ES2275563T3 - Inmovilizacion de proteinas mediante el uso de un segmento polipeptidico. - Google Patents
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Abstract
Material comprendiendo una proteína acoplada de manera covalente a una superficie sólida a través de al menos un segmento polipéptido que tiene uno o más sitios para un enlace covalente, donde el segmento polipéptido consiste en una secuencia de fórmula (XY)nZ(XY)m, donde: a) Z es una secuencia peptídica capaz de formar un bucle de inversión; b) n y m son el mismo o diferente y representan un número entero de 2 a 15; c) X e Y son residuos aminoácidos con una carga opuesta; y uno o más pares de residuos aminoácidos de carga opuesta X e Y, separados por Z, son capaces de alinearse los unos con respecto a los otros en una estructura plegada de tal modo que el segmento polipéptido (XY)nZ(XY)m adopte una conformación estructural en forma de horquilla beta.
Description
Inmovilización de proteínas mediante el uso de
un segmento polipeptídico.
La presente invención se refiere en general a la
inmovilización de proteínas en superficies sólidas. Más
particularmente, la invención se refiere a la preparación y uso de
materiales, especialmente materiales immunoactivos, comprendiendo
una proteína inmovilizada sobre una superficie sólida mediante un
segmento polipéptido comprendiendo uno o más sitios para un enlace
covalente, dicho segmento siendo capaz de adoptar una estructura
plegada.
Los procesos dirigidos a la inmovilización de
proteínas sobre una superficie sólida tienen un interés comercial
importante. La funcionalización de superficies con materiales
inmunológicos, tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpo,
por ejemplo, forma la base de técnicas de inmunoabsorción tales
como los procesos de purificación de la inmunoafinidad que son
aplicados esencialmente en la recuperación o purificación de una
gama de materiales comercialmente importantes.
Comúnmente, la unión de proteínas a superficies
sólidas, como los medios cromatográficos, ha sido realizada
mediante la exposición de la superficie a una solución de la
proteína para que la proteína sea adsorbida sobre la superficie
sólida mediante unos mecanismos de enlace no específico.
La adsorción sobre la superficie sólida es
asociada generalmente a una ruptura conformacional importante con
un despliegue parcial y una desnaturalización de la proteína
concernida. La pérdida concomitante de la actividad de la proteína
desvaloriza la utilidad global del proceso. Comúnmente, por
ejemplo, la adsorción de anticuerpos sobre una superficie
hidrofóbica es asociada a la pérdida de más del 95% de la actividad
de enlace específico. Si los fragmentos de anticuerpo más pequeños
son implicados, la cantidad de afinidad de enlace específico
retenida con respecto a la adsorción sobre una superficie sólida
puede ser incluso inferior tal y como se ha descrito en
Molina-Bolivar et al, J. Biomaterials
Science-Polymer Edition, 9,
1103-1113, 1998).
Se han considerado alternativas o mejoras para
el método de adsorción de proteínas en la preparación de
superficies proteicas inmovilizadas.
Un procedimiento alternativo consiste en usar un
enlace reticulado químico de residuos en la proteína para el enlace
covalente a una superficie sólida activada mediante el uso de
productos químicos de acoplamiento convencionales por ejemplo tal y
como está descrito en Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, ed.
Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA. Los residuos de
aminoácidos que incorporan grupos sulfidrilo, como la cisteína,
pueden ser ligados de manera covalente mediante el uso de un
reactivo biespecífico como por ejemplo el
succinimidil-maleimidofenilbutirato (SMPB).
Alternativamente, los grupos lisina localizados en la superficie de
la proteína pueden ser acoplados a grupos carboxilo activados en la
superficie sólida por acoplamiento de carbodiimida convencional
mediante el uso de
1,etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida
(EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS). Una desventaja
de este procedimiento es que los residuos de reticulación en la
proteína puede interferir en la funcionalidad de la
proteína.
proteína.
Suministrando a la proteína con una extensión de
cola peptídica comprendiendo residuos reticulables, el acoplamiento
de la proteína en la superficie puede ser realizado usando agentes
de reticulación químicos convencionales en un sitio alejado del
cuerpo principal de la proteína. De esta manera, el propio proceso
de acoplamiento covalente tiene menos posibilidad de interferir en
la funcionalidad de la proteína.
EP 0434317 (Joseph Crosfield & Sons) expone
el uso de medios de purificación de afinidad mejorada que emplean
agentes pequeños de enlace específico, especialmente fragmentos de
anticuerpos Fv. Opcionalmente éstos tienen una cola hidrofóbica,
siendo el residuo "Myc" de la secuencia de aminoácidos el
grupo de enlace particularmente preferido. Aunque este tipo de
grupo es destinado principalmente a facilitar la inmovilización del
agente aglutinante mediante un enlace no covalente sobre una
superficie hidrofóbica, se menciona de pasada en la especificación
que, debido al hecho de que el grupo myc contiene un residuo de
lisina, también podría ser usado para un enlace covalente sobre
superficies.
WO 91/08482 expone que pequeñas moléculas de
enlace específico, como los anticuerpos de dominio variable único
(Dabs) y fragmentos Fv, pueden unirse a superficies sólidas
plásticas o a trazadores como las enzimas mediante enlaces que
incluyan polipéptidos comprendiendo de 5 a 20 aminoácidos y que son
hidrofóbicos y/o contienen al menos un residuo de lisina.
US-4894443 describe polipéptidos
de fórmula general (F-(Pro)n)mF, donde F representa
una secuencia de aminoácidos flexible donde cada aminoácido es
seleccionado individualmente del grupo compuesto por serina,
glicina, y treonina, y n es un número entero de 4-8
inclusive y m es un número entero de 1-4 inclusive.
Los polipéptidos son aquellos usados en la construcción de
conjugados entre anticuerpos y toxinas peptídicas.
