ES2278556T3 - Virus adeno asociado recombinante. - Google Patents

Abstract

Un virus hibrido de replicación defectuosa, recombinante que comprende: (a) secuencias de adenovirus que comprenden los elementos cis-5'' y 3'' de adenovirus necesarios para la replicación y encapsidación de viriones, dichas secuencias de adenovirus comprenden una eliminación funcional en el gen E1 adenovirus y una eliminación de una porción del gen E3 pero comprende un gen E2 funcional y un gen E4; (b) secuencias (AAV) de virus adeno-asociado que comprende las repeticiones terminales invertidas 5'' y 3'' (ITRs) de un AAV, dichas secuencias AAV se flanquean por los elementos cis-5'' y 3''; y (c) un transgen seleccionado operativamente ligado a secuencias que regulan su expresión en una célula objetiva, dicha secuencia reguladora y transgen se flanquean por las secuencias AAV o (b), el virus hibrido se suministra con suficientes secuencias de adenovirus para permitir la infección de una célula objetivo.

Description

Virus adeno asociado recombinante.

Esta invención fue apoyada por el National Institute of Health No. de otorgamiento P30 DK 47757. El gobierno de los Estados Unidos tiene derechos en esta invención.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el campo de vectores útiles en terapia génica somática y la producción de ésta.

Antecedentes de la invención

Los adenovirus recombinantes son capaces de suministrar niveles extremadamente altos de entrega de trasgen a virtualmente todos los tipos de células, sin importar el estado de mitosis. Los títulos altos (10^{13} unidades formadoras de placa/ml) de los virus recombinantes pueden ser fácilmente generada en 293 células (el equivalente adenovirus a líneas celulares que empacan retrovirus) y crioalmacenadas durante períodos prolongados sin pérdidas apreciables.

La limitación primaria de los virus como un vector reside en la complejidad del genoma del adenovirus. Un adenovirus humano está comprendido de un genoma de ADN de doble hebra de aproximadamente 36 kb, lineal, el cual se divide en 100 unidades de mapa (m.u.), cada una de las cuales tiene 360 bp de longitud. El ADN contiene repeticiones de terminal invertidas cortas (ITR) en cada extremo del genoma que se requiere para la replicación del ADN viral. Los productos del gen están organizados en regiones tempranas (E1 a E4) y tardía (L1 a L5), con base en la expresión antes o después de la iniciación de la síntesis de ADN viral [ver, e.g., Horwitz, Virology, 2d edit., ed. B. N. Fields, Raven Press, Ltd., New York (1990)].

Un adenovirus humano experimenta un programa altamente regulado durante su ciclo de vida viral normal [Y. Yang et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:4407-4411 (1994)]. Los viriones son internalizados mediante endocitosis mediada por receptor y transportada al núcleo donde los genes tempranos inmediatos, E1a y E1b, son expresados. En razón a que estos productos de gen temprano regulan la expresión de una variedad de genes huéspedes (que inician la célula para la producción de virus) y son centrales a la activación en cascada de los genes tempranos retrazados (por ejemplo, E2, E3, y E4) seguido por los genes tardíos (por ejemplo, L1-5), la primera generación de adenovirus recombinantes para la terapia génica se enfocó en la remoción del dominio E1. Esta estrategia fue exitosa al hacer la replicación de los vectores defectuosa, sin embargo, estudios in vivo revelaron que la expresión del trasgen era transitoria e invariablemente asociada con el desarrollo de una inflamación severa en el sitio de apuntamiento del vector [S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest., 93:1885-1893 (1994); J. M. Wilson et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4421-4424 (1988); J. M. Wilson et al, Clin. Bio., 3:21-26 (1991); M. Grossman et al, Som. Cell. and Mol. Gen., 17:601-607 (1991)].

Los virus adeno asociados (AAV) también han sido empleados como vectores. El AAV es un virus de ADN de hebra simple pequeño (ss) con una organización genómica simple (4.7 kb) que la hace el sustrato ideal para la ingeniería genética. Dos estructuras de lectura abierta codifican una serie de polipéptidos rep y cap. Los polipéptidos rep (rep78, rep68, rep62 y rep40) están involucrados en la replicación, rescate e integración del genoma AAV. Las proteínas cap (VP1, VP2 y VP3) forman el cápsido del virión. Flanqueando las estructuras de lectura abierta rep y cap en los extremos 5' y 3' están las repeticiones terminales invertidas de 145 bp (ITR), los primeros 125 bp que son capaces de formar las estructuras dúplex con forma de Y o T. La importancia para el desarrollo de los vectores AAV, los dominios rep y cap completos pueden ser escindidos y reemplazados con un trasgen terapéutico o reportero [B. J. Carter, en "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp.155-168 (1990)]. Se ha mostrado que los ITR representan la secuencia mínima requerida para la replicación, rescate, empaque, e integración del genoma AAV.

El ciclo de vida AAV es bifásico, compuesto de tanto episodios latentes como líticos. Durante una infección latente, los viriones AAV ingresan a la célula como un ssADN encapsidado, y poco después son suministrados al núcleo donde el AAV ADN se integra establemente en un cromosoma huésped sin la necesidad aparente de la división de la célula huésped. En la ausencia del virus ayudante, el genoma ss ADN AAV integrado permanece latente pero capaz de ser activado y rescatado. La fase lítica del ciclo de vida inicia cuando una célula que hospeda un provirus AAV es inoculada con una infección secundaria por un herpesvirus o adenovirus que codifica las funciones ayudantes que son reclutadas por el AAV para ayudar en su escisión de la cromatina huésped [B. J. Carter, citada anteriormente]. El ssADN parental infeccioso es expandido a la forma de replicación dúplex (RF) ADN en de una manera dependiente de rep. Los genomas AAV recatados son empacados en cápsidos de proteína preformados (simetría icosahedral de aproximadamente 20 nm de diámetro) y liberados como viriones infecciosos que tienen empacados los genomas
+ o - ssADN luego de la lisis celular.

El progreso hacia estabilizar el AAV como un vector transductor para terapia génica ha sido lento por una variedad de razones. Aunque la capacidad del AAV de integrarse en células quiescentes es importante en términos de la expresión a largo plazo de un gen de transducción potencial, la tendencia del provirus integrado a apuntar preferiblemente solamente a sitios específicos en el cromosoma 19 reduce su utilidad. Adicionalmente, las dificultades que circundan la producción a gran escala de recombinantes defectuosos de replicación. En contraste a la producción de los retrovirus o adenovirus recombinantes, los únicos medios ampliamente reconocidos para elaborar viriones AAV de transducción implican co-transfección con dos diferentes plásmidos aún de complementación. Uno de éstos contiene el minigen terapéutico o reportero en sándwich entre los dos AAV ITR que actúan cis. Los componentes AAV que son necesarios para el rescate y el subsecuente empaque de los genomas recombinantes de la progenie son suministrados en trans por un segundo plásmido que codifica las estructuras de lectura abierta virales para las proteínas rep y cap. Las células que apuntan a la transfección también se deben infectar con adenovirus suministrando así las funciones ayudantes necesarias. En razón a que la producción de AAV recombinante es dependiente del número de células que son transfectadas con los plásmidos que actúan cis y trans, es deseable utilizar un protocolo de transfección con una alta eficiencia. Para la producción a gran escala de los virus de título alto, sin embargo, los sistemas de fosfato de calcio y liposoma de alta eficiencia previamente empleados son problemáticos y sujetos a inconsistencias.

Subsiste la necesidad en la técnica para el desarrollo de vectores que solucionen las desventajas de los sistemas de vector conocido.

Resumen de la invención

En un aspecto, la presente invención suministra un virus adenovirus/AAV híbrido recombinante único, que comprenda un cápsido de adenovirus que contenga porciones seleccionadas de una secuencia de adenovirus, las secuencias AAV ITR 5' y 3' que flanquea un trasgen seleccionado bajo el control de un promotor seleccionado y otros componentes reguladores del vector convencional. Este virus híbrido se caracteriza por un suministro de trasgen de alto título a una célula huésped y la capacidad a integrarse establemente el trasgen en el cromosoma de la célula huésped en la presencia del gen rep. En una modalidad, el trasgen es un gen reportero. Otra modalidad del virus híbrido contiene un trasgen terapéutico. En una modalidad preferida, el virus híbrido tiene asociado con éste una secuencia de policatión y el gen AAV rep. Esta construcción se denomina el conjugado de virus híbrido o la partícula de infección trans.

En otro aspecto, la presente invención suministra una construcción de vector híbrido para uso en la producción del virus o la partícula viral híbrida descrita anteriormente. Este vector híbrido comprende las porciones seleccionadas de una secuencia de adenovirus, las secuencias AAV ITR 5' y 3' que flanquean un trasgen seleccionado bajo el control de un promotor seleccionado y otros componentes reguladores del vector convencional.

En otro aspecto, la invención suministra una composición que comprende una partícula viral híbrida para uso en el suministro de un gen seleccionado a una célula huésped. Tal composición se puede emplear para suministrar un gen terapéutico a una célula huésped blanco para tratar un trastorno o enfermedad genéticamente asociada.

En aún otro aspecto, la presente invención suministra un método para producir el virus híbrido al transfectar una línea celular de empaque adecuado con la construcción del vector híbrido de esta invención. En otra modalidad el método involucra co-transfectar una línea celular (una línea celular de empaque o una línea celular de no empaque) con una construcción de vector híbrido y un virus ayudante adecuado.

En un aspecto adicional, la presente invención suministra un método para producir grandes cantidades de partículas AAV recombinantes con alta eficiencia al emplear los métodos anteriores, empleando la construcción de vector híbrido de esta invención y recolectando las partículas rAAV de una línea celular de empaque transfectada con el vector.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen adicionalmente en la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de ésta.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1A es un diagrama esquemático de una construcción del vector pAd.AV.CMVLacZ[SEQ ID NO: 1], que contiene (desde la parte superior en el sentido de las manecillas del reloj) las unidades de mapa de la secuencia de adenovirus 0-1 (barra clara); el AAV ITR 5' (barra sólida); un mejorador/promotor temprano inmediato CMV (flecha achurada), un intrón SV40 (barra clara), un cADN beta-galactosidasa de E. Coli (LacZ)(línea achurada), una señal de poliadenilación SV40 (barra clara), un AAV ITR 3'(barra sólida), una secuencia de adenovirus de las unidades de mapa 9-16 (barra clara), y una porción de un plásmido derivado pBR322 (línea sólida delgada). Las enzimas de endonucleasa de restricción están identificadas por sus designaciones convencionales; y la localización de cada enzima de restricción se identifica por medio del número de nucleótido en paréntesis a la derecha de la designación de la enzima.

La Fig. 1B es un dibujo esquemático que demuestra la linearización de pAd.AV.CMVLacZ[SEQ ID NO: 1] mediante la digestión con enzima de restricción Nhel y una disposición lineal de un adenovirus digerido Clal tipo 5 con las supresiones desde mu 0-1. El área donde ocurrirá la recombinación homóloga (entre m.u. 9-16) tanto en el plásmido como en la secuencia de adenovirus se indica por líneas cruzadas.

La Fig. 1C es un dibujo esquemático que demuestra el virus híbrido Ad.AV.CMVLacZ después de la co-transfección de la pAd.AV.CMVLacZ linearizado [SEQ ID NO: 1] y el adenovirus en las 293 células seguidas por la recombinación homóloga intracelular.

