PT1817342E - Método de purificação por afinidade - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "MÉTODO DE PURIFICAÇÃO POR AFINIDADE"

Campo da invenção A invenção refere-se a um método para purificação por afinidade e a um agente de ligação para ser utilizado nesse processo.

Antecedentes da invenção A utilização de agentes de ligação na purificação por afinidade é conhecida a partir da EP-A-434317. Este documento divulga que é possível imobilizar agentes de ligação específicos pequenos num veículo de fase sólida. Os agentes de ligação são especialmente constituídos pelas proteínas correspondentes do domínio VH e VL, mantidas em conjunto pela sua interação natural. Ao serem imobilizados estes agentes de ligação pequenos mantêm a afinidade para o seu ligando alvo. Um exemplo da tecnologia divulgada é a imobilização de uma Fv de anti-lisozima sobre agarose e a sua utilização como um imunoadsorvente. 0 imunoadsorvente compreendendo Fv de anti-lisozima imobilizada foi empacotado numa coluna e nesta coluna foi carregada uma mistura de lisozima e outra proteína. A coluna foi lavada para remover a proteína não ligada e subsequentemente foi eluída a proteína ligada.

Neste tipo de sistemas de imunoafinidade a força, especificidade e capacidade de ligação do imunoadsorvente são parâmetros importantes. 2 A força e especificidade de ligação referem-se à ligação entre o agente de ligação e o alvo. Especialmente, o agente de ligação é um anticorpo ou seu fragmento, e a ligação é altamente especifica para o alvo. De modo desejável, a ligação especifica ao alvo é maximizada e ligação não especifica é minimizada. A ligação com uma especificidade apenas muito limitada está subjacente aos sistemas de purificação comerciais que se baseiam na proteína A e proteína L. Sabe-se que estes se ligam a uma vasta gama de moléculas de imunoglobulina tais como imunoglobulinas de humano, rato e ratazana. A força de ligação deve ser equilibrada entre uma boa ligação de tal forma que a coluna é facilmente carregada com o material alvo e nenhum material alvo é eluído antes da eluição, e o desejo de utilizar condições de eluição suaves para evitar danos desnecessários às moléculas alvo. As condições de eluição muito rigorosas são indesejadas porque podem levar à desnaturação, fragmentação ou outros defeitos do material alvo. Além disso, as condições suaves são benéficas para o material da coluna e aumentam a vida útil do mesmo. A capacidade do imunoadsorvente indica a quantidade de material alvo que pode ser ligado pelo material imunoadsorvente nas condições de ligação. Assim que é alcançada a capacidade máxima do material imunoadsorvente, a carga adicional de alvo não resultará em ligação mas originará a perda de material alvo no eluente. Isto resulta numa perda de rendimento na purificação da proteína ou requer a inclusão de passos de processamento adicionais (repetidos).

Por exemplo, na EP-A-434317 alguns destes objetivos são abordados através da utilização de domínios variáveis 3 possuindo afinidade reduzida para o antigénio, levando à eluição ou dessorção em condições mais suaves. A ligação não especifica é reduzida diminuindo o tamanho do agente de ligação I até ao mínimo necessário para ligação.

McNahon et al. (2000, Journal of Immunological methods 241:1-10) divulgam uma IgM monoclonal murídea anti-IgG de cabra designada Mil. Os autores descrevem que este monoclonal era mono-reativo antes da purificação, enquanto era poli-reativo a muitas proteínas diferentes após purificação.

Lambin et al. (1993, Journal of Immunological methods 165:99-111) divulgam um método para purificar até um grau elevado uma fração de IgG4 contendo predominantemente anticorpo anti-pólen com atividade bloqueadora numa coluna de imunoafinidade compreendendo anticorpos monoclonais humanos.

Bird et al. (1984, Journal of Immunological methods 71:97-105) divulgam a utilização de anticorpos monoclonais de murídeos específicos para subclasses humanas (específicos para anti-IgGl; anti-IgG2; anti-IgG3; anti-IgG4) e restringidos a subclasses humanas (anti-IgG2, 3 e 4, não-IgGl; anti-IgGl, 2 e 4, não-IgG3; anti-IgGl, 2 e 3, não-IgG4) para padronizar procedimentos de imunoafinidade para permitir o isolamento de preparações de subclasses policlonais puras.

Monestier et al. (1989, Hybridoma 8(6):631-638) divulgam um método para a purificação de anticorpos de IgM de murídeo. Os autores divulgam a imunização de ratazanas com um anticorpo monoclonal IgM-kappa de murídeo (TEPC 183) e três semanas depois com um anticorpo monoclonal IgM-lambda de murídeo (MOPC 104E), para gerar anticorpos monoclonais de 4 ratazana contra IgM de murídeo. Foram obtidos dois anticorpos monoclonais de ratazana que se ligam a ambos, TEPC 183 e MOPC 104E. Foi observado que a ligação era independente da cadeia leve. A WO 2004/041862 divulga polipéptidos antifator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa) compreendendo um ou mais anticorpos de domínio único dirigidos contra TNF-alfa. Além disso, foi divulgada a sua utilização em diagnóstico e terapia. A WO 2004/041867 divulga um método de administração de moléculas terapêuticas de proteína através de vias de administração diferentes de forma a evitar a inativação. A aplicação divulga uma construção polipeptídica compreendendo pelo menos um anticorpo de domínio único dirigido contra a região constante de IgE.

Ewert et al. (2002, Biochemistry 41:3628-3636) apresentam as propriedades biofísicas dos domínios VHH de camelídeo em comparação com as propriedades de domínios VH3 humanos. Os autores concluem que os fragmentos de VHH de camelídeo são caracterizados por uma estabilidade favorável e pela sua aptidão para fundir de forma reversível sem agregação, permitindo desse modo que os fragmentos recuperem a afinidade de ligação após renaturação térmica. Pérez et al. (2001, Biochemistry 40:74-83) investigam a estabilidade térmica dos anticorpos de cadeia pesada de camelídeos.

Muildermans e Lauwereys (1999, Journal of Molecular Recognition 12:131-140) apresentam uma revisão dos anticorpos apenas de cadeia pesada de camelídeos. Os autores discutem o anticorpo apenas de cadeia única contra os anticorpos tradicionais e indicam que preveem que os 5 anticorpos de domínio único de camelídeos serão aplicados num número de aplicações biotecnológicas ou médicas.

Van der Linden et al. (2000, Journal of Immunological methods 240:185-195) abordam a questão de saber se os lamas são um fonte prática de fragmentos VHH específicos para antigénio e concluíram que os fragmentos VHH de anticorpo específicos para antigénio são facilmente acessíveis a partir do anticorpo de lama gerado contra a gonadotrofina coriónica humana.

Embora estas medidas possam, em certa medida, melhorar as características de capacidade, especificidade e afinidade do imunoadsorvente, continua a haver uma procura de materiais imunoadsorventes ainda mais melhorados.

Sumário da invenção Nós determinamos surpreendentemente que um material imunoadsorvente compreendendo um agente de ligação específico, o qual é preferencialmente um anticorpo ou um seu fragmento, que se liga a pelo menos dois epítopos num alvo, tem a afinidade elevada desejada, enquanto a eluição pode ser ainda realizada em condições suaves. Quando utilizado como um material para cromatografia em coluna verificou-se que origina uma alta capacidade da coluna.

Por conseguinte, a invenção refere-se a um método de purificação de uma imunoglobulina, em que: a) o método compreende o passo de ligar a imunoglobulina a um material imunoadsorvente que compreende pelo menos um agente de ligação mono-específico; 6 b) o agente de ligação tem afinidade para pelo menos dois epitopos na imunoglobulina que estão espacialmente separados por pelo menos 30 angstrom; e, c) o agente de ligação mono-especifico é um domínio variável de um anticorpo que pode ser obtido a partir de um camelídeo que consiste apenas de cadeias pesadas e que está naturalmente desprovido de cadeias leves.

Noutro aspeto a invenção refere-se a um método de purificação de uma molécula alvo por imunoafinidade, em que a molécula alvo é uma imunoglobulina, método esse que compreende a utilização de um material imunoadsorvente compreendendo pelo menos dois agentes de ligação diferentes, em que os agentes de ligação compreendem um agente de ligação com afinidade de ligação para um epítopo (um) na molécula alvo e um agente de ligação com afinidade de ligação para um epítopo diferente (dois) na molécula alvo.

Descrição da invenção A molécula alvo é definida como uma molécula que deve ligar-se a um agente de ligação tal como um anticorpo. Os exemplos de moléculas alvo são proteínas que requerem purificação, proteínas que são para ser identificadas. A afinidade de ligação (KD) é definida no contexto de ligação específica e é representada por uma afinidade de pelo menos 1*106 ΝΓ1. Preferencialmente, a afinidade de ligação (medida no agente de ligação isolado e alvo) é de pelo menos 1*107 ΝΓ1, mais preferido de pelo menos 1*108 ΝΓ1.

Material imunoadsorvente é aqui entendido como a combinação de um veículo e um agente de ligação que está imobilizado no veículo. O veículo pode ser qualquer material que possa 7 ser utilizado para a imobilização de um agente de ligação. Os exemplos adequados são materiais de matriz, para reter o agente de ligação, superfícies celulares nas quais o agente de ligação é apresentado e polímeros que podem estar ligados covalentemente ao agente de ligação. 0 especialista na técnica de cromatografia de afinidade está bem ciente de veículos adequados tais como, por exemplo, Sepharose. 0 agente de ligação está preferencialmente imobilizado sobre o veículo por uma ligação covalente.

Um epítopo é definido como a porção da molécula alvo que é ligada pelo agente de ligação. Se o agente de ligação é um anticorpo, aquele é a porção de uma molécula alvo que desencadeia uma resposta imunológica ao imunizar uma espécie com esta molécula. De uma forma geral, é o sítio da molécula alvo onde ocorre a ligação a um anticorpo.

