ES2275292T3 - Sondas y equipos para la deteccion de chlamidia trachomatis. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UN FORMATO PARA LA CAPTURA POR HIBRIDACION DE UN ADN AMPLIFICADO CON PCR SOBRE UN SOPORTE SOLIDO. DESPUES DE MARCAR EL ADN DIANA AMPLIFICADO CON BIOTINA DURANTE LA AMPLIFICACION, EL ADN MARCADO ES CAPTURADO DE FORMA ESPECIFICA POR UNA HIBRIDACION DE PARES DE BASES CON UNA SONDA DE CAPTURA DE OLIGONUCLEOTIDO ESPECIFICA DE AMPLICON, QUE ESTA UNIDA A UN SOPORTE SOLIDO, Y SE DETECTA EL ADN MARCADO CON UN ENSAYO DE DETECCION CROMOGENICO DEPENDIENTE DE BIOTINA. EN UN FORMATO ESPECIFICO, SE DESCRIBEN CEBADORES Y SONDAS ESPECIFICOS QUE PERMITEN LA DETECCION DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS.
Description
Sondas y equipos para la detección de
Chlamydia trachomatis.
Se proporciona un formato para la captura por
hibridación de DNA amplificado mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) en un soporte sólido de poliestireno que posee una
capacidad aumentada para la unión de proteínas. Preferiblemente, tal
soporte sólido, es una placa microtitulada, que presenta una serie
de pocillos. Después del marcaje del DNA diana (por ejemplo, con
biotina) durante la amplificación en la reacción de PCR, el DNA
marcado, se captura específicamente mediante hibridación de pares de
bases con una sonda de captura de oligonucleótidos específica para
amplicones, que se ha unido de una forma pasiva al pocillo
microtitulado. Si se utiliza biotina como marcador, se añade un
complejo avidina:HPR y se hace reaccionar, o bien (a) con sustrato
de peróxido de hidrógeno y cromógeno de
o-fenilendiamina (OPD), o bien (b) con sustrato de
peróxido de hidrógeno y cromógeno de tetrametilbencilidina (TMB). Se
revela una señal colorimétrica, que permite la detección
cuantitativa del DNA amplificado por
PCR.
PCR.
Se ha encontrado que, la sensibilidad de las
placas de captura de productos de PCR biotini1ados, es comparable a
la sensibilidad utilizando sondas radiomarcadas en los ensayos de
hibridaciones por transferencia Southern
(Southern blot) y de hibridación de oligonucleótidos (OH). El formato de captura en placa, sin embargo, ofrece algunas ventajas: (a) tiempo de ensayo más rápido; (b) un formato de ensayo menos laborioso, sin la utilización de una sonda radiomarcada y, (c), una evaluación objetiva, cuantitativa, de la hibridación.
(Southern blot) y de hibridación de oligonucleótidos (OH). El formato de captura en placa, sin embargo, ofrece algunas ventajas: (a) tiempo de ensayo más rápido; (b) un formato de ensayo menos laborioso, sin la utilización de una sonda radiomarcada y, (c), una evaluación objetiva, cuantitativa, de la hibridación.
Otro aspecto, es el diagnóstico de estados de
enfermedades específicas mediante la detección de la presencia de
secuencias específicas de DNA que caracterizan al organismo
causante. Se han descubierto sondas y cebadores específicos para uno
de estos microorganismos, concretamente: Chlamydia
trachomatis.
Otro aspecto de la invención, es la provisión de
equipos para la detección de secuencias de DNA, dichos equipos
comprenden el soporte sólido de poliestireno y juegos de reactivos
de PCR incluyendo los cebadores específicos y las sondas
preseleccionadas para la amplificación de las secuencias de DNA
diana que hibridarán con las sondas de captura. Tales equipos,
incluirán también, normalmente, la enzima o enzimas necesarias para
la reacción de PCR, preferiblemente, una enzima termoestable tal
como la Taq polimerasa de (Thermus aquaticus). En el
caso de la utilización de una placa microtitulada, éstos incluirán
también placas microtituladas con las sondas de captura para la
secuencia diana específica, ya unidas a éstas.
Por contra, Hatt et al. (Nucleic Acids
Research, 16:4053 4067, 1988) no describe ningún oligonucleótido
para la amplificación o detección del "plásmido críptico" de la
serotipo L1 de Chlamydia trachomatis. Además, la EP336412 no
describe los oligonucleótidos sintéticos son secuencias específicas
para la unión de Chlamydia trachomatis a una placa
microtitulada o a un soporte sólido de poliestireno. Por otro lado,
la EP317077 ni describe oligonucleótidos sintéticos útiles como
amplificadores o sondas de captura derivadas del "plásmido
críptico" revelado en Hatt et al. (Nucleic Acids Research,
16 4053-4067, 1988), ni describe ningún cebador ni
sondas de la invención. Además, el ensayo de hibridación para la
detección de Chlamydia trachomatis en la EP 317077 no
comprende la amplificación de la secuencia diana de DNA mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Las patentes estadounidenses números 4.683.195 y
4.683.202, describen métodos de amplificación de secuencias de DNA
mediante una técnica ya bien conocida en la materia como la
"reacción en cadena de la polimerasa" (PCR). La reacción en
cadena de la polimerasa, es un procedimiento en el que el DNA se
amplifica específicamente mediante múltiples síntesis de
amplificación de cebadores, de hebras complementarias (Saiki et
al., Science, 230:1350-1354 y 239;
487-491; 1985, 1988). El producto de PCR,
amplificado hasta 10^{6}-10^{7} veces, es un
fragmento de DNA de un tamaño discreto (amplicón) que se puede
detectar mediante electroforesis en gel, o mediante otros medios tal
y como se describen aquí. Brevemente: la PCR involucra la
preparación de cebadores cortos de oligonucleótidos, que corresponde
a los extremos opuestos de una secuencia "diana" conocida, la
cuales se intentan amplificar y posteriormente detectar. En este
procedimiento, el DNA o RNA, se extrae de células, tejidos, fluidos
corporales y similares. El ácido nucleico se desnaturaliza y, los
cebadores de oligonucleótidos se añaden en un exceso molar,
conjuntamente con dNTP (trifosfatos de desoxirribonucleótidos) y una
enzima de DNA polimerasa, preferiblemente una polimerasa Taq
estable al calor. Después de la subsiguiente desnaturalización por
calor, enfriado para permitir la hibridación a los cebadores, y la
extensión de cebadores mediante DNA polimerasa, se producen dos
"productos largos", que empiezan con los respectivos cebadores
y son complementarios a las dos hebras originales. Este
procedimiento se repite y, después de un segundo ciclo, se producen
dos hebras originales, dos productos largos del ciclo 1, dos nuevos
"productos largos", y dos "productos cortos". La longitud
de estos productos cortos (amplicones), es igual al número de
nucleótidos entre ambos cebadores e incluyendo a ambos cebadores.
Con ciclos adicionales, se producen "productos largos"
adicionales, incrementándose de forma lineal con cada ciclo. Sin
embargo, la generación de amplicones, se incrementa a una tasa de
crecimiento exponencial con cada ciclo y, mediante esta
amplificación, se permite la detección de cantidades extremadamente
pequeñas de DNA.
A través de la utilización de la tecnología de
PCR, es posible la detección de secuencias específicas de DNA
presentes en mínimas cantidades. Varias de estas técnicas,
involucran el uso de varias sondas hibridadas fijadas sobre ciertos
materiales.
\newpage
Tal y como se describirá de una forma completa
posteriormente, la presente invención utiliza la fijación de un
secuencia de captura de DNA, en pocillos microtitulados y la
subsiguiente detección mediante hibridación a amplicones marcados
(biotinilados). También involucra la utilización de tiocianato de
guanidina en la etapa de hibridación. Muchos de los procedimientos
que son relevantes aquí, se han descrito en la bibliografía
especializada. Dos informes de este tipo, describen la
inmovilización de grandes DNA diana en pocillos microtitulados,
seguido de la hibridación de estas dianas a oligonucleótidos
biotinilados o sondas de DNA con desplazamiento de la mella.
Cook et al., en Nucleic Acids Research,
16:4077-4095 (1988), inmovilizaban DNA diana
del bacteriófago M13 en pocillos microtitulados de placas Immulon®
2, mediante la incubación de DNA diana en acetato amónico 1M,
durante 1,5-2 horas, a 37ºC. El DNA diana
inmovilizado, se detectó después de la hibridación a sondas de
oligonucleótidos marcados en los extremos con biotina, o marcados
internamente con biotina, seguido de la adición de un complejo
estreptavidina-HPR y peróxido de
hidrógeno/o-fenilendiamina (OPD) para la detección
colorimétrica de la hibridación.
Negata et al., FEBS Lett.,
183:179-382 (1985), inmovilizaron DNA lambda
diana, en pocillos microtitulados en PBS que contenía MgCl_{2} 0,1
M. Después de una incubación durante la noche, a temperatura
ambiente, seguido de la eliminación de la solución, la placa se
irradió con rayos de luz ultravioleta. La hibridación con una sonda
de DNA lambda biotinilada (con desplazamiento de mella), se continuó
con una complejación con
avidin-beta-galoctisidasa. Se midió
la fluorescencia después de la adición del substrato,
4-metilumbeliferil-beta-D-galactósido.
Hevey et al., en la patente
Estadounidense Nº 4.228.237, describe un procedimiento que utiliza
biotina que reacciona a la avidina (unida de una forma covalente a
una enzima), para detectar un ligando en medio líquido. Nuestro
presente método, difiere en el hecho de que, el ligando está marcado
directamente con biotina, no con un anti-ligando
intermediario marcado con biotina. Además, varias otras
descripciones anteriores, describen sondas de hibridación
específicas, y la utilización diagnóstica de éstas; por ejemplo, la
patente Estadounidense U.S. Nº 4.358.535 (Falkow et al.) y
la solicitud de patente europea EP Nº 82301804.9 (publicación Nº
63.879; Yale University). Ésta última, describe la utilización de
sondas de DNA marcadas con biotina, detectadas por enzimas unidos a
anticuerpos específicos de avidina o biotina.
Ranki et al., en la patente
Estadounidense US Nº 4.486.539, describen la utilización de dos
reactivos de ácido nucleico que no se solapan entre ellos (uno de
ellos unido a un soporte sólido y el otro marcado), para detectar e
identificar microbios mediante la hibridación de DNA. La presente
invención, difiere de ésta, en el hecho de que el ácido nucleico
diana está marcado en sí mismo, y no requiere la utilización de una
sonda adicional de ácido nucleico marcada para la detección.