Se han usado colas péptidicas alternativas que
incorporan residuos de histidina para unir proteínas a superficies
de ácido nitrilotriacético (NTA, fabricado por QIAGEN GmbH) a
través de la coordinación de níquel. No obstante, este tipo de
interacciones son no covalentes.
Sigue habiendo una continua demanda de mejorar
la eficacia de la reacción de acoplamiento, y en particular el
hecho de solucionar los problemas que surgen de la necesidad de
asegurar que la proteína es llevada a asociarse con la superficie
antes de una reacción de acoplamiento covalente. En caso de
acoplamiento de una proteína a una superficie cargada negativamente,
como una superficie de dextrano activado con carboximetilo, por
ejemplo, la reacción de acoplamiento debe ser realizada con un pH
bajo para asegurarse de que la proteína sea cargada positivamente
para que se produzca este tipo de asociación. Como muchas proteínas
son sensibles al ácido, estas condiciones pueden perjudicar la
actividad específica de la proteína reticulada. No sólo puede ser
ventajoso aumentar la cantidad de proteína acoplada a la superficie
sino también aumentar la proporción de la proteína acoplada que
retenga su actividad específica mediante una minimización de la
posibilidad de interacciones de conexiones no específicas obtenidas
a partir del despliegue proteico según las condiciones de
acoplamiento.
En un aspecto, la invención provee un material
como se define en la reivindicación I anexa.
En otro aspecto, la invención provee un método
como se define en la reivindicación II anexa.
También se provee el uso de un material de la
invención, como se define en la reivindicación 8 anexa.
La presente invención puede ser mejor entendida
en referencia a la descripción siguiente, leída junto con los
dibujos anexos.
La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
de tres pares de oligonucleótidos en superposición complementarios
usados para el ensamblaje de anticuerpos VHH con colas peptídicas.
La traslación de la secuencia péptidica está indicada más
abajo.
La figura 2(a) muestra un diagrama que
muestra un casete comprendiendo una secuencia de codificación VHH
anti-hCG que está insertada en pUC19 para producir
un vector intermedio (Vector A). Este vector contiene un sitio
Xho I cerca de la extremidad 3' de la secuencia de ADN de
codificación de VHH, usada para ligar los oligonucleótidos
sometidos a hibridación de codificación de las secuencias de cola
al VHH, y un sitio Mun I para ligar los oligonucleótidos sometidos
a hibridación al eje central del vector.
La figura 2(b) muestra un diagrama que
muestra un casete que comprende la secuencia de codificación de VHH
que está insertada en pUC19 para producir la construcción
intermedia (Vector B). Este casete de vector intermedio contiene un
sitio Xho1 I en la extremidad 5' de la secuencia de ADN de
codificación de VHH, que está en el marco de lectura correcto para
una clonación en el vector de expresión Pichia Pastoris
pIC9.
La figura 3 muestra de forma esquemática el
casete del vector intermedio obtenido por ligadura de las
secuencias de cola a la extremidad 3' de la secuencia de
codificación de VHH en el Vector A.
La figura 4 muestra de forma esquemática la
estructura de los casetes comprendiendo las secuencias de
codificación de la cola de VHH ensambladas que son insertadas en el
vector pPIC9 para producir las construcciones usadas para una
expresión en Pichia Pastoris.
La figura 5 muestra una representación
esquemática de la estructura en horquilla de la cola EKP
propuesta.
La figura 6 muestra la dependencia del pH de la
cantidad proteica de la cola de VHH en asociación con una
superficie carboximetilada detectada mediante una resonancia
plasmónica de superficie.
La invención se basa en el descubrimiento de que
la eficiencia de acoplamiento covalente de una proteína a un
superficie sólida puede ser mejorada mediante el suministro a la
proteína de un segmento polipéptido que tenga uno o más sitios para
un enlace covalente que sea capaz de adoptar una estructura plegada
separada de la estructura plegada del resto de la proteína.
Por "plegada" se indica una estructura
tridimensional bien definida que es mantenida unida por fuerzas no
covalentes.
Sin desear estar vinculados por la teoría, se
considera que al incorporar en la proteína un segmento polipéptido
con uno o más sitios para un enlace covalente en una estructura
ordenada localmente y separada de la estructura plegada de la
proteína, se facilita la presentación de sitios de acoplamiento
covalentes en el segmento para grupos reticulables adecuados sobre
la superficie sólida en una orientación apropiada para que el
acoplamiento se realice. Esto conduce a una mayor probabilidad de
acoplamiento proteico a una superficie, lo cual ocurre a través del
segmento polipéptido ordenado localmente que no está implicado en
la unión proteica, y por lo tanto a una mayor eficacia de
acoplamiento.
Al mejorar la asociación intrínseca (o
"preconcentración") de proteína con la superficie antes de que
el acoplamiento se realice, de manera ventajosa la invención ofrece
la posibilidad de realizar la reacción de acoplamiento covalente en
condiciones menos susceptibles de causar cualquier daño
irreversible con respecto a la funcionalidad de la proteína obtenida
a partir de la desnaturalización. De esta manera, las interacciones
de unión no específicas pueden ser minimizadas ya que el despliegue
de proteína se reduce de manera que aumente la proporción de
proteína acoplada reteniendo su actividad, reduciendo la cantidad
de material necesario para producir una superficie activa.
Como se muestra en los ejemplos más abajo,
mediante la invención es posible aumentar el pH con el que se
produce el acoplamiento de una proteína a una superficie cargada
negativamente, reduciendo así la probabilidad de que la función
proteica sea influida de manera inversa por las condiciones de
acoplamiento utilizadas y aumentando así la eficacia del
acoplamiento. Esto representa una ventaja importante para el método
de la invención con respecto a los métodos de acoplamiento de
proteínas a superficies sólidas mediadas por colas que no pueden
adoptar una estructura plegada estable, como la cola myc.