La Fig. 2A-2K reportan la hebra de ADN superior del plásmido de doble hebra pAd.AV.CMVLacZ[SEQ ID NO: 1](la hebra complementaria puede ser fácilmente derivada por un experto en la técnica). Con referencia a la SEQ ID NO: 1, los nucleótidos 1-365 son las secuencias tipo 5 de adenovirus; la secuencia AAV ITR 5' cubre los nucleótidos 366-538; el promotor/mejorador CMV cubre los nucleótidos 563-1157; el intrón SV-40 cubre los nucleótidos 1158-1179; el gen LacZ cubre los nucleótidos 1356-4827; la secuencia SV-40 poly A cubre los nucleótidos 4839-5037; el AAV ITR 3' cubre los nucleótidos 5053 a 5221; los nucleótidos 5221 hasta aproximadamente el 8100 son secuencias del adenovirus tipo 5. Las secuencias restantes son secuencias no específicas/plásmido.

La Fig. 3 es una gráfica de barras que muestra la absorbancia u.v. a 420 nm del color azul de beta-galactosidasa para un control y diez clones positivos putativos (D1A a D1J) de 293 células transfectadas con el híbrido recombinante Ad.AV.CMVLacZ. Ocho de los clones expresados con altos niveles de enzima.

La Fig. 4 es un diagrama esquemático de pRep78/52 [SEQ ID NO: 2]. Este plásmido incluye un promotor AAV P5, Rep78, REp52 y una secuencia poli-A en un trasfondo de plásmido pUC18.

Las Figs. 5A-5E reportan los nucleótidos 1-4910 de la hebra de ADN superior del plásmido de hebra doble pRep78/52 [SEQ ID NO: 2] (la hebra complementaria puede ser fácilmente derivada por un experto en la técnica).

La Fig. 6 es un diagrama de flujo de la construcción de una partícula de transfección formada por un virus híbrido, una secuencia de poli-L-lisina y un plásmido que contiene el AAV rep unido.

La Fig. 7 es un diagrama de flujo del ciclo de vida del virus híbrido, en el cual una partícula de trans-infección ingresa a la célula y es transportada al núcleo. El virus no esta recubierto y el rep media el rescate del gen insertado, el cual es luego integrado en el cromosoma de la célula huésped.

Descripción detallada de la invención

La presente invención suministra un vehículo de transferencia de gen único que soluciona muchas de las limitaciones de los vectores virales de la técnica anterior. Este virus híbrido trabajado por ingeniería contiene dominios de adenovirus seleccionados y dominios AAV seleccionados así como también un trasgen seleccionado y elementos reguladores en un cápsido viral. Este virus híbrido novedoso resuelve los problemas observados con otros, virus de terapia génica convencional, en razón a que éste se caracteriza por la capacidad de suministrar niveles extremadamente altos de entrega de trasgen a virtualmente todos los tipos de célula (conferida por su secuencia de adenovirus) y la capacidad para suministrar integración de trasgen estable a largo plazo en la célula huésped (conferida por sus secuencias AAV). El virus híbrido adenovirus-AAV de esta invención tiene utilidad tanto como un vehículo de transferencia génica novedosa como un reactivo en un método de producción de AAV recombinante a gran escala.

En una modalidad preferida, se suministra una partícula de trans-infección o un conjugado de virus híbrido compuesto del virus Ad/AAV híbrido conjugado al plásmido de expresión rep por vía de un puente de poli-lisina. Esta partícula de trans-infección es ventajosa porque el vehículo de adenovirus puede crecer a título suficiente para infecciones MOI altas de un gran número de células, el genoma adenoviral es eficientemente transportado al núcleo en células no divisorias como un complejo que facilita la transducción en las células mitóticamente quiescentes, y la incorporación del plásmido rep en la partícula de trans-infección que suministra una expresión alta pero transitoria del rep que es necesaria tanto para el rescate del rAAV ADN como la integración eficiente y específica de sitio.

I. Construcción del Vector Híbrido y el Virus A. El Componente de Adenovirus del Vector y el Virus

El virus híbrido de esta invención utiliza secuencias de ácido nucleico de adenovirus como una lanzadera para suministrar un genoma recombinante AAV/trasgen a una célula blanco. La secuencia de ADN de un número de tipos de adenovirus, que incluye del tipo Ad5, están disponibles del Genbank. Las secuencias de adenovirus pueden ser obtenidas de cualquier tipo de adenovirus conocido, que incluye los tipos humanos 41 actualmente identificados [Horwitz et al, citado anteriormente]. Similarmente los adenovirus conocidos por infectar otros animales también se pueden emplear en las construcciones de vector de esta invención. La selección del tipo de adenovirus no se anticipa a limitar la siguiente invención. Una variedad de las cepas de adenovirus están disponibles del American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, o disponible por solicitud de una variedad de fuentes comerciales e institucionales. En la siguiente modalidad de ejemplo un adenovirus, tipo 5 (Ad5) se utiliza por conveniencia.

Las secuencias de ácido nucleico del adenovirus empleadas en el vector híbrido de esta invención pueden variar desde una cantidad de secuencia mínima, que requiere el uso de un virus ayudante para producir la partícula de virus híbrida, a solamente las supresiones seleccionadas de los genes de adenovirus, cuyos productos de gen suprimidos pueden ser suministrados en el proceso de producción viral híbrido mediante una célula de empaque seleccionada. Específicamente, como mínimo, las secuencias de ácido nucleico de adenovirus empleadas en el vector lanzadera pAd\Delta de esta invención son secuencias genómicas de adenovirus de las cuales todos los genes virales están suprimidos y que contienen solamente aquellas secuencias de adenovirus requeridas para empacar el ADN genómico adenoviral en una cabeza de cápsido preformada. Más específicamente, las secuencias de adenovirus empleadas son secuencias de repetición terminal invertidas 5' y 3' (ITR) que actúan cis de un adenovirus (que funcionan como orígenes de replicación) y el nativo. El dominio de empaque/mejorador 5', que contiene las secuencias necesarias para empacar los genomas Ad lineales y los elementos mejoradores para el promotor E1. De acuerdo con esta invención, la secuencia 5' del adenovirus completo que contiene el ITR 5' y la región de empaque/mejoradora se pueden emplear como la secuencia de adenovirus 5'en el virus híbrido. Éste deja la secuencia terminal (5') del genoma Ad5 útil en esta invención que cubra del bp 1 hasta aproximadamente 360 del genoma del adenovirus convencional, también denominado como unidades de mapa 0-1 del genoma viral, y generalmente va desde aproximadamente 353 a aproximadamente 360 nucleótidos de longitud. Esta secuencia incluye el ITR 5' (bp 1-103 del genoma de adenovirus); y el dominio empaque/mejorador (bp 194-358 del genoma de adenovirus). Preferiblemente, esta región 5' del adenovirus nativo se emplea en el virus y vector híbrido en forma no modificada. Alternativamente, las secuencias correspondientes de otros tipos de adenovirus pueden ser sustituidas. Estas secuencias Ad se pueden modificar para contener las supresiones, sustituciones, o mutaciones deseadas, suministrada siempre y cuando no se elimine la función deseada.

Las secuencias del adenovirus 3' del virus híbrido incluyen la secuencia ITR (3') del terminal derecho del genoma adenoviral que cubre aproximadamente el extremo bp 35,353 del genoma de adenovirus, o las unidades de mapa -98.4-100. Esta secuencia es generalmente de 580 nucleótidos de longitud. Esta secuencia completa es deseablemente empleada como la secuencia 3' del virus híbrido. Preferiblemente, la región 3' del adenovirus nativo se emplea en el virus híbrido de forma no modificada. Sin embargo, como se describió anteriormente con respecto a las secuencias 5', algunas modificaciones a estas secuencias que no afectan adversamente su función biológica pueden ser aceptables. Como se describe adelante, cuando estas secuencias de adenovirus 5' y 3' se emplean en el vector híbrido, un adenovirus ayudante que suministra todos los otros genes esenciales para la formación viral sola o con una línea celular de empaque se requieren en la producción del virus híbrido o la partícula viral.

Las modalidades alternativas del virus híbrido emplean secuencias de adenovirus además de las secuencias mínimas, pero que contienen supresiones de todo o porciones de los genes de adenovirus. Por ejemplo, el gen temprano inmediato de adenovirus E1a (que cubre el mu 1.3 a 4.5) y el gen temprano retardado E1b (que cubre el mu 4.6 a 11.2) se deben suprimir de la secuencia de adenovirus que forma una parte de la construcción del vector híbrido y del virus. Alternativamente, si estas secuencias no son completamente eliminadas, al menos una porción suficiente de las secuencias E1a y E1b se deben suprimir con el fin de hacer defectuosa la replicación del virus. Estas supresiones, sean completas o parciales, que eliminan la función biológica del gen se denominan aquí "supresiones funcionales".

Adicionalmente, toda o una porción del gen temprano retrazado de adenovirus E3 (que cubre el mu 76.6 a 86.2) se puede eliminar de la secuencia de adenovirus que forma una parte del virus híbrido. La función del E3 es irrelevante para la función y producción del virus híbrido.

Toda o una porción del gen temprano retrazado de adenovirus E2a (que cubre el mu 67.9 a 61.5) puede ser eliminada del virus híbrido. También se anticipa que las porciones de otros genes tempranos retrazados E2b (que cubren el mu 29 al 14.2) y el E4 (que cubre el mu 96.8 a 91.3) también se puede eliminar del virus híbrido y del vector.

Las supresiones también se pueden hacer en cualquiera de los genes tardíos L1 a L5, que cubren el mu 16.45 a 99 del genoma adenoviral. De manera similar, las supresiones pueden ser útiles en los genes intermedios IX que mapean entre el mu 9.8 y 11.2 y el IVa_{2} que mapea entre el 16.1 al 11.1. Pueden ocurrir otras supresiones en otros adenovirus estructurales o no estructurales.

Las supresiones anteriormente discutidas pueden ocurrir individualmente, es decir, una secuencia de adenovirus para uso en la presente invención puede contener supresiones de solamente E1. Alternativamente, las supresiones de los genes o porciones completas efectivas para destruir su actividad biológica pueden ocurrir en cualquier combinación. Por ejemplo, en un vector híbrido de ejemplo, la secuencia de adenovirus puede contener las supresiones de los genes E1 y el gen E3, o de los genes E1, E2a y E3, o de los genes E1 y E4, o de los genes E1, E2a y E4, con o sin supresión de E3 y así sucesivamente.

Entre más sean las supresiones en la secuencia de adenovirus hasta las secuencias mínimas identificadas anteriormente que caracterizan el virus híbrido, mayor la o las secuencias de los otros componentes descritos adelante a ser insertadas en el vector híbrido. Como se describió anteriormente para las secuencias de adenovirus mínimas, aquellas secuencias de gen no presentes en la porción de adenovirus del virus híbrido se deben suministrar mediante una línea celular de empaque y/o un adenovirus ayudante para generar el virus híbrido.

En un virus híbrido de ejemplo de esta invención que se describe adelante y en el Ejemplo 1, las secuencias genómicas del adenovirus presentes vienen del mu 0 al 1, del mu 9 al 78.3 y del mu 86 al 100 (las secuencias suprimidas eliminan los genes E1a y E1b y una porción del gen E3). De la información anterior, se espera que un experto en la técnica pueda construir vectores híbridos y virus que contienen más o menos de la secuencia de gen de adenovirus.

Las porciones del genoma de adenovirus en el virus híbrido permiten títulos de alta producción del virus para ser producidos, a menudo mayores de 1 x 10^{13} pfu/ml. Esto es en fuerte contraste con los títulos bajos (1 x 10^{6} pfu/ml) que han sido encontrados para el recombinante AAV.