De forma preferida, o epítopo está naturalmente presente na molécula alvo. Opcionalmente, o(s) epítopo(s) é/são uma sequência que foi incluída artificialmente na molécula alvo. Opcionalmente, um sem-número de epítopos iguais ou diferentes são incluídos na molécula alvo para facilitar a sua purificação e deteção. 0 agente de ligação é um componente que se liga especificamente à molécula alvo com a afinidade de ligação desejada. 0 agente de ligação é um agente de ligação mono-específico. Uma composição compreendendo um agente de ligação mono-específico, tal como os materiais imunoadsorventes da presente invenção, é entendida como uma composição possuindo uma população homogénea do agente de ligação. Entende-se que o agente de ligação mono-específico é específica para um único epítopo ou ligando. No entanto, inclui-se expressamente na invenção que o material imunoadsorvente pode compreender mais do que um tipo de 8 agente de ligação mono-específico, consistindo cada de uma população homogénea. No entanto, em geral, no contexto da presente invenção, um material imunoadsorvente não compreenderá mais do que 4, 6, 8, 10 ou 20 agentes de ligação mono-específicos diferentes. É extremamente preferido que o agente de ligação seja um anticorpo ou um seu fragmento. Nesse caso, o agente de ligação mono-específico será assim um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento, o qual pode ser obtido a partir de um hibridoma ou expressado a partir de uma sequência de codificação clonada. O termo agente de ligação mono-específico como aqui utilizado exclui assim anticorpos policlonais e antissoros. Um exemplo de um fragmento adequado que pode ser utilizado é a parte de ligação do anticorpo, referida como CDR (região determinante de complementaridade). Tais fragmentos podem ser adequadamente inseridos na molécula suporte natural ou sintético tal como um péptido sintético. A invenção refere-se a um método de purificação por imunoafinidade, o qual compreende a utilização de um agente de ligação, que se liga a uma molécula alvo em pelo menos duas posições. Isto é referido como ligação multivalente. Numa forma de realização, o agente de ligação liga-se a um epítopo que está presente pelo menos duas vezes na molécula alvo. Noutra forma de realização, o método utiliza pelo menos dois agentes de ligação diferentes, cada um dos quais se liga a epítopos diferentes na molécula alvo.

Por conseguinte, a invenção refere-se a um método de purificação de uma molécula alvo por imunoafinidade, o qual compreende a utilização de um material imunoadsorvente compreendendo um agente de ligação, o qual compreende quer a) Um agente de ligação com afinidade de ligação para um epítopo que está presente pelo menos duas vezes na molécula alvo 9 b) ou compreende um agente de ligação com afinidade de ligação para um epítopo (um) na molécula alvo e um agente de ligação diferente com afinidade de ligação para um epitopo diferente (dois) na molécula alvo. A seguir são apresentados outros passos preferidos deste método.

Numa forma de realização alternativa, a invenção refere-se a um método de purificação de uma molécula alvo por imunoafinidade, o qual compreende a utilização de um agente de ligação de acordo com (a) ou (b) acima, em combinação com pelo menos um agente de ligação que exibe ligação monovalente para a molécula alvo. Tais combinações de agente de ligação múltiplo são especialmente adequadas para serem utilizadas se o agente de ligação individual tiver uma afinidade de ligação inferior a 1*108 M_1, para o alvo.

Opcionalmente, o método da invenção é uma combinação de (a) e (b) acima.

Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se a um método de purificação de uma molécula alvo, em que o método compreende o passo de ligação da molécula alvo a um material imunoadsorvente que compreende pelo menos um agente de ligação mono-especifico, e em que o agente de ligação tem afinidade para pelo menos dois epítopos na molécula alvo que estão espacialmente separados.

Preferencialmente, a separação espacial dos pelo menos dois epítopos na molécula alvo é de tal forma que a ligação de um primeiro epítopo na molécula alvo a um agente de ligação não interfere substancialmente com a ligação de um segundo ou mais epítopos a um agente de ligação. Isto significa que 10 a ligação de um primeiro epítopo na molécula alvo a um agente de ligação não reduz ou "bloqueia" substancialmente a ligação de um segundo ou mais epítopos a um agente de ligação. A ausência de bloqueio substancial é aqui entendido como significando que a ligação de um primeiro epitopo na molécula alvo a um agente de ligação não reduz a ligação de um segundo ou mais epitopos a um agente de ligação em mais do que 50, 40, 30, 20, 10 ou 5%. A ausência de bloqueio substancial pode ser determinada em ensaios de bloqueio cruzado correntes (ver por exemplo "Using Antibodies" E. Harlow e D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press NY, 1999) ou como descrito no Exemplo 5 aqui . A separação espacial dos pelo menos dois epítopos na molécula alvo é, desse modo, preferencialmente de tal forma que pelo menos dois epítopos na molécula alvo estejam disponíveis para se ligarem a um agente de ligação no material imunoadsorvente. A separação espacial dos pelo menos dois epitopos é, desse modo, de tal forma que resulta numa ligação multivalente. A ligação multivalente resulta numa velocidade de dissociação significativamente menor (k-diss) da molécula alvo do material imunoadsorvente compreendendo o(s) agente(s) de ligação e em valores de KD significativamente mais altos. Preferencialmente, a presença de pelo menos dois epítopos espacialmente separados na molécula alvo produz pelo menos um aumento de 5, 10, 50, 100, 500 ou 1000 vezes na afinidade ou valor de KD para o material imunoadsorvente compreendendo um agente de ligação em comparação com a afinidade ou valor de KD de uma molécula alvo compreendendo apenas uma única cópia do mesmo epítopo. Entende-se aqui que 120 fM é uma afinidade ou valor de KD mais alto do que, por exemplo, 6,3 nM. A presença de pelo menos dois epítopos espacialmente separados na molécula alvo produz, ou melhor, induz avidez 11 para o material imunoadsorvente compreendendo um agente de ligação em comparação com uma molécula alvo compreendendo apenas uma única cópia do epítopo. Avidez é aqui entendida como referindo-se à força de ligação de uma molécula alvo com múltiplos sítios de ligação por um complexo maior de agentes de ligação, isto é, a força de ligação da ligação multivalente. Afinidade, por outro lado, refere-se a sistemas receptor-ligando monovalentes simples.

Assim, numa forma de realização preferida, a avidez do material imunoadsorvente para a molécula alvo é pelo menos 5, 10, 50, 100, 500 ou 1000 vezes superior à afinidade mais baixa de um agente de ligação para um epítopo individual na molécula alvo. A afinidade baixa refere-se aqui à situação em que o material imunoadsorvente compreende mais do que um tipo de agente de ligação para epítopos imunologicamente distintos na molécula alvo e em que cada tipo individual de agente de ligação pode ter uma afinidade diferente para o seu epítopo. Na situação em que um único tipo de agente de ligação liga um epítopo que se repete na molécula alvo a afinidade mais baixa é a afinidade do agente de ligação para uma molécula de ensaio compreendendo apenas uma única cópia do epítopo. A separação espacial dos pelo menos dois epítopos na molécula alvo é, desse modo, mais preferencialmente de tal forma que a capacidade de ligação dinâmica do material imunoadsorvente compreendendo um agente de ligação para a molécula alvo é aumentada em pelo menos 10, 20, 50, 100 ou 200% em comparação com a capacidade de ligação dinâmica do material para uma molécula alvo compreendendo apenas uma única cópia do epítopo. A capacidade de ligação dinâmica (DBC) é aqui definida como a área do pico de eluição dividida pela área de pico total (escoamento + eluição) e 12 este multiplicado pela quantidade de molécula alvo (ver Exemplo 3).

Outra caracteristica importante da presente invenção é que apesar da ligação multivalente da molécula alvo ao material imunoadsorvente conduzir a afinidades de ligação ou avidez elevadas para a molécula alvo, a libertação das referidas moléculas pode ser contudo obtida em condições de eluição suaves. Assim, numa forma de realização preferida, a avidez de um material imunoadsorvente compreendendo um agente de ligação para a molécula alvo é pelo menos 1*109 M_1, 1*1010 M-1, l*10n M_1 ou 1*1012 ΝΓ1. Preferencialmente, à mesma pelo menos 90% da molécula alvo pode ser eluida a partir do material imunoadsorvente a um pH de 2,5, 2,75, 3,0, 3,25 3,5 ou maior. No entanto, preferencialmente as afinidades individuais de um agente de ligação para um epítopo na molécula alvo são inferiores a 1*1010 M-1, 1*1011 M-1 ou 1*1012 M'1.

As caracteristicas definidas acima de ligação da molécula alvo ao material imunoadsorvente podem ser conseguidas quando os pelo menos dois epítopos na molécula alvo estão espacialmente separados por pelo menos 10, 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 Ângstrom.

Nos métodos da invenção, os pelo menos dois epítopos na molécula alvo podem ser pelo menos dois epítopos imunologicamente distintos. Nesse caso são necessários pelo menos dois agentes de ligação distintos no material imunoadsorvente, preferencialmente um para cada epítopo imunologicamente distinto.

Alternativamente, os métodos da invenção, os pelo menos dois epítopos na molécula alvo podem ser pelo menos dois epítopos imunologicamente idênticos que estão repetidos na 13 molécula alvo. Nesse caso é necessário apenas um único tipo de agente de ligação no material imunoadsorvente. As moléculas alvo com repetições de epítopos são, por exemplo, proteínas homo-multiméricas tais como, por exemplo, imunoglobulinas compreendendo 2 cadeias leves e 2 pesadas. 0 método compreende preferencialmente um passo de seleção do agente de ligação. Esta seleção é preferencialmente feita em condições que imitam as condições de carga e eluição para encontrar um agente de ligação que ligue com afinidade suficiente para ligar a molécula alvo durante a carga e que também possa ser eluída facilmente.

