ES2279512T3 - Factor de transcripcion e2f-5. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A DOS NUEVOS FACTORES DE TRANSCRIPCION PERTENECIENTES A LA FAMILIA DEL GEN E2F: EL E2F NO Y EL MURINO, QUE PUEDEN INTERACCIONAR CON DP - 1 Y P130.

Description

Factor de transcripción E2F-5.

La presente invención se refiere a un nuevo factor de transcripción y a su producción y usos.

Los sucesos moleculares que se producen durante el ciclo celular necesitan integrarse con el aparato de transcripción de manera que pueda sincronizarse la expresión génica con la progresión del ciclo celular.

Recientemente, se ha identificado un factor de transcripción denominado E2F (o DRTF1) y se ha demostrado que se une a pRb, el producto proteico del gen de susceptibilidad al retinoblastoma, un antioncogén o gen de supresión tumoral (ver, por ejemplo, Wagner y Green, Nature 352:189-190, 1991). Es una creencia ampliamente extendida que el factor celular de transcripción E2F como componente clave en el control del ciclo celular debido a que se asocia a importantes proteínas reguladoras del ciclo celular, tales como el producto génico del retinoblastoma (pRb), p107, ciclinas y quinasas dependientes de la ciclina, y además, su actividad transcripcional se encuentra modulada por determinadas oncoproteínas víricas, tales como el adenovirus Ela, el antígeno T grande del SV40, y la proteína E7 del virus del papiloma humano.

Se cree que el factor de transcripción E2F (o DRTF1) desempeña un papel importante en la integración de los sucesos del ciclo celular en el aparato de transcripción debido a que, durante la progresión del ciclo celular en las células de mamífero, experimenta una serie de interacciones periódicas con moléculas que es conocido que resultan reguladores importantes de la proliferación celular. Por ejemplo, el producto génico de supresión tumoral del retinoblastoma (pRb), que regula negativamente la progresión desde la fase G1 hasta la fase S, y se encuentra modificada frecuentemente en células tumorales, se une a E2F. De manera similar, la proteína p107 relacionada con pRb se halla predominantemente en complejo con E2F durante la fase S. Tanto pRb como p107 reprimen la actividad transcripcional de E2F, que es probable que resulte de importancia fundamental para la regulación de la proliferación celular debido a que los sitios de unión a E2F se encuentran en las regiones de control de una diversidad de genes implicados en la proliferación, tales como c-myc y p34cdc2. Además, las proteínas Rb mutantes, codificadas por alelos aislados de las células tumorales, no consiguen unirse a E2F, y por lo tanto no son capaces de interferir con la actividad transcripcional dependiente del sitio de E2F. Otra característica importante de E2F es que determinadas oncoproteínas víricas, tales como Ela de adenovirus, el antígeno T grande de SV40 y el virus E7 del papiloma humano, modulan su actividad mediante el secuestro de pRb y p107 del factor de transcripción inactivo. Este efecto requiere regiones en estas proteínas víricas que resultan necesarias para la transformación de las células en cultivo de tejidos y por lo tanto para superar el control del crecimiento. De esta manera, la capacidad de estas oncoproteínas de regular E2F podría ser el medio por el que superan los mecanismos normales de control del crecimiento celular y, a la inversa, la represión transcripcional por pRb podría ser la base del control negativo del crecimiento mediado por
pRb.

Un mecanismo potencial para integrar las propiedades de regulación de la transcripción de pRb y p107 con otros sucesos del ciclo celular fue sugerida por la identificación de la ciclina A y la quinasa dependiente de ciclina relacionada con cdc2 llamada p33cdk2 en el complejo de E2F. La ciclina A resulta necesaria para la progresión a través de la fase S, una función que quizá se encuentra mediada por su capacidad para reclutar la quinasa dependiente de ciclina p33cdk2 hasta E2F. Conjuntamente estos datos sugieren que E2F es un factor de transcripción cuyo papel principal podría ser transmitir sucesos del ciclo celular hasta el aparato de transcripción a través de moléculas, tales como una pRb, p107, ciclinas y cks, garantizando de esta manera que la expresión génica se encuentra sincronizada e integrada en la progresión del ciclo celular.

Más recientemente, ha sido secuenciada y clonada un factor de transcripción con las propiedades de E2F (Helin et al., Cell 70:337-350, 1992, y Kaelin et al., Cell 70:351-364, 1992).

Ahora los presentes inventores han descubierto inesperadamente dos nuevas proteínas más que aparentemente son nuevos miembros de la familia del gen de E2F, que han denominado E2F-5. La secuencia de ADNc de la E2F-5 humana se presenta en la figura 1A, al igual que la secuencia de aminoácidos de esta proteína. Las secuencias correspondientes para la E2F-5 murina aparecen en la figura 9A. Estas nuevas proteínas se denominan E2F-5 y se utiliza esta nomenclatura en la presente especificación.

Se ha descubierto que E2F-5 es una de entre una familia de componentes factores de transcripción relacionados. Se cree que los miembros de la familia interaccionan con proteínas DP formando una serie de factores transcripcionales. Las proteínas (o polipéptidos) DP incluyen DP-1, DP-2 y DP-3, aunque el primero de ellos habitualmente se contempla con preferencia a los otros.

La invención en un primer aspecto proporciona una proteína tal como se muestra en la figura 1A o 9A, homólogos de la misma, y fragmentos de la secuencia y sus homólogos, que pueden funcionar como factor de transcripción de mamífero. En particular, la invención proporciona un polipéptido (preferentemente una forma sustancialmente aislada) que comprende:

(a)

la proteína de la figura 1A o 9A;

(b)

una proteína con una identidad de aminoácidos de por lo menos el 90% con (a) que puede funcionar como facto de transcripción de mamífero;

(c)

un fragmento de la proteína de la figura 1A o 9A de por lo menos 30 aminoácidos capaz de formar un complejo con una proteína DP, p107 y/o p130.

Se hace referencia posteriormente a todos los polipéptidos comprendidos en dicha definición como polipéptido o polipéptidos de acuerdo con la invención.

Se hace referencia a las proteínas pRb, p107, DP y p130 en la presente invención como proteínas acomplejantes o "complexores" debido a que pueden formar un complejo con las proteínas de la invención. Bajo determinadas condiciones, E2F-5 puede unirse sólo débilmente a pRb.

Un polipéptido de la invención se encuentra en forma sustancialmente aislada si se encuentra en una forma en la que se encuentra libre de otros polipéptidos con los que puede encontrarse asociado en su ambiente natural (por ejemplo el cuerpo). Se entenderá que el polipéptido puede encontrarse mezclado con portadores o diluyentes que no interfieren con el propósito pretendido del polipéptido y todavía considerarse como sustancialmente aislado.

El polipéptido de la invención también puede encontrarse en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprende el polipéptido en una preparación en la que más del 90%, por ejemplo el 95%, el 98% o el 99% del polipéptido en la preparación es un polipéptido de la invención.

Los polipéptidos mutantes poseen una o más mutaciones que son adiciones, deleciones, o sustituciones de los residuos aminoácidos. Preferentemente, las mutaciones no afectan, o no afectan sustancialmente, a la estructura y/o función y/o propiedades del polipéptido. De esta manera, los mutantes poseen convenientemente la capacidad de poder acomplejarse con DP, proteínas, pRb, p107 y/o p130. Los mutantes pueden ser naturales (es decir, purificados o aislados a partir de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo llevando a cabo mutagénesis sitio-dirigida en el ADN codificante). De esta manera, resultará evidente que los polipéptidos de la invención puede ser naturales o recombinantes (es decir, prepararse utilizando técnicas de ingeniería genética).

Una variante alélica es una variante que se halla naturalmente en un ser humano o en un animal, por ejemplo, murino, y que funciona regulando la expresión génica de una manera sustancialmente similar a la proteína en la figura 1A o 9A.