B. Los Componentes AAV del Vector y del Virus

También parte de los vectores híbridos y los virus de esta invención son las secuencias de un virus adeno-asociado. Las secuencias AAV útiles en el vector híbrido son las secuencias virales de las cuales las secuencias que codifican el polipéptido rep y cap están suprimidas. Más específicamente, las secuencias AAV empleadas son las 5' que actúa cis y las secuencias de repetición terminal invertida 3' (ITR) [Ver, por ejemplo, B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp.155-168 (1990)]. Como se estableció anteriormente, las secuencias ITR son de aproximadamente 143 bp de longitud. Sustancialmente las secuencias completas que codifican los ITR son utilizadas en los vectores, aunque algún grado de menor modificación de estas secuencias se espera que sea permisible para este uso. Ver, por ejemplo, WO 93/24641, publicada en diciembre 9, 1993. La capacidad de modificar estas secuencias ITR son competencia del experto en la técnica. Para las técnicas adecuadas, ver, por ejemplo, los textos tales como Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual.", 2d edit., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989).

Las secuencias ITR del AAV se pueden obtener de cualquier AAV conocido, que incluye los tipos AAV humanos actualmente identificados. De manera similar, los AAV conocidos por infectar otros animales también se pueden emplear en las construcciones de vector de esta invención. La selección del AAV no se anticipa a limitar la siguiente invención. Una variedad de cepas AAV, tipos 1-4, están disponibles del American Type Culture Collection o disponibles por solicitud de una variedad de fuentes comerciales e institucionales. En la siguiente modalidad de ejemplo se utiliza un AAV-2 por conveniencia.

En la construcción del vector híbrido, las secuencias de AAV están flanqueadas por unas secuencias de adenovirus seleccionadas discutidas anteriormente. Las secuencias ITR del AAV 5' y 3' ellas mismas flanquean una secuencia de trasgen seleccionada y elementos reguladores asociados, descritos adelante. Así, la secuencia formada por el trasgen y las secuencias del AAV 5' y 3' de flanqueo se pueden insertar en cualquier sitio de supresión en las secuencias del adenovirus del vector. Por ejemplo, las secuencias AAV son deseablemente insertadas en el sitio de los genes E1a/E1b suprimidas del adenovirus, es decir, después de la unidad de mapa 1. Alternativamente, las secuencias AAV se pueden insertar en una supresión E3, una supresión E2a, y así sucesivamente. Si solamente las secuencias de adenovirus 5' ITR/empaque y las secuencias ITR 3' son utilizadas en el virus híbrido, las secuencias AAV se insertan entre ellos.

C. El Componente de Trasgen del Vector Híbrido y el Virus

La secuencia de trasgen del vector y el virus recombinante es una secuencia de ácido nucleico o un trascripto inverso de ésta, heterólogo para la secuencia de adenovirus, que codifica un polipéptido o proteína de interés. El trasgen esta operativamente ligado a los componentes reguladores de manera que permite la trascripción del trasgen.

La composición de la secuencia del trasgen dependerá del uso que será puesto al vector híbrido resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia de trasgen incluye una secuencia reportera, que luego de la expresión produce una señal detectable. Tales secuencias reporteras incluyen sin limitación un cADN (LacZ) beta-galactosidasa de E. coli, un gen alcalino fosfatasa y un gen de proteína fluorescente verde. Estas secuencias, cuando se asocian con elementos reguladores que manejan su expresión, suministran señales detectables mediante medios convencionales, por ejemplo, absorbancia de longitud de onda ultravioleta, cambio de color visible, etc.

Otro tipo de secuencia de trasgen incluye un gen terapéutico que expresa un producto de gen deseado en una célula huésped. Estos genes terapéuticos o secuencias de ácido nucleico típicamente codifican productos para la administración y expresión en un paciente in vivo o ex vivo para reemplazar o corregir un defecto genético heredado o no heredado o tratar un trastorno o enfermedad epigenético. Tales genes terapéuticos que son deseables para el desempeño de la terapia génica incluyen, sin limitación, un gen regulador de transmembrana de fibrosos cística normal (CFTR), un gen de lipoproteína de baja densidad (LDL), y un número de genes que pueden ser fácilmente por un experto en la técnica. La selección del trasgen no se considera por ser una limitación de esta invención, en razón a que tal selección está dentro del conocimiento del experto en la técnica.

D. Elementos Reguladores del Vector Híbrido

Además de los elementos principales identificados anteriormente para el vector híbrido, es decir, las secuencias de adenovirus, las secuencias AAV y el trasgen, el vector también incluye elementos reguladores convencionales necesarios para manejar la expresión del trasgen en una célula transfectada con el vector híbrido. Así el vector contiene un promotor seleccionado que está ligado al trasgen y localizado, con el trasgen, entre las secuencias ITR de AAV del vector.

La selección del promotor es asunto de rutina y no es una limitación del vector híbrido en sí mismo. Los promotores útiles pueden ser promotores constitutivos o promotores regulados (inducibles), que posibilitarán el control de la cantidad del trasgen a ser expresado. Por ejemplo, un promotor deseable es aquel del promotor/mejorador temprano inmediato de citomegalovirus [ver, por ejemplo, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)]. Otros promotores deseables incluyen, sin limitación, el promotor/mejorador LTR del virus sarcoma Rous y el promotor de \beta-actina de pollo. Aún otras secuencias promotoras/mejoradoras se pueden seleccionar por un experto en la técnica.

Los vectores también contendrán deseablemente secuencias de ácido nucleico heterólogas para las secuencias de adenovirus que incluyen secuencias que suministran las señales requeridas para la poliadenilación eficiente del trascripto y los intrones con sitios donadores o aceptadores de empalme funcional. Una secuencia poli-A común que se emplea en los vectores de ejemplo de esta invención es aquella derivada del papovavirus SV-40. La secuencia poli-A generalmente se inserta en el vector que sigue las secuencias del trasgen y antes de la secuencia ITR del AAV 3'. Una secuencia intrón común también se deriva del SV-40, y se denomina como la secuencia intrón SV-40 T. Un vector híbrido de la presente invención también puede contener tal intrón, deseablemente localizado entre la secuencia promotora/mejoradora y el trasgen. La selección de estos y otros elementos de vector común son convencionales y muchas de tales secuencias están disponibles [ver, por ejemplo, Sambrook et al, y referencias citadas aquí]. Las secuencias de ADN que codifican tales regiones reguladoras se suministran en la secuencia plásmido de la Fig. 2 [SEQ ID NO: 1].

La combinación del trasgen, promotor/mejorador, los otros elementos del vector regulatorio y el flanqueo 5' y 3' de los ITR del AAV son denominados como un "minigen" para fácil referencia aquí. Como se estableció anteriormente, el minigen esta localizado en el sitio de cualquier supresión de adenovirus seleccionada en el virus híbrido. El tamaño de este minigen depende de la cantidad y número de supresiones de la secuencia de adenovirus relacionadas anteriormente. Tal minigen puede ser de aproximadamente 8 kb de tamaño en el virus de ejemplo suprimido en los genes E1 y E3, como se describe en los ejemplos adelante. Alternativamente, si solamente se emplean las secuencias de adenovirus mínima en el virus, este minigen puede ser de un tamaño hasta de 30 kb. Así, este vector híbrido y vector permiten un gran trato de latitud en la selección de varios componentes del minigen; particularmente el trasgen, con relación al tamaño. Provisto con las enseñanzas de esta invención, el diseño de tal minigen se puede hacer al recurrir a técnicas convencionales.

E. Montaje de Vector Híbrido y Producción del Virus Híbrido

El material del cual se derivan las secuencias utilizadas en el vector híbrido, los virus ayudantes, si son necesarios, y el virus híbrido recombinante (o la partícula viral) y los varios componentes del vector y las secuencias empleadas en la construcción de los vectores híbridos de esta invención se obtienen de fuentes comerciales o académicas con base en materiales previamente publicados y descritos. Esos materiales también se pueden obtener de un paciente individual o generar y seleccionar utilizando técnicas de clonación molecular recombinante estándar conocidas y practicadas por aquellos expertos en la técnica. Cualquier modificación de las secuencias de ácido nucleico existentes que forman los vectores y los virus, que incluyen las supresiones, inserciones, de la secuencia y otras mutaciones también son generadas utilizando técnicas estándar.

El montaje de las secuencias de ADN seleccionadas de los adenovirus, el AAV y los genes reporteros o los genes terapéuticos y otros elementos de vector en el vector híbrido y el uso del vector híbrido para producir un virus híbrido utiliza técnicas convencionales, tales como las descritas en el Ejemplo 1. Tales técnicas incluyen técnicas de clonación convencional del cADN tales como aquellas descritas en los textos [Sambrook et al, citados anteriormente], el uso de secuencias de oligonucleótido traslapantes del adenovirus y los genomas del AAV, la reacción de cadena de polimeraza, y cualquier método adecuado que suministre la secuencia de nucleótido deseada. La transfección estándar y las técnicas de co-transfección son empleadas, por ejemplo, las técnicas de transfección CaPO_{4} que utilizan la línea celular 293 de riñón embriónico humano (HEK) de complementación (una línea celular de riñón humano que contiene un adenovirus funcional del gen E1a que suministra una proteína E1a de transacción). Otros métodos convencionales empleados en esta invención incluyen la recombinación homóloga de los genomas virales, plagamiento de virus en capas de agar, métodos de medición de generación de señal, y similares.

Como se describe con detalle en el Ejemplo 1 de adelante y con recurrencia a la Fig. 1, se prepara un único virus híbrido de esta invención el cual contiene un E1-suprimido, E3 suprimido parcialmente, la secuencia de adenovirus asociada con una copia simple de un AAV recombinante que tiene supresiones de sus genes rep y cap y que codifica un trasgen reportero seleccionado. En resumen, este virus híbrido de ejemplo se designó de tal forma que la secuencia AV.CMV LacZ [SEQ ID NO: 1] (un minigen que contiene un ITR de AAV 5', un promotor CMV, un intrón SV-40, un trasgen LacZ, una secuencia de poli-A SV-40 y un ITR de AAV 3') se ubiquen en lugar de los genes (Ad5) E1a/E1b tipo 5 de adenovirus, haciendo la replicación del vector de adenovirus defectuosa.

En razón de la cantidad limitada de secuencia de adenovirus presente el los vectores híbridos de esta invención, que incluyen el pAV.CMVLacZ[SEQ ID NO: 1] anterior, una línea celular de empaque o un adenovirus ayudante o ambos pueden ser necesarios para suministrar las secuencias de gen de adenovirus suficientes para que una infección viral productiva sea generada por el virus híbrido.

El virus ayudante útil en esta invención contiene las secuencias del gen de adenovirus seleccionadas no presentes en la construcción del vector híbrido o expresada por medio de la línea celular en la cual es vector híbrido es transfectado. Opcionalmente, tal virus ayudante puede contener un segundo minigen reportero que posibilita la separación del virus híbrido resultante y el virus ayudante luego de purificación. La construcción de los virus ayudantes deseables corresponde al experto en la técnica.

Como un ejemplo, si la línea celular empleada para producir el virus recombinante no es una línea celular de empaque, y el vector híbrido contiene solamente las secuencias de adenovirus mínimas identificadas anteriormente, el virus ayudante puede ser un virus Ad tipo silvestre. Así, el virus ayudante suministra los genes tempranos de adenovirus necesarios E1, E2a, E4 y todos permaneciendo como genes tardíos, intermedios, estructurales y no estructurales del genoma de adenovirus. Sin embargo, si, en esta situación, la línea celular de empaque es 293, que suministra las proteínas E1, el virus ayudante no necesita contener el gen E1.

En otra modalidad, cuando la construcción híbrida se hace defectuosa en replicación por medio de una supresión funcional en E1 pero no contiene otras supresiones en los genes Ad necesarios para la producción de una partícula viral infecciosa, y la línea celular 293 es empleada, ningún virus ayudante es necesario para la producción del virus híbrido. Adicionalmente, toda o una porción del gen temprano retrazado de adenovirus E3 (que abarca el mu 76.6 al 86.2) se puede eliminar del virus ayudante útil en esta invención porque este producto de gen no es necesario para la formación de una partícula de virus híbrido funcionante.