Stabinsky, en la patente Estadounidense Nº
4.751.177, describe un procedimiento de detección de DNA en donde el
DNA diana, se hibrida en solución a un polinucleótido mediador y a
una sonda de polinucleótido marcada. El polinucleótido mediador, a
su vez, es complementario a un polinucleótido inmovilizado en un
soporte sólido. La presente invención difiere en el hecho de que,
(a), la diana se marca durante la amplificación; no se necesita
ningún grupo indicador marcado para la detección y, (b), la sonda de
captura, está unida directamente a un soporte sólido, sin la
utilización de un polinucleótido mediador.
La GB2202328 no describe ni cebadores para la
amplificación del DNA de Chlamydia trachomatis ni sondas
unidas a placas microtituladas para la detección de secuencias
amplificadas a partir del DNA de Chlamydia trachomatis.
El tiocianato de guanidina (GuSCN), se ha
utilizado en la extracción de células y la subsiguiente hibridación
de ácido nucleico. Por ejemplo, Thompson y Gillespie, Anal. Bichem.,
163:281-291 (1987), prepararon sondas de RNA
radiomarcadas para detectar DNA o RNA dianas. En un formato de
transferencia "dot-blot", la sonda marcada con
^{32}P, se hibridó en GuSCN 5M /sal disódica del ácido
etilendiaminatracético (EDTA) 0,1 M, pH 8,0. Pellegrino et
al., Biotechniques, 5:452-459 (1987),
describen una hibridación en solución para detectar
HIV-RNA en células de la sangre. Se disolvieron
células de sangre en GuSCN 5 M/ Y EDTA 0,1 M, y se hibridaron con
una sonda de RNA radiomarcada en la misma solución a temperatura
ambiente. Los híbridos precipitados de TCA, se recogieron en
membranas y se determinó la radioactividad mediante la medición por
contador de centelleo. Gillespie, en la solicitud internacional de
patente Nº PCT/US87/01023, (publicación internacional Nº WO
87/06621), describe la utilización de tioisocianato de guanidina
para la hibridación molecular, utilizando una sonda marcada para
detectar DNA diana unido a un soporte sólido. La patente, describe
la utilización de GuSCN para hibridación molecular, en una gama de
concentraciones de 3 M a 6,5 M, a temperatura ambiente. El formato
para tal hibridación, incluye la unión de ácido nucleico diana a una
membrana de nitrocelulosa o nylon (transferencia
"dot-blot" o transferencia Southern),
prehibridación, a una sonda radiomarcada en GuSCN, lavados y
detección por auto-radiografía.
La figura 1, ilustra la preparación de un brazo
de unión químico, que se modificó para facilitar la biotinilación de
cebadores de oligonucleótidos de la PCR.
La figura 2, ilustra los resultados de un
autoradiograma de productos de PCR, unidos a una membrana de
Nytran®.
\newpage
La figura 3, ilustra los resultados del ensayo
de hibridación de oligonucleótidos (OH), utilizando los productos de
la PCR del ejemplo 6.
Los términos "oligonucleótido" y
"cebador", utilizados aquí, tienen el significado definido en
la anteriormente mencionada patente Estadounidense US Nº 4.683.202.
El término "sonda de captura", tal y como se utiliza aquí, se
define como un oligonucleótido que es complementario o
sustancialmente complementario a las secuencias del amplicón, dentro
de los límites de los cebadores. En la presente forma de realización
preferida, la sonda de captura no se encuentra provista de la
adición de una cola, pero podría añadirse una cola, con
desoxirribonucleótidos o
\hbox{ribonucleótidos.}
En la práctica de la presente invención, los
cebadores y las sondas se seleccionan para ser
"sustancialmente" complementarios a las diferentes hebras de la
secuencia diana a ser amplificada.
Para una de las realizaciones especificas
descritas aquí, se seleccionaron dos juegos de cebadores y sondas de
captura de PCR de la secuencia de nucleótidos del plásmido críptico
del serotipo L1 de Chlamydia trachomatis (Hatt et al.,
Nucleic Acids Research, 16:4053-4067, 1988).
Esto permite la amplificación y detección específica de C.
trachomatis. Para otros propósitos generales, la selección de
cebadores y de sondas para dianas individuales, será tal y como se
describe en la anteriormente mencionada patente Nº 4.683.202.
Como una alternativa y mejora de las técnicas
conocidas para la captura de la secuencia amplificada (amplicón),
resultante de la aplicación de la PCR, tal y como se ha descrito
anteriormente, la presente invención, en su realización preferida,
utiliza una sonda de captura de oligonucleótidos, pasivamente unida
a los pocillos de una placa microtitulada con objeto de capturar
amplicones marcados con biotina (mediante hibridación de secuencia
especifica). Se emplea entonces peroxidasa de rábano picante y
avidina en los amplicones biotinilados, y su reacción con el
sustrato (peróxido de hidrógeno) y cromógeno (ya sea OPD o TMB), da
como resultado una señal colorimétrica cuantitativa.
De nuevo, tal y como describe en la
anteriormente citada patente Estadounidense U. S. Nº 4.683.202, se
añaden también los trifosfatos de desoxirribonucleótidos dATP, dCTP,
dGTP Y TTP a la mezcla de la síntesis en cantidades apropiadas y, la
solución resultante se calienta a una temperatura de aproximadamente
90º-100ºC durante alrededor de 0,5 a 10 minutos, para separar las
hebras del molde. Después de este período de calentamiento, la
solución se enfría rápidamente a la temperatura que es preferible
para la hibridación de cebadores del molde. A esta mezcla se le
añade un agente apropiado para inducir o catalizar la reacción de
extensión del cebador y, se deja que la reacción acontezca bajo
condiciones conocidas en la materia. El agente inductor puede ser
cualquier compuesto o sistema que funcione para que se cumpla la
síntesis de productos de extensión de cebadores, incluyendo las
enzimas. Las enzimas apropiadas para este propósito, incluyen por
ejemplo la DNA polimerasa I de Escherichia coli (E. coli),
Fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. Coli, la DNA
polimerasa del T4, otras DNA polimerasas disponibles, transcriptasa
reversa, y otras enzimas, incluyendo preferiblemente enzimas
estables al calor (concretamente la DNA polimerasa Taq), que
facilitará la incorporación de los nucleótidos en la forma apropiada
para formar los productos de extensión de los cebadores que son
complementarios a cada hebra del ácido nucleico.
La hebra recién sintetizada y su hebra de ácido
nucleico complementaria, forma una molécula de doble hebra, cuyas
hebras se separan utilizando cualquier procedimiento de
desnaturalización para proporcionar moléculas de una sola hebra,
preferiblemente el calor.
El nuevo ácido nucleico se sintetiza en las
moléculas molde de una sola hebra. En caso necesario, se pueden
añadir a la reacción enzimas adicionales, nucleótidos y cebadores,
para proceder bajo las condiciones anteriormente descritas. De
nuevo, la síntesis se iniciará en un extremo de los cebadores de
oligonucleótidos y procederá a lo largo de las hebras individuales
del molde para producir ácido nucleico complementario mediante la
extensión de los cebadores.
Los pasos de separación de hebras y de síntesis
del producto de extensión, se pueden repetir tanto como sea
necesario para producir la cantidad deseada de la secuencia de ácido
nucleico amplificada.
En general, se puede utilizar cualquier material
(molécula, átomo) en la presente invención para proporcionar una
indicación o "señal" que sea detectable (y preferiblemente
cuantificable) y que se pueda unir o incorporar al ácido
nucleico.
En una realización preferida de la presente
invención, se emplean dos procedimientos para preparar amplicones
que incorporan marcadores de biotina durante la amplificación de
PCR. En el primer caso, la
biotina-11-dUTP (un análogo de la
TTP, químicamente modificado con un marcador de biotina), reemplaza
parcialmente a la TTP, en la reacción de PCR. La
biotina-11-DUTP, se incorpora
mediante la DNA polimerasa Taq durante la extensión del
cebador y, el producto de DNA resultante, se marca
"internamente" con biotina.
En el segundo caso, un "brazo de unión"
químico, está unido al extremo 5' terminal de los oligonucleótidos,
unido a un soporte sólido. En la realización preferida, el "brazo
de unión", tal y como se utiliza aquí, es una molécula que se
encuentra preferiblemente unida al extremo 5' del cebador (mediante
química de la fosforamidita) y es capaz de unir de una forma
covalente un grupo o grupos amino al oligonucleótido. Los grupos
amino, a su vez, se biotinilan con
biotina-X-NHS: Estos
oligonucleótidos marcados con biotina, cuando se utilizan como
cebadores en la reacción de PCR, generan amplicones que están
biotinilados en su extremo 5'.
El "brazo de unión" puede ser cualquier
molécula que sea lo suficientemente larga para actuar como un agente
espaciador para distanciar al marcador lejos de la secuencia de
oligonucleótidos, y que de esta forma sea fácil de unir uno o más
marcadores adecuados, enzimas termoestables o ligandos.
En la realización preferida de la presente
invención, uno de estos dos, o ambos procedimientos de marcaje con
biotina, (incorporación de cebadores marcados con
biotina-11-DUTP y cebadores marcados
con biotina en 5'), se pueden utilizar para marcar los productos
amplificados de la PCR.
Además de la biotina, en la presente invención
se pueden utilizar otros marcadores, incluyendo los compuestos
radiomarcados, reactivos luminiscentes o fluorescentes, reactivos
electrodensos, enzimas termoestables, ligandos, complejos de
anticuerpo-hapteno, y sistemas quelantes. Los
marcadores alternativos deben ser compatibles con las condiciones de
temperatura de la amplificación de PCR, así como con las condiciones
de desnaturalización y captura por hibridación.
Uno de estos ejemplos de marcadores
alternativos, incluyen a la
digoxigenina-11-dUTP, que al igual
que la biotina-11-dUTP, se incorpora
mediante la polimerasa Taq en el DNA amplificado y marcado.
Los amplicones marcados con digoxigenina, se pueden detectar
entonces con un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina dirigido
contra la digoxigenina, seguido de la detección calorimétrica
habitual, tal y como se derribe aquí.
