presentado también como un bolus o una pasta. Las composiciones pueden ser además procesadas para producir un supositorio o un enema para administración rectal.
Para la administración parenteral, las composiciones adecuadas incluyen inyecciones estériles acuosas y no acuosas. Las composiciones pueden ser presentadas en recipientes de una dosis unidad o multidosis, por ejemplo viales y ampollas cerrados herméticamente, y pueden ser almacenadas en una condición de congelación-desecación (liofilizadas) que requiere únicamente la adición de un vehículo líquido estéril, por ejemplo agua, antes de su utilización.
Las composiciones, o formulaciones, adecuadas para administración mediante inhalación nasal incluyen polvos finos o vapores que pueden ser generados por medio de aerosoles, nebulizadores o insufladores presurizados de dosis medida.
Los compuestos tieno[2,3-d]pirimidina de la invención pueden ser también administrados en forma de dispositivos farmacéuticos implantables, que constan de un núcleo central de material activo revestido por una membrana reguladora de la velocidad de liberación. Tales implantes son para ser aplicados subcutáneamente o localmente, y liberarán el ingrediente activo a una velocidad aproximadamente constante durante periodos de tiempo relativamente grandes, por ejemplo desde semanas a años. Los métodos para la preparación de dispositivos farmacéuticos implantables como tales son conocidos en la técnica, por ejemplo según está descrito en la Patente Europea 0.303.306 (AKZO N.V.).
Por tanto, los compuestos de acuerdo con la presente invención pueden ser utilizados para los mismos fines clínicos que la LH nativa, con la ventaja de que poseen actividad FSH, presentan propiedades de estabilidad alteradas y pueden ser administrados de forma diferente.
Los compuestos de la presente invención, representados por la Fórmula I, pueden ser generalmente preparados mediante sustitución nucleofílica de haluros (II) en los que Q = Cl o Br con aminas secundarias (cíclicas) de Fórmula (III) en un solvente apropiado tal como N,N-dimetilformamida o THF, a temperatura ambiente, en presencia de una base terciaria tal como N,N-diisopropiletilamina (DIPEA).
2
Derivados de Fórmula (II) en los que Q = Cl o Br pueden ser preparados mediante acilación regioselectiva del derivado de meta anilina (V) con cloruros de acilo de tipo (IV), en los que Q = Cl o Br, en presencia de una base terciaria tal como N,N-diisopropiletilamina en un solvente adecuado tal como diclorometano o THF.
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El compuesto (V) es accesible mediante la reducción conocida en la técnica de la función nitro del derivado (VI) utilizando un agente reductor apropiado tal como cloruro de estaño(II) en un solvente prótico tal como etanol, en presencia de ácido clorhídrico a temperatura elevada (J. Heilbron, J. Chem. Soc., 1279 (1940)).
4
La tienopirimidina (VI) puede ser preparada mediante condensación del ácido carboxílico (VII) con ter-butil amina bajo la influencia de un agente de acoplamiento tal como tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU) o hexafluorofosfato de bromotripirrolidinfosfonio (PyBrOP) y una base terciaria, por ejemplo N,N-diisopropiletilamina.
5
La saponización del éster de etilo (VIII) para dar el ácido carboxílico correspondiente (VII) tiene lugar en presencia de una base tal como hidróxido de litio, hidróxido de potasio o hidróxido de sodio en dioxano acuoso a temperatura elevada (de 80ºC hasta reflujo).
6
El biciclo (VIII) es formado mediante sustitución del cloro (X) por mercaptoacetato de etilo bajo la mediación de N,N-diisopropiletilamina, seguido por el cierre del anillo del tioéter intermedio (IX) catalizado por una base. Este tipo de formaciones de anillos de tieno[2,3-d]pirimidina ha sido descrito en: S.A. Abdel-Hady, M.A. Badawy, Y.A. Ibrahim, Sulfur Lett. 9, 101 (1989) y S. Tumkevicius, Liebigs Ann., 1703 (1995).
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7
Las condiciones adecuadas para la reacción de ciclación son etóxido de sodio en etanol o N,N-diisopropiletilamina en tolueno/etanol (1/1, v/v) a temperatura de reflujo.
8
La cloroimina (X) requerida puede ser sintetizada siguiendo procedimientos de la literatura según está descrito, por ejemplo, por A.A. Santilli, D.H. Kim y S.V. Wanser, J. Heterocycl. Chem. 8, 445, 1971. De acuerdo con este procedimiento, la lactama (XI) es tratada con POCl_{3} a temperatura elevada (80ºC hasta reflujo) para dar cloruro (X). La adición a la mezcla de reacción de un solvente apropiado, por ejemplo dioxano, y/o la adición de PCl_{5} o N,N-dimetilanilina puede tener como resultado tiempos de reacción más cortos y rendimientos de cloro (X) más elevados.