Se debe notar que un experto en la técnica puede diseñar otros virus ayudantes o desarrollar otras líneas celulares de empaque para complementar las supresiones de adenovirus en la construcción del vector y posibilitar la producción de la partícula de virus híbrida, dada esta información. Por lo tanto, esta invención no esta limitada al uso o descripción de cualquier virus ayudante particular o línea celular de empaque.

Así, como se describió en las Figs. 1A a 1C, el plásmido circular pAd.AV.CMVLacZ[SEQ ID NO: 1] (que contiene el minigen y solamente las secuencias de adenovirus de la unidad de mapa 0 a 1 y 9 a 16) se digirió y co-transfectó con un virus ayudante Ad5 seleccionado (que contiene las secuencias de adenovirus 9 a 78.4 y 86 a 100) en 293 células. Así, la línea celular de empaque suministra las proteínas E1 y el virus ayudante suministra todas las secuencias de gen de adenovirus necesarias subsecuentes a la unidad de mapa 16. La recombinación homóloga ocurre entre el virus ayudante y el vector híbrido, que resulta de la partícula viral híbrida. El crecimiento de esta partícula viral híbrida en 293 células ha sido cercanamente monitoreado por más de 20 rondas de amplificación y sin indicación de inestabilidad del genoma. El rescate e integración del trasgen proveniente del virus híbrido en una célula huésped y las modificaciones adicionales del vector se describen adelante. El virus híbrido resultante Ad.AV.CMVLacZ combina el alto título potencial del adenovirus con la biología integrante asociada con la latencia de AAV.

G. Conjugados de Policatión de Virus Híbrido

La expresión rep se requiere para que ocurra el rescate del genoma rAAV. Una aproximación preferida es incorporar sintéticamente un plásmido que permite a la expresión del rep en la partícula híbrida. Para hacerlos así, los virus híbridos descritos anteriormente son adicionalmente modificados al recurrir a la tecnología conjugada de adenovirus-polilisina. Ver, por ejemplo, Wu et al, J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989); y K. J. Fisher y J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49 (abril 1, 1994), incorporada aquí como referencia. Utilizando esa tecnología, el virus híbrido como se describió anteriormente se modifica mediante la adición de una secuencia de poli-catión distribuida alrededor del cápsido de la partícula viral híbrida. Preferiblemente, el poli-catión es poli-lisina, que se une alrededor del virus cargado negativamente para formar una carga positiva externa. Un plásmido que contiene el gen rep de AAV (o una porción funcional de éste) bajo el control de un promotor adecuado es luego complexado directamente al cápsido híbrido, que resulta en una partícula viral simple que contiene el virus híbrido y un gen rep de AAV. El ADN del plásmido negativamente cargado se une con alta afinidad a la polilisina positivamente cargada. Esencialmente las técnicas empleadas en construir este conjugado de virus híbrido o partícula de trans-infección son como se describe en detalle en el Ejemplo 3 adelante.

Una modalidad alternativa del vector híbrido y la partícula viral resultante se suministra al alterar el plásmido que contiene el rep y también contiene un gen cap AAV. Esta modalidad del vector híbrido cuando esta en una célula huésped es así capaz de producir una partícula AAV recombinante, como se discute con más detalle adelante.

Los plásmidos empleados en estas modalidades contienen secuencias de plásmido convencionales, que colocan una secuencia AAV seleccionada, es decir, las secuencias del gen rep y/o cap, bajo el control de un promotor seleccionado. En el ejemplo suministrado adelante, el plásmido de ejemplo es el pRep78/52[SEQ ID NO: 2], un plásmido trans-actuante que contiene las secuencias AAV que codifican las proteínas rep 78 kD y 52 kD bajo el control del promotor P5 de AAV. El plásmido también contiene una señal de poliadenilación SV-40. La secuencia de ADN de este plásmido se suministra en la Fig. 8 [SEQ ID NO: 2].

De una manera similar y con recurrencia a las secuencias del plásmido y el vector conocidas en la técnica, los plásmidos análogos pueden ser diseñados utilizando tanto los genes rep como cap, y diferentes promotores constitutivos o regulados, las secuencias poli-A opcionales y los intrones.

La disponibilidad de materiales para hacer estos virus y vectores híbridos modificados y los vectores que contiene el rep y/o cap del AAV y las técnicas involucradas en el montaje del vector híbrido y los plásmidos que contienen el rep y/o cap son convencionales como se describió anteriormente. Las técnicas de montaje para la partícula de trans-infección emplea las técnicas descritas anteriormente para el vector híbrido y las técnicas del Wu et al y Fisher et al, citadas anteriormente. El uso de esta partícula de trans-infección que incluye el rescate y la integración del trasgen en la célula huésped se describe adelante.

II. Función del Virus Híbrido A. El Virus Híbrido Infecta una Célula Blanco

Una vez que el virus híbrido o la partícula de trans-infección es construida como se discutió anteriormente, esta es apuntada a, y tomada por, una célula blanco seleccionada. La selección de la célula blanco también depende del uso del virus híbrido, es decir, si o no el trasgen va a ser replicado in vitro para la producción de una partícula AAV recombinante, o ex vivo para la producción de un tipo de célula deseado para el reenvío a un paciente, o in vivo para el suministro a un tipo de célula o tejido particular. Las células blanco pueden por lo tanto ser cualquier de mamífero (preferiblemente una célula humana). Por ejemplo, en uso in vivo, el virus híbrido puede apuntar a cualquier tipo de célula normalmente infectada por adenovirus, dependiendo de la ruta de administración, es decir, puede apuntar, sin limitación, neuronas, hepatocitos, células epiteliales y similares. La toma del virus híbrido por la célula es causada por la capacidad infecciosa contribuida al vector por el adenovirus y las secuencias de AAV.

B. El Trasgen es Rescatado

Una vez que el virus híbrido o la partícula de trans-infección es tomada por una célula, el trasgen flanqueado ITR de AAV debe ser rescatado de la estructura de adenovirus parental. El rescate del trasgen depende del suministro de la célula infectada con un gen rep de AAV. Así, la eficacia del virus híbrido se puede medir en términos del rescate mediado por rep de rAAV del molde de adenovirus parental.

Los genes rep pueden ser suministrados al virus híbrido por varios métodos. Una modalidad para suministrar las proteínas rep en trans se demostró con el virus híbrido de ejemplo Ad.AV.CMVLacZ al transfectar en monocapa blanco de células previamente infectadas con el vector híbrido, un plásmido recubierto por liposoma pRep78/52 [SEQ ID NO: 2] que contiene los genes que codifican las proteínas de 78 kDa y 52 kDa rep de AAV bajo el control del promotor P5 de AAV. El rescate y la amplificación de un monómero AAV de hebra doble y un dímero AAV de hebra doble, que contiene cada uno el trasgen LacZ descrito anteriormente, se observó en 293 células. Este se describe en detalle en el Ejemplo 2.

La producción del rep en trans se puede modular mediante la escogencia del promotor en el plásmido que contiene rep. Si los altos niveles de expresión del rep son importantes temprano para el rescate del dominio AAV recombinante, un promotor heterólogo (no adenovirus, no AAV) se puede emplear para manejar la expresión del rep y eliminar la necesidad de las proteínas E1. Alternativamente, los bajos niveles de expresión rep del P5 que ocurren en la ausencia de las proteínas E1 de adenovirus pueden ser suficientes para iniciar el rescate y óptimas para manejar la integración del genoma AAV recombinante en un uso seleccionado.

Más preferiblemente para uso in vivo, el gen rep de AAV también se puede suministrar como parte del virus híbrido. Una modalidad de este concepto de partículas simple es el virus híbrido conjugado de policatión (ver Fig. 7). La infección de esta partícula de trans-infección se logra de la misma manera y con relación a las mismas como se identificó anteriormente. El conjugado de polilisina del virus híbrido sobre el cual estaba directamente complejado un plásmido que codificaba las proteínas 78 y 52 de rep, combina todos los componentes funcionales en una estructura de partícula simple. Así, la partícula de trans-infección permite el suministro de una partícula simple a la célula, que es considerablemente más deseable para uso terapéutico. Los experimentos similares para demostrar el rescate del trasgen de la partícula de trans-infección de conjugado híbrida en 293 células y en células HeLa se detallan en el Ejemplo 4.

En otra modalidad, el virus híbrido se modifica al clonar el cADN de rep directamente en la porción del genoma de adenovirus del vector híbrido. En razón a que es conocido que aún los niveles residuales de expresión de rep pueden interferir con la replicación del ADN de adenovirus, tal incorporación de rep en el vector híbrido mismo se anticipa para requerir la posible mutación de los genes rep para codificar solamente los dominios seleccionados, y el uso de promotores inducibles para regular la expresión rep, así como también la colocación cuidadosa de los genes rep en las secuencias de adenovirus del vector híbrido.

C. El Trasgen se Integra en el Cromosoma

Una vez desacoplado (rescatado) del genoma del virus híbrido, el minigen recombinante AAV/trasgen busca un sitio de integración en la cromatina huésped y se integra con ésta, suministrando expresión estable del trasgen acompañante de la célula huésped. Este aspecto de la función del virus híbrido es importante para su uso en terapia génica. La secuencia del minigen AAV/trasgen rescatado del virus híbrido logra el estado provirus en la célula blanco, es decir, el evento final en el ciclo de vida híbrido (Fig. 7).

Para determinar si el minigen AAV rescatado del virus híbrido logra el estado de provirus en una célula blanco, las células HeLa que no expresan E1 fueron infectadas con el conjugado vector-poli-Lisina híbrido complejado con pRep78/52 [SEQ ID NO: 2] y pasado hasta que son evidentes las colonias estables de las células que expresan LacZ. Una placa duplicada de células se infectó con el mismo conjugado, pero en lugar de ser complejadas con el plásmido pRep78/52 [SEQ ID NO: 2], llevan un plásmido irrelevante. Las células que reciben la partícula híbrida que contiene rep producen un mayor número de colonias positivas LacZ estables que las células inyectadas con el vector de control. Esto indica eventos de rescate e integración múltiples en células que expresan proteínas rep. La confirmación de la integración se revela al caracterizar el genoma AAV recombinante en las células infectadas híbridas y las secuencias cromosómicas de flanqueo identificantes (ver Ejemplo 5).

III. Uso de los Virus Híbridos y las Partículas Virales en Terapia génica

El virus híbrido novedoso y las partículas de trans-infección de esta invención suministran vehículos de transferencia génica eficiente para terapia génica somática. Estos virus híbridos se preparan para contener un gen terapéutico en lugar del trasgen reportero LacZ ilustrado en el vector de ejemplo. Mediante el uso de los virus híbridos y las partículas de trans-infección que contienen los trasgenes terapéuticos, estos trasgenes se pueden suministrar a un paciente in vivo o ex vivo para suministrar la integración del gen deseado en una célula blanco. Así, estos virus híbridos y las partículas de trans-infección se pueden emplear para corregir las deficiencias o los defectos genéticos. Dos ejemplos de la generación de vehículos de transferencia de gen para el tratamiento de fibrosis cística e hipercolesterolemia familiar se describen en los Ejemplos 6 y 7 de adelante. Un experto en la técnica puede generar cualquier número de otros vehículos de transferencia génica al incluir un trasgen seleccionado para el tratamiento de otros desordenes. Por ejemplo, las partículas de trans-infección se anticipan por ser particularmente ventajosas en terapia génica ex vivo donde se desea la transducción y la integración proviral en una célula madre, tal como en terapia génica dirigida a medula ósea.

Los virus híbridos y las partículas de trans-infección de la presente invención se pueden administrar a un paciente, preferiblemente suspendido en una solución biológicamente compatible o en un vehículo de suministro farmacéuticamente aceptable. Un vehículo adecuado incluye la solución salina estéril. Otras soluciones de inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas conocidas por ser vehículos farmacéuticamente aceptables y bien conocidas por aquellos expertos en la técnica se pueden emplear para este propósito.

