JPH07107537B2 - アビジン−及びビオチン−固定試薬，分析要素並びにその使用法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、種々の分析方法で有用である水不溶性試薬に
関する。本発明はまた、これらの試薬を用いる分析要素
及び方法に関する。

〔従来の技術〕

医学実務、研究及び診断方法に於て、生物学的流体中に
低濃度で存在する生物学的物質の迅速で、正確な、定量
分析のために永続的なニーズがある。例えば、血液、
尿、唾液、膣分泌物、精液、及び他の生物学的流体中
の、医薬、麻酔薬、ホルモン、ステロイド、ポリペプチ
ド、プロスタグランジン又は病原菌生物の存在は、適当
な診断及び治療のために正確で迅速な方法で分析しなく
てはならない。

このような分析を提供するために、検出すべき物質とそ
の物質と反応するレセプターとの間の特異的結合反応を
使用して生物学的物質を分離又は同定するために、種々
の方法が提案されてきた。放射線又は酵素標識が、得ら
れた反応性錯体を検出するために使用されてきた。

開発された試験の一つの特別の形式は、抗体反応性のた
めの複数のサイトを有する抗原の検出のために有用であ
る凝集試験（又は検査）である。このような試験に於
て、抗体分子は適当な形式で水不溶性粒子に結合でき
る。複数サイトでの抗体−抗原反応は、粒子を凝集及び
沈澱させる。例えば、トレーサー物質を含有する粒子の
使用を含む、容易に観察できる凝集体を作るために適当
な分離及び検査方法が提案されてきた。

流体中の生物学的物質を検出するための他の有用な方法
は、「サンドウイッチ」アッセイとして当該技術で公知
のものである。このようなアッセイには、異なった及び
干渉しないサイトで対象の化合物と錯体化する２個又は
それ以上のレセプター分子（例えば、抗体）で、対象の
化合物（例えば、抗原）を「サンドウイッチ」すること
が含まれる。多くのサンドウイッチアッセイで、１個又
はそれ以上のレセプター分子が、小粒子、膜、板、試験
ウエル又は同様の物のような不溶性担体上に適当に固定
される。

不溶性担体物質への抗体又は抗原の結合は、これまで多
くの方法で達成されてきた。初期の研究者は分子の吸着
に期待したが、吸着は一般に結合の強い方法ではないこ
とが認識された。後の研究者は、担体物質上の特に設計
された反応性基を有する分子のある種の官能基の反応に
よって、分子が共有結合で結合できることを見出した。
例えば、蛋白質は粒子又は支持体のカルボキシ基を、基
を蛋白質のアミノ基と反応性にする活性化化合物と反応
させることによって結合できる。

アビジンは卵白中にある蛋白質である。ビオチン（ヘキ
サヒドロ−２−オキソ−1H−チエノ〔3,4〕イミダゾー
ル−４−ペンタン酸）もまたビタミンＨとして知られて
おり、比較的小さい水溶性分子である。これらの物質は
互いに特異的に反応して、アビジンの４個の亜単位（su
bunit）のそれぞれがビオチン分子に結合している非常
に強く安定な錯体を形成することが知られている。この
強い結合はビオチン又はアビジン又は両者が他の物質に
共有結合で結合しているときでさえも維持される。この
反応は、赤血球の凝集を強めるために使用され、研究者
に種々の生化学及び診断研究のための方法を提供してき
た。

競合反応は公知であり、その反応では、ビオチンに共役
している抗体は未知の検体及び酵素標識検体の既知量と
競合させられる。抗体−検体錯体の量は、担体物質に結
合したアビジンを添加することによって錯体を不溶化す
ることにより容易に分析される。アビジンは粒子、濾
紙、ガラス又はプラスチック物質のような固体支持体
に、共有結合、例えば、ベンゾキノン活性化セファロー
ズへの共有結合により結合される。

米国特許第4,582,810号には、その表面に遊離カルボキ
シル基を有するラテックス粒子へのアビジンの結合につ
いて記載されている。そこに記載されているようにアビ
ジンを粒子に共有結合させる公知の方法には、活性化工
程で水不溶性カルボジイミドを使用することが含まれ
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

試薬を製造するとき、この公知の方法は、粒子上のカル
ボキシル基と同様に、蛋白質アビジンの露出した反応性
基を活性化する傾向にある。その結果、アビジンの分子
内及び分子間の架橋又は重合が起こり、かくして試薬の
重要な部分はビオチンとの錯体化が損なわれる。更に、
活性化化合物の架橋反応性のために不溶性にされた試薬
の凝集が早すぎる。この問題は、診断感度の低下と同様
に重大な経済的損失を示す。更に、カルボジイミドが、
不安定であり直ちに使用しなくてはならないアビジン結
合のための反応性中間体を提供することも明らかであ
る。

エポキシド、アルデヒド、アミン基及びジアゾニウム塩
のような反応性基を有する粒子で、種々の他の試薬が製
造されている。全てのこれらの基は、欠点を持ってい
る。例えば、エポキシド基は安定でなく、そのために粒
子は非常に長い期間貯蔵できない。アルデヒド基を有す
る粒子は、一般に早期に凝集する傾向がある。アミン基
を有する粒子は、カルボキシル化物質と似て追加の活性
化工程を必要とする。ジアゾニウム化合物は不安定であ
り、それを使うことは望ましくない。

かくして、水不溶性粒子に共有結合で結合したアビジン
又はビオチンからなる試薬は、診断方法に於て非常に有
用である。しかしながら、効率的な方法で、限定されな
い条件、及び感度を低下させないか又は他の望ましくな
い結果を生じない条件下で容易に製造されるような試薬
を持つことが望まれる。早すぎる架橋及び凝集が顕著で
ある結合のために公知のカルボジイミド化学の使用を避
けることが特に望ましい。また、不溶性担体物質に種を
直接結合することなしに免疫種を不溶性にするための試
薬を持つことが望ましい。更に、得られる結合は、単な
る吸着によって得られるものよりも強くなくてはならな
い。

