ES2278052T5

ES2278052T5 - Formulación microbicida que comprende citral.

Info

Publication number: ES2278052T5
Application number: ES02775184T
Authority: ES
Inventors: Shimshon Ben-Yehoshua
Original assignee: State of Israel; Agricultural Research Organization of Israel Ministry of Agriculture
Current assignee: State of Israel; Agricultural Research Organization of Israel Ministry of Agriculture
Priority date: 2001-10-04
Filing date: 2002-10-03
Publication date: 2011-05-23
Anticipated expiration: 2022-10-03
Also published as: IL145767A; CA2462511C; WO2003028451A3; CN1592578A; WO2003028451A2; ATE348524T1; US7465469B2; ZA200402693B; KR20040068540A; HUP0402501A3; MA26288A1; JP2005504102A; US20040234662A1; DE60216944T3; EP1434486B1; DE60216944T2; NO20041791L; NZ532165A; ES2278052T3; JP4614658B2

Abstract

Una formulación acuosa microbicida que comprende: (i) una cantidad efectiva de al menos un componente oleoso esencial, los derivados del mismo, siendo obtenidos dichos derivados mediante exposición a luz o mediante oxidación, o sus mezclas; y (ii) al menos un estabilizador adicional seleccionado del grupo formado por (a) un emulsionante seleccionado del grupo formado por alquilaril polieter alcohol, monolaurato de polietilensorbitán, monooleato de polioxietilensorbitán, octil-fenil polieter alcohol, o mezclas de los mismos, (b) un antioxidante seleccionado del grupo formado por hidroxianisol butilado (BHA), ácido ascórbico, hidroxitolueno butilado (BHT), ácido isoascórbico, a-tocoferol, ß-caroteno, o mezclas de los mismos, y (c) un agente encapsulante seleccionado del grupo formado por almidón de maíz, maltodextrina, gel de sílice, ß-ciclodextrina, caseína, quitosana, o mezclas de los mismos.

Description

La presente invención se refiere a medios para inhibir el desarrollo microbiano. Más específicamente, la presente invención se refiere a formulaciones y métodos para inhibir el desarrollo microbiano en productos agrícolas perecederos, higiene doméstica y humana que comprenden citral junto con estabilizadores.

La pudrición de los productos agrícolas perecederos está causada por la infección microbiana. Tales productos son mantenidos típicamente durante períodos de tiempo suficientemente largos durante los cuales existen las condiciones que permiten la propagación de diferentes microorganismos y por consiguiente, muy a menudo, un alto porcentaje de los productos se llega a infectar. Además de las obvias pérdidas financieras sustanciales debidas a semejante pudrición, algunos de estos microorganismos producen metabolitos tóxicos y carcinogénicos, que son nocivos para los humanos.

El control de la infección por patógenos de los productos agrícolas perecederos se logra en la actualidad principalmente mediante la aplicación exógena de fungicidas y/o bactericidas sintéticos. No obstante, estos productos químicos sintéticos dejan residuos tóxicos en el producto. Adicionalmente, también se ha observado el desarrollo de cepas resistentes de microorganismos. Como resultado, algunos de tales fungicidas y bactericidas están siendo retirados progresivamente por las agencias reguladoras. La toxicidad residual y la retirada progresiva potencial han dado lugar al desarrollo de alternativas a los productos químicos sintéticos utilizados en la actualidad para la prevención de la pudrición.

Más abajo se describen varias alternativas. Por ejemplo, la irradiación del producto agrícola con luz ultravioleta (Ben-Yehoshua, S., Rodov, V, Kim, J. J. and Carmeli, S., 1992. Preformed and induced antifungal materials of citrus fruits in relation to the enhancement of decay resistance by heat and ultraviolet treatments. J Agric. Food Chem., 40:12171221; Rodov, V., Ben-Yehoshua, S., Kim, J. J., Shapiro, B. and Ittah, Y., 1992. Ultraviolet illumination induces scoparone production in kumquat and orange fruit and improves decay resistance. J. Amer. Soc. Hortic. Sci., 117:188-192), o la exposición del producto a levaduras antagónicas (Wilson, C. L. and Chalutz, E., 1989. Postharvest biocontrol of Penicillium rots of citrus with antagonistic yeasts and bacteria. Scientia Horticulturae, 40: 105-112). No obstante la radiación U.V. puede ser fitotóxica y el control biológico con la levadura antagónica no está todavía bien aceptado comercialmente, posiblemente debido al control inadecuado de los patógenos. Además, estos métodos tienen algunos inconvenientes y algunas autoridades sanitarias relevantes todavía no han aprobado algunos de ellos.

Los cítricos, así como varias otras plantas, poseen alguna resistencia endógena contra los patógenos debido a la producción de sustancias antimicrobianas en los tejidos de las plantas {Ben-Yehoshua, S., Rodov, V, Kim, J. J. and Carmeli, S., (1992) Preformed and induced antifungal materials of citrus fruits in relation to the enhancement of decay resistance by heat and ultraviolet treatments. J. Agric. Food Chem., 40:1217-1221; Ben-Yehoshua, S., Rodov, V, Fang, D. Q., and Kim, J. J., (1995) Preformed antifungal compounds of citrus fruit: effect of postharvest treatments with heat and growth regulators. J Agric. Food Chem. 43: 1062-1066; Rodov, V., Ben-Yehoshua, S., Fang, D. Q., and Kim, J. J., (1995) Preformed antifungal compounds of lemon fruit: citral and its relation to disease resistance. J Agric. Food Chem. 43: 1062-1066). Se ha mostrado previamente que estas sustancias incluyen componentes oleosos esenciales, que muestran un amplio rango de actividad microbiana. En las Patentes de los Estados Unidos Núms.

5.334.619 y 5.958.490 se describe el uso de algunos aceites de origen natural como agentes activos para prevenir la pudrición en productos agrícolas tras su recolección. Sin embargo sólo unos pocos de los componentes oleosos esenciales tienen actividad microbicida.