Los virus híbridos y las partículas de trans-infección de esta invención se pueden administrar en cantidades suficientes para transfectar las células deseadas y suministrar niveles suficientes de integración y expresión del trasgen seleccionado para suministrar el beneficio terapéutico sin efectos fisiológicos adversos indebidos o médicamente aceptables que se pueden determinar por aquellos expertos en las ciencias médicas. Las rutas convencionales y farmacéuticamente aceptables de administración incluyen el suministro directo al órgano, tejido o sitio blanco, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, oral y otras rutas parentales de administración. Las rutas de administración se pueden combinar, si se desea.

Las dosis del virus híbrido y/o la partícula de trans-infección dependerá primariamente de factores tales como la condición a ser tratada, el gen seleccionado, la edad, el peso y la salud del paciente, y puede así variar entre pacientes. Una dosis humana terapéuticamente efectiva de los virus híbridos o partículas de trans-infección de la presente invención se cree que está en el rango de desde aproximadamente 20 a aproximadamente 50 ml de solución salina que contiene concentraciones de aproximadamente 1 x 10^{7} a 1 x 10^{10} pfu/ml de virus híbrido de la presente invención. Una dosis humana preferida es de aproximadamente 20 ml de solución salina en las concentraciones anteriores. La dosis se ajustará para balancear el beneficio terapéutico contra cualquiera de los efectos colaterales. Los niveles de expresión del gen seleccionado se pueden monitorear para determinar la selección, ajuste o frecuencia de la administración de la dosis.

IV. Producción de Alta Eficiencia de rAAV

Los virus híbridos y las partículas de trans-infección de esta invención tienen otra utilidad deseable en la producción de grandes cantidades de partículas AAV recombinantes. Debido a los métodos habituales complicados para generar AAV, existe solamente una cantidad limitada de AAV disponible para uso en procedimientos de biotecnología industriales, médicos y académicos. Los vectores y los virus de la presente invención suministran un método conveniente y eficiente para generar grandes cantidades de partículas rAAV.

De acuerdo con este aspecto de la invención, una partícula de trans-infección es construida como se describió anteriormente y en el Ejemplo 3 y se emplea para producir altos niveles de rAAV como se detalla en el Ejemplo 8. En resumen, se genera un plásmido que contiene tanto los geners rep como cap de AAV bajo el control de un plásmido adecuado y es complejado al exterior de la poli-lisina del virus híbrido como se describió anteriormente. Esta partícula de trans-infección luego se le permite infectar una célula huésped seleccionada, tal como 293 células. La presencia tanto del rep como el cap permite la formación de las partículas de AAV en las células y generan un título de virus de AAV de aproximadamente 10^{9} viriones. En contraste, los métodos habituales que involucran la transfección de los plásmidos múltiples producen solamente aproximadamente un título de virión de 10^{7}. El rAAV se aisla del cultivo al seleccionar las placas azules que contienen LacZ y purificarlas sobre un gradiente de cloruro de cesio.

El beneficio de este procedimiento se relaciona con el hecho de que el elemento AAV de cis se codifica por el genoma del adenovirus parental. Como resultado, el plásmido trans es el único componente de ADN que es necesario para la formación del complejo. La célula es cargada de esta manera con significativamente más copias de las secuencias rep y cap trans-actuantes, resultando en una eficiencia mejorada del rescate y empaque.

Numerosos estudios comparativos que se enfocan en la proporción óptima y el número de copias de los plásmidos cis y trans para la producción de AAV indicaron que existe una correlación positiva entre el número de copias de plásmido trans y el rendimiento del virus recombinante. Como se describió en detalle en el Ejemplo 8, el rendimiento del virus AV.CMVLacZ recombinante se incremento 5-10 veces al utilizar la partícula de trans-infección en lugar del vector de adenovirus estándar.

La limitación primaria asociada con la producción del AAV recombinante que utiliza un virus híbrido de esta invención se relaciona con las dificultades que surgen para distinguir entre los dos virus (es decir, el adenovirus y el AAV) que son producidas por la célula. Utilizando los vectores de ejemplo y los componentes del vector de esta invención, el teñido histoquímico LacZ podría no ser utilizado para titular el rendimiento del recombinante AV.CMVLacZ en razón a que cualquier híbrido Ad.AV.CMVLacZ contaminante contribuiría al conteo final. Por lo tanto, una técnica Southern blot rápida para rendimientos cuantificados de AAV recombinante se incorporó. El ensayo que se desarrolló posibilitó no solamente la cuantificación y verificación de la producción de AAV, sino también demostró la remoción del virus híbrido contaminante de las cepas AAV purificadas.

Otro método para detectar los viriones híbridos contaminantes involucra modificar el vector híbrido al insertar un pequeño segundo minigen reportero (es decir, el gen reportero, promotor y otras secuencias de control de expresión, donde se desee) en la región E3 de la estructura del adenovirus parental. En razón a que este reportero no esta ligado al dominio AAV, el virus híbrido contaminante que esta presente durante la purificación se puede monitorear mediante este marcador específico del híbrido. Otro gen reportero posible es la secuencia de ácido nucleico para la proteína fluorescente verde. Con este vector híbrido que contiene dos secuencias reporteras, el teñido histoquímica para la fosfatasa alcalina (reportero adenovirus) o \beta-galactosidasa (reportero AAV) la actividad se puede utilizar para monitorear cada dominio viral.

Los siguientes ejemplos ilustran la construcción y el ensayo de los vectores híbridos de la presente invención y el uso de éstos en las producciones de AAV recombinante. Estos ejemplos son solamente ilustrativos, y no limitan el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Construcción del Virus Híbrido

Un primer virus adenovirus-AAV híbrido fue trabajado por ingeniería mediante recombinación homóloga entre el ADN extraído de un adenovirus y un vector complementario de acuerdo a los protocolos previamente descritos [ver, por ejemplo, K. F. Kozarsky et al, J. Biol. Chem., 269:13695-13702 (1994) y las referencias citadas aquí]. Las siguientes descripciones se refieren al diagrama de la Fig. 1.

El ADN del adenovirus se extrajo con viriones d17001 purificados CsCl, una variante Ad5 (subgrupo serotipo C) que lleva una supresión 3 kb entre el mu 78.4 al 86 en la región E3 no esencial (suministrada por el Dr. William Wold, Washington University, St. Louis, Missouri). El ADN adenoviral se preparó para co-transfección mediante la digestión con Clal (adenovirus genómico posición bp 917) que remueve el brazo izquierdo del genoma que comprende las unidades del mapa de adenovirus 0-2.5. Ver diagrama inferior de la Fig. 1B.

El vector híbrido complementante, pAd.AV.CMVLacZ (ver Fig. 1A y Fig. 2 [SEQ ID NO: 1]) se construyó como sigue:

Un vector de clonación parental, pAd.BgIII se designó. Éste contiene dos segmentos del genoma Ad5 tipo silvestre (es decir, unidades de mapa 0-1 y 9-16.1) separadas por un sitio de clonación BgIII único para la inserción de las secuencias heterólogas. Las secuencias Ad5 faltantes entre los dos dominios (genoma de adenovirus bp 361-3327) da como resultado la supresión del E1a y la mayoría del E1b luego de la recombinación con el ADN viral.

Un genoma AAV recombinante (AV.CMVLacZ) se designó e insertó en el sitio BgIII del pAd.BgIII para generar el plásmido de complementación. La disposición lineal del AV.CMVLacZ [SEQ ID NO: 1] (ver diagrama superior de la Fig. 1B) incluye:

(a)

el ITR del AAV 5' (bp 1-173) obtenido mediante PCR utilizando pAV2 [C. A. Laughlin et al, Gene, 23:65-73 (1983)] como molde [nucleótidos números 365-538 de la Fig. 2 [SEQ ID NO: 1];

(b)

un mejorador/promotor temprano inmediato CMV [Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985); nucleótidos números 563-1157 de la Fig. 2 [SEQ ID NO: 1]];

(c)

un aceptador donador de empalme SV 40 (nucleótidos números 1178-1179 de la Fig. 2 [SEQ ID NO: 1]),

(d)

el cADN beta-galactosidasa de E. coli (nucleótidos números 1356-4827 de la Fig. 2 [SEQ ID NO: 1]),

(e)

una señal de poliadenilación SV 40 (un fragmento de restricción Bam HI-BcII 237 que contiene las señales de clivaje/poli-A de ambas unidades de trascripción temprana y tardía; los números de nucleótido 4839-5037 de la Fig. 2 [SEQ ID NO: 1]) y

(f)

el ITR 3' AAV, obtenido del pAV2 como un fragmento SnaBI-BgIII (nucleótidos números 5053-5221 de la Fig. 2 [SEQ ID NO: 1]).

El vector híbrido complementante resultante, pAd.AV.CMVLacZ (ver Fig. 1A y Fig. 2 [SEQ ID NO: 1]), contiene una copia simple del AV.CMVLacZ recombinante flanqueado por adenovirus coordina 0-1 sobre el lado y 9-16.1 sobre el otro. El ADN del plásmido fue linearizado utilizando un sitio Nhel único inmediatamente 5' a la unidad cero (0) de mapa de adenovirus (resultando en el diagrama superior de la Fig. 1B).

Tanto el sustrato del adenovirus como los ADN del vector complementante fueron transfectados a 293 células [ATCC CRL 1573] utilizando un procedimiento de transfección de fosfato de calcio estándar [ver, por ejemplo, \hbox{Sambrook} et al, citado anteriormente]. El resultado final de la recombinación homóloga que involucra las secuencias del mapa a las unidades del mapa de adenovirus 9-16.1 es el híbrido Ad.AV.CMVLacZ (ver Fig. 1C) en la cual las regiones codificantes E1a y E1b del sustrato de adenovirus d17001 se reemplazan con el AV.CMVLacZ del vector híbrido.

Veinticuatro horas más tarde, el cocktail de transfección se removió y las células fueron sobrepuestas con 0.8% de agarosa que contiene 1 x BME y 2% de suero bovino fetal (FBS). Una vez que las placas virales se desarrollaron (típicamente 10-12 días post-transfección), las placas fueron inicialmente seleccionadas para actividad \beta-galactosidasa (LacZ) de E. coli al sobreponer la monocapa infectada con agarosa suplementada con teñido histoquímico para LacZ, de acuerdo al procedimiento descrito en J. Price et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:156-160 (1987). Los clones positivos (identificados por el depósito del tinte azul insoluble) se aislaron, se sometieron a tres rondas de congelamiento (hielo seco/etanol)- se descongelaron (37ºC) y una alícuota de la placa suspendida se utilizó para infectar la monocapa fresca de 293 células sembradas sobre placas duplicadas de 60 mm.

Veinticuatro horas más tarde las células provenientes del conjunto de placas se fijaron y de nuevo se tiñeron para actividad LacZ. Las células de la placa duplicada fueron cosechadas, suspendidas en 0.5 ml 10 mM de Tris-CI, pH 8.0, y lisadas al desarrollar una serie de tres ciclos de congelamientos (hielo seco/etanol)- descongelamiento (37ºC). Los desechos de las células se removieron mediante centrifugación y una alícuota del sobrenadante se utilizó para medir la actividad de la enzima LacZ.

Como se indicó en la Fig. 3, los ensayos para actividad de \beta-galactosidasa que midieron la absorbancia a 420 nm de la beta-galactosidasa color azul en recombinantes exitosos, reveló que ocho de diez aislados, clones positivos putativos (D1A a D1J) expresaron altos niveles de enzima. El teñido histoquímico produjo resultados similares.

La producción y purificación a gran escala del virus recombinante se desarrolló como se describió en Kozarsky et al, citado anteriormente, y las referencias citadas aquí.