9
Una ruta apropiada hacia la lactama (XI) comprende la condensación de múltiples componentes de cianoacetato de etilo con 3-nitro-benzaldehído y S-metil isotiourea en etanol bajo la mediación de una base tal como carbonato de potasio a temperatura elevada (60ºC).
10
Se han descrito procedimientos relacionados en: S. Kambe, K. Saito y H. Kishi, Synthesis 287 (1979); A.M. Abd-Elfattah, S.M. Hussain y A.M. El-Reedy, Tetrahedron 39, 3197 (1983); S.M. Hussain, A.A. El-Barbary y S.A. Mansour, J. Heterocycl. Chem. 22, 169 (1985).
Los métodos para determinar la unión a receptores así como los ensayos in vitro e in vivo para determinar la actividad biológica de las gonadotropinas son bien conocidos. En general, el receptor expresado es puesto en contacto con el compuesto a analizar y se mide la unión o la estimulación o inhibición de una respuesta funcional.
Para medir una respuesta funcional, ADN aislado que codifica el gen del receptor de LH o de FSH, preferiblemente el receptor humano, es expresado en células huésped adecuadas. Tal célula puede ser la célula de Ovario de Hámster Chino, pero otras células son también adecuadas. Preferiblemente, las células son de origen mamífero (Jia y col., Mol. Endocrin. 5, 759-776, 1991).
Los métodos para construir líneas celulares que expresen LH o FSH recombinante son bien conocidos en la técnica (Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, última edición). La expresión del receptor se obtiene por la expresión del ADN que codifica la proteína deseada. Las técnicas de mutagénesis dirigida a un sitio, la ligadura de secuencias adicionales, la PCR y la construcción de sistemas de expresión adecuados son todas bien conocidas en la técnica actualmente. Pueden construirse sintéticamente porciones de ADN o todo el ADN que codifica la proteína deseada utilizando técnicas estándar de fase sólida, preferiblemente para incluir sitios de restricción con el fin de facilitar la ligadura. Pueden proporcionarse a las secuencias de ADN codificadoras elementos de control adecuados para la transcripción y la traducción de la secuencia codificadora incluida. Como es bien conocido, están disponibles actualmente sistemas de expresión que son compatibles con una amplia variedad de huéspedes, incluyendo huéspedes procarióticos tales como bacterias y huéspedes eucarióticos tales como levaduras, células vegetales, células de insecto, células de mamífero, células de ave, etcétera.
Las células que expresan el receptor son puestas en contacto posteriormente con el compuesto de ensayo para observar la unión o bien la estimulación o la inhibición de una respuesta funcional.
Alternativamente, pueden utilizarse membranas celulares aisladas que contengan el receptor expresado para medir la unión del compuesto.
Para medir la unión pueden utilizarse compuestos marcados radiactivamente o fluorescentemente. Como compuesto de referencia puede utilizarse LH o FSH recombinante humana. Alternativamente, pueden realizarse también ensayos de unión competitiva.
Otro ensayo implica la selección de compuestos agonistas de los receptores de LH o FSH mediante la determinación de la estimulación de la acumulación de cAMP mediada por los receptores. Así, tal método implica la expresión del receptor en la superficie celular de una célula huésped y la exposición de la célula al compuesto de ensayo. Se mide posteriormente la cantidad de cAMP. El nivel de cAMP estará reducido o incrementado dependiendo del efecto inhibidor o estimulante del compuesto de ensayo después de unirse al receptor.
Además de la medida directa de, por ejemplo, los niveles de cAMP en la célula expuesta, pueden utilizarse células que además de la transfección con el ADN que codifica el receptor estén también transfectadas con un segundo ADN que codifique un gen informador cuya expresión responda al nivel de cAMP. Tales genes informadores podrían ser inducibles por cAMP o podrían ser construidos de tal forma que estuvieran conectados con nuevos elementos sensibles a cAMP. En general, la expresión del gen informador podría ser controlada por cualquier elemento de respuesta que reaccione a un cambio de los niveles de cAMP. Genes informadores adecuados son por ejemplo LacZ, fosfatasa alcalina, la luciferasa de la luciérnaga y la proteína fluorescente verde. Los principios de tales ensayos de transactivación son bien conocidos en la técnica y están descritos en, por ejemplo, Stratowa, Ch., Himmler, A. y Czernilofsky, A.P., Curr. Opin. Biotechnol. 6, 574 (1995).