Numa forma de realização da invenção, o agente de ligação deve ter afinidade de ligação para um epítopo que ocorre pelo menos duas vezes na molécula alvo. Através desta seleção são selecionados agentes de ligação, especialmente anticorpos ou seus fragmentos, que podem proporcionar ligação multivalente com uma molécula alvo. Na prática, dois agentes de ligação individuais, especialmente moléculas de anticorpo, podem ligar-se a epítopos diferentes da mesma molécula alvo, levando à ligação multivalente da molécula alvo. Esta multivalência aumenta a afinidade de ligação e a capacidade do imunoadsorvente com níveis surpreendentemente altos. Sem se pretender ficar limitado por qualquer teoria, julga-se que a ligação multivalente é essencial para conseguir a afinidade, ou antes avidez, elevada, a alta capacidade de ligação dinâmica e a eluição suave que são os objetivos da presente invenção.

Os exemplos de tais anticorpos ou seus fragmentos são anticorpos que reconhecem especificamente um epítopo que está presente na cadeia leve kappa ou lambda dos anticorpos humanos. Neste exemplo o anticorpo humano é a molécula 14 alvo. Os anticorpos humanos compreendem duas cadeias leves kappa que compreendem os epítopos.

Noutra forma de realização da invenção no passo de seleção são selecionados pelo menos dois agentes de ligação, compreendendo um agente de ligação com afinidade de ligação para um epitopo (um) na molécula alvo e um agente de ligação com afinidade de ligação para um epitopo diferente (dois) na molécula alvo. Na prática, o material adsorvente compreenderá estes dois agentes de ligação diferentes, especialmente anticorpos ou seus fragmentos, que podem ligar-se simultaneamente à mesma molécula alvo, levando novamente à ligação multivalente da molécula alvo.

Como mencionado acima, a ligação multivalente da molécula alvo, isto é, cada molécula alvo liga-se ao material imunoadsorvente através de pelo menos duas ligações agente de ligação-epítopo, é um aspeto preferido da presente invenção.

Entender-se-á que a ligação multivalente ocorrerá de forma ótima se a estrutura tridimensional da molécula alvo for de tal forma que permite esta ligação múltipla. Na prática, isto significa que está preferencialmente presente uma certa distância entre os dois epítopos na molécula alvo. A aptidão da molécula alvo para ligação multivalente pode ser deduzida a partir da sua estrutura cristalina 3D. A seleção do anticorpo ou fragmento é preferencialmente seguida da sua produção em quantidades maiores. Os sistemas de produção adequados incluem Saccharomyces Cerevisiae ou outras leveduras, bolores ou sistemas de expressão bacterianos. 15

Preferencialmente, aquela é seguida de um passo em que o agente de ligação é posto em contacto com o material imunoadsorvente. 0 imunoadsorvente e o agente de ligação podem estar ligados covalentemente ou através de outras interações. Preferencialmente, o agente de ligação está covalentemente acoplado a um material imunoadsorvente. Existem muitos protocolos conhecidos para imobilizar proteínas ou fragmentos em material adsorvente.

Entender-se-á que quando é feita referência ao imunoadsorvente compreendendo "um" agente de ligação, isto pretende também referir-se à situação em que um material imunoadsorvente é carregado com muitas moléculas individuais de agente de ligação.

Os exemplos de material imunoadsorvente adequado incluem materiais transportadores porosos de fase sólida tais como agarose, poliestireno, vidro de poro controlado, celulose, dextranos, terra-de-infusórios, polímeros sintéticos tais como Sepharose™, sílica amorfa porosa. Os materiais transportadores podem estar em qualquer formato adequado tal como partículas, pós, folhas, esferas, filtros e semelhantes. Outras especificações de materiais transportadores adequados são, por exemplo, divulgadas na EP-A-434317.

Estão disponíveis métodos para imobilizar ligandos de forma rápida, fácil e segura através de um grupo funcional escolhido. A escolha correta do método de acoplamento depende da substância a ser imobilizada. Por exemplo, os seguintes derivados de Sepharose™ comercialmente conhecidos permitem a imobilização conveniente de proteínas nos mesmos: a Sepharose™ 4B ativada com CnBr permite que ligandos contendo grupos amino primários sejam rapidamente imobilizados por uma reação espontânea. 16

As AH-Sepharose™ 4B e CH-Sepharose™ 4B têm ambas um braço espaçador com seis carbonos de comprimento e permitem o acoplamento através de grupos carboxilo e amino respetivamente. Os espaçadores flexíveis são adequados para serem utilizados em situações onde a flexibilidade das moléculas alvo é limitada ou onde a estrutura tridimensional do alvo requer alguma flexibilidade do agente de ligação para permitir uma ligação ótima. A CH-Sepharose™ 4B ativada proporciona um braço espaçador com seis carbonos e um éster ativo para acoplamento espontâneo através de grupos amino.

Estes são apenas alguns exemplos de vias de imobilização adequadas.

Opcionalmente, o material imunoadsorvente é colocado numa coluna para facilitar separações cromatográficas fáceis.

Num passo seguinte preferido, o material imunoadsorvente é posto em contacto com uma composição compreendendo o alvo. Frequentemente, a composição será uma composição aquosa compreendendo muitas outras proteínas além do alvo a ser purificado. As condições deste passo de contacto são de tal forma que ocorre a ligação do agente de ligação à molécula alvo.

Preferencialmente, neste passo é utilizado um tampão de carga possuindo um pH em torno de 6,5 a 8. Um tampão adequado é um tampão de PBS. É preferido que o material carregado seja lavado até terem eluído os agentes de ligação não específicos. 17 A dessorção da molécula alvo é o passo seguinte. Este é preferencialmente realizado mudando as condições de forma que o anticorpo ou fragmento já não liga a molécula alvo. A eluição pode ser conseguida mudando as condições em relação ao pH, sal, temperatura ou qualquer outra medida adequada. Um método de eluição preferido para dessorção é a eluição com um tampão possuindo um pH inferior a 3.

Mais especificamente a invenção refere-se a um método para a purificação de uma molécula alvo por imunoafinidade compreendendo os passos de: a) selecionar um anticorpo ou seu fragmento, que se liga a um epitopo que está presente pelo menos duas vezes na molécula alvo; b) ligar o anticorpo ou seu fragmento ao material imunoadsorvente; c) carregar o material imunoadsorvente com uma composição compreendendo a molécula alvo, preferencialmente em condições às quais ocorre a ligação multivalente do agente de ligação à molécula alvo; d) lavar o imunoadsorvente carregado para remover agentes de ligação não específicos; e, e) eluir a molécula alvo aplicando condições de eluição. 0 agente de ligação pode ser proveniente de qualquer organismo fonte adequado ou pode ser preparado sinteticamente ou por organismos geneticamente modificados. É importante que o fragmento retenha a afinidade de ligação como definida acima no contexto desta invenção.

Os exemplos de fragmentos adequados são os fragmentos Fab, fragmentos Fv. 18

Numa forma de realização preferida, os agentes de ligação são anticorpos, mais preferida tais anticorpos ou seus fragmentos são derivados de anticorpos naturalmente desprovidos de cadeias leves. Tais anticorpos são, por exemplo, obtidos por imunização de lamas ou tubarões e purificação dos anticorpos assim gerados. Estes anticorpos compreendem apenas cadeias pesadas e são desprovidos de cadeias leves. A vantagem da utilização destes anticorpos é que são excecionalmente estáveis mesmo a altas temperaturas, pequenos e facilmente produzidos em organismos hospedeiros tais como Saccharomyces cerevisiae. Estes anticorpos são descritos em mais pormenor na EP-A-656946.

De uma maneira mais geral, o agente de ligação compreende preferencialmente o domínio variável derivado de imunoglobulina que compreende um sítio de ligação de antigénio completo para um epítopo na molécula alvo numa única cadeia polipeptidica. Assim, tais agentes incluem especificamente mas se limitam a: 1) anticorpos que podem ser obtidos a partir de camelídeos e tubarões que consistem apenas de cadeias pesadas e que são naturalmente desprovidos de cadeias leves; 2) domínios variáveis dos anticorpos definidos em 1), geralmente referidos como domínios VHH; 3) formas manipuladas dos anticorpos definidos em 1) tais como, por exemplo, anticorpos "camelidizados" nos quais as sequências estruturais de um domínio VHH de camelídeo (ou tubarão) são enxertadas com CDRs obtidos de outras fontes; 4) formas manipuladas de domínios variáveis tipo imunoglobulina nos quais as sequências estruturais de uma variedade de moléculas tipo imunoglobulina são combinadas com CDRs específicos para uma dada molécula alvo como descrito, por exemplo, em WO 04/108749. 19 A seguir é dada uma definição de CDR e sequências estruturais. Entende-se ainda que a sequência de aminoácidos estrutural de um domínio variável derivado de imunoglobulina que compreende um sítio de ligação de antigénio completo para um epítopo na molécula alvo numa única cadeia polipeptídica tem preferencialmente pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos estrutural de qualquer uma de SEQ ID NO 1 - 33. Preferencialmente, o domínio variável derivado de imunoglobulina tem uma afinidade para o epítopo como definida aqui acima.

Um agente de ligação preferido é um fragmento de anticorpo de domínio único derivado de um anticorpo camelídeo. Aqui, derivado de um anticorpo camelídeo significa apenas que as sequências de aminoácidos estruturais do fragmento são como definidas acima mas que o fragmento pode ser concebido e sintetizado, em vez de ser obtido diretamente ou gerado num organismo camelídeo. Nós determinamos que o material imunoadsorvente da invenção, compreendendo um agente de ligação que se liga especificamente à cadeia leve kappa de anticorpos humanos, exibe afinidade e capacidade muito boas e precisa apenas de condições de eluição suaves.