Ejemplo 2 Análisis Funcional del Vector Híbrido

La capacidad para rescatar la secuencia AV.CMVLacZ [SEQ ID NO: 1] del virus híbrido representó una característica importante del vector híbrido y los sistemas de virus del Ejemplo 1. Para evaluar esta característica, era necesario suministrar los productos del gen AAV necesarios en trans que dirigen la excisión y la amplificación de AAV (es decir, las proteínas rep). Adicionalmente, este experimento se condujo en 293 células para transcomplemento de la supresión E1 en los clones Ad.AV.CMVLacZ, en razón a que las proteínas del gen E1 del adenovirus han mostrado ser importantes para iniciar la fase lítica del ciclo de vida del AAV.

Las 293 células fueron sembradas sobre placas de 35 mm de 6 pozos a un densidad de 1 x 10^{6} células/pozo. Veinticuatro horas más tarde, el medio de siembra [DMEM/10% FBS suplementado con antibióticos] se reemplazó con DMEM/2% 1.0 ml de FBS e infectadas con los clones híbridos Ad.AV.CMVLacZ a un MOI de 1. Dos horas más tarde, cada pozo fue transfectado con 1 \mug de plásmido pRep78/52 [SEQ ID NO: 2], un plásmido trans-actuante que codifica la secuencia que codifica las proteínas de 78 kD y 52 kD rep de AAV. Las secuencias rep en esta construcción están bajo control del promotor P5 de AAV y utilizan una señal de poliadenilación SV40.

Como un control positivo para el rescate de AAV, se sembraron 293 células en una placa de 6 pozos como anteriormente fueron co-transfectadas con un plásmido AAV actuante cis pAV.CMVLacZ y pRep78/52.pAV.CMVLacZ que contenía AV.CMVLacZ, la secuencia idéntica codificada por el pAd.AV.CMVLacZ [SEQ ID NO: 1] descrita en el Ejemplo 1 clonado en el sitio BgIII del pSP72 (Promega).

Para suministrar la función necesaria del ayudante del adenovirus para el rescate AAV, las células fueron infectadas con el virus Ad5 tipo silvestre o un virus suprimido E1 de primera generación Ad.CMhpAP a un MOI de 5, aproximadamente 2 horas antes de agregar el cocktail de transfección. El Ad.CMhpAP es idéntico al Ad.CMVLacZ (Ejemplo 1) con la modificación de que la secuencia de fosfatasa alcalina (que se puede obtener del Genbank) se inserta en el lugar del gen LacZ.

Las transfecciones fueron desarrolladas con Lipofectamina (Life Technologies) de acuerdo a las instrucciones suministradas por el fabricante. Treinta horas post-transfección, las células fueron cosechadas y el ADN episomal (extracto Hirt) preparado como se describió por J. M. Wilson et al, J. Biol. Chem., 267:11483-11489 (1992). Las muestras fueron resueltas sobre un gel de agarosa 1.2% y electrobloteadas sobre una membrana de nylon. Los blots fueron hibridizados (Southern) con un fragmento de restricción marcado con iniciador aleatorio ^{32}P aislado del cADN LacZ de E. coli.

El espectro completo de las especies moleculares dúplex que aparecen durante la infección AAV lítica (es decir, las formas monoméricas de los intermedios de hebra doble, RFm y RFd, respectivamente) fueron evidentes en las células transfectadas infectadas con tipo silvestre y E1 suprimido Adj. No se detectaron intermedios replicativos cuando se desarrollaron las transfecciones en la ausencia del virus ayudante.

Los extractos Hirt provenientes de las 293 células infectadas con Clones híbridos Ad.AV.CMVlACZ putativo de 1A y de 1C revelan una banda única que corresponde al ADN viral, cuando se sondea con un fragmento de restricción LacZ. En la presencia de las proteínas rep 78 y 52, sin embargo, los mismos clones produjeron un patrón de banda que incluye no sólo el ADN de adenovirus, sino un monómero de RF y un dímero de AV.CM-VLacZ. Una forma de hebra sencilla de AV.CMVLacZ [SEQ ID NO: 1] no fue evidente. Dos clones adicionales dieron similares patrones de banda. D1B y D1H. En todos, cada uno de los 8 híbridos Ad.AV.CMVLacZ que se encontraron en la figura 3, expresan altos niveles de actividad LacZ, que son positivos para el rescate de un dominio AAV.

Con la excepción de una banda extra de aproximadamente 3.5 kb, el rescate del AV.CMVLacZ. [SEQ ID NO: 1] del ADN viral híbrido fue casi idéntico a los resultados obtenidos de logros basados en plásmidos cis y trans estándar. En estas últimas muestras, la función auxiliar del adenovirus, se suministra por células preinfectadas ya sea con Ad5 tipo silvestre o un Ad.CBhpAP de virus recombinante E1-eliminado (también denominado H5.CBALP). El virus Ad.CBhpAP tiene la misma secuencia que el virus Ad.CMhpAP descrito anteriormente, excepto que la secuencia promotora CMV se remplaza por el promotor \beta-actina citoplásmico de gallina [nucleótidos+1 a +275 como se describe en T. A. Kost et al, Nucl. Acids Res., 11(23):8287 (1983)]. El nivel de rescata en las células infectadas con WT Ad5 parece ser mayor con relación a aquellas infectadas con el virus recombinante Ad. CBhpAP, probablemente debido a la expresión E1 adicional suministrada por el genoma tipo silvestre. La importancia de incluir aquí el adenovirus E1 eliminado es documentar que el nivel de proteínas E1 de adenovirus expresadas en células 293 es suficiente para la función auxiliar AAV.

Ejemplo 3 Síntesis de Conjugados de Poli lisina

Otra versión de la partícula viral de ésta invención es un conjugado de poli lisina con un plásmido rep complejado directamente al cápsido de virus híbrido. Éste conjugado permite el suministro deficiente del plásmido de expresión rep pRep78/52 [SEQ ID NO: 2] en tándem con el virus híbrido removiendo por lo tanto la necesidad de una etapa de transfección separada. Ver, figura 8 para un resumen esquemático de ésta construcción.

Materia prima purificada, de una expansión a gran escala del clon D1A Ad.AV.CMVLacZ se modifican al acoplar poli-L-lisina al cápsido virión presencialmente como se describe por K. J. Fisher y J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49-58 (1994), que resulta en un conjugado Ad.AV.CMVLacZ-(Lys)_{n}. El procedimiento involucra 3 etapas. Primero, se activan viriones híbridos a través de aminas primarias sobre proteínas cápsido con agente de reticulación soluble en agua heterobifuncional, sulfo-SMCC [sulfo -(N-succinimidil 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilatos] (Pierce). La reacción de conjugación, que contiene 0.5 mg (375 nmol) de sulfo-SMCC y partículas de vector híbrido 6 x 10^{12} A_{260} en 3.0 ml de HBS, se incuba a 30ºC durante 45 minutos con agitación gentil constante. Ésta etapa involucra la formación de un enlace péptido entre el ester N-hidroxisuccinimida (NHS) activo del sulfo-SMCC y una amina libre (por ejemplo lisina) contribuido por una secuencia de proteína de adenovirus (proteína cápsido) en el virus recombinante, produciendo una partícula viral activada por maleimida.

Se remueve el reticulador que no ha reaccionado, no incorporado por filtración de gel sobre 1 cm x 15 cm de columna Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad Laboratorios) equilibrado con 50 mM de amortiguador Tris/HCl, pH 7.0, y 150 mM NaCl. Fracciones pico A_{260} contienen virus híbrido activado por maleimida se combinan y se colocan el hielo.

Segundo, la poli-L-lisina, que tiene una masa molecular de 58 kDa a 10 mg/ml en 50 mM de amortiguador de trietanolamina (pH 8.0), 150 mM de NaCl y 1 mM EDTA se tiolata con 2-iminotiato/HCl (reactivo Traunt; Pierce) para una proporción molar de 2 moles-SH/mol de polilisina bajo N_{2}; el tioimidato cíclico reacciona con las aminas primarias poli (L-lisina) resultando en el poli catión tiolatado. Después de una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente la reacción se aplica a una columna de 1 cm x 15 cm de Bio-Gel P6DG equilibrado con 50 mM de amortiguador Tris/HCl (pH 7.0), 150 mM de NaCl y 2 mM de EDTA para remover el reactivo Traut no incorporado.

La cuantificación de los grupos tiol libres se acompaña con el reactivo Ellman [5,5'-ditio-bis (ácido 2-nitro benzoico)], que revela aproximadamente 2 mol de SH-mol de poli (L-lisina). La reacción de acoplamiento se inicia al agregar 1 x 10^{12} A_{260} partículas de virus/mg híbrido activado por maleimida de poli (L-lisina) tiolatada e incubar la mezcla en hielo a 4ºC durante 15 horas bajo argón. Se agrega 2-mercaptoetilamina en la terminación de la reacción y la incubación, se lleva a cabo a temperatura ambiente durante 20 minutos para bloquear los sitios maleimida que no reaccionan.

Los conjugados del virus poli lisina, Ad.AV.CMVLacZ-(Lys)_{n}, se purifican de poli (L-lisina) no conjugada por ultra centrifugación a través de un gradiente de etapa CsCl con una composición inicial de volúmenes iguales de 1.45 g/ml (etapa inferior) y 1.2 g/ml (etapa superior) CsCl en 10 mM de amortiguador Tris/HCl (pH 8.0). La centrifugación se dializa contra amortiguador Hepes 20 mM (pH 7.8) que contiene 150 mM de NaCl (HBS).

Complejos de Ad.AV.CMVLacZ-(Lys)_{n} con ADN de plásmido pRep78/52 [SEQ ID NO:2] se forma al agregar variantes de Ad.AV.CMVLacZ-(Lys)_{n} en 50 \mul HBS. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se forma un complejo del virus híbrido Ad.AV.CMVLacZ-(Lys)_{n} asociado en una partícula única con el ADN de plásmido que contiene los genes rep.

Éste complejo, demonizado una partícula de trans-infección se evalúa para capacidad de unión de ADN por ensayo de cambio de movilidad de gel, desarrollado como se describe en Fisher et al, citado anteriormente. Éste análisis revela que la capacidad de unión del plásmido del conjugado purificado (expresado como el número de partículas A_{260} Ad.AV.CMVLacZ-(Lys)_{n} que puede neutralizar la carga contribuye mediante 1 \mug de plásmido de ADN) es 1 \mug de pRep78/52 plásmido ADN/6.0 V 10^{10} A_{260} partículas Ad.AV.CMVLacZ-(Lys)_{n}.

Ejemplo 4 Protocólo-Trans infección para demostrar la escisión del AAV y amplificación

Se preparan complejos Trans-infección al mezclar el conjugado Ad.AV.CMVLacZ-(Lys)_{n} con el plásmido
pRep78/52 [SEQ ID NO: 2] y aplicar a células 293 como sigue. Ad.AV.CMVLacZ-(Lys)_{n} (6 x 10^{10} A_{260} partículas) en 100 \mul DMEM se agrega en forma de gotas a un tubo micro fugo que contiene 1 \mug de ADN de plásmido en 100 \mul DMEM. La mezcla se agita gentilmente se le permite incubar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Se agrega el cóctel Trans-infección a células 293 sembradas en 6 pozos de 35 mM como se detallo anteriormente. 30 horas después se cosechan las células y se preparan los extractos Hirt.

Las muestras se redisuelven en 1.2% de gel de agarosa y se electro marcan en una membrana de nylon. Los Blot se hibridizan (Southem) con un fragmento de restricción de iniciador-etiquetado aleatorio P-32 aislado del E. coli LacZ cADN.