De manera similar, un homólogo específico de la proteína es el equivalente proteína que se halla naturalmente en otra especie, y que lleva a cabo la función equivalente en esa especie a la de la proteína de la figura 1A o 9A. Dentro de cualquier especie dada, puede existir un homólogo en forma de varias variantes alélicas, y todas éstas se consideran homólogos de la proteína. Pueden obtenerse variantes alélicas y homólogos específicos siguiendo los procedimientos descritos en la presente memoria para la producción de la proteína de la figura 1A o 9A y llevado a cabo estos procedimientos en una fuente celular adecuada, por ejemplo de un ser humano o de un roedor, portando una variante alélica de otra especie. Debido a que la proteína puede encontrarse evolutivamente conservada, también puede resultar posible utilizar un polinucleótido de la invención para sondear bibliotecas preparadas a partir de células humanas, de roedor u otras células con el fin de obtener clones codificantes de variantes alélicas o específicas. Los clones pueden manipularse mediante técnicas convencionales para identificar un polipéptido de la invención que después pueden producirse mediante técnicas recombinantes o sintéticas conocidas per se. Entre los homólogos específicos preferentes se incluyen homólogos de especies de mamífero o de anfibio.

Se incluye en la invención una proteína homóloga por lo menos al 70% con la de la figura 1A o 9A, debido a que son proteínas homólogas por lo menos al 80% o al 90%, y más preferentemente por lo menos al 95% a la proteína mostrada en estas figuras. Esto es a lo largo de una región de por lo menos 20, preferentemente de por lo menos 30, por ejemplo de por lo menos 40, 60 ó 100 o más aminoácidos contiguos. Son bien conocidos en la técnica procedimientos para medir la homología de las proteínas, lo que resulta conocido en el presente contexto por los expertos en la materia. La homología habitualmente se calcula a partir de la identidad de los aminoácidos (en ocasiones denominada "homología dura").

Generalmente, los fragmentos del polipéptido en la figura 1A o 9A o sus variantes alélicas u homólogos específicos de las mismas capaces de formar un complejo con los complexores presentarán una longitud de por lo menos 10, preferentemente de por lo menos 15, por ejemplo de por lo menos 20, 25, 30, 40, 50 ó 60 aminoácidos.

Resulta posible determinar si los fragmentos forman un complejo con el complejo de proteínas proporcionando la proteína complexora y el fragmento bajo condiciones en las que normalmente forman un factor transcripcional trans-activadora, y determinar si se ha formado o no un complejo. La determinación puede llevarse a cabo midiendo, por ejemplo, la capacidad del complejo de unirse a un sitio de unión a E2F, o alternativamente, determinando el peso molecular del complejo putativo mediante procedimientos tales como SDS-PAGE.

Entre los fragmentos preferentes se incluyen aquellos que son capaces de formar un complejo de transactivación con DP-1 u otros complexores. Los ejemplos, en la presente invención, describen varios procedimientos para analizar la función de la proteína y estos pueden adaptarse para evaluar si un polipéptido o no es capaz de formar un complejo de transactivación con la proteína DP-1. Por ejemplo, el polipéptido puede añadirse al complexor en la presencia de un constructo de gen informador adaptado para resultar activado por el complejo DP-1/E2F-5 (por ejemplo ver la figura 10 de la patente WO nº A-94/10307 a nombre del Medical Research Council). Este experimento puede determinar si el fragmento de polipéptido presenta la actividad necesaria.

Puede marcarse un polipéptido de la invención con un marcaje revelador o detectable. El marcaje (revelador) puede ser cualquier marcaje adecuado que permita detectar el polipéptido. Entre los marcajes adecuados se incluyen isótopos radioactivos, por ejemplo ^{125}I, enzimas, anticuerpos y línkers, tales como polipéptidos marcados con biotina de la invención, pueden utilizarse en procedimientos diagnósticos, tales como inmunoensayos, con el fin de determinar la cantidad de proteína E2F-5 en una muestra.

Puede fijarse un polipéptido o polipéptido marcado según la invención a una fase sólida, por ejemplo la pared de una placa de inmunoensayo.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido que comprende

(a)

una secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1A o 9A;

(b)

una secuencia complementaria a (a); o

(c)

una secuencia codificante de un polipéptido según se define en la reivindicación 1.

Además, la invención proporciona un polinucleótido que consiste de un fragmento de por lo menos 25 nucleótidos de longitud de los polinucleótidos que presentan la secuencia mostrada en la figura 1A o 9A. Entre los polinucleótidos de la invención se incluyen una secuencia de ADN en la figura 1A o 9A y los fragmentos de la misma capaces de hibridarse selectivamente con la secuencia de la figura 1A o 9A. Una realización adicional de la invención proporciona un ADN codificante de la proteína en la figura 1A o 9A o un fragmento de la misma.

Un polinucleótido también puede comprender ARN. También puede ser un polinucleótido que incluye nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen en la técnica varios tipos diferentes de modificación de los oligonucléotidos. Entre estos se incluyen esqueletos metilfosfonato y fosforotionato, la adición de acridina o cadenas de polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines de la presente invención, debe entenderse que los oligonucleótidos indicados en la presente invención pueden modificarse mediante cualquier procedimiento disponible en la técnica. Estas modificaciones pueden llevarse a cabo con el fin de incrementar la actividad o vida in vivo de los oligonucleótidos de la invención utilizados en procedimientos de terapia.

Un polinucleótido capaz de hibridarse selectivamente al ADN de la figura 1A o 9A es homólogo generalmente por lo menos al 70%, preferentemente por lo menos al 80% o al 90%, óptimamente por lo menos al 95%, respecto al ADN de la figura 1A o 9A a lo largo de una región de por lo menos 20, preferentemente por lo menos 30, por ejemplo por lo menos 40, 60 ó 100 o más nucleótidos contiguos. Estos polinucleótidos se encuentran comprendidos en la
invención.

Un polinucleótido de la invención se encontrará en forma sustancialmente aislada si se encuentra en una forma en la que se encuentre libre de otros polinucleótidos con los que puede encontrarse asociado en su ambiente natral (habitualmente el cuerpo). Se entenderá que el polinucléotido puede encontrarse mezclado con portadores o diluyentes que no interfieran con el propósito pretendido del polinucléotido y todavía puede considerarse como sustancialmente aislado.

Puede utilizarse un polinucleótido según la invención para producir un cebador, por ejemplo un cebador de PCR, una sonda, por ejemplo marcada con un marcaje revelador o detectable mediante medios convencionales utilizando marcajes radioactivos o no radioactivos, o el polinucleótido puede clonarse en un vector. Estos cebadores, sondas y otros fragmentos del ADN de la figura 1A o 9A presentarán una longitud preferentemente de por lo menos 20 nucleótidos, por ejemplo de por lo menos 25, 30 ó 40 nucleótidos, y también se encuentran comprendidos dentro de la invención.

Pueden producirse recombinantemente, sintéticamente, o mediante cualquier medio disponible para los expertos en la materia polinucleótidos, tales como un polinucleótido de ADN según la invención. También puede clonarse por referencia a las técnicas dadas a conocer en la presente invención.

La invención incluye un polinucleótido de doble cadena que comprende un polinucleótido según la invención y su complemento.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un vector (por ejemplo de expresión) adecuado para la replicación y expresión de un polinucleótido, en particular un polinucleótido de ADN o de ARN, según la invención. Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores plásmido, virus o fago provistos de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. El vector puede contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o n gen de resistencia a la neomicina para un vector de mamífero. El vector puede utilizarse in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o utilizarse para transfectar o transformar una célula huésped. El vector también puede adaptarse para su utilización in vivo, por ejemplo en un procedimiento de terapia génica.

Los vectores del tercer aspecto preferentemente son vectores replicables recombinantes. De esta manera, el vector puede utilizarse para replicar el ADN. preferentemente, el ADN en el vector se encuentra operablemente ligado a una secuencia de control que es capaz de permitir la expresión de la secuencia codificante por parte de una célula huésped. La expresión "operablemente ligado" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Una secuencia de control "operablemente ligada" a una secuencia codificante se encuentra ligada de manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Estos vectores pueden transformarse o transfectarse en una célula huésped adecuada, permitiendo la expresión de un polipéptido de la invención.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere de esta manera a células huésped transformadas o transfectadas con los vectores del tercer aspecto. Esto puede permitir la replicación y la expresión de un polinucleótido según la invención, incluyendo la secuencia de figura 1A o 9A o el marco de lectura abierta de la misma. Las células se seleccionan para que sean compatibles con el vector y pueden ser, por ejemplo, bacterianas, de levadura, de insecto o de mamífero.