La invención es aplicable a las proteínas en
general y no se limita a ningún agrupamiento particular. Algunos
ejemplos de proteínas adecuadas incluyen anticuerpos o fragmentos
inmunológicamente activos de éstos, receptores o fragmentos de
conexión de éstos, lectinas y enzimas.
Se apreciará el hecho de que una superficie
sólida puede tener más de una proteína diferente inmovilizada sobre
ésta de acuerdo con la presente invención. Estas puede ser
distribuidas también sobre la superficie o inmovilizadas en una o
más regiones diferentes.
Según una forma de realización importante de la
invención, los anticuerpos o fragmentos immunológicamente activos
de éstos pueden ser inmovilizados en una superficie sólida para
preparar materiales inmunoactivos mejorados usados en
procedimientos de reconocimiento inmunológico tales como técnicas
de inmunoafinidad.
De forma adecuada, el anticuerpo es una
inmunoglobulina que puede provenir de fuentes naturales, o ser
producida sintéticamente. Los términos "anticuerpo" e
"inmunoglobulina" son usados como sinónimos a lo largo de la
especificación a menos que se indique lo contrario. Un fragmento de
anticuerpo immunológicamente activo es una parte de anticuerpo
entero que conserva la capacidad de exhibir una actividad de enlace
de antígenos. El sitio de enlace de antígenos puede ser formado a
través de la asociación de dominios variables de cadena pesada y
ligera de un anticuerpo y o puede comprender dominios variables de
anticuerpos individuales. Los fragmentos adecuados incluyen un
fragmento Fab, conteniendo ambos sitios de enlace de un anticuerpo
conectados juntos, un fragmento Fv (que comprende los dominios
variables de cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo asociados los
unos con los otros) o una única cadena de fragmento Fv (donde las
dos cadenas pesadas y ligeras están presentes como parte de una
proteína de
fusión).
fusión).
Según una forma de realización particular de la
invención, la proteína es una inmunoglobulina naturalmente
desprovista de cadenas ligeras (indicada a continuación como
inmunoglobulina de cadena pesada), incluso más particularmente un
dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina
naturalmente desprovista de cadenas ligeras puede ser obtenida a
partir de Camélidos tal y como está descrito en WO 94/04678
(Casterman et al), o una proteína funcionalmente equivalente
a ésta. Una ventaja del uso de inmunoglobulinas o dominios
variables de cadena pesada de Camélidos es que pueden ser
producidos a gran escala fácil y convenientemente desde un punto de
vista económico, por ejemplo, mediante el uso de un huésped
eucariótico inferior transformado como se describe en WO
94/25591.
Con una inmunoglobulina de cadena pesada, la
capacidad y especificidad de enlace de antígenos se localiza
natural y exclusivamente en las cadenas pesadas de inmunoglobulina,
más específicamente en los dominios variables de cadena pesada. Lo
que significa que el dominio variable de cadena pesada forma el
sitio de enlace de antígeno completo. Por funcionalmente
equivalente se entiende cualquier proteína o fragmento o derivado
de éstos que tenga propiedades aglutinantes de antígeno iguales o
similares localizadas en un único dominio de unión. Se apreciará el
hecho de que las inmunoglobulinas o fragmentos o derivados de éstos
modificados para que puedan funcionar en forma de dominios de
conexión de la misma manera que las inmunoglobulinas de cadena
pesada de Camélidos (ver Davies et al, Bio Technology. 13,
475-479, (1995)), pueden de manera adecuada también
ser utilizados según la invención.
El segmento polipéptido según la invención puede
ser introducido por mutación o inserción en la secuencia de
proteína o preferiblemente puede ser añadida en forma de cola a
cada, o a los dos terminales proteicos N- o C-.
El segmento polipéptido y la proteína a la que
está ligado pueden ser producidos de manera adecuada juntos
mediante una expresión en forma de una única proteína fundida en un
organismo modificado genéticamente de manera que la proteína y el
segmento sean enlazados a través de una(s)
conexión(es) péptidica(s). De forma alternativa, la
proteína y segmento pueden ser producidos separadamente y unidos
mediante una conjugación química, en tal caso, en general la
conexión entre el segmento y la proteína no será una conexión
péptidica y el segmento tampoco estará necesariamente ligado a una
extremidad de la proteína.
El segmento polipéptido según la invención
comprende 3 a 30 residuos aminoácidos, preferiblemente 5 a 20
residuos aminoácidos.
El segmento polipéptido contiene al menos uno,
más preferiblemente una pluralidad de residuos reticulables para un
enlace covalente a una superficie sólida. Se apreciará el hecho de
que el número de estos residuos reticulables sólo es limitado por
el requisito de que la secuencia debe permanecer capaz de formar
una estructura plegada. De manera adecuada, el segmento polipéptido
comprende 2 a 15 residuos reticulables para un enlace covalente.
Los residuos reactivos reticulables adecuados incluyen residuos de
cisteína y/o lisina. Mediante el suministro del segmento polipéptido
con una pluralidad de tales residuos, la probabilidad de
acoplamiento realizado a través de este segmento aumenta. Esto
tiene como efecto el aumento de eficacia del acoplamiento, y la
minimización del acoplamiento a través de los residuos en otro
lugar sobre la proteína, lo cual puede perjudicar la actividad de la
proteína reticulada.
Los expertos en la técnica deducirán fácilmente
las características de la secuencia que pueden de manera adecuada
ser incorporadas en el segmento polipéptido para proporcionar la
propensión necesaria para formar una estructura plegada según los
objetivos de la invención.
Se apreciará el hecho de que no es necesario
para la operación de la invención que la totalidad del segmento
polipéptido forme una estructura plegada, a condición de que al
menos una parte de ésta, más particularmente una parte
comprendiendo residuos reticulables puedan formar una estructura
plegada local. De manera adecuada, el segmento polipéptido contiene
una cola o terminal de separación además de la parte que forma la
estructura plegada de manera que la estructura plegada localmente
sea mantenida separada de la estructura plegada de la proteína en
la que es introducida.
