PT797678E - Virus adenovirus-aav hibridos e metodos para a sua utilizacao - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "VÍRUS ADENOVIRUS- AAV HÍBRIDOS E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO" A presente invenção foi suportada pela bolsa do National Institute of Health No. P30 DK 47757. Os Estados Unidos detêm direitos sobre a presente invenção. Âmbito da invenção A presente invenção refere-se ao campo dos vectores úteis na terapia de genes somáticos e sua produção.
Antecedentes da invenção
Os adenovirus recombinantes são capazes de proporcionar níveis extremamente elevados de fornecimento transgénico, praticamente a todos os tipos de células, independentemente do estado mitótico. Podem-se produzir facilmente títulos elevados (1013 unidades formadoras de placas/ml) de vírus recombinante em células 293 (o equivalente para adenovirus às linhas celulares de empacotamento de retrovírus) e armazenar, congelados, durante períodos longos, sem perdas apreciáveis. A limitação principal destes vírus, como vectores, reside na complexidade do genoma do adenovirus. Um adenovirus humano é constituído por um genoma de ADN de cadeia dupla, linear, de aproximadamente 36 kb, o qual se divide em 100 unidades map (m.u.), tendo cada uma 360 pb de comprimento. O ADN contém repetições terminais invertidas (ITR), curtas, em cada extremidade do genoma, as quais são necessárias para a replicação do ADN virai. Os produtos dos genes estão 1
U, organizados em regiões precoces (El a E4) e tardias (LI a L5), baseadas na expressão antes ou depois da iniciação da síntese de ADN virai [veja-se, e.g., Horwitz, Virology, 2a ed, Ed. B.N. Fields, Raven Press, Ltd., Nova Iorque (1990)].
Um adenovírus humano está submetido a um programa altamente regulado, durante o seu ciclo de vida virai, normal [Y. Yang et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:4407-4411 (1994)]. Os viriões são internalizados por endocitose mediada por receptor e transportados até ao núcleo, onde os genes precoces imediatos, Ela e Elb são expressos. Devido ao facto destes produtos de genes precoces regularem a expressão de uma variedade de genes hospedeiros (que induzem a célula para a produção de vírus) e serem centrais na activação em cascata de genes atrasados, precoces (e.g. E2, E3 e E4), seguidos de genes tardios (e.g. Ll-5), as primeiras produções de adenovírus recombinantes para terapia genética focaram-se na remoção do domínio El. Esta estratégia teve sucesso em tornar os vectores defeituosos para a replicação, no entanto, estudos in vivo revelaram que a expressão transgénica era transiente e estava invariavelmente associada com o desenvolvimento de inflamação grave no local alvo do vector [S. Ishibashi et al. J. Clin. Invest. 93:1885-1893 (1994); J.M. Wilson et al. Proc. Natl, Acad. Sei.USA, 85:4421-4424 (1988); J.M. Wilson et al., Clin. Bio., 3:21-26 (1991); M. Grossman et al. Som. Cell. and Mol. Gen. 17:601-607 (1991)].
Os vírus adeno-associados (AAV) também têm sido utilizados como vectores. 0 AAV é um vírus de ADN pequeno, de cadeia simples (ss), com uma organização genóraica simples (4,7 kb), que o torna um substrato ideal para manipulação genética. Duas sequências de leitura aberta codificam para uma série de polipéptidos rep e cap. Os polipéptidos rep (rep78, rep68, rep62 e rep40) estão envolvidos na replicação, recuperação e integração do genoma AAV. As proteínas cap (VP1, VP2 e VP3) formam a cápside do virião. Flanqueadoras âs sequências de leitura aberta rep e cap nas extremidades 5' e 3', encontram- 2
se repetições terminais invertidas (ITRs) de 145 pb, cujos primeiros 125 pb são capazes de formar estruturas duplex em forma de Y- ou T-. De relevância para o desenvolvimento de vectores AAV, os domínios rep e cap inteiros podem ser excisados e substituídos por um transgene terapêutico, ou repórter [B.J. Cárter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155-168 (1990)]. Verificou-se que os ITRs representam a sequência mínima necessária para a replicação, recuperação, empacotamento e integração do genoma AAV. 0 ciclo de vida do AAV é bifásico, composto quer de episódios latentes, quer líticos. Durante uma infecção latente, os viriões AAV entram numa célula como um ADNss encapsidado e pouco tempo depois são fornecidos ao núcleo, onde o ADN de AAV integra, de forma estável, num cromossoma do hospedeiro, sem a necessidade aparente de divisão celular do hospedeiro. Na ausência de vírus ajudantes, o genoma de AAV de ADNss permanece latente, mas capaz de ser activado e recuperado. A fase lítica do ciclo de vida começa quando uma célula que alberga um pró-vírus AAV é desafiada com uma segunda infecção, por um vírus de herpes ou adenovírus, que codifica para as funções ajudantes, recrutadas pelo AAV para auxiliar a sua excisão da cromatina do hospedeiro [B. J. Cárter, citado acima]. O ADNss progenitor infeccioso é expandido para ADNs duplex de forma replicativa (RF) de um modo dependente de rep. Os genomas AAV recuperados são empacotados em cápsides de proteína pré-formadas (simetria icosaédrica de aproximadamente 20 nm de diâmetro) e libertados como viriões infecciosos, que têm empacotados, ou genomas ADN ss +, ou -, após a lise celular. 0 progresso no estabelecimento do AAV como um vector de transdução para terapia genética tem sido lento, por várias razões. Apesar da capacidade do AAV se integrar em células quiescentes ser importante, em termos de expressão a longo termo de um gene transdutor potencial, a tendência do pró-vírus integrado se direccionar preferencialmente apenas para 3 locais específicos no cromossoma 19, reduz a sua utilidade. Adicionalmente, existem várias dificuldades na produção em grande escala de recombinantes defeituosos para a replicação. Em contraste com a produção de retrovírus, ou adenovírus recombinantes, os únicos meios amplamente reconhecidos para a produção de viriões de AAV transdutores, englobam a co-transfecção com dois plasmídeos diferentes, mas no entanto complementares. Um destes contém o minigene terapêutico, ou repórter, ensaduichado entre os dois ITRs de AAV que actuam em cis. Os componentes de AAV necessários para recuperar e empacotar subsequentemente os genomas recombinantes descendentes, são proporcionados em trans, por um segundo plasmídeo que codifica para sequências de leitura aberta para proteínas rep e cap. As células alvo para a transfecção deverão ser também infectadas com adenovírus, que proporcionam assim as funções ajudantes necessárias. Devido ao facto de o rendimento em AAV recombinante ser dependente do número de células que são transfectadas com os plasmídeos que actuam em cis e trans, é desejável utilizar um protocolo de transfecção com uma eficiência elevada. Para a produção em grande escala de vírus de título elevado, no entanto, os sistemas de fosfato de cálcio e de lipossomas de eficácia elevada, anteriormente utilizados são incómodos e inconsistentes.
Persiste a necessidade na arte, de desenvolver vectores que ultrapassem as desvantagens dos sistemas vectores conhecidos. A W093/24641 descreve um vector virai que contém sequências de repetição terminal invertidas (ITR), de vírus adeno-associados (AAV), que flanqueiam uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga. Descreve a utilização de ITRs de AAV como promotores de transcrição competentes, sem um promotor independente. 4
Sumário da invenção
Num aspecto, a presente invenção proporciona um virus híbrido, defeituoso para a replicação, que compreende: (a) sequências de adenovírus que compreendem os elementos-cis 5' e 3', necessários para a replicação e encapsidação de viriões, em que as referidas sequências de adenovírus compreendem uma delecção funcional em cada um dos genes El, E2, E3 e E4 do adenovírus. (b) sequências adeno-associadas (AAV) que compreendem as repetições terminais invertidas (ITRs) 5' e 3' de um AAV, em que as referidas sequências de AAV são flanqueadas pelas sequências de adenovírus de (a); e (c) um transgene seleccionado, ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão, numa célula alvo, sendo o referido transgene e sequências reguladoras flanqueados pelas sequências de AAV de (b), em que o vírus híbrido é proporcionado com sequências de adenovírus suficientes, para permitir a infecção de uma célula alvo e a integração estável do transgene na célula alvo, na presença de uma porção funcional de um gene rep de AAV.
Assim, o único vírus adenovírus/AAV híbrido, recombinante, da invenção, compreende uma cápside de adenovírus contendo porções seleccionadas de uma sequência de adenovírus, sequências ITR de AAV 5' e 3', que flanqueiam um transgene seleccionado, sob o controlo de um promotor seleccionado e outros componentes reguladores do vector, convencionais. Este vírus híbrido tem um fornecimento de transgene a uma célula hospedeira, de título elevado, e a capacidade de integrar de forma estável o transgene no cromossoma da célula hospedeira, na presença do gene rep. Numa forma de concretização, o transgene é um gene repórter. Outra L-Cj ^ forma de concretização do vírus híbrido contém um transgene terapêutico. Numa forma de concretização preferida, o vírus híbrido tem associado a ele uma sequência policatiónica e o gene rep de AAV. A construção é designada como o conjugado do vírus híbrido, ou partícula de trans-infecção.
Noutro aspecto, o presente invento proporciona um vector híbrido defeituoso para a replicação, recombinante, que compreende: (a) sequências de adenovírus que compreendem os elementos cis 5' e 3' do adenovírus, necessários para a replicação e encapsidação do virião, em que as referidas sequências do adenovírus compreendem uma delecção funcional em cada um dos genes El, E2, E3 e E4 do adenovírus. (b) sequências de vírus adeno-associadas (AAV), que compreendem as repetições terminais invertidas (ITRs) 5' e 3' de um AAV, sendo as referidas sequências de AAV flanqueadas pelas sequências de adenovírus de (a); e (c) um transgene seleccionado, ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão numa célula alvo, sendo as referidas sequências do transgene e reguladoras flanqueadas pelas sequências de AAV de (b).
Assim, este vector híbrido compreende porções seleccionadas de uma sequência de adenovírus, sequências ITR de AAV 5' e 3', que flanqueiam um transgene seleccionado sob o controlo de um promotor seleccionado e outros componentes reguladores de vector, convencionais.
Num outro aspecto o invento proporciona uma partícula de trans-infecção recombinante, que compreende: (a) vírus híbrido defeituoso para a replicação, recombinante, que compreende: 6
V
ΐ· (i) sequências de adenovírus compreendendo os elementos cis 5' e 3' do adenovírus, necessários para a replicação e encapsidação do virião; (ii) sequências de vírus adeno-associado (AAV) compreendendo as repetições terminais invertidas (ITRs) 5' e 3', de um vírus adeno-associado, sendo as referidas sequências de AAV flanqueadas pelas sequências de adenovírus de (i) e (iii) um transgene seleccionado, ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão numa célula alvo, sendo o referido gene e sequências reguladoras flanqueados pelas sequências de AAV de (ii) , em que o vírus híbrido tem sequências de adenovírus suficientes para permitir a ínfecção de uma célula alvo e a integração, de forma estável, do transgene numa célula alvo, na presença de uma porção funcional de um gene rep de AAV; (b) sequência policatiónica conjugada com o referido vírus híbrido; e (c) plasmídeo que compreende uma porção funcional de um gene rep de AAV, ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão, estando o referido plasmídeo associado com a referida sequência policatiónica. A invenção proporciona também uma composição para utilização no fornecimento e integração, de forma estável, de um gene seleccionado, no cromossoma de uma célula alvo, em que a referida composição compreende (a) um vírus híbrido, defeituoso para a replicação, recombinante, de acordo com a invenção, que compreende ainda uma porção funcional de um gene rep de AAV, ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão; e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável. 7
u
Pode-se utilizar uma composição deste tipo para fornecer um gene terapêutico a uma célula hospedeira alvo, para tratar ou corrigir uma desordem, ou doença geneticamente associada.
Ainda noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a produção de um virus híbrido numa célula em cultura, que compreende o passo de fazer a cultura de uma célula co-transfectada com o vector híbrido da invenção, na presença de um plasmídeo contendo um gene rep de AAV, sob o controlo de sequências que regulam a expressão do referido gene rep e, de preferência, na presença de um vírus ajudante. Alternativamente, a célula a ser cultivada pode compreender o vírus híbrido da invenção e um plasmídeo que contém um gene rep de AAV sob o controlo de sequências que regulam a expressão do gene.
Ainda noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a produção de vírus adeno-associados (AAV), recombinantes, numa célula em cultura, compreendendo o passo de fazer a cultura de uma célula transfectada com a partícula de trans-infecção da invenção.
As partículas de AAV recombinantes podem ser recolhidas a partir de uma linha celular de empacotamento, transfectada com o vector, ou as partículas, ou o vírus.
Descrição sumária das figuras A Fig. IA é um diagrama esquemático de uma construção de um vector pAd.AVCMVLacZ[SEQ ID N0:1], que contém (desde o topo no sentido dos ponteiros do relógio) , as unidades map 0-1 da sequência de adenovírus (barra vazia); a ITR de AAV 5' (barra a cheio); o potenciador/promotor precoce imediato de CMV (seta a tracejado); um intrão de SV40 (barra vazia), um ADNc de beta-galactosidase (LacZ) de E. coli (linha a ponteado); um sinal de poliadenilação de SV40 (barra vazia) , um ITR de AAV 3' (barra a cheio), sequência de adenovírus das unidades map 8
9-16 (barra vazia) e uma porção de um plasmídeo derivado de pBR322 (linha a cheio, fina). As enzimas endonucleases de restrição estão identificadas pelas suas designações convencionais; e a localização de cada enzima de restrição está identificada pelo número de nucleótido entre parêntesis, à direita da designação da enzima. A Fig. 1B é um esquema que mostra a linearização de pAd.AV.CMVLacZ[SEQ ID N0:1] por digestão com a enzima de restrição Nhel e um arranjo linear de um adenovirus tipo 5, digerido com Ciai, com delecções de mu 0-1. A área onde irá ocorrer a recombinação homóloga (entre m.u. 9-16), em ambas, a sequência de plasmídeo e de adenovirus, está indicada por linhas cruzadas A Fig. 1C é um esquema que mostra o vírus híbrido Ad.AV.CMVLacZ após co-transfecção do pAd.Av.CMVLacZ[SEQ ID NO:l] linearizado e adenovirus, em células 293, seguido de recombinação homóloga intracelular.
As Fig. 2A-2K referem-se à cadeia de ADN de topo do plasmídeo pAd.AV.CMVLacZ[SEQ ID NO:l] de cadeia dupla (a cadeia complementar pode ser facilmente derivada por um perito na arte). Em relação à SEQ ID N0:1, os nucleótidos 1-365 são sequências do tipo 5 de adenovirus; a sequência ITR de AAV 5' abrange os nucleótidos 366-538; o promotor/indutor de CMV abrange os nucleótidos 563-1157; o intrâo de SV40 abrange os nucleótidos 1158-1179; o gene de LacZ abrange os nucleótidos 1356-4827; A sequência poli A de SV40 abrange os nucleótidos 4839-5037; O ITR de AAV 3' abrange os nucleótidos 5053 a 5221; os nucleótidos 5221 a cerca de 8100 são sequências do tipo 5 de adenovirus. As sequências remanescentes são sequências não específicas/de plasmídeo. A Fig. 3 é um gráfico de barras de absorvência u.v a 420 nm da cor azul de beta-galactosidase para um clone controlo e dez clones positivos, putativos (DIA até DlJ), de células 293 9 transfectadas com o híbrido recombinante, Ad.AV.CMVLacZ. Oito dos clones expressaram níveis elevados de enzima. A Fig. 4 é um diagrama esquemático de pRep78/52[SEQ ID N0:2]. Este plasmídeo inclui um promotor P5 de AAV, Rep78, Rep52 e uma sequência poli-A, num plasmídeo pUC18 como base.
As Figs. 5A-5E mostram os nucleótidos 1-4910 da cadeia de ADN de topo do plasmídeo de cadeia dupla pRep78/52[SEQ ID No:2] (a cadeia complementar pode ser facilmente derivada por um perito na arte). A Fig. 6 é um fluxograma da construção de uma partícula de trans-infecção, formada por um virus híbrido, uma sequência de poli-L-lisina e um plasmídeo contendo rep de AAV, ligado. A Fig. 7 é um fluxograma do ciclo de vida do vírus híbrido, em que a partícula de trans-infecção entra na célula e é transportada para o núcleo. 0 vírus é não revestido e o rep medeia a recuperação do gene inserido, que é por sua vez integrado no cromossoma da célula hospedeira.
Descrição pormenorizada da invenção A presente invenção proporciona um veículo de transferência de genes único, que ultrapassa muitas das limitações dos vectores virais da arte anterior. Este vírus híbrido, manipulado, contém domínios de adenovírus seleccionados e domínios de AAV seleccionados, bem como elementos transgénicos e reguladores seleccionados, numa cápside virai. Este novo vírus híbrido resolve os problemas observados com outros genes de terapia genética, convencionais, pois é caracterizado pela capacidade de proporcionar níveis extremamente elevados de fornecimento transgénico, a quase todos os tipos de células (conferida pela sua sequência de adenovírus) e a capacidade de proporcionar uma integração de transgenes de longo termo, estável, na Γ u célula hospedeira (conferida pelas suas sequências de AAV). 0 vírus híbrido adenovírus-AAV da invenção, tem utilidade quer como um novo veiculo de transferência de genes, quer como reagente num método para a produção de AAV recombinante, em grande escala.