También puede insertarse un polinucleótido de la invención en los vectores indicados anteriormente en una orientación antisentido con el fin de permitir la producción de ARN antisentido. El ARN antisentido u otros polinucleótidos antisentido también pueden producirse mediante medios sintéticos. Pueden utilizarse polinucleótidos antisentido en un procedimiento para controlar los niveles de la proteína E2F-5 en una célula. Este procedimiento puede incluir la introducción en la célula del polinucleótido antisentido en una cantidad eficaz para inhibir o para reducir el nivel de traducción del ARNm de E2F-5 en proteína. La célula puede ser una célula que se encuentre proliferando incontroladamente, tal como una célula tumoral.

De esta manera, en un quinto aspecto la invención proporciona un procedimiento para preparar un polipéptido según la invención que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector (de expresión) del tercer aspecto bajo condiciones que permitan la expresión (por parte del vector) de una secuencia codificante del polipéptido y recuperar el polipéptido expresado.

También se describen anticuerpos (monoclonales o policlonales) específicos para un polipéptido según la invención. Entre los anticuerpos de la invención se incluyen fragmentos de los mismos, así como mutantes que conservan la actividad de unión del anticuerpo. También se describe un procedimiento para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales contra un polipéptido de la invención. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales mediante tecnología de hibridoma convencional utilizando las proteínas o fragmentos de péptidos de las mismas como inmunógeno. También pueden prepararse anticuerpos policlonales mediante medios convencionales que comprenden inocular un animal huésped, por ejemplo una rata o un conejo, con un polipéptido de la invención y recuperar suero inmune.

Se incluyen en el presente aspecto de la invención fragmentos de anticuerpos monoclonales que pueden conservar su actividad de unión a antígeno, tales como fragmentos Fv, F(ab') y F(ab)_{2}. Además, los anticuerpos monoclonales según la invención pueden analizarse (por ejemplo mediante análisis de secuencias de ADN de los genes que expresan estos anticuerpos) y puede prepararse anticuerpo humanizado con regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo según la invención, por ejemplo de acuerdo con los procedimientos dados a conocer en la patente EP nº A-0239400 (Winter).

Los polipéptidos de la invención pueden encontrarse presentes en composiciones conjuntamente con un portador o un diluyente. Entre estas composiciones se incluyen composiciones farmacéuticas en las que el portador o diluyente es farmacéuticamente aceptable.

Entre los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables se incluyen aquellos utilizados en formulaciones adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural). Las formulaciones convenientemente pueden presentarse en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos de la técnica farmacéutica. Entre estos procedimientos se incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con el portador, que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y después, si resulta necesario, conformando el producto.

Por ejemplo, entre las formulaciones adecuadas para la administración parenteral se incluyen las soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que convierten a la formulación en isotónica respecto a la sangre del recipiente pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes, y liposomas u otros sistemas de micropartículas diseñados para dirigir el polipéptido a componentes sanguíneos o a uno o más órganos.

Los polipéptidos según la invención, y las composiciones anteriormente indicadas pueden utilizarse para el tratamiento, regulación o diagnóstico de condiciones, incluyendo enfermedades proliferativas, en un mamífero, incluyendo el ser humano. Entre estas condiciones se incluyen aquéllas asociadas con la expresión anormal (por ejemplo a un nivel inusualmente elevado o reducido) y/o aberrante (por ejemplo debido a una mutación en la secuencia génica) de uno o más factores de transcripción, tales como las proteínas DP o E2F o miembros relacionados de la familia. Entre las condiciones también se incluyen aquéllas producidas por la expresión anormal de un gen cuyo producto génico se encuentra regulado por la proteína de la figura 1A o 9A. El tratamiento o regulación de condiciones con los péptidos, anticuerpos, fragmentos de los mismos y composiciones, etc. anteriormente indicadas habitualmente implica la administración a un receptor que necesita de dicho tratamiento de una cantidad eficaz de un polipéptido, anticuerpo, fragmento de los mismos o composición, según resulte apropiado.

También se describen anticuerpos y fragmentos de los mismos dirigidos a esta región con el fin de inhibir la activación de factores de transcripción por medio de la alteración de la formación del complejo de proteínas E2F-5-DP.

También se describe un procedimiento para llevar a cabo un inmunoensayo para detectar la presencia o ausencia de un polipéptido de la invención en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

(a)

proporcionar un anticuerpo según la invención;

(b)

incubar la muestra con el anticuerpo bajo condiciones que permiten la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno; y

(c)

detectar, si se encuentra presente, el complejo anticuerpo-antígeno.

En otro aspecto, la invención proporciona un nuevo ensayo para identificar agentes quimioterapéuticos putativos para el tratamiento de enfermedades proliferativas o víricas que comprende poner en contacto una proteína DP o un derivado de la misma, un polipéptido de la invención y un agente quimioterapéutico putativo, y medir el grado de inhibición de la formación del complejo de proteínas DP/E2F-5 causada por el agente. Puede resultar necesario utilizar proteína DP-1 y/o E2F-5 completa en el ensayo, con la condición de que cada proteína se proporcione de manera que, bajo las condiciones del ensayo en ausencia del agente, formen un heterodímero.

La clonación y secuenciación de DP-1 (y de E2F-1, 2 y 3) son conocidas en la técnica y pueden encontrarse procedimientos para la expresión recombinante y preparación de anticuerpos contra DP-1 en la patente WO nº A-94/10307.

De esta manera, la invención proporciona un procedimiento de cribado para identificar agentes quimioterapéuticos putativos para el tratamiento de enfermedades proliferativas, que comprende:

(A) poner en contacto:

(i)

un polipéptido DP;

(ii)

un polipéptido del primer aspecto, y

(iii)

un agente quimioterapéutico putativo;

bajo condiciones en las que los componentes (i) e (ii) en ausencia de (iii) forman un complejo; y

(B) medir el grado con el que el componente (iii) puede alterar dicho complejo.

En el ensayo, puede marcarse uno o más cualesquiera de los tres componentes, por ejemplo con un marcaje radioactivo o colorimétrico, para permitir la medición del resultado del ensayo. Entre los agentes quimioterapéuticos putativos se incluyen péptidos de la invención.

Las variantes, homólogos y fragmentos de las proteínas DP se definen de una manera correspondiente las variantes, homólogos y fragmentos de la proteína E2F-5.

El complejo de (i) e (ii) puede medirse, por ejemplo, por su capacidad de unirse a un sitio de unión del ADN de E2F in vitro. Alternativamente, el ensayo puede ser un ensayo in vivo en el que se mide la capacidad del complejo de activar un promotor que comprende un sitio de unión a E2F ligado a un gen informador. El ensayo in vivo puede llevarse a cabo, por ejemplo, haciendo referencia a los ejemplos que muestran dicho ensayo en células de levadura, de insecto, de anfibio o de mamífero.

Entre los agentes terapéuticos candidatos que pueden medirse mediante el ensayo se incluyen no sólo polipéptidos del primer aspecto, sino en particular fragmentos de 10 o más aminoácidos de:

(a) la proteína de la figura 1A o 9A;

(b) una variante alélica u homólogo específico de la misma; o

(c) una proteína homóloga por lo menos al 70% a (a).

Los vectores que portan un polinucleótido según la invención o un ácido nucleico que codifica un polipéptido según la invención pueden utilizarse en un procedimiento de terapia génica. Esta terapia génica puede utilizarse para tratar la proliferación incontrolada de células, por ejemplo una célula tumoral. Entre los procedimientos de terapia génica se incluyen administrar a una célula en un paciente que necesita tratamiento una cantidad eficaz de un vector capaz de expresar en la célula un polinucleótido antisentido de la invención con el fin de inhibir o de reducir la traducción del ARNm de E2F-5 en proteína E2F-5 o en un polipéptido que interfiere con la unión de E2F-5 a una proteína DP o a un miembro relacionado de la familia.

El vector convenientemente es un vector vírico. El vector vírico puede ser cualquier vector adecuado disponible en la técnica para tratar células tumorales, por ejemplo, Huber et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039, 1991) informan de la utilización de retrovirus anfotróficos para transformación de células de hepatoma, de mama, de colon o de piel. Culvert et al. (Science 256:1550-1552, 1992) también describen la utilización de vectores retrovíricos en terapia de profármaco enzimático dirigido por virus, al igual que Ram et al. (Cancer Research 53:83-88, 1993). Englehardt et al. (Nature Genetics 4:27-34, 1993) describen la utilización de vectores basados en adenovirus en la introducción del producto de conductancia transmembranal de la fibrosis quística (CFTR) en células.

La invención contempla varios ensayos. En términos generales, estos pueden clasificarse de la manera siguiente:

1.

