ES2275285T3 - Proteinas purificadas, secuencias de adn recombinante y procesos para producir bebidas libres de cafeina. - Google Patents
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Abstract
PROTEINA PURIFICADAS, SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN SU EXPRESION Y MOLECULAS DE ADN RECOMBINANTE, INCLUYENDO HUESPEDES TRANSFORMADOS CON ELLAS, PARA TRANSFORMAR LAS PLANTAS DE CAFE PARA SUPRIMIR LA EXPRESION DE CAFEINA. LAS SECUENCIAS DE ADN Y LAS MOLECULAS DE ADN RECOMBINANTE SE CARACTERIZAN PORQUE CODIFICAN LA EXPRESION DE UNA ENZIMA EN LA RUTA DE LA SINTESIS DE CAFEINA DEL CAFE. LAS PLANTAS DEL CAFE TRANSFORMADAS CON MOLECULAS DE ADN QUE CODIFICAN LA TRANSCRIPCION DE ARNM QUE ES ANTISENTIDO RESPECTO AL ARNM QUE CODIFICA LA EXPRESION DE AL MENOS UNA ENZIMA EN LA RUTA DE LA BIOSINTESIS DE CAFEINA.
Description
Proteínas purificadas, secuencias de ADN
recombinante y procesos para producir bebidas libres de cafeína.
Esta solicitud se relaciona con proteínas
purificadas, con secuencias de ADN recombinante, con huéspedes
transformados con ellos y con procesos para la producción de
bebidas y productos alimenticios libres de cafeína. Más
particularmente, esta solicitud se relaciona con proteínas
purificadas, y con secuencias de ADN recombinante que suprime la
expresión de la cafeína en las plantas de café, y en las frutas
cosechadas de allí. La invención produce líneas estables de plantas
de café libres de cafeína cuyos frutos, después de tostados y
molidos, pueden ser utilizados para preparar café libre de cafeína.
Se espera que la invención pueda ser utilizada para suprimir la
síntesis de cafeína en té (Camellia sinensis) y en cola
(Cola acuminata), así como de los alcaloides relacionados en
el chocolate (Theobroma cacao).
El café se prepara a partir de granos molidos
tostados de las plantas del género Coffea, generalmente a
partir de la especie C. arabica. Las plantas de café producen
el alcaloide cafeína, que está presente en sus frutos secos, los
granos de café. Debido a que muchos bebedores de café prefieren el
café sin cafeína, se han desarrollado una variedad de procesos para
remover la cafeína de los granos de café. Todos estos procesos dan
como resultado la remoción en los granos de otras sustancias
diferentes a la cafeína, afectando por lo tanto en forma adversa el
sabor del café preparado a partir de los granos tratados. Aunque se
conocen unos cuantos cafés libres de cafeína de ocurrencia natural y
géneros relacionados (Mascarocoffea spp y Coffea
bengalensis), ellos no tienen valor comercial. (Charrier y
Berthaud, "Variation Of Caffeine Content In The Coffea Genus",
Cafe' Cacao The', 14:251-264 (1975)). Por lo tanto,
existe la necesidad de un método para producir granos de café
descafeinados que no conduzcan a la remoción de sustancias de los
granos diferentes a la cafeína.
La cafeína es un alcaloide de purina de
ocurrencia natural producida por el café y las plantas de té, entre
otras. Se cree que la síntesis de cafeína protege a las plantas
contra los insectos. Las plantas de café sintetizan cafeína a partir
del nucleósido xantosina en cuatro reacciones secuenciales como se
muestra en la Figura 1. Para revisión ver Suzuki, T.,
Ashihara, H. y Waller, G.R., Phytochemistry 31:2575 (1992).
La primera etapa en la ruta es la metilación del nucleósido
xantosina por medio de la S-adenosilmetionina, que
es catalizada por medio de la enzima xantosina N^{7} metil
transferasa (XMT). El producto, 7-metilxantosina se
hidroliza (se remueve una ribosa) hasta
7-metilxantina, y sufre metilaciones adicionales
hasta teobromina y cafeína. Se espera que la interrupción de esta
secuencia de reacciones de síntesis bloquearía la síntesis de la
cafeína.
Por lo tanto, una estrategia para eliminar en
forma selectiva la cafeína de las plantas de café es la de evitar la
síntesis de enzimas específicas en la ruta para la biosíntesis de la
cafeína. En una modalidad esta invención se relaciona con la
alteración genética de las plantas de café para eliminar la síntesis
de la XMT. En la modalidad actualmente preferida, la síntesis de la
XMT se suprime por medio de la transformación de plantas de café con
una secuencia de ADN que codifica la transcripción para un ARN
(ARNm) que es antisentido con el ARNm que codifica la expresión para
la XMT. Se puede generalizar la invención para producir otras
bebidas y productos alimenticios libres de cafeína, incluidos té,
cacao, y otras bebidas o alimentos basados en chocolate.
Las proteínas purificadas, las secuencias de ADN
que codifican por lo tanto la expresión y las moléculas de ADN
recombinante, incluyendo los huéspedes transformados con ellas, para
transformar las plantas de café para suprimir la expresión de la
cafeína. Las secuencias de ADN y las moléculas de ADN recombinante
se caracterizan porque ellas codifican la expresión de un enzima,
xantosina N^{7} metil transferasa (XMT), que es la primera etapa
en la ruta para la síntesis de la cafeína en el café. Se suministran
la secuencia base de aquel ADN y la secuencia predicha de
aminoácidos de la XMT.
Las plantas de café se transforman con moléculas
de ADN que codifican la transcripción para el ARNm que es
antisentido con el ARNm que codifica la expresión de al menos un
enzima en la ruta para la biosíntesis de la cafeína. El ARN
antisentido se enlaza al ARNm de la XMT, inactivando así al ARNm
que codifica la primera etapa en la ruta para la síntesis de la
cafeína. El resultado es que las plantas transformadas son incapaces
de sintetizar cafeína, aunque otros aspectos de su metabolismo no se
afecten.
La Figura 1 es un dibujo esquemático de la ruta
para la síntesis de la cafeína en Coffea arabica.
La Figura 2 es una fotografía de un gel SDS PAGE
teñido de color plata de la xantosina N^{7} metil transferasa
purificada.
La Figura 3 es una gráfica de una densitometría
que muestra la elusión de fragmentos trípticos de la xantosina
N^{7} metil transferasa purificada después de la separación por
medio de HPLC.
La Figura 4 es una descripción de los
iniciadores oligonucleótidos utilizados para hacer una selección del
ADNc de la genoteca de ADNc que codifica a la xantosina N^{7}
metil transferasa.
La Figura 5 es la secuencia base del ADNc que
codifica a la xantosina N^{7} metil transferasa.
La Figura 6 con la secuencia predicha de
aminoácidos de la xantosina N^{7} metil transferasa.
Con el propósito de la que la invención aquí
descrita pueda ser entendida más completamente, se exponen la
siguiente descripción detallada. En la descripción se emplean los
siguientes términos:
- Nucleótido -Una unidad monomérica de ADN o de ARN que consiste de una fracción de azúcar (pentosa), un fosfato, y una base heterocíclica nitrogenada. La base está enlazada a la fracción de azúcar a través de un carbono glicosídico (1' carbono de la pentosa) y esa combinación de base y azúcar es llamada un nucleósido. La base caracteriza al nucleósido. Las cuatro bases de ADN son adenina ("A"), guanina ("G"), citosina ("C"), y timina ("T"). Las cuatro bases de ARN son A, G, C y uracilo ("U").
- Secuencia de ADN -Una disposición lineal de nucleótidos conectados entre sí por medio de enlaces fosfodiéster entre los carbonos 3' y 5' de pentosas adyacentes.
- Codón -Una secuencia de ADN de tres nucleótidos (un triplete) que codifica a través del ARNm un aminoácido, una señal de inicio de la traducción o una señal de terminación de la traducción. Por ejemplo, la tripleta de nucleótidos TTA, TTG, CTT, CTC, CTA y CTG codifica al aminoácido leucina ("Leu"), TAG, TAA y TGA son señales de detención de la traducción y ATG es una señal de inicio de la traducción, que también codifica al aminoácido metionina ("MET").
- Polipéptido -Una disposición lineal de aminoácidos conectados uno a continuación del otro por medio de enlaces peptídicos entre el grupo amino y el grupo carboxilo de los aminoácidos adyacentes.
- Genoma -El ADN completo de una célula o de un virus. Incluye entre otros al gen estructural que codifica a los polipéptidos de la sustancia, así como al promotor y a los sitios de iniciación y terminación de transcripción y de traducción.
- Gen -Una secuencia de ADN que codifica a través de su ARN molde o mensajero ("ARNm") a una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.
- Transcripción -El proceso de producir ARNm a partir de un gen o de una secuencia de ADN.
- Traducción -El proceso de producir un polipéptido a partir de ARNm.
- Expresión -El proceso experimentado por un gen o por una secuencia de ADN para producir un polipéptido. Es una combinación de transcripción y de traducción.
- Plásmido -Una secuencia de ADN bicatenario no cromosomal que contiene un "replicón" intacto de tal manera que el plásmido se replica en una célula huésped. Cuando se coloca al plásmido dentro de un organismo unicelular, se pueden cambiar o transformar las características de ese organismo como resultado del ADN del plásmido. Por ejemplo, un plásmido que porta al gen de resistencia a la tetraciclina (TETR) transforma a una célula previamente sensible a la tetraciclina en una célula que es resistente a ella. Una célula transformada por un plásmido es llamada un "transformante".
- Fago o Bacteriófago -Los virus bacteriales, muchos de los cuales consisten de secuencias de ADN encapsidadas en una envoltura o recubrimiento de proteína ("cápside").
- Vehículo de Clonación -Un plásmido, ADN de fago, cósmido u otra secuencia de ADN que es capaz de replicarse en una célula huésped, caracterizada por uno o por un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasas en los cuales tales secuencias de ADN pueden ser cortadas en una forma determinable sin la perdida concomitante de una función biológica esencial del ADN, por ejemplo, replicación, producción de proteínas de recubrimiento o perdida del promotor o de los sitios de enlazamiento y que contienen un marcador adecuado para el uso en la identificación de células transformadas, por ejemplo, resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina. Un vehículo de clonación es a menudo llamado un vector.