Por conseguinte, numa forma de realização específica, a invenção refere-se a um material imunoadsorvente compreendendo um agente de ligação que tem afinidade de ligação para a cadeia leve kappa de anticorpos humanos. A invenção refere-se ainda à utilização desse material na purificação de anticorpos humanos. 20

Numa forma de realização, a invenção refere-se a um agente de ligação que é selecionado do grupo de moléculas VHH de ligação à cadeia leve kappa selecionadas de SEQ ID NO 1 -15 ou um agente de ligação compreendendo um domínio variável derivado de imunoglobulina compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR) 1, 2 e/ou 3 exibindo pelo menos 80, 85, 90, 95, 98% de identidade de aminoácidos com as CDRs das moléculas VHH de SEQ ID NO 1 -15. Preferencialmente, os domínios variáveis derivados de imunoglobulina têm uma afinidade para a cadeia leve kappa de anticorpos humanos que é pelo menos ΙΟ6 Μ-1, 107 M_1 ou ΙΟ8 ΝΓ1. As CDRs 1, 2 e 3 podem exibir cada individualmente as identidades definidas acima ou as CDRs podem exibir coletivamente as identidades definidas acima.

As regiões determinantes de complementaridade (CDR) 1, 2 e/ou 3 das moléculas VHH são aqui definidas como representadas nas Figuras 3 e 4. Mais geralmente, as CDRs dos domínios de cadeia pesada variável de camelídeo são aqui definidas como descritas por Vu et al. (1997, Mol

Immunol. 34(16-17):1121-31). As sequências de VHH diferentes das sequências CDR na SEQ ID NO 1 - 33 ou como definidas por Vu et al. (1997, supra) são aqui definidas como sequências estruturais VHH.

Noutra forma de realização mais específica, a invenção refere-se a um material imunoadsorvente compreendendo um anticorpo ou seu fragmento ativo possuindo a sequência de aminoácidos especificada abaixo como Sequência ID 1.

Sequência ID 1:

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTISRYAMSWFRQAPGKEREFVAVARRSGDGAFYADSVQGRFTV

SRDDAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAIDSDTFYSGSYDYWGQGTQVTVSS 21

Noutra forma de realização, a invenção refere-se a um anticorpo ou fragmento possuindo afinidade de ligação para um anticorpo humano, em que as sequências compreendem a sequência de acordo com a sequência ID n° 1 ou são essencialmente homólogas à mesma. No contexto da invenção essencialmente homólogo significa que a molécula homóloga exibe a afinidade de ligação desejada de pelo menos ΙΟ6 ΝΓ1. Os exemplos de sequências homólogas são sequências que foram modificadas na parte estrutural mas não na parte de ligação ao antigénio do anticorpo de acordo com a sequência ID 1.

Ainda noutra forma de realização, a invenção refere-se a um agente de ligação que é selecionado do grupo de moléculas VHH de ligação à cadeia leve lambda selecionadas de SEQ ID NO 16 - 33 ou um agente de ligação compreendendo um domínio variável derivado de imunoglobulina compreendendo Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) 1, 2 e/ou 3 exibindo pelo menos 80, 85, 90, 95, 98% de identidade de aminoácidos com as CDRs das moléculas VHH de SEQ ID NO 16 -33. Preferencialmente, os domínios variáveis derivados de imunoglobulina têm uma afinidade para a cadeia leve lambda de anticorpos humanos que é pelo menos ΙΟ6 Μ-1, 107 M_1 ou 108 M-1. As CDRs 1, 2 e 3 podem exibir cada individualmente as identidades definidas acima ou as CDRs podem exibir coletivamente as identidades definidas acima.

Ainda numa outra forma de realização, o material imunoadsorvente compreende pelo menos dois agentes de ligação diferentes, que ligam cada um epítopo imunologicamente distinto de um domínio Fc de IgG humana, de acordo com o que os epítopos imunologicamente distintos do domínio Fc de IgG humana, estão espacialmente separados como aqui definidos acima. 22

Mais uma vez noutra forma de realização, o material imunoadsorvente compreende pelo menos dois agentes de ligação diferentes, que ligam cada um epítopo imunologicamente distinto de albumina de soro humano, de acordo com o que os epítopos imunologicamente distintos da albumina estão espacialmente separados como aqui definidos acima.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona métodos e materiais imunoadsorventes que são extremamente adequados para a adsorção ou isolamento e/ou purificação de imunoglobulinas a partir de preparações em bruto, em particular de imunoglobulinas humanas dos tipos IgM, IgA, IgE e muito em particular dos isotipos IgG.

Os materiais imunoadsorventes compreendem como agentes de ligação de imunoglobulina, cadeias pesadas naturalmente desprovidas de uma cadeia leve, preferencialmente VHH de camelídeo, que são específicas para um epítopo que está presente pelo menos duas vezes na imunoglobulina alvo, os quais podem ser alvos idênticos ou diferentes.

Numa forma de realização preferida, o alvo pode compreender um epítopo presente numa cadeia leve dos isotipos kappa ou lambda, alvos esses que estão sempre presentes em duplicado numa imunoglobulina intacta.

Noutra forma de realização, aquele pode ser um epítopo que está presente duas vezes na parte Fc da imunoglobulina, ou dois epítopos diferentes que estão presentes na parte Fc e simultaneamente acessíveis para interação com a molécula de ligação VHH.

Ainda noutra forma de realização, os materiais imunoadsorventes podem compreender combinações de 23 anticorpos de ligação de kappa ou lambda com anticorpos de ligação de Fc, preferencialmente anticorpos VHH camelídeos, normalmente desprovidos de uma cadeia leve. A utilização de agentes de ligação de imunoglobulina específicos para epítopos presente pelo menos duas vezes na imunoglobulina alvo resulta numa diminuição surpreendente da velocidade de dissociação de 10 vezes até mais de 1000 vezes nalguns casos, como se demonstra na secção de exemplos para os anticorpos de ligação de kappa A diminuição da velocidade de dissociação é útil para processos de isolamento e purificação, já que a capacidade de ligação dinâmica dos materiais imunoadsorventes (ou taxa de retenção) é dramaticamente aumentada pela menor dissociação. Em segundo lugar, as imunoglobulinas podem ser ainda eluídas em condições suaves, o que é crucial para manter a sua integridade estrutural e propriedades de ligação de antigénio.

Neste documento e nas suas reivindicações, o verbo "compreender" e suas conjugações são utilizados no seu sentido não limitativo para significar que os itens que seguem a palavra estão incluídos, mas não estão excluídos os itens não especificamente mencionados. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que esteja presente mais do que um elemento, a menos que o contexto exija claramente que seja um e apenas um elemento. Assim, o artigo indefinido "um" ou "uma" significa geralmente "pelo menos um". A invenção é ilustrada pelos exemplos que se seguem.

Descrição das figuras 24

Figura 1 Alinhamentos dos VHHs de ligação à cadeia leve lambda humana e kappa humana e consenso para as regiões CDR.

Figura 2 Sensorgramas de medições de afinidade Biacore; curvas de ligação de Fab e IgG em Biacore num circuito integrado sensor revestido com VHH kappa-l-Hu (A; ligação e dissociação, B; apenas dissociação, indicando o efeito na velocidade de dissociação (kdiss) induzida pela avidez. Figura 3 Sequências de aminoácidos da CDR de moléculas VHH de ligação à cadeia leve kappa humana.

Figura 4 Sequências de aminoácidos da CDR de moléculas VHH de ligação à cadeia leve lambda humana.

Exemplos

Exemplo 1: Geração de ligandos VHH de Lama contra cadeias leves kappa de anticorpos humanos. 0 protocolo que se segue é tomado como um exemplo de como os fragmentos VHH específicos podem ser isolados, clonados, expressados, em seguida acoplados sobre a matriz desejada.

Apesar dos fragmentos VHH particulares descritos neste exemplo terem sido derivados de um repertório imunológico, eles também poderiam ter sido selecionados de uma biblioteca de VHH não imunizada (ver EP1051493, Unilever) ou uma biblioteca de VHH não imunizada sintética/semissintética (ver WO00/43507, Unilever).

Um lama foi imunizado com IgM policlonal preparada a partir de soro humano por técnicas de precipitação e filtração em gel e diluída em soro fisiológico tamponado com fosfato pH 7,4 (PBS). Para aumentar a especificidade da resposta imunológica, o lama recebeu vários reforços após a 25 imunização inicial (dias 0, 28 e 49) com 250 pg do antigénio mencionado acima em specol (ID-DLO, Lelystad, Países Baixos) (Boersma et al., 1992). Uma amostra de sangue de cerca de 150 mL foi colhida para heparina 6 dias após a última imunização. As células sanguíneas periféricas foram obtidas via uma centrifugação em Ficoll-Paque. A partir de cerca de 2xl08 linfócitos foi isolado o ARN total essencialmente como descrito por Chomczynnski e Sacchi (1987) . O ADN que codifica fragmentos de VHH específicos pode ser depois isolado utilizando métodos semelhantes aos descritos em WO 94/04678 (Casterman et al.) e ligado, por exemplo, num vetor de expressão epissomal de Saccharomyces cerevisiae como anteriormente descrito por Frenken et.al. (2000). A partir destas bibliotecas de expressão de VHH podem ser selecionados fragmentos VHH com a especificidade de ligação ao antigénio desejada (cadeias leves kappa ou lambda de anticorpos humanos) por rastreio direto dos sobrenadantes de cultura de colónias individuais de S. cerevisiae (Frenken et.al. 2000).

Alternativamente podem ser utilizados métodos de seleção baseados em técnicas de apresentação tipo apresentação em fago e apresentação em levedura para isolar clones que produzem VHH anti-cadeia leve kappa a partir dos repertórios imunológicos.