Llevar a cabo un ensayo para encontrar un inhibidor de la trans-activación de E2F-5 (es decir, la inhibición de la activación de la transcripción). Por lo tanto, este inhibidor puede inhibir la unión de E2F-5 al ADN (habitualmente en el sitio de unión a E2F). Son inhibidores potencialmente adecuados las proteínas, y pueden presentar un efecto similar o igual a p107. De esta manera, las moléculas inhibidoras adecuadas comprenden fragmentos, mutantes, variantes alélicas u homólogos específicos de p107 de la misma manera que se ha definido para las proteínas del primer aspecto.

2.

Someter a ensayo para inhibidores de (hetero)dimerización. Estos inhibidores pueden evitar la dimerización de E2F-5 (o un polipéptido del primer aspecto) con un complexor, por ejemplo una proteína DP, tal como DP-1. Evidentemente el inhibidor puede ser un fragmento, mutante, variante alélica u homólogo específico de una proteína DP de una manera similar a la definida para las proteínas del primer aspecto.

3.

Una tercera categoría de ensayo es encontrar inhibidores de fosforilación. Se cree que E2F-5 (y otras proteínas del primer aspecto) podrían resultar activadas mediante fosforilación. Por lo tanto, es probable que un inhibidor de fosforilación inhiba propiedades de trans-activación de E2F-5 (y, por lo tanto, podría finalmente presentar el mismo efecto que los inhibidores que se encuentran en cualquiera de los dos ensayos anteriores). La fosforilación la realizan cdks y por lo tanto un inhibidor de esta fosforilación es uno que se encuentra contemplado en dichos ensayos.

La invención contempla varios usos terapéuticos. Por ejemplo, terapia génica que utiliza un ácido nucleico de secuencia antisentido respecto a E2F-5. Se contemplan adicionalmente las moléculas que pueden unirse a una proteína DP-1 y formar de esta manera un complejo inactivo con la proteína DP. Entre las moléculas adecuadas se incluyen aquéllas del primer aspecto, aparte de E2F-5 misma. Estas moléculas pueden ser mutantes de E2F-5, y con frecuencia se hace referencia a ellas en la técnica como moléculas negativas dominantes.

La invención contempla el tratamiento o la profilaxis de enfermedades que se basan en la proliferación incontrolada de células, o donde la proliferación incontrolada es un aspecto patológico importante o esencial de la enfermedad. Este aspecto incluye cáncer, enfermedad vírica, la autoproliferación misma, así como enfermedades autoinmunes, tales como la soriasis. Puede resultar deseable inhibir temporalmente el crecimiento de células en división, por ejemplo células madre hematopoyéticas y/o células de médula ósea. En estos aspectos, generalmente se busca evitar, inhibir o interferir la actividad de E2F-5.

En contraste, algunas enfermedades y condiciones pueden crearse incrementando la expresión de E2F-5, por ejemplo promoviendo o induciendo la sobreexpresión. Esto resulta preferentemente en la apoptosis, en ocasiones conocida como muerte celular programada. La sobreexpresión de la proteína E2F-5 puede resultar en la muerte de la célula, y por lo tanto este aspecto también puede utilizarse en el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, un objetivo es incrementar la actividad de E2F-5. Se conocen usos similares para E2F-1 (Qin et al., PNAS USA 91 (en prensa)).

Debe tenerse en cuenta que el gen de E2F-5 puede encontrarse mutado en las células tumorales. En este caso, podría utilizarse el gen mutado en el diagnóstico de una condición resultante de la mutación. También se presta al tratamiento a través del gen mutado.

Los dos Ejemplos siguientes describen el aislamiento y caracterización de la nueva proteína y del ADN de la invención a partir de fuentes humanas y murinas, respectivamente. Sin embargo, otras fuentes, por ejemplo de mamífero, se encuentran comprendidas dentro del alcance de la presente invención y pueden aislarse otros homólogos de mamífero de la proteína de manera análoga. Los Ejemplos se presentan en la presente invención a título ilustrativo y no deben interpretarse como limitativos de la invención.

Ejemplo 1 Descripción resumida

Se encuentran los sitios de unión del ADN de E2F en varios genes cuya expresión se encuentra estrechamente regulada durante el ciclo celular. La actividad de los factores de transcripción de E2F se encuentra regulada mediante asociación con moléculas represoras específicas que pueden unirse e inhibir el dominio de trans-activación de E2F. Para E2F-1, 2 y 3, el represor es el producto del gen del retinoblastoma, pRb. E2F-4 interacciona con p107, relacionado con pRb, y no con pRb mismo. Recientemente, se ha aislado un ADNc codificante de un tercer miembro de la familia del gen del retinoblastoma, p130. p130 también interacciona con la actividad de unión al ADN de E2F, principalmente en la fase G_{0} del ciclo celular. Los presentes inventores informan en la presente memoria de la clonación de un quinto miembro de la familia del gen de E2F. El ADNc de E2F-5 humano codifica una proteína de 346 aminoácidos con una masa molecular teórica de 38 kDa. E2F-5 está más estrechamente relacionado con E2F-4 (similitud del 78%) que a E2F-1 (similitud del 57%). E2F-5 se asemeja a otros E2Fs en que se une a un sitio de consenso de E2F de manera cooperativa con DP-1. Los presentes inventores demuestran utilizando un antisuero específico de E2F-5, que bajo condiciones fisiológicas, E2F-5 interacciona preferentemente con p130.

Introducción

E2F es el nombre que recibe un grupo de factores de transcripción heterodiméricos compuestos de una subunidad similar a E2F y una subunidad similar a DP [27]. Se encuentran presentes sitios de unión a ADN de E2F en los promotores de varios genes cuya expresión se encuentra regulada durante el ciclo celular, y existe evidencia que indica que la presentencia de estos sitios de E2F contribuye a la expresión regulada en el ciclo celular de estos genes [13, 28, 38].

Se ha encontrado actividad de unión a ADN de E2F en complejo con la proteína del retinoblastoma (pRb) y la p107 y p130 relacionadas con pRb [6, 10, 29, 37]. Este grupo de proteínas comparte un motivo conservado, el "bolsillo", que se encuentra implicado en la unión a proteínas tanto celulares como víricas. Por este motivo, el grupo de proteínas similares a pRb se conoce colectivamente como la familia de las proteínas de bolsillo. Los complejos entre E2F y las diversas proteínas del bolsillo es probable que presenten diferentes funciones en la regulación del ciclo celular, debido a que su aparición difiere durante el ciclo celular. E2F en complejo con pRb se encuentra principalmente en la fase G1 del ciclo celular [5-7, 11]. Por el contrario, los complejos entre p107 y E2F persisten durante el ciclo celular, pero su composición es variable. En G1, aparte de E2F y p107, se encuentran presentes la ciclina E y cdk2. En la fase S, la ciclina E resulta sustituida por la ciclina A en el complejo E2F/p107 [29, 37]. La significación funcional de la presencia de estos complejos de ciclina/cdk en el complejo p107/E2F todavía no ha sido esclarecida. En las células quiescentes, la especie de unión a ADN de E2F más prominente es un complejo entre E2F y p130. Este complejo desaparece a medidas que las células salen de la quiescencia, sugiriendo un papel para la actividad de interacción de E2F con p130 en la entrada en el ciclo celular [10].

La capacidad de E2F de activar la transcripción se encuentra regulada por la formación de complejo con las proteínas del bolsillo. La formación de complejo entre E2F y pRb se encuentra sometida a regulación mediante fosforilación. Únicamente las especies hipofosforiladas de pRb interaccionan con E2F, indicando que la fosforilación de pRb por los complejos de ciclina/cdk controla la interacción entre E2F y pRb durante el ciclo celular [5-7, 11].

El papel crucial de los factores de transcripción de E2F en la regulación del ciclo celular queda subrayada por el descubrimiento de que la expresión forzada de actividad de unión a ADN de E2F provoca que las células progresen de G1 a las fases S y G2/M del ciclo celular [3] y E2F puede estimular que las células quiescentes inicien la síntesis de ADN [23]. Más importante, la sobreexpresión de E2F, junto con un oncogén ras activado, puede causar la transformación oncogénica de fibroblastos primarios de roedor [3].