- Clonación -El proceso de obtención de una población de organismos o secuencias de ADN derivados de uno de tales organismos o secuencias por medio de reproducción asexual.
- Molécula de ADN Recombinante o ADN Híbrido -Una molécula consiste de segmentos de ADN de genomas diferentes que han sido unidos por los extremos fuera de las células vivas y capaces de ser mantenidas en células vivas.
- ADNc -Una cadena de ADN complementaria a un ARNm que codifica para un polipéptido particular.
Aunque la estrategia para producir café libre de
cafeína se puede generalizar a otras enzimas en la ruta para la
síntesis de cafeína en plantas de café y en otras plantas para
producir cafeína, en la modalidad actualmente preferida de esta
invención, se suprime la expresión de la primera enzima única en la
ruta, la xantosina N^{7} metil transferasa (XMT). Mientras que el
papel de la XMT en la síntesis de cafeína ha sido dilucidado por
medio de la radiomarcación de los precursores, hasta la fecha la
enzima no ha sido purificada ni se ha determinado su secuencia de
aminoácidos. Esta invención incluye por lo tanto a la XMT
sustancialmente purificada. La invención incluye además la secuencia
de aminoácidos de fragmentos trípticos aislados de la XMT
purificada.
Las sondas de ADNc basadas en las porciones de
la secuencia de aminoácidos obtenida a partir de muestras de la
enzima purificada fueron sintetizadas y se amplificó una porción del
gen utilizando PCR. Se utilizaron los productos PCR para
seleccionar una genoteca de ADNc sintetizada a partir de ARNm de
hoja joven para identificar a los transcriptos que codifican a la
XMT. Los transcriptos positivos fueron secuenciados y se obtuvo
aproximadamente 90% del gen que codifica a la XMT.
El ADN que codifica la expresión para XMT se
incorpora dentro de un vector de transformación
pBl-121 que incluye un gen de resistencia a la
kanamicina. La incorporación exitosa del vector dentro de las
células de la planta será monitoreada por medio de la adquisición
de resistencia al antibiótico. Se utilizan las construcciones para
transformar a los embriones somáticos del café en cultivo de tejido.
Los embriones transformados son cultivados después de eso en nuevas
plantas de café que no producen cafeína. El café descafeinado en
forma natural se prepara a partir de frutos molidos tostados de
estas nuevas plantas.
Más específicamente, se maceraron tejidos de
hoja fresca de hojas jóvenes de C. arabica y se extrajo la
proteína de allí. Se analizaron los extractos purificados en
columna por la actividad enzimática, monitoreando la metilación de
la xantosina utilizando S-adenosilmetionina marcada
con C^{14} como substrato. El producto de reacción fue confirmado
como 7-metilxantosina por medio de la migración del
producto marcado de la reacción con la migración de
3-metilxantina, 7-metilxantina,
8-metilxantina, 7-metilxantosina,
xantina y xantosina en cada uno de los cuatro diferentes sistemas
cromatográficos.
La purificación de los aislados de proteína se
determinó utilizando electroforesis SDS-PAGE y
electroforesis bidimensional en gel. La coloración plata de los
geles SDS-PAGE en una dimensión indicó la presencia
de un doblete con la actividad enzimática de XMT, con un peso
molecular de 36-37 kiloDaltons (kD) como se muestra
en la Figura 2. Cada proteína se resolvió adicionalmente con
isoelectroenfoque. Los datos indican la presencia de isozimas de la
XMT que pueden resultara partir de la modificación postraducción de
la proteína, alternativamente, puede existir una familia de genes
que codifican a las enzimas XMT.
Se utilizó el doblete visualizado sobre los
geles SDS-PAGE para la secuenciación de la proteína.
La XMT purificada fue sometida a digestión tríptica parcial para
crear fragmentos para análisis adicionales; se resolvieron tres
picos utilizando HPLC. La secuenciación fue realizada por el
Laboratorio de Estructura de las Proteínas de la Universidad de
California en Davis, utilizando degradación automatizada de Edman.
(Edman, P. y Begg, G., Eur. J. Biochem. 1:80). Se
resolvieron dos secuencias únicas, y se las utilizó para construir
iniciadores para la síntesis de la sonda. Se extrajo el ARN de las
hojas del café. Se purificaron a partir de allí las secuencias poli
(A^{+}) que contienen ARNm. Se preparó una genoteca de ADNc a
partir del ARNm de poli (A^{+}) utilizando transcriptasa inversa.
Se preparó el ADN bicatenario utilizando ADN polimerasa l, y se lo
recuperó por medio de precipitación. Se fraccionó el ADNc y se lo
insertó dentro del fago para amplificación. Se seleccionó la
genoteca de ADNc con una sonda sintetizada por PCR producida
utilizando iniciadores basados en la secuencia de ADN esperada a
partir de la secuencia de aminoácidos de la XMT purificada. Se ha
identificado un clon que produce un ADNc que contiene todas las
secuencias que codifican la XMT.
El ADNc correspondiente al gen que codifica a la
XMT es utilizado para transformar a las plantas embrionarias de
café. Se utiliza el plásmido pBl-121 como un vector
transformador. Las secuencias correspondientes al ADN que codifica
la expresión para XMT se inserta dentro del plásmido en una
orientación invertida adyacente a un promotor 35S del virus del
mosaico de coliflor. El ARN transcrito a partir de allí será
complementario al ARNm que codifica a la secuencia de aminoácidos
de la XMT. Las construcciones completas se amplifican en
huéspedes bacterianos. Se rompen los huéspedes y se une el vector
amplificado a partículas coloidales de oro. Las partículas
coloidales de oro con los vectores adheridos se insertan dentro de
los protoplastos de la planta de café impulsando las partículas a
alta velocidad hacia las células como se describe en la patente
estadounidense 5.107.065. Las plantas jóvenes exitosamente
transformadas se identifican por medio de la resistencia a los
antibióticos. Las plantas transformadas no producen cafeína.
Se recolectaron tejidos de hoja joven, de menos
de 5 mm de longitud (equivalente a la etapa B3 (Frischknecht, P.M.,
Ulmer-Dufek, J. y Baumann, T.W. (1986)
Phytochemistry 25:613) a partir de árboles que crecieron en
la Estación de Investigación Waimanalo de la Universidad de Hawai,
Oahu, Hawai. Las hojas fueron inmediatamente sumergidas en nitrógeno
líquido (N_{2} líquido) y almacenadas a -70ºC hasta su uso. Todos
los procedimientos posteriores se llevaron a cabo a 4ºC a menos que
se estableciera otra cosa. Se maceró el tejido de la hoja (150 g) en
un mortero con pistilo bajo N_{2} líquido y, mientras se
encontraba aún congelado, fue transferido a un molino doméstico de
café preenfriado y molido con un pequeño pedazo de hielo seco
aproximadamente durante 30 segundos. El tejido en polvo fue añadido
a un vaso de precipitados que contenía 1,5 L de acetona al 80%
enfriada con hielo, tiourea 5 mM y
\beta-mercaptoetanol 12,5 mM. Después de mezclar
con agitación magnética durante 45 minutos, se recuperó el tejido
por medio de filtración al vacío en un embudo Buchner que contenía
papel de filtro Whatman No. 1. Se lavó el tejido con 2,5 L de
acetona al 80% enfriada con hielo que contenía tiourea y
\beta-mercaptoetanol como anteriormente, se lo
secó durante 20 minutos y luego se lo liofilizó durante 48
horas.
El polvo resultante en la acetona fue
homogenizado en un mezclador con 400 mL de búfer para extracción
(EB) (PIPES 0,1 M [pH 7,0], Na_{2}EDTA 0,5 mM, Na_{2}EGTA 0,5
mM, ácido ascórbico al 5%, ditiotreitol [DTT] 5 mM, tiourea 5 mM,
clorhidrato de L-cisteína 12 mM, polietilén glicol
(PEG) 20.000 al 1%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF] 0,1 mM, y
20 g de polivinil pirrolidona [PVPP]). Se homogenizó la suspensión
durante 10 minutos a velocidad media, y se transfirió luego a
botellas de centrífuga de 250 mL y se centrífugo a 23.000 x g
durante 30 minutos en un rotor GSA
(Dupont-Sorvall).
Los 350 mL de sobrenadante crudo obtenidos
fueron llevados hasta saturación con sulfato de amonio (AS) al 40%
durante 30 minutos por medio de la adición lenta de 79,86 g de polvo
de AS mientras se agita en un vaso de precipitados rodeado por un
baño de hielo. La mezcla fue transferida nuevamente a botellas de
centrífuga de 250 mL y se centrífugo a 23.000 x g durante 30 minutos
como anteriormente. Los 350 mL del sobrenadante obtenido fueron
cargados en una columna cromatográfica (HIC) de 40 mL de interacción
hidrófoba con metilo Macro-Prep
(Bio-Rad) con una velocidad de flujo de 2,5 mL/min.
Todas las fracciones de la columna fueron monitoreadas por proteína
utilizando una absorbancia a 280 nm. Se lavó la columna HIC con un
búfer para equilibrio previo que contenía AS 1,7 M,
bis-tris-propano 20 mM (pH 6,8), y
DTT 5 mM hasta que se estableció una línea base cercana a cero. Se
despojó luego la columna con un búfer que contenía tris 10 mM (pH
7,0), DTT 5 mM, MgCl_{2} 1 mM. Se descartaron los primeros 15 mL
que salieron de la columna y el eluato restante (200 mL) fue cargado
por gravedad en una columna de 100 mL de gel de afinidad
Affi-Gel blue (100-200 mallas,
Bio-Rad) que tenía el colorante Cibacron blue F3GA
unido en forma covalente a la matriz. El gel fue equilibrado
previamente con tris 10 mM (pH 7,0), DTT 5 mM, búfer de carga
MgCl_{2} 1 mM. Se lavó en forma extensa la columna con este búfer
de carga hasta estabilizar la línea base cerca de cero, y las
proteínas enlazadas fueron eluidas con un búfer que contenía tris
10 mM (pH 7,0), DTT 5 mM, y cloruro de sodio (NaCl) 1,5 M.