Para o rastreio, placas de ligação Nunc Maxisorp foram revestidas com antigénios de anticorpo humano e subsequentemente bloqueadas com leite em pó a 4% (p/v) em PBS. Os fragmentos VHH ligados foram detetados quer por um mAb anti-His de rato em combinação com um conjugado policlonal de cabra anti-rato-HRP (Bio-Rad, 172-1011) ou um soro policlonal de coelho anti-VHH de lama em combinação com um conjugado policlonal de suíno-anti-IgG de coelho-HPO 26 (Dako, P217). 0 rastreio inicial foi realizado em placas Maxisorp revestidas com um anticorpo monoclonal de IgGl humana que possuia uma cadeia leve kappa ou um mab de IgGl humana que possuia uma cadeia leve lambda. Os fragmentos VHH de lama que exibiram ligação apenas a IgGl kappa foram ainda testados em ELISA com diferentes anticorpos monoclonais humanos (por exemplo IgG, IgA, IgM) para confirmar a especificidade de ligação para a cadeia leve kappa humana. Durante o processo de rastreio puderam ser identificados fragmentos VHH adicionais que exibiram especificidade de ligação para a cadeia leve lambda humana. A especificidade de ligação de um dos fragmentos VHH anti-kappa humana (VHH kappa-l-Hu) como determinado por ELISA é dada no Quadro 1 e aqui comparada com dois outros fragmentos VHH que se ligam especificamente à porção Fc dos anticorpos de IgG humana (VHHs Fc-l-Hu e Fc-2-Hu, respetivamente). Estes fragmentos VHH foram obtidos a partir de uma biblioteca imunológica de VHH proveniente de um lama imunizado com fragmentos Fc humanos preparados a partir de IgG policlonal de soro humano. Como demonstrado no Quadro 1, o VHH kappa-l-Hu reconhece um epitopo que está presente nas cadeias leves kappa de anticorpos humanos e, portanto, liga-se a um epitopo que está presente duas vezes na molécula alvo, por exemplo, no caso de anticorpos de IgG, IgA e IgE ou dez vezes no caso de anticorpos de IgM. Ambos os fragmentos VHH Fc-l-Hu e Fc-2-Hu mostram ser específicos para um epitopo que está presente no domínio Fc de todas as 4 subclasses de IgG humana, estando o referido epitopo presente apenas uma vez na molécula alvo de IgG. A sequência destes anticorpos é apresentada na sequência ID n° 1 a 15 para os VHHs de ligação à cadeia leve kappa, n° 16 a 31 para os VHHs de ligação a lambda. 0 consenso para ambos os agentes de ligação a kappa e lambda é mostrado na Figura 1. 27

Quadro 1 Especificidade de ligação dos fragmentos VHH anti-cadeia leve kappa humana e anti-Fc de IgG humana como determinada por ELISA.

Anticorpo Espécie Isotipo / Subclasse Fragmento Kappa-Hu VHH: Fc-l-Hu Fc-2-Hu Humano IgG, lambda - + + igG2 lambda - + + IgG3 lambda - + + IgG4 lambda - + + igGi kappa + + + igG2 kappa + + + igG3 kappa + + + igG4 kappa + + + igG, fragmentos Fab + - - igG, fragmentos Fc - + + IgM (policlonal) + - - IgA (policlonal) + - - Bovino IgG (policlonal) - - - Rato IgG (policlonal - - - Produção de anticorpo e purificação por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC)

Os fragmentos de anticorpo VHH foram produzidos à escala de fermentação de 1 litro ou 10 litros (balões agitados) utilizando uma estirpe geneticamente modificada de Saccharomyces cerevisiae e purificados utilizando cromatografia de troca iónica sobre SP sepharose de caudal rápido (Amersham Biosciences) . Os anticorpos purificados foram submetidos a diálise contra três alterações de tampão de PBS, pH 7,4 ou o tampão de acoplamento necessário, 48 horas a 4°C, utilizando tubo de corte de 3,5 kDa (Spectra/Por 3; Spectrum Medicai Industries). As 28 concentrações das amostras purificadas foram determinadas por OD28o. Todas as amostras purificadas foram conservadas a -20 °C quando não estavam em utilização.

Exemplo 2 Medições da afinidade

As constantes de afinidade de ligação dos fragmentos VHH kappa-l-Hu, Fc-l-Hu e Fc-2-Hu foram determinadas utilizando análise de ressonância plasmónica superficial (SPR) num BiaCore 3000. Para este efeito, os fragmentos VHH purificados foram imobilizados sobre a superfície de um circuito integrado sensor CM5 e subsequentemente incubados com diferentes concentrações de Fab humano e/ou anticorpos de IgG humana em tampão de HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH7,4; NaCl 0,15 M; EDTA 3 mM; 0, 005% de Tensioativo P20) . A ligação foi deixada decorrer durante 3 minutos a 30 pL/min seguida de um passo de dissociação de 15 minutos a 30 pL/min. Foram ajustadas curvas de ligação de acordo com um modelo de ligação de Langmuir 1:1 utilizando o software Biacore. No Quadro 2 é dada uma visão geral dos dados de afinidade calculados. No que diz respeito ao fragmento anti-kappa-l-Hu o efeito de avidez é claramente demonstrado pelas grandes diferenças nas velocidades de dissociação entre Fab e moléculas de IgG. Uma vez que o fragmento anti-kappa-l-Hu está imobilizado sobre a superfície de um circuito integrado sensor, a referida superfície pode interagir simultaneamente com dois epítopos idênticos presentes numa molécula de IgG. Em comparação com a interação monovalente com fragmentos Fab humanos, a velocidade de dissociação (kdiss) para a IgG é significativamente menor (> 1000 vezes) resultando num valor de KD para a IgG de cerca de 120 fM que compara com 6,3 nM para os fragmentos Fab. O último valor situa-se na mesa gama que os valores de KD para o dois VHHs anti-Fc-Hu 29 (6,4 e 2,2 nM para a IgG, respetivamente) indicando interações monovalentes.

Quadro 2 Dados de afinidade Biacore de VHHs anti-kappa-l-Hu e anti-Fc-Hu (VHHs imobilizados sobre o circuito integrado sensor). VHH Antigénio k ass (1/Ms) k diss (1/s) KA (1/M) KD (M) Avidez kappa-l-Hu Fab-Hu 1,24 X 105 7, 78 X 10~4 1,60 X 108 6,27 X 10~9 Não kappa-l-Hu IgG—Hu 4,18 X 105 5, 29 X 10"8 7,90 X 1012 1,27 X 10"13 Sim Fc-l-Hu IgG-Hu 2,15 X 105 1, 39 X 10"3 1,55 X 106 6, 44 X 10“9 Não Fc-2-Hu IgG-Hu 8,30 X 105 1,78 X 10"3 4,66 X 108 2,15 X 10~9 Não

Este efeito na velocidade de dissociação (kdiss) induzida pela avidez é ainda ilustrado pela Figura 2, a qual compara as curvas de ligação de Fab e IgG em Biacore (sensorgramas).

Exemplo 3: Materiais e métodos gerais para acoplamento e avaliação por cromatografia Acoplamento a sepharose 4 de Caudal Rápido ativada com N-hldroxissuccinimida (NHS)

Após purificação, os anticorpos foram submetidos a diálise contra tampão de acoplamento com NHS. Este tampão contém HEPES 0,1 M, pH 8,3. Para uma eficiência de acoplamento ótima, a proporção recomendada de volumes da solução de acoplamento/NHS sepharose é de 0,5 : 1. Os anticorpos tinham concentrações diferentes, 0,5-15 mg/mL, a proporção de anticorpo/NHS sepharose dos anticorpos variou entre 1 : 1 e 10 : 1. Quando é imobilizada uma mistura de 2 ligandos numa matriz foi utilizada uma proporção 1:1 dos ligandos. O seguinte procedimento foi utilizado para acoplar os anticorpos a sepharose 4 de Caudal Rápido ativada com NHS (General Electric Healthcare). Subsequentemente, a matriz foi lavada duas vezes com tampão de acoplamento com NHS. A 30 NHS sepharose foi misturada com a solução de anticorpo e deixada de um dia para o outro a 4°C em agitação por rotação vertical ou 1 hora à temperatura ambiente. Após incubação, o material de gel foi filtrado sobre um filtro de vidro sinterizado e os grupos por reagir do material de gel foram bloqueados com Tris (0,1 M, pH 8,0) 1 hora à temperatura ambiente. O meio acoplado foi lavado utilizando pH baixo e alto alternado (3x 10 vc PBS pH 2 e 3x 10 vc PBS pH 7,4). A eficiência de acoplamento foi determinada utilizando a fração não ligada. Esta é determinada medindo o valor de OD280 da solução de acoplamento antes e após acoplamento. A eficiência de acoplamento foi também determinada olhando para o padrão de proteína na SDS-PAGE da solução de acoplamento antes e após acoplamento.

Experiências de cromatografia

Foram preparadas colunas a partir da matriz de anticorpo acoplado utilizando colunas HR 5/5 (GE Health). Foi utilizado um volume de coluna de 400 pL. Todas as experiências de cromatografia foram realizadas num Akta explorer 100. Foi utilizado um sistema de dois tampões, tampão AI o tampão de carga foi PBS pH 7,4, tampão B o

tampão de eluição por exemplo PBS com a adição de HC1 8 M para produzir pH 2,1 ou Glicina-HCl 0,1 M a pH 2 ou 3. Foram utilizados vários programas. A deteção da proteína foi realizada em linha seguindo o sinal de OD214 e OD28o · As frações foram recolhidas com um volume de 1 mL. As frações foram neutralizadas imediatamente com 20 pL de Tris (2 M).