Numa forma de concretização preferida, proporciona-se uma partícula de trans-infecção, ou conjugado de vírus híbrido, composto pelo vírus híbrido Ad/AAV, conjugado com um plasmideo de expressão rep, através de uma ponte de poli-lisina. Esta partícula de trans-infecção é vantajosa porque o transportador de adenovírus pode ser crescido a títulos suficientes para a infecção, de MOI elevado, de um grande número de células, o genoma adenoviral é transportado eficazmente para o núcleo de células em não divisão, na forma de um complexo que facilita a transdução em células mitoticamente quiescentes e a incorporação do plasmideo rep na partícula de trans-infecção proporciona uma expressão elevada, mas transiente, de rep, que é necessária quer para a recuperação do ADN de AAVr, quer para uma integração eficaz e específica do local. I. Construção do vector e vírus híbrido A. A componente adenovírus do vector e vírus 0 vírus híbrido da presente invenção utiliza sequências de ácidos nucleicos de adenovírus como um veículo para fornecer um genoma AAV recombinante/transgene a uma célula alvo. As sequências de ADN de vários tipos de adenovírus, incluindo o tipo Ad5, estão disponíveis no Genbank. As sequências de adenovírus podem ser obtidas a partir de qualquer tipo de adenovírus conhecido, incluindo os 41 tipos humanos actualmente identificados [Horwitz et al., citado acima]. Também se podem utilizar nas construções de vectores da invenção, adenovírus semelhantes, que se sabe infectarem outros animais. Não é esperado que a selecção do tipo de adenovírus limite a invenção. Há uma variedade de estirpes de 11
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L·, t adenovírus disponível da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ou disponíveis por pedido a partir de uma variedade de fontes comerciais e institucionais. No exemplo seguinte de uma forma de concretização, utiliza-se um adenovírus tipo 5 (Ad5), para conveniência.
As sequências de ácido nucleico de adenovírus utilizadas no vector híbrido da invenção, podem variar desde uma quantidade mínima de sequência, que requer a utilização de um vírus ajudante, para produzir a partícula de vírus híbrido, até apenas delecções seleccionadas de genes do adenovírus, cujos produtos do gene deletado podem ser fornecidos no processo de produção do híbrido virai, por uma célula de empacotamento seleccionada. Especificamente, num mínimo, as sequências de ácidos nucleicos do adenovírus utilizadas no vector veículo pAdA desta invenção, são sequências genómicas de adenovírus a partir das quais todos os genes virais são deletados e que contêm apenas as sequências de adenovírus necessárias para empacotar o ADN genómico adenoviral numa cabeça de cápside pré-formada. Mais especificamente, as sequências de adenovírus utilizadas são as sequências de repetição terminal invertida (ITR) 5' e 3', que actuam em cis, de um adenovírus (que funciona como origem de replicação) e o domínio de empacotamento/indutor 5', nativo, que contém as sequências necessárias para empacotar genomas Ad lineares e elementos indutores para o promotor El. De acordo com a presente invenção, toda a sequência 5' do adenovírus que contém a região ITR e indutora/empacotamento 5', pode ser utilizada como a sequência 5' de adenovírus no vírus híbrido. Esta sequência terminal esquerda (5') do genoma Ad5, útil na presente invenção abrange os pares de base 1 a cerca de 360 do genoma de adenovírus convencional, também referido como unidades map 0-1 do genoma virai e é geralmente de cerca de 353 a cerca de 360 nucleótidos em comprimento. Esta sequência inclui a 5'ITR (pb 1-103 do genoma do adenovírus) e o domínio empacotamento/indutor (pb 194-358 do genoma do adenovírus). De preferência, esta região 5' do adenovírus nativo é utilizada 12 no vírus e vector híbridos, na forma não modificada. Alternativamente, as sequências correspondentes de outros tipos de adenovírus podem ser substituídas. Estas sequências Ad podem ser modificadas para conter as delecções, substituições, ou mutações desejadas, desde que a função desejada não seja eliminada.
As sequências 3' de adenovírus do vírus híbrido incluem a sequência ITR terminal da direita (3') do genoma do adenovírus, que abrange cerca de 35.353 pb - fim do genoma adenoviral, ou unidades map de ~98,4-100. Esta sequência é geralmente de cerca de 580 nucleótidos de comprimento. Esta sequência total é desejavelmente utilizada como a sequência 3' de um vírus híbrido. De preferência, a região 3' do adenovírus nativo é utilizada no vírus híbrido na forma não modificada. No entanto, como descrito acima, em relação às sequências 5', poderão ser aceitáveis algumas modificações destas sequências, que não afectem de forma adversa a sua função biológica. Como se descreve a seguir, quando estas sequências de adenovírus 5' e 3' são utilizadas no vector híbrido, é necessário um adenovírus ajudante que forneça todos os outros genes, essenciais para a formação virai, sozinho ou com uma linha celular de empacotamento, para a produção do vírus ou partícula virai, híbridos. O vector e vírus híbridos podem conter sequências de adenovírus além das sequências mínimas, que contêm delecções funcionais em cada uma das regiões El, E2, E3 e E4. Alternativamente, uma partícula de trans-infecção que contém o vírus híbrido pode conter apenas as sequências mínimas de adenovírus, ou pode conter sequências adicionais, que contêm delecções de todos, ou parte, dos genes de adenovírus. Por exemplo, o gene precoce imediato Ela de adenovírus (que abrange as mu 1,3 a 4,5) e o gene precoce atrasado Elb (que abrange as mu 4,6 a 11,2) deverão ser eliminados da sequência de adenovírus que forma uma parte da construção do vector híbrido e do vírus híbrido. Alternativamente, se estas 13
sequências não são completamente eliminadas, pelo menos uma porção suficiente das sequências Ela e Elb deve ser eliminada, de modo a tornar o virus defeituoso para a replicação. Estas delecções, quer completas, quer parciais, que eliminam a função biológica do gene, são designadas aqui por "delecções funcionais".
Adicionalmente, todo ou uma porção do gene precoce atrasado, E3 de adenovirus (que abrange as mu 76,6 a 86,2) pode ser eliminado da sequência de adenovirus que forma uma parte do virus híbrido. A função de E3 é irrelevante para a função e produção do vírus híbrido.
Pode-se eliminar todo, ou uma porção do gene precoce atrasado E2a, do adenovirus (que abrange as mu 67,9 a 61,5) do vírus híbrido. Também se prevê que porções dos outros genes precoces atrasados E2b (que abrange as mu 29 a 14,2) e E4 (que abrange as mu 96,8 a 91,3) também possam ser eliminadas do vírus híbrido e do vector.
Também se podem efectuar delecções em quaisquer dos genes tardios LI a L5, que abrange as mu 16,45 a 99 do genoma do adenovirus. Igualmente, poderão ser úteis delecções nos genes intermédios IX, que estão mapeados entre mu 9,8 e 11,2 e IVa2 que está mapeado entre 16,1 e 11,1. Podem ocorrer outras delecções nos outros adenovirus estruturais, ou não estruturais.
As delecções acima discutidas podem ocorrer individualmente, i.e. uma sequência de adenovirus para utilização na presente invenção pode conter delecções apenas de El. Alternativamente, podem ocorrer, em qualquer combinação, delecções de genes totais, ou de porções eficazes em destruir a sua actividade biológica. Por exemplo, num exemplo de vector híbrido, a sequência de adenovirus pode conter delecções dos genes El e do gene E3 ou dos genes El, 14
V
u E2a e E3, ou dos genes EI e E4, ou dos genes El, E2a e E4, com, ou sem delecção do E3 e assim sucessívamente.
Quanto maior for o número de delecções na sequência de adenovirus, até ao mínimo de sequências identificadas acima que caracterizam o vírus híbrido, maior será a sequência(s) dos outros componentes a seguir descritos, a ser inseridos no vector híbrido. Como descrito acima para as sequências de adenovirus mínimas, as sequências de genes não presentes na porção de adenovirus do vírus híbrido, deverão ser fornecidas, ou por uma linha celular de empacotamento e/ou por ura adenovirus ajudante, para produzir o vírus híbrido.
Num exemplo de vírus híbrido de acordo com a invenção, descrito a seguir no Exemplo 1, as sequências genómicas de adenovirus presentes são de mu 0 a 1, mu 9 a 78,3 e mu 86 a 100 (as sequências deletadas, eliminam os genes Ela e Elb e uma porção do gene E3) . Pela informação anterior, é esperado que um perito na arte possa construir vectores híbridos e vírus contendo mais ou menos sequência do gene de adenovirus.
As porções do genoma de adenovirus no vírus híbrido permitem a produção de títulos elevados de vírus a ser produzidos, muitas vezes mais do que 1 x 1013 pfu/ml. Isto contrasta grandemente com os títulos baixos (1 x 106 pfu/ml) encontrados para o AAV recombinante. B. Componentes AAV do vector e vírus
Também fazem parte dos vectores e vírus híbridos da invenção, as sequências de um vírus adeno-associado. As sequências AAV úteis no vector híbrido são as sequências virais a partir das quais são eliminadas as sequências que codificam para os polipéptidos rep e cap. Mais especificamente, as sequências AAV utilizadas são as sequências de repetição terminal invertida (ITR) 5' e 3' que actuam em cis [Veja-se e.g., B.J. Cárter em "Handbook of 15
Parvoviruses", ed. P.Tijsser, CRC Press, pp. 155-168 (1990)]. Como referido acima, as sequências ITR têm cerca de 143 pb de comprimento. Substancialmente, as sequências totais que codificam para os ITRs são utilizadas nos vectores, embora possa ser permitida, nalguma extensão, uma modificação menor destas sequências, para esta utilização. Veja-se, e.g. W093/24641, publicada em 9 de Dezembro de 1993. A capacidade para modificar estas sequências ITR faz parte da arte. Para técnicas adequadas, veja-se, e.g., livros como Sambrook et al. "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1989).
As sequências ITR de AAV podem ser obtidas a partir de qualquer AAV conhecido, incluindo os tipos de AAV humanos actualmente identificados. Igualmente, os AAV que se sabe infectarem outros animais podem também ser utilizados nas construções de vector desta invenção. Não se pretende que a selecção do AAV limite a invenção. Há uma variedade de estirpes de AAV, tipos 1-4, disponíveis da American Type Culture Collection, ou disponíveis por pedido, a partir de uma variedade de fontes comerciais e institucionais. No exemplo da forma de concretização seguinte, utiliza-se um AAV-2 para conveniência.
Na construção de vector híbrido, as sequências AAV são flanqueadas pelas sequências de adenovírus seleccionadas, acima discutidas. As sequências de ITR de AAV 5' e 3', flanqueiam, elas próprias, uma sequência de transgene seleccionada e elementos reguladores associados, a seguir descritos. Assim, a sequência formada pelo transgene e sequências de AAV 5' e 3' flanqueadoras, podem ser inseridas em qualquer local de delecção nas sequências de adenovírus do vector. Por exemplo, as sequências de AAV são desejavelmente inseridas no local dos genes Ela/Elb deletados do adenovírus, i.e. após a unidade map 1. Alternativamente, as sequências AAV podem ser inseridas numa delecção E3, delecção E2a, etc. Se apenas se utilizam as sequências ITR/empacotamento 5' de 16 adenovírus e as sequências ITR 3' no virus híbrido, as sequências AAV são inserias entre estas. C. 0 componente transgéníco do vector e vírus híbridos A sequência transgénica do vector e vírus recombinante é uma sequência de ácidos nucleicos ou um transcrito inverso desta, heterólogo à sequência de adenovírus que codifica para um polipéptido, ou proteína de interesse. 0 transgene está ligado de forma operacional a componentes reguladores, de um modo que permite a transcrição do transgene. A composição da sequência do transgene dependerá da utilização dada ao vector híbrido resultante. Por exemplo, um tipo de sequência transgénica inclui uma sequência repórter, que por expressão produz um sinal detectável. Estas sequências repórter incluem, sem limitação, um ADNc de beta-galactosidase(LacZ) de E. coli, um gene de fosfatase alcalina e um gene de proteína fluorescente, verde. Estas sequências, quando associadas com elementos reguladores que controlam a sua expressão, proporcionam sinais detectáveis por meios convencionais, e.g. absorvência a comprimentos de onda do ultravioleta, alterações de cor visíveis, etc.
Outro tipo de sequência transgénica inclui um gene terapêutico, que expressa um produto genético desejado numa célula hospedeira. Estes genes terapêuticos, ou sequências de ácidos nucleicos, codificam tipicamente para produtos para administração e expressão num paciente in vivo, ou ex vivo, para substituir ou corrigir um defeito genético herdado, ou não herdado, ou para tratar uma desordem, ou doença epigenética. Estes genes terapêuticos que são desejáveis para a performance da terapia genética incluem, sem limitação, um gene regulador transmembranar da fibrose quística (CFTR), normal, um gene receptor de lipoproteína de densidade baixa (LDL) e vários genes que podem ser facilmente seleccionados por um perito na arte. A selecção do transgene não é 17 ? considerada uma limitação da presente invenção, dado que essa selecção está dento do conhecimento dos peritos na arte. D. Elementos reguladores do vector híbrido
Além dos elementos principais identificados acima para o vector híbrido, i.e. as sequências de adenovírus, as sequências de AAv e o transgene, o vector inclui também elementos reguladores convencionais, necessários para controlar a expressão do transgene, numa célula transfectada com o vector híbrido. Assim, o vector contém um promotor seleccionado que está ligado ao transgene e localizado, com o transgene, entre as sequências ITR de AAV do vector. A selecção do promotor é rotineira e não constitui uma limitação do próprio vector híbrido. Os promotores úteis podem ser promotores constitutivos, ou promotores regulados (inductíveis), que permitirão o controlo da quantidade de transgene a ser expressa. Por exemplo, um promotor desejável é o indutor/promotor precoce imediato de cítomegalovírus [veja-se, e.g. Boshart et al., Cell, 4JL:521-530 (1985)]. Outros promotores desejáveis incluem, sem limitação, o promotor/indutor LTR do vírus de sarcoma de Rous e o promotor de β-actina de galinha. 0 perito na arte poderá seleccionar ainda outras sequências promotor/indutor.
Os vectores conterão também, desejavelmente, sequências de ácidos nucleicos heterólogas às sequências de adenovírus, incluindo sequências que propocionam sinais necessários para uma poliadenilação eficaz do transcrito e intrões com locais dadores e aceitadores de corte e rearranjo ("splice") funcionais. Uma sequência poli-A comum, que é utilizada nos exemplos de vectores da invenção, é a derivada do papovavírus SV-40. A sequência poli-A é geralmente inserida no vector após as sequências dos transgenes e antes da sequência ITR de AAV 3'. Uma sequência de intrão comum é também derivada de SV40 e é referida como a sequência de intrão T de SV-40. Um vector 18 1--
híbrido da presente invenção pode conter também um intrão deste tipo, localizado desejavelmente entre a sequência de promotor/indutor e o transgene. A selecção deste e outros elementos de vector comuns é convencional e muitas destas sequências estão disponíveis [veja-se, e.g. Sambrook et al. e as referências aí citadas]. As sequências de ADN que codificam para estas regiões reguladoras são fornecidas na sequência de plasmídeo da Fig. 2 [SEQ ID N0:1] A combinação do transgene, promotor/indutor, outros elementos de vector reguladores e as ITRs de AAV 5' e 3' são referidas como "minigene", para facilidade de referência. Como referido acima, o minigene está localizado no local de qualquer delecção de adenovírus seleccionada, no vírus híbrido. O tamanho deste minigene depende da quantidade e número de delecções de sequência de adenovírus, acima referida. Este minigene pode ser de cerca de 8 kb em tamanho, no exemplo de vírus em que se eliminaram os genes EI e E3, como descrito nos exemplos a seguir. Alternativamente, se apenas se utilizam as sequências de adenovírus mínimas no vírus, este minigene pode ter um tamanho de até 30 kb. Assim, este vector híbrido e vector permitem uma grande amplitude na selecção dos vários componentes do minigene, particularmente do transgene, no que respeita ao tamanho. Tendo em conta os ensinamentos da presente invenção, a concepção de um minigene deste tipo pode ser feita recorrendo a técnicas convencionais. E. Construção do vector híbrido e produção de vírus híbrido O material a partir do qual são derivadas as sequências utilizadas no vector híbrido, os vírus ajudantes, se necessário e o vírus híbrido (ou partícula virai) recombinante e os vários componentes e sequências do vector, utilizados na construção dos vectores híbridos da presente invenção, são obtidos de fontes comerciais ou académicas, com base em materiais previamente publicados e descritos. Estes materiais podem também ser obtidos a partir de um paciente individual, 19 ou produzidos e seleccionados utilizando técnicas de clonagem molecular recombinante, convencionais, conhecidas e praticadas pelos peritos na arte. Qualquer modificação de sequências de ácidos nucleicos existentes, que formam os vectores e vírus, incluindo delecções, inserções e outras mutações de sequências, são também produzidas utilizando técnicas convencionais. A organização das sequências de ADN seleccionadas, do adenovírus, o AAV e os genes repórter, ou genes terapêuticos, e outros elementos vector, no vector híbrido e a utilização do vector híbrido para produzir um vírus híbrido é feita por meio de técnicas convencionais, como descrito no Exemplo 1. Estas técnicas incluem técnicas de clonagem de ADNc convencionais, como as descritas nos livros [Sambrook et al., citado acima], utilização de sequências de oligonucleótidos sobrepostos dos genomas de adenovírus e de AAV, reacção em cadeia com polimerase e qualquer método adequado, que proporcione a sequência nucleotídica desejada. Utilizam-se técnicas de transfecção e co-transfecçâo convencionais, e.g. técnicas de transfecção com CaP04, utilizando a linha celular de complementação 293 de rim de embrião humano (HEK) (uma linha celular de rim humano que contém um gene Ela de adenovírus funcional, que proporciona uma proteína Ela que actua em trans). Outros métodos convencionais utilizados na invenção incluem a recombinação homóloga dos genomas virais, plaqueamento de vírus em agar, métodos de medição de produção de sinal e semelhantes.