Otro ejemplo de un marcador alternativo, son los
trifosfatos de desoxinucleótidos marcados con ^{32}P, que se
pueden utilizar también para reemplazar parcialmente trifosfatos de
desoxinucleótidos no marcados. La extensión de la captura por
hibridación, se pudo determinar, por ejemplo, mediante la medición
por contador de centelleo de pocillos microtitulados desechables
(descritos posteriormente, en el paso 2), después de la captura por
hibridación y de los lavados.
La placa de captura o soporte utilizado en la
presente invención, será un soporte sólido de poliestireno que tiene
una capacidad de unión a proteínas aumentada. Se conoce en la
técnica de la materia, varios tratamientos para lograr tal aumento
en dicho soporte (por ejemplo, irradiación con ^{60}Co).
El soporte sólido de poliestireno, puede tomar
cualquiera de diversas formas: por ejemplo, placas de
microtitulación, partículas micromagnéticas (obtenibles de Advanced
Magnetics, Inc.) microesferas, tiras, varillas, etc.
Preferiblemente, el soporte de poliestireno
utilizado en la presente invención, será una placa microtitulada que
tenga una capacidad de unión a proteínas aumentada y una serie de
pocillos, siendo la más preferida de tales placas microtituladas
aquéllas conocidas como "Dynatech Immulon® 2" (Dynatech
Laboratories, Inc., Chantilly, VA, suministradas por Fisher
Scientific).
En una realización preferida de la presente
invención se une una sonda de captura de oligonucleótidos específica
para amplicones de forma pasiva a los pocillos de una placa
microtitulada de poliestireno Immulon® 2, a una concentración de 25
ng DNA/pocillo, en una solución de acetato amónico 1 M. Tales placas
microtitulada, tienen una multiplicidad de pocillos y, de esta
forma, proporcionan un gran área y, al mismo tiempo, permiten un
gran número de ensayos simultáneos (por ejemplo, 96).
Además de la unión pasiva de la sonda de
captura, se pueden utilizar métodos de unión alternativos, que
incluye pero no se limita a: unión covalente; unión mediante una
proteína intermediaria (por ejemplo, BSA); y unión mediante
cualquier método químico alternativo.
El paso de hibridación de la presente invención,
de una forma más particular la "captura por hibridación", se
realiza preferiblemente en presencia de un tiocianato de guanidina 1
M, sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético 20 mM (EDTA), a
pH 8,0. La gama de concentraciones para lograr la captura por
hibridación en la placa microtitulada, es preferiblemente de 0,5 a
2,0 molar GuSCN y más preferiblemente de 1,0 a 2,0 M.
Se pueden también utilizar otros reactivos para
llevar a cabo la captura por hibridación. Por ejemplo, se puede
utilizar una solución de tiocianato amónico (0,5 a 5,0 M más
preferiblemente 5,0 M), en lugar de tiocianato de guanidina.
Otro posible sustituto para el tiocianato de
guanidina es un reactivo consistente en: formamida desionizada al
30% (v/v); 3 x SSPE [1 x SSPE = NaCl 0,18 M; NaPO_{4} 10 mM, pH
7,7; EDTA 1 mM]; sulfato de dextrano al 5% (p/v); Triton
X-100 0,1% (octilfenoxipolietoxietanol: Sigma
Chemical Co., St. Louis. MO).
El formato para tal tipo de hibridación incluye
los siguientes pasos:
- 1.
- Preparación de la sonda de captura
- 2.
- Preparación de la placa de captura microtitulada
- 3.
- Dilución y desnaturalización de DNA marcado, amplificado
- 4.
- Captura por hibridación
- 5.
- Lavados
- 6.
- Bloqueo
- 7.
- Adición de Avidina:peroxidasa de rábano picante
- 8.
- Lavados
- 9.
- Adición de sustrato y cromógeno: Aparición del color
- 10.
- Lectura de la placa (cuantificación)
Estos pasos, se describirán ahora de forma más
detallada.
Las sondas de captura, a las que se hace aquí
referencia, se seleccionan para ser "sustancialmente
complementarias" a las secuencias del amplicón dentro de los
límites de los cebadores. Por lo tanto, las sondas de captura deben
ser lo suficientemente complementarias como para hibridar
específicamente con los amplicones bajo condiciones de captura por
hibridación. En la presente realización preferida, las sonda de
captura contiene normalmente 20-200
nucleótidos.
Además, se puede utilizar más de una sonda de
captura, y se pueden utilizar sondas adicionales de captura para
capturar la misma hebra o la hebra opuesta del amplicón marcado.
A pesar de que la sonda de captura se define
aquí como "secuencias de amplificación dentro de los límites de
los cebadores", se pueden también utilizar como sondas de
captura, los cebadores en sí mismos, u oligonucleótidos que
contienen la secuencia de los cebadores. Debe no obstante tomarse
debida nota de que, cuando tales tipos de oligonucleótidos se
utilizan como sondas de captura, deben competir, durante la
hibridación con cebadores de PCR que no se hayan eliminado de los
productos de reacción.
Las presentes sondas de captura y cebadores de
PCR, se han sintetizado en un sintetizador de DNA MilliGen 7500
(MilliGen/Biosearch, Inc., Bulington, MA), mediante métodos químicos
habituales basados en beta-cianoetil fosforamidita,
si bien son posibles otros procedimientos conocidos por los expertos
en la materia. Antes de su utilización, las sondas de captura y los
cebadores de PCR, se purificaron parcialmente mediante, o bien
electroforesis en geles de poliacrilamida al 15% (p/v), o bien
mediante centrifugación en columna (ver ejemplo 3). Las sondas de
captura y los cebadores finales, parcialmente purificados, se
resuspendieron en agua y su concentración se determinó
espectrofotométricamente, y se almacenaron a 4ºC hasta que se
necesitaron.
A pesar de que la sonda de captura, tal como se
describe aquí, se produce sintéticamente, no tiene porqué ser
necesariamente así. Ésta se puede también obtener como un
subconjunto de DNA obtenido naturalmente, preparado mediante métodos
estándar (por ejemplo, digestión mediante endonucleasas de
restricción).
La sonda de captura de oligonucleótidos, se fija
preferiblemente en los pocillos de una placa microtitulada de
poliestireno Dynatech Immulon® 2 (Dynatech Laboratories, Inc.,
Chantilly, VA., suministradas por Fisher Scientific). La placa
Immulon® 2, consiste en una disposición de 96 tubos de ensayo de
poliestireno en miniatura (pocillos), ordenados en una única placa
de plástico, diseñada para su uso general en procedimientos de
inmunoensayos de microvolúmenes en fase sólida. En la realización
preferida de la presente invención, se utilizan placas con pocillos
de fondo plano (de 400 \mul de capacidad volumétrica), pero se
asume que se pueden utilizar también pocillos con el fondo en forma
de "U" (de 300 \mul de capacidad volumétrica).
Como otra realización preferida de la presente
invención, la sonda puede también fijarse a tiras Immulon®
2Removawell® de (Dynatech), que son tiras desechables de doce tubos de ensayo de poliestireno (pocillos) Immulon® 2, que están situadas en soportes (Dynatech) de tiras de Removawell® en un formato de placa microtitulada.
2Removawell® de (Dynatech), que son tiras desechables de doce tubos de ensayo de poliestireno (pocillos) Immulon® 2, que están situadas en soportes (Dynatech) de tiras de Removawell® en un formato de placa microtitulada.
\newpage
La sonda de captura de oligonucleótidos se
diluye para proporcionar 25 ng por pocillo microtitulado en 50
\mul de acetato amónico 1 M (Fisher Scientific, Fair Lawn NJ). Se
preparan también los "pocillos en blanco" mediante la adición
de acetato amónico 1 M (sin sonda de captura de oligonucleótidos) a
ciertos pocillos, (a los cuales se les añadirá posteriormente
productos de PCR marcados para la hibridación ficticia). Estos
pocillos en blanco, son un indicativo de la unión inespecífica del
DNA biotinilado a los pocillos de las placas microtituladas, y se
utilizan también para calibrar el instrumento de lectura de la placa
(espectrofotómetro) (Ver después en el paso 10).
La placa, se sella con sellador de placas mylar
(Dynatech) y se incuba a 37ºC toda la noche para la fijación pasiva
de la sonda de captura de oligonucleótidos a la superficie de
poliestireno. Si las placas no van a utilizarse inmediatamente,
éstas se guardan a 4ºC hasta que se necesiten. Las placas
almacenadas de esta forma durante seis meses, no mostraron ninguna
diferencia significativa en su capacidad para capturar DNA.
Justo antes de la hibridación, los pocillos de
las placas se lavaron dos veces con 200 \mul de 2 x SSC [1 x SSC =
NaCl 0,15 M,; tampón de citrato sódico 15 mM, pH 7,0] y una vez con
200 \mul de 2 x SSC, Triton X-100 al 0,1% (v/v).
Todos los lavados de placa descritos aquí se realizan utilizando un
dispositivo de pipeta de canales múltiples (por ejemplo, Titertek®),
o se pueden realizar utilizando un lavador de placas microtituladas
automático apropiado.
Los productos biotinilados de PCR se diluyen (en
un rango comprendido de entre 1:10 hasta 1:100 ó más) en GuSCN 1 M
(de grado ultrapuro; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis,
IN), EDTA 20 mM, pH 8,0 (preparado de una solución de reserva 5 x),
y se calientan a una temperatura de 100ºC durante cinco minutos, y
se enfrían rápidamente en un baño de agua helada. [El paso de
calentamiento provoca la desnaturalización por calor de los
productos de PCR, y el rápido proceso de enfriamiento, evita la
hibridación de las hebras de los amplicones, favoreciendo de esta
forma la hibridación a las sondas de captura de oligonucleótidos].
Se cargan alícuotas de 100 \mul en cada pocillo, incluyendo los
pocillos designados como "blancos" (sin sondas de captura) tal
y como se ha descrito antes (paso 2).
La captura especifica de DNA marcado y
amplificado mediante sondas de captura de oligonucleótidos, se
realiza mediante incubación a temperatura ambiente, durante un
tiempo de 1-3 horas. Durante dicho tiempo, los
amplicones de PCR se capturan específicamente mediante la sonda de
captura de oligonucleótidos, basada en la secuencia complementaria
entre la sonda de captura y el amplicón marcado.