Hasta el momento, se han aislado cuatro polipéptidos similares a E2F diferentes. E2F-1, 2 y 3 se encuentran sólo formando complejo con pRb, mientras que E2F-4 interacciona preferentemente con p107 [3, 15, 19, 22, 24, 30, 36]. En la actualidad se desconoce cómo se encuentra regulada la formación de complejo entre E2F y p107 y entre E2F y p130. Para empezar a tratar la regulación del complejo E2F/p107 y el complejo E2F/p130, los presentes inventores han buscado miembros adicionales de la familia del gen E2F. Los presentes inventores informan de la clonación de un quinto miembro de la familia del gen E2F que interacciona preferentemente con p130.

Materiales y métodos Cribado de dos híbridos en levaduras

Se transformó la cepa Y190 de levadura [17] que contiene el plásmido "cebo" pPC97-p107 con una biblioteca de embriones de ratón CD1 de día 14,5 [8] utilizando el procedimiento del acetato de litio [34]. Se seleccionaron dos millones de transformantes para el crecimiento en placas sin histidina suplementadas con 3-aminotriazol 25 mM y posteriormente se analizaron para actividad de \beta-galactosidasa tal como se ha descrito anteriormente [12]. Se sometieron a ensayo para especificidad de diana plásmidos de bibliotecas de ADNc derivados de colonias de levaduras doblemente positivas mediante retransformación con diferentes plásmidos de fusión Ga14-DBD: pPC97-p107, pPC97-bmi y pPC97 sin inserción. Se utilizó el ADNc parcial de E2F-5 de ratón para cribar bibliotecas de ADNc humanas adicionales. Se aisló el ADNc de E2F-5 humano de longitud completa indicado en la presente memoria a partir de la biblioteca de carcinoma de colon T84 (Stratagene).

Plásmidos

Se generó pPC97-p107 mediante clonación de la región de bolsillo de p107 (aminoácidos 240 a 816) en el mismo marco de lectura del dominio de unión a ADN de Ga14 (aminoácidos 1 a 147) de pPC97 [8]. Se construyeron pGST-E2F-5 (A) y (B) mediante clonación de un fragmento de ADNc de E2F-5 humano codificante de los aminoácidos 89 a 200 (A) o de los aminoácidos 89-346 (B) en pGEX-2T. Para los experimentos de transfección, se utilizaron los plásmidos siguientes: pSG-Gal4-E2F-1, que contiene los aminoácidos 284 a 437 de E2F-1 humana [19]. Se obtuvieron pJ3-Gal4-E2F-4 y pJ3-Ga14-E2F-5 mediante clonación de un fragmento del ADNc humano de E2F-4 (codificante de los aminoácidos 276 a 412) o de E2F-5 (codificante de los aminoácidos 222 a 346) en el mismo marco de lectura del dominio de unión a ADN de Gal4 en pJ3\Omega [33], pJ3-E2F-5 se construyó mediante clonación del ADNc de E2F-5 humano de longitud completa (que carece de los últimos 184 nucleótidos de la secuencia no codificante 3') en el vector de expresión de mamífero pJ3\Omega. El codón de inicio de traducción de E2F-5 se encontraba precedido del epítopo de 10 aminoácidos (HA) reconocido por el anticuerpo monoclonal 12CA5.

pCMV-DP-1, pCMV-pRb, pCMV-p107, pCMV-p107DE, PCMV-pRb\Delta22 han sido descritos anteriormente [20, 41].

Líneas celulares

Se cultivaron células U2-OS y CAMA en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de feto bovino al 10% o al 20%, respectivamente.

Se llevaron a cabo transfecciones utilizando la técnica de precipitación con fosfato de calcio [39].

Ensayos CAT

Se transfectaron transitoriamente células U2-OS con los vectores de expresión tal como se ha indicado, conjuntamente con 5 \mug de (Gal4)5-CAT [25] o 2 \mug de E2F4-CAT [20], 0,2 \mug de RSV-luciferasa y ADN portador de esperma de arenque hasta una cantidad total de 20 \mug/placa de 10 cm. Las células se sometieron a ensayo para actividad de CAT y de luciferasa tal como se ha descrito anteriormente [2, 3].

Análisis de transferencia northern

Para el análisis de expresión de E2F-5, se preparó ARN citoplasmático total a partir de un panel de líneas celulares. Se sometió a electroforesis 20 mg de ARN celular total a través de un gel de formaldehído-agarosa al 1% tal como se ha descrito [4], se transfirió a nitrocelulosa y se sondeó con un ADNc de E2F-5 humano parcial marcado con [^{32}P] (nt 666 a 1.038). Posteriormente, se sondeó el mismo filtro con un ADNc de \alpha-tubulina de rata como control de la cantidad de ARN cargado en cada carril.

Reactivos inmunológicos e inmunoprecipitaciones

Para generar anticuerpos contra E2F-5, se prepararon proteínas GST-E2F-5 (A) y (B) (ver plásmidos) en E. coli y se purificaron utilizando perlas de glutatión-sefarosa. Se inyectaron ambas proteínas en un conejo en cantidades iguales. Tras tres rondas de inmunización, se obtuvo suero policlonal.

Los anticuerpos monoclonales contra E2F-1 (KH20), E2F-4 (RK13), pRB (XZ77) y p107 (SD-4 y 9) han sido descritos anteriormente [3, 20, 21, 41]. Se obtuvo el antisuero policlonal de conejo p130 (C20) de Santa Cruz Biotechnology Inc. Se marcaron células CAMA y células U2-OS transfectadas y se inmunoprecipitaron tal como se ha descrito anteriormente [3].

Ensayos de retardo en gel

Se llevaron a cabo ensayos de retardo en gel para células U-2 OS transfectadas transitoriamente tal como se ha descrito anteriormente [20] con modificaciones menores. Se utilizaron 10 \mug de extracto de células completas en un tampón de unión que contenía HEPES 20 mM (pH 7,4), KCl 0,1 M, MgCl_{2} 1 mM, EDTA 0,1 mM, glicerol al 7%, NaF 1 mM y 1 \mug de ADN de esperma de salmón sonicado en 20 \mul de volumen de reacción con 0,5 ng de oligonucleótido marcado con [^{32}P] que especificaba el sitio de unión a ADN de E2F de consenso (Santa Cruz Biotechnology). Se dejó que se formaran complejos de ADN-proteína durante una incubación de 20 minutos a TA. Se separaron los productos de reacción en un gel de poliacrilamida al 3,5% en 0,25xTBE a TA durante 2,5 horas. A continuación, el gel se secó y se expuso a película.

Resultados Aislamiento de las proteínas de unión p107

Para identificar ADNcs codificantes de polipéptidos que interaccionan con p107, se llevó a cabo un cribado de dos híbridos en levadura [14]. Se cotransformó la cepa Y190 de levadura [17], que contiene dos genes informadores inducibles por Gal4 situados cromosómicamente: HIS3 y LacZ [12], con el plásmido "cebo" que contenía la región bolsillo (aminoácidos 240 a 816) de p107 fusionados con el dominio de unión a ADN (DB) de Gal4 y una biblioteca de ADNc de embrión de ratón CD1 de día 14,5 en la que cada ADNc se encuentra individualmente fusionado con el dominio de transactivación de Gal4 [8]. Se sometieron a selección un total de 2 millones de transformantes en placas sin histidina. Se cribaron ochenta y siete colonias supervivientes para la expresión de \beta-galactosidasa. Se rescataron plásmidos que contenían ADNc de dieciséis colonias de levadura doblemente positivas. Se confirmó la especificidad de la unión de p107 mediante retransformación con plásmidos codificantes de otras fusiones Gal4-DBD. Se descubrió que la totalidad de las dieciséis proteínas híbridas interaccionaba específicamente con Gal4-p107. El análisis de secuencias de ADN demostró que los dieciséis plásmidos de biblioteca de ADNc rescatados de las levaduras se derivaban de 10 genes diferentes. Se derivaron tres ADNcs del mismo gen y mostraban homología significativa con las cuatro E2Fs conocidas. Debido a ello, los presentes inventores llamaron a la proteína codificada por este ADNc, E2F-5.

A continuación, se utilizó el ADNc parcial de E2F-5 de ratón para obtener un clon de ADNc humano de longitud completa mediante cribado de una biblioteca de ADNc de carcinoma de colon humano. Se secuenció el ADNc más lago (2,1 kb) y contenía un marco de lectura abierto de 1.038 pb codificante de una proteína de 346 aminoácidos con una masa molecular teórica de 38 kDa. La fig. 1A muestra la secuencia de ADNc de E2F-5 y la secuencia de aminoácidos deducida.