Como descrito em pormenor no exemplo 1 a seguir, e em relação à Fig. 1, prepara-se um vírus híbrido único, da presente invenção, que contém um EI eliminado, um E3 parcialmente deletado, sequência de adenovírus associada com uma única cópia de um AAV recombinante com delecções dos seus genes rep e cap e que codifica para um transgene repórter seleccionado. Em resumo, este exemplo de vírus híbrido foi concebido de modo a que a sequência AV.CMHacZ [SEQ ID N0:1] (um minigene que contém um ITR de AAV 5', um promotor de CMV, um intrão de SV-40, um transgene LacZ, uma sequência poli-A de SV-40 e um ITR de AAV 3') fosse posicionada em vez dos genes Ela/Elb de adenovirus do tipo 5 (Ad5), tornando o vector de adenovirus defeituoso para a replicação.
Devido à quantidade limitada de sequência de adenovirus presente nos vectores híbridos da invenção, incluindo o pAV.CMCLacZ[SEQ ID N0:1] acima, poderão ser necessários uma linha celular de empacotamento, ou um adenovirus ajudante, ou ambos, para proporcionar sequências de genes de adenovirus suficientes, necessárias para uma infecção virai productiva, para produzir o vírus híbrido.
Os vírus ajudantes úteis na presente invenção contêm sequências de genes de adenovirus seleccionadas, que não estão presentes na construção do vector híbrido, nem são expressas pela linha celular em que o vector híbrido é transfectado. Opcionalmente, um virus ajudante deste tipo pode conter um segundo microgene repórter que permite a separação dos vírus híbridos resultantes e vírus ajudantes, por purificação. A construção dos vírus ajudantes desejados está no âmbito da arte.
Como exemplo, se a linha celular utilizada para produzir o vírus recombinante não é uma linha celular de empacotamento e o vector híbrido contém apenas as sequências de adenovirus mínimas, acima identificadas, o vírus ajudante pode ser um virus Ad do tipo selvagem. Assim, o vírus ajudante fornece os genes precoces de adenovirus El, E2a e E4, necessários e todos os restantes genes tardios, intermédios, estruturais e não estruturais, do genoma de adenovirus. No entanto, se, nesta situação, a linha celular de empacotamento é a 293, que fornece as proteínas El, não é necessário que o vírus ajudante contenha o gene El. 21
Noutra forma de concretização, quando a construção híbrida é tornada defeituosa para a replicação por uma delecção funcional em El, mas não contém outras delecções nos genes Ad necessários para a produção de uma partícula virai infecciosa e se utiliza a linha celular 293, não são necessários nenhuns vírus ajudantes para a produção do vírus híbrido. Além disso, todo ou parte do gene precoce atrasado, E3, do adenovírus (que abrange as mu 7 6,6 a 8 6,2) pode ser eliminado do vírus ajudante útil nesta invenção, uma vez que este produto genético não é necessário para a formação de uma partícula de vírus híbrido funcional.
Deve ter-se em conta que o perito na arte pode conceber outros vírus ajudantes, ou desenvolver outras linhas celulares de empacotamento, para complementar as delecções de adenovírus na construção do vector e permitir a produção da partícula de vírus híbrido, tendo em conta esta informação. Deste modo, a presente invenção não é limitada pela utilização, ou descrição de nenhum vírus ajudante, ou linha celular de empacotamento, particulares.
Assim, como descrito nas Figs. IA a 1C, o plasmídeo circular pAd.Av.CMVLacZ[SEQ ID N0:1] (que contém o minigene e apenas as sequências de adenovírus das unidades map 0 a 1 e 9 a 16) foi digerido e co-transfectado com um vírus ajudante Ad5 seleccionado (que contém as sequências de adenovírus 9 a 78,4 e 86 a 100) em células 293. Deste modo, a linha de empacotamento proporciona as proteínas El e o vírus ajudante proporciona todas as sequências de genes de adenovírus necessárias, subsequentes à unidade map 16. A recombinação homóloga ocorre entre o vírus ajudante e o vector híbrido, resultando na partícula virai híbrida. O crescimento desta partícula virai híbrida em células 293 tem sido monitorizada de perto, em mais de 20 ciclos de amplificação, sem haver indicação de instabilidade do genoma. A recuperação e integração do transgene do vírus híbrido numa célula hospedeira e outras modificações do vector são descritas a 22 seguir. 0 vírus Ad.Αν.CVNLacZ híbrido resultante combina o potencial de título elevado do adenovírus com a biologia de integração associada com a latência de AAV. Assim, a presente invenção proporciona um método para a produção de um adenovírus híbrido recombinante, que compreende o passo de fazer a cultura de uma célula hospedeira contendo um vector híbrido da invenção e um adenovírus ajudante, opcional. De acordo com este método, a célula hospedeira e/ou o vírus ajudante, proporcionam as sequências de adenovírus necessárias para produzir um adenovírus híbrido, recombinante, de acordo com a invenção. Uma vez produzido, o adenovírus híbrido pode ser isolado a partir da cultura de células. Numa forma de concretização desejável, o vector híbrido contém delecções funcionais no gene El, gene E2, gene E3 e gene E4 do adenovírus. Opcionalmente, o adenovírus híbrido produzido por este método compreende ainda delecções funcionais no gene IX intermediário do adenovírus, o gene IVa intermediário do adenovírus e qualquer dos genes tardios LI a L5, do adenovírus. G. Conjugados policatiónicos de vírus híbrido A expressão de rep é necessária para que possa haver recuperação do genoma AAVr. Uma aproximação preferida é incorporar, de forma sintética, um plasmídeo, permitindo a expressão de rep na partícula híbrida. Para isso, os vírus híbridos acima descritos são posteriormente modificados por recurso à tecnologia de conjugado adenovírus-polilisina. Veja-se, e.g. Wu et al. J. Biol. Chem, 264:16985-16987 (1989); e K.J. Fisher e J.M. Wilson, Biochem. J. , 299: 49 (1 de Abril, 1994), aqui incorporados para referência. Utilizando esta tecnologia, um vírus híbrido como descrito acima, é modificado por adição de uma sequência policatiónica, distribuída em torno da cápside da partícula virai híbrida. De preferência, o poli-catião é poli-lisina, que se liga em torno do vírus carregado negativamente, para formar uma carga positiva externa. Um plasmídeo contendo o gene rep de AAV (ou uma porção sua derivada, funcional) sob o controlo de um promotor adequado é então complexado directamente com a cápside híbrida, resultando numa partícula virai única, contendo o vírus híbrido e um gene rep de AAV. 0 ADN de plasmídeo carregado negativamente liga-se com afinidade elevada à polilisina carregada positivamente. Essencialmente, as técnicas utilizadas na construção deste conjugado de vírus híbrido, ou partícula de trans-infecção, são como descrito em pormenor no Exemplo 3, a seguir.
Pode-se obter uma forma de concretização alternativa do vector híbrido e partícula virai resultante, alterando o plasmídeo que contém rep, de modo a que contenha também um gene cap de AAV. Esta forma de concretização do vector híbrido quando numa célula hospedeira é portanto capaz de produzir uma partícula AAV recombinante, como discutido em maior pormenor a seguir.
Os plasmídeos utilizados nestas formas de concretização contêm sequências de plasmídeo convencionais, que colocam a sequência AAV seleccionada, i.e. as sequências do gene rep e/ou cap, sob o controlo de um promotor seleccionado. No exemplo apresentado a seguir, o exemplo de plasmídeo é pRep78/52[SEQ ID NO:2] um plasmídeo que actua em trans, que contém as sequências de AAV que codificam para proteínas rep de 78 kD e 52 kD, sob o controlo do promotor P5 de AAV. 0 plasmídeo contém também um sinal de poliadenilação de SV40. A sequência de ADN deste plasmídeo é proporcionada na Fig. 8 [SEQ ID NO:2].
De um modo semelhante e no que respeita às sequências de plasmídeo e vector conhecidas na arte, podem-se conceber plasmídeos análogos utilizando ambos os genes rep e cap e diferentes promotores, constitutivos ou regulados, sequências poli-A opcionais e intrões. 24 ρ 1_ ^^ 'Ί A disponibilidade de materiais para produzir estes vectores e virus híbridos modificados e os vectores contendo rep e/ou cap de AAV e as técnicas envolvidas na construção do vector híbrido e plasmídeos contendo rep e/ou cap são convencionais, como descrito acima. As técnicas de construção para a partícula de trans-infecção utilizam as técnicas descritas acima para o vector híbrido e as técnicas de Wu et al. e Fischer et al. acima citados. A utilização desta partícula de trans-infecção, incluindo a recuperação e integração do transgene na célula hospedeira é descrita a seguir. II. Função do virus híbrido A. O vírus híbrido infecta uma célula alvo
Uma vez construído o vírus híbrido, ou partícula de trans-infecção, como acima discutido, este é direccionado para, e absorvido, por uma célula alvo seleccionada. A selecção da célula alvo depende da utilização do vírus híbrido, i.e. se o transgene deve ou não ser replicado in vitro para a produção de uma partícula AAV recombinante, ou ex vivo para a produção num tipo de célula desejado para fornecimento a um paciente, ou in vivo, para fornecimento a um tipo de célula ou tecido particulares. As células alvo podem portanto ser qualquer célula de mamífero (de preferência uma célula humana). Por exemplo, para utilização in vivo, o vírus híbrido pode ser direccionado para qualquer tipo de célula normalmente infectada por adenovírus, dependendo da via de administração, i.e. pode ser direccionado, sem limitação, para neurónios, hepatócitos, células epiteliais e semelhantes. A absorção do vírus híbrido pela célula é causada pela capacidade infecciosa do vector, contribuída pelo adenovírus e sequências AAV. B. 0 transgene é recuperado 25 i—
Após o vírus híbrido ou a partícula de trans-infecção serem absorvidos por uma célula, o transgene flanqueado por ITR de AAV deve ser recuperado do esqueleto de adenovírus progenitor. A recuperação do transgene depende do fornecimento da célula infectada com um gene rep de AAV. Assim, a eficácia do vírus híbrido pode ser medida em termos da libertação de rAAV mediada por rep, a partir do modelo de adenovírus progenitor.
Os genes rep podem ser fornecidos ao vírus híbrido por diversos métodos. Uma forma de concretização para proporcionar proteínas rep em trans foi demonstrada com o exemplo de vírus híbrido Ad.AV.CMVLacZ, fazendo a transfecção na monocamada de células alvo, previamente infectadas com o vector híbrido, de um plasmídeo pRep78/52 [SEQ ID NO:2] num envelope de lipossoma, que contém os genes que codificam para as proteínas rep de AAV de 7 8 kDa e 52 kDa, sob o controlo do promotor P5 de AAV. A recuperação e amplificação de um monómero de AAV de cadeia dupla e um dímero de AAV de cadeia dupla, contendo cada um o transgene LacZ acima descrito, foi observada em células 293. Isto é descrito em pormenor no Exemplo 2. A produção de rep em trans pode ser modulada pela escolha do promotor no plasmídeo que contém rep. Se são importantes níveis elevados de expressão de rep, cedo, para recuperar o domínio de AAV recombinante, pode-se utilizar um promotor heterólogo (de não adenovírus, não AAV), para controlar a expressão de rep e eliminar a necessidade de proteínas El. Alternativamente, os níveis baixos de expressão de rep a partir de P5, que ocorrem na ausência de proteínas El de adenovírus, podem ser suficientes para iniciar a recuperação e óptimos para controlar a integração do genoma de AAV recombinante, numa utilização seleccionada.
De preferência, para utilização in vivo, o gene rep de AAV pode ser também fornecido como parte do vírus híbrido. Uma forma de concretização deste conceito de partícula única é o 26 Γ
t vírus híbrido conjugado com um policatião (veja-se Fig. 7) . A infecção desta partícula de trans-infecção é conseguida do mesmo modo e relativamente às mesmas células alvo, como acima identificadas. 0 conjugado de polilisina do vírus híbrido, no qual foi directamente complexado um plasmídeo que codificava as proteínas rep 78 e 52, combina todos os componentes funcionais numa estrutura de partícula única. Assim, a partícula de trans-infecção permite o fornecimento de uma única partícula à célula, o que é consideravelmente mais desejável para utilização terapêutica. Experiências semelhantes para demonstrar a recuperação do transgene da partícula de trans-infecção, conjugada, híbrida, em células 293 e em células HeLa, estão descritas em pormenor no Exemplo 4.
Noutra forma de concretização, o vírus híbrido é modificado por clonagem do ADNc de rep directamente na porção do genoma de adenovírus do vector híbrido. Uma vez que se sabe que mesmo níveis residuais de expressão de rep podem interferir com a replicação do ADN e adenovírus, prevê-se que esta incorporação de rep no próprio vector híbrido necessite de uma possível mutação dos genes rep, para codificar apenas domínios seleccionados e a utilização de promotores inductíveis, para regular a expressão rep, bem como a colocação cuidadosa de genes rep nas sequências de adenovírus do vector híbrido. C. O transgene integra-se no cromossoma
Uma vez desacoplado (recuperado) do genoma do vírus híbrido, o minigene AAV recombinante/transgene procura um local de integração na cromatina do hospedeiro e torna-se integrado nesta, proporcionando uma expressão estável do transgene acompanhante, na célula hospedeira. Este aspecto da função do vírus híbrido é importante para a sua utilização na terapia genética. A sequência de minigene AAV/transgene recuperada do vírus híbrido atinge um estado de pró-vírus na 27
U ^ célula alvo, i.e. o fenómeno final no ciclo de vida do híbrido (Fig. 7).
Para determinar se o minigene AAV recuperado do vírus híbrido atinge o estado de pró-vírus numa célula alvo, as células HeLa que não expressam EI foram infectadas com o conjugado híbrido vector-poli-Lisina, complexado com pRep78/52[SEQ ID N0:2] e passado até serem evidentes colónias de células que expressam LacZ. Infectou-se uma placa de células em duplicado, com o mesmo conjugado, mas em vez de ser complexada com o plasmídeo pRep7 8/52 [SEQ ID NO: 2] transportava m plasmídeo irrelevante. As células que receberam a partícula híbrida contendo rep produziram um número maior de colónias positivas para LacZ, estáveis, do que as células injectadas com o vector controlo. Isto índica fenómenos de recuperação e integração múltiplos em células que expressaram proteínas rep. A confirmação da integração é revelada caracterizando o genoma AAV recombinante nas células infectadas com híbrido e identificando as sequências cromossómicas flanqueadoras (veja-se Exemplo 5). III. Utilização de virus híbridos e partículas virais em terapia genética 0 novo vírus híbrido e partículas de trans-infecção da presente invenção proporcionam veículos de transferência de genes eficazes, para a terapia de genes somáticos. Estes vírus híbridos estão preparados para conter um gene terapêutico em vez do transgene repórter LacZ, ilustrado no exemplo de vector. Utilizando vírus híbridos e partículas de trans- infecção contendo transgenes terapêuticos, estes transgenes podem ser fornecidos a um paciente in vivo ou ex vivo, para proporcionar a integração do gene desejado numa célula alvo. Assim, estes vírus híbridos e partículas de trans-infecção podem ser utilizados para corrigir deficiências ou defeitos genéticos. Dois exemplos da produção de veículos de transferência de genes para o tratamento da fibrose quística e 28 V Γ
hipercolesterolémia familiar estão descritos nos Exemplos 6 e 7, a seguir. Um perito na arte pode produzir qualquer número de outros veículos de transferência de genes, incluindo um transgene seleccionado para o tratamento de outras desordens. Por exemplo, prevê-se que as partículas de trans-infecção sejam particularmente vantajosas na terapia genética ex vivo, quando se pretende a transdução e integração proviral num hemocitoblasto, tal como na terapia genética direccionada para a medula óssea.
Os vírus híbridos e partículas de trans-infecção da presente invenção podem ser administrados a um paciente, de preferência suspensos numa solução biologicamente compatível, ou veículo de fornecimento farmaceuticamente aceitável. Um veículo adequado inclui solução salina estéril. Podem-se utilizar para este fim, outras soluções de injecção estéreis, isotónicas, aquosas e não aquosas e suspensões estéreis aquosas e não aquosas, conhecidas por serem transportadores farmaceuticamente aceitáveis e bem conhecidos dos peritos na arte.
Os vírus híbridos e partículas de trans-infecção da presente invenção podem ser administrados em quantidades suficientes para transfectar as células desejadas e proporcionar níveis suficientes de integração e expressão do transgene seleccionado, para proporcionar um benefício terapêutico sem efeitos adversos, ou com efeitos fisiológicos medicinalmente aceites, que podem ser determinados pelos peritos na arte de medicina. As vias de administração convencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem o fornecimento directo ao órgão, tecido ou local alvo, por administração intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, oral e outras vias parentéricas. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado.
As dosagens do vírus híbrido e/ou partícula de trans-infecção dependerão primariamente de factores como a condição 29 Γ- il a ser tratada, o gene seleccionado, a idade, peso e saúde do paciente e podem, portanto, variar entre pacientes. Pensa-se que uma dose humana terapeuticamente eficaz de virus híbridos ou partículas de trans-infecção da presente invenção está na gama de cerca de 20 a cerca de 50 ml de solução salina, contendo concentrações desde cerca de 1 x 107 a 1 x IO10 pfu/ml de vírus híbrido da presente invenção. Uma dose humana preferida é de cerca de 20 ml de solução salina nas concentrações acima. A dosagem será ajustada para balancear o benefício terapêutico, contra quaisquer efeitos secundários. Os níveis de expressão do gene seleccionado podem ser monitorizados, para determinar a selecçâo, ajuste ou frequência da administração da dosagem. IV. Produção de alta eficiência de AAVr
Os vírus híbridos e as partículas de trans-infecção da presente invenção têm outra utilidade desejável na produção de grandes quantidades de partículas AAV recombinantes. Devido aos métodos actuais complicados, para a produção de AAV há apenas uma quantidade limitada de AAV disponível para utilização em processos biotecnológicos, médicos e académicos, industriais.