Después de la hibridación, los contenidos de
todos los pocillos microtitulados se desechan y, dichos pocillos, se
lavan dos veces con 200 \mul de 2 X SSC, Triton
X-100 al 0,1%, (v/v), y cuatro veces con 200 \mul
de 0,2 x SSC de Triton X-100 al 0,1% (v/v)
previamente calentado a 37ºC. Estos lavados, se realizan para
eliminar los productos biotinilados no unidos a los pocillos
microtitulados.
Después del proceso de lavado, los pocillos de
la placa, se "bloquean" durante un tiempo mínimo de
15-30 minutos, con 200 \mul de una solución de
PBS, (PBS = NaCl 0,13 M, Na_{2}HPO_{4} 7 mM, NaH_{2}PO_{4} 3
mM, pH 7,0), albúmina de suero bovino (BSA) al 2% (p/v) (Sigma),
Triton X-100 al 0,1% (v/v). Este paso de
"bloqueo", es necesario para minimizar la unión no especifica
de avidina:HPR a los pocillos microtitulados.
Se diluye un complejo de avidina/peroxidasa
(HPR) (Vector Laboratories, Inc,. Burlingame, CA), a un valor 1:2000
en PBS, Triton X-100 0,1% (v/v), hasta una
concentración final de 2,5 \mug de avidina:HPR/ml. Se añaden
cincuenta microlitros de complejo de avidina:HPR diluida a cada
pocillo y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Durante este paso, el complejo de avidina:HPR, se une estrechamente
a los productos biotinilados capturados en cada pocillo. Mientras
que el complejo de avidina:HPR, es el que se utiliza en la presente
invención, se puede también utilizar en su lugar un complejo de
estreptavidina:HPR. De la misma forma, se pueden utilizar también
otros productos complejados con avidina (o estreptavidina),
incluyendo: fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa,
luciferasa, fluoresceína, Rojo Texas o cualquier otro agente capaz
de generar una señal colorimétrica, fluorescente o luminiscente.
Los pocillos de la placa microtitulada se lavan
entonces cuatro veces con 200 \mul de PBS, Triton
X-100 al 0,1%; y una vez con 200 \mul de PBS, EDTA
1 mM, el lavado final se incubó a temperatura ambiente durante
1-10 minutos. Estos lavados se realizaron para
eliminar el complejo avidina:HRP, no unido a los pocillos
microtitulados, antes de proceder a la adición del cromógeno.
La aparición de color, en la realización
preferida de la presente invención, se logra utilizando uno de los
dos sistemas de cromógenos: (a) peróxido de hidrógeno/OPD y (b)
peróxido de hidrógeno/TMB.
(a) peróxido de hidrógeno/OPD. Después de
desechar el tampón de lavado (descrito en el paso 8), se añaden 150
\mul de reactivo OPD [1,6 mg/ml de sal disódica de la
o-fenilendiamina (Sigma), peróxido de hidrógeno al
0,0125% (v/v) (Fisher Scientific) en un tampón de fosfato
sódico/citrato 0,15 M, pH 6,0], y se deja que aparezca el color en
la oscuridad durante 1-30 minutos. La aparición de
color se para mediante la adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4}
4N.
(b) peróxido de hidrógeno/TMB. Después de
desechar el tampón del último lavado (descrito en el paso 8), se
añade a cada pocillo 100 \mul de reactivo de color TMB. [El
reactivo de color TMB, consiste en la mezcla inmediata de volúmenes
iguales de sustrato de TMB peroxidasa
(3,3',5,5'-tetrametilbencidina, a una concentración
de 0,4 g/l en una base orgánica; (comercialmente disponible de
Kirkergaard and Perry, Inc., Gaithersburg, MD) y solución de
peróxido de hidrógeno [peróxido de hidrógeno al 0,02% (v/v) en un
tampón de ácido cítrico; comercialmente disponible de Kirkegard and
Perry, Inc.]. Se deja que proceda la reacción a temperatura ambiente
en la oscuridad, durante 1-30 minutos, al cabo del
cual, se para la aparición de color mediante la adición de 100
\mul de ácido fosfórico 1 M (H_{3}PO_{4}).
El substrato de TMB, produce un precipitado con
un color azul. Después de la adición de ácido fosfórico, acontece un
cambio de color hacia el amarillo, con una densidad óptica medida a
450 nm (ver posteriormente en el aso 10). Adicionalmente a los
substratos de HPR, ODP Y TMB, otros substratos solubles incluyen
a:
ácido
2,2-azino-di(3-etilbenciltiazolinsulfónico)
(ABTS), y ácido 5-aminosalicílico (ASA). Los
substratos insolubles, incluyen al
3-amino-9-etilcarbazol
(AEC) y al 3,3-diaminobencideno (DAB).
Después de que se haya parado la aparición de
color, la densidad óptica (DO) de las muestras de cada pocillo, se
determina mediante la lectura con un lector automático de placas
microtituladas capaz de realizar una determinación
espectrofotométrica (por ejemplo, InterMed Immunoreader®
NJ-2000) a longitudes de onda específicas por el
cromógeno utilizado (ver posteriormente).
Se determina también la DO de los pocillos en
blanco [productos de PCR biotinilados añadidos a los pocillos sin
sondas de captura, tal y como se describe en el paso 2]. Esta señal,
(normalmente muy baja), es un indicativo de la unión inespecífica de
los productos biotinilados en los pocillos de muestras, mejor que la
señal resultante de la captura auténtica de amplicones biotinilados
a través de la hibridación con una sonda de captura. De esta forma,
la DO de los pocillos en blanco, se sustrae de la DO de los pocillos
de las muestras para proporcionar una cuantificación precisa de la
captura por hibridación auténtica.
La longitud de onda apropiada para ajustar el
espectrofotómetro (lector de placas), depende del cromógeno
específico utilizado para la reacción colorimétrica. De esta forma,
si se utiliza peróxido de hidrógeno/OPD, el ajuste correcto de la
longitud de onda, es de 490 nm; si se utiliza peróxido de
hidrógeno/TMB, el ajuste correcto de longitud de onda, es de 450
nm.
Mediante el uso de la presente invención, se
pueden diagnosticar varias enfermedades infecciosas a través de la
detección de la presencia de secuencias especificas de DNA que
caracterizan al microorganismo causante. Tal y como se ha descrito
previamente, y como una realización adicional de la presente
invención, se han descubierto nuevas sondas de captura y cebadores
que son específicamente capaces de poderse utilizar en la detección
del organismo
Chlamydia trachomatis. Dichas nuevas sondas y cebadores, se describirán de forma detallada en los siguientes ejemplos específicos.
Chlamydia trachomatis. Dichas nuevas sondas y cebadores, se describirán de forma detallada en los siguientes ejemplos específicos.
La presente invención ofrece también ventajas
particulares en el contexto de la aplicación clínica. Mediante el
uso de placas microtituladas, se proporciona un procedimiento de
ensayo apropiado, rápido, fácil, económico, y automatizable. El
ensayo, es altamente preciso y sensible si se compara con los medios
convencionales y se puede realizar en una fracción de tiempo del que
se necesita normalmente.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no intentan ser limitantes.
Se sintetizó químicamente la
biotina-11-dUTP mediante los métodos
de Larger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),
78:6633-6637 (1981), y se resuspendió a una
concentración de 0,4 mM en Tris-HCl 100 mM, pH 7,5,
EDTA 0,4 mM. Se optimizó la relación
biotina-11-dUTP:TTP y, la señal más
alta se obtuvo utilizando una proporción de 4:1
(biotina-11-dUTP:TTP).
Todos los oligonuc1eótidos utilizados como
cebadores de PCR se sintetizaron en un sintetizador de DNA
automatizado MilliGen 7500, mediante procesos químicos habituales de
la beta-cianoetilfosforamidita, utilizando
procedimientos químicos estándar para los entendidos en la
materia.
Los oligonucleótidos preparados para su
utilización como cebadores biotinilados, se modificaron tal y como
se muestra en la figura 1. Los oligonucleótidos sintéticos en
soporte sólido, se derivatizaron en los extremos 5' mediante
reacción con la hexilamino fosforamidita protegida [estructura 1],
seguido de la oxidación y desprotección, según procedimientos
estándar (McBride y Caruthers, Tetrahedron Letters,
24:245-248, 1983), para proporcionar
oligómeros 5'-amino marcados [estructura 2]. La
reacción de [2] con ésteres de
N-hidroxisuccinimidilo de derivados de la biotina,
proporcionó oligonucleótidos 5'-biotini1ados
[estructura 3], en buenos rendimientos productivos, que se
purificaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. (Ver
más adelante, Ejemplo 3).
Los oligonucleótidos utilizados como cebadores
de PCR o sondas de captura, se purificaron según una de las dos
siguientes formas: (a) electroforesis en gel de poliacrilamida, o
(b), centrifugación en columna
(a) Electroforesis en gel de
poliacrilamida Se secaron al vacío alícuotas de
100-250 \mug de cada oligonucleótido, se
resuspendieron en un volumen mínimo de tampón de carga de gel, [TBE
(trisborato 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM); formamida
desionizada 90% (v/v); azul de bromofenol 0,02% (p/v)], se
calentaron a 100ºC durante 5 minutos, y se enfriaron rápidamente en
una baño de agua helada. Se cargaron las muestras en un gel de
poliacrilamida desnaturalizante [acrilamida al 15% (p/v)
(acrilamida:bis-acrilamida, 29:1) (IBI, New Haven,
CT), urea 7 M (IBI) en TBE] y se procedió a realizar la
electroforesis a 650 voltios durante cuatro horas. El DNA se
visualizó mediante sombreado UV sobre una placa de cromatografía de
capa fina (Eastman Kodak Nº 13254 celulosa), se fotografió, y se
cortó la banda del gel con el oligonucleótido de longitud completa.
El fragmento de gel se trituró y se eluyó el DNA en agua durante
toda la noche a 37ºC. El DNA se purificó adicionalmente con un pase
sobre un cartucho C_{18} Sep-Pak® (Waters
Associates, Milford, MA), y se eluyó en acetonitrilo (Fisher) al 40%
(v/v). Después de la evaporación hasta secado al vacío, el DNA se
resuspendió en agua y su concentración se determinó por
espectrofotometría. Las concentraciones de reserva se ajustaron con
agua y se almacenaron a 4ºC hasta que fueron necesarias.