〔課題を解決するための手段〕

上記した課題は、本発明によれば、 ポリマー粒子を含んでなる水不溶性試薬であって、前記
ポリマー粒子の少なくとも外表面上には、１種類もしく
はそれ以上のエチレン系不飽和の重合性モノマーから誘
導されたポリマーが含まれており、前記モノマーの少な
くとも１種類は、活性化２−置換エチルスルホニル基、
反応性ビニルスルホニル基及び活性ハロゲン原子含有基
（以下、「活性ハロゲン原子基」とも記す）からなる群
から選択される１個もしくはそれ以上の反応性基を有し
ており、そして、前記ポリマー粒子は、それらの粒子の
外表面上の前記反応性基を介して、 （１）アビジン、 （２）ビオチン又は （３）アビジンもしくはビオチンの誘導体 に直接的又は間接的に共有結合で結合していることを特
徴とする水不溶性試薬； 上記したような水不溶性試薬を含んでなることを特徴と
する分析要素；そして水性液体中の生物学的対象化合物
を分析するに当って、 A.前記液体を上記したような水不溶性試薬と接触させ、 B.前記試薬と、特定の結合リガンドのためのものであっ
て前記生物学的化合物で錯体化せしめられるかもしくは
錯体化せしめられるであろうレセプター分子との反応生
成物を形成させ、その際、前記アジビン、ビオチン又は
それらの誘導体は前記生物学的化合物と特異的に反応し
たレセプター分子に結合せしめられており、そして C.前記反応生成物の存在の結果として前記生物学的化合
物を分析すること、を特徴とする分析方法； によって解決することができる。

〔実施態様〕

本発明は、検出できる錯体がビオチンのためのアビジン
の高特定結合親和性を使用してそれにより得られる、分
析方法及び要素で使用される試薬を提供する。これらの
方法は分析を迅速に行なうことができ、それによってア
ッセイが医院又は消費者の家庭で即座に結果を得ること
ができる。この試験は生物学的流体のような水性液体中
の生物学的対象物の化合物の存在又は不存在を検出する
ために使用できる。

本明細書に於て、生物学的対象の化合物は、対応する特
定結合レセプター分子と錯体化するための１個又は２個
以上のサイトを有する生物学的又は化学的化合物として
定義される。一つの態様に於て、生物学的対象の化合物
は、そのための対応するレセプターを含有する本発明の
試薬で検出できるアビジン又はビオチンである。例え
ば、流体中のビオチンを検出するために、それに結合し
たアジビンを有する試薬が使用される。

また、生物学的対象の化合物は、ビオチン又はアビジン
ではない対応するレセプター分子と特別に錯体化するリ
ガンドとして定義される。例えば、該化合物は、（１）
免疫生成能の宿主に出会ったときその物質と結合し得る
特異的な抗体を生成する結果になる全ての物質、又は
（２）化合物がその使用に於て抗原−抗体反応に関与す
る、そのようにして生成された抗体である免疫種であ
る。このような態様に於て、アビジン、ビオチン又はア
ビジン若しくはビオチン誘導体は、生物学的化合物と特
異的に反応するレセプター分子に適切に結合している。

本発明で検出できる代表的リガンドには、第一級アミ
ン、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、脂蛋
白質、糖蛋白質、医薬、ハプテン、酵素、ステロイド、
脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、多糖類、糖脂質、ア
ルカロイド、生物（細菌、原生動物、菌類、ウイルス、
リケッチア及び類似物）及びそれらの構成成分、血液成
分、組織及び臓器抗原並びに当業者に公知の他の物質が
含まれる。ある例に於て、リガンドは、医薬、ホルモ
ン、抗生物質又は抗原性質を有する他の化合物に指向す
る抗体である。また、リガンドは（一価もしくは多価又
は多決定子（multideterminant）抗原を含む）抗原物質
である。更に他の態様に於て、他の抗体に対抗する抗体
（即ち、抗−抗体）である。モノクローナル及びポリク
ローナル抗体の両者が使用でき、これらは分子全体又は
その種々の断片であってよい。

本発明の試薬はアビジン、ビオチン又はそれらの誘導体
を特定組成の水不溶性ポリマー粒子に共有結合で結合さ
せることによって製造される。この結合は、粒子の外表
面上の反応性基と直接反応するために利用されるアビジ
ン又はアビジン若しくはビオチン誘導体のアミノ又はス
ルフヒドリル基を介して達成される。「直接」結合は、
アビジン又はアビジン若しくはビオチン誘導体分子が、
粒子の基と直接反応することを意味する。また、この物
質は、変性がアビジン及びビオチンが互いに錯体化する
サイトに悪影響を与えない限り、結合のための反応性サ
イトを与えるために化学的に変性できる。例えば、ビオ
チンはこのような粒子に直接結合できないが、適当な反
応性基（例えば、サクシンイミドオキシカルボニル、マ
レイミドオキシカルボニル又はＮ′−ブロモアセチルヒ
ドラジノカルボニル）を有する適当なビオチン誘導体
は、ビオチン誘導体と反応するアミン基を与えるために
カゼインのような蛋白質で前処理された粒子と結合でき
る。反応性アミン又はスルフヒドリル基を有するビオチ
ン誘導体は粒子に直接結合できる。更に、アビジン、ビ
オチン又はそれらの誘導体は、蛋白質、ペプチド、ポリ
ペプチド、ジアミン又はジメルカプタンである結合成分
を介して「間接的に」結合できる。

本発明の試薬を製造するために使用できるアビジン及び
ビオチン誘導体には、ストレプトアビジン、琥珀酸化ア
ビジン、モノマーアビジン、ビオシチン（即ち、ビオチ
ン−ε−Ｎ−リジン）、ビオシチンヒドラジド、２−イ
ミノビオチンのアミン又はスルフヒドリル誘導体及びビ
オチニル−ε−アミノカプロン酸ヒドラジドが含まれ
る。

ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビ
オチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル、スルホスクシンイミジル−６−
（ビオチンアミド）ヘキサノエート、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドイミノビオチン、ビオチンブロモアセチル
ヒドラジド、ｐ−ヂアゾベンゾイルビオシチン及び３−
（Ｎ−マレイミドプロピオニル））ビオシチンのような
ビオチン誘導体も、蛋白質をポリマー粒子に適当に結合
させた後、このような結合蛋白質に結合できる。

本発明の試薬の製造に於て使用される粒子は、下記にも
っと詳細に記載される１種又はそれ以上のエチレン性不
飽和重合性モノマーから製造される１種又はそれ以上の
ポリマーからなる。少なくとも１種のこのようなモノマ
ーは、粒子の少なくとも表面に所望の反応性基を与え
る。ある態様に於て、粒子は均質である。即ち、全体が
同じポリマーからなる。他の態様に於て、粒子は１種又
はそれ以上のポリマー、例えばコア／シェル粒子又はグ
ラフトコポリマーからなる。

ポリマー粒子は、一般に0.01μｍ以上の粒子サイズを有
する水不溶性ラテックス粒子である。好ましくは、ポリ
マー粒子は0.01〜５μｍの範囲の平均粒子サイズを有す
る。

上記のように、本発明の実施に有用なポリマー粒子は、
活性化２−置換エチルスルホニル、ビニルスルホニル及
び活性ハロゲン原子からなる群から選択される１個又は
それ以上の反応性基を有する少なくとも１種のα，β−
エチレン性不飽和重合性モノマーから誘導される少なく
とも１種のポリマーから成る。