El citral [3,7-dimetil-2,6-octadienal] es un componente oleoso esencial que es producido naturalmente en varias clases de cítricos así como en algunas otras plantas tales como la citronella y el eucalipto. El citral es un aldehído insaturado de la serie de los terpenos y está compuesto de una mezcla isomérica de geranial y neral. Debido a su intenso aroma y sabor a limón, el citral se ha utilizado extensamente en las industrias de la alimentación y la cosmética. El citral está reconocido como un aditivo alimentario seguro y está aprobado para su uso en alimentación por la U.S. Food and Drug Administration. También se ha demostrado que el citral muestra un rango muy efectivo y amplio de actividad antimicrobiana y antifúngica. De hecho, Ben Yehoshua et al (1992) y Rodov et al (1995) han mostrado que el citral es el compuesto antifúngico constituyente más activo en el limón.

El limoneno 1-metil-4-(1-metiletenil)ciclohexeno (también conocido como p-menta-1,8-dieno) es otro ejemplo de un componente oleoso esencial abundante, que puede ser extraído de las glándulas del flavedo de los cítricos. En la Patentes de los Estados Unidos Núm. 4.379.168 y en la Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.951.992 se describe el uso de limoneno como insecticida y plaguicida, respectivamente. No obstante en su forma pura tiene una actividad antifúngica muy baja. Chalchat et al. (Chalchat, J.C., Chiron, F., Garry, R.Ph. and Lacoste (2000, J. Essent. Oil Res. 12, 125-134) describen la actividad antimicrobiana del hidroperóxido de limoneno contra patógenos humanos.

Aureli et al. (Aureli, P., Costantini, A. and Zolea, S., 1992. Antimicrobial activity of some plant essential oil against Listeria monocytogenes. J. Food Protection, 55:344-348) mostraron que algunos componentes oleosos esenciales tienen una fuerte actividad contra bacterias patógenas tales como Listeria y sugirieron su uso para prevenir la infección de los alimentos por Listeria.

Se han realizado varios intentos de utilizar citral para controlar la pudrición de diversos productos agrícolas. Se ha mostrado que el Citral podía reducir el deterioro del grano de la cebada con alta humedad inoculada con Aspergillus (Nandi, B., Thomke S. and Fries, N., 1977. Preservation of high moisture barley grains with citral and allyl caproate and preliminary acceptability tests with piglets. Acta Agric. Scand., 27:105-109), el arroz sin descascarar (Mallick, A.

K. and Nandi, B., 1982. Deterioration of stored rough rice. IV. Preservation and palatability of citral and propionic acid treated grains. Acta Agric. Scand., 32:177-187) y el trigo (Ghosh, J. and Nandi, B., 1985. Preservation of high moisture wheat by some antifungal volatile compounds and palatability tests with rats. Acta Agric. Scand, 35:245254). Arora y Pandey (Arora, R. and Pandey, G. N., 1977. The application of essential oils and their isolates for blue mold decay control in Citrus reticulata Blanco. J. Food Sci. and Tech. 14:14-16) informaron de que el citral, el geraniol y otros compuestos oleosos esenciales reducen la pudrición por moho azul del fruto de Citrus reticulata. El autor de la presente invención (Ben-Yehoshua, S., Rodov, V, Kim, J. J. and Carmeli, S., 1992. Preformed and induced antifungal materials of citrus fruits in relation to the enhancement of decay resistance by heat and ultraviolet treatments. J. Agric. Food Chem., 40:1217-1221) mostró que la aplicación de Citral exógeno a limones inoculados con Penicillium inhibía significativamente su pudrición.

En la mayoría de los casos de uso anterior de componentes oleosos esenciales para prevenir la pudrición de los productos agrícolas, el componente oleoso esencial se aplicó a los productos en emulsión acuosa. Si bien se logró la prevención parcial de la pudrición del producto mediante el uso de tales sustancias, los componentes oleosos esenciales, incluyendo el citral y el geraniol, todavía no se utilizan comercialmente para el control de la pudrición de productos agrícolas perecederos. Una razón importante para no utilizar esas sustancias es que su aplicación a los productos perecederos, a una concentración efectiva contra los microorganismos, causa daño a los productos, lo que causa pudrición más tarde. Por ejemplo, los aceites esenciales causan daños en la piel y cambios de color en la carne. Este daño puede ser severo y produce una pudrición significativa de los productos tratados al cabo de un período de tiempo relativamente corto. Otra razón para la pérdida de su uso comercial es su inestabilidad puesto que muchos de estos aceites esenciales son inestables y tienden a descomponerse antes de llevar a cabo su actividad bactericida.

La presente invención está basada en el hecho de que, citral, se puede utilizar como ingrediente activo en una formulación microbicida efectiva estable para la inhibición del desarrollo microbiano. En semejante formulación se evita el daño fitotóxico conocido de este componente oleoso esencial y se prolonga la estabilidad del componente oleoso esencial, produciendo una composición microbicida respetuosa con el medio ambiente.

Así un objeto de la presente invención es proporcionar una formulación acuosa microbicida novedosa que comprende: (i)una cantidad efectiva de al menos citral; y (ii)al menos un estabilizador adicional a saber, un antioxidante seleccionado del grupo formado por hidroxianisol butilado (BHA), ácido ascórbico, hidroxitolueno butilado (BHT), ácido isoascórbico, α-tocoferol, β-caroteno, o las mezclas de los mismos; y

(iii) imazalil en una concentración de 5 ppm a 100 ppm.

La concentración de aceite esencial citral en la composición microbicida acuosa es de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 1% ( v/v).

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para inhibir el desarrollo microbiano en productos agrícolas perecederos aplicando una formulación acuosa microbicida que comprende: (i)una cantidad efectiva de al menos citral; y (ii)al menos un estabilizador adicional, a saber, un antioxidante seleccionado del grupo formado por hidroxianisol butilado (BHA), ácido ascórbico, hidroxitolueno butilado (BHT), ácido isoascórbico, α-tocoferol, β-caroteno, o las mezclas de los mismos; y

(iii) imazalil en una concentración de 5 ppm a 100 ppm.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar métodos para inhibir el desarrollo microbiano en el hogar aplicando la formulación acuosa microbicida de la presente invención ya sea sola o junto con detergentes utilizados comúnmente.