Los extractos Hirt de las células 293 revelan un patrón de banda que sugiere que la secuencia de mini-gen AV.CMVLacZ [SEQ ID NO: 1] se rescata eficientemente del conjugado híbrido. El monómero RF y el dímero de la secuencia AV.CMVLacZ recombinante son evidentes. Como se observo previamente, el evento de rescate depende de las proteínas rep en razón a que las células 293 que se Trans-infectan con un complejo conjugado híbrido con un plásmido reportero irrelevante que expresa fosfatasa alcalina (es decir pCMVhpAP) sólo revela Ad.AV.CMVLacZ ADN. Éste control negativo de rescate fue secundariamente útil para demostrar la alta eficiencia de transferencia de gel a las células 293 que se logra con el vehículo conjugado.

Un conjunto duplicado de células 293 que reciben el conjugado híbrido que se compleja adicionalmente con el plásmido de fosfatasa alcalinasa fija 24 horas después de la adición de cóctel de Trans-infección y se tiñe histoquímicamente para LacZ como se describe el Price et al, citado anteriormente, o para actividad fosfatasa alcalina como se describe en J. H. Schreiber et al, BioTecniques, 14:818-823 (1993). Aquí LacZ fue un marcador para el Ad.AV.CMVLacZ híbrido, mientras que la fosfatasa alcalina sirve como un reportero para el plásmido portador. Más del 90% de la monocapa se transluce con \beta-galactosidasa y transgenes fosfatasa alcalina, que muestran la alta eficiencia de el vehículo de suministro del conjugado (el teñido diferencial revela un color azul para los híbridos que contienen el marcador LacZ y un color púrpura para los plásmidos que llevan el marcador AP).

Debido al papel importante que tiene las proteínas E1 para la progresión del ciclo del de cida AAV, es crítico probar la eficiencia del sistema del suministro híbrido en una configuración donde las proteínas E1 no se expresen. Un experimento de trans-infección utilizando el conjugado híbrido complejado con pRep78/52 [SEQ ID NO:2] se conduce por lo tanto en células HeLa [ATCC CCL2] para remover el involucramiento de las proteínas E1. Los hallazgos sugieren el rescate de AV.CMVLacZ ocurre con evidencia por la acumulación de monómeros y dímeros RF. El rescate de las células HeLa (que a diferencia de las células 293 no contienen ninguna proteína E1 de adenovirus) revelan niveles inferiores de rescate del trans-gen. La expresión del rep del promotor AAV P5 se regula positivamente por el adenovirus y señala el inicio del ciclo lítico AAV. En la ausencia del E1, la expresión rep del promotor P5 es virtualmente silente lo que es importante para el mantenimiento de tapas latentes provirales del ciclo de vida del AAV. Se anticipa que un promotor no depende de la expresión E1 luego de la sustitución por P5, lo que supera éste
problema.

Ejemplo 5 Integración del Transgen

Se ha desarrollado un estudio preliminar para determinar si la secuencia AAV rescatada del virus híbrido puede lograr estado provirus en una célula objetivo (Figura 7). En resumen, las células HeLa [ATCC CCL2] se infectan con el conjugado híbrido complejado con pRep78/52 [SEQ ID NO: 2] y pasa hasta colonias estables de LacZ que expresan células es evidente. Una placa duplicada de células se infecta con el mismo conjugado, pero en cambio de ser complejada con el plásmido pRep78/52 [SEQ ID NO: 2], lleva un plásmido irrelevante. Estos hallazgos indican que las células que reciben el rep que contiene la partícula híbrida produce un número mayor de colonias positivas LacZ estables que las células que se infectan con el virus de control. Esto se puede interpretar como una reflexión del rescate múltiple y eventos de integración en células que expresan las proteínas rep. Sin embargo, es posible que una forma episomal de AAV que puede persistir para periodos extendidos de tiempo esté presente. Para establecer la ocurrencia de integración dentro del cromosoma del mini-gen AV.CMVLacZ del conjugado híbrido, se desarrollan los siguientes experimentos. El conjugado Ad.AV.CMVLacZ-(Lys)_{n} que lleva el plásmido pRep78/52 [SEQ ID NO:2] se utiliza para infectar las células HeLa [ATCC CRL2] (también se pueden utilizar fibroblastos primarios). Las células infectadas se pasan durante varias generaciones. Las células se crecen para confluencia, se dividen y se permiten crecer para confluencia de nuevo, se dividen de nuevo y se repite el ciclo según se desee. Esto permite suficiente tiempo de toma, expresión, replicación e integración. Ver figura 7.

Para verificar que la secuencia AAV recombinante que se rescata del genoma híbrido (etapa III de figura 7) tiene integrado en un cromosoma de la célula huésped (etapa IV de la figura 7), células que se separan por Clasificador de Célula Activado por Florescencia (FACS). Mediante ésta técnica, aquellas células que contiene una copia del mini-gen AV.CMVLacZ recombinante se separan basado e la presencia del reportero \beta-galactosidasa. Estas células se marcan con anticuerpos etiquetados-fluoresceína que reconocen la proteína \beta-Gal, y luego se separan de células no traslucidas (es decir, aquellas que no reciben una copia del minigen AAV) por FACS.

El ADN se aisla de ésta población purificada de células y se utiliza para construir una librería genómica que se selecciona para clones individuales y se verifica la secuencia si ocurre la integración, esta se documenta directamente por análisis de secuencia.

Ejemplo 6 Vehículo de Transferencia de Gen para Fibrosis Cística

Un virus adenovirus -AAV-CFTR construido al modificar el virus Ad. AV. CMVlacZ híbrido descrito en el ejemplo 1 por contener el gen (CFTC) regulador de transmembrana de fibrosis cística [J.R. Riordan et. al, Science, 245:1066-1073 (1989)] en el lugar del gen LacZ, utilizando técnicas conocidas. Un método adecuado involucra producir un nuevo vector utilizando las técnicas descritas en el ejemplo 1. En este nuevo vector se reemplaza el minigen LacZ con el minigen CFTR que se ha descrito previamente y se puede construir fácilmente. Se utiliza este nuevo vector o vector reconstruido para generar un nuevo virus a través de combinación homologa como se describió anteriormente. El virus simple y dos resultantes se denomina Ad. AV. CM-VCFTR híbrido. Este tiene la secuencia de la figura 2 [SEQ ID NO: 1] excepto que el gen LacZ se reemplaza con CFTR. Alternativamente, el gen LacZ se puede remover del vector Ad. AV. CMVLacZ dl ejemplo 1 y reemplazar con el gen CFTR utilizando técnicas conocidas.

El virus (o un virus híbrido análogo con un promotor diferente, regiones reguladoras, etc.) es útil en la terapia de gen solo, o preferiblemente, en la forma de un conjugado preparado como se describe en el ejemplo 4.

El tratamiento de la fibrosis cística, que utiliza los virus suministrados anteriormente, es particularmente adecuado para terapia de gen in vivo, dirigida a los pulmones. Las células epiteliales de las vías aéreas son los objetivos más deseables para la transferencia de gen debido a las complicaciones pulmonares del CF que son usualmente en su mayoría mórbidos y limitantes de la vida. Así, el vector híbrido de la invención, contiene el gen CFTR, que se suministra directamente dentro de la vía aérea, por ejemplo mediante la formulación del virus híbrido anterior, dentro de una preparación que se puede inhalar. Por ejemplo, el virus híbrido o conjugado de la invención contiene el gen CFTR, se suspende 0.25 molar de cloruro de sodio. El virus o conjugado se toma por las células de la vía aérea respiratoria y el gen se expresa.

Alternativamente, los virus híbridos o conjugados de la invención se pueden suministrar por otros medios adecuados, que incluyen dirección dirigida al sitio de virus que lleva al gen CFTR. En el caso del suministro del gen CFTR, las soluciones preferidas para instilación bronquial son soluciones salinas estériles que contienen en el rango de aproximadamente 1 x 10^{7} a 1 x 10^{10} pfu/ml, más particularmente, en el rango de aproximadamente 1 x 10^{8} a
1 x 10^{9} pfu/ml del virus híbrido recombinante de la presente invención.

Otros métodos adecuados para el tratamiento de fibrosis cística por uso de virus recombinante de terapia de gen de esta invención se pueden obtener a partir de las discusiones de la técnica de otros tipos de vehículos de terapia de gen para CF. Ver por ejemplo, patente Estadounidense número 5,240,846 incorporada aquí como referencia.

Ejemplo 7 Vehículo de Transferencia de Gen para Hipercolesterolemia Familiar

La hipercolesterolemia familiar (FH) es un trastorno dominante autosomal originado por anormalidades (deficiencias) en la función o expresión de receptores LDL [M.S. Brown y J.L. Goldstein, Science, 232(4746):34-37 (1986); J.L. Goldstein y M.S. Brown, "Familial hipercolesterolemia" in Metabolic Basis of Inherited Disease., ed. C.R. Scriver et al, McGraw Hill, New Cork, pp 1215-1250 (1989)]. Pacientes quienes heredan un alelo anormal tienen elevaciones moderadas en LDL de plasma y sufren enfermedad prematura de arteria coronarias que amenazan la vida (CAD). Los parientes homocigotos tienen severa hipercolesterolemia y CAD que amenaza la vida en la niñez.

Un virus adenovirus -AAV-LDL híbrido de la invención se construye al reemplazar el gen LacZ en el virus Ad.AV.CMVlacZ híbrido del ejemplo 1 con un gen receptor LDL [T. Yamamoto et al, Cell, 39:27-38 (1984)] utilizando técnicas conocidas y como se describe análogamente para CF en el ejemplo precedente. Los vectores que llevan el gen receptor se pueden construir fácilmente de acuerdo con esta invención. El vector híbrido resultante se denomina pAd. AV. CMVLDL.

\newpage

Este plásmido o sus virus recombinantes son útiles en la terapia de gen del FH solo, o preferiblemente, en la forma de un conjugado preparado como se describe en el ejemplo 4 para sustituir un gen LDL normal para el alelo anormal responsable para el gen.

A. Terapia de Gen Ex Vivo

La terapia de gen ex vivo se puede desarrollar al cosechar y establecer un cultivo primario de hepatocitos de un paciente. Se pueden utilizar técnicas conocidas para aislar y translucir los hepatocitos con los anteriores vectores que llevan los genes receptores LDL. Por ejemplo, las técnicas de perfusión de colagenaza desarrolladas para hígado de conejos se pueden adaptar para tejido humano y utilizar en transducción. Siguiendo la transducción, los hepatocitos se remueven de las placas de cultivo de tejido y se colocan en reinfusión en el paciente utilizando técnicas conocidas, por ejemplo por vía de un catéter colocado en la vena mesentérica inferior.

B. Terapia de Gen In Vivo

De forma deseable, la aproximación in vivo para la terapia de gen, por ejemplo dirigida la hígado involucra el uso de virus híbrido y conjugados virales como se describió anteriormente. Un tratamiento preferido involucra colocar en infusión una partícula trans-infección de la invención de acuerdo que contiene LDL dentro de la circulación periférica del paciente. El paciente luego se evalúa para cambios en lípidos de suero y tejido de hígado.

El virus híbrido o conjugado viral se puede utilizar para infectar hepatocitos in vivo mediante inyección directa dentro de una vena periférica o portal (10^{7}-10^{8} pfu/kg) o retrograda dentro del tracto biliar (las mismas dosis). Esto afecta la transferencia de gen dentro de la mayoría de los hepatocitos.

Los tratamientos se repiten según sea necesario, por ejemplo semanalmente. La administración de una dosis de virus equivalente a un MOI de aproximadamente 20 (es decir 20 pfu/hepatocito) se anticipa por conducir a expresión de gen de alto nivel en la mayoría de los hepatocitos.