Los 142 mL del eluato de la columna
Affi-Gel Blue Gel produjeron AS 1,7 M por medio de
la adición lenta de 31,8 g de AS en polvo mientras se agita durante
30 min en un vaso de precipitados rodeado por un baño de hielo. Se
centrifugó la suspensión en botellas para centrífuga de 250 mL a
23.000 x g durante 30 minutos como anteriormente, y se cargó el
sobrenadante en una columna FPLC de Fenil-Sefarosa
XK 26/20 (Pharmacia) a 23ºC. La columna fue equilibrada previamente
con un búfer que contenía
bis-Tris-Propano 20 mM (pH 8,6), DTT
5 mM, y AS 1,7 M. Cuando se estableció la línea base cerca de cero
eluyeron las proteínas fuera de la columna en un gradiente inverso
de 40 min de AS 1,7 M hasta AS 0 M a una velocidad de flujo de 5
mL/min, recolectando fracciones de 1 min. El búfer de elusión de AS
0 M contenía tris 10 mM (pH 7,0), DTT 5 mM, y MgCl_{2} 1 mM.
Los ensayos de actividad sobre las fracciones
recolectadas indicaron que la mayor parte de la actividad enzimática
para la
xantosina-N^{7}-metiltransferasa
se concentró en las fracciones 49 a 54. Estas fracciones fueron
reunidas en un volumen final de 30 mL, y luego cargados en una
columna ATP-agarosa (Sigma Chemicals, A2767) por
gravedad a 4ºC. La columna fue equilibrada previamente con tris 10
mM (pH 7,0), DTT 5 mM, y MgCl_{2} 1 mM. Después de la
estabilización de la línea base, la columna fue despojada con 20 mL
de búfer para equilibrar previamente que contenía xantosina 100
\muM, y lavada con 40 mL adicionales de búfer para equilibrar
previamente. Ambos eluatos de la columna fueron recolectados y
cargados en una columna Mono-P HR 5/20 FPLC
(Pharmacia) preequilibrada con bis-tris 25 mM (pH
6,0) y betaína al 9% a 23ºC. Después de que se estabilizó la línea
base se eluyó la columna con 100 mL de Polybuffer 74 (10 mL:90 mL
H_{2}O, v:v) (pH 4,0) (Pharmacia), y betaína al 9% con una
velocidad de flujo de 1 mL/min. Los tubos para la recolección
contenían 100 \muL de búfer tricina 0,5 M (pH 7,0), y DTT 50 mM
para dar una concentración final en 1 mL de tricina 50 mM (pH 7,0),
y DTT 5 mM en fracciones de 1 min. Esto estabilizó en efecto
estabilizó las condiciones de pH final para las proteínas eluidas
bajo un pH ligeramente ácido de la columna Mono-P.
La principal actividad para la
xantosina-N^{7}-metiltransferasa
en los tubos de recolección sin tricina se encontró en las
fracciones 15 y 16 del gradiente que eluye desde la columna con un
pH de 5,42 y 5,35 respectivamente. Fue importante no congelar las
muestras de proteína en ninguna etapa de la purificación, ya que
esto tenía un efecto negativo sustancial sobre el estado de
actividad de la
xantosina-N^{7}-metiltransferasa.
Los 100 \muL de la mezcla para el ensayo
estándar contenían tricina 50 mM (pH 7,0), xantosina 1200 \muM,
DTT 5 mM,
S-adenosil-L-[metil-^{14}C]-metionina
(SAM) 7,5 \muM (60 mCi/mmol; DuPont NEN), y Na_{2}EDTA 1 mM. Se
preincubó la mezcla de reacción (50 \muL sin enzima) durante 10
min a 25ºC y se inició la reacción por medio de la adición de 50
\muL de solución de la enzima y se le permitió proceder a 25ºC
durante 1 hora. Al final del período de incubación se removieron
tres alícuotas de 30 \muL de la reacción y se terminó con la
adición de 8 \muL de ácido perclórico (HClO_{4}) 0,6 M. Lo
mismo se hizo para los controles a tiempo cero con el propósito de
detectar la verdadera actividad enzimática. Esta mezcla fue
centrifugada en una microcentrífuga durante 5 min y se mezclaron 19
\muL del sobrenadante con 1,0 \muL de
7-metilxantosina 33 mM. Estas mezclas fueron
pintadas sobre papel cromatográfico Whatman No. 1 y desarrolladas
con n-butanol-ácido acético-H_{2}O
(n-BuOH-HOAc-H_{2}O)
(4:1:1). La posición de la 7-metilxantosina se
determinó por medio de su fluorescencia azul cuando se la expuso a
luz UV de longitud de onda corta. Se cortó esta región de los
cromatogramas y se determinó la radioactividad por medio de recuento
de centelleo utilizando 3 mL de fluido de centelleo
Scinti-verse (Fisher Scientific). La eficiencia del
recuento fue del 74,7%. Se restó la radiación de fondo y la no
específica detectada en la región de la
7-metilxantosina de las muestras a tiempo cero.
El sitio de la metilación sobre el anillo de
xantina se identificó por medio de la hidrólisis del azúcar del
producto de reacción de la xantosina metilada y de la separación en
4 diferentes sistemas cromatográficos. El producto de dos reacciones
de 100 \muL hecha como se describió anteriormente y que contenía 6
\muL de 7-metilxantosina 33 mM como vehículo, se
aplicó como una banda en el origen de un cromatograma sobre papel
Whatman No. 1. El cromatograma se desarrolló en
n-BuOH-HOAc-H_{2}O
(4:1:1). La región del cromatograma correspondiente a la xantosina
metilada fue detectada como anteriormente, cortada en pedazos
pequeños, colocada en un tubo estéril, e incubada con 35 mL de agua
desionizada a 37ºC con agitación durante la noche. Se filtró el
extracto a través de 2 capas de miracloth seguido por un filtro de
0,22 \mum y luego liofilizado. El extracto seco se resuspendió en
1,0 mL de agua desionizada, se lo colocó en un vial de vidrio para
digestión y se lo liofilizó. La muestra fue resuspendida en 400
\muL de 7-metilxantosina 3 mM y liofilizada
nuevamente. La digestión fue resuspendida en 40 \muL de agua
desionizada, y se sometieron a cromatografía 10 \muL en cada uno
de los cuatro sistemas diferentes. 1-Metilxantina,
3-metilxantina, 7-metilxantina,
8-metilxantina, 7-metilxantosina,
xantina y xantosina fueron incluidas sobre cada cromatograma para
comparación. Se utilizaron los siguientes sistemas cromatográficos.
Papel Whatman No. 1 desarrollado en
n-BuOH-HOAc-H_{2}O
(4:1:1) y placas de capa fina C8 (Whatman KC18F) desarrolladas ya
sea en alcohol
isoamílico-H_{2}O-acetonitrilo
(41:4:5), etanol-H_{2}O (4:1) o
tert-BuOH-HOAc-H_{2}O
(4:1:1). Después de secar, se rociaron los cromatogramas con
En^{3}Hance (Dupont NEN), se secó nuevamente y se expuso durante
30 días a una película de rayos X preobscurecida FujiRX_{GCU} a
-70ºC.
Los extractos obtenidos en la forma anterior
fueron utilizados en minigeles SDS-PAGE de una sola
dimensión (1D) (gel principal: acrilamida al 12,5%, bisacrilamida
metilénica al 0,8%, gel de apilamiento: acrilamida al 7,5%,
bisacrilamida metilénica al 0,21%) por medio de la mezcla con búfer
de Laemmli para la muestra (Laemmli, U.K., Nature 227:680
(1970)), y mini en dos dimensiones (2D) IEF/SDS-PAGE
por medio del método modificado de O'Farrell y colaboradores
(O'Farrell, P.Z., Goodman, H.M., O'Farrell P.H., Cell
12:1133 (1977)). La electroforesis bidimensional fue posible
por medio de la precipitación de las proteínas con 50 volúmenes de
etanol al 100% durante 1 hora y redisolviendo las proteínas en un
búfer para la muestra con isoelectroenfoque (IEF) que contenía
anfolinas al 5% (1:1, v:v, pH 3-10:pH
5-7, LKB-Pharmacia). La relación del
extracto de proteína original con el búfer para la muestra con IEF
se mantuvo al menos 1:2 para asegurarse que cualquiera de los
constituyentes remanentes en el búfer de las etapas cromatográficas
no interfiriera con el IEF. Se aplicaron muestras iguales de
proteína total (<20 \mug) al extremo básico de los geles
preenfocados en tubo (acrilamida al 8,8%, bisacrilamida metilénica
1,6%) que contenían anfolinas al 5% como anteriormente. Los geles
fueron enfocados por 10.000V-hora más 2 horas
adicionales a 1.000 V. Los geles blanco enfocados fueron cortados en
secciones de 5 mm e incubados en 0,5 mL de CaCl_{2} 100 mM durante
24 horas, y se determinó el pH de los segmentos. A partir de este
análisis, el gradiente de pH del gel de IEF se estimó en el rango
desde 4,4 hasta 6,0.
Los geles en tubo fueron preparados para
SDS-PAGE por medio de un breve lavado con H_{2}O
seguido de tres lavados (10 minutos cada uno) en búfer caliente de
Laemmli para la muestra. Los geles en tubo fueron colocados en la
parte superior de los geles SDS-PAGE (gel principal:
acrilamida al 12,5%, bisacrilamida metilénica al 0,8%, gel de
apilamiento: acrilamida al 7,5%, bisacrilamida metilénica al 0,21%)
y mantenidos en su lugar con agarosa al 3% en búfer para muestra de
Laemmli. Las proteínas se visualizaron por medio de coloración
plata. En los geles de 1D la fracción 16 Mono-P que
tenía la actividad enzimática más alta solamente indicó la
presencia de un doblete bajo coloración de plata (Figura 2). Los
pesos moleculares de estas proteínas (kD) fueron aproximadamente de
37,6 y 36,1 kD. En los geles en 2D cada proteína se separó en dos
manchas. El punto isoeléctrico (IP) de la más ácida tenía un valor
promedio sobre varios geles de 5,2, y la más básica de 5,3. Sin
embargo, sus pesos moleculares promediaron ahora 43,5 kD, con los
péptidos superiores e inferiores fusionándose entre sí. Por lo
tanto, existe una diferencia clara en kD entre los geles de 1D y de
2D. La migración similar de todos estos cuatro péptidos en columnas
Mono-P, en los geles de 1D y de 2D indica que ellos
son isozimas que pueden ser modificadas posteriormente a la
traducción. Alternativamente ellos pueden ser los productos de una
familia de genes que tienen ligeras diferencias en sus estructuras,
resultando en las diferentes isozimas observadas.