Otro nuevo objeto adicional de la presente invención es proporcionar el uso de la formulación microbicida para la higiene humana donde los aceites esenciales junto con aditivos adecuados se añaden a pastillas de jabón, productos higiénicos, detergentes para lavavajillas, desinfectantes para lavados bucales o aplicaciones cosméticas.

Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar el uso de la formulación microbicida como producto nutracéutico para aliviar o tratar pequeñas infecciones causadas por microbios, así como para proporcionar efectos beneficiosos para la salud humana.

Para comprender la invención y para ver cómo se puede llevar a la práctica, se describirá ahora una realización preferida, sólo a modo de ejemplo no limitante, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Fig. 1 muestra la inducción de la producción de escoparona en limón verde maduro inyectando limoneno tratado al sol (de referencia), limoneno (de referencia) o citral al albedo o liberando los contenidos de las glándulas oleosas en limones verdes maduros. La Fig. 2 muestra el efecto de la madurez del fruto de limones sobre la producción de fitoalexinas en frutos de limón verde maduro y limón amarillo. La Fig. 3 muestra la tasa de pudrición de pomelos inoculados con Penicillium tratados mediante inmersión en formulaciones de citral, y geraniol. La Fig. 4 muestra la tasa de pudrición de limones inoculados con Penicillium tratados con una emulsión acuosa de citral estabilizada con etanol al 25%, amif 72 (hidroxianisol butilado al 20%, de galato de propilo al 6%, y ácido cítrico al 4% en propilenglicol), β-ciclodextrina y monolaurato de polioxietilensorbitán (Tween 20) en comparación con la pudrición de frutos de la misma clase con 5.000 ppm de Tween 20 sin etanol. La Fig. 5 muestra la tasa de pudrición de limones inoculados con Penicillium tratados con una emulsión acuosa de citral que comprende octil-fenil polieter alcohol (Triton X100) e hidroxianisol butilado (BHA). La Fig. 6 muestra la tasa de pudrición de limones inoculados con Penicillium tratados con una emulsión acuosa de citral que comprende monolaurato de polioxietilensorbitán (Tween 20) e hidroxianisol butilado (BHA) en comparación con la tasa de pudrición cuando se añade imazalil. (El imazalil es un fungicida, que se utiliza comúnmente para la protección tras la recolección de frutas y vegetales). La Fig. 7 muestra la tasa de pudrición de limones inoculados con Penicillium tratados con una emulsión acuosa con etanol al 25% de extracto bruto en diclorometano de flavedo de limón verde en comparación con una solución de

1.000: ppm de imazalil y etanol al 25%. La Fig. 8 muestra la tasa de pudrición de limones inoculados con Penicillium tratados con una solución acuosa con etanol al 25% de diferentes formulaciones combinadas que comprenden extracto bruto de citral, 1-octanol y diclorometano con etanol al 25% de flavedo de limón que, antes de su uso, se expuso a luz solar durante 4 horas. La Fig. 9 muestra la tasa de pudrición de limones inoculados con Penicillium tratados con una solución con etanol al 25% de 5.000 ppm de limoneno expuesto a luz solar durante 3 horas. Se comparó el efecto de la duración de la inmersión así como el número de inmersiones. La Fig. 10 muestra la tasa de pudrición de limones inoculados con Penicillium tratados con una solución acuosa de

2.500: ppm de limoneno que, antes de su uso, se irradió con UV durante tres horas y después se disolvió con etanol al 25%. Un tratamiento de inmersión de un minuto con esta solución (3UVL) se comparó con tres inmersiones consecutivas de un minuto en la misma solución con un período de una hora entre estas inmersiones (3UVL3). Estos tratamientos se compararon con una inmersión en agua o en etanol al 25%. La Fig. 11 muestra el efecto del hidroperóxido de limoneno preparado mediante fotooxidación con Rosa de Bengala sobre el porcentaje de pudrición del limón inoculado con Penicillium digitatum. La Fig. 12 muestra el efecto del hidroperóxido de limoneno preparado con un catalizador de molibdato sobre la pudrición del limón inoculado con Penicillium digitatum. La Fig. 13 muestra el efecto de la retirada del catalizador de Rosa de Bengala y la dosificación de Tween 20 sobre la fitotoxicidad del limón tratado con hidroperóxido de limoneno. La Fig. 14 muestra el efecto de la formulación de citral sobre el crecimiento de células de Staphylococcus aureus. La Fig. 15 muestra el efecto del citral y del limoneno tratado al sol sobre el crecimiento de células de Candida albicans.

Como se ha establecido antes la presente invención proporciona una formulación microbicida medioambientalmente favorable eficaz para prevenir la pudrición en productos agrícolas, en el hogar, para la higiene humana y como composición nutracéutica. La formulación microbicida acuosa comprende como ingrediente activo citral, y al menos un estabilizador adicional, a saber, un antioxidante como se ha mencionado antes. El papel del estabilizador es estabilizar el componente oleoso esencial de la descomposición antes de realizar esta acción microbicida y/o evitar y/o reducir la fitotoxicidad de este compuesto. La formulación microbicida acuosa se puede utilizar para un control y una inhibición eficaces del desarrollo microbiano. El componente oleoso esencial es bien conocido por ser componente de grado alimentario. Se debe recalcar adicionalmente que todos los componentes de la formulación microbicida acuosa son de grado alimentario, y no plantean ningún perjuicio para el organismo humano. Un amplio uso potencial concreto es para proteger productos agrícolas perecederos de la pudrición causada por los microbios. Entre los productos agrícolas se pueden incluir por ejemplo cualquier producto alimenticio fresco, que se pueda deteriorar como resultado de la infección microbiana, tales como frutas, vegetales, carne o pescado. Otros usos potenciales para la formulación apropiada pueden ser casos cualesquiera en los que se necesite una protección eficaz contra los microbios por ejemplo en el uso doméstico, la higiene corporal o como producto nutracéutico. Para el uso doméstico la formulación microbicida acuosa se puede usar sola o junto con detergentes comerciales. Para el uso de citral para la higiene corporal, se puede incorporar una cantidad efectiva de este componente oleoso esencial