Las características de secuencia promueven la
formación de conformación helicoidal o en forma de bucle. La
presencia de una estructura plegada puede ser detectada
convenientemente usando técnicas convencionales como una
espectroscopia nuclear magnética razonable.
En una forma de realización, el segmento
polipéptido para usar según la invención comprende preferiblemente
uno o más residuos de prolina.
Sin desear estar vinculados por la teoría, en
general se piensa que la incorporación de un residuo de prolina en
la secuencia aminoácida del segmento polipéptido ayuda a la
formación de una configuración estructural en forma de bucle beta,
con el eje central peptídico cambiando de dirección alrededor del
residuo de prolina.
El segmento polipéptido comprende al menos uno,
preferiblemente una pluralidad de pares de residuos aminoácidos de
carga opuesta capaces de alinearse el uno contra el otro en una
estructura plegada.
Mediante la incorporación de aminoácidos de
carga opuesta en la secuencia del segmento polipéptido en una
distribución tal, que la formación de una estructura plegada
posicione estos últimos en una configuración electroestática
favorable, se puede mejorar la estabilidad de la estructura
plegada. El segmento comprende dos o más regiones de residuos
aminoácidos de carga opuesta alternos entre sí. Preferiblemente,
las regiones de residuos aminoácidos alternos de carga opuesta son
separadas por una secuencia que favorece la formación de un bucle
inverso compatible con un par de cargas opuestas, especialmente por
una secuencia comprendiendo uno o más residuos de prolina.
Los segmentos polipéptidos para usar según la
invención comprenden una secuencia aminoácida de fórmula:
(XY)_{n}
Z(XY)_{m}
donde X e Y son aminoácidos de
carga opuesta, n y m son iguales o diferentes y representan un
número entero de 2 a 15, y Z es una región de secuencia péptida
capaz de formar un bucle comprendiendo una conformación helicoidal
\alpha o de bucle
\beta.
Los segmentos polipéptidos particularmente
preferidos comprenden una secuencia aminoácida seleccionada de:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ EHHHHHHRSEKEKKPKEKEK \+ (SEC. ID. No. 1)\cr \+\+\cr \+
EHHHHHHRSGKGKKPKGKGK \+ (SEC. ID. No.
2)\cr}
indicada a continuación como los
segmentos EKP y GKP
respectivamente.
Se apreciará el hecho de que la parte de las
secuencias comprendiendo los aminoácidos EHHHHHHRS corresponde a un
terminal poli-His; su presencia no es esencial para
la invención y esta parte de secuencia puede ser sustituida por
otro terminal convencional o ser eliminada.
Como se muestra en la figura 5, el segmento que
posee una secuencia aminoácida tal como se expone en la SEC. ID.
No. 1 anterior (indicada a continuación como el segmento EKP) está
previsto para adoptar una configuración estructural en forma de
horquilla, donde el bucle en el eje central peptídico facilitado
por la presencia del residuo de prolina en la secuencia es
estabilizado por la interacción electroestática de los pares de
residuos aminoácidos de carga opuesta. Este segmento, especialmente
cuando es añadido en forma de cola en una o ambas extremidades de
la proteína, representa una forma de realización particularmente
preferida de la invención.
Como se muestra en los ejemplos más abajo, el
suministro de una proteína con una cola polipéptidica capaz de
adoptar una estructura plegada no sólo permite acoplar más
proteínas a una superficie sólida sino que este acoplamiento puede
ser efectuado en condiciones que tengan menos posibilidades de
producir una desnaturalización de la proteína y por lo tanto menos
probabilidades de afectar adversamente la funcionalidad de la
proteína, llevando a una mayor eficacia de acoplamiento.
Los experimentos para estudiar el acoplamiento o
las proteínas provistas o bien con las colas EKP o GKP según el
modo descrito anteriormente o con una cola de control sin
características de secuencia de introducción de características
estructurales (con la secuencia aminoácida EHHHHHHRSGKGKKGKGKGK,
indicada a continuación como una cola GKG) a una superficie de
dextrano activado con carboximetilo han revelado que, de forma
demostrable, se pueden acoplar más proteínas a la superficie sólida
cuando se emplea una cola estructurada, el orden de aumento en
cantidad refleja una organización estructural en aumento de la cola
(GKG < GKP < EKP). Además, usando la cola EKP para acoplar un
fragmento VHH anti-hCG a una superficie de dextrano
de carboximetilo, se ha demostrado que es posible obtener un
rendimiento aceptable de proteína inmovilizada, mientras se aumenta
la proporción que mantiene su funcionalidad, mediante la reacción de
acoplamiento en condiciones menos
acídicas.
acídicas.
La superficie sólida en la que la proteína es
inmovilizada según la invención puede ser proporcionada por una
variedad de materiales. De manera adecuada, la superficie sólida es
cualquier material portador de fase sólida usado de forma
convencional en proteínas de inmovilización. Los ejemplos incluyen
poliestireno u otro plástico tal como el polipropileno o cloruro de
polivinilo, celulosas, dextranos, polímeros y copolímeros
sintéticos, látex, sílices, tejidos, metales como oro, plata y
platino, carbono, vidrio. De manera adecuada, estos materiales
pueden ser partículas, como perlas poliméricas o gránulos para
columnas, o presentarse en forma de lámina, por ejemplo membranas o
filtros, portaobjetos de vidrio o plástico, placas de ensayo de
microtitulación, varillas, dispositivos de relleno capilar o
similares. De manera alternativa, la superficie sólida puede
comprender parte de un biosensor dependiente de masa tal como un
sensor de tipo onda evanescente, por ejemplo un detector de
resonancia plasmónica superficial como el que se puede obtener en
Biacore AB, Stevenage, Reino Unido.