Os vectores e vírus híbridos Ad/AAV da presente invenção são úteis num método conveniente e eficaz para a produção de grandes quantidades de partículas AAVr. Tipicamente, estes vectores e vírus híbridos Ad/AAV são cultivados numa célula contendo o gene rep de AAV e o gene cap de AAV, que estão sob o controlo de sequências que dirigem a sua expressão na célula. Igualmente, a partícula de trans-infecção da invenção é útil num método conveniente e eficaz para a produção de grandes quantidades de partículas AAVr, quando cultivadas numa célula, na presença de um gene cap de AAV sob o controlo de sequências que regulam a expressão do referido gene cap. Opcionalmente, os genes rep e/ou cap expressos na célula podem estar num plasmídeo. Uma vez produzido utilizando o método da 30
L-Cj invenção, as partículas AAVr podem ser isoladas a partir da cultura.
De acordo com uma forma de concretização deste aspecto da invenção, uma partícula de trans-infecção é construída como acima descrito e, no Exemplo 3, e é utilizada para produzir níveis elevados de AAVr, como pormenorizado no exemplo 8, com as modificações possíveis descritas no Exemplo 9, a seguir.
Em resumo, produz-se um plasmídeo que contém ambos os genes rep e cap de AAV sob o controlo de um plasmídeo adequado e este é complexado com o exterior de poli-Lisína do vírus híbrido, como descrito acima. Deixa-se então que esta partícula de trans-infecção infecte uma célula hospedeira seleccionada, como as células 293. A presença de ambos rep e cap permite a formação de partículas AAV nas células e produz um título de vírus AAV de cerca de 109 viriões. Pelo contrário, os métodos actuais envolvendo a transfecção de plasmídeos múltiplos produzem apenas um título de cerca de 107 viriões. 0 AAVr é isolado da cultura, seleccionando as placas azuis contendo LazZ e purificando estas num gradiente de cloreto de césio. 0 benefício deste procedimento reside no facto de o elemento AAV cis ser codificado pelo genoma de adenovírus progenitor. Como resultado, o plasmídeo trans é o único componente de ADN necessário para a formação do complexo. A célula é portanto carregada significativamente com mais cópias das sequências rep e cap que actuam em trans, resultando numa eficácia maior de recuperação e empacotamento. Vários estudos comparativos, centrados na razão óptima e número de cópias de plasmídeos cis e trans para a produção de AAV indicam que há uma correlação positiva entre o número de cópias de plasmídeo trans e o rendimento de vírus recombinante. Como descrito em pormenor no Exemplo 8, o rendimento em AV.CMVLacZ recombinante aumentou 5-10 vezes, 31
V
u
utilizando a partícula de trans-infecção, em vez de um vector adenovírus convencional. A principal limitação, associada com a produção de AAV recombinante utilizando um vírus híbrido da presente invenção, refere-se às dificuldades que surgem em distinguir entre os dois vírus (i.e. adenovírus e AAV) que são produzidos pela célula. Utilizando os exemplos de vectores e componentes de vector da presente invenção, não foi possível utilizar a coloração histoquímica de LacZ para titular o rendimento de AV.CMVLacZ recombinante, pois qualquer híbrido Ad.AV.CMVLacZ contaminante iria contribuir para a contagem final. Assim, incorporou-se uma técnica de análise de manchas Southern, rápida, para quantificar os rendimentos de AAV recombinante. 0 desenvolvimento deste teste permitiu não só a quantificação e verificação da produção de AAV, mas demonstrou também a remoção do vírus híbrido contaminante, dos estoques de AAV purificado.
Um outro método para a detecção de viriões híbridos contaminantes envolve a modificação do vector híbrido, inserindo um segundo minigene repórter, pequeno (i.e., sequências de um gene repórter, promotor e outras sequências de controlo da expressão, quando desejado) na região E3 do esqueleto do adenovírus progenitor. Uma vez que este repórter não está ligado ao domínio AAV, o vírus híbrido contaminante que está presente durante a purificação pode ser monitorizado por este marcador específico de híbrido. Um outro gene repórter possível é a sequência de ácidos nucleicos para a proteína fluorescente verde. Com este vector híbrido contendo duas sequências repórter, a coloração histoquímica para a actividade de fosfatase alcalina (repórter do adenovírus) ou β-galactosidase (repórter do AAV) pode ser utilizada para monitorizar cada domínio virai.
Os exemplos seguintes ilustram a construção e teste de vectores híbridos da presente invenção e a sua utilização em 32 produções de AAV recombinante. Estes exemplos são apenas ilustrativos e não limitam o âmbito da presente invenção.
Exemplo 1 - Construção de um virus híbrido
Manipulou-se um primeiro vírus híbrido adenovírus-AAV por recombinação homóloga entre ADN extraído de um adenovírus e um vector de complementação de acordo com protocolos anteriormente descritos [veja-se, e.g. K.F. Kozarsky et al., J. Biol Chem., 269:13695-13702 (1994) e referências nele citadas). A descrição seguinte refere-se ao diagrama da Fig. 1
Extraiu-se ADN de adenovírus de viriões dl7001 purificados por CsCl, uma variante Ad5 (subgrupo de serotipo C) que transporta uma delecção de 3 kb entre as mu 78,4 a 86, na região E3 não essencial (cedido pelo Dr. William Wold, Washington University, St. Louis, Missouri). Preparou-se ADN adenoviral para co-transfecção por digestão com Ciai (posição de 917 pb genómico de adenovírus) que remove o braço esquerdo do genoma, englobando as unidades map 0-2,5 do adenovírus. Veja-se diagrama inferior da Fig. 1B. 0 vector híbrido de complementação, pAd.AV.CWJLacZ (veja-se Fig. IA e Fig. 2 [SEQ ID N0:1]) foi construído como se segue:
Concebeu-se um vector de clonagem progenitor, pAd.BglII. este contém dois segmentos do genoma Ad5 do tipo selvagem (i.e. unidades map 0-1 e 9-16,1), separados por um único local de clonagem BglII, para a inserção de sequências heterólogas. As sequências Ad5 em falta, entre os dois domínios (pb 361-3327 do genoma do adenovírus) resultam na delecção de Ela e da maioria de Elb, após recombinação com ADN virai.
Concebeu-se um genoma AAV recombinante (AV.CMVLacZ) e inseriu-se no local de BglII de pAd.BglII, para produzir o plasmídeo de complementação. O arranjo linear de
V
L· ^ AV. CMVLacZ [SEQ ID N0:1] (veja-se diagrama do topo da Fig. 1B) inclui: (a) o ITR 5' de AAV (pb 1-173) obtido por PCR, utilizando pAV2 [C. A. Laughlin et al., Gene 23:65-13 (1983)] como modelo [nucleótidos números 365-538 da Fig. 2 [SEQ ID N0:1]];
(b) um indutor/promotor precoce, imediato, de CMV
[Boshart et al., Cell, £1:521-530 (1985); núcleótidos número 563-1157 da Fig. 2 [SEQ ID NO:1]], (c) um dador de corte e rearranjo-aceitador de corte e rearranjo de SV40 (nucleótidos número 1178-1179 da Fig. 2 [SEQ ID NO:1]), (d) ADNc de beta-galactosidase de E.coli (nucleótidos número 1356-4827 da Fig. 2 [SEQ ID NO:l]), (e) um sinal de poliadenílação de SV40 (um fragmento de restrição Bam HI-BcII 237, contendo os sinais de clivagem/poliA de ambas as unidades de transcrição, precoce e tardia; nucleótidos número 4839-5037 da Fig. 2 [SEQ ID NO:l]) e (f) ITR 3' de AAV obtido de pAV2 como um fragmento SnaBI-BglII (nucleótidos números 5053-5221 da Fig. 2 [SEQ ID NO:l]). O vector hibrido de complementação resultante, pAd.AV.CMVLacZ (veja-se Fig. IA e Fig. 2[SEQ ID NO:l]) continha uma única cópia de AV.CMVLacZ recombinante flanqueada pelas coordenadas de adenovirus 0-1 num dos lados e 9-16,1 no outro. O ADN de plasmídeo foi linearizado utilizando um único local Nhel, imediatamente 5' da unidade map zero (0) de adenovirus (resultando no diagrama de topo da Fig. 1B).
Ambos os ADNs substrato do adenovirus e do vector de complementação foram transfectados em células 293 [ATCC 34 CRL1573], utilizando um processo de transfecção de fosfato de cálcio convencional [veja-se, e.g., Sambrook et al., citado acima]. 0 resultado final da recombinação homóloga envolvendo sequências que mapeiam para as unidades map de adenovirus 9-16, é o híbrido Ad. AV. CMVLacZ (veja-se Fig. 1C) , em que as regiões codificantes Ela e Elb do substrato de adenovirus dl7001 são substituídas pelo o AV.CMVLacZ do vector híbrido.
Vinte e quatro horas mais tarde, removeu-se o "cocktail" de transfecção e colocou-se nas células uma camada de agarose a 0,8%, contendo lx BME e 2% de soro fetal de bovino (FBS) . Após o desenvolvimento de placas virais (tipicamente 10-12 dias após a transfecção) , as placas foram inicialmente pesquisadas quanto à actividade de β-galactosidase (LacZ) de E. coli, colocando na monocamada infectada, uma camada de agarose suplementada com uma coloração histoquímica para LacZ, de acordo com o processo descrito em J. Price et al.r Proc. Natl. Acad. Sei, USA, ££:156-170 (1987). Os clones positivos (identificados pelo depósito do corante azul) foram isolados, submetidos a três ciclos de congelação (gelo seco/etanol) -descongelação (37 °C) e utilizou-se uma alíquota da placa suspendida para infectar uma monocamada fresca de células 293, semeadas em placas de 60 mm, em duplicado.
Vinte e quatro horas mais tarde, as célula de um conjunto de placas foram fixadas e mais uma vez coradas quanto a actividade de LacZ. As células da placa em duplicado foram recolhidas, suspendidas em 0,5 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 e lisadas, realizando uma série de três ciclos de congelação (gelo seco/etanol) - descongelação (37 °C) . Os restos celulares foram removidos por centrifugação e utilizou-se uma alíquota do sobrenadante para medir a actividade da enzima LacZ.
Tal como indicado na Fig. 3, os testes para a actividade de β-galactosidase que mediram a absorvência a 420 nm da cor azul de beta-galactosidase em recombinantes bem sucedidos, p Li ^^ revelaram que oito dos dez clones positivos, putativos, isolados (DIA a DlJ) expressaram níveis elevados de enzima. A coloração histoquímica produziu resultados semelhantes. A produção e purificação em grande escala de vírus recombinantes foi realizada como descrito em Kozarsky et al., acima citado, e referências nele citadas.
Exemplo 2 - Análise funcional do vector híbrido A capacidade de recuperar a sequência AV.CMVLacZ [SEQ ID N0:1] do vírus híbrido representou uma característica importante dos sistemas de vector e vírus híbridos do Exemplo 1. Para avaliar esta característica, foi necessário proporcionar os produtos genéticos de AAV necessários em trans, que direccionam a excisão e amplificação de AAV (i.e. proteínas rep). Além disso, esta experiência foi realizada em células 293 para complementar a delecção de EI nos clones Ad.AV.CMVLacZ, porque se verificou que as proteínas do gene EI do adenovírus são importantes para iniciar a fase lítica do ciclo celular de AAV.
As células 293 foram semeadas em placas de 35 mm de 6 poços, a uma densidade de 1 x 106 células/poço. Vinte e quatro horas mais tarde, o meio de sementeira [DMEM/FBS a 10% suplementado com antibióticos] foi substituído com 1,0 ml de DMEM/FBS a 2% e infectado com clones híbridos Ad.AV.CMVLacZ a um MOI de 1. Duas horas mais tarde, cada poço foi transfectado com 1 μg de plasmídeo pRep78/52[SEQ ID NO:2], um plasmídeo que actua em trans, que codifica para a sequência que codifica para as proteínas rep de AAV de 78 kD e 52 kD. As sequências rep nesta construção estão sob o controlo do promotor P5 de AAV e utilizam um sinal de poliadenilação de SV40.
Como controlo positivo para a recuperação de AAV, as células 293 semeadas numa placa de 6 poços, como acima, foram co-transfectadas com um plasmídeo de AAV que actua em cis, 36
pAV.CMVLacZ e pRep78/52. 0 pAV.CMVLacZ continha AV.CMVLacZ, a sequência idêntica codificada pelo pAV.CMVLacZ [SEQ ID N0:1] descrita no Exemplo 1, clonada no local BglII de pSP72 (Promega).
Para proporcionar a função ajudante de adenovirus necessária para a recuperação de AAV, as células foram infectadas, ou com o vírus Ad5 do tipo selvagem, ou com um vírus sem El, de primeira geração, Ad.CMhpAP, a um MOI de 5, aproximadamente 2 horas antes da adição do cocktail de transfecção. 0 Ad.CMhpAP é idêntico ao AV.CMVLacZ (Exemplo 1), com a modificação de se inserir a sequência de fosfatase alcalina (que pode ser obtida do Genbank) , em vez do gene LacZ.
As transfecções foram realizadas com Lipofectamina (Life Technologies) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Trinta horas após a transfecção, as células foram recolhidas e o ADN episomal (extracto de Hirt) preparado como descrito por J.M. Wilson et al. J. Biol. Chem., 267: (16):11483-11489 (1992). As amostras foram resolvidas num gel de agarose a 1,2% e electrotransferidas para uma membrana de nylon. As manchas foram hibridadas (Southern) com um iniciador de síntese ao acaso 32P-fragmento de restrição marcado, isolado do ADNc de LacZ de E. coli. 0 espectro total de espécies moleculares duplex que surge durante uma infecção por AAV lítica (i.e. formas monoméricas de intermediários de cadeia dupla, RFm e RFd, respectivamente) era evidente em células transfectadas infectadas com o Adj sem El, do tipo selvagem. Não se detectaram nenhuns intermediários replicativos quando as transfecções foram realizadas na ausência de vírus ajudantes.
Extractos de Hirt de células 293 infectadas com clones híbridos Ad.AV.CMVLacZ putativos DIA e D1C revelaram uma única 37
V
banda correspondente ao ADN virai, quando sondado com um fragmento de restrição LacZ. Na presença das proteinas rep 78 e 52, no entanto, os mesmos clones originaram um padrão de bandas que incluía, não só o ADN de adenovírus, mas um monómero RF e dímero de AV.CMVIacZ. Não era evidente uma forma de AV.CMVLacZ [SEQ ID N0:1] de cadeia simples. Dois clones adicionais originaram padrões de bandas semelhantes, o DIB e D1H. Em todos, cada um dos oito híbridos Ad.AV.CMVLacZ que se verificou, na Fig. 3, expressarem níveis elevados de actividade de LacZ, eram positivos para a recuperação do domínio AAV.
Com a excepção de uma banda extra, de aproximadamente 3,5 kb, a recuperação do AV.CMVLacZ [SEQ ID N0:1] do ADN virai híbrido era quase idêntica aos resultados obtidos a partir de uma aproximação cis e trans convencional, baseada num plasmídeo. Nestas últimas amostras, a função ajudante do adenovírus foi proporcionada pré-infectando células, ou com Ad5 do tipo selvagem, ou com um vírus Ad.CBhpAP recombinante, sem EI (também designado por H5.CBALP). 0 vírus Ad.CBhpAP tem a mesma sequência que o vírus Ad.CMhpAP acima descrito, excepto que a sequência do promotor de CMV é substituída pelo promotor de β-actina citoplásmica de galinha [nucleótidos +1 a +275, como descrito em T.A. Kost et al., Nucl. Acids Res, 11 (23):8287 (1983)]. 0 nível de recuperação em células infectadas com WT Ad5 parece ser maior, em relação aos infectados com o vírus Ad.CEhpAP recombinante, provavelmente devido à exprssão de El adicional, proporcionada pelo genoma do tipo selvagem. A relevância de incluir um adenovírus deletado de El, é documentar que o nível de proteínas El de adenovírus expressas em células 293 é suficiente para a função ajudante de AAV.
Exemplo 3 - Síntese de conjugados de polilisina
Outra versão da partícula virai da presente invenção é um conjugado de polilisina com um plasmídeo rep complexado 38 v
L-Cj directamente cora a cápside do vírus híbrido. Este conjugado permite o fornecimento eficaz do plasmídeo de expressão rep pRep78/52 [SEQ ID NO:2] em sequência com o vírus híbrido, eliminando desse modo a necessidade de um passo de transfecção separado. Veja-se Fig. 8 para um diagrama esquemático desta construção.
Modificaram-se estoques purificados de uma expansão em grande escala do clone DIA de Ad.AV.CMVLacZ por acoplamento de poli-L-Lisina à cápside do virião, essencialmente como descrito por K.J. Fisher e J.M. Wilson, Biochem. J., 299:49-58 (1994), resultando num conjugado de Ad.AV.CMVLacZ-(Lys)n. 0 processo envolve três passos. Primeiro, os viriões híbridos são activados através de aminas primárias em proteínas de cápside, com o agente de entrecruzamento solúvel em água, heterobifuncional, sulfo-SMCC [(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilatoal-sulfo-(N-succinimidilo4] (Pierce). A reacção de conjugação, que continha 0,5 mg (375 nmol) de sulfo-SMCC e 6 x 1012 A26o partículas de vector híbrido em 3,0 ml de HBS, foi incubada a 30 °C durante 45 minutos, com agitação suave, constante. Este passo envolveu a formação de uma ligação peptídica entre o éster de N-hidroxisuccinimida activo (NHS) de sulfo-SMCC e uma amina livre (e.g. lisina), contribuída por uma sequência de proteína do adenovírus (proteína de cápside) no vírus recombinante, originando uma partícula virai activada com maleimida. O agente de entrecruzamento não reagido, não incorporado, foi removido por filtração em gel numa coluna Bio-Gel P-6DG de 1 cm x 15 cm (BioRad Laboratories) equilibrada com tampão Tris/HCl 50 mM, pH 7,0 e NaCl 150 mM. As fracções do pico a A260 contendo vírus híbridos activados com maleimida, foram combinadas e colocadas em gelo.