活性ハロゲン原子を有するモノマーには、クロロ酢酸ビ
ニル、ブロモ酢酸ビニル、ハロアルキル化ビニル芳香族
体（例えば、クロロメチルスチレン又はブロモメチルス
チレン）、ハロアルキルアクリル−又はメタクリルエス
テル（例えば、クロロエチルメタクリレート、３−クロ
ロ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート及び３−ク
ロロプロピルアクリレート）並びに当業者に公知の他の
ものが含まれる。１〜３個の炭素原子の活性ハロアルキ
ル基を有するもののようなハロアルキル化ビニル芳香族
体は、活性ハロゲン原子が反応性基として使用されると
きに好ましい。クロロメチルスチレンが最も好ましい。

上記のように、活性ハロゲン原子を有するモノマーは、
公知の物質よりも多くの利点を有する。しかしながら、
活性化２−置換エチルスルホニル及びビニルスルホニル
基を有するモノマーは、蛋白質がより緩和な条件でポリ
マーに結合でき、製造の間プロセス調節の必要性が少な
い場合に、追加の利点を有する。これは製造をより効率
的にし、コストを少なくさせる。必要な側鎖基を有する
多くの代表的なモノマーは、米国特許第4,161,407号及
び同第4,548,870号を含む当該技術分野において公知で
ある。

好ましい活性化２−置換エチルスルホニル及びビニルス
ルホニルモノマーは、式（Ｉ）によって表わされる。

式中、Ｒは水素又はメチル、エチル、イソプロピル若し
くはヘキシルのような置換若しくは非置換アルキル（一
般に１〜６個の炭素原子）である。好ましくは、Ｒは水
素又はメチルである。

R¹は−CH＝CHR²又は−CH₂CH₂X〔式中、Ｘは求核試薬に
よって置換されるか又は塩基（例えば、ハロ、アセトキ
シ、メチルスルホニルオキシのようなアルキルスルホニ
ルオキシ、ｐ−トリルスルホニルオキシのようなアリー
ルスルホニルオキシ、トリアルキルアンモニオ、例えば
トリメチルアンモニオ塩又は、ピリジニオ塩）での処理
によりHXを形成して除かれるリービング基である〕であ
る。R²は、水素、置換又は非置換のアルキル（一般にＲ
について定義したような１〜６個の炭素原子）又は置換
若しくは非置換のアリール（一般に６〜12個の核炭素原
子、例えば、フェニル、ナフチル、キシリル又はトリ
ル）である。好ましくは、R¹は−CH₂CH₂Xである。この
活性化２−置換エチル基である基は、リービング（leav
ing）基Ｘに置換を損なわないあらゆる基で置換し得
る。

Ｌは、主鎖中に一般に１〜20個の炭素原子及びヘテロ原
子を有する置換又は非置換アルキレンである結合基であ
る。アルキレンについてのこの定義は、オキシ、チオ、
−NR³−〔式中、R³は水素、１〜６個の炭素原子の置換
若しくは非置換アルキル（例えば、メチル、クロロメチ
ル若しくは２−ヒドロキシエチル）又は６〜10個の炭素
原子の置換若しくは非置換のアリール（例えば、フェニ
ル、ナフチル又はキシリル）である〕、エステル（−CO
O−）、アミド（−CONH−）、ウリレン スルホニル（−SO₂−）、カーボネート、スルホンアミ
ド、アゾ、ホスホノ又は他の同様な基が、中間に入るか
又は末端に付いたアルキレン基を含むことを意味する。
代表的なアルキレン基には、メチレン、エチレン、イソ
ブチレン、ヘキサメチレン、カルボニルオキシエチレン
オキシカルボニルエチレン、メチレンビス（イミノカル
ボニル）エチレン、カルボニルオキシドデシレンカルボ
ニルオキシエチレン、カルボニルイミノメチレンイミノ
カルボニルイミノエチレン、カルボニルイミノメチレン
イミノカルボニルエチレン及び米国特許第4,161,407号
及び同第4,548,870号に記載又は示唆された他の基が含
まれる。

また、Ｌは一般に６〜12個の核炭素原子を有する置換又
は非置換アリーレンであってもよい。代表的はアリーレ
ン基には、フェニレン、トリレン、ナフチレン及び上記
特許に記載された他のものが含まれる。また、Ｌのこの
定義には、１個又は２個以上のアミド又はエステル基が
中間に入るか末端に付いた組合せ（例えば、カルボニル
イミノアリーレンアルキレン）と同様に、上記定義され
たアルキレン又はアリーレン基のそれぞれの１個又は２
個以上の組合せである二価の基（例えば、アリーレンア
ルキレン、アルキレンアリーレンアルキレン、及び当業
者によって容易に分析できる他のもの）が含まれる。好
ましくは、Ｌは置換若しくは非置換のフェニレンアルキ
レン〔例えば、１個又は２個以上のアルキル基（Ｒにつ
いて定義したもの）、アルコキシ基（一般に１〜６個の
炭素原子で、例えば、メトキシ、プロポキシ又はブトキ
シ）、若しくはハロ基で置換された〕、カルボニルイミ
ノアリーレンアルキレン（アリーレン及びアルキレンは
上記定義したもの）又はカルボニルイミノアルキレンイ
ミノカルボニルアルキレン（アルキレンは上記定義した
もの）である。

代表的有用なモノマーには、ｍ＆ｐ−（２−クロロエチ
ルスルホニルメチル）スチレン、ｍ＆ｐ−〔２−（ｐ−
トリルスルホニルオキシ）エチルスルホニルメチル〕ス
チレン、ｍ＆ｐ−ビニルスルホニルメチルスチレン、Ｎ
−〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フ
ェニル〕アクリルアミド及びＮ−〔２−（２−クロロエ
チルスルホニル）エチルホルムアミドメチル〕アクリル
アミドが含まれる。最初のモノマーが好ましい。

上記１種又はそれ以上のモノマーは、個々に又は組み合
わせて重合して、ホモ−又はコポリマーを形成できる。
また、好ましくは、これらモノマーの１種又はそれ以上
は、少なくとも１個の他のエチレン性不飽和重合性モノ
マーと共重合される。一般的にこのようなモノマーは、
疎水性、分散性及び他の特徴のような種々の望ましい性
質を与える。