Se apreciará el hecho de que se debe poder
acoplar de manera covalente una superficie sólida al segmento
polipéptido según el uso de la invención. La superficie sólida
puede comprender residuos reticulables naturalmente adecuados para
un enlace covalente al segmento o pueden ser revestidos o
derivatizados para introducir grupos reticulables adecuados según
los métodos bien conocidos en la técnica.
Los materiales preparados según la invención
pueden ser usados en cualquier proceso en los que sea útil enlazar
una molécula a una proteína inmovilizada. Las aplicaciones
adecuadas resultarán evidentes al experto en la materia; éstas
pueden incluir probar la presencia de un asociado por enlace, por
ejemplo, usando una pluralidad de proteínas ligadas a una superficie
sólida según la presente invención en una estructura proteínica, o
en un ensayo o purificación de una muestra de prueba. Si la
proteína es un anticuerpo o un fragmento de éste inmunológicamente
activo, los materiales inmovilizados pueden ser utilizados en
procesos de inmunoabsorción como los inmunoensayos, por ejemplo un
procedimiento de inmunoensayo específico enlazado por enzima
(ELISA), o procesos de purificación de inmunoafinidad mediante la
puesta en contacto de un material según la invención con una
muestra de prueba según los métodos estándares convencionales en la
técnica.
Se apreciará el hecho de que la invención puede
ser aplicada a otras proteínas que no sean las derivadas de
anticuerpos y similares. Por ejemplo, algunas enzimas pueden ser
acopladas a superficies usadas en la clarificación de zumos. Otras
aplicaciones de proteínas inmovilizadas que pueden ser aplicadas
son descritas en Protein Immobilisation, pp. 2-9,
R.F. Taylor ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1991.
De manera conveniente, la invención puede ser
empleada en kits de prueba diagnóstica.
Los ejemplos siguientes son provistos únicamente
como ilustración. Las técnicas usadas para la manipulación y
análisis de materiales de ácido nucleico fueron realizadas tal y
como se describe en Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor Press, New York, 2nd Ed., (1989), a menos que se
indique lo contrario.
VHH define un dominio variable de cadena pesada
de una inmunoglobulina de cadena pesada.
Se sometieron a hibridación oligonucleótidos de
superposición complementarios (figura 1) y se usaron para añadir
ADN codificante de cola peptídica a un VHH anti hCG (clon número
HI15) aislado de una llama inmunizada como se describe en WO
94/25591 según las fases siguientes:
- (I)
- El ADN codificante de VHH fue aislado del vector de visualización de fago (pHEN) por digestión de restricción, usando las enzimas Pst I/Bst EII, y fue clonado en dos vectores intermedios pUC 19 (A y B), modificados para permitir otra manipulación por medio de técnicas biológicas moleculares estándares (figura 2a y b).
- (II)
- 2 \mug de cada par de oligonucleótidos superpuestos (figura 1) fueron mezclados en un volumen de 50 \mul, calentados durante 5 minutos a 98°C y posteriormente enfriados en hielo para ser sometidos por hibridación. Los pares de cebado de los oligonucleótidos fueron: SW26 y SW27 (usados para el ensamblaje de la secuencia de cola GKG, una secuencia de control sin organización estructural), SW28 y SW29 (secuencia de cola GKP) y SW30 y SW31 (secuencia de cola EKP). Un vector intermedio (A) fue aislado y digerido con enzimas Xho I y Mun I. Un vector y pares de cebado sometidos a hibridación fueron ligados, introduciendo el ADN codificante de cola peptídica (figura 3).
- (III)
- Las fusiones de ADN de cola de VHH fueron introducidas en el vector de expresión Pichia Pastoris pPIC 9 en forma de ligaduras de tres puntos (una para cada formato de cola). Los clones del vector A, comprendiendo ADN de VHH insertado correctamente, fueron digeridos con Bst EII y Eco RI (se recogieron insertos de ADN de cola). El vector B, (figura 2b) fue digerido con Xho Bst EII (El inserto VHH fue recogido). El ADN del vector pPIC 9 fue digerido con Xho I/Eco RI (eje principal del vector recogido). El inserto, el vector y las colas fueron ligados y transformados en la cepa E. coli XL1-b usando técnicas biológicas moleculares estándares, creando los constructos finales.
- (IV)
- el ADN comprendiendo los constructos finales fue aislado de los cultivos inoculados durante toda la noche con colonias individuales tomadas de transformaciones dispuestas en placas, usando un kit plásmido Qiagen midiprep según las instrucciones de los fabricantes. Se verificó que los constructos estuvieran correctamente ensamblados mediante un análisis de secuencia de ADN automatizado. 5 \mug de cada constructo fueron digeridos con la enzima de restricción Bgl II, seguido de una extracción con fenol, extracción con cloroformo y precipitación con etanol. El ADN granulado fue lavado dos veces con 70% de etanol (para eliminar las sales), secado al aire y resuspendido en 5 \mul de dH_{2}O. El vector pPIC 9 digerido con Bgl II, conteniendo el ADN de VHH modificado, fue transformado en una cepa Pichia Pastoris GS115 según el método de la etapa (V).