La estimación de la proteína total por medio el
procedimiento de Lowry (Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. y
Randall, R.J., J. Biol. Chem. 193:265 (1951)) para la
fracción 16 de Mono-P indicó que existía un total de
100 \mug de proteína en la fracción de 1 mL. Es nuestra
experiencia que a estas bajas concentraciones de proteína, los
valores de Lowry tienden a ser una sobre estimación de la cantidad
real presente. Decidimos sobrecompensar esto por medio del uso de
una parte sustancial de esta fracción para la secuenciación de la
proteína. Una porción de 900 \muL de la fracción 16 de
Mono-P que representa 90 \mug fue colocada en un
tubo para microcentrífuga de 1,5 mL y se le añadieron 216 \muL de
ácido tricloroacético (TCA) al 100%. Después de la mezcla, se le
permitió al tubo incubarse durante la noche sobre hielo, y luego se
lo centrifugó a 14.000 rpm en una microcentrífuga durante 30 minutos
a 4ºC. El sobrenadante fue removido por medio de aspiración, y se
lavó el precipitado dos veces con 1 mL de etanol al 75%, siendo cada
lavada seguida por una etapa de centrifugación. Se secó el
precipitado colocando el tubo en un concentrador speedvac y rotación
durante 1 min al vacío. El precipitado tenía 20 \muL de 2 x búfer
Laemmli para la muestra que se le añadió. Se lo sometió a ebullición
en un baño de agua durante 5 min, y luego a microcentrifugación
durante 1 min. Cuando la temperatura del tubo había bajado hasta
23ºC, toda la cantidad fue cargada en una senda única de un gel de
1D al 12,5%. Al finalizar la electroforesis las proteínas fueron
visualizadas por medio de coloración con Coomassie al 0,1%
R-250 en metanol acuoso al 50% y ácido acético al
10%, (p:v:v), y luego decoloradas. El mismo doblete de 37,6 y 36,1
kD observado en geles teñidos de plata fue también visible en los
geles coloreados con Coomassie. La región del gel que contenía este
doblete fue cortada y utilizada para la secuenciación de la proteína
por medio de degradación automatizada de Edman.
La secuenciación de la proteína fue realizada en
la Universidad de California en Davis, protocolo estándar del
Laboratorio para la Estructura de las Proteínas. La pieza de gel que
contenía al doblete fue lavada 4 veces con 15 mL de H_{2}O
agitando suavemente durante 15 minutos para remover el ácido acético
y el SDS restante de las etapas anteriores. La pieza de gel fue
cortada en forma de cubos pequeños con una hoja de afeitar de 2 mm
cuadrados, y transferidos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
Las piezas de gel fueron deshidratadas en un
Speed-Vac durante 2 horas hasta que perdieron la
adherencia al tubo. Luego se añadieron 30 \muL del búfer para
rehidratación del gel (Tris-HCl 0,1 M, pH 9,0, SDS
al 0,05%), y se verificó el pH en 8,0 por medio de 0,5 \muL
sobre una tira de papel pH. Se añadió la enzima digestora
Lys-C (0,2 ug) del Achromobacter lyticus
(Wako), junto con búfer adicional para rehidratación, para hidratar
completamente las piezas de gel y dejar un pequeño residuo de búfer.
La mezcla se incubó durante la noche a 30ºC. Después del período de
incubación, se removió el sobrenadante hasta un tubo fresco y
estéril de microcentrífuga y se lo almacenó. Se añadió suficiente
agua para cubrir las piezas de gel, y se las incubó durante otras 2
horas a 30ºC. Se removió el sobrenadante y se lo almacenó en la
misma microcentrífuga como se hizo anteriormente. Esta etapa de
lavado se repitió una vez más, combinando los sobrenadantes con los
dos lavados anteriores. Se cubrieron luego las piezas de gel con una
solución que contenía ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en
acetonitrilo al 80%, y se incubó durante 1 hora a 30ºC. Se recolectó
el sobrenadante que fue añadido al tubo que contenía todos los
sobrenadantes anteriores. Se repitió una vez más el último lavado, y
los sobrenadantes recolectados fueron secados en un
speed-vac.
Los productos secos de la digestión tríptica se
disolvieron en 25 \muL de guanidina-HCl 6 M, tris
0,4 M (pH 8,2), y el pH se verificó por medio de 0,5 \muL sobre
una tira de papel pH. Se añadió un \muL de DTT 450 mM y se incubó
la digestión durante 45 minutos a 50ºC. Después de enfriar hasta
temperatura ambiente, se añadieron 2 \muL de iodoacetamida 500 mM,
y se incubó durante 15 minutos más a 23ºC. Al final de esta
incubación, se añadieron 72 \muL de agua para obtener una
concentración final de guanidina de 1,5 M, y de tris de 0,1 M. La
muestra fue centrifugada luego durante 5 minutos a 14.000 rpm en
una microcentrífuga y se removió cuidadosamente el sobrenadante
hasta un nuevo tubo de centrífuga. Al precipitado se le añadieron 25
\muL de TFA al 0,1% y se le agitó por medio de un vórtice. Se
centrifugó nuevamente el tubo como anteriormente, y se añadió el
sobrenadante a aquel de la etapa anterior.
Los fragmentos escindidos a partir de la
digestión tríptica fueron separados uno del otro por medio de
cromatografía capilar líquida de alta eficiencia (HPLC) en una
columna C18 de 1 mm x 10 cm, utilizando un gradiente lineal durante
90 minutos de 5% de solvente A (TFA al 0,1%) hasta 70% de solvente B
(acetonitrilo al 0,075%) con una velocidad de flujo de 100 \muL
por minuto. La detección UV se hizo a 210 nm con la escala de
lectura en el rango entre 0 y 0,1A. La recuperación de los picos
individuales indicó la presencia de diferentes péptidos como se
muestra en la Figura 3. Como control, se llevó a cabo completamente
el proceso de digestión con una porción del gel
BDS-PAGE original que no contenía proteína. Los
picos rellenos de color negro mostrados en la Figura 3, fueron
comunes tanto para el control como para la muestra. Los 3 picos
marcados como A, B y C fueron sometidos a degradación automatizada
de Edman. Dos de los picos (A y B) produjeron secuencias únicas de
solapamiento que representan al mismo fragmento de proteína (Figura
2, Fragmentos A y B). El tercer pico (C) produjo una secuencia única
diferente (Figura 2, Fragmento C).
La síntesis química de los iniciadores de 20
unidades monoméricas para las dos secuencias de aminoácidos
obtenidas por medio de los fragmentos de la digestión de la
xantosina-N^{7}-metiltransferasa
fue hecha por The Midland Certified Reagent Company. Las regiones de
los fragmentos seleccionados tenían una degeneración mínima del
ácido nucleico, y donde fue posible se evitó a los aminoácidos que
tenían una extensa redundancia del código genético. Donde esto no
fue posible, se sintetizó más de un iniciador para el mismo
fragmento, para incluir todas las posibles alternativas de
combinaciones de codones. Adicionalmente, también sintetizamos
iniciadores de tal manera que fueran complementarios con la hebra de
codificación de las secuencias de ADN que codifican la secuencia de
aminoácidos. La degeneración de tres o más de los nucleótidos de
tercera posición fue superada por medio del uso de inosina en estas
posiciones. Donde la degeneración de un nucleótido fue doble, se
incluyeron ambos nucleótidos en la síntesis del iniciador (Figura
3).
Todos los componentes utilizados durante la
extracción estaban estériles, libres de RNasa, y preparados por
medio del tratamiento con agua con 0,1% de DEPC. Todas las etapas de
centrifugación fueron realizadas a 4ºC a menos que se establezca
otra cosa.
Se recolectaron las hojas jóvenes del café de la
etapa B3 y se almacenaron como se describió anteriormente. Se aisló
el ARN total de 100 g de este tejido joven de hojas moliendo junto
con nitrógeno líquido y transfiriendo inmediatamente a un molino
doméstico de café preenfriado. Este tejido fue molido hasta obtener
un polvo, junto con un pequeño pedazo de hielo seco. Este tejido fue
luego añadido a 200 mL de búfer para homogenización elaborado con
Tris-HCl 100 mM (pH 9,0), NaCl 200 mM, Na_{2}EDTA
15 mM, sacarosil al 0,5%, y \beta-mercaptoetanol
100 mM añadido en forma fresca. A esta mezcla se le añadieron 200 mL
de fenol equilibrado con búfer, y 40 mL de una mezcla de
cloroformo:alcohol isoamílico (24:1, v:v). El tejido fue
homogenizado luego en un vaso de precipitado de vidrio en un baño de
hielo durante 2 min a alta velocidad en un homogenizador Polytron.
Inmediatamente después de la homogenización se añadieron 14 mL de
acetato de sodio 3 M (pH 4,0) y se hizo la mezcla operando el
homogenizador durante 1 min adicional. Se almacenó luego el
homogenizado sobre hielo durante 15 min, y posteriormente se lo
transfirió a dos tubos de centrífuga de polipropileno de 250 mL. La
centrifugación se efectuó en un rotor GSA (DuPont Sorvall) a 16.000
x g durante 10 min. Se transfirió la fase acuosa (la capa superior)
a un nuevo tubo para centrífuga de polipropileno de 250 mL y se le
añadió un volumen igual de isopropanol.
Se incubó la mezcla durante la noche a -20ºC y
luego se centrifugó a 10.000 x g durante 10 min para recolectar el
ARN precipitado.