(b) Centrifugación en columna Algunas
sondas de captura y cebadores de oligonucleótidos, se purificaron
parcialmente utilizando columnas Bio-SPin®, 6
(Bio-Rad. Inc. Richmond, CA) en un rotor de cubeta
oscilante a reducidas fuerzas centrifugas, siguiendo las
instrucciones del fabricante para la centrifugación en columna.
Después de la purificación parcial, la concentración de los
oligonucleótidos se determinó por espectrofotometría y se prepararon
soluciones de reserva con agua y se almacenaron a 4ºC hasta que
fueron necesarias.
(Ejemplo de
referencia)
Se ensayaron empíricamente la mayoría de pares
de cebadores para determinar sus condiciones de temperatura óptima
para la amplificación por PCR, prestando particular atención a su
temperatura de hibridación.
Para la detección de las secuencias tax del
HTLV-1, se utilizaron los juegos de cebadores SK43 y
SK44 (descritos por Kwok et al., J. Inf. Dls.,
158:1193-1197, 1998). Utilizando este par de
cebadores, una reacción PCR de 100 ml, consistió en: tampón de
reacción 1 x (RB) [10 x RB = KCl 500 mM; Tris-HCl
100 mM, pH 8,5; MgCl_{2} 25 mM]; 200 mM de cada una de dATP, dCTP,
dGTP Y TTP, 50 pmol de cada uno de los SK43 y SK44, Y 2 unidades de
Taq DNA polimerasa recombinante (RecOmbiTaq®, Cetus Perking Elmer,
Norwalk. CT).
Para los experimentos en los que se incorporó
biotina-11-dUTP, los contenidos de
la reacción fueron como se ha definido antes, en el punto anterior,
excepto que los TTP 200 \muM, se reemplazaron con
biotina-11-dUTP 160 \muM, TTP 40
\mum.
Para el juego de cebadores SK43 y SK44, el
régimen de temperaturas para la PCR, empezó con una
desnaturalización prolongada, a una temperatura de 94ºC, durante 5
minutos, seguido de una etapa de hibridación a 50ºC, durante 25
segundos, y un paso de extensión, a 72ºC, durante 1 minuto. Para los
siguientes 28 ciclos, el régimen de temperatura consistió en:
desnaturalización a 94ºC durante 25 segundos, hibridación a 50ºC
durante 25 segundos, y extensión a 72ºC durante 1 minuto. El ciclo
final (30º) fue: desnaturalización a 94ºC durante 25 segundos,
hibridación a 50ºC durante 25 segundos, y un alargamiento prolongado
a 72ºC durante 10 minutos. Después de la amplificación de PCR, se
retiraron 90 \mul del contenido de la reacción por debajo del
aceite mineral, y se almacenó a 4ºC hasta el análisis de los
productos de la PCR.
(Ejemplo de
referencia)
Un plásmido (pTAX) que contiene la totalidad del
gen tax de HTLV-1, se utilizó como un molde de
control positivo. La concentración del DNA del plásmido se determinó
por espectrofotometría, y se hicieron diluciones en agua para
liberar números de copias conocidos de DNA diana en las reacciones
de PCR. De esta forma se creó un molde de control positivo.
Se utilizó también un plásmido heterólogo con el
juego de cebador tax de HTLV-1, como un control
negativo. Este plásmido pRT-POL, contenía secuencias
de la región de la polimerasa (pol) del HTLV-1. Se
determinó la concentración del DNA del plásmido, y se diluyó en
serie tal y como se describe para el pTAX. Las concentraciones de
plásmido se calcularon para proporcionar un número conocido de
copias en un volumen específico añadido a la mezcla de reacción de
la PCR (concretamente, 2 \mul de DNA molde añadido a 98 ml de la
mezcla de reacción).
(Ejemplo de
referencia)
Con objeto de comparar directamente tres
sistemas de detección de PCR, lado a lado, se amplificaron por PCR
un número conocido de copias del plásmido pTAX (Ejemplo 5). La
concentración del plásmido, se ajustó con agua para proporcionar
1300, 100, 50, 20 o 10 copias de molde por reacción. El juego de
cebador HTLV-1 tax SK43/SK44 (Kwok et al., J.
Inf. Dis. 158:1193-1197, 1988) se sintetizó
y purificó mediante columnas de centrifugación
Bio-Spin® 6 (descritas en el Ejemplo 3), y cada
cebador se añadió a la reacción de PCR a una concentración de 50
pmoles.
Se generó DNA amplificado sin marcar mediante la
utilización de cada uno de los dNTP a 200 \muM para la
amplificación de PCR. Estos productos no marcados de PCR se
utilizaron para determinar la sensibilidad de los ensayos de
hibridación de transferencia Southern (Ejemplo 9) e hibridación de
oligonucleótidos (OH) (Ejemplo 10). La amplificación se desarrolló
durante 30 ciclos, utilizando las condiciones de mezcla de reacción
y temperatura descritas en el ejemplo 4.
de
referencia)
Se realizó también la amplificación por PCR con
el juego de cebadores SK43/SK44para producir amplicones
biotinilados, a través de la incorporación de
biotina-11-dUTP. Las condiciones
para esta amplificación de tax de HTLV-1 fueron como
las descritas anteriormente (Ejemplo 6), excepto que en la mezcla de
la reacción incluyó dATP, dCTP y dGTP a 200 \muM;
biotina-11-dUTP a 160 \muM; TTP a
40 \muM. Los productos marcados de PCR, se utilizaron para
determinar la sensibilidad de detección de captura por hibridación
en placas (Ejemplo 8) e hibridación por transferencia Southern
(Ejemplo 9). La amplificación se desarrolló durante 30 ciclos
utilizando la mezcla de reacción y las condiciones de mezcla de
reacción y temperatura descritas en el ejemplo 4.
(Ejemplo de
referencia)
Se preparó una placa de captura, procediendo a
unir 25 ng de "sonda de captura" de oligonucleótido SK45 (Kwok
et al., J. Inf. Dis., 158:1193-1197,
1998) en acetato amónico 1 M, a los pocillos de una placa Dynatech
Immulon®, e incubando durante toda la noche, a 37ºC. Los productos
biotinilados de PCR (Ejemplo 7) se diluyeron a 1:25 y 1:100 en
tiocianato de guanidina (GuSCN) 1M, se desnaturalizaron por calor
(cinco minutos, 100ºC), y se enfriaron rápidamente en un baño de
agua helada. Para cada muestra y control, se añadieron 100 \mul a
cada uno de los cuatro pocillos microtitulados (pocillos de sonda de
captura SK45 triplicados, y un pocillo "en blanco"), y se
incubaron para la hibridación durante dos horas a temperatura
ambiente. Los contenidos de las placas se descartaron y las placas
se lavaron, se bloquearon y se trataron con avidina:peroxidasa de
rábano picante, como se ha descrito antes en el paso 9. Después de
añadir H_{2}O_{2} y ODP, se determinó la aparición del color a
490 nm utilizando un lector de placas.
Los resultados de la captura por hibridación en
placa se incluyen abajo. Con referencia a la tabla 1 de más abajo,
la captura por hibridación de productos de PCR biotinilados se
ilustra utilizando cebadores de HTLV-l, SK43/SK44,
específicos para tax de HTLV-1, amplificando el
molde homólogo (pTAX), y el molde heterólogo
(pRT-POL). Se añadió
Biotina-11-dUTP como precursor, en
la reacción de PCR (ver ejemplo 7) y las condiciones de la PCR
fueron como en el ejemplo 4. Se realizó el ensayo de captura en
placa tal y como se ha descrito. Se diluyeron muestras a 1:25 y
1:100 en GuSCN 1 M para la hibridación, después de lo cual se
procedió a lavar las placas, se bloquearon y se trataron con
avidina:HRP. Se determinó la DO_{490} después de 35 minutos de
aparición de color, con H_{2}O_{2}/OPD. Los números presentados
a continuación, son valores medios de muestras triplicadas.
| DO_{490} | DO_{490} | |
| Dilución 1:25 | Dilución 1:100 | |
| 1300 copias pTAX | 1,693 | 0,444 |
| 100 copias pTAX | 0,343 | 0,117 |
| 50 copias pTAX | 0,300 | 0,053 |
| 20 copias pTAX | 0,123 | 0,040 |
| 10 copias pTAX | 0,031 | 0,029 |
| Controles negativos: | ||
| Sin molde | 0,007 | 0,026 |
| 10^{4} copias pTR-POL | 0,000 | 0,042 |
El limite de detección para este ensayo, pareció
ser de 20 copias de plásmido diana limpio (la DO_{490} de la
dilución 1:25, fue de 0,123). El control negativo "sin molde" y
el control negativo utilizando un molde de amplificación heterólogo,
proporcionaron valores de DO de 0,007 y 0,000, respectivamente, a
una dilución de 1/25; y de 0,026 y 0,042, respectivamente, a una
dilución de 1/100.
(Ejemplo de
referencia)
Se secaron al vacío alícuotas (25 \mul) de
ambos productos de PCR, no marcados (Ejemplo 6) y marcados con
biotina (Ejemplo 7), se resuspendieron en 5 \mul de agua y 2
\mul de tampón de carga de gel de agarosa [0,25% (p/v) de azul de
bromofenol, 0,25% (p/v) de xileno cianol, 30% (v/v) de glicerol], y
se cargaron en un gel de agarosa NuSieve® GTC al 3% (p/v) (FMC
Bioproduts, Rockland, ME)/ Sea Kem (FMC) al 1% (p/v) en TBE, que
contenía 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. El gel, se visualizó
con un transiluminador UV y se fotografió. El gel se trató a
continuación durante 30 minutos en NaOH 0,5 N, NaCl 1M, y durante 30
minutos en Tris-HCl 0,5 M, pH de 7,5, y se
transfirió durante toda la noche con membranas de nylon Nytran®
(Schleicher and Schuell, Inc., Keene, HN), en alta concentración de
sal, siguiendo procedimientos estandarizados conocidos en la
materia. La transferencia ("Transferencia Southern"), se horneó
a continuación durante 30 minutos a 75ºC y se prehibridó
1-4 horas a 37ºC en una bolsa sellada que contenía 6
x SSPE [1 x SSPE = NaCl 0,18 M, NaPO_{4} 10 mM, pH, 7,7, EDTA 1
mM], dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1% (p/v) (Aldrich Chemical
Co., Milwaukee, WI); 10 x reactivo de Denhardt [1% p/v de cada uno
de ficoll (Pharmacia, Piscataway, NJ), polivinilpirrolidona (Sigma),
y BSA (Sigma)]; y 50 mg/ml de DNA de esperma de salmón, se
desnaturalizó por calor y se enfrió rápidamente.