E2F-5 se encuentra más estrechamente relacionada a E2F-4 (similitud del 78%) que a E2F-1 (similitud del 57%). En comparación con E2F-1 y E2F-4, pueden observarse tres regiones de homología en E2F-5 (fig. 1B). El dominio de unión a ADN (aminoácidos 43 a 115 de E2F-5) comparte una similitud del 93% con la región de unión a ADN de E2F-4, mientras que el dominio de dimerización DP-1 contiguo es similar al 81% entre E2F-4 y E2F-5. Finalmente, el dominio de interacción de proteína de bolsillo carboxi-terminal de E2F-4 y 5 es similar al 83%. E2F-4 y E2F-5 difieren de E2F-1 en que ambas proteínas carecen del motivo amino-terminal de E2F-1 que se encuentra implicada en la unión de la ciclina A. E2F-5 difiere de E2F-4 en que carece de la región de repetición de serinas de E2F-4.

Para analizar los niveles de expresión de ARNm de E2F-5, se utilizó un ADNc de E2F-5 humano para sondear una membrana de transferencia northern que contenía ARN citoplasmático total de varias líneas celulares humanas. La sonda E2F-5 detectó un nivel bajo de un solo transcrito de 2,1 kb en la mayoría de líneas celulares. La línea celular de carcinoma de mama CAMA humana expresó niveles algo superiores de E2F-5 (fig. 2).

E2F-5 contiene un dominio carboxi-terminal de transactivación

E2F-1 y E2F-4 contienen un dominio carboxi-terminal de transactivación que se solapa con el sitio de unión de proteína de bolsillo [3, 18]. Para someter a ensayo si E2F-5 también contiene un dominio de transactivación, los presentes inventores fusionaron el extremo carboxi-terminal de la E2F-5 humana al dominio de unión a ADN de Gal4 en el vector de expresión de mamífero pJ3\Omega. Se transfectaron transitoriamente células de osteosarcoma U2-OS con un gen informador CAT que transportaba cinco sitios Gal4 corriente arriba o se cotransfectó con los vectores de expresión del gen informador y de Gal4-E2F. La fig. 3 muestra que la cotransfección del plásmido de informador Gal4 con los vectores de expresión Gal4-E2F5 resultó en una activación de 50 veces del gen informador CAT. La cotransfección con Gal4-E2F-1 o Gal4-E2F-4 resultó en una activación dos a tres veces superior del gen informador CAT (fig. 3). Los presentes inventores concluyen que E2F-5 contiene un potente dominio carboxi-terminal de transactivación.

E2F-5 requiere DP-1 para la unión de ADN

Tanto E2F-1 como E2F-4 requieren la dimerización con DP-1 para la unión eficiente al ADN [1, 3, 20, 26]. Para investigar si E2F-5 puede unirse a un sitio de unión a ADN de E2F de consenso y si E2F-5 requiere la dimerización de DP-1 para unirse al ADN, los presentes inventores llevaron a cabo un experimento de transfección transitoria. Se transfectaron células de osteosarcoma U2-OS humana con un plásmido de informador CAT en el que un promotor nuclear se encontraba unido a cuatro sitios de E2F situados más arriba. La fig. 4 muestra que el plásmido de informador E2F-CAT sólo presenta una actividad reducida cuando se transfectaba solo en las células de osteosarcoma. La transfección de vectores de expresión de DP-1 o de E2F-5 separadamente no resultó en la activación del informador E2F-CAT (fig. 4, carriles 2 y 6). La cotransfección de los vectores de expresión de DP-1 y E2F-5 resultó en una fuerte activación sinérgica dependiente de dosis del informador CAT (fig. 4, carriles 3 a 5). Estos datos indican que E2F-5 puede unirse al sitio E2F de consenso y que la unión al ADN depende de DP-1. Los presentes inventores concluyen basándose en estos resultados que E2F-5 es un miembro genuino de la familia de genes de E2F.

La transactivación de E2F-5 resulta suprimida por las proteínas de bolsillo

La transactivación de E2F-1 y de E2F-4 resulta suprimida por la unión de proteínas bolsillo debido a que el dominio de transactivación de estas E2Fs se solapa con la superficie de interacción de la proteína de bolsillo. Para someter a ensayo el efecto de la expresión de proteínas bolsillo sobre la transactivación de E2F-5, los presentes inventores utilizaron un ensayo de transfección transitoria. Debido a que tanto E2F-1 como E2F-5 requieren la dimerización de DP-1 para la unión eficaz a sus proteínas bolsillo respectivas [3, 20], los presentes inventores midieron el efecto de la expresión de proteínas bolsillo sobre la transcripción activada por E2F-5 más DP-1. Las células U2-OS se transfectaron con el plásmido de informador E2F-CAT conjuntamente con E2F-5 y DP-1. La fig. 5 (carril 3) muestra que la cotransfección de E2F-5 y DP-1 resultó en una activación de más de 100 veces del gen informador E2F-CAT. La transcripción estimulada por E2F-5 resultó inhibida por la cotransfección con los vectores de expresión de pRb, p107 y p130 de una manera dependiente de dosis. Los mutantes de pRb (pRb\Delta22) y p107 (p107DE) que carecen de un dominio bolsillo intacto no pudieron suprimir la transactivación de E2F-5 (fig. 5, carriles 6 y 9). Significativamente, estas formas mutantes de pRb y de p107 también carecen de actividad inhibidora del crecimiento [41]. De esta manera, aunque este experimento no permitió una identificación inequívoca de la pareja de unión preferente de E2F-5, sí indicó que la transactivación de E2F-5 resulta inhibida por la unión de proteína de bolsillo y que existe una estrecha correlación entre la capacidad de pRb y p107 de causar una detención del crecimiento y su capacidad de inhibir la transactivación de E2F-5. Resulta importante señalar que las células U2-OS utilizadas en el presente experimento no son sensibles a una detención del crecimiento inducida por pRb o por p107 [41]. Los efectos observados sobre la transactivación de E2F-5, por lo tanto, resulta improbable que se deban a efectos no específicos sobre el ciclo celular de pRb o de p107.

E2F-5 interacciona preferentemente con p130 en un ensayo de desplazamiento de bandas

Con el fin de investigar en más detalle la especificidad de la unión de E2F-5 a proteína de bolsillo, los presentes inventores llevaron a cabo un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA). Las células U2-OS se transfectaron transitoriamente con vectores de expresión de DP-1 y de E2F-5 con o sin vectores de expresión de pRb, p107 o p130. Dos días después de la transfección, se prepararon extractos celulares completos a partir de células transfectadas y se incubaron con un oligonucleótido marcado con [^{32}P] que especifica un sitio E2F de consenso. Se separaron los complejos de ADN-proteína en un gel de poliacrilamida y se visualizaron mediante radiografía. La fig. 6 muestra que la transfección de los vectores de expresión de E2F-5 y de DP-1 conduce a la aparición de un nuevo complejo que no se observó en las células transfectadas sin plásmido (fig. 6, comparar los carriles 1 y 2). Pudo provocarse un cambio adicional en el desplazamiento de este complejo mediante cotransfección de vector de expresión de p130, pero no con vectores de expresión de p107 o de pRb (fig. 6, carriles 3 a 5). Estos datos sugieren que de las tres proteínas bolsillo sometidas a ensayo, p130 presentaba la afinidad más elevada para el heterodímero E2F-5/DP-1.