Segundo, a poli-L-lisina com um peso molecular de 58 kDa a 10 mg/ml em tampão trietanolamina 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM e EDTA 1 mM foi tiolada com 2-iminotiolano/HCL (Reagente de 39
V Γ
Traut; Pierce) a uma razão molar de 2 moles -SH/mole de polilisina sob N2; o tioimidato cíclico reage com as poli(L-lisina) aminas primárias, resultando num policatião tiolado. Após uma incubação de 45 minutos à temperatura ambiente, a reacção foi aplicada a uma coluna de Bio-Gel P6DG de 1 cm x 15 cm, equilibrada com tampão Tris/HCl 50 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM e EDTA 2 mM, para remover o reagente de Traut não incorporado. A quantificação dos grupos tiol livres foi realizada com reagente de Ellman [ácido 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzóico)], revelando aproximadamente 2 mol de SH/mol de poli(L-lisina). A reacção de acoplamento foi iniciada pela adição de 1 x 1012A26o partículas de vírus híbrido activado com maleimida/mg de poli(L-lisina) tiolada e incubando a mistura em gelo a 4 °C, durante 15 horas, sob argon. Adicionou-se 2-mercaptoetilamina no final da reacção e a incubação foi realizada à temperatura ambiente, durante 20 minutos, para bloquear os locais de maleimida não reagidos.
Os conjugados de vírus-polilisina Ad.AV.CMVLacZ(Lys)n foram purificados da poli(L-lisina) não conjugada por ultracentrifugação, através de um gradiente descontínuo de CsCl, com uma composição inicial de volumes iguais de 1,45 g/ml (nível inferior) e 1,2 g/ml (nível superior) de Cscl, em tampão Tris/HCl 10 mM (pH 8,0). A centrifugação foi realizada a 90.000 g durante 2 horas a 5 °C. 0 produto final foi dializado contra tampão Hepes 20 mM (pH 7,8), contendo NaCl 150 mM (HBS).
Formaram-se complexos de Ad.AV.CMVLacZ(Lys)n com ADN de plasmídeo pRep78/52 [SEQ ID NO:2], por adição de quantidades variáveis de Ad.AV. CMVLacZ (Lys) n em 50 μΐ de HBS a 0,5 μg de ADN de plasmídeo pRep78/52 [SEQ ID N0:2] em 50 μΐ de HBS. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, formou-se um complexo do vírus híbrido Ad.AV.CMVLacZ(Lys)n, associado numa única partícula com o plasmídeo de ADN contendo os genes rep. 40 r— U, —& y '
Este complexo designado por partícula de trans-infecção, foi avaliado quanto à capacidade de ligação ao ADN por testes de desvio de mobilidade em gel, realizados como descrito em Fisher et al., acima citado. Esta análise revelou que a capacidade de ligação do plasmídeo do conjugado purificado (expresso como o número de partícula Α2βο de Ad.AV.CMVLacZ que podem neutralizar a carga contribuída por 1 μg de ADN de plasmídeo) era de 1 pg de ADN de plasmídeo pRep78/52/6, 0 x IO10 partículas A26o de Ad.AV.CMVLacZ(Lys).
Exemplo 4 - Protocolo de trans-infecção para demonstrar a
excisão e amplificação de AAV
Prepararam-se complexos de trans-infecção por mistura de Ad.AV.CMVLacZ(Lys)n conjugado com plasmídeo pRep78/52[SEQ ID NO: 2] e aplicado a células 293 como se segue. Adicionou-se, gota a gota, Ad.AV. CMVLacZ- (Lys) n (6 x IO10 partículas A26o) em 100 μΐ de DMEM a um tubo de microcentrífuga contendo 1 μg de ADN de plasmídeo em 100 μΐ de DMEM. A mistura foi misturada cuidadosamente e deixou-se a incubar à temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Adicionou-se o "cocktail" de trans-infecção a células 293 semeadas numa placa de 6 poços de 35 mm, como acima descrito. Trinta horas mais tarde, as células foram recolhidas e prepararam-se extractos de Hirt.
As amostras foram resolvidas num gel de agarose a 1,2% e electrotransferidas para uma membrana de nylon. As manchas foram hibridadas (Southern) com um iniciador de síntese ao acaso Ρ-32-fragmento de restrição marcado, isolado a partir de ADNc de LacZ de E. coli.
Os extractos de Hirt de células 293 revelaram um padrão de bandas que sugere que a sequência de minigene de AV.CMVLacZ [SEQ ID NO:l] foi recuperada de forma eficaz do conjugado híbrido. Tanto o monómero RF, como o dímero da sequência AV.CMVLacZ recombinante eram evidentes. Como observado anteriormente, o fenómeno de recuperação era dependente de 41
V
j— proteínas rep, uma vez que as células 293 que foram trans-infectadas com um conjugado híbrido, complexado com um plasmídeo repórter irrelevante que expressa a fosfatase alcalina (i.e. pCMVhpAP) , revelou apenas ADN de Ad.AV.CMVLacZ. Este controlo negativo para a recuperação era secundariamente útil para demonstrar a alta eficácia da transferência de genes para as células 293, que se obteve com o veículo conjugado.
Um conjunto duplicado de células 293 que receberam o conjugado híbrido, que foi posteriormente complexado com o pi asmídeo de expressão de fosfatase alcalina foi fixado 24 horas após a adição do "cocktail" de trans-infecção e corado histoquimicamente para LacZ, como descrito em Price et al., acima citado, ou quanto a actividade de fosfatase alcalina, como descrito em J.H. Schreiber et al., BioTechniques, 14:818-823 (1993) . Aqui, o LacZ era um marcador para o híbrido Ad.AV.CMVLacZ, enquanto que a fosfatase alcalina servia como repórter para o plasmídeo transportador. Mais de 90% da monocamada foi transduzida com ambos transgenes de β-galactosidase e fosfatase alcalina, mostrando a eficácia elevada do veículo de fornecimento conjugado (uma coloração diferencial revelou uma cor azul para os híbridos que contêm o marcador LacZ e uma cor púrpura para os plasmídeos que transportam o marcador AP).
Devido ao papel importante que as proteínas El têm para a progressão do ciclo de vida de AAV, era crítico testar a eficácia do sistema de fornecimento híbrido numa construção em que as proteínas El não são expressas. Realizou-se portanto uma experiência de trans-infecção, utilizando o conjugado híbrido complexado com pRep78/52[SEQ ID NO:2], em células HeLa [ATCC CCL2], para eliminar o envolvimento das proteínas El. As descobertas sugeriram que a recuperação de AV.CMVLacZ ocorreu, o que é evidenciado pela acumulação de monómeros e dímeros RF. A recuperação a partir de células HeLa (que, ao contrário das células 293, não contêm nenhumas proteínas El de adenovírus) revelou níveis inferiores de recuperação do transgene. A 42 Γ u expressão de rep a partir do promotor P5 de AAV é supraregulada pelo EI de adenovírus e sinaliza o início do ciclo litico de AAV. Na ausência de El, a expressão de rep a partir do promotor P5 é praticamente silenciosa, o que é importante para a manutenção dos estádios latentes pró-virais do ciclo de vida de AAV. Prevê-se que um promotor não dependente da expressão de El ultrapasse este problema, por substituição de P5.
Exemplo 5 - Integração do transgene
Realizou-se um estudo preliminar, para determinar se a sequência de AAV recuperada do vírus híbrido pode alcançar o estado de pro-virus numa célula alvo (Fig. 7) . Em resumo, as células HeLa [ATCC CCL 2] foram infectadas com o conjugado híbrido complexado com pRep78/52[SEQ ID NO:2] e passadas até serem evidentes colónias estáveis, de células que expressam LacZ. Uma placa de células, em duplicado, foi infectada com o mesmo conjugado, mas em vez de ser complexada com o plasmídeo pRep78/52 [SEQ ID N0:2], transportava um plasmídeo irrelevante. Estas descobertas indicam que as células que receberam a partícula híbrida contendo Rep produziram um maior número de colónias positivas para LacZ, estáveis, do que as células que foram infectadas com o vírus controlo. Isto pode ser interpretado como um reflexo de fenómenos de recuperação e integração múltiplos, nas células que expressaram as proteínas Rep. No entanto, é possível que esteja presente uma forma episomal de AAV que poderá persistir por períodos de tempo prolongados. A fim de estabelecer a ocorrência de integração no cromossoma do minigene AV.CWJLacZ do conjugado híbrido, realiza-se a seguinte experiência. 0 conjugado Ad.AV.CMVLacZ(Lys)n que transporta o plasmídeo pRep78/52 [SEQ ID NO:2] é utilizado para infectar células HeLa [ATCC CRL2] (também se podem utilizar fibroblastos primários). As células infectadas são passadas durante várias gerações. As células 43 p Lc, ^^ são crescidas até à confluência, divididas e deixam-se crescer de novo até à confluência, dividem-se mais uma vez e este ciclo é repetido quanto o desejado. Isto permite que haja um tempo suficiente para que ocorra a absorção, replicação e integração. Veja-se Fig. 7. A fim de verificar que a sequência de AAV recombinante que foi recuperada do genoma híbrido (passo III da fig. 7) se integrou num cromossoma da célula hospedeira (passo IV da fig. 7), as células são separadas por um separador de células activado por fluorescência (FACS). Por meio desta técnica, as células que contêm uma cópia do minigene AV.CMVLacZ integrada de forma estável, são separadas com base na presença do repórter β-galactosidase. Estas células são sinalizadas com anticorpos marcados com fluoresceína, que reconhecem a proteína β-Gal e são então separados das células não transduzidas (i.e. as que não receberam uma cópia do minigene de AAV), por FACS. 0 ADN é isolado a partir desta população purificada e utilizado para construir uma biblioteca genómica que é pesquisada quanto a clones individuais e a sequência é verificada. Se ocorrer integração, esta é documentada directamente por análise de sequência.
Exemplo 6 - Veículo de transferência de genes para fibrose quística
Constrói-se um vírus adenovírus-AAV-CFTR, modificando o vírus híbrido Ad.AV.CMVLacZ descrito no Exemplo 1, de modo a conter o gene regulador transmembranar de fibrose quística (CFTR) [J.R. Rioldan et al., Science 245/1066-1073 (1989)] em vez do gene lacZ, utilizando técnicas conhecidas. Um método adequado envolve a produção de um novo vector utilizando as técnicas descritas no Exemplo 1. Neste novo vector, o minigene LacZ é substituído por um minigene CFTR. Para realizar este método, os vectores que transportam o gene CFTR foram 44
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L-Ci )^*· anteriormente descritos e podem ser facilmente construídos. Este vector novo, ou reconstruído, é utilizado para produzir um novo vírus, por recombinação homóloga, como acima descrito. 0 vírus híbrido resultante é designado por híbrido Ad.AV.CM VCFTR. Tem a sequência da Fig. 2 [SEQ ID N0:1], excepto que o gene LacZ é substituído por CFTR.
Alternativamente, o gene LacZ pode ser removido do vector Ad. AV. CVNLacZ do Exemplo 1 e substituído pelo gene CFTR, utilizando técnicas conhecidas.
Este vírus (ou um vírus híbrido análogo com um promotor, regiões reguladoras diferentes, etc) é útil na terapia genética sozinho, ou, de preferência, na forma de um conjugado, preparado como descrito no Exemplo 4. 0 tratamento da fibrose quística, utilizando os vírus descritos acima, é particularmente adequado para uma terapia in vivo direccionada para o pulmão. As células epiteliais das vias respiratórias são os alvos mais desejados para a transferência de genes, pois as complicações pulmonares da CF são normalmente as mais mórbidas e limitantes. Assim, o vector híbrido da invenção contendo o gene CFTR é fornecido directamente às vias respiratórias, e.g., por formulação do vírus híbrido acima descrito numa preparação que pode ser inalada. Por exemplo, o vírus ou conjugado híbrido da invenção, contendo o gene CFTR, é suspendido em cloreto de sódio 0,25 molar. O vírus, ou conjugado, é absorvido pelas células das vias respiratórias e o gene é expresso.
Alternativamente, os vírus, ou conjugados, híbridos, da invenção podem ser fornecidos por outros meios adequados, incluindo a injecção direccionada para o local do vírus que transporta o gene CFTR. No caso do fornecimento do gene CFTR, as soluções preferidas para a instilação brônquica são as soluções salinas estéreis contendo uma gama de cerca de 1 x 107 a 1 x IO10 pfu/ml, mais particularmente, na gama de cerca 45
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de 1 x 108 a 1 x 109 pfu/ral de híbrido recombinante da presente invenção.
Outros métodos adequados para o tratamento da fibrose quística utilizando vírus recombinantes em terapia genética de acordo com a invenção, podem ser obtidos de discussões na arte, acerca de outros tipos de veículos de terapia genética da CF. Veja-se, por exemplo, Patente U.S. No. 5,240,846, aqui incorporada para referência.
Exemplo 7 - Veículo de transferência de genes para a hipercolesterolémia familiar A hipercolesterolémia familiar (FH) é uma desordem dominante autossómica, causada por anomalias (deficiências) na função, ou expressão, de receptores de LDL [M.S. Brown e J.L. Goldstein, Science, 232 (4746):34-37 (1986); J.L. Goldstein e M.S. Brown, "Familial hypercholesterolemia" in Metabolic Basis of Inherited Disease, ed. C.R. Scriver et al., McGraw Hill, New York, pp 1215-1250 (1989)]. Os pacientes que herdaram um alelo anormal, têm elevações moderadas nos níveis de LDL plasmáticos e sofrem de doença das artérias coronárias (CAD), com risco de vida, prematura. Os pacientes homozigóticos têm hipercolesterolémia grave e CAD de risco de vida, na infância.
Um vírus híbrido adenovírus-AAV-LDL da invenção é construído por substituição do gene LacZ no vírus híbrido Ad.AV.CMVlacZ do Exemplo 1, com um gene de receptor de LDL [T. Yamamoto et al., Cell, 39:27-38 (1984)] utilizando técnicas conhecidas e como descrito de forma análoga para o CF no exemplo anterior. Os vectores que transportam o gene do receptor de LDL podem ser facilmente construídos de acordo com a presente invenção. O vector híbrido resultante é designado por pAd.AV.CMCLDL.
Este plasmídeo, ou o seu vírus recombinante, é útil na terapia genética de FH sozinho ou, preferencialmente, na forma 46 Γ L-Cj de um conjugado virai, preparado como descrito no Exemplo 4, para substituir um gene de LDL normal, pelo alelo anormal responsável pelo gene. A. Terapia genética ex vivo A terapia genética ex vivo pode ser realizada recolhendo e estabelecendo uma cultura primária de hepatócitos de um paciente. Podem-se utilizar técnicas conhecidas para isolar e transduzir os hepatócitos com o vector(es) acima que transporta o(s) gene do receptor de LDL. Por exemplo, as técnicas de perfusão de colagenase desenvolvidas para o fígado de coelho, podem ser adaptadas para o tecido humano e utilizadas na transdução. Após a transdução, os hepatócitos são removidos das placas de cultura de tecidos e faz-se nova infusão no paciente, utilizando técnicas conhecidas, e.g. através de um cateter colocado na veia mesentérica inferior. B. Terapia genética in vivo
Desejavelmente, a aproximação in vivo à terapia genética, e.g. direccionada para o fígado, envolve a utilização de vírus híbridos e conjugados virais, acima descritos. Um tratamento preferido, envolve a infusão de uma partícula de trans-infecção de acordo com a invenção, contendo LDL, na circulação periférica do paciente. 0 paciente é então avaliado, quanto à alteração nos lípidos do soro e tecidos do fígado. 0 vírus ou conjugado virai, híbridos, podem ser utilizados para infectar hepatócitos in vivo, por injecção directa numa veia porta periférica (107-108 pfu/kg), ou retrógrada, no tracto biliar (mesma dose). Isto faz a transferência de genes para a maioria dos hepatócitos.
Os tratamentos são repetidos como necessário, e.g. semanalmente. Prevê-se que a administração de uma dose de vírus, equivalente a um MOI de aproximadamente 20 (i.e. 20 47
pfu/hepatócito) conduza a um nível elevado de expressão genética, na maioria dos hepatócitos.
Exemplo 8 - Produção eficiente de AAV recombinante, utilizando um vírus/conjugado híbrido A experiência seguinte demonstrou que o genoma AAV que foi recuperado do vírus híbrido Ad.AV.CMVLacZ podia ser empacotado numa cápside de AAV, desde que a sequência de leitura aberta de cap fosse fornecida em trans. Assim, os vírus da presente invenção são úteis num método de produção para AAV recombinante, que ultrapassa as complicações da arte anterior, que envolvem a produção de títulos elevados de AAV recombinante. A. Protocolo de trans-infecção para a produção de AAVr
Formou-se um complexo de trans-infecção, composto pelo conjugado Ad.Av.CMVLacZ-(Lys)n acima descrito e um plasmídeo de trans-complementação pAdAAV que é descrito em pormenor em R.J. Samulski et al., J. Virol, 63 (9): 3822-3828 (1989)]. Em resumo, o plasmídeo pAdAAV codifica para as sequências de leitura aberta rep e cap totais, na ausência de ITRs de AAV e verificou-se que proporcionam as funções ajudantes de AAV, necessárias para a replicação e empacotamento das sequências de AAV recombinantes.