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a pastillas de jabón, una formulación limpiadora, detergentes para lavar platos, lavado o composición bucal o una solución o composición desodorante. Una cantidad efectiva del componente oleoso esencial de la presente invención, citral, también puede ser parte de una composición utilizada como producto nutracéutico. Tales composiciones nutracéuticas pueden lograr dos efectos, a saber, para proteger contra las infecciones biocidas así como para producir beneficios adicionales para la salud por ejemplo, para introducir una actividad anti-cancerosa. Se ha encontrado que varias formulaciones comprenden aceites esenciales tales como citral, limoneno, geraniol, mentol, carvona, perillaldehído (solo citral se reivindica) actúan como agentes anticancerosos y reducen en nivel de colesterol y LDL. Se sabe que el citral y la citronella calman y relajan las emociones y ayudan al organismo para una función digestiva apropiada. Tales componentes oleosos esenciales son conocidos como fitonutrientes o alimentos funcionales.

Algunos de los componentes oleosos esenciales son conocidos en la técnica anterior como eficaces para combatir los microbios, especialmente en productos agrícolas. No obstante, los componentes oleosos esenciales adolecen de dos problemas inherentes, que limitaban su uso práctico hasta ahora. Un problema está asociado con su estabilidad limitada, debido al proceso de oxigenación que ocasiona la rápida desintegración de los aceites esenciales tras la exposición a oxígeno. Así, si bien se conocía su uso como potentes microbicidas, semejante uso realmente estaba limitado debido a su corta duración. El uso de cantidades bastante grandes de un aceite esencial con el fin de prolongar su efecto microbicida conduce por último al segundo inconveniente asociado con su uso: La exposición de frutas a altas concentraciones de aceites esenciales, concretamente si la mezcla no forma una verdadera solución, ocasiona el deterioro del producto.

Se ha encontrado ahora que cuando el componente oleoso esencial citral se aplica como componente activo de una composición microbicida junto con al menos un aditivo, que estabiliza el componente oleoso esencial, se obtiene una composición microbicida estable y efectiva que no causa ningún deterioro al producto. Estos aditivos se seleccionan entre antioxidantes.

El antioxidante reduce la tasa de oxidación del aceite esencial que conduce a su descomposición. Reduce adicionalmente la fitotoxicidad inherente del aceite esencial. El antioxidante se elige del grupo entre los compuestos hidroxianisol butilado (BHA), ácido ascórbico, ácido isoascórbico, α-tocoferol, hidroxitolueno butilado (BHT), βcaroteno o las mezclas de los mismos. Las concentraciones preferidas del antioxidante en la formulación de la invención se encuentran en el intervalo del 0,05% al 0,8% (p/v). El efecto del antioxidante para reducir la fototoxicidad del aceite esencial para el caso de la adición de BHA al citral se demuestra en la Tabla 1, que muestra el Indice de Manchado de la Piel, donde se debe entender que el BHA no ocasiona ningún manchado por sí mismo.

El índice de manchado de la piel se determina mediante

�� Σ(puntuación X número de frutos que dan

�� puntuación) Indice =

�� (número total de frutos)

La puntuación de manchado es 0 = sin manchas, 1 = manchas ligeras, 2 = manchas moderadas; y 3 = manchas severas.

Tabla 1. Efecto de una inmersión de 1 minuto del antioxidante BHA sobre manchas en la piel de limones mantenidos a 20ºC durante 20 días.

Citral (%): BHA (%) Indice de Manchado de la Piel

0,0
0,0: 0,10

0,5: 0,0 0,48

0,5: 0,05 0,14

0,5: 0,1 0,05

0,5: 0,3 0,00

0,5: 0,6 0,00

Citral (%): BHA (%) Indice de Manchado de la Piel

1,0: 0,0 0,90

1,0: 0,3 0,52

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Se debe observar que además del componente oleoso esencial citral, la composición microbicida puede comprender el otro biocida imazalil a una concentración muy baja. Semejante baja concentración del biocida no es suficiente para evitar el daño microbiano por sí mismo, no obstante junto con el aceite esencial de la presente invención o sus derivados, se puede evitar la pudrición microbicida. La concentración de tal plaguicida añadido es de 5 ppm a 100 ppm. El uso de semejante composición que comprende una combinación del componente oleoso esencial con una pequeña cantidad de fungicida posibilitará dos importantes beneficios:

1.: Reducir el residuo tóxico del biocida, que es una demanda importante de todas las autoridades sanitarias para todos los fungicidas tóxicos.

2.: Controlar el desarrollo de resistencia del patógeno al biocida.

Este punto específico se lograría mediante el uso de la nueva formulación con o sin el componente biocida. De hecho, el uso de un biocida diferente, que puede tener un modo de acción diferente, incluso durante un tiempo relativamente corto, se considera el modo recomendado para controlar la población resistente a los biocidas.

El componente oleoso esencial según la presente invención se puede producir sintéticamente, o pueden ser una preparación de extractos de plantas. También puede ser una preparación de aceite esencial natural purificada enriquecida con un solo componente oleoso esencial. Las preparaciones que contienen aceites esenciales naturales se pueden producir a partir de diferentes plantas tales como cítricos, citronella y eucaliptos.

Según la presente invención, se puede añadir directamente una mezcla del componente oleoso esencial con el antioxidante como composición antimicrobiana a alimentos, artículos de tocador, y artículos domésticos con fines microbicidas. Asimismo, la mezcla se puede preparar en forma de un líquido o como un aerosol añadiendo bases no tóxicas en una cantidad adecuada según se necesite, y se añaden o pulverizan con fines microbicidas.

La concentración del componente esencial de la patente necesaria para lograr un efecto puede ser determinada fácilmente por el artesano en cada caso y depende del modo de aplicación de la preparación. La cantidad efectiva oscila entre aproximadamente 0,1%-1%, particularmente 0,2-0,4%.