En la figura 2, la amplificación por PCR fue tal
y como se describe en los ejemplos 6 y 7 y las condiciones para la
electroforesis en gel de agarosa, transferencia e hibridación,
fueron tal y como se describe en este Ejemplo.
En la mitad superior de la fotografía, se
muestran productos de PCR marcados con biotina del Ejemplo 7: los
productos amplificados de 1300, 100, 50, 20 Y 10 copias de pTAX
(carriles 1-5, respectivamente); control negativo de
PCR "sin molde" (carril 6).
En la mitad inferior de la fotografía, se
muestran los productos no marcados de PCR del Ejemplo 6: productos
amplificados de 1300, 100, 50, 20 Y 10 copias de pTAX (carriles
1-5, respectivamente); control negativo de PCR
"sin molde" (carril 6).
Se marcó una sonda especifica de amplicones,
SK45, con ^{32}P-ATP, utilizando la polinucleótido
quinasa (Boehringer Mannheim Biochemicals), utilizando
procedimientos estandarizados en la materia. Para la hibridación, se
añadió esta sonda radiomarcada a un tampón de hibridación (6 x SSPE,
SDS 1% (p/v)), a una proporción de 4,1 x 10^{6} cpm/transferencia.
Después de la hibridación a 60ºC durante 2-3 horas,
la transferencia se sometió a varios lavados astringentes y se
colocó bajo una película Kodak X-OMAT AR durante
toda la noche a -80ºC, con una pantalla intensificadora.
Después de la exposición durante toda la noche,
el límite de detección para la transferencia Southern fue de 10
copias de plásmido pTAX diana para productos de PCR que no estaban
biotinilados (Ejemplo 6), y 20 copias de plásmido diana para
productos de PCR biotinilados (Ejemplo 7). (Ver la fotografía del
autoradiograma, Figura 2.). El control negativo de PCR "sin
molde", no proporcionó productos detectables en la
autoradiografía.
(Ejemplo de
referencia)
Con referencia a la Figura 3, las condiciones
del ensayo OH (OH = hibridación de oligonucleótidos) (preparación de
la sonda marcada, condiciones de desnaturalización y de hibridación
para electroforesis en gel de poliacrilamida) fueron como se
describen en este Ejemplo.
La fotografía mostrada, es una exposición de
toda la noche de un autoradiograma (-80ºC, con pantalla
intensificadora sobre película Kodak X-OMAT AR), que
muestra la señal generada por cada una de las 1300, 100, 50, 20 ó 10
copias de pTAX (carriles 1-5, respectivamente);
control negativo de PCR "sin molde" (carril 6); 10^{4}
células de Jurkat extraídas expresando constitutivamente el tax de
HTLV-1, amplificado por PCR (carril 7). 10^{4}
células de Jurkat extraídas, amplificadas por PCR (carril 8). El
control negativo de la OH en la que no se añadió DNA amplificado al
^{32}P-SK45 para el ensayo de OH (carril 9).
Los productos no marcados de PCR del juego de
cebadores SK43/SK44 (ejemplo 6), se analizaron mediante el ensayo de
hibridación de oligonucleótidos (ensayo OH), para determinar el
límite de detección para este formato. El procedimiento fue
esencialmente tal y como de describe en Abbot et al., J. Inf.
Dis. 158:1158-1169 (1988) para hibridación
líquida (LH). Se añadieron treinta microlitros de producto
amplificado por PCR a 10 \mul de una mezcla de sondas que contenía
250.000-400.000 cpm de sonda SK45 marcada con
^{32}P diluida en EDTA 44 mM, NaCl 66 mM. La mezcla de DNA se
desnaturalizó a 95ºC durante cinco minutos, seguido inmediatamente
de la hibridación a sonda a 55ºC durante 15 minutos. Se añadieron 10
microlitros de tampón de carga de gel de agarosa (ejemplo 9) y medio
volumen se cargó a un gel de poliacrilamida nativo al 10% (p/v)
(acrilamida:bis-acrilamida, 19:1) en TBE. La
electroforesis se realizó a 200 voltios hasta que el azul de
bromofenol alcanzó el final del gel. La mitad superior del gel, se
expuso a una película Kodak X-Omat AR, para
exposiciones de 3 horas y de toda la noche, a -80ºC con una pantalla
intensificadora.
Después de una exposición de tres horas (no
mostrado) o después de una exposición de toda la noche (figura 3),
se pueden ver claramente diez copias de plásmido pTAX diana
amplificado como una banda específica. El control negativo "sin
molde" y otros controles negativos, no produjeron bandas.
(Ejemplo de
referencia)
El ensayo de captura en placa (Ejemplo 8), se
comparó con ensayos más convencionales, la hibridación por
transferencia Southern, (Ejemplo 9), y el ensayo de hibridación de
oligonucleótidos (OH) (Ejemplo 10), para la capacidad de detectar
mínimos números de copias de DNA de HTLV-l después
de 30 ciclos de amplificación por PCR (Ejemplos 6 y 7). Cada uno de
los tres sistemas de detección ensayados (ensayo de captura en
placa, ensayo de transferencia Southern y ensayo OH), fueron
esencialmente comparables en su capacidad para detectar pequeños
números de copias de plásmido diana limpio después de treinta ciclos
de amplificación por PCR. Se encontró que la captura en placa,
detectaba 20 copias, la transferencia Southern entre 10 y 20 copias,
y la OH, 10 copias de diana limpia. De los tres sistemas de
detección, el ensayo en placa es el más rápido, proporcionado un
resultado definitivo en horas. Además, el ensayo en placa,
proporciona valores numéricos de DO, en oposición a las bandas de
autoradiograma subjetivas en los ensayos de transferencia Southern y
de OH. Por lo tanto, la presente invención permite la determinación
numérica objetiva de "positividad" de una muestra, y el cálculo
de un valor de corte objetivo para los límites inferiores de
positividad (este valor de corte en un valor de DO, por debajo del
cual las muestras se consideran negativas con un grado calculado de
significación estadística).
Los valores de DO, proporcionados por el ensayo
en placa, permiten también la determinación cuantitativa de un valor
de proporción de "señal respecto a ruido de fondo" que es de
importancia en la validación de un ensayo de diagnóstico. Para los
formatos de hibridación por transferencia Southern y ensayo OH, la
relación "señal respecto a ruido" se puede únicamente estimar
mediante una evaluación visual de la señal de la
autoradiografía.
\newpage
(Ejemplo de
referencia)
Se sintetizaron dos juegos de cebadores y sondas
de captura para detectar específicamente Chlamydia
trachomatis. Las secuencias de oligonucleótidos se escogieron
del plásmido críptico del serotipo L1 de C. trachomatis (Hatt
et al., Nucleic Acids Research,
16:4053-4067, 1988).
El juego de cebadores A, generó un amplicón
específico de 208 pb utilizando los siguientes cebadores:
- CP-24 (25-mero, polaridad +, bases 195-219)
- 5' GGT ATT CCT GTA ACA ACA AGT CAG G 3'
Es decir, el cebador es cualquier
oligonucleótido que se unirá a la siguiente secuencia, o provocará
elongación a través de ella:
- 5' C CTG ACT TGT TGT TAC AGG ATT CCC 3'
- CP-27 (26-mero, polaridad -, bases 377-402)
- 5' CCT CTT CCCCAG AAC AAT AAG AAC AC 3'
Es decir, el cebador es cualquier
oligonucleótido que se unirá a la siguiente secuencia, o provocará
elongación a través de ella:
- 5' GT GTT CTT ATT GTT CTG GGG AAG AGG 3'
El amplicón específico del juego de cebadores A
de 208 pb se detectó con la sonda de captura
CP-35:
- CP 35 (26-mero, polaridad -, bases 235-260)
- 5' CAT AGC ACT ATA GAA CTC TGC AAG CC 3'
Es decir, la sonda es cualquier oligonucleótido
que se unirá a la siguiente secuencia:
- 5' GG CTT GCA GAC TTC TAT AGT GCT ATG 3'
El juego de cebadores de Chlamydia B, generó un
amplicón específico de 173 pb utilizando los siguientes
cebadores:
- CP-37 (23-mero, polaridad +, bases 678-700)
- 5' GTC CTG CTT GAG AGA ACG TGC GG 3'
Es decir, el cebador es cualquier
oligonucleótido que se unirá a la siguiente secuencia, o provocará
elongación a través de ella:
- 5' CC GCA CGT TCT CTC AAG CAG GAC 3'
- CP-38 (24-mero, polaridad -, bases 827-850)
- 5' CTC CCA GCT TAA GAA CCG TCA GAC 3'
Es decir, el cebador es cualquier
oligonucleótido que se unirá a la siguiente secuencia, o provocará
elongación a través de ella:
- 5' GTC TGA CGG TTC TTA AGC TGG GAG 3'
El amplicón de 173 pb del juego de cebadores B,
se detectó con la sonda de captura CP-39:
- CP-39 (23-mero, polaridad -, bases 726-748)
- 5' TGT CTT CGT AAC TCG CTC CGG AA 3'
\newpage
Es decir, el cebador es cualquier
oligonucleótido que se unirá a la siguiente secuencia:
- 5' TT CCG GAG CGA GTT ACG AAG ACA 3'
El juego de cebadores B se utilizó para
amplificar el plásmido diana pCHL-1. Utilizando
cebadores 5'-biotinilados, la diana se amplificó con
30 ciclos de PCR, y los productos biotinilados se examinaron
mediante captura por hibridación (Tabla 2). Después de 30 minutos de
aparición del color (TMB/H_{2}O_{2}), fueron detectables tan
solo 20 copias de partida de pCHL-1 (dilución 1:25,
DO_{450} = 0,140), con señal de fondo despreciable (DO_{450} =
0,009 para la dilución 1:25).
| DO_{450} | DO_{450} | |
| 1:25 | 1:100 | |
| 10^{4} copias pCHL-1 | > 1,500 | > 1,500 |
| 10^{3} copias pCHL-1 | > 1,500 | 1,286 |
| 10^{2} copias pCHL-1 | 0,686 | 0,170 |
| 50 copias pCHL-1 | 0,215 | 0,050 |
| 20 copias pCHL-1 | 0,140 | 0,035 |
| Control negativo | ||
| Sin molde | 0,009 | 0,000 |
Ejemplo de referencia
13
Células McCoy, bien no inoculadas o bien
infectadas con C. trachomatis, se sometieron a lisis en 2SP
(tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 7,2, sacarosa 2M), que contenían
100 \mug/ml de proteinasa K, y Tween-20 al 1%, y
se incubaron a 55ºC durante 1 hora, seguido de una incubación a 95ºC
durante diez minutos. Se utilizó el juego de cebadores A (Ejemplo
12) en una amplificación por PCR de 30 ciclos y los productos se
examinaron mediante ensayo en placa, tal y como se describe en el
Ejemplo 8. Después de 10 minutos de aparición del color, ambos
juegos de 10 y 100 células infectadas de McCoy, cuando se añadieron
a 10^{5} células no infectadas de McCoy, proporcionaron valores
de DO_{450} > 2,000 (para ambas diluciones 1/25 y 1/100 de
producto en GuSCN). Las células no infectadas extraídas y
amplificadas solas, (10^{5} células), proporcionaron valores de
DO_{450} < 0,050.