好ましいポリマーは、式（II）： −（Ａ）_ｘ−（Ｂ）_ｙ−（Ｄ）_ｚ− （II） で表わされるポリマーである。

式中、−Ａ−は１種又はそれ以上の疎水性のエチレン性
不飽和モノマーから誘導される繰り返し単位を表わす。

−Ｂ−は、上記必要な反応性基を有する１種又はそれ以
上のエチレン性不飽和モノマーから誘導される繰り返し
単位を表わす。

−Ｄ−は、−Ａ−又は−Ｂ−によって示されるもの以外
の１種又はそれ以上のエチレン性不飽和モノマーから誘
導される繰り返し単位を表わす。

式（II）に於て、ｘは０〜99.9モル％、ｙは0.1〜100モ
ル％、そしてｚは０〜20モル％である。好ましくは、ｘ
は45〜99.5モル％、ｙが0.5〜50モル％、そしてｚが０
〜10モル％である。

−Ａ−繰り返し単位が誘導されるモノマーは、一般的及
び好ましい態様の両方に於て、疎水性であり、水に不溶
性であるホモポリマーを形成する。好ましくは、これら
のモノマーは芳香族類である。代表的な疎水性モノマー
には、スチレン及びスチレン誘導体（例えば、４−ビニ
ルトルエン、2,5−ジメチルスチレン、４−ｔ−ブチル
スチレン、２−クロロスチレン及び当該技術分野で公知
の他のもの）、アクリル酸及びメタクリル酸のエステル
及びアミド（例えば、ｎ−ブチルアクリレート、プロピ
ルメタクリレート、メチルアクリレート、メチルメタク
リレート、エチルメタクリレート、２−エチルヘキシル
メタクリレート、Ｎ−フェニルアクリルアミド及び当該
技術分野で公知の他のもの）、アクリロニトリル及び酢
酸ビニルが含まれるが、これらに限定されるものではな
い。

このポリマーは、所望ならば、適当な方法で架橋でき
る。一つの方法は、少量の、即ち、10モル％までの、好
ましくは0.3〜５モル％の、２個又は３個以上のエチレ
ン性不飽和重合性基を有するモノマーを含有させること
である。これらのモノマーは、−Ａ−が誘導される疎水
性モノマーに含まれる。代表的なモノマーは、Research
Disclosure,publication 19551,1980年７月、304頁に
記載されており、例えば、ジビニルベンゼン、エチレン
ジメタクリレート、N,N′−メチレンビスアクリルアミ
ド、2,2−ジメチル−1,3−プロピレンジアクリレート、
アリルアクリレート、エチリジントリメタクリレート及
びエチレンジアクリレートを含む。

−Ａ−繰り返し単位が誘導される好ましいモノマーは、
ビニル芳香族モノマー、特にスチレン及びスチレン誘導
体である。

−Ｂ−繰り返し単位が誘導されるモノマーは、上記反応
性基を有するものである。

−Ｄ−繰り返し単位が誘導されるモノマーには、−Ａ−
及び−Ｂ−が誘導されるものとは異なるモノマーが含ま
れる。特に、−Ｄ−繰り返し単位は、粒子に水分散安定
性又は他の性質を付与するモノマーから誘導される。代
表的なモノマーには、ナトリウム２−アクリルアミド−
２−メチルプロパンスルホネート、アクリル酸、メタク
リル酸、２−カルボキシエチルアクリレート、スチレン
スルホン酸、カリウム塩帯びｍ＆ｐ−カルボキシメチル
スチレン並びに他のエチレン性不飽和重合性スルホネー
ト、カルボキシレート、スルフェート及びホスホネート
のようなアニオン性モノマー、２−ヒドロキシエチルア
クリレート及び２−ヒドロキシエチルメタクリレートの
ような他の親水性であるがノニオン性のモノマー並びに
当業者に公知の他のものが含まれるが、これらに限定さ
れるものではない。

−Ｄ−単位が誘導される好ましいモノマーは、アクリル
酸、メタクリル酸、ナトリウム２−アクリルアミド−２
−メチルプロパンスルホネート、ｍ＆ｐ−カルボキシメ
チルスチレン及びｐ−スチレンスルホン酸、カリウム塩
である。

上記モノマーの代表的ポリマーには下記のものが含まれ
る。ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン）、ポリ（ス
チレン−共−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−共−２−
ヒドロキシエチルアクリレート）（67:30:3モル比）、
ポリ（スチレン−共−ｍ＆ｐ−クロロエチルスルホニル
メチルスチレン）（95.5:4.5モル比）、ポリ｛スチレン
−共−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメ
チル）フェニル〕アクリルアミド｝（99.3:0.7モル
比）、ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−共−メタ
クリル酸）（95:5,98:2及び99.8:0.2モル比）、ポリ
（スチレン−共−ｍ＆ｐ−クロロエチルスルホニルメチ
ルスチレン−共−メタクリル酸）（93.5:4.5:2モル
比）、ポリ｛スチレン−共−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−（２−クロ
ロエチルスルホニルメチル）フェニル〕アクリルアミド
−共−メタクリル酸｝（97.3:0.7:2モル比）、及びポリ
（スチレン−共−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン）（7
0:30モル比）。

上記のように、本発明の実施で有用な粒子は、上記ポリ
マーの１種又はそれらの混合物からなる均質なものであ
る。また、上記ポリマーは、それぞれ外側グラフト又は
グラフトコポリマーのシェル又はコアーシェル粒子であ
ってもよい。

ポリマー粒子は、乳化（回分、半連続及び連続を含む）
並びに懸濁重合技術、グラフト共重合並びにポリマー化
学技術分野に当業者に公知の他の技術を含む適当な重合
技術を使用して製造できる。例えば、米国特許第4,415,
700号及びResearch Disclosuer,publication 15963,（1
977年７月）に記載されたような界面活性剤又は乳化剤
を使用しないで粒子を生成するために使用できるので乳
化重合が好ましい。

本発明の試薬を製造する一般的な方法には、一般的に公
知の反応を使用して、アジビン、ビオチン又はアジビン
若しくはビオチン誘導体を該粒子に共有結合で結合する
ことが含まれる。活性ハロゲン原子、２−置換活性化エ
チルスルホニル及びビニルスルホニル基で、アビジン又
はアジビン誘導体を該粒子に直接接合できる。ビオチン
又はその誘導体は上記のように間接的に結合できる。一
般的に、ポリマー粒子は緩衝水溶液（pHは一般的に７〜
10）中で、且つ0.01〜40重量％（好ましくは0.01〜10重
量％）のポリマー粒子濃度で結合すべき物質と混合す
る。アビジン、ビオチン又はそれらの誘導体の量は、ポ
リマーに対する比が0.1:1000〜1:10、好ましくは1:100
〜1:10である。混合は５〜50℃、好ましくは５〜40℃の
範囲の温度で0.5〜48時間行なう。全ての適当な緩衝剤
が使用できる。代表的準備方法の詳細は、下記実施例１
に示す。