La formulación se puede aplicar al producto que se va a proteger en varios momentos antes y durante su almacenamiento. Cuando la formulación se aplica a frutos, se aplicará preferiblemente antes del envasado, v.g., después de la recolección. La formulación de la presente invención se puede aplicar al producto mediante cualquier método en el que el producto entrará en contacto con una cantidad efectiva de la formulación, es decir una cantidad que inhibirá su infección por microorganismos a lo largo del período de almacenamiento. Los ejemplos para los métodos de aplicación son sumergiendo, fumigando, pulverizando o aplicando espuma al fruto en el local de envasado. Otro método podría ser mediante la incorporación de estas sustancias en el interior de una emulsión cerosa. De hecho, como se ha mencionado previamente, la emulsión cerosa era un disolvente adecuado para tratar varios cítricos.

Otro método de aplicación es fumigando el fruto en una cámara relativamente impermeable al aire utilizando la volatilidad de la sustancia activa citral.

Otro posible método de aplicación se puede realizar cargando la sustancia activa en un material de gel de sílice utilizado como agente secante o como absorbente. Este material podría absorber más del 10% de su peso de la sustancia activa de los autores de la presente invención y albergarlas después como entidad encapsulada. No obstante, cuando la humedad ambiente de este material aumenta se liberan estos biocidas activos y el agua los reemplaza. Por supuesto esta es la situación en la que el fruto está incluido en una sala de almacenamiento o en cualquier contenedor que aloja productos agrícolas perecederos que está transpirando continuamente. Semejante aplicación podría producir una liberación lenta controlada del fungicida posibilitando una protección más duradera contra la pudrición.

La formulación también se puede aplicar a través de polímeros de degradación lenta, que durante su degradación liberan el componente oleoso esencial contenido en ellos sobre el producto.

Según la presente invención, el pH de la formulación oleosa es preferiblemente ácido pero también puede ser alcalino con un valor de pH de hasta 9.

Como se ha mencionado, la formulación microbicida acuosa comprende un estabilizador para disolver el al menos un componente esencial. En caso de que el estabilizador sea el etanol (no reivindicado) se muestra que el citral a una concentración del 0,2% fue mucho más eficaz inhibiendo la pudrición de naranjas de Washington cuando se aplicó como una formulación que contenía el 10%-50% de Etanol que cuando se aplicó, a la misma concentración, en una emulsión acuosa (Tabla 3, ver también el Ejemplo de Referencia 4).

Tabla 3: Efectos del citral y del etanol al 50% sobre el porcentaje de pudrición de naranjas de Washington no inoculadas (Números = % de frutos podridos).

-----Meses de Almacenamiento----

Tratamiento: 0.5 1 2 3 4

No tratados: 5 8 20 29 36

Citral al 0,2%, emulsionante al 0,02% en agua: 0 8 28 35 48

etanol al 50% en agua: 0 4 14 20 23

Citral al 0,2%, etanol al 50% en agua: 0 0 2 3 5

Imazalil, 0,2% en agua: 0 2 4 5 8

10 Además, no se produjo deterioro notable del producto, normalmente asociado con la aplicación del aceite esencial. En presencia de etanol del 10 al 50% el aceite esencial no produce deterioro fitotóxico. El deterioro no se produce ni siquiera cuando los aceites esenciales son aplicables a concentraciones relativamente altas (0,5 al 1%) conocidas en la técnica por infligir un deterioro considerable.

15 El efecto de tales formulaciones para reducir la pudrición se demuestra de este modo con todos los frutos cítricos sometidos a ensayo en todas las salas de envasado (los resultados se muestran en las tablas 3 y 4) y con frutos de mango y pimiento (datos no mostrados). El experimento con el pimiento mostró un buen control de la mayoría de los patógenos de pimiento en Israel, Botrytis cinerea y Alternaria alternata.

20 Tabla 4. Efecto del limoneno (de referencia) expuesto a tres horas de luz solar sobre la pudrición de frutos de kumquat después del almacenamiento durante 11 días a 10°C y simulación de la vida media en el estante a 20°C durante 6 días.

Tratamiento: Fin del almacenamiento

Inmersión en agua: 12,0 b

Etanol al 25%: 7,9 ab

Limoneno1: 1,6 a

15000 μL L-1 expuesto a luz solar durante 3 horas con etanol al 25% + 5000 μL L-1 de TWEEN 20.

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Un aspecto importante de esta nueva invención es que el control de la pudrición del patógeno se logra tanto por una inhibición directa del patógeno como por provocar el mecanismo endógeno de resistencia de la planta. De este modo, el limoneno tratado con sol o UV o el extracto bruto (no reivindicado) tratado al sol ejercen tanto una actividad

30 antifúngica directa como la provocación de la resistencia endógena.

En un experimento separado tanto el citral como el limoneno tratado al sol (disuelto con etanol al 25%) mostraron una notable inhibición de otro patógeno Cladosporium herbarum desarrollado sobre mazorcas de maíz inoculadas. El método convencional para controlar la pudrición en salas de envasado de cítricos comprende varios compuestos que son medioambientalmente favorables, pero no están incluidos en la presente formulación por razones técnicas.

5 Tales compuestos son sales de calcio, ácido giberélico, acetaldehído de ácido 2,4-dicloroacético, quitosana o quitosana más una baja concentración de metales tales como Zn o Cu, algunos ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico etc. Estos compuestos podrían ser parte de la formulación medioambientalmente favorable de los autores de la presente invención. De hecho, datos recientes demostraron semejante actividad. De hecho, la disminución del pH de las formulaciones por debajo de 2 o 3 ayudaba también al control del patógeno en

10 experimentos con fruta inoculada.

La invención se ilustrará ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes con la referencia ocasional a los dibujos adjuntos.