Para seleccionar compuestos activos sobre el receptor de LH o FSH, el ensayo a una concentración de 10^{-5} M debe tener como resultado una actividad de más del 20% de la actividad máxima cuando se utilizan como referencia LH o FSH. Otro criterio podría ser el valor de la CE_{50}, que debe ser < 10^{-5} M, preferiblemente < 10^{-7} M.
El técnico experto reconocerá que los valores deseables de la CE_{50} dependen del compuesto analizado. Por ejemplo, un compuesto con una CE_{50} que sea menor de 10^{-5} M se considera generalmente un candidato para la selección de fármacos. Preferiblemente, este valor es menor de 10^{-7} M. Sin embargo, un compuesto que tenga una CE_{50} mayor, pero que sea selectivo para el receptor particular, puede ser un candidato incluso mejor.
La selección de compuestos agonistas de los receptores de LH puede ser realizada también mediante la utilización de un bioensayo con células de Leydig de ratón (Van Damme, M., Robersen, D. y Diczfalusy, E., Acta Endocrinol. 77, 655-671 (1974); Mannaerts, B., Kloosterboer, H. y Schuurs, A., Neuroensocrinology of reproduction, R. Rolland y col. Eds., Elsevier Science Publishers B.V., 49-58 (1987)). En este ensayo, puede medirse la estimulación de la producción de testosterona mediada por el receptor de LH en células de Leydig aisladas de ratones macho.
La actividad agonista de FSH de los compuestos puede ser también determinada en un modelo ex vivo utilizando folículos de ratón cultivados de acuerdo con Nayudu, P. y Osborn, S. (J. Reproduction and Fertility 95, 349-362 (1992)). Por tanto, folículos de ovarios de ratón son aislados y cultivados en presencia de compuestos agonistas de la FSH para inducir el crecimiento folicular. Las medidas del diámetro folicular y de estradiol en el medio de cultivo son indicativas del crecimiento folicular.
Para medir la actividad LH in vivo de los compuestos, puede estudiarse la inducción de la ovulación en ratones inmaduros. En este ensayo, ratones hembra inmaduros son estimulados con FSH de orina y tratados 48 horas después aproximadamente con un compuesto agonista de LH. Los animales son sacrificados después del tratamiento con el agonista de LH y se determina microscópicamente el número de óvulos en el oviducto.
Para medir la actividad FSH in vivo de los compuestos, ratas hembra inmaduras son tratadas a las 0, 8, 24 y 32 horas con un compuesto agonista de FSH para inducir el crecimiento folicular. A las 52 horas después del comienzo del experimento se inyecta a los animales hCG para inducir la ovulación. Los animales son sacrificados 72 horas después del comienzo del experimento y se determina microscópicamente el número de óvulos en el oviducto. Se determina además el peso de los ovarios.
Los compuestos de la presente invención pueden ser aplicados clínicamente en aquellos regímenes en los que se utilizan actualmente LH o hCG. Éstos incluyen la sustitución de LH entre sujetos con hipogonadismo hipogonadal ya sean varones o mujeres, la administración a mitad del ciclo para inducir la ovulación (inducción de la ovulación (OI) o hiperestimulación controlada (COH) o estimulación del cuerpo lúteo).
Los ejemplos siguientes son ilustrativos de la invención y no deben ser interpretados de ninguna manera como limitantes del ámbito de la invención.
Ejemplos Ejemplo 1 ter-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(azetidin-1-il)-acetamido)-fenil-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida (a). 5-Ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-oxopirimidina
Una mezcla de sulfato de S-metilisotiourea (69,0 g), 3-nitrobenzaldehído (75,0 g), cianoacetato de etilo (56,0 ml) y carbonato de potasio (72,5 g) en EtOH absoluto (1500 ml) fue agitada a 60ºC durante 16 horas. La mezcla de reacción fue enfriada a 0ºC en un baño de hielo. El precipitado resultante fue extraído por filtración, lavado con EtOH absoluto y disuelto en agua caliente (100ºC). La solución fue enfriada a temperatura ambiente, acidificada con HCl 2 N hasta pH 2 y enfriada a 0ºC en un baño de hielo. El precipitado resultante fue extraído por filtración y lavado con agua de hielo. El agua residual del precipitado fue eliminada por coevaporación con 1,4-dioxano.