アビジン、ビオチン又はそれらの誘導体の直接的又は間
接的結合の方法の詳細は当該技術分野で公知である。

本発明で使用されるポリマー粒子は、所望によりそれに
付随する検出し得るトレーサー物質を有していてもよ
い。トレーサーは肉眼又は適当な装置及び技術で検出で
きる物質である。トレーサー物質は、粒子の内側又は外
側にあってよい。有用なトレーサーには、ガンマー線を
出すラジオアイソトープ、蛍光化合物又は染料、生物発
光化合物、化学ルミネセンス化合物、電磁スペクトルの
可視又は紫外領域で吸収する染料又は染料形成物のよう
な色原体並びに当業者に公知の他のものが含まれるが、
それらに限定されるものではない。

本発明の試薬は、水性液体中の生物学的化合物の分析
（定性又は定量アッセイ）で使用できる。この分析は、
該化合物の存在又は不存在を単に分析するか、又は該化
合物の量を定量的に分析することによって行なうことが
できる。特に、本発明は動物、人又は植物、好ましくは
人の生物学的体液を測定するために使用できる。このよ
うな体液には、全血液、血漿、血清、リンパ液、胆汁、
尿、脊髄液、精液、涙、膣分泌物、唾液、汗及び便分泌
物並びにその類似物が含まれるが、それらに限定される
ものではない。これはまた、骨筋肉、心臓、腎臓、肺
臓、脳、骨髄、皮膚及び類似物のような人又は動物組織
の体液標本アッセイできる。

本発明は、本発明の試薬の一部である対応する成分と反
応性であるアビジン、ビオチン又はそれらの誘導体を分
析するために使用できる。例えば、試薬は粒子に結合し
たアビジンからなり、分析すべき化合物はアビジンが反
応性であるビオチン又はその誘導体である。

また、生物学的化合物は、１個又はそれ以上のレセプタ
ー分子と錯体化するための１個又はそれ以上のサイトを
有する、抗体又は抗原のようなアビジン又はビオチン以
外のリガンドである。このようなレセプター分子は一般
に免疫的反応性種である。少なくとも１個のレセプター
分子はアビジン又はビオチンと共役している。リガンド
はレセプターと錯体化でき、全錯体は共役アビジン又は
ビオチンと本発明の試薬との反応によって不溶化でき
る。例えば、リガンドは、ストレプトコッカス（Strept
ococcus）Ａ抗原、クラミジル又は淋菌有機体からの抗
原、HTLV抗原又は抗体（例えば、HTLV−Ｉ、又はHTLV−
II）、HIV抗原又は抗体（例えばHIV−Ｉ、又はHIV−I
I）、甲状腺刺激ホルモン、アポ脂蛋白質、ヒト絨毛性
性腺刺激ホルモン、ロイチナイズ化（leutinizing）ホ
ルモン、癌胚抗原、肝炎抗原、ヘルペスビールス並びに
他の生物学的及び化学的化合物である。

本発明の試薬は競合結合免疫アッセイに使用できる。錯
体化した又は錯体化しない標識物質のいずれも分析する
ことができる。所望により、錯体と錯体化しない物質と
の物理的分離が、適当な分離技術を使用してできる。下
記の分析要素を使用して、垂直又は水平分離の何れもが
使用できる。

他の態様に於て、試薬は免疫的アッセイ（immunometric
assay）、例えば、「サンドウイッチ」アッセイとして
公知である方法で使用できる。このよな測定の詳細は、
米国特許第4,486,530号に記載されている。本発明の試
薬は、分析すべきリガンドが２個又はそれ以上のレセプ
ター分子と免疫反応する２個又はそれ以上のエピトピッ
クサイト（epitopic site）を有する分析で有用であ
る。レセプター分子は同じでも異なっていてもよい。レ
セプターは異なったサイトでリガンドと免疫的に反応し
得る。この方法の結果、二つの異なったレセプターとリ
ガンドとの錯体が形成する。少なくとも一つのレセプタ
ーは、ビオチン又はアビジン（好ましくはビオチン）と
共有結合で結合している。対応するアビジン又はビオチ
ン分子は上記粒子と結合している。アビジン及びビオチ
ンが反応するとき錯体は不溶化され、得られる不溶化錯
体は未反応物質から分離できる。粒子は、例えば酵素に
より、検出のために適当な標識化でき、又は１個もしく
はそれ以上ののレセプター分子は適当に標識化できる。
好ましい免疫分析アッセイに於て、両方のレセプターは
一つの抗原に指向する区別できる抗体であり、抗体の一
つは酵素で標識化されている。これらは、同じ又は異な
った抗体、全体又は断片、モノクローナル又はポリクロ
ーナルである。

本発明の方法は、溶液又は乾式測定の何れでも実施でき
る。溶液測定による場合は、試薬が懸濁液で使用される
ことを意味する。乾式測定に於て、試薬は乾式分析要素
に含有される。最も簡単な要素は、吸収性担持物質、例
えば濾紙又は濾紙片のような自己支持性吸収性又は吸水
性物質の薄いシートからなり、これは少なくとも１個の
帯域が本発明の試薬を含有している１個又はそれ以上の
帯域を有している。他の帯域は他の有用な試薬を含有す
るために使用できる。このような要素は、当該技術分野
で、試験片、診断要素、浸漬棒又は診断剤とし公知であ
る。

好ましくは、本発明の乾式分析要素の吸収性担持物質
は、多孔性展開域である。この帯域は、自己支持性（即
ち、その元の状態を維持するために充分堅い物質からな
る）で有り得るが、好ましくは、別の支持体に担持され
る。このような支持体は、適当な寸法安定性であり、好
ましくは非孔性で透明である。

多孔性展開域は、適当な繊維状若しくは非繊維状物質又
はその何れか若しくは両者の混合物から製造できる。有
用な展開域は、例えば、米国特許第4,292,272号、同第
3,992,158号、同第4,258,001号、同第4,430,436号、お
よび特開昭57（1982）−101760号に記載された物質及び
方法を使用して製造できる。