15 Ejemplo de Referencia 1 Concentración Inhibidora Mínima contra P. digiatum y Modo de acción de los aceites esenciales en comparación con el imazalil

La concentración inhibidora mínima (CIM) de más de 50 compuestos encontrados en las glándulas oleosas de frutos

20 de cítricos se evaluó (in vitro) estableciendo la concentración más baja del compuesto a la que no se producía crecimiento del patógeno (in vitro) en placas Petri. La Tabla 5 da la CIM de los compuestos más prometedores (en comparación con el imazalil). La cantidad requisito de cada uno de los compuestos que se van a someter a ensayo, disuelta en 0,5 ml de acetona, se añadió a una placa Petri (90 mm) estéril que contenía 15 ml de agar patata dextrosa (APD) fundido (50ºC) para dar una concentración final de 1 mg ml-1. La placa se agitó suavemente para

25 asegurar una distribución uniforme del compuesto de ensayo y el agar se dejó solidificar. Las placas fueron inoculadas utilizando un disco micelial (8 mm) cortado de un cultivo en placa de agar de P. digitatum que todavía no había comenzado la esporulación. Los discos miceliales se colocaron en el centro de cada placa de ensayo y después se pusieron a 24ºC. La inhibición fúngica se verificó midiendo el diámetro del crecimiento de las hifas al cabo de 7 días.

30 Se llevó a cabo un ensayo adicional (in vitro) para investigar si el modo de acción era fungicida o fungistático; el disco micelial de inóculo de la placa de análisis se transfirió una placa que contenía solo APD. Las placas se verificaron después en cuanto al crecimiento a lo largo de los 5 días siguientes. Si el crecimiento se reanudaba, el compuesto era clasificado como fungistático, y si el crecimiento no se reanudaba se clasificaba como fungicida. Los

35 resultados se muestran en las Tablas 5 y 6.

Tabla 5: Concentración Inhibidora Mínima (CIM) contra P. digitatum y Modos de Acción Tabla 6: Efectos Inhibidores de Diferentes Compuestos contra 3 especies diferentes de Patógenos de Citrus en el Análisis de Difusión en Agar In Vitro.

Compuesto de Ensayo: CIM mg ml-1 agar Modo de acción

Imazalil: <0,025 Fungicida

Decanol: 0,05 Fungistático

Octanol: 0,1 Fungicida

Nonanol: 0,2 Fungistático

Citral: 0,4 Fungicida

Cinnamaldehído: 0,4 Fungicida

Perillaldehído: 0,4 Fungicida

Perillalcohol: 0,4 Fungicida

Citronellal: 0,6 Fungistático

Terpineol: 0,8 Fungicida

Compuesto de Ensayo: CIM mg ml-1 agar Modo de acción

Carveol: 1,0 Fungistático

AREA DE INHIBICION DEL CRECIMIENTO DEL PATOGENO1 (cm2)

Compuesto: Geotrichum Candidum Penicillium italicum Alternaria citri

Imazalil: 8,3 Inhibición total 42,8

Cinnamaldehído: 24,2 Inhibición total Inhibición total

Octanal: 3,6 2,6 5,3

Decanol: 0,95 Inhibición total Inhibición total

1-Octanol: Inhibición total Inhibición total Inhibición total

Perillaldehído: Inhibición total Inhibición total Inhibición total

Citral: 10,6 Inhibición total Inhibición total

1 La inhibición total es la inhibición máxima que es 62,3 cm2

5

Método del Análisis de Difusión en Agar

Se preparó y se esterilizó agar patata dextrosa (Difco). El medio se enfrió después en un baño de agua a 50ºC antes de la inoculación mediante la adición de una suspensión de esporas de P. digitatum a 104 esporas/ml. El medio se 10 mezcló suavemente para dispersar las esporas uniformemente antes de dispensar 15 ml en cada una de las placas Petri de 90 mm de diámetro. Se pipetearon 5 mg de cada sustancia que se iba a someter a ensayo a un disco de papel de análisis Whatman para antibióticos que se colocó centralmente en la placa de agar inoculada. Las placas se incubaron a 24ºC durante 3 días. La actividad antifúngica se verificó midiendo la anchura de la zona despejada desde el borde del disco de papel al área de crecimiento fúngico. Los valores son para el radio (mm) de la zona de

15 crecimiento inhibido del patógeno sobre la placa Petri. Inhibición total significa que el crecimiento estaba completamente inhibido.

En otros experimentos (datos no mostrados) se encontró que el citral y otras formulaciones oleosas esenciales eran eficaces controlando el crecimiento del hongo P. digitatum y de la bacteria Erwinia carotovora, un patógeno

20 importante de productos agrícolas.

Ejemplo de Referencia 2.

Se recogieron pomelos sin manchas del huerto y el mismo día se clasificaron de nuevo en el laboratorio para

25 eliminar los frutos dañados. El pomelo se lavó con agua del grifo y se secó al aire. Cada fruto se inoculó después perforando su tejido de flavedo 1,5 mm de profundidad con una herramienta que incorporaba tres agujas en tres sitios diferentes. Antes de cada perforación, la herramienta se sumergió en una suspensión de esporas de Penicillium digitatum (106 esporas/ml). Los pomelos inoculados se mantuvieron a 17ºC y a una humedad relativa del 85% durante 24 horas, después de lo cual los pomelos se dividieron en seis grupos y los pomelos de cada grupo se

30 trataron sumergiéndolos durante dos minutos en: (a) agua; (b) etanol al 25%; (c) Geraniol al 0,2% en EtOH al 25%;

(d) Citral al 0,1% en EtOH al 25%, (e) Citral al 0,2% en EtOH al 25% y (f) Citral al 0,5% en EtOH al 25%.

Se midió el porcentaje de frutos podridos en cada grupo cada día después del tratamiento y los resultados se muestran en la Fig. 3.

35 Como se observa en la Fig. 3, los frutos de control (sumergidos solamente en agua) desarrollaron pudrición rápidamente alcanzando el 100% ocho días después de la inoculación. La pudrición del fruto sumergido en Etanol (EtOH) al 25% se retrasó, pero 6 días después de la inoculación comenzó un rápido aumento de la pudrición en los frutos tratados con EtOH y tres semanas después de la inoculación más del 50% de los frutos estaban podridos.