Adicionou-se conjugado Ad.Av.CMVLacZ (Lys)n (4,5 x 1013 partículas A260) em 75 ml de DMEM, gota a gota, com agitação constante, em 25 ml de DMEM contendo 750 μg de plasmídeo ajudante pAdAAv e incubou-se à temperatura ambiente, durante 10-15 minutos. O complexo foi diluído com 450 ml de DMEM suplementado com FBS a 2% e adicionaram-se alíquotas de 20 ml a monocamadas de células 293, semeadas em placas de 150 mm. 48 V Γ
t
Quarenta horas após a trans-infecção, recolheram-se as células, suspenderam-se em 12 ml de Tris-Cl 10 mM (pH 8,0) e armazenaram-se a -80 °C.
Uma vez que o resultado esperado era a produção de virus híbrido Ad.Av.CMVLacZ e um virião de AAV recombinante (Av.CMVLacZ), ambos transportando um minigene LacZ funcional, não foi possível utilizar a detecção da actividade de LacZ como indicador da produção de Av.CMVLacZ. Desenvolveu-se uma nova aproximação molecular, que pôde ser realizada num dia e permitiu a identificação dos ADNs virais empacotados. B. Purificação de AAVr
Em resumo, submeteram-se suspensões de células congeladas a três ciclos de congelamento-descongelamento, para libertar o AV.CMVLacZ e o Ad.AV.CMVLacZ híbrido. No final do último descongelamento, adicionou-se ADNase pancreática de bovino (2000 unidades) e ribonuclease (concentração final de 0,2 mg/ml) e o extracto foi incubado a 37 °C durante 30 minutos. Os restos celulares foram removidos por centrifugação (5000 x g durante 10 minutos) e o sobrenadante clarificado (15 ml) foi aplicado em 22,5 ml de um gradiente descontínuo, composto por volumes iguais de CsCl a 1,2 g/ml, 1,36 g/ml e 1,45 g/ml em Tri-HCl 10 mM, pH 8,0. Separaram-se as partículas virais a 25.000 rpm num rotor SW-28 Beckman, durante 8 horas a 4 °C. Recolheram-se fracções de 1 ml do fundo dos tubos.
As fracções de vírus parcialmente purificados, recuperadas do gradiente de CsCl são então digeridas, para libertar o ADN virai das cápsides dos viriões, como se segue. Transfere-se uma amostra de 5,0 μΐ de cada fracção, para um tubo de microcentrífuga contendo 20 μΐ de tampão de digestão da cápside (Tris-HCl 50 mM, pH 3,0, EDTA 10 mM, pH 8,0, SDS 0,05% e proteinase K 1,0 mg/ml) . A reacção foi incubada a 50 °C durante 1 hora, deixada arrefecer até à temperatura 49
U ambiente, diluída com 10 μΐ de água mili-Q e adicionou-se corante de carga de gel de agarose.
Estas fracções são então analisadas por análise de manchas Southern. As amostras são resolvidas num gel de agarose a 1,2% e electrotransferidas para uma membrana de nylon. Utilizou-se um fragmento de restrição de LacZ marcado com 32P, o qual era comum a ambos os vectores, como sonda de hibridação para localizar a migração de ADN virai ao longo do gel de agarose. As bandas virais foram quantificadas num Molecular Dynamics Phosphoimager.
Testou-se também uma amostra do extracto antes da separação em CsCl e esta revelou quer formas de ADN de Ad.AV.CMVLacZ híbrido, quer de RF de cadeia dupla (monómeros e dímeros) da sequência de AV.CMVLacZ recuperada [SEQ ID NO:l]. Parece estar presente um monómero de cadeia simples de AV.CMVLacZ no extracto bruto; no entanto, apenas quando os viriões foram concentrados por ultracentrifugação de densidade flutuante, é que o genoma de cadeia simples se tornou claramente evidente. 0 genoma recombinante de cadeia simples do vírus foi distribuído ao longo de uma gama de densidades de CsCl e revelou um padrão de bandas bifásico. Os dois picos do genoma AAVr de cadeia simples ocorreram a densidades de 1,41 e 1,45 g/ml de CsCl, o que é consistente com as densidades flutuantes referidas para o AAV de tipo selvagem, em CsCl [L. M. de la Maza et al., J. Virol, 33_: 1129-1137 (1980)]. A análise das fracções correspondentes às duas formas do vector revelou que as espécies AAVr-1,41 eram várias ordens de grandeza mais activas para a transdução de LacZ, do que a variante mais densa, AAVr-1,45 g/ml. A fim de evitar confusão com Ad.AAV contaminantes, as amostras foram inactivadas pelo calor (60 °C durante 30 minutos), antes de serem adicionadas a células HeLa indicadoras.
As fracções de pico de AAVr-1,41 foram combinadas e purificadas por sedimentação de equilíbrio em Cscl, para 50 Γ
eliminar partículas de adenovírus residuais e concentrar viriões de rAAV. No ciclo final de ultracentrifugação, observou-se uma banda opalescente, fraca mas claramente visível, no meio do tubo de gradiente. As fracções em torno da banda foram avaliadas quanto à densidade, absorvência a 260 nm e partículas de transdução de lacZ. A medida que a banda eluía do tubo de gradiente, registou-se um material absorvente a 260 nm, num pico bem definido, com uma absorvência máxima a uma densidade de 1,40 g/ml de CsCl. A análise para as partículas de transdução de LacZ em células HeLa revelou um pico de actividade que espelhava o perfil de absorvência. Estes resultados indicam que o AAVr foi produzido a partir do vírus híbrido Ad.AAV. Além disso, os títulos alcançados utilizando o vírus híbrido eram 5-10 vezes maiores, comparados com esquemas de produção de AAV recombinante mais convencionais (i.e. transfecções com plasmídeos que actuam em cis e trans). Isto representa uma melhoria significativa na produção de AAVr e indica que o híbrido é útil para a produção de AAVr em grande escala. São possíveis numerosas modificações e variações da descrição acima e estas deverão ser óbvias para os peritos na arte. Estas modificações e alterações às composições e processos, tais como as modificações que permitem a utilização óptima dos vírus híbridos como veículos de terapia genética, ou veículos de produção para a produção de AAV recombinante, são englobados no âmbito da invenção, desde que não saiam do âmbito das reivindicações desta. 51 Γ u
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Administração da Universidade da
Pensilvânia Wilson, James M.
Kelley, William M.
Fisher, Krishna J. (ii) TÍTULO DO INVENTO: Vector híbrido Adenovírus-AAV e métodos para a sua utilização (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2
(iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA (A) DESTINATÁRIO: Howson e Howson (B) RUA: Spring House Corporate Cntr, PO Box 457 (C) CIDADE: Spring House (D) ESTADO: Pensilvânia
(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 19477 (v) FORMA DE LEITURA DO COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete
(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão # 1.25 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: 52 V Γ
(vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: 08/331,384 (B) DATA DE DEPÓSITO; 28-OCT-1994 (viii) INFORMAÇÃO PARA MANDATÁRTIO/AGENTE: (A) NOME: Bak, Mary E. (B) NÚMERO DE REGISTO: 31,215
(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/ENTRADA: GNVPN.007PCT
(ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES (A) TELEFONE 215-540-9200 (B) TELEFAX: 215-540-5818 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1
(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 10398 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.l: 53 f U, ^—ή, \f v
GAATTCGCTA GCATCATCAA ATGATAATGA GGGGGTGGAG GGCGGGTGAC GTAGTAGTGT AACACATGTA AGCGACGGAT GGTGTACACA GGAAGTGACA GTAAATTTGG GCGTAACCGA GAATAAGAGG AAGTGAAATC ATATTTGTCT AGGGAGATCT CCGGGCAAAG CCCGGGCGTC GCGAGCGAGC GCGCAGAGAG TTGTAGTTAA TGATTAACCC CATGCCTGCA GGTCGTTACA CCGCCCAACG ACCCCCGCCC AGTAACGCCA ATAGGGACTT GGTAAACTGC CCACTTGGCA CCCCCTATTG ACGTCAATGA GTACATGACC TTATGGGACT TCATCGCTAT TACCATGGTG GGATAGCGGT TTGACTCACG CAATGGGAGT TTGTTTTGGC
TAATATACCT TATTTTGGAT TTTGTGACGT GGCGCGGGGC GGCGGAAGTG TGATGTTGCA GTGGCAAAAG TGACGTTTTT ATTTTCGCGC GGTTTTAGGC GTAAGATTTG GCCATTTTCG TGAATAATTT TGTGTTACTC GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC GCCATGCTAC TTATCTACAA TAACTTACGG TAAATGGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT TCCATTGACG TCAATGGGTG GTACATCAAG TGTATCATAT CGGTAAATGG CCCGCCTGGC TTCCTACTTG GCAGTACATC ATGCGGTTTT GGCAGTACAT GGGATTTCCA AGTCTCCACC ACCAAAATCA ACGGGACTTT TGAAGCCAAT 50 GTGGGAACGG 100 AGTGTGGCGG 150 GGTGTGCGCC 200 GGATGTTGTA 250 CGGGAAAACT 300 ATAGCGCGTA 350 CTGAGGCCGC 400 GCCTCAGTGA 450 TAGGGGTTCC 500 TTCGAGCTTG 550 GCCTGGCTGA 600 ATGTTCCCAT 650 GAGTATTTAC 700 GCCAAGTACG 750 ATTATGCCCA 800 TACGTATTAG 850 CAATGGGCGT 900 CCATTGACGT 950 CCAAAATGTC 1000 54
GTAACAACTC CGCCCCATTG GAGGTCTATA TAAGCAGAGC ACGCCATCCA CGCTGTTTTG GCCTCCGGAC TCTAGAGGAT GTTAACTGGT AAGTTTAGTC GGTGGTGGTG CAAATCAAAG TCTAGGCCTG TACGGAAGTG ACCCGCGGCC GCAATTCCCG GAAGTCACCA TGTCGTTTAC CGGTCTGGGA GGCATTGGTC ATCCCGTCGT TTTACAACGT CTTAATCGCC TTGCAGCACA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC AATGGCGCTT TGCCTGGTTT CTGGAGTGCG ATCTTCCTGA GCAGATGCAC GGTTACGATG TTACGGTCAA TCCGCCGTTT TCGCTCACAT TTAATGTTGA AATTATTTTT GATGGCGTTA GCTGGGTCGG TTACGGCCAG AGCGCATTTT TACGCGCCGG TTGGAGTGAC GGCAGTTATC GCATTTTCCG TGACGTCTCG GATTTCCATG TTGCCACTCG GGAGGCTGAA GTTCAGATGT CAGTTTCTTT ATGGCAGGGT Γ
ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TCGTTTAGTG AACCGTCAGA ACCTCCATAG AAGACACCGG CCGGTACTCG AGGA^CTGAA TTTTTGTCTT TTATTTCAGG AACTGCTCCT cagtggatgt TTACTTCTGC TCTAAAAGCT GGGATCGAAA GAGCCTGCTA TTTGACCAAC AAGAACGTGA TGGACACCAG CAAGGAGCTG CGTGACTGGG AAAACCCTGG TCCCCCTTTC GCCAGCTGGC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CCGGCACCAG AAGCGGTGCC GGCCGATACT GTCGTCGTCC CGCCCATCTA CACCAACGTA GTTCCCACGG AGAATCCGAC TGAAAGCTGG CTACAGGAAG ACTCGGCGTT TCATCTGTGG GACAGTCGTT TGCCGTCTGA AGAAAACCGC CTCGCGGTGA TGGAAGATCA GGATATGTGG TTGCTGCATA AACCGACTAC CTTTAATGAT GATTTCAGCC GCGGCGAGTT GCGTGACTAC GAAACGCAGG TCGCCAGCGG L-C, )^··— TGTACGGTGG 1050 TCGCCTGGAG 1100 GACCGATCCA 1150 AAACCAGAAA 1200 TCCCGGATCC 1250 TGCCTTTACT 1300 GCGGAATTGT 1350 AAGCAAAAAA 1400 TTTTCGTTGC 1450 CTCAAGCGCG 1500 CGTTACCCAA 1550 GTAATAGCGA 1600 CTGAATGGCG 1650 GGAAAGCTGG 1700 CCTCAAACTG 1750 ACCTATCCCA 1800 GGGTTGTTAC 1850 GCCAGACGCG 1900 TGCAACGGGC 1950 ATTTGACCTG 2000 TGGTGCTGCG 2050 CGGATGAGCG 2100 ACAAATCAGC 2150 GCGCTGTACT 2200 CTACGGGTAA 2250 CACCGCGCCT 2300 55 TTCGGCGGTG AAATTATCGA TGAGCGTGGT GGTTATGCCG ATCGCGTCAC 2350 ACTACGTCTG AACGTCGAAA ACCCGAAACT GTGGAGCGCC GAAATCCCGA 2400 ATCTCTATCG TGCGGTGGTT GAACTGCACA CCGCCGACGG CACGCTGATT 2450 GAAGCAGAAG CCTGCGATGT CGGTTTCCGC GAGGTGCGGA TTGAAAATGG 2500 TCTGCTGCTG CTGAACGGCA AGCCGTTGCT GATTCGAGGC GTTAACCGTC 2550 ACGAGCATCA TCCTCTGCAT GGTCAGGTCA TGGATGAGCA GACGATGGTG 2600 CAGGATATCC TGCTGATGAA GCAGAACAAC TTTAACGCCG TGCGCTGTTC 2650 GCATTATCCG AACCATCCGC TGTGGTACÀC GCTGTGCGAC CGCTACGGCC 2700 TGTATGTGGT GGATGAAGCC AATATTGAAA CCCACGGCAT GGTGCCAATG 2750 AATCGTCTGA CCGATGATCC GCGCTGGCTA CCGGCGATGA GCGAACGCGT 2800 AACGCGAATG GTGCAGCGCG ATCGTAATCA CCCGAGTGTG ATCATCTGGT 2850 CGCTGGGGAA TGAATCAGGC CACGGCGCTA ATCACGACGC GCTGTATCGC 2900 TGGATCAAAT CTGTCGATCC TTCCCGCCCG GTGCAGTATG AAGGCGGCGG 2950 AGCCGACACC ACGGCCACCG ATATTATTTG CCCGATGTAC GCGCGCGTGG 3000 ATGAAGACCA GCCCTTCCCG GCTGTGCCC-A AATGGTCCAT CAAAAAATGG 3 05 0 CTTTCGCTAC CTGGAGAGAC GCGCCCGCTG ATCCTTTGCG AATACGCCCA 3100 CGCGATGGGT AACAGTCTTG GCGGTTTCGC TAAATACTGG CAGGCGTTTC 3150 GTCAGTATCC CCGTTTACAG GGCGGCTTCG TCTGGGACTG GGTGGATCAG 3200 TCGCTGATTA AATATGATGA AAACGGCAAC CCGTGGTCGG CTTACGGCGG 3250 TGATTTTGGC GATACGCCGA ACGATCGCCA GTTCTGTATG·AACGGTCTGG 3300 TCTTTGCCGA CCGCACGCCG CATCCAGCGC TGACGGAAGC AAAACACCAG 3350 CAGCAGTTTT TCCAGTTCCG TTTATCCGGG CAAACCATCG AAGTGACCAG 3400 CGAATACCTG TTCCGTCATA GCGATAACGA GCTCCTGCAC TGGATGGTGG 3450 CGCTGGATGG TAAGCCGCTG GCAAGCGGTG AAGTGCCTCT GGATGTCGCT 3500 CCACAAGGTA AACAGTTGAT TGAACTGCCT GAACTACCGC AGCCGGAGAG 3550 CGCCGGGCAA CTCTGGCTCA CAGTACGCGT AGTGCAACCG AACGCGACCG 3600 56 r' L-C, ^— CATGGTCAGA AGCCGGGCAC ATCAGCGCCT GGCAGCAGTG GCGTCTGGCG 3650 GAAAACCTCA GTGTGACGCT CCCCGCCGCG TCCCACGCCA TCCCGCATCT 3700 GACCACCAGC GAAATGGATT TTTGCATCGA GCTGGGTAAT AAGCGTTGGC 3750 AATTTAACCG CCAGTCAGGC TTTCTTTCAC AGATi-TGGAT TGGCGATAAA 3800 AAACAACTGC TGACGCCGCT GCGCGATCAG TTCACCCGTG CACCGCTGGA 3850 TAACGACATT GGCGTAAGTG AAGCGACCCG CATTGACCCT AACGCCTGGG 3900 TCGAACGCTG GAAGGCGGCG GGCCATTACC AGGCCGAAGC AGCGTTGTTG 3950 CAGTGCACGG CAGATACACT TGCTGATGCG GTGCTGATTA CGACCGCTCA 4000 CGCGTGGCAG CATCAGGGGA AAACCTTATT TATCAGCCGG AAAACCTACC 4050 GGATTGATGG TAGTGGTCAA ATGGCGATTA CCGTTGATGT TGAAGTGGCG 4100 AGCGATACAC CGCATCCGGC GCGGATTGGC CTGAACTGCC AGCTGGCGCA 4150 GGTAGCAGAG CGGGTAAACT GGCTCGGATT AGGGCCGCAA GAAAACTATC 4200 CCGACCGCCT TACTGCCGCC TGTTTTGACC GCTGGGATCT GCCATTGTCA 4250 GACATGTATA CCCCGTACGT CTTCCCGAGC GAAAACGGTC TGCGCTGCGG 4300 GACGCGCGAA TTGAATTATG GCCCACACCA GTGGCGCGGC GACTTCCAGT 4350 TCAACATCAG CCGCTACAGT CAACAGCAAC TGATGGAAAC CAGCCATCGC 4400 CATCTGCTGC ACGCGGAAGA AGGCACATGG CTGAATATCG ACGGTTTCCA 4450 TATGGGGATT GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCGTCAGTA TCGGCGGAAT 4500 TACAGCTGAG CGCCGGTCGC TACCATTACC AGTTGGTCTG GTGTCAAAAA 4550 TAATAATAAC CGGGCAGGCC ATGTCTGCCC GTATTTCGCG TAAGGAAATC 4600 CATTATGTAC TATTTAAAAA ACACAAACTT TTGGATGTTC GGTTTATTCT 4650 TTTTCTTTTA CTTTTTTATC ATGGGAGCCT ACTTCCCGTT TTTCCCGATT 4700 TGGCTACATG ACATCAACCA TATCAGCAAA AGTGATACGG GTATTATTTT 4750 TGCCGCTATT TCTCTGTTCT CGCTATTATT CCAACCGCTG TTTGGTCTGC 4800 TTTCTGACAA, ACTCGGCCTC GACTCTAGGC GGCCGCGGGG ATCCAGACAT 4850 GATAAGATAC ATTGATGAGT TTGGACAAAC CACAACTAGA ATGCAGTGAA 4900 57