Rendimiento:
54,0 mg.
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 289,0.
TLC:
R_{f} = 0,3, gel de sílice, DCM/MeOH = 9/1 (v/v).
(b) 6-Cloro-5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-pirimidina
Se añadió POCl_{3} (100 ml) a una solución agitada de 5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-oxopirimidina (Ejemplo 1(a), 25,0 g) en 1,4-dioxano seco (300 ml). Después de 3 horas a 90ºC, la mezcla fue enfriada a temperatura ambiente y concentrada bajo presión reducida. El residuo fue disuelto en 1,4-dioxano (100 ml) y la solución resultante fue enfriada a 0ºC. Se añadió con precaución agua de hielo fundente. El precipitado resultante fue extraído por filtración y lavado con agua. El agua residual del precipitado fue eliminada mediante coevaporación con 1,4-
dioxano.
Rendimiento:
26,0 g.
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 307,0
TLC:
R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
(c) Etil 5-Ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-(etoxicarbonilmetiltio)-pirimidina
Se añadió DIPEA (15,7 ml) a una solución agitada de 2-mercaptoacetato de etilo (9,3 ml) y 6-cloro-5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-pirimidina (Ejemplo 1(b), 26,0 g) en una mezcla de EtOH (250 ml) y DCM (250 ml). Después de 1 hora a temperatura ambiente, se añadió a la mezcla HCl acuoso 0,1 N (500 ml) que fue luego extraída con DCM (3*500 ml), secada (MgSO_{4}) y concentrada bajo presión reducida.
Rendimiento:
28,0 g.
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 390,4
TLC:
R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
(d) 5-Amino-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxilato de etilo
Se agitó a temperatura de reflujo (100ºC) durante 16 horas una mezcla de etil 5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-(etoxicarbonilmetiltio)-pirimidina (Ejemplo 1(c), 28,0 g) y DIPEA (30 ml) en una mezcla de tolueno (150 ml) y EtOH (150 ml). La mezcla fue enfriada posteriormente hasta temperatura ambiente y concentrada bajo presión reducida. La DIPEA residual fue eliminada mediante coevaporación con tolueno.
Rendimiento:
28,0 g.
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 391,2
TLC:
R_{f} = 0,6, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
(e) 5-Amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxilato de etilo
Se añadió EtOH (400 ml) a una mezcla de 5-amino-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxilato de etilo (Ejemplo 1(d), 28,0 g), HCl acuoso concentrado (15 ml) y cloruro de estaño (II) (41,0 g) en 1,4-dioxano (400 ml). La mezcla fue agitada a 90ºC durante 16 horas. La mezcla fue luego enfriada hasta temperatura ambiente y concentrada bajo presión reducida. El residuo fue suspendido en EtOAc (1000 ml). Se añadió NaOH acuoso 4 N para obtener un pH de 10-11. La mezcla fue agitada vigorosamente y la capa orgánica fue separada, secada (MgSO_{4}) y concentrada bajo presión reducida.
Rendimiento:
21,0 g.
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 361,0
TLC:
R_{f} = 0,6, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
(f) Ácido 5-Amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxílico
Se añadió hidróxido de potasio (32,4 g) a una solución de 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxilato de etilo (Ejemplo 1(e), 21,0 g) en una mezcla de 1,4-dioxano (300 ml) y agua (100 ml). Después de 16 horas a 90ºC, la mezcla fue enfriada hasta 10ºC y se añadió ácido cítrico acuoso 2 N (300 ml) bajo agitación vigorosa. El precipitado resultante fue extraído por filtración, lavado con agua (180 ml) y secado in vacuo.
Rendimiento:
14,0 g.
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 333,0
TLC:
R_{f} = 0,5, gel de sílice, DCM/MeOH = 9/1 (v/v).
(g) ter-Butil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3d]pirimidina-6-carboxamida
Se añadió TBTU (16,1 g) a una solución de ácido 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxílico (Ejemplo 1(f), 14,0 g), DIPEA (17,4 ml) y ter-butilamina (7,3 g) en DCM/DMF (1/1, v/v, 250 ml). Después de 3 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue lavada con NaHCO_{3} acuoso saturado (3*100 ml), HCl acuoso 0,1 N (100 ml) y agua (100 ml). La capa orgánica fue concentrada bajo presión reducida. El producto bruto fue purificado mediante cristalización a partir de EtOH absoluto caliente (300 ml).
Rendimiento:
10,5 mg.