En contraste, los frutos sumergidos en Geraniol al 0,2% y Citral al 0,1-0,2% disueltos en EtOH al 25% mostraron una tasa de pudrición más baja y el día 18o después de la inoculación sólo el 20-40% de los frutos de estos grupos estaban podridos. La inhibición más eficaz de la pudrición resultó de la inmersión de frutos inoculados en Citral al 0,2% disuelto en EtOH al 25% que inhibía completamente la pudrición del fruto hasta 18 días después de la inoculación y producía sólo un 20% de frutos que mostraban pudrición tan tarde como 28 días después de la inoculación. La dosis de Citral al 0,5% era demasiado alta y en este experimento se aumentaba la pudrición debida a la fitotoxicidad.

Ejemplo de Referencia 3

Se inocularon limones como se muestra en el Ejemplo de Referencia 2 y se trataron con y sin etanol al 25% para verificar si 5.000 ppm del emulsionante Tween 20 podría estabilizar la actividad antifúngica del citral. Los resultados, mostrados en la Fig. 4, demuestran que esta concentración de Tween 20 aumenta la actividad del citral. Adicionalmente evita la fitotoxicidad que está causada usualmente por el citral si no se disolvía en etanol. Probablemente el emulsionante posibilita la formación de una emulsión microcoloidal estable, que evita la fitotoxicidad permitiendo la dispersión uniforme del citral, que es fitotóxico por sí mismo en estas concentraciones. Así, el Tween 20 combinado con el BHA antioxidante podría sustituir el etanol en la formulación.

Ejemplo de Referencia 4

Naranjas Navel Washington no inoculada se dividieron en cuatro grupos que se trataron como sigue: (a) sin tratamiento; (b) sumergidas en Etanol al 50%; (c) sumergidas en Citral al 0,2% en Emulsionante L-77 al 0,02% (emulsión acuosa); (d) sumergidas en Citral al 0,2% en Etanol al 50%; y (e) sumergidas en una solución acuosa de Imazalil al 2%.

Las naranjas se almacenaros después durante cuatro meses a 15ºC a una humedad relativa del 50-75% y se midió el porcentaje de frutos podridos en cada grupo a diferentes períodos de tiempo tras el almacenamiento. Los resultados se dan en la Tabla 3.

Como se puede observar en la Tabla 3, el porcentaje de frutos podridos tras el tratamiento con la formulación (citral al 0,2% en etanol al 50%) fue significativamente inferior que el del tratamiento o con el citral en una emulsión acuosa

o con el etanol solo. Además, los resultados con la formulación son comparables a los logrados con el imazalil. El alto nivel de pudrición en el tratamiento con citral con el 0,02% de emulsionante estuvo causado probablemente por la fitotoxicidad que se observó en este tratamiento debido a la carencia de etanol o de un nivel superior de emulsionante.

Ejemplo de Referencia 6

Los limones inoculados con Penicillium como se ha mostrado en el Ejemplo de Referencia 2 se sumergieron durante 2 minutos en una solución acuosa que comprende citral, emulsionante (Triton X100) y BHA a diferentes concentraciones. La concentración de Citral es del 1,0%. La solución de control comprendía Triton X100 al 0,5%. Los resultados se muestran en la Fig. 5. Se muestra claramente el efecto del BHA al 0,1% en el aumento de la actividad del citral para prevenir el desarrollo del patógeno.

Ejemplo 7

Los limones inoculados con Penicillium como se ha mostrado en el Ejemplo de Referencia 2 se trataron con una solución acuosa que comprendía Citral al 0,5%, BHA al 0,3%, Tween 20 e imazalil y se almacenaron a 20ºC durante un período de 21 días. Los resultados se muestran en la Fig. 6. Concentraciones de imazalil de 1 y 10 ppm fueron insuficientes para controlar completamente la pudrición. No obstante, la adición de citral al 0,5% a 10 ppm de imazalil evitó completamente la pudrición y posibilitó la reducción tanto de la dosificación como de los residuos de este efectivo pero no deseable, fungicida sintético. Además del citral a 1 ppm el imazalil no controló la pudrición adecuadamente, pero fue mucho mejor que el imazalil a 1 ppm por sí mismo.

Ejemplo 8 (ejemplo de Referencia)

Los limones inoculados con Penicillium a 104 esporas/ml se sumergieron un día después en una solución acuosa que comprendía citral y un detergente (Tween 20), otros aceites esenciales así como algunas combinaciones de los aceites esenciales más eficaces y se mantuvieron durante un período de seis días. Los resultados de la protección microbiana lograda con estos diferentes aceites esenciales se muestran en la Tabla 7. Algunos de estos aceites esenciales, particularmente el ácido cinámico, la vainillina, el octanol y mezclas de varios aceites esenciales, fueron más eficaces en estos experimentos que el citral. Adicionalmente su actividad contra P. digitatum permaneció durante más tiempo.

TABLA 7

Efecto de diversos aceites esenciales sobre el porcentaje de pudrición de frutos inoculados mantenidos durante 6 días a 20ºC

Núm.: TRATAMIENTO % Pudrición

1.: Inmersión en agua 73

2.: etanol al 25% 30

3.: 5.000 ppm de 1-octanol + EtOH al 25% + 5.000 ppm de Tween 20 7

4: 1.000 ppm de Citral + 1.000 ppm de 1-nonanol + 1.000 ppm de 1-octanol + 1.000 ppm de Carveol + EtOH al 25% + 4.000 ppm de Tween 20 7

5.: 2.500 ppm de Acido Trans-cinámico + EtOH al 25% + 2.500 ppm de Tween 20 3

6.: 2.500 ppm de 1-octanol + EtOH al 25% + 2.500 ppm de Tween 20. 10

7.: 2.500 ppm de Benzaldehído + EtOH al 25% + 2.500 ppm de Tween 20 20

8.: 2.500 ppm de Citral + EtOH al 25% + 2.500 ppm de Tween 20 13

9.: 2.500 ppm de Vainillina + EtOH al 25% + 2.500 ppm de Tween 20 7

10.: 2.500 ppm de Carveol + EtOH al 25% + 2.500 ppm de Tween 20 23

10 Ejemplo 9 (ejemplo de Referencia)

Procedimiento general para obtener un extracto bruto más activo de flavedo de limón.