- (V)
- Las células fueron cultivadas durante toda la noche a 30°C, en un medio de 500 ml de YPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 1% de glucosa) para un OD_{600} de 1.4. Las células fueron centrifugadas (3 min. 2.5 Kg) y el granulado fue lavado con agua destilada estéril antes de una resuspensión en 100 ml de tampón KDTT (50 mM de KH_{2}PO_{4} pH 7.5 más 25 mM de ditiotreitol). Después de 15 min. de incubación a 37°C, las células fueron granuladas como se describió anteriormente y resuspendidas en 100 ml de tampón STM helado (10 mM Tris. Cl pH 7.5 más 1 mM de MgCl_{2} y 92.4 g de glucosa por litro). Después de 5 lavados con este tampón, el granulado celular fue resuspendido en un volumen final de 3 ml de tampón STM. El ADN digerido (en un volumen de 5 \mul) fue mezclado con 70 \mul de células competentes sobre hielo. Las células fueron sometidas a una electroporación en una cubeta de 0.2 cm a 1.5 kV, 400 \Omega, 25 \muF en un BioRad Gen-Pulser. Inmediatamente después de la electroporación, un medio de 1 ml de YPD fue añadido a las células. Después de la recuperación durante 1 hora a 37°C, las células fueron dispuestas en placas sobre placas de 3 X MD. Las colonias formadas mediante células transformadas (His+) fueron visibles en un periodo de 48 horas de incubación a 30°C.
Los VHHs Anti hCG comprendiendo colas peptídicas
fueron expresados en Pichia Pastoris según el método
siguiente.
Las colonias de P. Pastoris transformadas
recientemente fueron depositadas en placas por réplicas sobre
placas MD y MM tal como se describe en el manual de usuarios del
kit de expresión Pichia Invitrogen (versión B). Las placas fueron
incubadas durante 48 horas a 30°C, en cuyo punto fueron
seleccionados los clones mut-s (visualizados por la
presencia de una colonia mucho más pequeña de crecimiento en placas
MM). 6-12 colonias de cada tipo de VHH fueron
"picados" de las placas MD (correspondiendo a las colonias
mut-s identificadas de las placas MM) y usadas para
inocular 10 ml de medio BMGY. Los cultivos de 10 ml fueron
incubados a 30°C durante 20 horas y posteriormente granulados por
centrifugado. Se utilizó 2 ml de BMMY para reemplazar los medios
para cada cultivo, y éstos fueron posteriormente incubados durante
otras 20 horas. 10 \mul de metanol (100%) fueron añadidos y los
cultivos fueron incubados durante unas últimas 24 horas antes de ser
granulados de nuevo.
Los sobrenadantes de expresión fueron sometidos
a una prueba para la producción de VHH usando un Chip sensor NTA
(para enlazar los terminales His6 que forman parte de cada tipo de
cola de VHH) en un instrumento Biacore 2000. Cada sobrenadante fue
diluido 1/50 en tampón HBS con un contenido de 50 pM de EDTA. 15
\mul de muestra diluida fue pasada sobre la superficie (después
de cebar primero la superficie con 15 \mul de 0.5 mM
Ni_{2}SO_{4}). Tras la adición de la muestra, las superficies
del sensor se regeneraron mediante el uso de 15 \mul de 0.35 M
EDTA. El nivel de flujo era de 15 \mul/min en todas partes. Las
colonias aisladas de generación de sobrenadantes de expresión con
los niveles de producción máximos fueron recultivadas durante toda
la noche en BMGY, y almacenadas en 15% de glicerol a -70°C hasta
ser necesarias.
La expresión del frasco de agitación a gran
escala se efectúo tal y como se describe en el Manual de Usuarios
de Invitrogen Pichia, usando frascos de agitación de 2 L
disipados, con un volumen líquido de 0.5 L. Cuarenta y ocho horas
después de la inducción, los cultivos fueron recogidos por
centrifugado a 18,112 g (durante 1 hora a 4°C) y los sobrenadantes
fueron posteriormente filtrados mediante unidades de filtro Nalgene
de 0.45 \mum.
Se realizó la purificación de los VHHs usando
una resina Superflow Ni-NTA comercialmente
disponible (Qiagen corp.), con una capacidad de 5 - 10 mg de 6x
proteína de terminación His por ml de resina. Antes del inicio, se
determinó el pH de la carga (sobrenadante de expresión) a 6 o más
para asegurar una interacción de alta afinidad entre los VHH de
terminación His6 y la resina.
10-20 ml de resina fueron
dispuestos en columnas de cromatografía, las cuales fueron lavadas
con 5 volúmenes de estrato de tampón de lavado (por ejemplo PBSA o
10 mM de tampón de fosfato potásico pH 6). Ésta y todas las etapas
posteriores fueron realizadas con un caudal de 2 mL/min.
Los sobrenadantes fueron cargados sobre la
columna y posteriormente lavados con aproximadamente 10 volúmenes
de columna de tampón de lavado, 5 volúmenes de columna de 1 M de
NaCl, y después de nuevo con un tampón de lavado hasta que la
densidad óptica a 280 nm alcanzó la línea de base. La elución de
VHH se efectúo a través de un gradiente lineal de
0-0.5 M de imidazol sobre 10 volúmenes de columna
seguido de un desalado mediante una columna de desalación G25 con
200 ml de sefadex. La pureza de los VHH aislados usando esta
metodología fue estimada en 99% o más.
Un chip sensor CM5 (Biacore AB, Suecia) fue
introducido en un biosensor Biacore 2000 (Biacore AB, Suecia) y se
realizó un experimento como se indica a continuación:
Se estableció el caudal a 10 ul/min y 20 ul de
VHH115EKP (formados en 10 mM de citrato sódico pH 4.0) fueron
inyectados a través de la superficie del sensor. Esto se repitió
usando VHH115EKP formado en un tampón de citrato sódico de pH 4.0,
4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.1, 5.4, 5.8 y 6.0. Se determinó la cantidad
de proteína en interacción con la superficie del sensor durante la
inyección.
Se realizó otro experimento después donde las
inyecciones de VHH115GKP (20 ul formados en 10 mM de Tris pH 5.8,
6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 y 7.6) e inyecciones de
VHH115GKG (20 ul formados en 10 mM de Tris pH 5.8, 6.0, 6.2, 6.4,
6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 y 7.6) se formaron a través de una
superficie del biosensor CM5.