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 388,2
HPLC:
R_{t} = 30,72 minutos, Luna C-18(2), 5 \mum, 250*2,0 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 42ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente agua/ACN/MeOH = 90/9,5/0,5 a 0/95/5, tiempo de carrera = 50 minutos.
(h) ter-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
Se añadió cloruro de bromoacetilo (615 mg) a una solución de ter-butil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3d]pirimidina-6-carboxamida (Ejemplo 1 (g), 1,08 g) y DIPEA (2,43 ml) en DCM seco (20 ml). Después de 3 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue diluida con DCM, lavada con NaHCO_{3} acuoso saturado, secada (MgSO_{4}) y concentrada bajo presión reducida. El producto bruto fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice utilizando como eluyente heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
Rendimiento:
910 mg.
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 510,2
TLC:
R_{f} = 0,3, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
(i) ter-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-azetidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
Se añadió ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
(Ejemplo 1(h), 91 mg) a una solución de clorhidrato de azetidina (120 mg) y N,N-diisopropiletilamina (0,25 ml) en DCM (5 ml). Después de 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue lavada con NaHCO_{3} acuoso saturado, secada (MgSO_{4}) y concentrada bajo presión reducida. El producto bruto fue purificado mediante HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: TFA acuoso al 0,1% + ACN acuoso al 10%/ACN = 90/10 a 10/90 en 30 minutos. El compuesto del título fue posteriormente liofilizado a partir de agua con TFA al 0,1%.
Rendimiento:
56 mg (TFA-sal).
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 485,2
HPLC:
R_{t} = 13,45 minutos, columna Luna C-18(2), 3 \mum, 100*2,0 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN = 10/70/20 a 10/10/80 (v/v), tiempo de carrera = 20 minutos.
Ejemplo 2 ter-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(morfolin-4-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
Se añadió morfolina (5,0 ml) a una solución de ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida (Ejemplo 1(h), 1,0 g) en THF (50 ml). Después de 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue concentrada bajo presión reducida. El residuo fue purificado mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando como eluyente DCM/MeOH = 9/1. El producto bruto fue purificado adicionalmente mediante HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: TFA acuoso al 0,1%/agua/ACN = 3/97/0 a 3/7/90 en 30 minutos. El compuesto del título puro fue liofilizado a partir de una mezcla de TFA acuoso al 0,1% y agua.
Rendimiento:
215 mg (TFA-sal).
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 515,2
HPLC:
R_{t} = 20,62 minutos, Luna C-18(2), 5 \mum, 150*2 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN/MeOH = 10/72/17/1 a 10/18/68/4 (v/v), tiempo de carrera = 40 minutos.
Ejemplo 3 ter-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(tiomorfolin-4-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
Se añadió tiomorfolina (2,16 ml) a una solución de ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida (Ejemplo 1(h), 1,09 g) en DCM (50 ml). Después de 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue diluida con DCM, lavada con NaHCO_{3} acuoso saturado, secada (MgSO_{4}) y concentrada bajo presión reducida. El producto bruto fue purificado mediante HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el gradiente siguiente: TFA acuoso al 0,1% + ACN acuoso al 10%/ACN = 100/0 a 10/90 en 30 minutos. El compuesto del título puro fue liofilizado a partir de agua acidificada con HCl acuoso 1 N.
Rendimiento:
816 mg
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 531,2
HPLC:
R_{t} = 14,72 minutos, columna Luna C-18(2), 3 \mum, 100*2 mm, detección UV = 210 nm + 254 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN/MeOH = 10/72/17/1 a 10/18/68/4 (v/v), tiempo de carrera = 20 minutos.
Ejemplo 4 ter-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
Se añadió piperidina (3,0 ml) a una solución de ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida (Ejemplo 1(h), 1,0 g) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml). Después de 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue concentrada bajo presión reducida. El residuo fue purificado mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando como eluyente DCM/MeOH = 9/1. El producto bruto fue purificado adicionalmente mediante HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: TFA acuoso al 0,1%/ACN = 100/0 a 10/90 en 30 minutos. El compuesto del título puro fue liofilizado a partir de una mezcla de TFA acuoso al 0,1% y agua.
Rendimiento:
851 mg (TFA-sal)
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 513,2
HPLC:
R_{t} = 37,3 minutos, Luna C-18(2), 5 \mum, 150*2 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN = 20/60/20 a 20/0/80 (v/v), tiempo de carrera = 40 minutos.