E2F-5 interacciona preferentemente con p130 in vivo

Bajo condiciones fisiológicas, E2F-1 se une preferentemente a pRb y E2F-4 a p107 [3, 15, 19, 24]. Sin embargo, en experimentos de transfección transitoria, puede suprimirse la expresión génica activada tanto por E2F-1 como E2F-4 tanto por pRb como por p107 [3, 40]. Esta pérdida de especificidad probablemente está causada por la sobreexpresión transitoria de estas proteínas. Para averiguar cuál de los tres miembros de la familia de la proteína del retinoblastoma interacciona con E2F-5 bajo condiciones fisiológicas, los presentes inventores generaron un antisuero policlonal de conejo contra E2F-5 humana. Los experimentos iniciales de inmunoprecipitación con E2F-1, E2F-4 y E2F-5 transcritos y traducidos in vitro indicaron que el suero policlonal de E2F-5 reconocía específicamente E2F-5 (datos no mostrados). A continuación, se utilizó el antisuero E2F-5 en un experimento de inmunoprecipitación secuencial. Se marcaron metabólicamente células de carcinoma de mama CAMA con [^{32}P]-ortofosfato y se prepararon lisados con detergente no iónico. Estos lisados se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpo específico de pRb, anticuerpo de p107 o antisuero específico de p130. Las proteínas que coinmunoprecipitaron con pRb, p107 o p130 se liberaron mediante ebullición en tampón que contenía SDS, se diluyeron y se reinmunoprecipitaron con antisuero específico para E2F-5. La fig. 6 panel B muestra que una proteína de 47 kDa puede reinmunoprecipitarse específicamente con antisuero de E2F-5 a partir del inmunoprecipitado de p130, pero a partir de inmunoprecipitados de pRb o de p107. Esta proteína de 47 kDa comigran en geles de SDS-poliacrilamida con E2F-5 transitoriamente transfectado (datos no mostrados). Como control, los presentes inventores verificaron si los inmunoprecipitados con pRb o con p107 contenían sus E2Fs respectivas. La fig. 6, panel C muestra que pRb efectivamente coinmunoprecipitó con E2F-1 y que p107 precipitó E2F-4. Conjuntamente estos datos indican que E2F-5 preferentemente interacciona con p130 in vivo.

Comentario

Los presentes inventores informan en la presente invención de un quinto miembro de la familia del gen de E2F. E2F-5 presenta todas las características de un miembro genuino de la familia E2F: contiene un dominio de unión a ADN altamente conservado, un dominio de dimerización de DP-1 y un dominio carboxi-terminal de transactivación. Además, E2F-5 se une a un sitio de unión a ADN de E2F de consenso de manera cooperativa con DP-1 y pueden activar la expresión de un gen informador que contiene un sitio E2F.

Los presentes inventores llevaron a cabo tres tipos de experimentos para investigar con cuál de las tres proteínas bolsillo interacciona E2F-5 preferentemente in vivo. En experimentos de transfección transitoria, se pudo suprimir la transactivación de E2F-5 por los tres miembros de la familia de la proteína del retinoblastoma, pRb, p107 y p130. A este respecto, E2F-5 se asemeja a E2F-1 y a E2F-4, debido a que puede inhibir la transactivación tanto de E2F-1 como de E2F-4 en ensayos de transfección transitoria de pRb, así como de p107 [3, 40]. Esta aparente pérdida de especificidad en ensayo de transfección transitoria probablemente es el resultado de los elevados niveles de expresión transitoria tanto de E2F como de las proteínas bolsillo en las células transfectadas transitoriamente. El nivel relativamente reducido de inhibición de la transactivación de E2F-5 por parte de p130 en el experimento de transfección transitoria (fig. 5) es el resultado del reducido nivel de expresión de p130 debido a que en las células transfectadas transitoriamente, se encontró que p107 se expresaba a un nivel 10 veces más elevado que p130 (datos no mostrados). Se llevaron a cabo dos experimentos adicionales para investigar la especificidad para proteína de bolsillo de E2F-5. En el primer experimento, las células se transfectaron transitoriamente con vectores de expresión de E2F-5 y DP-1 en presencia o en ausencia de vectores de expresión para las tres proteínas bolsillo. Posteriormente, se llevaron a cabo ensayos de desplazamiento de bandas utilizando extractos procedentes de las células transfectadas con un oligonucleótido que especifica un sitio de unión de E2F de consenso. Sólo la cotransfección de p130 pudo causar un cambio adicional en el desplazamiento del complejo E2F-5/DP-1 (fig. 6). En el experimento de desplazamiento de bandas, sólo los complejos entre proteínas bolsillo y E2F-5 estables durante periodos de tiempo prolongados se detectan como complejos de E2F/proteína de bolsillo "superdesplazados". De esta manera, aunque p130 se expresaba a un nivel inferior a p107, el complejo entre E2F-5 y p130 era más estable que el complejo p107/E2F-5 (fig. 6). En un experimento similar, los presentes inventores pudieron provocar un cambio adicional de desplazamiento de un complejo de unión a ADN de E2F-4 con p107, pero no con pRb (R.L.B y R.B., datos no publicados). Este resultado sugiere que los experimentos de cambio de movilidad potencialmente pueden resultar útiles para investigar la especificidad de proteínas de bolsillo de las E2Fs. En consistencia con los resultados del ensayo de cambio de movilidad, los presentes inventores descubrieron que en células de carcinoma de mama CAMA marcadas metabólicamente no transfectadas, E2F-5 pudo inmunoprecipitar con p130, pero no con p107 ni con pRb (fig. 7). Conjuntamente, los datos de los presentes inventores indican que, bajo condiciones fisiológicas, E2F-5 se asocia preferentemente con p130.

El descubrimiento de que E2F-5 interaccionaba con p130 pero no con p107 resultó bastante inesperado debido a que p130 y p107 se encuentran estrechamente relacionados desde el punto de vista estructural y efectivamente p107 y p130 comparten la capacidad de unirse a las ciclinas A y E [16, 32, 41]. Por otra parte, p107 y p130 difieren en su capacidad de interaccionar con ciclinas de tipo D in vivo debido a que p107, y no p130, coinmunoprecipitan con los anticuerpos anti-ciclina de tipo D [32]. Resulta importante que la apariencia de los complejos p130/E2F y p107/E2F difiere en el ciclo celular [9, 10, 29, 35, 37]. Esto sugiere que p107 y p130 presentan funciones diferentes durante el ciclo celular. La unión preferente de E2F-5 a p130 es consistente con este papel diferente de p130 en la regulación del ciclo celular.

El descubrimiento de los presentes inventores de que E2F-5 puede unirse a un sitio de E2F de consenso en modo alguno descarta la posibilidad de que E2F-5 interaccione con un subconjunto discreto de sitios de E2F in vivo que es diferente de los sitios E2F que se encuentran unidos a otros miembros de la familia del gen de E2F. En consistencia con esta preferencia de sitio de unión de los diferentes E2Fs es el descubrimiento de que los sitios E2F que se encuentran presentes en el promotor del gen de la timidina quinasa y en el promotor b-myb interaccionan preferentemente con los complejos E2F/p107 [28, 31]. Debido a que los complejos entre E2F y p130 se encuentran mayoritariamente en células quiescentes y desaparecen rápidamente tras salir las células de la quiescencia, resulta probable que se encuentren implicados genes sensibles a E2F-5 en las respuestas tempranas de las células quiescentes a la estimulación por factor de crecimiento [10]. La disponibilidad del E2F-5 que interacciona con p130 debería permitir la identificación de los genes sensibles a E2F-5.

Agradecimientos

Los presentes inventores agradecen a P. Chevray la cesión de la biblioteca de ADNc de embrión de ratón y los vectores de expresión de levadura, a S. Elledge por la cepa Y1090 de levadura, a M. Alkema por el vector de expresión de levadura Gal4-bmi, a G. Hannon por la cesión del vector de expresión p130, a A. Bes-Gennissen por la cesión del ARN de línea celular humana, y a Y. Ramos por la preparación de la transferencia northern. El presente trabajo ha recibido el apoyo de una subvención de la Netherlands Organization for Scientific Research (NWO).

Referencias para el ejemplo 1

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Ejemplo 2 Descripción resumida

El factor de transcripción DRTFI/E2F se encuentra implicado en el control de la proliferación celular debido a su interacción con reguladores clave de la progresión del ciclo celular, tales como el producto del gen supresor del tumor del retinoblastoma y proteínas bolsillo relacionadas, ciclinas y quinasas dependientes de ciclina. La actividad de unión a ADN de DRTF1/E2F surge cuando un miembro de dos familias diferentes de proteínas, DP y E2F, interacciona como heterodímero DP/E2F. En la presente invención, los presentes inventores informan del aislamiento y la caracterización de un nuevo miembro de la familia E2F de proteínas, denominado E2F-5. E2F-5 se aisló mediante un ensayo de dos híbridos en una levadura en la que se cribó una biblioteca de embrión de ratón de día 14,5 para moléculas capaces de unirse a la DP-1 murina, pero que también interaccionase con todos los miembros conocidos de la familia DP de proteínas. E2F-5 existe como heterodímero fisiológico con DP-1 en la actividad genérica de unión a ADN de DRTF1/E2F en extractos celulares de mamífero, una interacción que resulta en actividad cooperativa de unión a ADN y la activación transcripcional a través del sitio de E2F. Un potente dominio de activación transcripcional, que funciona en células tanto de levadura como de mamífero y reside en la región C-terminal de E2F-5, y la expresión de la proteína relacionada con pRb, p107, y no pRb, inactiva la actividad transcripcional de E2F-5. La comparación de la secuencia de E2F-5 con otros miembros de la familia indica que E2F-5 muestra un nivel de similitud a E2F-4 mayor que a E2F-1, a E2F-2 y a E2F-3. La similitud estructural y funcional de E2F-5 y d E2F-4 define una subfamilia de proteínas E2F.