Se extrajeron muestras clínicas, previamente
evaluadas para ver la magnitud de los efectos citopáticos (CPE) [en
un rango de "negativo" (sin CPE) a 4+ (los CPE más
prominentes)], se extrajeron de forma similar y se amplificaron
durante 30 ciclos de PCR utilizando el juego de cebadores A. Los
resultados de este ensayo, se muestran en la tabla 3:
En resumen, aquí se describen nuevas formas de
marcar y detectar los productos amplificados de la PCR. Estos
procedimientos de marcaje y captura, ofrecen varias ventajas sobre
los métodos convencionales de detección:
1. La biotinilización y captura de los productos
de la PCR en placas microtituladas es un ensayo más rápido. El
ensayo en placa en la presente invención, se puede realizar en 2
horas, en comparación con las aproximadamente 6-24
horas para el ensayo OH, y con las 48 horas para la transferencia
Southern e hibridación.
2. El formato de ensayo en placa, es menos
laborioso, y puede automatizar para el análisis de un gran número de
muestras.
3. De una forma distinta a los otros dos
formatos de ensayo examinados, el formato de ensayo en placa no
requiere la preparación, purificación, o manipulación de sondas
radioactivas peligrosas de alta actividad especifica.
4. La captura de productos biotinilados mediante
ensayo en placa proporciona una evaluación objetiva y cuantitativa
de la hibridación; el cálculo de un punto de corte estadístico para
la positividad de muestras: y el cálculo cuantitativo de un valor de
la proporción de "señal respecto a ruido de fondo".
Las realizaciones específicas descritas aquí se
ofrecen solo a modo de ejemplo, y la invención debe limitarse
solamente por medio de las reivindicaciones anexadas.
Se describen aquí las siguientes
realizaciones
La realización 1 es un método para la detección
de una secuencia de ácido nucleico diana marcada y amplificada a
partir de una muestra biológica que comprende la hibridación de
dicha secuencia de ácido nucleico diana con al menos una sonda de
captura de oligonucléotidos, que tiene una secuencia de ácido
nucleico sustancialmente complementaria a dicha secuencia diana,
estando dicha sonda de captura unida a un soporte sólido de
poliestireno, y para la determinación de la presencia del marcaje
asociado con dicha secuencia diana.
La realización 2 es el método de la realización
1 en la que dicho soporte sólido de poliestireno es una placa
microtitulada con una serie de pocillos.
La realización 3 es el método de la realización
1 en la que dicho soporte sólido de poliestireno posee una capacidad
de unión a proteínas aumentada.
La realización 4 es el método de la realización
2 en la que dicha placa microtitulada posee una capacidad de unión a
proteínas aumentada.
La realización 5 es el método de la realización
1 en la que dicha hibridación se logra mediante la utilización de
sondas de captura no solapantes.
La realización 6 es el método de la realización
2 en la que dicha sonda de captura está unida de forma pasiva a los
pocillos de la placa de poliestireno microtitulada.
La realización 7 es el método de la realización
1 en la que dichas sondas de captura están unidas en forma de cola
con homopolímeros de trifosfatos de desoxiribonucleótido.
La realización 8 es el método de la realización
1 en la que dicha secuencia de ácido nucleico diana es DNA o
RNA.
La realización 9 es el método de la realización
1 en que comprende además la desnaturalización por calor del DNA de
doble hebra para formar DNA de hebra única, realizando dicha
desnaturalización antes del paso de hibridación.
La realización 10 es el método de la realización
1 en la que dicha hibridación se lleva a cabo en presencia de
tiocianto de guanidina.
La realización 11 es el método de la realización
1 en la que dicho material de marcaje se selecciona de entre el
grupo que consiste de compuestos radiomarcados, reactivos
luminiscentes, reactivos fluorescentes, reactivos electrodensos,
enzimas termoestables, ligandos, complejos de
anticuerpo-hapteno, y agentes quelantes.
La realización 12 es el método de la realización
1 en la que dicho material de marcaje es biotina.
La realización 13 es el método de la realización
12 en la que dicho marcador de biotina se incorpora o se une a dicha
secuencia diana de ácido nucleico durante la amplificación de dicha
secuencia diana, mediante la reacción en cadena de la
polimerasa.
La realización 14 es el método de la realización
13 en la que dicho marcador de biotina se incorpora a dicha
secuencia diana de ácido nucleico mediante la inclusión de
biotina-11-dUTP, durante la reacción
en cadena de la polimerasa.
La realización 15 es el método de la realización
12 en la que dicha reacción se realiza en presencia de la polimerasa
Taq.
La realización 16 es el método de la realización
14 en la que la biotina no incorporada se elimina mediante lavados
tras la hibridación y antes de realizar la determinación del
marcaje.
La realización 17 es el método de la realización
13 en la que dicho marcaje de biotina, se incorpora en dicha
secuencia diana de ácido nucleico, utilizando cebadores 5'
biotinilados durante la amplificación de la reacción en cadena de la
polimerasa.
La realización 18 es el método de la realización
12 en la que dicha detección con marcaje de biotina, se realiza
mediante la adición de complejo de
avidina-peroxidasa de rábano picante, y la reacción
con agente cromogénico y sustrato para provocar una señal
colorimétrica.
La realización 19 es el método de la realización
12 en la que dicha detección con marcaje de biotina, se realiza
mediante la adición de avidina o estreptavidina complejada con un
miembro del grupo consistente de fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa, luciferasa, fluoresceína y Rojo
Texas.
La realización 20 es el método de la realización
18 en la que dicho paso de lavados se realiza para eliminar la
avidina-peroxidasa de rábano picante no unida, antes
de añadir el agente cromogénico y el sustrato.
La realización 21 es el método de la realización
18 en la que dicho agente cromogénico es
3,3',5,5'-tetrametilbencidina y dicho sustrato es
peróxido de hidrógeno, realizando dicha reacción de tal forma que
provoque la aparición de señal colorimétrica.
La realización 22 es el método de la realización
18 en la que dicho agente cromogénico es o-fenilen
diamina y dicho sustrato es peróxido de hidrógeno, realizando dicha
reacción de tal forma que provoque la aparición de señal
colorimétrica.
La realización 23 es el método de la realización
2 en la que dichos pocillos son desechables y dicha detección
comprende además la determinación de la extensión de la captura por
hibridación mediante el contaje por centelleo de dichos pocillos
desechables.
La realización 24 es el método de la realización
18 en la que la cuantificación de dicha captura por hibridación se
determina mediante mediciones de la densidad óptica de la intensidad
de la señal de color aparecida.
La realización 25 es el método de la realización
19 en la que la cuantificación de dicha captura por hibridación se
determina mediante mediciones de la densidad óptica de la intensidad
de la señal de color aparecida.
La realización 26 es un método de determinación
cuantitativa de una secuencia de ácido nucleico diana en un ensayo
de captura por sonda, comprendiendo dicho método la utilización de
placas microtituladas con una serie de pocillos como soporte para la
unión pasiva de sondas de captura, contactando dichas placas con una
muestra biológica que contiene una secuencia de ácido nucleico diana
que ha sido marcada para generar una señal capaz de ser detectada, y
contar o medir de otra forma cuantitativa las señales así
generadas.
La realización 27 es un ensayo de hibridación de
ácido nucleico, que comprende los pasos de:
(a) proporcionar una muestra biológica que
comprende una secuencia de ácido nucleico;
(b) realizar la reacción en cadena de la
polimerasa en dicha muestra, utilizando cebadores seleccionados para
realizar la amplificación de ácidos nucleicos que tienen dicha
secuencia diana, e incorporando en dicha amplificación un material
marcador capaz de una detección subsiguiente;
(c) proporcionar una sonda de captura de
oligonucleótidos, que tiene una secuencia de ácido nucleico
sustancialmente complementaria a dicha secuencia diana;
(d) unir dicha sonda de captura a los pocillos
de una placa microtitulada de poliestireno;
(e) poner en contacto dicha placa microtitulada,
que contiene dicha sonda de captura unida, con el producto
amplificado del paso (b), en presencia de tiocianato de guanidina;
y
(f) determinar la presencia de dicha secuencia
diana, mediante la detección de dicho marcaje.
La realización 28 es el ensayo de hibridación de
la realización 27 en la que dicha secuencia diana está marcada para
una posterior detección mediante la incorporación de
biotina-11-dUTP por medio de la
polimerasa Taq durante la amplificación por la reacción en cadena de
la polimerasa de las secuencias diana.
La realización 29 es el ensayo de hibridación de
la realización 27 en la que dicha secuencia diana está marcada para
una posterior detección mediante la incorporación de cebadores de
oligonucleótidos 5'-biotinilados durante la
amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa de las
secuencias diana.
La realización 30 es un equipo de diagnóstico
para la detección de una secuencia diana de ácido nucleico,
comprendiendo dicho equipo cebadores de PCR seleccionados para
amplificar ácidos nucleicos con dicha secuencia diana y una placa
microtitulada con una serie de pocillos y que tienen unida a éstos
una sonda de captura de oligonucleótidos que tiene una secuencia de
ácido nucleico sustancialmente complementaria a dicha secuencia
diana.