Se lavó el precipitado de ARN con etanol al 70%
y se centrifugó nuevamente a 10.000 x g durante 5 min. Se decantó el
etanol y se secó el precipitado al vacío durante 5 min. Se
resuspendió luego el precipitado en 15 mL de agua tratada con DEPC.
Se transfirió la suspensión con el ARN a un tubo de centrifuga
estéril con tapa rosca de 40 mL y se removió el material insoluble
por medio de centrifugación a 10.000 x g durante 5 min. Se
transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo de centrifuga con tapa
rosca de 40 mL y se añadieron 5 mL de LiCl 8 M para obtener una
concentración final de LiCl de 2 M. Se incubó el tubo durante la
noche a 4ºC y se recuperó el ARN por medio de centrifugación a
14.000 x g durante 10 min. Se lavó luego el precipitado de ARN con
etanol al 70%, se centrifugó a 10.000 x g durante 5 min y se secó
brevemente al vacío. Se resuspendió el precipitado en 5 mL de agua
tratada con DEPC y se centrifugó a 10.000 x g durante 5 min para
remover el material insoluble. Se transfirió el sobrenadante a 4
tubos estériles para microcentrífuga de 1,5 mL y se almacenó sobre
hielo. La cuantificación de 10 \muL de la solución de ARN total en
un espectrofotómetro Shimadzu UV 160U en un rango de espectro de 230
a 330 nm indicó que existían 42,8 mg de ARN. Los tubos que contenían
al ARN fueron almacenados a -70ºC.
Se enriqueció la preparación de ARN total para
el ARN de poli (A^{+}) (ARNm) utilizando el kit del sistema de
aislamiento de ARNm PolyAT tract II (Promega Corporation). Se añadió
una alícuota de 600 \muL del ARN total que es igual a 5.1 mg en un
tubo del kit anteriormente mencionado y se llevó hasta un volumen
final de 2,43 mL con agua libre de RNasa. Después de calentar a 65ºC
durante 10 min, se añadieron 50 pmoles/mL de oligo(dT)
biotinilado y 60 \muL de 20x SSC (175,3 g/L de NaCl, 88,2 g/L de
citrato de sodio, pH 7,0) y se permitió que la mezcla se enfriara
lentamente hasta temperatura ambiente durante un período de
aproximadamente 30 min. Se lavaron 3 veces las partículas
paramagnéticas de una alícuota de estreptavidina en 0,5x SSC (1,5
\muL por lavado) y se resuspendió en 0,5 mL de 0,5x SSC. Se
añadió la solución de ARN que contenía al oligo(dT)
biotinilado a las partículas paramagnéticas lavadas de
estreptavidina. Después de incubación durante 10 min a temperatura
ambiente, se capturaron las partículas paramagnéticas junto con el
ARNm atrapado a un costado del tubo utilizando un imán. Se removió
el sobrenadante y se lavaron las partículas cuatro veces con 0,1 X
SSC (1,5 mL/lavado). Se recuperó el ARNm suspendiendo las partículas
en 1,0 mL de agua libre de RNasa y se removió el agua mientras las
partículas eran capturadas sobre el costado del tubo. El agua fue
colocada, 500 \muL a la vez, en dos tubos estériles para
microcentrífuga de 1,5 mL. Después de la adición de 1/10 de volumen
de acetato de sodio 3 M (50 \muL por tubo), se recuperó el ARNm
por medio de precipitación con un volumen igual de isopropanol (550
\muL por tubo). Se almacenaron los tubos a -20ºC durante la noche
y luego se centrifugó a 14.000 rpm durante 30 min a 4ºC. Se lavó el
precipitado con 500 \muL de etanol al 75% enfriado con hielo y se
centrifugó nuevamente. Se decantó el etanol y se secó el
precipitado brevemente al vacío. Se disolvió el ARNm en 60 \muL de
agua estéril libre de nucleasa tratada con DEPC. La cuantificación
se llevó a cabo sobre 15 \muL del ARNm disuelto como se describió
para el ARN total. Se recuperaron aproximadamente 9,6 \mug de ARNm
a partir de 5 mg de ARN total.
Se sintetizaron la primera y la segunda cadenas
del ADNc utilizando el kit para síntesis ZAP-cDNA
(Stratagene). Se incubaron 4 \mug de ARNm en 25 \muL de agua a
65ºC durante 5 min. Se añadieron 3 \muL de metil mercurio 100 mM y
se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadieron 4
\muL de \beta-mercaptoetanol 700 mM y se
continuó la incubación durante 5 min más. Al ARNm desnaturalizado se
le añadieron 5 \muL del búfer 10x para la primera cadena, 5 \muL
de DTT 100 mM, 3 \muL de la mezcla de nucleótidos (10 mM de cada
dATP, dGTP, TTP y 5-metil-dCTP), 2
\muL de enlazador-iniciador de 1,4
\mug/mL,(5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTT TTTTTTTTTTTTT3'),
1 \muL de un bloque de RNasa y 5 \muL de agua. Se incubó la
reacción a temperatura ambiente durante 10 min para fijar el
iniciador al ARNm y se añadieron 2,5 \muL de transcriptasa inversa
M-MuLV de 20 u/ \muL. Se removieron 5 \muL de
esta mezcla de reacción a un tubo que contenía 0,5 \muL de 800
Ci/mmoles [\alpha-^{32}P]dCTP (DuPont
NEN). Se incubaron ambas reacciones a 37ºC durante 1 hora. Se
congeló la reacción marcada con reactividad a -20ºC para un análisis
posterior en gel.
\newpage
A 45 \muL de la reacción principal se le
añadieron 40 \muL del búfer para la segunda cadena, 15 \muL de
DTT 100 mM, 6 \muL de la mezcla de nucleótidos (10 mM de cada
dATP, dGTP, TTP y 26 mM de dCTP 26 mM), 268,3 \muL de agua y 2
\muL de 800 Ci/mmoles
[\alpha-^{32}P]dCTP (DuPont NEN). Después
de mezclar, se añadieron 4,5 \muL de RNasa H 1 u/\muL y 19,2
\muL de ADN polimerasa I de E. coli de 5,2 u/\muL y se
incubó la reacción a 16ºC durante 2,5 horas. Se extrajo la reacción
con 400 \muL de fenol:cloroformo (1:1) y se separaron las fases
por medio de centrifugación. Se removió la fase acuosa a un nuevo
tubo y se extrajo nuevamente con cloroformo. Se recuperó la fase
acuosa como anteriormente. Se recuperó el ADNc bicatenario por medio
de precipitación durante la noche a -20ºC después de la adición de
33,3 \muL de acetato de sodio 3 M y 867 \muL de etanol al 100%.
Se recuperó el filtrado por centrifugación en una microcentrífuga a
4ºC durante 60 min. Se lavó el precipitado con 1 \muL de etanol al
80% y se lo recuperó por medio de centrifugación a temperatura
ambiente a velocidad máxima en una microcentrífuga. Se removió el
sobrenadante, se secó el precipitado al vacío y se lo disolvió en 45
\muL de agua. Se removieron 3 \muL de el ADNc bicatenario
resuspendido y congelado a -20ºC hasta analizarlo por medio de
electroforesis en gel.
A los restantes 42 \muL del ADNc bicatenario
se le añadieron 5 \muL del búfer 10 x Klenow (búfer #3) 2,5 \muL
de los nucleótidos de 2,5 mM (dCTP, dGTP, dATP y TTP), y 0,5 \muL
de el fragmento de Klenow de 5 u/\muL. Después de 30 min a 37ºC,
se añadieron 50 \muL de agua y se extrajo la reacción con un
volumen igual de fenol:cloroformo (1:1) y luego cloroformo como se
describió anteriormente. Después de la adición de 7 \muL de
acetato de sodio 3 M y de 226 \muL de etanol al 100%, se recuperó
el ADN bicatenario romo en el extremo por medio de precipitación
incubando sobre hielo durante 30 min y centrifugando a velocidad
máxima a 4ºC durante 60 min. Se lavó el precipitado con 300 \muL
de etanol al 80%, se centrifugó y se secó como anteriormente. Se
añadieron 7 \muL de los enlazadores EcoRI de 0,4
\mug/\muL al ADNc seco. Las estructuras de los enlazadores
EcoRI son:
5' AATTCGGCACGAG
3'
3' GCCGTGCTC
5'
Después de agitar en vórtice para resuspender el
ADNc, se añadieron 1 \muL de búfer de ligación 10x, 1 \muL de
ATP 10 mM y 1 \muL de 4 Weiss u/\muL T4 ADN ligasa, y se incubó
la reacción durante la noche a 8ºC. Se inactivó la ligasa por medio
de calentamiento a 70ºC durante 30 min. Se fosforilaron los extremos
5' de los enlazadores EcoRI unidos al ADNc utilizando al
polinucleótido quinasa. Se añadieron 1 \muL del búfer #3 10x, 2
\muL de ATP 10 mM, 6 mL de agua y 1 mL de T4 polinucleótido
quinasa de 10 u/mL a la reacción de ligación. Después de 30 min a
37ºC la reacción de la quinasa se inactivó con calor a 70ºC durante
30 min.
Se generaron "extremos pegajosos" de
Xhol en el extremo del ADNc correspondiente al extremo 3' del
ARNm por medio de digestión del sitio de Xhol en el
enlazador-iniciador (ver más arriba). Se añadieron
28 \muL del búfer de Xhol y 3 \muL de Xhol de 40
u/mL al ADNc y se incubó la reacción a 37ºC durante 1,5 horas. El
ADNc con los extremos pegajosos de EcoRI en el extremo 5' y
los extremos pegajosos de Xhol en el extremo 3' (con relación
al ARNm original) fueron fraccionados por tamaño por medio del paso
a través de una columna de giro Sephacryl S-400
como sigue. Se añadieron 5 \muL de STE 10x (tris 100 mM (pH 7,0),
EDTA 5 mM y NaCl 100 mM) y se aplicó el ADNc a la parte superior de
una jeringa de 1 \muL que contenía Sephacryl
S-400. Se colocó un tubo de microcentrífuga de 500
mL en el fondo de la jeringa y se colocó la columna en un tubo de
centrífuga y se centrifugó aproximadamente a 400 x g durante 2 min.