La cantidad de fragmento de anticuerpo asociada
a la superficie del chip fue representada en gráficos a diferentes
pH y puede ser visualizada en la figura 6. Los datos mostrados con
las líneas continuas representan las muestras formadas en el tampón
de citrato sódico, mientras que los datos mostrados con las líneas
discontinuas representan las muestras formadas en el tampón
Tris.
El fragmento de anticuerpo VHH115EKP asociado
con la superficie de sensor CM5 tuvo una extensión superior a pH
más elevado que cualquiera de los otros dos fragmentos. Esto se
debe al pl reducido de esta proteína producida por la introducción
de residuos de ácido glutámico en la cola peptídica.
Los fragmentos de anticuerpo VHH115EKP,
VHH115GKP y VHH115GKG fueron acoplados de manera covalente a una
superficie del sensor CM5 como se indica a continuación:
Un nuevo chip sensor CM5 fue introducido en el
Biacore y se obtuvo un sensograma como se indica a continuación. El
paso de flujo fue establecido en
1-2-3-4 y el caudal
de HBS establecido en 10 \mul/min. El paso de flujo se modificó
en flujo sólo a través de una célula de flujo 1 y el VHH115EKP fue
acoplado usando un kit de acoplamiento de amina según lo descrito
por los fabricantes. En resumen, 40 \mul de una mezcla de éster
N-hidroxisuccinimida (NHS) y carboimida de
etilenodiamina (EDC) fue inyectada rápidamente a través de una
célula de flujo 1 para activar la superficie del sensor. Esto fue
seguido de una inyección rápida de 20 \mul de VHH115EKP diluido a
1 en 50 en 10 mM de tampón de citrato sódico de pH 5.4. La
superficie del sensor fue bloqueada por una inyección rápida de 40
\mul de etanolamina (1 M) a través de célula de flujo 1. El paso
de flujo se modificó posteriormente para fluir sólo a través de una
célula de flujo 2 y el VHH115GKP fue acoplado en amina. En resumen,
40 \mul de una mezcla de NHS/EDC fueron inyectados rápidamente a
través de una célula de flujo 2 para activar la superficie del
sensor. Esto fue seguido de una inyección rápida de 20 \mul de
VHH115GKP diluido en 1 en 50 en 10 mM de tampón de citrato sódico
de pH 4.0. La superficie del sensor fue bloqueada por una inyección
rápida de 40 \mul de etanolamina (1 M) a través de una célula de
flujo 2. El paso de flujo fue posteriormente modificado para fluir
sólo a través de una célula de flujo 3 y el VHH115GKG fue acoplado
en amina, En resumen, 40 \mul de una mezcla de EDC fueron
inyectados a través de una célula de flujo 3 para activar la
superficie del sensor. Esto fue seguido de una inyección rápida de
20 \mul de VHH115GKG diluido a 1 en 50 en 10 mM de tampón de
citrato sódico de pH 4.7. La superficie del sensor fue bloqueada por
una inyección rápida de 40 \mul de etanolamina (1 M) a través de
una célula de flujo 3.
El pH de acoplamiento particular para cada
fragmento fue escogido de modo que a estos pH, todos los fragmentos
sean asociados con la superficie CM5 en la misma medida (ver figura
6). La cantidad de fragmento acoplado a las numerosas células de
flujo es mostrada en la Tabla 1 más abajo. Como se puede ver en los
resultados presentados en la Tabla 1, se acopla una cantidad mayor
de proteína cuando se usa una cola estructurada.
En este experimento, los pH de acoplamiento
individuales seleccionados fueron tales que la extensión de
asociación no covalente anterior a la reacción de acoplamiento
fuera la misma para las tres proteínas. El descubrimiento de que la
cantidad de proteína acoplada no es la misma en los tres casos
indica por lo tanto que la eficacia de reticulación no depende
únicamente de la cantidad de proteína asociada de forma no covalente
a la superficie. Los resultados obtenidos demuestran la influencia
de la estructura de cola y del pH sobre la eficacia de
acoplamiento, la cantidad de proteína acoplada en aumento en un
orden reflejando el aumento en una organización estructural de la
cola (GKG < GKP < EKP).
Un nuevo chip sensor CM5 (chip 2) fue
introducido en el Biacore y se produjo un sensograma. El paso de
flujo fue establecido a
1-2-3-4 y el caudal
de HBS establecido a 10 \mul/min. El paso de flujo se modificó en
flujo sólo a través de una célula de flujo 1 y el VHH115EKP fue
acoplado usando un kit de acoplamiento de amina tal y como está
descrito por los fabricantes. En resumen, 40 \mul de una mezcla
de NHS/EDC fueron inyectados rápidamente a través de una célula de
flujo 1 para activar la superficie del sensor. Esto fue seguido de
una inyección rápida de 20 \mul de VHH115EKP diluido en 1 en 50 en
10 mM de tampón de citrato sódico de pH 4.0. La superficie del
sensor fue bloqueada por una inyección rápida de 40 \mul de
etanolamina (1 M) a través de la célula de flujo 1. El paso de
flujo se modificó después en flujo sólo a través de la célula de
flujo 2 y el VHH115EKP fue acoplado en amina por una inyección
rápida de 40 \mul de una mezcla de NHS/EDC a través de una célula
de flujo 2 para activar la superficie del sensor. Esto fue seguido
de una inyección rápida de 20 \mul de VHH115EKP diluido en 1 en
50 en 10 mM de tampón de citrato sódico de pH 4.6. La superficie
del sensor fue bloqueada por una inyección rápida de 40 \mul de
etanolamina (1 M) a través de la célula de flujo 2. La trayectoria
del flujo fue posteriormente modificada en flujo sólo a través de la
célula de flujo 3 y el VHH11 SEKP fue acoplado en amina. En
resumen, 40 \mul de una mezcla de EDC fueron inyectados a través
de la célula de flujo 3 para activar la superficie del sensor. Esto
fue seguido por una inyección rápida de 20 \mul de VHH115EKP
diluido en 1 en 50 en 10 mM de tampón de citrato sódico de pH 5.1.