好ましくは、本発明の試薬は、その女性の尿中の存在が
妊娠の早期標識であるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hC
G）のような多価リガンドを検出するために使用され
る。hCGについての測定を下記実施例１に示す。但し、h
CGに関するこの態様は、単なる例示であって、本発明の
範囲をそのように限定する意図でないことはいうまでも
ない。ホルモンを含有すると思われる生物学的試料（一
般に尿）は、患者から集め、本発明の試薬と接触させ
る。もしリガンドが存在すると、リガンドとそのための
１個又はそれ以上のレセプター分子との間の反応生成物
が形成される。レセプター分子の一つは、本発明の試薬
と反応するアビジン又はビオチンの何れかと共役結合で
きる。例えば、試薬は粒子に結合したアビジン分子を有
しており、この分子はhCGのためのレセプター分子（例
えば、抗体）と共役結合しているビオチン分子と反応す
る。リガンドの量は、粒子で固定化されている得られた
反応生成物の存在又は量を測定することによって分析さ
れる。一般にこのような検出は、錯体化した又は錯体化
していない物質中の検出できるトレーサーの量を測定す
ることによって行なわれる。

本発明の方法は、錯体化物質を錯体化していない物質か
ら分離するために濾過膜が使用される使い捨て試験器具
中でも行なうことができる。このような器具は、その中
にリガンドを含む試験試料が本発明の試薬を含む適当な
試薬と反応させるために添加される１個又は２個以上の
ウエルを有する。

以下に、本発明の実施例を示す。

実施例1:試薬の製造 この実施例は、本発明の試薬の製造に於けるポリマーラ
テックスの製造及びアビジンの結合を示す。

ポリマーラテックスの製造 下記に概略した３個の溶液を、脱酸素水を含有する1365
ml容器に80℃で下記速度で連続的に添加した。

溶液1:スチレン（739g）、ｍ＆ｐ−（２−クロロエチル
スルホニルメチル）スチレン（82g）及び１−ドデカン
チオール（8.2g）を2.5g/分で、380分間。

溶液2:過硫酸アンモニウム（19.7g）及び蒸留水（1152
g）を2.14g/分で、380分間。

溶液3:ピロ亜硫酸ナトリウム（9.9g）及び蒸留水（1152
g）を2.27g/分で、380分間。

380分後に、反応を停止し、33.4％（固型分）でラテッ
クス約1218gの収量であった。ラテックスを３日間透析
して、27.3％（固型分）及びpH5を有するラテックスを
生成した。このラテックスを13.5％（固型分）に希釈し
た。核磁気共鳴分析で、スチレンの第２モノマーに対す
るモル比は96:4であることが分かった。得られたラテッ
クス粒子は、透過型電子顕微鏡で測定して平均径が約0.
67μｍであった。

アビジンの共有結合 上記ラテックスの試料（0.75ml）を、硼酸塩緩衝液（50
ミリモル濃度、pH8.5）で20mlに希釈し、ついでアビジ
ン（5mg）を添加した。得られた懸濁液を37℃で18時間
端−端回転（end−over−end rotation）形式で撹拌
し、ついで遠心分離した。上澄みを捨て、粒子を遠心分
離により緩衝鍵で一度洗浄し、硼酸塩緩衝液10ml中に再
懸濁させた。ビオチン結合分析（即ち、トリチウム標識
ビオチンで滴定）の結果、アビジンは粒子（0.3％ビー
ド懸濁液当り７×10^-6モル濃度の結合サイト）に共有結
合で結合し、本発明の試薬を形成していた。

実施例2:大サイズ粒子の製造 ラテックス中のポリマー粒子が約2.5μｍの平均径を有
している他は、実施例１で製造したと同様にして試薬を
製造した。精製したラテックスの試料（15.5％（固型
分）で0.65ml）を、硼酸塩緩衝液（50ミリモル濃度、pH
8.5）で10mlに希釈し、ついでアビジン（1mg）を添加し
た。得られた懸濁液を室温で24時間端−端回転形式で撹
拌した。放射線標識トレーサー分析（¹²⁵Iで標識したア
ビジン）の結果、アビジンの84％が粒子に共有結合で結
合しており、ついでビーズを３回洗浄した。

実施例3:ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの分析での試薬の
使用 この実施例は、hCGを分析するためのアッセイに於ける
本発明の試薬の使用を示す。

試験器具を、下記の方法で尿試料中のhCGを分析するた
めに使用した。この器具は、蛋白質で被覆された市販の
ナイロン膜からなる濾過膜を含む。ビオチンとhCGに指
向するモノクローナル抗体との共役体（３μｇ）を、試
験器具の試料ウエル中に入れた。緩衝液、３−（Ｎ−モ
ルホリノ）プロパンスルホン酸（2mg,pH7.2）を、試料
ウエル中の異なる場所に入れた。

前濾過して不純物を除去し、hCGを約50mI.U./ml含有す
る尿試料を、試料ウエルに添加し、次いでセイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ（10^-9モル濃度溶液40μ）で標識
化したhCGに対する第二モノクローナル抗体を添加し
た。室温で１分間のインキュベーション期間の間に、抗
原（hCG）と２種の抗体との錯体が形成された。

次いで、本発明の免疫反応試薬の試料を、錯体を含有す
るウエルに添加した。この試料は、アビジンが結合した
ポリ〔スチレン−共−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスル
ホニメチル）スチレン〕粒子の0.42％分散液40μを含
んでいた。この添加の後、ウエル内の液体を試験器具の
膜を通して流し出し、次いで、0.1モル濃度の燐酸ナト
リウム（200μ）及びドデシル硫酸ナトリウム（10ミ
リモル濃度）を含有する洗浄溶液を添加した。次いで、
染料供出組成物（40μ）を添加した。この組成物は、
燐酸ナトリウムでpH7に緩衝され少量のメタノールを含
む水溶液中の、２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキ
シフェニル）−4,5−ビス（４−メトキシフェニル）イ
ミダゾールロイコ染料（40μ溶液中に0.005％）、ジ
エチレントリアミンペンタ酢酸（10μモル濃度）キレー
ト化剤、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル
濃度）電子移動剤、過酸化水素（10ミリモル濃度）から
成っていた。反応の２分後に、試料ウエル中の膜上に残
留する錯体中に、検出できる染料が形成された。染料の
量を、通常の装置及びWilliams−Clapper変換器（J.Op
t.Soc.Am.,43,p.595,1953）を使用して、測定した反射
率を透過率（D_T）に変換することによって測定した。測
定した染料の量は、試験した尿試料中にhCGが存在する
ことの指標であった。

実施例4:反応性クロロメチル基を有する粒子を使用する
試薬の製造 平均粒子径2.9μｍを有するポリ（スチレン−共−ｍ＆
ｐ−クロロメチルスチレン）（77.3:22.7モル比）粒子
を、上記実施例１に記載したのと同様の連続エマルジョ
ン重合方法を使用して製造した。得られたラテックスの
試料（0.82ml,12.2％固型分）を、0.05モル濃度の硼酸
塩緩衝液（pH8.5,0.01％チオメルサル（thiomersal）殺
菌剤を含有）20mlで希釈した。アビジン（5mg）を希釈
ラテックスに添加し、得られた懸濁液を37℃で24時間端
−端回転した。それによってアビジンは粒子表面上のク
ロロメチル基を介して粒子に結合した。ビオチン結合容
量は、実施例１に記載した方法により測定して、0.3％
希釈粒子懸濁液当り1.5×10^-6モル濃度のサイトであっ
た。