Se añadieron 60 \muL de STE 10x a la parte superior de la jeringa,
se colocó un nuevo tubo de microcentrífuga sobre el fondo y se
centrifugó nuevamente la columna como anteriormente. Se repitió este
proceso hasta que se habían recogido seis fracciones.
Aproximadamente 10% de cada una de las
fracciones fue sometida a electroforesis sobre un gel de agarosa al
1% para determinar la distribución por tamaño del ADNc en cada
fracción. Se extrajo el resto de cada una de las fracciones con un
volumen igual de fenol:cloroformo y luego con cloroformo como se
describió anteriormente, y luego se precipitó por medio de la
adición de 2 volúmenes de etanol al 100%. Después de incubar a -20ºC
durante la noche, se recuperó el ADNc por medio de centrifugación a
14.000 rpm a 4ºC durante 60 min en una microcentrífuga. Se lavó el
ADN con 200 \muL de etanol al 80% como se describió anteriormente,
y se secó. Se disolvió el ADNc en 5 \muL de agua y se removieron
0,5 \muL para determinar la concentración de ADNc por medio de
fluorografía utilizando el Hoefer TKO 100 DNA Fluorometer. Los 4,5
mL restantes de la fracción 1, que contenían las moléculas más
grandes de ADNc, contenían aproximadamente 304 ng de ADNc.
Se ligaron 100 ng de ADNc de la fracción 1 en 1
\mug de Uni-Zap, un vector bacteriófago lambda ZAP
que había sido digerido con EcoRI y con Xhol
(Stratagene). Se añadió la fracción 1 del ADNc (2,9 MI) a 0,54
\muL del búfer de ligación 10x, 0,5 \muL de ATP 10 mM, 1 \muL
del vector Uni-Zap XR de 1 \mug/\muL y 0,5
\muL de 4 Weiss u/\muL T4 ADN ligasa. Se incubó la reacción a
8ºC aproximadamente durante 44 horas. Se añadió una alícuota de 1
\muL de la reacción de ligación a una alícuota del extracto para
‘Congelación-Descongelación' del kit de
acondicionamiento Gigapack II Gold (Stratagene). Se añadieron 15
\muL del extracto sónico y se mezclaron suavemente los contenidos.
Se llevo el acondicionamiento hasta temperatura ambiente. Después de
2 horas, se añadieron 500 \muL del búfer SM
(tris-HCL 0,01 M, pH 7,5, MgCl_{2} 0,01 M,
Na_{2}EDTA 0,1 mM) y 20 \muL de cloroformo a la reacción de
acondicionamiento, se removieron los residuos por medio de una
centrifugación corta en una microcentrífuga y los fagos
acondicionados se almacenaron a 4ºC hasta su uso.
Se mezcló 1 \muL de los 500 \muL de la
genoteca primaria con 9 \muL del búfer SM para una dilución 1/10.
Se utilizó 1 \muL de esta dilución para infectar a 200 \muL de
células de E. coliXL1-Blue MRF' cultivadas
hasta una densidad igual a un O. D._{600} = 0,5. Se incubaron las
células a 37ºC durante 15 min con agitación suave. Se mezclaron
entonces las células infectadas con 2,5 mL del agar de superficie a
48ºC que contenía 15 \muL de IPTG 0,5 M, y 50 \muL de
X-gal de 250 mg/mL y se las sembró sobre placas NZY
de 100 x 15 mL (5 g/L de NaCl, 2 g/L de MgSO_{4}.7 H_{2}O, 5 g/L
de extracto de levadura, 10 g/L de amina NZ [pH 7,5], y 15 g/L de
agar Difco). Se incubaron las placas durante la noche a 37ºC. Las
placas de respaldo eran azules, mientras que las placas
recombinantes eran blancas. El promedio de tres de estas placas
indica que 1 \muL de la genoteca primaria produjo 1.930 placas
recombinantes blancas, y 65 placas azules. Los 500 \muL totales de
la genoteca primaria fueron calculados para representar 965.000
placas recombinantes.
En 20 tubos estériles se cultivaron 300 \muL
de células de E. coliXL1-Blue MRF' cultivadas
hasta un O. D._{600} = 0,5. A cada tubo se le añadieron 12, 5
\muL de estándar de genoteca primaria, y 90 \muL de búfer SM y
se incubaron los tubos a 37ºC durante 15 min. Se añadieron 2,5 mL de
agar de superficie a 48ºC a cada tubo y se sembraron en placa las
células sobre placas NZY de 100 x 15 mm. Se incubaron las placas
durante la noche a 37ºC. Se añadieron 5 mL de búfer SM a cada placa
y éstas fueron incubadas durante 8 horas más a 4ºC. Se recolectó el
búfer SM con una pipeta estéril y se lo almacenó en un tubo de
centrífuga estéril de 250 mL. Cada placa fue lavada aproximadamente
con 4 mL de búfer SM fresco que fue añadido al material previamente
recolectado. Se añadió cloroformo hasta un volumen final del 5%, a
la genoteca amplificada. Se incubó luego la genoteca a temperatura
ambiente durante 15 min y luego se centrifugó a 2.000 x g durante 10
min para remover los residuos celulares. Se recuperó el sobrenadante
(114,5 mL) y luego se lo transfirió a una botella estéril de
polipropileno. Se añadió cloroformo hasta un volumen final de 0,3% y
se almacenó la genoteca amplificada a 4ºC.
Un \muL de una dilución 10^{-11} de la
genoteca amplificada en búfer SM contenía 192 placas recombinantes
cuando se las sembró sobre placa como se describió anteriormente.
Con el propósito de obtener 50.000 placas recombinantes, se
utilizaron 25 \muL de una dilución 10^{-7} para infectar 600
\muL de células E. coliXL1-Blue MRF'
cultivadas hasta un O. D._{600} = 0,5, las cuales fueron incubadas
luego a 37ºC durante 15 min. A estas células se les añadió 6,5 mL de
agar de superficie a 48ºC y se sembró sobre placa la genoteca en
placas NZY de 150 x 15 mm. Se prepararon cuatro de tales placas que
representan 200.000 placas recombinantes, y se incubaron a 37ºC
durante la noche. Se enfriaron luego las placas durante 4 horas a
4ºC, y luego se las utilizó para seleccionar el ADN de la
genoteca.
La síntesis del ADNc de la primera cadena fue
como se describe en el protocolo anterior de Stratagene. Las dos
únicas secuencias de péptidos obtenidas por medio de digestión
tríptica permitieron la síntesis de los iniciadores degenerados
descritos en la Figura 4. Se llevó a cabo una reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) (Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S.,
Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. y Erlich, H.A.,
Science 239:487 (1988)) entre pares de estos
iniciadores (1-6, 2-6,
3-5 ó 4-5) utilizando 4 ng de ADNc,
1 \muL de iniciadores 20 \muM, 0,5 \muL de cada
desoxirribonucleótido trifosfato 1 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,3
\muL de Taq ADN polimerasa [5.000 u/mL], 2,5 \muL de búfer PCR
10x [tris-HCl 10 mM (pH 9,0), triton
X-100 al 0,1%] y H_{2}O estéril hasta un volumen
final de 25 \muL. Las condiciones para la PCR fueron 94ºC durante
4 min [1 ciclo]; 94ºC durante 1 min, 43ºC durante 1 min, 72ºC
durante 1 min [35 ciclos]; 72ºC durante 5 min [1 ciclo]). Las
reacciones se hicieron en tubos estériles para microcentrífuga de
500 \muL utilizando un termociclador para ADN de Perkin Elmer
modelo 480. Únicamente la combinación de los iniciadores 1 y 6
resultó en un producto único a una temperatura para fijación de
43ºC. Se midió por medio de una electroforesis sobre gel de agarosa
utilizando agarosa SeaPlaque (FMC) que el producto era
aproximadamente de 750 pares de bases. Se utilizó una escala de 100
pb comercialmente disponible como marcador de tamaño (Promega
Corporation).
El fragmento de 750 pb obtenido utilizando los
iniciadores 1 y 6 (Figura 4) en una reacción PCR de 50 \muL tenía
añadidos 50 \muL de cloroformo, y 100 \muL de agua estéril. La
mezcla fue agitada en vórtice y luego centrifugada en una
microcentrífuga a 14.000 rpm durante 2 min. La capa acuosa superior
que contenía al ADN fue removida y colocada en un tubo estéril. La
cuantificación en una placa con bromuro de etidio indicó la
presencia aproximadamente de 5 ng del ADN/\muL aproximadamente
amplificado por PCR. El producto PCR fue luego ligado dentro de un
vector TA Cloning Kit pCR II (Invitrogen Corporation) en una
reacción de ligación de 10 \muL que contenía 1 \muL de búfer de
ligación 10x, 2 \muL del vector pCR II (25 ng/\muL), 3 \muL de
producto PCR fresco (5 ng/\muL), 1 \muL de T4 ADN Ligasa, y 3
\muL de agua estéril. Se incubó la reacción de ligación a 14ºC
durante la noche. Se centrifugaron las reacciones de ligación a
14.000 rpm durante 2 min y se las colocó sobre hielo. A un vial
recientemente descongelado de células competentes de E.
coliXL 1-Blue se le añadieron 2 \muL de
\alpha-mercaptoetanol 0,5 M y se mezcló suavemente
con la punta de la pipeta. Se pipetearon 2 \muL de la reacción de
ligación dentro de las células y luego se las agitó suavemente con
la punta de la pipeta para mezclar. Se incubó luego el vial sobre
hielo durante 30 minutos y se lo sometió a choque térmico
exactamente durante 30 segundos en un bloque de calentamiento a
42ºC. Se colocó el vial sobre hielo. Después de 2 min, se le
adicionaron 450 \muL de medio SOC estéril (20 g/L triptona, 5 g/L
de extracto de levadura, 0,5 g/L de NaCl, 10 mL/L de KCl 250 mM, 10
mL/L de MgCl_{2}, 20 mL/L de glucosa 1 M, [pH 7.0]).
Posteriormente se agitó el vial a 225 rpm en un agitador rotatorio
durante 1 hora y luego se lo colocó sobre hielo.