Se recogió flavedo (exocarpo) de limón y se extrajo durante la noche en diclorometano, después se expuso a luz

15 solar durante aproximadamente 18 horas hasta que el color del extracto en diclorometano se volvió pardo. El flavedo se mezcló y se filtró a través de una capa de papel Whatman. La solución extraída se evaporó para eliminar el diclorometano y el licor denso se separó adicionalmente mediante cromatografía con una columna de gel de sílice 60 utilizando diclorometano como portador. Se obtuvieron dos fracciones en diclorometano, una de color verde y otra incolora, tras la cromatografía. El extracto activo bruto se aisló mediante la evaporación de la fracción en

20 diclorometano de color verde. Los limones se inocularon con Penicilliun digitatum a 104 esporas/ml se sumergieron 24 horas después de la inoculación en una solución etanólica que comprendía los compuestos positivos a la vainillina extraídos y se mantuvieron a 20ºC. El efecto de los compuestos sobre el desarrollo del patógeno en el fruto se verificó diariamente durante el almacenamiento. El efecto se muestra en la Fig. 7, para varias concentraciones (10.000, 5.000 y 2.500 ppm de extracto bruto) en comparación con el efecto logrado por una solución de etanol,

25 imazalil o agua. El extracto bruto a 10.000 ppm evitó completamente el desarrollo del patógeno. En semejante alta dosis del extracto bruto, algunos frutos mostraron algo de fitotoxicidad. No obstante se ha demostrado que esta fitotoxicidad era causada principalmente por diferentes componentes y no por los componentes antifúngicos activos puesto que la fitotoxicidad se pudo eliminar a la vez que se mantuvo la actividad biocida.

30 Se lograron resultados similares con las extracciones en hexano de limoneno.

Ejemplo de Referencia 10

Los limones inoculados con Penicillium (104 esporas/ml) se sumergieron en una solución acuosa que comprendía citral, un detergente (Tween 20), otros componentes oleosos esenciales así como un extracto bruto en diclorometano de flavedo de limón expuesto a luz solar. Se evaluó la pudrición a intervalos específicos durante un período de 20 días. Los resultados de la protección microbiana lograda con estos diferentes aceites esenciales se muestra en la Fig. 8.

La combinación de citral bruto tratado al sol y 1-octanol a concentraciones del 0,5% y el 0,25% mostraron respectivamente la inhibición del desarrollo de pudrición durante más de 20 días (Fig. 8). Estos tratamientos produjeron una pudrición de menos del 5% mientras que se encontró que la del control era mayor del 95%. Adicionalmente, se producía una pudrición del menos del 10% de los frutos tras el tratamiento con una combinación de citral al 0,25% y 1-octanol al 0,25%, o de citral al 0,25% y de extracto bruto al 0,25% tratado al sol o citral al 0,125%, extracto bruto al 0,25% tratado al sol y 1-octanol al 0,125%.

Ejemplo de Referencia 11

Se hicieron crecer células de Staphylococcus aureus de tipo salvaje (5x108, DO600 = 0,219) durante 3 horas en caldo de cultivo (cy/gp) a 37°C con 50-100 μl de diferentes concentraciones de extractos. La DO se determinó a 600 nm. La muestra 1 comprende 2.000 ppm de citral, etanol al 25% y 2.000 ppm de Tween 20. La muestra 2 comprende las mismas sustancias que la muestra 1 junto con 500 ppm de β-CD y 300 ppm de BHA de. Ambas muestras 1 y 2 inhibieron significativamente el crecimiento celular de Staphylococus aureus. Las mismas composiciones de sustancias sin citral (MUESTRAS 3,4) no inhibieron el crecimiento del patógeno (Figura 14).

Ejemplo de Referencia 12

Células de Candida albicans de tipo salvaje (1x103) se hicieron crecer en caldo de cultivo a 37ºC con 50-100 μl de diferentes concentraciones de extractos. La DO se determinó a 600 nm.

Se dieron los siguientes tratamientos en 6 tubos diferentes: TUBO 1. 2000 ppm de Citral + Etanol al 25% + 2000 ppm de Tween-20. TUBO 2. 2000 ppm de Citral + Etanol al 25% + 2000 ppm de Tween-20 + 300 ppm de BHA. TUBO 3. 2000 ppm de Limoneno tratado al sol + 2000 ppm de Tween-20. TUBO 4. 2000 ppm de Limoneno tratado al sol + etanol al 25% + 2000 ppm de Tween-20. TUBO 5. etanol al 25% + 2000 ppm de Tween-20. TUBO 6. etanol al 25% + 2000 ppm de Tween-20 + 500 ppm de β-CD + 300 ppm de BHA. Dos mil ppm de citral con etanol al 25% y 2.000 ppm de Tween 20, o las mismas sustancias junto con 500 ppm de βCD, 300 ppm de BHA, o limoneno tratado al sol disuelto en etanol al 25% o 2.000 ppm de Tween 20 inhibieron completamente el crecimiento celular de este organismo. Las mismas composiciones de sustancias sin citral o limoneno tratado al sol (Tubos 5 y 6) no inhibieron el crecimiento del patógeno (Fig. 15).

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Una formulación acuosa microbicida que comprende:

(i) una cantidad efectiva de citral.

5 (ii) al menos un estabilizador adicional, a saber un antioxidante seleccionado del grupo formado por hidroxianisol butilado (BHA), ácido ascórbico, hidroxitolueno butilado (BHT), ácido isoascórbico, α-tocoferol, β-caroteno, o las mezclas de los mismos; y (iii)imazalil en una concentración de 5 ppm a 100

10 ppm.
2.-Una formulación acuosa microbicida según la reivindicación 1, donde la concentración de citral es del 0,1% al 1%.
3.-Un método para inhibir el desarrollo microbiano que comprende la aplicación de una cantidad efectiva de una 15 formulación acuosa como se ha reivindicado en las reivindicaciones 1 o 2.
4.-Un método según la reivindicación 3 para proteger frutos y vegetales de la pudrición posterior a la recolección.