La superficie del sensor fue bloqueada por una inyección rápida de
40 \mul de etanolamina (1 M) a través de la célula de
flujo 3.
flujo 3.
Las cantidades de VHH115EKP acoplado según los
diferentes pH aparecen en la Tabla 2.
El chip sensor (chip 2) fue introducido en el
Biacore 2000 y se produjo un sensograma. El paso de flujo fue
establecido en un flujo comprendido entre
1-2-3-4 y el caudal
se estableció a 10 \mul/min. Una muestra de 40 \mul de hCG (50
IU/ml) fue inyectada a través de unas células de flujo
1-4. Los rastros de sensograma obtenidos a partir
de la inyección fueron superpuestos en el paquete software
BIAevaluation (Biacore AB) y los niveles de fondo de la célula de
flujo 4 fueron sustraídos de todos los canales de flujo.
Los rastros superpuestos del enlace hCG a
superficies acopladas VHH115EKP aparecen en la figura 9 (línea
fina, célula de flujo 3; línea mediana, célula de flujo 2; línea
gruesa, célula de flujo 1). La cantidad de hCG enlazado cuando la
curva de enlace alcanzaba una meseta aparece en la Tabla 3. La
cantidad máxima de hCG prevista para enlazarse con el fragmento
acoplado VHH115EKP puede ser determinada por la ecuación
siguiente:
Enlace máximo =
A *
M1/M2
Donde A es la cantidad de VHH115EKP acoplado, M1
es el peso molecular de hCG (38000 Da) y M2 es el peso molecular de
VHH115EKP (15000 Da).
La cantidad de enlace hCG puede ser expresada en
forma de porcentaje de enlace máximo, estos datos aparecen en la
Tabla 3.
Se puede observar que el pH disminuye, aunque la
cantidad de hCG capturado aumente, éste no aumenta con respecto a
la cantidad total de proteína reticulada, indicando que una
proporción mayor de la proteína reticulada pierde su función cuando
el acoplamiento de pH es inferior. Esto demuestra la importancia
potencial de ser capaz de conseguir una buena eficacia de
acoplamiento con un pH de acoplamiento más alto (más moderado)
usando el método de la presente invención.
<110> UNILEVER PLC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> INMOVILIZACIÓN DE PROTEÍNAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> T3081
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 99309515.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-11-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SECUENCIA DE ENLACE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu His His His His His His Arg Ser Glu Lys
Glu Lys Lys Pro Lys}
\sac{Glu Lys Glu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SECUENCIA DE ENLACE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu His His His His His His Arg Ser Gly Lys
Gly Lys Lys Pro Lys}
\sac{Gly Lys Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SECUENCIA DE ENLACE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(62)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
INSERTO PLÁSMIDO SINTETICO CODIFICANTE DE COLA PEPTÍDICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu His His His His His His Arg Ser Gly Lys
Gly Lys Lys Gly Lys}
\sac{Gly Lys Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
INSERTO PLÁSMIDO SINTETICO CODIFICANTE DE COLA PEPTÍDICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
INSERTO PLÁSMIDO SINTETICO CODIFICANTE DE COLA PEPTIDICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(62)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
INSERTO PLÁSMIDO SINTÉTICO CODIFICANTE DE COLA PEPTÍDICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu His His His His His His Arg Ser Gly Lys
Gly Lys Lys Pro Lys}
\sac{Gly Lys Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
INSERTO PLÁSMIDO SINTETICO CODIFICANTE DE COLA PEPTÍDICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
INSERTO SINTETICO PLÁSMIDO CODIFICANTE DE COLA PEPTIDICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(62)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
INSERTO PLÁSMIDO SINTETICO CODIFICANTE DE COLA PEPTIDICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu His His His His His His Arg Ser Glu Lys
Glu Lys Lys Pro Lys}
\sac{Glu Lys Glu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
INSERTO PLÁSMIDO SINTETICO CODIFICANTE DE COLA PEPTÍDICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Material comprendiendo una proteína acoplada
de manera covalente a una superficie sólida a través de al menos un
segmento polipéptido que tiene uno o más sitios para un enlace
covalente, donde el segmento polipéptido consiste en una secuencia
de fórmula (XY)_{n}Z(XY)_{m}, donde:
- a)
- Z es una secuencia peptídica capaz de formar un bucle de inversión;
- b)
- n y m son el mismo o diferente y representan un número entero de 2 a 15;
- c)
- X e Y son residuos aminoácidos con una carga opuesta;
y uno o más pares de residuos
aminoácidos de carga opuesta X e Y, separados por Z, son capaces de
alinearse los unos con respecto a los otros en una estructura
plegada de tal modo que el segmento polipéptido
(XY)_{n}Z(XY)_{m} adopte una conformación
estructural en forma de horquilla
beta.
2. Material según la reivindicación 1 donde Z
comprende uno o más residuos de prolina.
3. Material según la reivindicación 2 donde el
segmento proteico (XY)_{n}Z(XY)_{m} está
constituido por la secuencia de aminoácidos EKEKKPKEKEK.
4. Material según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde la proteína acoplada de manera
covalente a la superficie sólida es un anticuerpo o un fragmento
inmunológicamente activo de éste.
5. Material según la reivindicación 4, donde la
proteína es una inmunoglobulina naturalmente desprovista de cadenas
ligeras o un fragmento de dominio variable de cadena pesada (VHH)
de éste.
6. Material según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde la superficie sólida es seleccionada
de poliestireno, polipropileno, cloruro de polivinilo, celulosas,
dextranos, polímeros y copolímeros sintéticos, látex, sílice,
tejido, metal, carbono y vidrio.
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