Se sembraron sobre placa las células
transformadas pipeteando 50 \muL y/o 200 \muL de la suspensión
celular sobre una de las dos placas LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de
extracto de levadura, 10 g/L de NaCl, 15 g/L de agar Difco, pH 7,5)
que contenía 50 \mug/mL de ampicilina y 40 \mug/mL de
X-Gal. Se incubaron las placas a 37ºC durante 20
horas y luego se las movió hasta 4ºC durante 3 horas para permitir
el desarrollo de color. Se analizaron 6 colonias transformantes
blancas por la presencia y orientación del fragmento PCR.
Cada una de las colonias transformantes fue
cultivada en medio estéril terrific broth (12 g/L de triptona, 24
g/L de extracto de levadura, 4 mL/L de glicerol, 100 mL/L de fosfato
de TB 10x [KH_{2}PO_{4} 0,17 M, KH_{2}PO_{4} 0,72 M])
suplementado con 50 \mug/mL de ampicilina. Se incubaron los tubos
durante la noche en un agitador rotatorio a 37ºC. Se transfirieron 3
mL de cada colonia a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, 1 mL a la
vez, y se concentraron las células por centrifugación a 14.000 rpm
durante 2 min. Se descartó el sobrenadante cada vez y se dejó al
precipitado celular tan seco como fuera posible. Se lavaron las
células una vez con 1 mL de H_{2}O estéril y se centrifugó como
anteriormente. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el
precipitado celular en 320 \muL de búfer STET (sacarosa al 8%,
triton X-100 al 0,5%, EDTA 50 mM,
tris-HCl 10 mM, pH 8,0). A estas células se les
añadió 32 \muL de lisozima de 10 mg/mL en búfer TE (10 mL/L de
tris-HCl 1M, pH 8,0, 2 mL/L de EDTA 0,5 M, pH 8,0) y
se mezcló por medio de inversión de los tubos varias veces. Los
tubos fueron colocados en baño de agua en ebullición durante 5 min
y, colocados inmediatamente después sobre hielo. Una vez enfriados
fueron centrifugados durante 30 min a 14.000 rpm a 4ºC. Se removió
el precipitado de cada tubo con un palillo de dientes estéril. El
sobrenadante tenía 170 \muL de NH_{4}OAc 7,5 M y se le
añadieron 500 \muL de isopropanol enfriado sobre hielo, y se
precipitó el ADN durante la noche a -20ºC. Se centrifugaron los
tubos a 14.000 rpm a 4ºC durante 30 min, y se lavó el precipitado
con etanol al 75% y se lo secó durante 1 min en un
speed-vac. Se resuspendió el ADN en 50 \muL de
H_{2}O estéril que contenía 1 \muL de RNasa A de 5 mg/mL.
Se preparó una mezcla de reacción de 25 \muL
por medio de la adición de 15 \muL de ADN de miniprep plasmídico
como el obtenido anteriormente, 2,5 \muL de búfer H
(tris-HCl 90 mM [pH 7,5], MgCl_{2} 10 mM, NaCl 50
mM) 1 \muL de EcoRI (8-12 u/\muL), y 6,5
\muL de H_{2}O estéril. Se incubó la mezcla en un baño de agua
con agitación a 37ºC durante 1 hora, y luego ebulló en un baño de
agua durante 1 min. se centrifugaron los tubos a 14.000 rpm durante
15 segundos y luego se dejó enfriar hasta temperatura ambiente. Se
añadieron 2 \muL colorante de carga a 10 \muL de cada mezcla, y
se analizaron los productos de digestión por medio de electroforesis
sobre gel de agarosa al 1,5% utilizando agarosa ultra pura
(GibcoBRL) y una escala de 100 pb como marcador de tamaño (Promega
Corporation).
Solamente una de las seis reacciones indicó la
presencia de un inserto digerido de \sim 750 pb. Se inoculó la
colonia bacteriana original correspondiente al plásmido con el
producto PCR de la
xantosina-N^{7}-metil transferasa
de 750 pb dentro de un erlenmeyer de 250 mL que contenía 50 mL de
medio LB estéril (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura,
10 g/L de NaCl, pH 7,5) suplementada con 50 ug/mL de ampicilina. Se
incubó el erlenmeyer en un agitador rotatorio a 30ºC durante la
noche. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL se concentraron 18 mL
del medio celular resultante por medio de centrifugación como
anteriormente.
Se purificó el ADN plasmidial utilizando el
procedimiento del mini kit plasmidial de QIAGEN (Qiagen Inc.). Se
resuspendió el precipitado bacteriano lavado en 0,3 mL de búfer P1
que contenía a la RNasa suministrada. A estos 0,3 mL de búfer P2
para lisis alcalina se le añadieron, mezclando sacudiendo suavemente
el tubo e incubado por no más de 5 min a temperatura ambiente. Se
añadieron los siguientes 0,3 mL de búfer P3 enfriado y se mezcló
invirtiendo el tubo 6 veces. Después de 10 minutos sobre hielo se
centrifugó el extracto a 14.000 rpm durante 15 min en una
microcentrífuga. Se removió el sobrenadante y se lo aplicó a un
QIAGEN-tip 20 que fue previamente equilibrado por
medio de la aplicación de 1 mL de búfer QBT por medio de flujo por
gravedad. También se le permitió al sobrenadante aplicado con el
extracto celular entrar a la resina de la columna por medio de flujo
por gravedad. Una vez se había detenido el flujo a través de la
columna, se lavó el QIAGEN-tip 20 4 veces con un mL
de búfer QC. Se eluyó el ADN lavando el QIAGEN-tip
20 con 0,8 mL de búfer QF y se lo precipitó por medio de la adición
de 0,7 volúmenes (560 \muL) de isopropanol a temperatura ambiente.
Se centrifugó inmediatamente el tubo a 14.000 rpm durante 30 min y
se removió cuidadosamente el sobrenadante. Se lavó el ADN
precipitado con 1 mL de etanol al 70% enfriado sobre hielo, se lo
centrifugó como anteriormente, y se lo secó al aire durante 5 min.
Se resuspendió el ADN en 100 \muL de H_{2}O estéril. La
espectrofotometría UV, como se describió anteriormente, sobre 1
\muL de la resuspensión de ADN indicó que habían 55 \mug del ADN
plasmídico de pCRII por 100 \muL.
La secuenciación automatizada del ADN del
inserto en el plásmido pCRII a partir de su extremo 5' se logró
utilizando el iniciador inverso M13 que se enlaza a una referencia
en el pCRII justamente adyacente al sito en donde el producto PCR
fue insertado. La secuenciación fue hecha en las instalaciones del
servicio de Biotecnología de la Universidad de Hawai. La reacción de
secuenciación contenía 1 \mug del molde del plásmido y 3,2 pmoles
del iniciador M13. La secuencia obtenida indicó que el producto PCR
codificado por la secuencia de ADN de los primeros 6 aminoácidos de
los fragmentos peptídicos A y B (Figura 4) a partir de cuya
secuencia se elaboraron los iniciadores 1 y 2 del ADN degenerado
(Figura 4). Además, la secuencia también codificó a los siguientes 7
aminoácidos del fragmento de péptido, cuya secuencia de ADN no fue
utilizada en la construcción del iniciador. Por lo tanto, en efecto
se clonó la secuencia de ADN para la proteína correcta.
Se llevaron a cabo dos digestiones de
restricción de 25 \muL con EcoRI sobre dos alícuotas de
17,5 \muL del plásmido pCRII purificado como se describió
anteriormente. Los productos fueron separados sobre un gel de
agarosa al 1% como antes, y se cortó en forma aséptica el inserto de
750 pb de dos sendas del gel. Las piezas de gel que tienen una masa
de 0,65 g fueron transferidas a un tubo de polipropileno estéril de
40 mL y sometidas a purificación con el kit Geneclean II (BIO 101,
Inc.). Se añadieron 4,5 volúmenes de una solución patrón de NaI
(2,93 mL) a las rebanadas de gel. Se añadió la mitad del volumen del
modificador TBE al gel (325 \muL) y se incubó el tubo a 45ºC
durante 5 min. A éste se le añadieron 15 \muL de suspensión
glassmilk y se incubó durante 5 min adicionales. Se precipitó el
complejo glassmilk/ADN por medio de centrifugación durante 10 seg a
1.000 rpm y se removió el sobrenadante. Se lavó el precipitado de
glassmilk 3 veces con 1 mL de solución New Wash y se eluyó el ADN
con 50 \muL de H_{2}O estéril. Las placas con bromuro de etidio
indicaron que la concentración de ADN era de 10 mg/ \muL.
Se sintetizó una sonda cebada en forma aleatoria
a partir de 30 ng (3 \muL) del ADN purificado. Se añadieron 3
\muL del ADN a 27 \muL de agua estéril y se desnaturalizó el ADN
por medio de calentamiento en un baño de agua en ebullición. A esta
se le añadieron los constituyentes del kit Promega Corporations
Prime-a-Gene (10 \muL de búfer de
marcación 5x, 2 \muL de los dNTP no marcados [20 \muM cada dCTP,
dGTP, TTP], 2 \muL de BSA acetilado de 1 mg/mL, 1 \muL de enzima
Klenow de 5u/\muL) y 5 \muL de
[\alpha-^{32}P]dATP (50 \muCi, 3.000
Ci/mmol; DuPont NEN) hasta un volumen final de 50 \muL, y se
permitió la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora. Se
terminó la reacción por medio de la adición de 2 \muL de
Na_{2}EDTA 0,5 M (concentración final 20 mM) y se calentó durante
2 min en un baño de agua en ebullición.
Las cuatro placas NZY de 150 x 15 mm que tenían
aproximadamente 50.000 clones recombinantes por placa fueron
enfriadas hasta 4ºC (ver más arriba para las condiciones de siembra
y cultivo), y las placas recombinantes levantadas por medio de un
primer remojo previo en membranas de transferencia de nylon Magna de
132 mm (MSI Corporation) sobre papel cromatográfico saturado con
búfer SSC 5x durante 10 seg. Las membranas fueron colocadas sobre
las placas que contenían a las placas recombinantes durante 5 min, y
luego levantadas y colocadas, con la cara que contiene a los fagos
hacia arriba, durante 2 min sobre papel cromatográfico saturado con
NaOH 0,5 M y NaCl 1,5 M. Las membranas fueron neutralizadas por
medio de transferencia sobre papel cromatográfico saturado con
tris-HCl 0,5 M (pH 8,0) y NaCl 1,5 M durante 5 min.