V
V
AAAAATGCTT TATTTGTGAA ATTTGTGATG CTATTGCTTT ATTTGTAACC 4950 ATTATAAGCT GCAATAAACA AGTTAACAAC AACAATTGCA TTCATTTTAT 5000 GTTTCAGGTT CAGGGGGAGG TGTGGGAC-GT TTTTTCGGAT CCTCTAGAGT 5050 CGAGTAGATA AGTAGCATGG CGGGTTAATC ATTaACTACA AGGAACCCCT 5100 AGTGATGGAG TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG 5150 CCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA 5200 GTGAGCGAGC GAGCGCGCAG CAGATCTGGA AGGTGCTGAG GTACGATGAG 5250 ACCCGCACCA GGTGCAGACC CTGCGAGTGT GGCGGTAAAC ATATTAGGAA 5300 CCAGCCTGTG ATGCTGGATG TGACCGAGGA GCTGAGGCCC GATCACTTGG 5350 TGCTGGCCTG CACCCGCGCT GAGTTTGGCT CTAGCGATGA AGATACAGAT 5400 TGAGGTACTG AAATGTGTGG GCGTGGCTTA AGGGTGGGAA AGAATATATA 5450 AGGTGGGGGT CTTATGTAGT TTTGTATCTG TTTTGCAGCA GCCGCCGCCG 5500 CCATGAGCAC CAACTCGTTT GATGGAAGCA TTGTGAGCTC ATATTTGACA 5550 ACGCGCATGC CCCCATGGGC CGGGGTGCGT CAGAATGTGA TGGGCTCCAG 5600 CATTGATGGT CGCCCCGTCC TGCCCGCAAA CTCTACTACC TTGACCTACG 5650 AGACCGTGTC TGGAACGCCG TTGGAGACTG CAGCCTCCGC CGCCGCTTCA 5700 GCCGCTGCAG CCACCGCCCG CGGGATTGTG ACTGACTTTG CTTTCCTGAG 5750 CCCGCTTGCA AGCAGTGCAG CTTCCCGTTC ATCCGCCCGC GATGACAAGT 5800 TGACGGCTCT TTTGGCACAA TTGGATTCTT TGACCCGGGA ACTTAATGTC 5850 GTTTCTCAGC AGCTGTTGGA TCTGCGCCAG CAGGTTTCTG . CCCTGAAGGC 5900 TTCCTCCCCT CCCAATGCGG TTTAAAACAT AAATAAAAAA CCAGACTCTG 5950 TTTGGATTTG GATCAAGCAA GTGTCTTGCT GTCTTTATTT AGGGGTTTTG 6000 CGCGCGCGGT AGGCCCGGGA CCAGCGGTCT CGGTCGTTGA GGGTCCTGTG 6050 TATTTTTTCC AGGACGTGGT AAAGGTGACT CTGGATGTTC AGATACATGG 6100 G.CATAAGCCC GTCTCTGGGG TGGAGGTAGC ACCACTGCAG AGCTTCATGC 6150 TGCGGGGTGG TGTTGTAGAT GATCCAGTCG TAGCAGGAGC GCTGGGCGTG 6200 58
GTGCCTAAAA ATGTCTTTCA CTAGCAAGCT TGGTGTAAGT GTTTACAAAG CGGTTAAGCT GATATGAGAT GCATCTTGGA CTGTATTTTT CATATCCCTC CGGGGATTCA TGTTGTGCAG CGGTGCACTT GGGAAATTTG TCATGTAGCT AACTTGGAGA CGCCCTTGTG ACCTCCAAGA AATGATGGCA ATGGGCCCAC GGGCGGCGGC GATCACTAAC GTCATAGTTG TGTTCCAGGÃ TTTACAAAGC GCGGGCGGAG GGTGCCAGAC CGGCCCAGGG GCGTAGTTAC CCTCACAGAT GTTCAGATGG GGGGATCATG TCTACCTGCG TCCGGGGTAG GGGAGATCAG CTGGGAAGAA CGACTTACCG CAGCCGGTGG GCCCGTAAAT ACTGGTAGTT AAGAGAGCTG CAGCTGCCGT ACTTCGTTAA GCATGTCCCT GACTCGCATG CAGAAGGCGC TCGCCGCCCA GCGATAGCAG TTTTCAACGG TTTGAGACCG TCCGCCGTAG CCAAGCAGTT CCAGGCGGTC CCACAGCTCG TCGATCCAGC ATATCTCCTC GTTTCGCGGG CGGCAGTAGT CGGTGCTCGT CCAGACGGGC GGCGCAGGGT CCTCGTCAGC GTAGTCTGGG CCGGGCTGCG CGCTGGCCAG GGTGCGCTTG GAAGCGCTGC CGGTCTTCGC CCTGCGCGTC TGGTGTCATA GTCCAGCCCC TCCGCGGCGT CCCTTGGAGG AGGCGCCGCA CGAGGGGCAG GAGCTTGGGC GCGAGAAATA CCGATTCCGG ( V u GATTGCCAGG GGCAGGCCCT 6250 GGGATGGGTG CATACGTGGG 6300 AGGTTGGCTA TGTTCCCAGC 6350 AACCn,CCAGC ACAGTGTATC 6400 TAGAAGGAAA TGCGTGGAAG 6450 TTTTCCATGC ATTCGTCCAT 6500 CTGGGCGAAG ATATTTCTGG 6550 TGAGATCGTC ATAGGCCATT 6600 TGCGGTATAA TGGTTCCATC 6650 TTGCATTTCC CACGCTTTGA 6700 GGGCGATGAA GAAAACGGTT 6750 AGCAGGTTCC TGAGCAGCTG 6800 CACACCTATT ACCGGGTGCA 6850 CATCCCTGAG CAGGGGGGCC 6900 TTTTCCCTGA CCAAATCCGC 6950 TTCTTGCAAG GAAGCAAAGT 7000 GCATGCTTTT GAGCGTTTGA 7050 GTCACCTGCT CTACGGCATC 7100 TTGGGGCGGC TTTCGCTGTA 7150 CAGGGTCATG TCTTTCCACG 7200 TCACGGTGAA GGGGTGCGCT. 7250 AGGCTGGTCC TGCTGGTGCT 7300 GGCCAGGTAG CATTTGACCA 7350 GGCCCTTGGC GCGCAGCTTG 7400 TGCAGACTTT TGAGGGCGTA 7450 GGAGTAGGCA TCCGCGCCGC 7500 59
Lc, ^ AGGCCCCGCA GACGGTCTCG CATTCCACGA GCCAGGTGAG CTCTGGCCGT 7550 TCGGGGTCAA AAACCAGGTT TCCCCCATGC TTTTTGATGC GTTTCTTACC 7600 TCTGGTTTCC ATGAGCCGGT GTCCACGCTC GGTGACGAAA AGGCTGTCCG 7650 TGTCCCCGTA TACAGACTTG AGAGGCCTGT CCTGGACCGA TGCCCTTGAG 7700 AGCCTTCAAC CCAGTCAGCT CCTTCCGGTG GGCGCGGGGC ATGACTATCG 7750 TCGCCGCACT TATGACTGTC TTCTTTATCA TGCAACTCGT AGGACAGGTG 7800 CCGGCAGCGC TCTGGGTCAT TTTCGGCGAG GACCGCTTTC GCTGGAGCGC 7850 GACGATGATC GGCCTGTCGC TTGCGGTATT CGGAATCTTG CACGCCCTCG 7900 CTCAAGCCTT CGTCACTGGT CCCGCCACCA AACGTTTCGG CGAGAAGCAG 7950 GCCATTATCG CCGGCATGGC GGCCGACGCG CTGGGCTACG TCTTGCTGGC 8000 GTTCGCGACG CGAGGCTGGA TGGCCTTCCC CATTATGATT CTTCTCGCTT 8050 CCGGCGGCAT CGGGATGCCC GCGTTGCAGG CCATGCTGTC CAGGCAGGTA 8100 GATGACGACC ATCAGGGACA GCTTCAAGGA TCGCTCGCGG CTCTTACCAG 8150 CCTAACTTCG ATCACTGGAC CGCTGATCGT CACGGCGATT TATGCCGCCT 8200 CGGCGAGCAC ATGGAACGGG TTGGCATGGA TTGTAGGCGC CGCCCTATAC 8250 CTTGTCTGCC TCCCCGCGTT GCGTCGCGGT GCATGGAGCC GGGCCACCTC 8300 GACCTGAATG GAAGCCGGCG GCACCTCGCT AACGGATTCA CCACTCCAAG 8350 AATTGGAGCC AATCAATTCT TGCGGÀGAAC TGTGAATGCG CAAACCAACC 8400 CTTGGCAGAA CATATCCATC GCGTCCGCCA TCTCCAGCAG CCGCACGCGG 8450 CGCATCTCGG GCAGCGTTGG GTCCTGGCCA CGGGTGCGCA TGATCGTGCT 8500 CCTGTCGTTG AGGACCCGGC TAGGCTGGCG GGGTTGCCTT ACTGGTTAGC 8550 AGAATGAATC ACCGATACGC GAGCGAACGT GAAGCGACTG CTGCTGCAAA 8600 ACGTCTGCGA CCTGAGCAAC AACATGAATG GTCTTCGGTT TCCGTGTTTC 8650 GTAAAGTCTG GAAACGCGGA AGTCAGCGCC CTGCACCATT ATGTTCCGGA 8700 TCTGCATCGC AGGATGCTGC TGGCTACCCT GTGGAACACC TACATCTGTA 8750 TTAACGAAGC CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT 8800 60
AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GACCGCTGCG CCTTATCCGG ACACGACTTA TCGCCACTGG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT GGCTACACTA GAAGGACAGT 'TACCTTCGGA AAAAGAGTTG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT AAAGGATCTC AAGAAGATCC GTGGAACGAA AACTCACGTT GGATCTTCAC CTAGATCCTT TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TGAGGCACCT ATCTCAGCGA GACTCCCCGT CGTGTAGATA CCCAGTGCTG CAATGATACC ATCAGCAATA AACCAGCCAG CAACTTTATC CGCCTCCATC GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA AGGCATCGTG GTGTCACGCT GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TTCTGAGAAT AGTGTATGCG ACGGGATAAT ACCGCGCCAC GAAAACGTTC TTCGGGGCGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC
GGCTGTGTGC ACGAACCCCC TAACTATCGT CTTGAGTCCA CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ACAGAGTTCT TGAA^TGGTG ATTTGGTATC TGCGCTCTGC GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA GTTTGCAAGC AGCAGATTAC TTTGATCTTT TCTACGGGGT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTAAATTAAA AATGAAGTTT TTGGTCTGAC AGTTACCAAT TCTGTCTATT TCGTTCATCC ACTACGATAC GGGAGGGCTT GCGAGACCCA CGCTCACCGG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA CAGTCTATTA ATTGTTGCCG TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CGTCGTTTGG TATGGCTTCA GTTACATGAT CCCCCATGTT TCCGATCGTT GTCAGAAGTA TGGCAGCACT GCATAATTCT TCTGTGACTG GTGAGTACTC GCGACCGAGT TGCTCTTGCC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG AAACTCTCAA GGATCTTACC TCGTGCACCC AACTGATCTT CGTTCAGCCC 8850 ACCCGGTAAG 8900 ATTAGCAGAG 8950 GCCTAACTAC 9000 TGAAGCCAGT 9050 CAAACCACCG 9100 GCGGAGAAAA 9150 CTGACGCTCA 9200 TTATCAAAAA 9250 TAAATCAATC 9300 GCTTAATCAG 9350 ATAGTTGCCT 9400 ACCATCTGGC 9450 CTCCAGATTT 9500 AGTGGTCCTG 9550 GGAAGCTAGA 9600 CCATTGCTGC 9650 TTCAGCTCCG 9700 GTGCAAAAAA 9750 AGTTGGCCGC 9800 CTTACTGTCA 9850 AACCAAGTCA 9900 CGGCGTCAAC 9950 CTCATCATTG 10000 GCTGTTGAGA 10050 CAGCATCTTT 10100 TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA r AACAGGAAGG CAAAATGCCG 10150 CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC 10200 CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGG 10250 ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA 10300 CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT TATTATCATG 10350 ACATTAACCT ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC GTCTTCAA 10398 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 4910 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.2 • TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG 50 GAGACGGTCA CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG 100 TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG 150 CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA 200 CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC ATTCGCCATT 250 CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT 300 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA 350 ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA 400 GCTTGCATGC CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG ATCCGAAAAA ACCTCCCACA 450 CCTCCCCCTG AACCTGAAAC ATAAAATGAA TGCAATTGTT GTTGTTAACT 500 TGTTTATTGC AGCTTATAAT GGTTACAAAT AAAGCAATAG CATCACAAAT 550 TTCACAAATA AAGCATTTTT TTCACTGCAT TCTAGTTGTG GTTTGTCCAA 600 ACTCATCAAT GTATCTTATC ATGTCTGGAT CCCCGCGGCC GCCAAATCAT 650 62
V
t
TTATTGTTCA AAGATGCAGT CAGTGCAAGC GTCTGGCACC TTCTGATACG CCTTTTTGAC AAAGCACTCT AAACAGTCTT TCTGATTCAT TCTCTCGCAT CCCACGTGAC GAGAACATTT AGCTTCCGCG TCTGACGTCG TGGGCTCACT TATATCTGCG CCCTTTTTGA CGTAGAATTC CCACCGGAAA AAGTCTTTGA GATCCAGACG GCGGGTGAGT TGCTGGTGTT CGAAGGTCGT GGTGTTGGAG GTGACGATCA TGCATTTCTG GTCCACGCGC GACTCCACGA CCTTGGCGGT CTTGTCGACA CAGTCGTTGA ACCCGTAGAA GGGCACAGTG CCGGTAGTTG CAGGCCCAAA TTTCGTGGCC CATCCCAGAA CGTTTAGTTC CAAAATTTTA GGCTGCTGGC CCACCAGGTA CTTTCCCGCA TTGTCCAAGG CCGCATTGAA GGAGATGTAT TCCGAGGTAA TCCCCTTGTC GGCTGAAGTT TTTGATCTGA TCTCTTTGTT CTGCTCCTGC
CATCCAAATC CACATTGACC TTTCCCATGA TATGATGAAT GACAGAAACG GGTTGAGATT TCTGTCCGTG AGTG^AGCAG TGTCTGCAGG GAAACAGCAT GTTTTGGTAC CTGTCTGCGT ATGGCTGCGC AACTGACTCG TCACTGGGGG CGGGTCTTTT ATGCTCCACC TCAACCACGT CTTCCTGCTT GGTGACCTTC TCAAATTTGA ACATCCGGTC TGAGTTCCCG TCAATCACGG CGGGAGTCGG GTCTATCTGG ACCTTGCTTC CTCCGAGAAT CATCTTCCCC TCCTCCCACC AGGGAAAGTT CTCATTGGTC TGGGCTATGG CCTCCGCGAT CAGCCAGATG GTGTTCCTCT AGACGGAAGC CGCATATTGG TAAATCCGAT TGCTGGAAAT GTCGGGGGCG GTTTTAGTCA CAGCCTTGAT TTGGGACCGC GAGGCCTGGT CCTCCTGGAT CACGAGCCAC CCGACCAGCT TCACCGGCGC ATCAGAATTG GTCTGCGACA CGTGCGTCAG AGATCGCAGG 700 GTAGCACAGT 750 CTGACACGGG 800 ATATTTGAAT 850 CAGATTCATG 900 AGTTGATCGA 950 CGCACCCGTT 1000 CTTGGCTCCA 1050 GATCCTTTGC 1100 CCAAAGTCAT 1150 TTGCAACGGC 1200 CGCACATGTT 1250 GCCGAGGACT 1300 GGCTTTGGCC 1350 AGATCACCAT 1400 CAGTTTACGC 1450 GTTGGTCTTC 1500 TGCCGAACTT 1550 GGATCGTACC 1600 GTCCTCCACG 1650 GGCTCATAAT 1700 GAGTTGGAGG 1750 CCACTGCTTC 1800 CCATGTACCT 1850 GGATTCTGAT 1900 ATGCTGCGCC 1950 63 Γ
ACCAACCGTT TACGCTCCGT CATATTAGTC CACGCCCACT AATTGGGGAT GTAGCACTCA TTTCTGGTCT TTGTGACCGC GCGGTAAATT CTCTGAATCA CCAAAACCAT GGATTTCACC AAGTAGCTCT CTCCCTTCTC CTTACTCACA CGGCGCCATT CCACGGTCAG GGGTGCCTGC GGCGGCAACT CCCATTCCTT AATGCCGGGC AGATGCCCGT CGTAAAACCC CGGCATGGCG GGAGACCCTG CGTGCTCACT TGTCGCAAAA TGTCGCAAAA GAGGATCCCC GGGTACCGAG TCCTGTGTGA AATTGTTATC GAAGCATAAA GTGTAAAGCC TTAATTGCGT TGCGCTCACT CCAGCTGCAT TAATGAATCG TTGGGCGCTC TTCCGCTTCC CGGCTGCGGC GAGCGGTATC CACAGAATCA GGGGATAACG AAAAGGCCAG GAACCGTAAA CTCCGCCCCC CTGACGAGCA GCGAAACCCG ACAGGACTAT CCCTCGTGCG CTCTCCTGTT
GAGATTCAAA CAGGCGCTTA GGAGCTCAGG CTGGGTTTTG TCCACCACCT TGTTCCCGCC GAACCAGTTT GGCAAAGTCG GTTTTTCGCG AATCTGACTC CCGGTGGTTT CCACGAGCAC AAATTGCACA AAGAAAAGGG CCGTCAGAAA GTCGCGCTGC TCAATCAGAT TCAGATCCAT CTCGGCCACC CAGTTCACAA CAAGGTCGCT GGGGACCTTA GCTGCGCGTT CAAACCTCCC CGGGCTTAAA TACCCAGCGT CACTCACGTG ACCTCTAATA CTCGAATTCG TAATCATGGT CGCTCACAAT TCCACACAAC TGGGGTGCCT AATGAGTGAG GCCCGCTTTC CAGTCGGGAA GCCAACGCGC GGGGAGAGGC TCGCTCACTG ACTCGCTGCG AGCTCACTCA AAGGCGGTAA CAGGAAAGAA CATGTGAGCA AAGGCCGCGT TGCTGGCGTT TCACAAAAAT CGACGCTCAA AAAGATACCA GGCGTTTCCC CCGACCCTGC CGCTTACCGG AATACTGTTC 2000 GGGAGCAAGT 2050 TCCGGCGCCA 2100 GCTCGATCCC 2150 AGGAAACGTC 2200 GTGCATGTGG 2250 CCTCCGGGGC 2300 AGCTTCTCGG 2350 GTCAGAATCT 2400 AGCTGTCAGA 2450 ATCACAATCT 2500 GCTTCAAAAT 2550 GACCACATGG 2600 CAGGACTCTA 2650 CATAGCTGTT 2700 ATACGAGCCG 2750 CTAACTCACA 2800 ACCTGTCGTG 2850 GGTTTGCGTA 2900 •CTCGGTCGTT 2950 TACGGTTATC 3000 AAAGGCCAGC 3050 TTTCCATAGG 3100 GTCAGAGGTG 3150 CCTGGAAGCT 3200 ATACCTGTCC 3250 64
GCCTTTCTCC CTTCGGGAAG GTATCTCAGT TCGGTGTAGG AACCCCCCGT TCAGCCCGAC GAGTCCAACC CGGTAAGACA TAACAGGATT AGCAGAGCGA AGTGGTGGCC TAACTACGGC GCTCTGCTGA AGCCAGTTAC CGGCAAACAA ÂCCACCGCTG AGATTACGCG CAGAAAAAAA ACGGGGTCTG ACGCTCAGTG CATGAGATTA TCAAAAAGGA GAAGTTTTAA ATCAATCTAA TACCAATGCT TAATGAGTGA TTCATCCATA GTTGCCTGAC AGGGCTTACC ATCTGGCCCC TCACCGGCTC CAGATTTATC GCGCAGAAGT GGTCCTGCAA GTTGCCGGGA AGCTAGAGTA GTTGTTGCCA TTGCTACAGG GGCTTCATTC AGCTCCGGTT CCATGTTGTG CAAAAAAGCG AGAAGTAAGT TGGCCGCAGT TAATTCTCTT ACTGTCATGC AGTACTCAAC CAAGTCATTC TCTTGCCCGG CGTCAATACG AAAAGTGCTC ATCATTGGAA Γ
C3TGGCGCTT TCTCATAGCT TCGTTCGCTC CAAGCTGGGC CGCTGCGCCT TATCCGGTAA CGACTTATCG CCAC1GGCAG GGTATGTAGG CGGTGCTACA TACACTAGAA GGACAGTATT CTTCGGAAAA AGAGTTGGTA GTAGCGGTGG TTTTTTTGTT GGATCTCAAG AAGATCCTTT GAACGAAAAC TCACGTTAAG TCTTCACCTA GATCCTTTTA AGTATATATG AGTAAACTTG GGCACCTATC TCAGCGATCT TCCCCGTCGT GTAGATAACT AGTGCTGCAA TGATACCGCG AGCAATAAAC CAGCCAGCCG CTTTATCCGC CTCCATCCAG AGTAGTTCGC CAGTTAATAG CATCGTGGTG TCACGCTCGT CCCAACGATC AAGGCGAGTT GTTAGCTCCT TCGGTCCTCC GTTATCACTC ATGGTTATGG CATCCGTAAG ATGCTTTTCT TGAGAATAGT GTATGCGGCG GGATAATACC GCGCCACATA AACGTTCTTC GGGGCGAAAA -t CACGCTGTAG 3300 TGTGTGCACG 3350 CTATCGTCTT 3400 CAGCCACTGG 3450 GAGTTCTTGA 3500 TGGTATCTGC 3550 GCTCTTGATC 3600 TGCAAGCAGC 3650 GATCTTTTCT 3700 GGATTTTGGT 3750 AATTAAAAAT 3800 GTCTGACAGT 3850 GTCTATTTCG 3900 ACGATACGGG 3950 AGACCCACGC 4000 GAAGGGCCGA 4050 TCTATTAATT 4100 TTTGCGCAAC 4150 CGTTTGGTAT 4200 ACATGATCCC 4250 GATCGTTGTC 4300 CAGCACTGCA 4350 GTGACTGGTG 4400 ACCGAGTTGC 4450 GCAGAACTTT 4500 CTCTCAAGGA 4550 65