Determinação da capacidade de ligação dinâmica do matriz acoplada a anticorpo 31

Para determinar a capacidade de ligação dinâmica, a coluna foi carregada com a molécula alvo. Foi utilizado um caudal de 150 cm/h. A quantidade de molécula alvo no escoamento e eluição foram calculadas por integração da área do escoamento e pico de eluição. A capacidade dinâmica é a área do pico de eluição dividida pela área de pico total (escoamento + eluição) e esta multiplicada pela quantidade de molécula alvo.

Exemplo 4: Capacidades de ligação dinâmicas de diferentes matrizes de VHH para a IgG humana

Os fragmentos VHH (ligandos) kappa-l-Hu, Fc-l-Hu e Fc-2-Hu foram imobilizados sobre NHS sepharose como descrito atrás. As densidades de ligando foram 20 mg de ligando por mL de matriz. A capacidade de ligação dinâmica foi determinada utilizando procedimentos como descritos acima. A coluna foi carregada com uma quantidade de IgG Humana superior à capacidade de ligação dinâmica esperada. A eluição foi realizada utilizando tampões de Glicina 0,1M com valores de pH entre 2 e 4.

Como se pode ver no Quadro 3, a capacidade de ligação dinâmica (DBC) mais elevada para a IgG humana é encontrada para a matriz de kappa-l-Hu e é quase 2 vezes maior em comparação com as matrizes de Fc-l-Hu e Fc-2-Hu. As medições de afinidade mostraram que a afinidade de ligação (KD) deste anticorpo para as moléculas de IgG humana (contendo 2 cadeias leves kappa idênticas) é de cerca de 120 fM. Isto é significativamente superior à afinidade de ligação efetiva da kappa-l-Hu para o seu epítopo presente nas cadeias leves kappa como determinado com os fragmentos de ligação monovalente Fab (6,3 nM) . O último valor situa-se mais na gama de ambos os fragmentos VHH específicos para o Fc humano testados e composições geralmente conhecidas da 32 técnica anterior. Isto mostra que a utilização de materiais imunoadsorventes de acordo com a invenção leva a uma maior capacidade de ligação em comparação com os sistemas que não incluem a caracteristica de ligação multivalente.

Outra caracteristica importante da presente invenção é que apesar de os ligandos de ligação multivalente levarem a afinidades de ligação elevadas para a molécula alvo, a libertação das referidas moléculas pode ser ainda obtida em condições de eluição suaves. Como se demonstra no Quadro 3, o pH ótimo de eluição para a matriz de Fc-2-Hu é inferior (pH 2) em comparação com as matrizes de kappa-l-Hu e Fc-1-Hu (ambas pH 3). A força de ligação do fragmento Fc-2-Hu ao seu epitopo na IgG humana é quase 3 vezes maior em comparação com Fc-l-Hu e kappa-l-Hu (2,2 nM contra 6,4 nM e 6,3nM, respetivamente). Apesar de a ligação multivalente da matriz de kappa-l-Hu aumentar a capacidade de ligação dinâmica para a IgG humana em comparação com, por exemplo, a matriz de Fc-l-Hu, esta caracteristica de avidez claramente não afeta as condições para obter uma libertação eficiente da IgG ligada. As referidas condições são comparáveis àquelas dos sistemas que não incluem a caracteristica of ligação multivalente (por exemplo matriz de Fc-l-Hu).

Os resultados como mencionados neste exemplo são medidos com uma altura de leito baixa e um tempo de residência curto. Alturas de leito maiores aumentarão o tempo de residência e a capacidade dinâmica. A capacidade dinâmica da coluna de kappa-l-Hu descrita a uma altura de leito de 15 cm e um caudal linear de 150cm/h é de 30 a 40 mg de IgG Humana/mL de matriz. Isto é cerca de duas vezes superior à capacidade de sistemas conhecidos que não incluem a caracteristica de ligação multivalente, a qual é especifica para a presente invenção. 33

Além disso, o exemplo demonstra que o princípio multivalente da presente invenção permite uma combinação única de alta capacidade de ligação por um lado e condições de eluição suaves por outro lado.

Quadro 3 Comparação da capacidade de ligação dinâmica (DBC) de matrizes anti-IgG Humana.

Matriz Densidade de Ligando DBC (mg IgGHu/mL) pH de eluição que origina >90% de libertação da IgG KD para IgGHu (mg/mL) ligada (M-l) kappa- 1-Hu 20 24 3 1,27 X 10“13 Fc-l-Hu 20 14 3 6,44 X 10~9 Fc-2-Hu 20 15 2 2,15 X 10~9

Exemplo 5: Capacidades de ligação dinâmicas de matrizes para IgG humana compreendendo VHHs que se ligam a epítopos diferentes presentes na molécula alvo

Este exemplo demonstra a característica de maior capacidade de ligação induzida pela ligação multivalente utilizando pelo menos dois ligandos de VHH diferentes, em que cada ligando reconhece um epítopo diferente na molécula alvo, neste caso anticorpos de IgG humana.

Para este efeito foram utilizados dois ligandos anti-Fc de IgG humana (Fc-l-Hu e Fc-2-Hu) , em que cada ligando se liga a um epítopo diferente presente no domínio Fc dos anticorpos de IgG humana como demonstrado pela análise de ligação Biacore (ver Quadro 4). Nesta experiência Biacore, ligandos anti-Fc de IgG humana purificados foram imobilizados sobre a superfície de um circuito integrado sensor CM5 e subsequentemente incubados com fragmentos Fc humanos. Este passo de captura de Fc humano foi seguido de 34 incubação com ligando VHH Fc-l-Hu ou Fc-2-Hu. 0 Quadro 4 mostra que o ligando VHH Fc-2-Hu pode ligar-se aos fragmentos Fc humanos quando capturado pelo ligando VHH Fc-l-Hu imobilizado e vice versa (51 RU e 181 RU, respetivamente) o que demonstra que cada ligando se liga a um epitopo diferente presente no domínio Fc dos anticorpos de IgG humana. Não foram obtidos sinais de ligação significativos nesta experiência utilizando pares ligandos idênticos, o que indica que cada ligando individual se liga a um epitopo no domínio Fc de anticorpos de IgG humana que está presente ou disponível apenas uma vez.

Quadro 4 Sinais de ligação de VHHs anti-Fc-Hu em fragmentos Fc humanos capturados em Biacore.

Experiência Biacore: VHH Imobilizado Alvo de captura (100 pg/mL) VHH anti-Fc-Hu (100 pg/mL) Sinal de Ligação (RU) Fc-l-Hu Fc Humano Fc-l-Hu 6, 0 Fc-l-Hu Fc Humano Fc-2-Hu 51, 0 Fc-2-Hu FC Humano Fc-2-Hu 9, 6 Fc-2-Hu Fc Humano Fc-l-Hu 181, 9

Isto ilustra ainda mais que apesar dos anticorpos de IgG consistirem de duas cadeias pesadas e leves idênticas, os ligandos dirigidos contra os anticorpos podem reconhecer epítopos que são formados por uma combinação de cadeias idênticas tais como presentes no domínio Fc dos referidos anticorpos. Outra característica que pode ocorrer é que o ligando liga-se a um parte da cadeia pesada do domínio Fc de tal forma que impede a ligação de outro ligando idêntico devido a impedimento estérico. A este respeito, os domínios de cadeia leve dos anticorpos (por exemplo anti-cadeias leves kappa humanas) como 35 demonstrados no Exemplo 4, provaram ser epítopos ideais para gerar ligandos específicos contra para permitir a ligação multivalente a um epítopo que está presente duas vezes no caso de anticorpos. Os referidos ligandos são claramente não afetados por esta característica de impedimento estérico.

Foram construídos três lotes diferentes de matrizes Fc anti-IGg humana (Fc-l-Hu, Fc-2-Hu e Fc-l-Hu/2) sobre NHS sepharose utilizando métodos como anteriormente descritos. Para cada matriz a densidade de ligando final foi de 2 mg de ligando por mL de matriz. A capacidade de ligação dinâmica foi determinada utilizando o procedimento como anteriormente descrito. A coluna foi carregada com uma quantidade de IgG humana superior à capacidade de ligação dinâmica esperada. Como se pode observar no Quadro 5, a capacidade de ligação dinâmica para a matriz mista Fc-1/2-Hu é superior a cada uma das matrizes individuais. A capacidade de ligação dinâmica para a matriz mista (2,45 mg IgG humana/mL de matriz) é 1,5 vezes superior ao valor médio das matrizes individuais (1,65 mg de IgG humana / mL de matriz) que no máximo poderia ser esperado quando não ocorresse qualquer ligação multivalente na matriz mista. Com base no princípio da ligação multivalente da presente invenção, estes resultados demonstram que podem ser obtidas matrizes com alta capacidade de ligação utilizando combinações de diferentes ligandos, em que cada ligando liga-se a um epítopo diferente presente na molécula alvo.

Quadro 5 Comparação da capacidade de ligação dinâmica (DBC) de matrizes mistas anti-IgG humana.

Matriz Mista Densidade de Ligando (mg/mL) DBC (mg IgGHu/mL) Fc-l-Hu 2 1, 95 Fc-2-Hu 2 1,35 36

Matriz Mista Densidade de Ligando (mg/mL) DBC (mg IgGHu/mL) Fc-l-Hu / Fc-2-Hu 2 2,45

Exemplo 6: Capacidades de ligação dinâmicas de matrizes para albumina de soro humano compreendendo VHHs que se ligam a epítopos diferentes presentes na molécula alvo

Este exemplo demonstra a caracteristica de maior capacidade de ligação induzida pela ligação multivalente utilizando pelo menos dois ligandos VHH diferentes, em que cada ligando reconhece um epitopo diferente na molécula alvo, neste caso albumina de soro humano.