Ellas fueron colocadas entonces durante 20 seg sobre papel
cromatográfico saturado con búfer SCC 2x, tris-HCl
0,2 M (pH 7,5) y luego trasferidas secas. Después de 1 hora de
secado al aire, se entrelazó el ADN a las membranas por medio de la
exposición a 12.000 \muJulios de UV utilizando un UV Stratalinker
1800 (Stratagene Corporation). Las cuatro membranas fueron
hibridadas previamente a 65ºC durante 2 horas en 100 mL de SSPE 6x
(52,2 g/L de NaCl, 8,3 g/L de NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O, 2,2 g/L
de Na_{2}EDTA, [pH 7,4]), solución de Denhardt 5x (1 g/L de
Ficoll, 1 g/L de polivinilpirrolidona, 1 g/L de BSA [fracción V de
pentax]), SDS al 0,5% y 100 \mug/mL de ADN de esperma
desnaturalizado de arenque en un horno para hibridación Hybrid Mark
II.
La hibridación se realizó a 65ºC durante 12
horas en 10 mL de SSPE 6x, SDS al 0,5%, 100 \mug/mL de ADN de
esperma desnaturalizado/en polvo de arenque, y 52 \muL de 15 x
10^{6} dpms/ml de la sonda cebada en forma aleatoria descrita
anteriormente. Al final del período de hibridación se removió la
sonda y se lavaron brevemente las membranas durante 30 seg con 100
mL de SDS al 0,5% que contenía SSC 2x a 65ºC. Las membranas fueron
lavadas luego durante 30 min adicionales con la misma cantidad y
concentración de búfer fresco. Las membranas fueron sometidas a dos
lavadas más con 100 mL durante 30 min con 65ºC, SSC 0,2x, SDS al
0,5%, y luego envueltas en una envoltura de celofán y expuestas
durante 24 horas a una película de rayos X preobscurecida
FujiRX_{GCU} a -70ºC. Se observaron quince clones positivos.
Estas placas fueron recogidas y colocadas en 1 mL de búfer SM que
contenía 20 \muL de cloroformo (material de fago). De estas, 11
fueron procesadas para selección secundaria o terciaria hasta que se
obtuvieron placas individuales únicas.
Se determinaron los tamaños de los clones
putativos de ADNc de la
xantosina-N^{7}-metiltransferasa
por medio de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando
iniciadores homólogos para los promotores T3 y T7 que están
presentes en el vector de clonación y que flanquean al sitio de
inserción del ADNc. Las condiciones para la reacción en cadena de la
polimerasa fueron las descritas anteriormente excepto por que el
ciclo era de 35 ciclos de 95ºC durante 1 min, 50ºC durante 1 minuto
y 72ºC durante 2 minutos. El análisis se hizo por medio de
electroforesis en gel de agarosa como anteriormente. Los tres clones
más grandes obtenidos fueron sometidos a una excisión in vivo
por medio de una mezcla en un tubo estéril de 200 \muL de material
de fago en una sola placa con 200 \muL de células frescas de
XL1-Blue MRF' cultivadas hasta un O. D._{600} =
1,0. A esta mezcla se le añadió 1 \muL del fago auxiliar ExAssist
(Stratagene Corporation) (>1 x 10^{6} pfu/\muL) y se
incubaron los tubos a 37ºC durante 15 min. Se añadieron 3 mL de
caldo estéril LB y se continuó la incubación durante 3 horas a 37ºC
con agitación. Los cultivos fueron calentados en un baño de agua a
70ºC durante 20 min, y luego se centrifugaron los tubos a 1.000 x g
durante 15 min. Un mL del sobrenadante que contenía al fagémido
pBluescript cortado empacado como una partícula filamentosa de fago
fue transferido a un tubo estéril para microcentrífuga de 1,5 mL y
almacenado a 4ºC como la solución patrón. Se añadieron 25 \muL de
la solución patrón a 200 \muL de E. coli Solar cultivadas
hasta un O.D._{600} = 1 en un tubo de microcentrífuga. Después de
incubación a 37ºC durante 15 min, se sembraron 200 \muL de
células sobre placas de agar NZY de 100 x 15 mm que contenían 50
\mug/mL de ampicilina. Las placas fueron incubadas durante la
noche a 37ºC hasta que aparecieron las colonias. Se incubó una
colonia única en 10 mL de caldo estéril LB que contenía 50 \mug/mL
de ampicilina y se desarrolló durante la noche a 37ºC con agitación.
Se concentraron los 10 mL de cultivo celular en un tubo estéril para
microcentrífuga de 1,5 mL y se sometieron las células precipitadas a
la purificación del plásmido de QIAGEN como se describió
previamente. El ADN plasmidial fue resuspendido en 50 \muL de
H_{2}O estéril. Las reacciones automatizadas de secuenciación del
ADN fueron llevadas a cabo por medio de la mezcla de 8 \muL de
esta muestra de ADN (0,8 \mug) con 4 \muL de cualquiera de los
dos iniciadores de secuenciación T3 o T7 (0,8 pmol/\muL). El resto
del proceso fue como el descrito previamente. Cada reacción de
secuenciación produjo aproximadamente 350 bases de la secuencia. La
secuencia es mostrada en la Figura 5. La secuencia de aminoácidos de
la xantosina-N^{7}-metil
transferasa como se predijo a partir de la secuencia de bases del
ADNc es mostrada en la Figura 6.
Los ejemplos anteriores son para propósitos de
ilustración únicamente, y no deben ser vistos como limitantes del
alcance de la invención del solicitante, que se expone en las
reivindicaciones anexas aquí.
<110> Universidad de Hawai
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteínas purificadas, secuencias de
AND recombinante y procesos para producir bebidas libres de
cafeína
\vskip0.400000\baselineskip
<130> J100054PCEP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP97919934.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1997-03-24
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X significa indeterminado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu
Asp Gln Xaa Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu
Asp Gln Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N denota inosina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatnaaytayg cntcnggngc
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<212> ADN
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<213> Coffea arabica
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<220>
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<221> característica nueva
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<223> N denota inosina
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N denota inosina
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N denota inosina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<212> ADN
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<220>
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<221> característica nueva
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<222> (3)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X es ya sea Thr o Asp
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Tyr Val Pro Cys Tyr Phe Xaa Phe Ile Asp
Asp Gln Asp}
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<220>
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<221> característica nueva
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<222> (9)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcawtatgtnc cntgttattt
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(12)
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<223> N denota inosina
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<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaawtawcang gnacwtattg
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 371
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<212> PRT
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<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 11
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<211> 1347
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<212> ADN
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<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (53)..(1168)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de codificación
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 371
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<212> PRT
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<213> Coffea arabica
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Universidad de Hawai
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteínas purificadas, secuencias de
AND recombinante y procesos para producir bebidas libres de
cafeína
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<130> J100054PCEP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP97919934.6
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<141>
1997-03-24
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<160> 12
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<170> PatentIn versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X significa indeterminado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu
Asp Gln Xaa Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> PRT
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<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu
Asp Gln Thr}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N denota inosina
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<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatnaaytayg cntcnggngc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N denota inosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N denota inosina
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
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<210> 5
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N denota inosina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\hfill20
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<210> 6
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N denota inosina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X es ya sea Thr o Asp
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Tyr Val Pro Cys Tyr Phe Xaa Phe Ile Asp
Asp Gln Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N denota inosina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcawtatgtnc cntgttattt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N denota inosina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaawtawcang gnacwtattg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 371
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<212> PRT
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<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 1347
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<212> ADN
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<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (53)..(1168)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de codificación
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<400> 11
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<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 371
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Coffea arabica
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. La xantosina N^{17} metil transferasa
sustancialmente pura que utiliza S-adenosilmetionina
como substrato caracterizada por los fragmentos típicos A; B
o C de acuerdo con la fórmula siguiente:
2. La transferasa de la reivindicación 1, que
consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de acuerdo a
la Figura 6.
3. Una planta de café generalmente alterada
caracterizada porque la alteración está basada en la
transformación con una secuencia de ADN que suprime la síntesis de
la xantosina N^{7} metil transferasa de acuerdo con la
reivindicación 1 ó la 2.
4. Un fruto o grano de la planta de café
generalmente alterada derivada de la planta de la reivindicación 3
que contiene una molécula de ADN que suprime la síntesis de la
xantosina N^{7} metil transferasa de acuerdo con la reivindicación
1 ó la 2.
5. Una planta de café generalmente alterada,
fruto de la planta o grano que contienen una molécula de ADN que
codifica la transcripción para el ARNm que es antisentido al ARNm
que codifica la expresión para la xantosina N^{7} metil
transferasa de acuerdo con la reivindicación 1 ó la 2.
6. Una secuencia sustancialmente pura de ADN que
codifica la expresión para la xantosina N^{7} metil transferasa
seleccionada a partir de un grupo que consiste de
- a)
- una secuencia de acuerdo a la Figura 5;
- b)
- secuencias de ADN que híbrida a la secuencia de acuerdo a la Figura 5, dichas secuencias de hibridación consisten esencialmente de secuencias que son complementarias a la secuencia de acuerdo a la Figura 5; y
- c)
- secuencias de ADN que son degeneradas con respecto a la secuencia de acuerdo a la Figura 5.
7. El ADN de la reivindicación 6 siendo un
vehículo de clonación.
8. Un método para producir granos de café libres
de cafeína que comprende:
- a)
- transformar las plantas de café con una secuencia de ADN que es ya sea antisentido a una segunda secuencia de ADN o que codifica la transcripción para un ARNm que es antisentido a la segunda secuencia de ADN, en donde dicha segunda secuencia de ADN es ya sea la secuencia de ADN de acuerdo a la Figura 5 o una secuencia de ADN que codifica la expresión para una secuencia de proteína de acuerdo a la Figura 6; y opcionalmente
- b)
- cosechar el fruto de las plantas de café transformadas.
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