TCTTACCGCT GTTGAGATCC TGATCTTCAG CATCTTTTAC AGGAAGGCAA AATGCCGCAA GAATACTCAT ACTCTTCCTT TATTGTCTCA TGAGCGGATA AATAGGGGTT CCGCGCACAT AAACCATTAT TATCATGACA CCCTTTCGTC
AGTTCGATGT AACCCACTCG TTTCACCAGC GTTTCTGGGT AAAAGGGAAT AAGGGCGACA TTTCAATATT ATTGAAGCAT CATATTTGAA TGTATTTAGA TTCCCCGAAA AGTGCCACCT TTAACCTATA AAAATAGGCG TGCACCCAAC 4600 GAGCAAAAAC 4650 CGGAAATGTT 4700 TTATCAGGGT 4750 AAAATAAACA 4800 GACGTCTAAG 4850 TATCACGAGG 4900 4910
Lisboa, 19 de Junho de 2001
O AGF.NTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL
66
Claims (34)
- \REIVINDICAÇÕES 1. Virus hibrido defeituoso para a replicação, recombinante compreendendo: (a) sequências de adenovirus que compreendem os elementos cis 5' e 3', necessários para a replicação e encapsidação do virião, em que as referidas sequências de adenovirus compreendem uma delecção funcional em cada gene EI do adenovirus, o gene E2 do adenovirus, o gene E3 do adenovirus e o gene E4 do adenovirus; (b) sequências de virus adeno-associados (AAV) que compreendem as repetições terminais invertidas (ITRs) 5' e 3' de um AAV, em que as referidas sequências de AAV são flanqueadas pelos elementos cis 5' e 3' do adenovirus; e (c) um transgene seleccionado, ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão numa célula alvo, sendo o referido transgene e sequências reguladoras flanqueados pelas sequências AAV de (b), em que o virus hibrido é proporcionado com sequências de adenovirus suficientes para permitir a infecção de uma célula alvo.
- 2. Virus hibrido defeituoso para a replicação, recombinante, de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas sequências de adenovirus compreendem delecções funcionais num, ou mais genes do adenovirus, seleccionados do grupo constituido por: gene Ela de adenovirus, gene Elb de adenovirus, gene E2a; qualquer dos genes tardios LI a L5; gene intermediário IX e gene intermediário IVa. 1 Γ U
- 3. Vírus híbrido defeituoso para a replicação, recombinante, compreendendo: (a) sequências de adenovírus que compreendem os elementos cis 5' e 3' necessários para a replicação e encapsidação do virião, em que as referidas sequências de adenovírus compreendem uma delecção funcional em cada gene EI do adenovírus, o gene E2 do adenovírus, o gene E3 do adenovírus e o gene E4 do adenovírus; (b) sequências de vírus adeno-associados (AAV) que compreendem as repetições terminais invertidas (ITRs) 5' e 3' de um AAV, em que as referidas sequências de AAV são flanqueadas pelos elementos cis 5' e 3' do adenovírus; e (c) um transgene, seleccionado ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão numa célula alvo, sendo o referido transgene e sequências reguladoras flanqueados pelas sequências AAV de (b), em que o vírus híbrido é proporcionado com sequências de adenovírus suficientes, para permitir a infecção de uma célula alvo.
- 4. Vírus híbrido, defeituoso para a replicação, recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido transgene seleccionado é um gene repórter.
- 5. Vírus híbrido, defeituoso para a replicação, recombinante, de acordo com a reivindicação 4, em que o referido gene repórter é seleccionado do grupo constituído pelos genes que codificam para a β-galactosidase, fosfatase alcalina e proteína fluorescente verde.
- 6. Vírus híbrido, defeituoso para a replicação, recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em 2 7. j" Uc -L·». V ' que o referido transgene seleccionado é um gene terapêutico.
- Vírus híbrido, defeituoso para a replicação, recombinante, de acordo com a reivindicação 6, em que o referido gene terapêutico é seleccionado do grupo constituído por um gene de regulador transmembranar, da fibrose quística (CFTR), normal, e um gene normal do receptor de lipoproteínas de baixa densidade (LDL).
- 8. Vírus híbrido, defeituoso para a replicação, recombinante, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda uma porção funcional de um gene rep de AAV ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão.
- 9. Vírus híbrido, defeituoso para a replicação, recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que as sequências que regulam a expressão do referido transgene compreendem sequências seleccionadas do grupo constituído pelo indutor/promotor precoce, imediato, de citomegalovírus, o indutor/promotor LTR do vírus de sarcoma de Rou e o promotor da β-actina de galinha.
- 10. Vector híbrido, defeituoso para a replicação, recombinante, compreendendo: (a) sequências de adenovírus que compreendem os elementos cis 5' e 3' necessários para a replicação e encapsidação do virião, em que as referidas sequências de adenovírus compreendem uma delecção funcional em cada gene EI do adenovírus, o gene E2 do adenovírus, o gene E3 do adenovírus e o gene E4 do adenovírus; (b) sequências de vírus adeno-associados (AAV) que compreendem as repetições terminais invertidas (ITRs) 5' e 3' de um AAV, em que as referidas sequências de 3 ^ L-W I. AAV são flanqueadas pelos elementos eis 5' e 3' do adenovírus; e (c) um transgene seleccionado ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão numa célula alvo, sendo o referido transgene e sequências reguladoras flanqueados pelas sequências AAV de (b).
- 11. Partícula de trans-infecção recombinante, compreendendo: (a) um vírus híbrido, defeituoso para a replicação, recombinante, compreendendo: (i) sequências de adenovírus compreendendo elementos cis 5' e 3' necessários para a replicação e encapsidação do virião; (ii) sequências de vírus adeno-associados (AAV), compreendendo repetições terminais invertidas 5' e 3' (ITRs) de vírus adeno-associados, sendo as referidas sequências de AAV flanqueadas pelos elementos cis 5' e 3' de adenovírus e (iii) transgene seleccionado, ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão numa célula alvo, sendo o referido gene e sequências reguladoras, flanqueados pelas sequências AAV de (ii), em que o vírus híbrido é proporcionado com sequências de adenovírus suficientes para permitir a infecção de uma célula alvo; (b) sequência de policatião conjugada com o referido vírus híbrido; e (c) plasmídeo compreendendo uma porção funcional de um gene rep de AAV, ligado de forma operacional a 4 f )==^sw-_, sequências que regulam a sua expressão, estando o referido plasmideo associado com a referida sequência de policatião.
- 12. Partícula de trans-infecção de acordo com a reivindicação 11, em que as referidas sequências de adenovírus compreendem delecções funcionais num ou mais genes de adenovírus, seleccionados do grupo constituído por: gene E2a, gene E3, qualquer dos genes tardios LI a L5, genes intermediários IX e gene intermediário IVa.
- 13. Partícula de trans-infecção de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que o referido transgene seleccionado é um gene repórter.
- 14. Partícula de trans-infecção de acordo com a reivindicação 13, em que o referido gene repórter é seleccionado do grupo constituído pelos genes que codificam para a β-galactosidase, fosfatase alcalina e proteína fluorescente verde.
- 15. Partícula de trans-infecção de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que o referido transgene seleccionado é um gene terapêutico.
- 16. Partícula de trans-infecção de acordo com a reivindicação 15, em que o referido gene terapêutico é seleccionado do grupo constituído por um gene de regulador transmembranar da fibrose quística (CFTR), normal e um gene de receptor de lipoproteínas de baixa densidade (LDL).
- 17. Partícula de trans-infecção de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, em que as sequências reguladoras que controlam a expressão do referido transgene compreendem sequências seleccionadas do grupo constituído pelo indutor/promotor precoce, imediato, de 5 ç Lz ^—ç. citomegalovírus, pelo promotor/indutor LTR do virus de sarcoma de Rou e pelo promotor de β-actina de galinha.
- 18. Partícula de trans-infecção recombinante, compreendendo: (a) um vírus híbrido, defeituoso para a replicação, recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7; (b) uma sequência policatiónica conjugada com o referido vírus híbrido; e (c) um plasmídeo compreendendo uma porção funcional de um gene rep de AAV, ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão, estando o referido plasmídeo associado com a referida sequência policatiónica.
- 19. Composição para utilização no fornecimento e integração estável de um gene seleccionado no cromossoma de uma célula alvo, em que a referida composição compreende (a) um vírus híbrido defeituoso para a replicação, recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que compreende ainda uma porção funcional de um gene rep de AAV ligado de forma operacional a sequências que regulam a sua expressão; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável
- 20. Composição de acordo com a reivindicação 19, em que a referida porção funcional do gene rep codifica para as proteínas rep 78 e 52.
- 21. Composição para utilização no fornecimento e integração de forma estável, de um gene seleccionado no cromossoma de 6 j"'·’ L-Cí ^^ uma célula alvo, compreendendo uma quantidade eficaz de uma partícula de trans-infecção recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18 e ura veículo farmaceuticamente aceitável.
- 22. Célula de mamífero contendo o vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, o vector de acordo com a reivindicação 10, ou a partícula de trans-infecção de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 19.
- 23. Método para a produção de vírus adeno-associado (AAV), recombinante, numa célula em cultura, que compreende o passo de cultivar uma célula co-transfectada com o vector de acordo com a reivindicação 10, na presença de um gene rep de AAV, sob o controlo de sequências que regulam a expressão do referido gene rep e na presença de um gene cap de AAV, sob o controlo de sequências que regulam a expressão do referido gene cap.
- 24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a célula é co-transfectada na presença de um vírus ajudante.
- 25. Método de acordo com a reivindicação 23 ou 24, compreendendo ainda o passo de isolar um AAV recombinante, a partir da referida cultura.
- 26. Método para a produção de vírus adeno-associados (AAV) recombinantes, numa célula em cultura, compreendendo o passo de fazer a cultura de uma célula transfectada com a partícula de trans-infecção de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 19, na presença de um gene cap de AAV, sob o controlo de sequências que regulam a expressão do referido gene cap.
- 27. Método de acordo com a reivindicação 26, que compreende ainda o passo de isolar um AAV recombinante a partir da referida cultura. 7
- 28. Método para a produção de vírus adeno-associados (AAV), recombinantes, numa célula em cultura, que compreende o passo de fazer a cultura de uma célula contendo o vírus híbrido de acordo com a reivindicação 1 a 9, na presença de um gene rep de AAV, sob o controlo de sequências que regulam a expressão do referido gene rep e na presença de um gene cap AAV, sob o controlo de sequências que regulam a expressão do referido gene cap.
- 29. Método de acordo com a reivindicação 28, que compreende ainda o passo de isolar AAV recombinante a partir da referida cultura.
- 30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 ou 28, em que o gene rep é transportado num plasmídeo.
- 31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23, 26 ou 28, em que o gene cap é transportado num plasmídeo.
- 32. Método para a produção de um adenovírus híbrido, recombinante, que compreende o passo de fazer a co-cultura de uma célula hospedeira contendo um vector híbrido de acordo com a reivindicação 10 e um adenovírus ajudante opcional, em que a célula hospedeira e/ou o vírus ajudante proporcionam ao vector híbrido as sequências de adenovírus necessárias para produzir um adenovírus híbrido, recombinante.
- 33. Método de acordo com a reivindicação 32, que compreende ainda o passo de isolar o adenovírus híbrido, recombinante, a partir da referida cultura.
- 34. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o adenovírus híbrido, recombinante, compreende ainda delecções funcionais no gene intermediário de adenovírus e qualquer IX, o gene intermediário de adenovirus, IVa, dos genes tardios de adenovirus, LI a L5. Lisboa, 19 de Junho de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL9
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