Para este efeito foram utilizados três ligandos VHH específicos (HSA-1, HSA-2 e HSA-3) diferentes anti-albumina de soro humano (HSA). Estes ligandos VHH foram obtidos a partir de uma biblioteca imunológica de VHH proveniente de um lama imunizado com albumina de soro humano. A análise de ligação em Biacore de acordo com métodos como anteriormente descritos revelou que os ligandos HSA-2 e 3 se ligam ao mesmo epitopo presente na HSA, enquanto que o ligando HSA-1 se liga a um epitopo diferente permitindo uma ligação multivalente de HSA quando o ligando VHH HSA-1 é utilizado em combinação com o ligando VHH HSA-2 ou 3.

Foram construídos cinco lotes diferentes de matrizes anti-HSA (HSA-1, HSA-2, HSA-3, HSA-1/2 e HSA-2/3) sobre NHS sepharose utilizando métodos como anteriormente descritos. Para cada matriz a densidade de ligando final foi 2 mg de ligando por mL de matriz. A capacidade de ligação dinâmica foi determinada utilizando o procedimento como anteriormente descrito. A coluna foi carregada com uma quantidade de HSA superior à capacidade de ligação dinâmica esperada. Como se pode ver no Quadro 6, a capacidade de 37 ligação dinâmica para a matriz mista HSA-1/2 é maior do que para cada matriz individual e para a matriz mista HSA-1/3. A capacidade de ligação dinâmica da matriz mista HSA-1/2 é 2,14 mg de HSA/mL de matriz, o que é cerca de 1,5 vezes superior em comparação como o valor médio esperado de 1,48 mg de HSA/mL de matriz se não ocorresse qualquer ligação multivalente na matriz mista ((1,72 + 1,23)/ 2 = 1,48). A capacidade de ligação dinâmica de HSA para a matriz mista HSA-2/3 é 0,83 mg de HSA/mL de matriz. Isto está em consonância com o valor médio esperado de 0,85 mg de HSA/mL de matriz, uma vez que ambos os ligandos se ligam ao mesmo epitopo presente na HSA e, por conseguinte, não podem induzir a ligação multivalente que leva a uma maior capacidade de ligação como demonstrado pela presente invenção.

Quadro 6 Comparação da capacidade de ligação dinâmica (DBC) de matrizes mistas anti-HSA.

Matriz Mista Densidade de Ligando (mg/mL) DBC (mg de HSA/mL) HSA-1 2 1,72 HSA-2 2 1,23 HSA-3 2 0,46 HSA-1/2 2 2,14 HSA-2/3 2 0,83

Referências

Boersma, W.J.A., Bogaerts, W.J.C., Bianchi, A.T.J., Claassen, E., 1992. Adjuvant properties of stable water-in-oil emulsions: evaluation of the experience with specol. Res. Immunol. 143, 503-512. 38

Chomczynnski, P., Sacchi, N., 1987. Single step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate- phenolchloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159. Frenken G.J., Richard H.J. van der Linden, Pim W.J.J. Hermans, J. Wil Bos a, Robin C. Ruuls, Bernard de Geus, C. Theo Verrips, 2000, Journal of Biotechnology 78, 11-21.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Unilever N.V. / BAC Unilever N.V. <120> Método para purificação por afinidade <130> P6004885 pct / T7116 <160> 33 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Lama glama <4 0 0> 1 39

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Arg Thr Ile Ser Arg Tyr 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai 45

Ala Vai Ala Arg Arg Ser Gly Asp 50 55

Gly Ala Phe Tyr Ala Asp Ser Vai 60

Gin Gly Arg Phe Thr Vai Ser Arg 65 70

Asp Asp Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro 85

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Ile Asp Ser Asp Thr Phe Tyr Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Lama glama <400> 2

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15 40

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Thr Gly Leu Thr Phe Ser Gly Vai 20 25 30

Ala Met Ala Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai 35 40 45

Ala Ile Ile Arg Trp Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Ala 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ala Asp Pro Ser Asp Arg Phe Gly Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Arg 100 105 HO

Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Lama glama <400> 3

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Ser Arg Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai 35 40 45

Ala Vai Ala Arg Arg Ser Gly Asp Gly Ala Phe Tyr Ser Asp Ser Ala 50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Vai Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 41

Ala Ile Asp Ser Ser Thr Asp Tyr Thr Gly Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Lama glama <400> 4

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Arg Thr Ile Ser Arg Tyr 25 30

Ala Vai Ser Trp Phe Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai 45

Ala Vai Ala Arg Arg Thr Gly Asp 50 55

Gly Ala Phe Tyr Ser Asp Ser Ala 60

Glu Gly Arg Phe Thr Vai Ser Arg 65 70

Asp Asp Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro 85

Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Ile Asp Ser Ser Thr Phe Tyr 100

Thr Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ser

Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser 115 120 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Lama glama <400> 5 42

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Ser Arg Tyr 20 25 30

Ala Leu Ser Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai 35 40 45

Ala Vai Ala Arg Arg Ser Gly Asp Gly Ala Phe Tyr Ser Asp Ser Ala 50 55 60

Gin Gly Arg Phe Thr Vai Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ile Asp Ser Asp Thr Phe Tyr Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Lama glama <400> 6 43

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser 1 5

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 20

Thr Met Ala Trp Phe Arg Gin 35

Ala Arg Vai Asp Trp Ser Gly 50 55

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 65 70

Leu Gin Met Asp Ser Leu Lys 85

Ala Ala Gly Pro Tyr Trp Gly 100 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Lama glama <400> 7

Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 10 15 Ala Ser Asp Arg Tyr Phe Ser Ser His 25 30 Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai 40 45 Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Vai 60 Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 75 80 Pro Glu Asp Ala Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95 Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 105 110 44

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Vai Asp 20 25 30

Ile Met Tyr Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Arg Vai 35 40 45

Gly Ser Met Tyr Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Vai Asp Ser Vai Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asp Ser Thr Asp Asn Ala Lys Arg 65 70 75 80

Ile Thr Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Gin Pro Glu Asp Thr Ala Vai 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Ala Gly Ser Phe Tyr Trp Gly Ser Gly Thr 100 105 110

Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Lama glama <400> 8

Gin Vai Gin Leu Gin Asp Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Ser Vai Ala Trp Phe Arg Gin Vai Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Vai 35 40 45 Ala Ser Ile Asn Arg Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Ile Glu Asp Ser Vai 50 55 60 45

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Asn Thr Lys Ser Thr Ile Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Leu Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ala Pro Tyr Gly Leu Gly Arg Tyr Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 HO

Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 9 <211> 118 <212> PRT <213> Lama glama <400> 9

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Vai Asp 20 25 30

Ile Met Tyr Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Arg Vai 35 40 45

Ala Ser Met Phe Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Vai Asp Ser Vai Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asp Ser Thr Asp Asn Ala Lys Arg 65 70 75 80

Ile Thr Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Gin Pro Glu Asp Thr Ala Vai 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Ala Gly Ser Phe Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 10 46 <211> 113 <212> PRT <213> Lama glama <400> 10

Gin Vai Gin Leu Gin Asp Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Phe Ser Vai Tyr 20 25 30 Thr Vai Ala Trp Phe Arg Gin Thr Pro Gly Gly Lys Glu Arg Glu Phe 35 40 45 Vai Ala Gin Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Vai Lys Gly Arg Phe Thr Vai Ser Arg Asp Asn Vai Lys Asn Thr Vai 65 70 75 80 Phe Leu Gin Met Ser Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Gly Ser Asn Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser 100 105 110

Ser <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Lama glama <4 0 0> 11 47

Gin Vai Gin Leu Gin Asp Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Thr His 20 25 30

Thr Met Ala Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Gin Glu Arg Glu Phe Vai 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Trp Asn Gly Ala Vai Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ala Gly Arg Asn Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 100 105 no <210> 12 <211> 121 <212> PRT <213> Lama glama <400> 12 48

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30

Ala Met Ala Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai 35 40 45

Ala Vai Ile Arg Arg Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Ala 50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ala Asp Vai Ser Asp Asp Asn Thr Gly Lys Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <4 0 0> 13

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ile His 20 25 30 49 Leu Met Ala Trp Phe Arg 35

Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg 40 45

Ala Ser Ile lie Trp Thr 50

Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala 55 60

Phe Tyr Gly Asp Ser Ala 65 70

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser 75

Ala Arg Asn Thr Gly Tyr 85

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 100

Ala Ala Thr Ser Leu Vai Asn 105

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin 115 <210> 14 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama

Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser 120 125

Glu Gly Asn Pro Pro 110 Ser

Phe Leu

Thr Thr

Asp Asn 80

Glu Asp 95

Thr Arg <4 0 0> 14 50

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ile His 20 25 30

Leu Met Ala Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai 35 40 45

Ala Ser Ile Ile Trp Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Gly Thr Thr 50 55 60

Phe Tyr Gly Asp Ser Ala Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asn Asp Asn 65 70 75 80

Ala Arg Asn Thr Gly Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 85 90 95

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Ser Leu Glu Asn Pro Thr Arg 100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125 <210> 15 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 15 51

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vâl Gin Ala Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ile His 20 25 30

Leu Met Ala Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai 35 40 45

Ala Ser Ile Ile Trp Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Gly Thr Thr 50 55 60

Phe Tyr Gly Asp Ser Ala Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asn Asp Asn 65 70 75 80

Ala Arg Asn Thr Gly Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 85 90 95

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Ser Leu Glu Asn Pro Thr Arg 100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125 <210> 16 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <4 0 0> 16

Gin Vai Gin Leu Gin Asp Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Vai 35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr 52 50 55 60

Ala Asp Ser 65 Asn Thr Vai Vai Tyr Tyr Ser Tyr Phe 115

Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 85 90 35

Cys Ala Ala Arg Leu Phe Gly Vai Ala Thr Thr Asp Pro 100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 120 125 <210> 17 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <4 0 0> 17