実施例5:粒子に結合したビオチンを有する試薬の製造及
びhCGのためのアッセイでの使用 この実施例は、ビオチンが水不溶性ポリマー粒子に結合
している本発明の免疫反応性試薬の製造及びhCGのため
のアッセイに於ける該試薬の使用を示す。

試薬の製造 0.01％チオメルサル殺菌剤を含有する硼酸塩緩衝剤の溶
液（50ml、0.05モル濃度、pH8.5）を遠心分離管に入
れ、カゼイン（1mg/ml）の脱イオン蒸留水中の溶液（6m
l）を添加した。この管に蓋をして激しく振盪させ、次
いで、ポリ（スチレン−共−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチ
レン（77.3:22.7モル比）ポリマー粒子（平均粒子径約
2.7μｍ）の水性分散液（12.22％（固型分）、1.23ml）
を添加し、次いで、この管に蓋をして37℃で24時間端−
端回転させた。得られた粒子は、反応性クロロメチル基
を介して外表面に結合したカゼインを有していた。

次いで、カゼイン−粒子試薬を、0.01％チオメルサルを
含有するグリシン緩衝液（0.1モル濃度、pH8.5）で洗浄
し、次いで0.01％チオメルサルを含有するグリシン緩衝
液（0.1モル濃度）中に再懸濁させ、カゼイン−粒子試
薬の分散液（0.3％固型分）を製造した。

上記分散液の試料（100ml）を遠心分離し、重炭酸ナト
リウム溶液（80ml、100ミリモル濃度）で洗浄し、再び
約15,000rpmで５〜６分間遠心分離し、そして重炭酸ナ
トリウム溶液（100ミリモル濃度）に再懸濁させて、100
mlビード懸濁液を製造した。この懸濁液をＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド（10mg）でエステル化したビオチンの
混合物で処理し、約90分間インキュベートした。得られ
た生成物を遠心分離し、ジエチレントリアミノペンタ酢
酸（５マイクロモル濃度）を含有する燐酸ナトリムウ緩
衝液（200ml、50ミリモル濃度、pH7.2）で洗浄し、再び
遠心分離し、燐酸ナトリウム緩衝液（100ml、50ミリモ
ル濃度、pH7.2、0.3％固型分）に再懸濁させた。

hCGのアッセイ 上記のような３ウエル試験器具を、２個のウエル内のナ
イロン微孔性フィルターを蛋白質の溶液（２％固型分）
と接触させることによって前処理した。第３の試験ウエ
ル内の膜はそのように処理しなかった。

hCG（GC−100絨毛性性腺刺激ホルモン）の貯蔵溶液を、
試験溶液として使用するために、燐酸塩緩衝食塩溶液
（50ミリモル濃度燐酸ナトリウム、150ミリモル濃度食
塩、pH7）で5000mI.U.hCG/mlから成るように製造した。

この試験溶液の試料（150μ）を、試験器具の２個の
カゼイン処理試験ウエルのそれぞれに入れ、下記の試薬
を直ちに３個のウエルのそれぞれに入れた。

ａ）1:10に希釈された上記ビオチン化試薬40μ、 ｂ）1:200に希釈されたアビジン−抗hCG共約体40μ。
この共役体は、Chen et al,Clin.Chem.,30（９）,pp.14
46−1451（1984）のチオール／マレイミド法によりチオ
ール化アビジンに結合した、添加された0.01％チオメル
サルを有する、β−hCG（Immunoresearch）に対する精
製モノクローナル抗体から製造された。この溶液は、希
釈の前に280nmで0.072の光学濃度を有するという特徴が
あった。

ｃ）1:250に希釈されとhCGに体するペルオキシダーゼ標
識モノクローナル抗体40μ。この共役体は、本質的に
Chen et al,の上記文献に記載されたセイヨウワサビペ
ルオキシダーゼに抗体を結合させることによって製造し
た。この溶液は、希釈前に抗体0.49mg/mlから成ってい
た。

各試験ウエル中の混合により30秒間インキュベートし、
次いで液体を膜を通して流し出し、各ウエルを燐酸ナト
リウム（100ミリモル濃度）及びドデシル硫酸ナトリウ
ム（10ミリモル濃度）の溶液８滴で洗浄した。次いで各
ウエルに、上記と同様の染料組成物１滴を添加した。

15秒間インキュベーションした後、液体を各試験ウエル
中の膜を通して流し出し、膜上に形成された色に３分後
に観察した。形成された色は、試験溶液中にhCGが存在
することの指標であった。

上記のアッセイを、各試験ウエル内の液体を15分間イン
キュベーションした後流し出し、次いで１又は２分後に
色観察した他は、２回繰り返した。また、第三の測定
で、ビチオン化試薬分散液を希釈しないで使用した。下
記の表はこれらの測定からの結果を示す。これらのデー
タは、hCG試験溶液を含有する試験ウエル内でポジ色が
生ずることを示している。しかしながら、hCGが添加さ
れなかった第三のウエル内では、本質的に色形成がなか
った。

実施例6:ロイチナイズ化ホルモン（LH）を分析するため
の試薬の使用粒子上へのアビジンの固定化 チオメルサル殺菌剤（0.01％）を含有する硼酸塩緩衝剤
の溶液（50ml、0.05モル濃度、pH8.5）をポリプロピレ
ン製遠心分離管に入れ、それに脱イオン蒸留水6mlに溶
解した卵白アビジン（6mg）の溶液（6ml）を添加した。
次いでこの管に蓋をして激しく振盪させ、次いで、ポリ
〔スチレン−共−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニ
ルメチル）スチレン〕（95.5:4.5モル比）ビーズ（平均
径2.54μｍ）の分散液（15.5％固型物）1.35mlを添加
し、24時間端−端回転させた。

共有結合で結合したアビジンを有するポリマービーズ
を、0.01％チオメルサルを含有するグリシン緩衝液（0.
1モル濃度、pH8.5）で洗浄し、次いで、0.01％チオメル
サルを含有するグリシン緩衝液（0.1モル濃度）中で再
懸濁させ、不溶性分離特定結合試薬（0.3％固型物）を
含有する分散液を製造した。