La realización 31 es el equipo de diagnóstico de
la realización 30 que comprende adicionalmente reactivos para
realizar la amplificación por PCR y la hibridación de dicha sonda de
captura y dicha secuencia diana.
La realización 32 es el equipo de diagnóstico de
la realización 31 que comprende adicionalmente la polimerasa Taq y
dNTP.
La realización 33 es el equipo de diagnóstico de
la realización 32 en la que uno o más de esos dNTP comprende un
agente marcador.
La realización 34 es el equipo de diagnóstico de
la realización 30 en la que al menos uno de dichos cebadores de PCR
está biotinilado a través de un brazo de unión en el extremo 5'.
La realización 35 es el equipo de diagnóstico de
la realización 30 en la que dicha placa microtitulada comprende
poliestireno con una capacidad de unión a proteínas aumentada.
La realización 36 es el equipo de diagnóstico de
la realización 30 que es apropiado para la detección de Chlamydia
trachomatis y en la que dichos cebadores son oligonucleótidos
que se unirán o provocarán la elongación a través de las siguientes
secuencias:
- 5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3'
- y 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'
La realización 37 es el equipo de diagnóstico de
la realización 36 en la que dicha sonda es un oligonucleótido que se
unirá a la siguiente secuencia:
- 5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3'
La realización 38 es el equipo de diagnóstico de
la realización 30 que es apropiado para la detección de Chlamydia
trachomatis y en la que dichos cebadores son oligonucleótidos
que se unirán o provocarán la elongación a través de las siguientes
secuencias:
- 5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3'
- y 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'
La realización 39 es el equipo de diagnóstico de
la realización 38 en la que dicha sonda es un oligonucleótido que se
unirá a la siguiente secuencia:
- 5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3'.
La realización 40 son cebadores para utilizar en
la amplificación por PCR de secuencias de ácido nucleico diana de
Chlamydia trachomatis, dichos cebadores son oligonucleótidos
que se unirán o provocarán la elongación a través de las siguientes
secuencias:
- 5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3'
- y 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'
La realización 41 son sondas útiles en los
ensayos de hibridación de secuencias de DNA amplificadas con los
cebadores de la realización 40, dichos cebadores son
oligonucleótidos que se unirán a través de la siguiente
secuencia:
- 5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3'
La realización 42 son cebadores para utilizar en
la amplificación por PCR de secuencias de ácido nucleico diana de
Chlamydia trachomatis, dichos cebadores son oligonucleótidos
que se unirán o provocarán la elongación a través de las siguientes
secuencias:
- 5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3'
- y 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'
\newpage
La realización 43 son sondas útiles en los
ensayos de hibridación de secuencias de DNA amplificadas con los
cebadores de la realización 42, dichos cebadores son
oligonucleótidos que se unirán a través de la siguiente
secuencia:
- 5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3'.
La realización 44 es un método para detectar
Chlamydia trachomatis mediante amplificación por PCR y ensayo
de hibridación que comprende la utilización de cebadores en dicha
amplificación por PCR, que son oligonucleótidos que se unirán o
provocarán la elongación a través de las siguientes secuencias:
- 5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3'
- y 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'
La realización 45 es el método de la realización
40, en la que dicha amplificación por PCR utiliza además una sonda
de captura y en la que dicha sonda de captura es un oligonucleótido
que se unirá a la siguiente secuencia:
- 5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3'
La realización 46 es un método para detectar
Chlamydia trachomatis mediante amplificación por PCR y ensayo
de hibridación que comprende la utilización de cebadores en dicha
amplificación por PCR, que son oligonucleótidos que se unirán o
provocarán la elongación a través de las siguientes secuencias:
- 5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3'
- y 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'
La realización 47 es el método de la realización
40, en la que dicha amplificación por PCR utiliza además una sonda
de captura y en la que dicha sonda de captura es un oligonucleótido
que se unirá a la siguiente secuencia:
- 5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3'.
La realización 48 es una placa microtitulada con
una serie de pocillos y que es útil para el ensayo de hibridación de
secuencias de ácido nucleico diana amplificadas con cualquier sonda
de captura de oligonucleótido unida a ella, dicha sonda de captura
con una secuencia de ácido nucleico sustancialmente complementaria a
dicha secuencia diana.
La realización 49 es la placa microtitulada de
la realización 48 que está compuesta de poliestireno y presenta una
capacidad de unión a proteínas aumentada.
La realización 50 son cebadores que comprenden
una secuencia seleccionada del grupo que consiste de
- 5' GGGATTCCTGTAACAACAAGTCAGG 3'
- 5' CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC 3'
- 5' GTCCTGCTTGAGAGAACGTGCGG 3'
- y 5' CTCCCAGCTTAAGAACCGTCAGAC 3'
La realización 51 son cebadores que comprenden
una secuencia seleccionada del grupo que consiste de
- 5' CATAGCACTATAGAACTCTGCAAGCC 3'
- y 5' TGTCTTCGTAACTCGCTCCGGAA 3'.
La realización 52 son cebadores de acuerdo con
la realización 51 con un marcaje en el extremo 5'.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
| SOLICITANTE: |
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: F. Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Grenzacher Strasse 124
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4070
\vskip1.000000\baselineskip
| TÍTULO DE LA INVENCIÓN: | MARCAJE DE DNA CON BIOTINA Y DETECCIÓN DEL MISMO |
| MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA | |
| NÚMERO DE SECUENCAS: | 12 |
| FORMATO LEGIBLE POR COMPUTADORA: |
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PADAT Sequenzmodul, Versión 1.0
\vskip1.000000\baselineskip
| DATOS DE SOLICITUD ACTUALES: |
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PE 98.111076.0
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGATTCCTG TAACAACAAG TCAGG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTGACTTGT TGTTACAGGA ATCCC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCTTCCCC AGAACAATAA GAACAC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGTTCTTAT TGTTCTGGGG AAGAGG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATAGCACTA TAGAACTCTG CAAGCC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTTGCAGA GTTCTATAGT GCTATG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCCTGCTTG AGAGAACGTG CGG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCACGTTC TCTCAAGCAG GAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCCCAGCTT AAGAACCGTC AGAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTGACGGT TCTTAAGCTG GGAG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCTTCGTA ACTCGCTCCG GAA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA Genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCCGGAGCG AGTTACGAAG ACA
\hfill23
Claims (14)
1. Un equipo de diagnóstico para la detección de
una secuencia de ácido nucleico diana de Chlamydia
trachomatis, comprendiendo dicho equipo cebadores de PCR en los
que dichos cebadores son oligonucleótidos que se unirán
específicamente o provocarán la elongación a través de las
siguientes secuencias:
- 5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3' y
- 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'
y una placa microtitulada con una serie de
pocillos y que tiene unida a ella una sonda de captura de
oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico sustancialmente
complementaria a dicha secuencia diana.
2. Un equipo de diagnóstico para la detección de
una secuencia de ácido nucleico diana de Chlamydia
trachomatis, comprendiendo dicho equipo cebadores de PCR en los
que dichos cebadores son oligonucleótidos que se unirán
específicamente o provocarán la elongación a través de las
siguientes secuencias:
- 5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3' y
- 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'
y una placa microtitulada con una serie de
pocillos y que tiene unida a ella una sonda de captura de
oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico sustancialmente
complementaria a dicha secuencia diana.
3. El equipo diagnóstico de las reivindicaciones
1 o 2 que comprende además reactivos para realizar las amplificación
por PCR y la hibridación de dicha sonda de captura y dicha secuencia
diana.
4. El equipo diagnóstico de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 que comprende además la polimerasa Taq y
dNTP.
5. El equipo diagnóstico de la reivindicación 4
en el que uno o más de los dNTP comprende un agente de marcaje.
6. El equipo diagnóstico de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en el que al menos uno de dichos cebadores de
PCR está biotinilado a través de una modificación por un brazo de
unión en el extremo 5'.
7. El equipo diagnóstico de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en el que dicha placa microtitulada comprende
poliestireno tratado para aumentar la capacidad de unión a
proteínas.
8. El equipo diagnóstico de cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3 a 6, cuando dependen de la reivindicación 1,
en la que dicha sonda es un oligonucleótido completamente o
sustancialmente complementario a la siguiente secuencia:
- 5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3'
9. El equipo diagnóstico de cualquiera de las
reivindicaciones 2 y 3 a 6, cuando dependen de la reivindicación 2,
en la que dicha sonda es un oligonucleótido completamente o
sustancialmente complementario a la siguiente secuencia:
- 5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3'.
10. Los cebadores para utilizar en la
amplificación por PCR de secuencias de ácido nucleico diana de
Chlamydia trachomatis, dichos cebadores son oligonucleótidos
que se unirán específicamente o provocarán la elongación a través de
las siguientes secuencias:
- 5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3' y
- 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'
- 5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3' y
- 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'
11. Las sondas unidas a una placa microtitulada
útil para los ensayos de hibridación de secuencias de DNA
amplificadas con los cebadores de la reivindicación 10, en la que
dichas sondas son oligonucleótidos completamente o sustancialmente
complementarios a la siguiente secuencia:
- 5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3' o
- 5' TTCCGGAGCGAGTTACGAAGACA 3'.
12. Un método para la detección de Chlamydia
trachomatis mediante amplificación por PCR y ensayo de
hibridación utilizando en dicha amplificación por PCR, cebadores que
son oligonucleótidos que se unirán específicamente o provocarán la
elongación a través de las siguientes secuencias:
- 5' CCTGACTTGTTGTTACAGGAATCCC 3' y
- 5' GTGTTCTTATTGTTCTGGGGAAGAGG 3'
13. El método de la reivindicación 12 en que
dicho ensayo de hibridación utiliza además una sonda de captura y en
la que dicha sonda de captura es un oligonucleótido completamente o
sustancialmente complementario a la siguiente secuencia:
- 5' GGCTTGCAGAGTTCTATAGTGCTATG 3' o
14. Un método para la detección de Chlamydia
trachomatis mediante amplificación por PCR y ensayo de
hibridación utilizando en dicha amplificación por PCR, cebadores que
son oligonucleótidos que se unirán específicamente o provocarán la
elongación a través de las siguientes secuencias:
- 5' CCGCACGTTCTCTCAAGCAGGAC 3' y
- 5' GTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAG 3'
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