Ejemplo 8 Producción Eficiente de AAV Recombinante que Utiliza un Virus/Conjugado Híbrido

El siguiente experimento demuestra que el genoma AAV que se rescata del virus Ad. AV. CM-VlacZ híbrido se puede empacar dentro de un cápsido AAV, dado que el cap abre el cuadro de lectura que se suministra en el trans. Así los virus de esta invención son útiles en un método de producción para AAV recombinante que supera las complicaciones de la técnica anterior que envuelve la producción alta de titulo de AAV recombinante.

A. Protocolo de trans-infección para la producción de rAAV

Se forma un complejo transinfección compuesto del conjugado Ad. AV. CMVLacZ-(Lys)_{n} descrito anteriormente y un plásmido pAdAAV trascomplementación, que se describe en detalle en R.J. Samulski et al, J. Virol., 63(9):3822-3828 (1989)]. En resumen, el plásmido pAdAAV codifica los cuadros de lectura abiertos cap y rep completos en la ausencia de AAVITR, y se ha mostrado que suministra funciones auxiliares AAV necesarias para replicación y empaque de secuencias AAV recombinantes.

El conjugado Ad. AV. CMVLacZ-(Lys)_{n} (4.5 x 10^{13} partículas A_{260}) en 75 ml DMEM se agrega en forma de gotas con agitación gentil constante en 25 ml de DMEM que contiene 750 \mug de plásmido auxiliar pAdAAV e incubado a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. El complejo se diluye con 450 ml DMEM complementado con 2% FBS y 20 ml de alícuotas se agregan a monocapas de 293 células sembradas en placas de 150 mm.

Cuarenta horas post transinfección, se cosechan las células, se suspenden en 12 ml 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), y se almacena a -80ºC.

Debido al resultado anticipado el Ad.AV.CMVlacZ de virus híbrido y un virión AAV recombinante (AV.CMV.
LacZ), ambos llevan un minigen LacZ funcional, no fue posible utilizar la detección de actividad LacZ como un indicador de producción AV.CMVlacZ. Se desarrolla un aproximación molecular novedosa que se puede desarrollar en un día y permitir la identificación del ADN viral empaquetado.

B. Purificación de rAAV

En resumen se someten células de suspensión congeladas a tres rondas de ciclos de congelamiento-descongelamiento para liberar el AV.CMVlacZ recombinante y el Ad.AV.CMVlacZ híbrido. A la terminación del descongelamiento final, el ADNse pancreático bovino (200 unidades) y ribonucleasa (0.2 mg/ml de concentración final) se agrega y el extracto se incuba a 37ºC durante 30 minutos. Los residuos de células se remueven por centrifugación (5000 xg durante 10 minutos) y el supernadante clarificado (15 ml) aplicado a 22.5 ml de gradiente de etapa compuesto de volúmenes iguales de CsCl a 1.2 g/ml, 1.36 g/ml, 1.45 g/ml 10 mM Tris-Cl, pH 8.0. Se colocan bandas en partículas virales a 25,000 rpm en un rotor Sw-28 Beckman durante 8 horas a 4ºC. Se recolecta fracciones de un ml del fondo del tubo.

Las fracciones recuperadas del gradiente CsCl de virus purificado parcialmente luego se digieren para liberar ADN viral de cápsidos virión como sigue. Una muestra de 5.0 \mul de cada fracción se transfieren a un tubo microfugo que contiene 20 \mul de amortiguador de digestión de cápsido (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1.0 mM EDTA, pH 8.0, 0.5% SDS, y 1.0 mg/ml de proteinasa K). La reacción se incuba a 50ºC durante 1 hora, se le permite enfriarse a temperatura ambiente, se diluye con 10 \mul de mi-Q agua, y gel de agarosa que contiene tinte agregado.

Estas fracciones luego se analizan por Southern blotting. Las muestras se redisuelven en 1.2% de gel de agarosa, se practica electroblotted sobre un membrana de nylon. Un fragmento de restricción LacZ etiquetado ^{32}p que es común a ambos vectores se utiliza como una sonda de hibridización para ubicar la migración del ADNviral a través del gel de agarosa. Las bandas virales se cuantifican sobre un Molecular Dynamics Phos-phoimager.

Una muestra del extracto antes de formación de banda CsCl también se ensaya y se revela el LacZ el híbrido de ADN Ad.AV.CMVlacZ y formas RF de doble hebra (monómeros y dímeros) de la secuencia AV.CMVlacZ rescatada [SEQ ID No: 1]. Un monómero de hebra sencilla de Ad.AV.CMVlacZ parece estar presente en el extracto crudo; sin embargo, no fue sino hasta que se concentraron los viriones por ultracentrifugación de densidad flotante que el genoma de hebra única llego a ser claramente evidente. El genoma recombinante de hebra única del virus se distribuye sobre un rango de densidades CsCl y revela un patrón de formación de banda bifásico. Los dos picos de genoma de hebra sencilla de rAAV ocurre en densidades de 1.41 y 1.45 g/ml CsCl, consistente con las densidades flotantes reportadas de tipo silvestre AAV en CsCl [L. M. de la Maza et al, J. Virol., 33:1129-1137 (1980)]. El análisis de las fracciones que corresponden a las dos formas de vectores reveló las especies rAAV-1.41 que fueron de varios órdenes de magnitud más activos para la transducción Lacz para la variante de condensador rAAV-1.45 g/ml. Para evitar confusión con las muestras Ad. AAV recombinantes se calienta e inactiva (60ºC durante 30 min) antes de ser agrega do al indicador de células HeLa.

Las fracciones de pico del rAAV-1.41 se combinan y purifican por sedimentación de equilibrio en CsCl para eliminar partículas d adenovirus residual y concentrar viriones rAAV. En la ronda final de ultracentrifugación, se observa una banda opaca débil pero claramente visible en el medio del tubo de gradiente. Las fraccione que rodean la banda se evalúan para densidad, absorbancia a 260 nm, y partículas de transducción LacZ. Como la banda se diluye del tubo de gradiente, un pico bien definido de 260 nm absorbe material que se registra, con una absorbancia máxima que ocurre en una densidad de 1.40 g/ml CsCl. El análisis para partículas de transducción LacZ en células Hela revela un pico de actividad que refleja el perfil de absorbancia. Estos resultados indican que el rAAV se produce del virus Ad. AAV híbrido. Adicionalmente los títulos alcanzados que utilizan el virus híbrido fueron 5-10 veces elevados comparados con esquemas de producción AVV recombinantes mas convencionales (es decir, las transfecciones con plásmidos que actúan cis- y trans-). Esto representan una mejora significativa en la producción rAAV e indica que el híbrido es útil para producción rAAV a gran escala.

Todas la referencias descritas anteriormente se incorporan aquí como referencia. Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención se incluyen en la especificación identificada anteriormente y se espera que sean obvias para un experto en la técnica. Tales modificaciones y alteraciones a las composiciones y procesos de la presente invención, tal como aquellas modificaciones que permiten el uso óptimo de virus híbrido como vehículos de terapia de gen o vehículos de producción para producción AAV recombinante, se cree están abarcados en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (20)

1. Un virus híbrido de replicación defectuosa, recombinante que comprende:

(a)

secuencias de adenovirus que comprenden los elementos cis-5' y 3' de adenovirus necesarios para la replicación y encapsidación de viriones, dichas secuencias de adenovirus comprenden una eliminación funcional en el gen E1 adenovirus y una eliminación de una porción del gen E3 pero comprende un gen E2 funcional y un gen E4;

(b)

secuencias (AAV) de virus adeno-asociado que comprende las repeticiones terminales invertidas 5' y 3' (ITRs) de un AAV, dichas secuencias AAV se flanquean por los elementos cis-5' y 3'; y

(c)

un transgen seleccionado operativamente ligado a secuencias que regulan su expresión en una célula objetiva, dicha secuencia reguladora y transgen se flanquean por las secuencias AAV o (b),

el virus híbrido se suministra con suficientes secuencias de adenovirus para permitir la infección de una célula objetivo.

2. Un virus híbrido de replicación defectuosa, recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de adenovirus comprende genes tardíos funcionales L1 a L5.

3. Un virus híbrido de replicación defectuosa, recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha secuencia de adenovirus comprende un gen intermedio funcional IX.

4. Un virus híbrido de replicación defectuosa, recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho transgen seleccionado es un gen reportero.

5. Un virus híbrido de replicación defectuosa, recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho gen reportero se selecciona del grupo que consiste de los genes que codifican \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y proteína fluorescente verde.

6. Un virus híbrido de replicación defectuosa, recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho transgen seleccionado es un gen terapéutico.

7. Un virus híbrido de replicación defectuosa, recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho gen terapéutico se selecciona del grupo que consiste de un gen regulador de transmembrana de transmembrana de fibrosis cística normal (CFTR) y gen receptor de lipoproteína de densidad baja normal (LDL).

8. Un virus híbrido de replicación defectuosa, recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las secuencias que regulan la expresión de dichas secuencias que comprenden transgen seleccionadas del grupo que consiste del mejorador/promotor inmediatamente anterior citomegalovirus, el promotor/mejorador LTR de carcoma de Rous, y el promotor \beta-actina de pollo.

9. Un virus híbrido de replicación defectuosa, recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente una porción funcional de un gen rep AAV ligado operativamente a las secuencias que regulan su expresión.

10. Un virus híbrido de replicación defectuosa, recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha porción funcional de dicho gen rep codifica las proteínas rep 78 y 52.

11. Un vector híbrido de replicación defectuosa, recombinante que comprende:

(a)

secuencias de adenovirus que comprenden los elementos cis-5' y 3' de adenovirus necesarios para la replicación y encapsidación de viriones, dichas secuencias de adenovirus comprenden una eliminación funcional en el gen E1 adenovirus y una eliminación de una porción del gen E3 pero comprende un gen E2 funcional y un gen E4;

(b)

secuencias (AAV) de virus adeno-asociado que comprende las repeticiones terminales invertidas 5' y 3' (ITRs) de un AAV, dichas secuencias AAV se flanquean por los elementos cis-5' y 3'; y

(c)

un transgen seleccionado operativamente ligado a secuencias que regulan su expresión en una célula objetiva, dicha secuencia reguladora y transgen se flanquean por las secuencias AAV o (b),

12. Una composición para uso en el suministro de un gen seleccionado en el cromosoma de una célula objetivo, dicha composición comprende

(a)

Un virus híbrido, de replicación defectuosa, recombinante, de acuerdo con la reivindicación 9 o 10; y

(b)

Un portador farmacéuticamente aceptable.

13. Una célula de mamífero que contiene un virus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un vector de acuerdo con la reivindicación 11.

14. Un método para al producción alta de titulo de virus adeno-asociado recombinante (AAV) en una célula cultivada que comprende la etapa de cultivar una célula que contiene un virus híbrido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una célula cotransfectada con un vector de acuerdo con la reivindicación 11, en la presencia de un gen rep AAV bajo el control de secuencias que regulan la expresión de dicho gen rep y en la presencia de un gen cap AAV bajo el control de secuencias que regulan la expresión de dicho gen cap.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la célula se co-transfecta con el vector en la presencia de un virus auxiliar.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, que comprende adicionalmente la etapa de aislar de dicho cultivo un AAV recombinante.

17. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en donde el gen rep se lleva a cabo sobre un plásmido.

18. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 en donde el gen cap se lleva a cabo sobre un plásmido.

19. Un método para producción mayor de titulo de un adenovirus híbrido recombinante, que comprende la etapa de cocultivar una célula huésped que contiene un vector híbrido de acuerdo con la reivindicación 11 y un adenovirus adicional opcional, en donde la célula huésped y/o el virus auxiliar suministran al vector híbrido las secuencias de adenovirus necesarias para generar u adenovirus híbrido recombinante.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende adicionalmente la etapa de aislar de dicho cultivo el adenovirus híbrido recombinante.