LHのアッセイ 上記のような３個の試験ウエルを有し、各ウエル内にカ
ゼインで前処理した５μｍのメッシュナイロンフィルタ
ーを有する試験器具を、このアッセイで使用した。ま
た、このアッセイでは、上記hCGに対するビオチン化抗
体と同様にして製造したLHに対するビオチン化抗体（燐
酸塩緩衝食塩溶液中0.044mg/ml）、LHに対するセイヨウ
ワサビペルオキシダーゼ標識抗体（0.5％ウシ血清アル
ブミンを含有する燐酸塩緩衝食塩溶液中0.0015mg/ml）
及びビーズ上のアビジンからなる上記試薬（0.9％固型
物に濃縮、pH8.5）を使用した。

この測定でいくつかの尿試料を試験した。

（ａ）18mI.U.LH/mlを含有する女性月経周期の第13日採
取の試料及び （ｂ）64mI.U.LH/mlを含有する女性月経周期の第14日採
取の試料。

これら試料の両方を同じ人から取り、LH含量をDiagnost
ic Products Corporationから入手したLH放射線免疫ア
ッセイキットにより分析した。

尿試料（ａ）（200ml）、ペルオキシダーゼ標識抗体（3
5μ）及びビオチン化抗体（10μ）の混合物を製造
し、室温で２分間インキュベートした。次いで不溶性に
したアビジン試薬（40μ）をこの混合物に添加し、更
に５分間インキュベーションを続けた。次いで混合物を
試験器具の試験ウエルの一つに移し、液体及び未反応物
質を流し出し、濾過膜上にインキュベーションの間に形
成した不溶性化錯体を残した。次いで残留した不溶性生
成物を、0.1％TWEN20界面活性剤（ソルビタンモノラウ
レート非イオン界面活性剤）を含有する燐酸塩緩衝食塩
溶液（125μ）で２回洗浄し、再び濾過し、次いで上
記のような染料供出溶液（50μ,pH7）と接触させた。

尿試料（ｂ）を試験器具の第二試験ウエルを使用して同
様にアッセイした。

両試験ウエル内で、５分間以内に濾過膜上に色が観察さ
れた。第一ウエル内の色は薄いピンク色であり、他方第
二ウエル内の色は明るい赤色であった。

実施例7:ストレプトコッカスＡ抗原のアッセイ この実施例は、体液試料中のストレプトコッカスＡ抗原
を分析するための本発明の試薬の製造及び使用を示す。

試薬は、実施例１に記載したのと同様の方法を使用し
て、アビジンを、ポリ（スチレン−共−ｍ＆ｐ−クロロ
メチルスチレン−共−２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト）（69:30:1モル比）粒子（0.69μｍ平均径）に結合
することによって製造した。また該粒子は、実施例１に
記載したような乳化重合法を使用して製造した。

上記試薬の試料（0.15％固型分）を、ストレプトコッカ
スＡ抗原に対するビオチン化抗体（20％抗体w/w）及び
抽出ストレプトコッカスＡ抗原を含有する体液試料と混
合し、得られた混合物を１時間インキュベートした。そ
の後、抗体が抗原と反応したことを示す凝集反応が生じ
たことが観察され、得られた錯体はアビジンとビオチン
との反応によって不溶性にされた。

〔発明の効果〕

本発明は、種々の分析及び診断方法で非常に有利に使用
できる安定な試薬を提供する。この試薬を製造するため
に使用されるポリマー粒子は、アビジン、ビオチン又は
アビジン若しくはビオチン誘導体と容易に反応する容易
に利用可能である官能性基を有する。有用な官能性基に
は、活性化２−置換エチルスルホニル基、ビニルスルホ
ニル基又は活性ハロゲン原子を含む基が含まれる。アビ
ジン又はアビジン誘導体と上記の基を含む粒子との反応
は、カルボジイミド及び追加の活性化工程のような活性
化剤の必要なしに行なうことができる。そのために、カ
ルボキシ基の活性化に伴う問題（即ち、早すぎる架橋及
び凝集）が一般に避けられる。

更に、粒子が反応性ビニルスルホニル及び活性化２−置
換エチルスルホニル基を有する本発明の好ましい試薬
は、それらを温和なpH条件及び低温度で反応させる際に
更に利点を示す。このため、結合の条件は苛酷ではな
く、より低い温度、より短い反応時間及び柔軟な混合条
件が、感度を犠牲にすることなく使用できる。また、本
発明の試薬は免疫化合物又は他の特異的結合化合物を不
溶性担体物質に強く結合するために使用できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブレント アーサー バーディック アメリカ合衆国，ニューヨーク 14624, ロチェスター，フリントロック サークル 30 (72)発明者 ハロルド チェスター ワーレン，ザ サ ード アメリカ合衆国，ニューヨーク 14543, ラッシュ，ストウニーブロック ロード 390 (72)発明者 ブライアン アンソニー シュナイダー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14616, ロチェスター，オークウッド ロード 263 (72)発明者 グレゴリー ジョセフ マククルーン アメリカ合衆国，ミシガン 49002，ポー テイジ，マンスフィールド アベニュ 2162 (72)発明者 アニー リォウ ウ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14526, ペンフィールド，ヒドン メドウ ドライ ブ ８

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ポリマー粒子を含んでなる水不溶性試薬で
   あって、前記ポリマー粒子の少なくとも外表面上には、
   １種類もしくはそれ以上のエチレン系不飽和の重合性モ
   ノマーから誘導されたポリマーが含まれており、前記モ
   ノマーの少なくとも１種類は、活性化２−置換エチルス
   ルホニル基、反応性ビニルスルホニル基及び活性ハロゲ
   ン原子含有基からなる群から選択される１個もしくはそ
   れ以上の反応性基を有しており、そして、前記ポリマー
   粒子は、それらの粒子の外表面上の前記反応性基を介し
   て、 （１）アビジン、 （２）ビオチン又は （３）アビジンもしくはビオチンの誘導体 に直接的又は間接的に共有結合で結合していることを特
   徴とする水不溶性試薬。
2. 【請求項２】請求項１記載の水不溶性試薬を含んでなる
   ことを特徴とする分析要素。
3. 【請求項３】水性液体中の生物学的対象化合物を分析す
   るに当って、 A.前記液体を請求項１に記載の水不溶性試薬と接触さ
   せ、 B.前記試薬と、特定の結合リガンドのためのものであっ
   て前記生物学的化合物で錯体化せしめられるかもしくは
   錯体化せしめられるであろうレセプター分子との反応生
   成物を形成させ、その際、前記アジビン、ビオチン又は
   それらの誘導体は前記生物学的化合物と特異的に反応し
   たレセプター分子に結合せしめられており、そして C.前記反応生成物の存在の結果として前記生物学的化合
   物を分析すること、を特徴とする分析方法。