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile 35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Ser Asp Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ala Arg His Tyr Gly Leu Cys Vai Vai Asp Arg Ala Tyr Tyr Ala 100 105 HO

Met Gly Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Pro Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125 53 <210> 18 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <400> 18

Gin Vai Gin Leu Gin Asp Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin 15 10

Pro Gly Gly 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Leu 20 25

Asp Tyr Tyr 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg 35 40 45

Glu Gly Vai

Ser Cys Met Ser Ser Ser Asp Gly Ser Ser Asp Gly Tyr 50 55 60

Thr Tyr Tyr

Glu Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 65 70 75

Asn Ala Lys 80

Asn Thr Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu 85 90

Asp Thr Ala 95

Vai Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Thr 100 105

Thr Asp Pro 110

Ser Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr 115 120 125

Vai Ser Ser <210> 19 <211> 124 <212> PRT <213> Lama glama <400> 19 54

Gin Vai Gin Leu Gin Asp Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Vai Thr Leu Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Vai 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Leu Phe Gly Vai Ala Thr Met Asp Pro Ser Tyr Phe Gly 100 105 110 Ser Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 20 55

Gin Vai Gin Leu Gin Asp Ser Gly Gly Ala Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr 20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Gly Ile 35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Asn Vai Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ala Arg His Tyr Gly Leu Cys Vai Vai Asp Arg Tyr Tyr Tyr Asp 100 105 110

Met Gly Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Pro Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125 <210> 21 <211> 130 <212> PRT <213> Lama glama <400> 21

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 56 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Vai 35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 65 70 75 80

Asn Thr Vai Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Met Ala 85 90 95

Vai Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg His Tyr Gly Leu Cys Vai Vai Asp Pro 100 105 110

Asp Tyr Tyr Gly Lys Gly Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Pro Vai Thr Vai 115 120 125

Ser Ser 130 <210> 22 <211> 124 <212> PRT <213> Lama glama <400> 22 57

Gin Vai Gin Leu Gin Asp Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Vai 45

Ser Cys Ile Ser Ser Gly Asn Ser 50 55

Tyr Thr Tyr Tyr Glu Asp Pro Vai 60

Lys Gly Arg Phe Xhr Ile Ser Arg 65 70

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro 85

Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 75 80

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Ala Arg Leu Phe Gly Vai Ala 100

Thr Met Asp Pro Ser Tyr Phe Asp 105 110

Thr Vai Ser Ser

Ser Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai 115 120 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> Lama glama <400> 23 58

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30

Phe Ala Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gin Arg Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Ile Vai Thr Ser Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Lys Thr Vai Tyr Leu 65 70 75 80

Gin Met Asn Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95

Gly Asn Phe Gly Thr Ala Leu Thr Asn Leu Ser Ala Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Gin Vai Thr Vai Thr Ser 115 <210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> Lama glama <400> 24

Gin Vai Gin Leu Gin Asp Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15 59

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30

Vai Ala Tyr Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Gly Ile Met Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Met Vai Tyr Leu 65 70 75 80

Gin Met Asn Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95

Ala Asn Vai Arg Gin Lys Ser Gly His Asn Ile Ser Ala Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 120 <212> PRT <213> Lama glama <400> 25

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30

Vai Ala Tyr Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Gly Ile Met Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Met Vai Tyr Leu 65 70 75 80

Gin Met Asn Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 60 Ala Asn Vai Arg Gin Asn Ser Gly His Asn Ile Ser Ala Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 119 <212> PRT <213> Lama glama <400> 26

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Vai Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gin Arg Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Ile Vai 50

Thr Ser Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Lys Thr Vai Tyr Leu 65 70 75 80

Gin Met Asn

Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Asn Cys Asp 85 90 95

Ala Asn Ile

Asn Ser Arg Vai Gly Arg Ile Ser Ala Arg Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 27 <211> 124 <212> PRT <213> Lama glama <400> 27 61

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala 35 40

Ser Gly Vai Thr Leu Asp Asp Tyr 25 30

Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Vai 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asn Gly 50 55

Tyr Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Vai 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro 85

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Ala Ser Leu Phe Gly Vai Ala 100

Thr Met Asp Pro Ser Tyr Phe Gly 105 110

Thr Vai Ser Ser

Ser Trp Gly Arg Gly Thr Gin Vai 115 120 <210> 28 <211> 123 <212> PRT <213> Lama glama <400> 28 62

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile 35 40 45

Ser Cys Vai Ser Ser Ser Asp Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80

Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Ala Arg Leu Trp Gly Leu Cys Ala Vai Asp Glu Ala Tyr Phe Thr Ser 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 29 <211> 123 <212> PRT <213> Lama glama 120 <400> 29 63

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Ala Gly Gly Ser 15 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 20 25 30

Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Vai Ser 35 40 45

Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly His Thr Tyr Ser Vai Asp Ser Vai Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr Leu 65 70 75 80

Gin Met Asn Ser Leu Gin Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Ala Arg Arg Trp Gly Leu Cys Thr Vai Asp Vai Pro Tyr Phe His Ser 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 128 <212> PRT <213> Lama glama <400> 30

Gin Vai Gin Leu Gin Asp Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Lys Asp Tyr 20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Vai 35 40 45 64 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Ser Asp 50 55

Gly Trp Thr Tyr Tyr 60

Ala Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 65 70 75

Arg Asp Asn Ala Lys 80

Asn Thr Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys 85 90

Pro Glu Asp Thr Ala 95

Vai Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Leu Phe Gly Vai 100 105

Ala Thr Thr Asp Pro 110

Ser Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Gin 115 120

Vai Thr Vai Ser Ser 125 <210> 31 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 31 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala 35 40 Ser Cys Ile Ser Ser Asn Val Gly 50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70 Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro 85 Ala Ala Arg Gin Tyr Gly Leu Cys 100 Met Gly Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 115 120

Gly Ala Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr 25 30

Pro Gly Arg Glu Arg Glu Gly Ile 45

Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 60

Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 75 80

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95

Vai Vai Asp Arg Tyr Tyr Tyr Asp 105 110

Pro Vai Thr Vai Ser Ser 125 65 <210> 32 <211> 124 <212> PRT <213> Lama glama <400> 32

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr 20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Phe 35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Thr Arg Leu Phe Gly Ile Cys Thr Vai Asp Ala Gly Tyr Phe Gly 100 105 110

Ser Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 121 <212> PRT <213> Lama glama <400> 33 66

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Ala Leu Vai 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Ser Gly Ser Tyr 20 25 30 Asp Met m «r vja y iJ-JJ Phe Arg Gin Arg Pro Gly T .,*** ±jy o UJ. lai Arg Glu Phe Vai 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ile Ile Glu Tyr Ser Gly Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Ser Cys 85 90 95 Ala Ala Tyr Arg Leu Thr Ala Asp Ala Tyr Asn Phe Arg Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES Método de purificação de uma imunoglobulina, em que: a) o método compreende o passo de ligar a imunoglobulina a um material imunoadsorvente que compreende pelo menos um agente de ligação mono-específico ; b) o agente de ligação tem afinidade para pelo menos dois epitopos na imunoglobulina que estão espacialmente separados por pelo menos 30 angstrom; e c) o agente de ligação mono-especifico é um domínio variável de um anticorpo que pode ser obtido a partir de um camelídeo que consiste apenas de cadeias pesadas e que está naturalmente desprovido de cadeias leves. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a avidez do material imunoadsorvente para a imunoglobulina é pelo menos 50 vezes superior à afinidade mais baixa de um agente de ligação para um epítopo individual. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o material imunoadsorvente compreende um primeiro agente de ligação com afinidade de ligação para um primeiro epítopo na imunoglobulina e um segundo agente de ligação com afinidade de ligação para um segundo epítopo na imunoglobulina e em que o primeiro e segundo epitopos são epitopos imunologicamente distintos. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os pelo menos dois epitopos são pelo menos dois epitopos 2 imunologicamente idênticos que estão repetidos na imunoglobulina.
2. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o agente de ligação compreende um domínio variável derivado de imunoglobulina que compreende um sítio de ligação de antigénio completo para um epítopo na imunoglobulina numa única cadeia polipeptídica e de acordo com o que as sequências de aminoácidos estruturais do domínio variável têm pelo menos 50% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos estrutural de qualquer uma de SEQ ID NO 1 - 33.
3. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os pelo menos dois epítopos estão fora das CDR da imunoglobulina.
4. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que pelo menos um epítopo está presente na cadeia leve da imunoglobulina.
5. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os pelo menos dois epítopos são epítopos de uma imunoglobulina humana.
6. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que os epítopos são epítopos de uma cadeia leve de imunoglobulina humana do isotipo kappa ou lambda.
7. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o agente de ligação é selecionado do grupo de moléculas VHH de ligação à cadeia leve kappa selecionadas das SEQ ID NO 1 - 15 ou um agente de ligação compreendendo um domínio variável derivado de imunoglobulina 3 compreendendo uma Região Determinante de Complementaridade (CDR) 1, 2 e/ou 3 exibindo pelo menos 80, 85, 90, 95, 98% de identidade de aminoácidos com as CDRs das moléculas VHH de SEQ ID NO 1 - 15.
8. 11. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o agente de ligação é selecionado do grupo de moléculas VHH de ligação à cadeia leve lambda selecionadas das SEQ ID NO 16 a 33 ou um agente de ligação compreendendo um domínio variável derivado de imunoglobulina compreendendo uma Região Determinante de Complementaridade (CDR) 1, 2 e/ou 3 exibindo pelo menos 80, 85, 90, 95, 98% de identidade de aminoácidos com as CDRs das moléculas VHH de SEQ ID NO 16 - 33.
9. 12. Método de acordo com a reivindicação 8, em que os pelo menos dois epítopos são pelo menos dois epítopos imunologicamente distintos de um domínio Fc de IgG humana.