Ejemplo 5 ter-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(pirrolidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
Se añadió pirrolidina (3,0 ml) a una solución de ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida (Ejemplo 1(h), 1,0 g) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml). Después de 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue concentrada bajo presión reducida. El residuo fue purificado mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando como eluyente DCM/MeOH = 9/1. El producto bruto fue purificado adicionalmente mediante HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: TFA acuoso al 0,1%/ACN = 100/0 a 10/90 en 30 minutos. El compuesto del título puro fue liofilizado a partir de una mezcla de TFA acuoso al 0,1% y
agua.
Rendimiento:
616 mg (TFA-sal)
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 499,2
HPLC:
R_{t} = 37,5 minutos, Luna C-18(2), 5 \mum, 150*2 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN = 20/60/20 a 20/0/80 (v/v), tiempo de carrera = 40 minutos.
Ejemplo 6 ter-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperazin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
Se añadió piperazina (2,5 g) a una solución de ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida (Ejemplo 1(h), 1,0 g) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml). Después de 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla fue concentrada bajo presión reducida. El residuo fue purificado mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando como eluyente DCM/MeOH = 7/1. El producto bruto fue purificado adicionalmente mediante HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: TFA acuoso al 0,1%/ACN = 100/0 a 10/90 en 30 minutos. El compuesto del título puro fue liofilizado a partir de una mezcla de TFA acuoso al 0,1% y
agua.
Rendimiento:
766 mg (bis TFA-sal)
MS-ESI:
[M+H]^{+} = 514,4
HPLC:
R_{t} = 33,7 minutos, Luna C-18(2), 5 \mum, 150*2 mm, detección UV = 210 nm, temperatura de la estufa = 40ºC, flujo = 0,25 ml/minuto, eluyente tampón fosfato 50 mM pH 2,1/agua/ACN = 20/60/20 a 20/0/80 (v/v), tiempo de carrera = 40 minutos.
Ejemplo 7 Bioactividad in vitro de CHO-LH y CHO-FSH
Se analizó la actividad agonista de LH de los compuestos en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) transfectadas de manera estable con el receptor humano y cotransfectadas con un elemento sensible a cAMP (CRE)/promotor que dirige la expresión de un gen informador de la luciferasa de la luciérnaga. La unión del ligando al receptor de LH acoplado a Gs tendrá como resultado un incremento de cAMP, que a su vez inducirá una transactivación incrementada de la construcción con el informador de la luciferasa. La señal de la luciferasa fue cuantificada utilizando un contador de luminiscencia. Para los compuestos de ensayo, se calcularon los valores de la CE_{50} (concentración del compuesto de ensayo que produce una estimulación semimáxima (50%)). Para ese fin se utilizó el programa de ordenador GraphPad PRISM, versión 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego).
De manera similar, se analizó la actividad agonista de FSH de los compuestos en células CHO transfectadas con el gen informador de la luciferasa y el receptor de la FSH humana. Los resultados están mostrados en la Tabla 1.
Bioactividad in vivo
Para medir la actividad in vivo de los compuestos agonistas de los receptores de LH/FSH, se estudió la inducción de la ovulación en ratones inmaduros. En este ensayo, ratones hembra inmaduros fueron estimulados con FSH de orina (Humegon, 12,5 UI/animal). Cuarenta y ocho horas después aproximadamente, los animales fueron tratados con un compuesto agonista de LH/FSH a una nivel de dosis de 50 mg/kg. Los animales fueron sacrificados 24 horas después del tratamiento con el agonista de LH/FSH y se determinó microscópicamente el número de óvulos en el oviducto. Los resultados están mostrados en la Tabla 1.
TABLA 1
11

Claims (5)

1. Un derivado de tieno[2,3-d]pirimidina de acuerdo con la fórmula general I,
12
o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, donde R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo que tiene 2-6 átomos de carbono, conteniendo opcionalmente uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y/o S.
2. Un compuesto seleccionado del grupo de ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(azetidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(morfolin-4-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(tiomorfolin-4-il)-acetamido)-fenil)-tieno
[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida; ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(pirrolidin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida o ter-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-(2-(piperazin-1-il)-acetamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida.
3. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1-2 para ser utilizado en terapia.
4. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto tieno[2,3-d]pirimidina de acuerdo con las reivindicaciones 1-2 o una sal o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, en mezcla con un agente auxiliar farmacéuticamente aceptable.
5. Utilización de compuestos tieno[2,3-d]pirimidina de acuerdo con las reivindicaciones 1-2 o de una sal o solvato de los mismos farmacéuticamente aceptable para la fabricación de un medicamento destinado al control de la fertilidad.
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