Introducción

Existe evidencia considerable que sugiere que el factor celular de transcripción DRTF1/E2F se encuentra implicado en la coordinación de la transcripción con la progresión del ciclo celular. Por ejemplo, 5 DRTF1/E2F aparentemente es una de las dianas principales a través de las que el producto del gen supresor de tumores del retinoblastoma (pRb) ejerce sus efectos negativos sobre la proliferación celular (La Thangue, 1994). De esta manera, mediante la regulación de la actividad transcripcional de DRTF1/E2F y por lo tanto de la actividad de los genes diana, muchos de los cuales codifican proteínas requeridas para la progresión del ciclo celular (Nevins, 1992), pRb es capaz de influir sobre la progresión a través del ciclo celular temprano. Las mutaciones naturales en Rb, que se producen en las células tumorales humanas, codifican proteínas que no consiguen unirse a DRTF1/E2F (Bandara et al., 1992; Heibert et al., 1992; Zamanian y La Thangue, 1992), subrayando la correlación entre DRTF1/E2F desregulador y el crecimiento celular aberrante. Además, la actividad transformante de las oncoproteínas víricas, tales como la E1a de adenovirus, la E7 del virus del papiloma humano y el antígeno T grande de SV40, se correlaciona con su capacidad de desregular DRTF12F a través del secuestro de pRb y proteínas relacionadas (Nevins, 1992), proporcionando soporte adicional a esta visión.

Otras moléculas que desempeñan un papel central en el ciclo celular también interaccionan con DRTF1/E2F. Las ciclinas A y E, junto con la subunidad catalítica cdk2, se unen a DRTF1/E2F directamente entrando contacto con los componentes de unión a ADN en el factor transcripcional (Krek et al., 1994) o indirectamente a través de contactos que se producen en la región espaciadora de las proteínas bolsillo relacionadas con pRb llamadas p107 o p130 (Lees et al., 1992; Cobrinik et al., 1993). Aunque el papel del complejo ciclina-cdk que se asocia con p107 y con p130 todavía no ha sido identificado, se ha demostrado que la interacción directa entre el complejo ciclina A/cdk2 y DRTF1/E2F afecta a su actividad de unión a ADN (Krek et al., 1994).

Se está empezando a descubrir la composición molecular de DRTF1/E2F. Ahora ya resulta claro que la actividad genérica de unión a ADN de DRTF1/E2F surge cuando los miembros de dos familias diferentes de proteínas interaccionan como heterodímeros DP/E2F (La Thangue, 1994), siendo las moléculas prototipo de cada familia DP-1 (Girling et al., 1993) y E2F-1 (Helin et al., 1992; Kaelin et al., 1992; Shan et al., 1992). Una región de tamaño reducido de similitud entre ambas proteínas permite que éstas interaccionen formando un heterodímero (Bandara et al., 1993; Helin et al., 1993; Krek et al., 1993), encontrándose conservada esta región en todos los miembros de la familia de DP y de E2F aislados hasta la fecha (Girling et al., 1994), permitiendo de esta manera que se produzcan interacciones combinatorias diversas.

Durante la progresión del ciclo celular la asociación de pRb, p107 y p130 se ce de una manera temporalmente regulada, presentando cada proteína su propio perfil característico de interacciones con DRTF1/E2F (Shirodkar et al., 1992; Schwarz et al., 1993; Cobrinik et al., 1993). De entre los miembros de la familia de E2F aislados hasta el momento, E2F-1, E2F-2 y E2F-3 reconocen pRb (Ivey-Hoyle et al., 1993; Lees et al., 1993) y E2F-4, la proteína p107 (Beijersbergen et al., 1994; Ginsberg et al., 1994), siendo una explicación probable que las interacciones temporales de proteínas bolsillo reflejan la composición y/o disponibilidad reguladas del miembro de la familia E2F en el heterodímero E2F/DP.

Aunque en muchos tipos de células, DP-1 es un componente frecuente de unión a ADN de DRTF1/E2F, encontrándose presente en las diversas formas que se producen durante la progresión del ciclo celular (Bandara et al., 1994), otros miembros de la familia de DP, tales como DP-2, se expresan de una manera restringida a tejido (Girling et al., 1994). Por lo tanto, aparentemente resulta probable que la composición molecular de DRTF1/E2F se encuentra bajo la influencia de la progresión del ciclo celular y del fenotipo de la célula.

La complejidad de la familia E2F de proteínas todavía no ha sido elucidada. Con el fin de investigar esta cuestión los presentes inventores llevaron a cabo un cribado de dos híbridos en levadura para definir nuevos miembros de la familia. En la presente invención, los presentes inventores dan a conocer el aislamiento y la caracterización de E2F-5 murina, un nuevo miembro de la familia E2F. E2F-5 interacciona con todos los miembros conocidos de la familia DP de proteínas. En los extractos celulares de mamífero, E2F-5 existe en forma de heterodímero fisiológico con DP-1, una interacción que resulta en la unión cooperativa al ADN y la activación transcripcional desde el sitio de E2F. E2F-5 posee un potente dominio de transactivación que se inactiva específicamente con la unión de la proteína de bolsillo. La secuencia de la proteína y la organización molecular de E2F-5 se encuentra más estrechamente relacionada con E2F-4 que con otros miembros de la familia, definiendo por primera vez una subfamilia de proteínas E2F que se encuentra funcional y estructuralmente relacionada.

Resultados Aislamiento de E2F-5

Con el fin de explorar la diversidad de la familia E2F de proteínas, los presentes inventores utilizaron una estrategia de tipo dos híbridos en levadura (Fields y Song, 1989) para identificar nuevos miembros (figura 8). Los presentes inventores eligieron utilizar DP-1 como el cebo, debido a que DP-1 es una pareja fisiológica y frecuente de los miembros de la familia E2F (Bandara et al., 1993; Bandara et al., 1994). Para encontrar proteínas híbridas capaces de interaccionar con LexA-DP-1 se cribó una biblioteca de ADNc etiquetada con dominio de activación y preparada a partir de embrión de ratón de día 14,5 (Chevray y Nathans, 1992). Uno de los clones identificados codificaba una proteína híbrida que según varios criterios interaccionaba específicamente con LexA-DP-1. El análisis parcial de la secuencia de ADNc indicó una similitud extensiva con miembros de la familia E2F, y de esta manera se aisló adicionalmente un clon de ADNc codificante de la secuencia de proteínas completa a partir de una biblioteca de ADNc de F9 EC. La comparación de la secuencia de proteínas con otros miembros de la familia E2F indicaba que el clon de ADNc codificaba un nuevo miembro. Tras la denominación adoptada para las proteínas E2F anteriormente aisladas como E2F-1, E2F-2, E2F-3 y E2F-4, los presentes inventores se refiere a este clon con E2F-5.

El tamaño teórico de E2F-5 murino es de 335 residuos (figura 9a). Esta predicción se basa en la posición de la primera metionina de iniciación potencial, conjuntamente con la homología extensiva existente respecto a la secuencia de E2F-5 humana, en la que la traducción se inicia en la misma metionina (Hijmans et al., enviado). E2F-5 contiene similitud de secuencia extensiva respecto a los dominios conservados entre otros miembros de la familia E2F (Ivey-Hoyle et al., 1993; Lees et al., 1993; Beijersbegen et al., 1994; Ginsberg et al., 1994). Por ejemplo, el dominio de unión a ADN muestra una identidad del 48% con E2F-1 y del 87% con E2F-4 (figura 9b y c). Dentro de este área, un subdominio C-terminal contiene la única región de similitud respecto a miembros de la familia DP (indicada en las figuras 9b y c). Esta región, conocida como caja DEF (Girling et al., 1994; Lam y La Thangue, 1994) se encuentra íntimamente implicada en la formación del heterodímero DP/E2F (Bandara et al., 1993; Bandara y La Thangue, en preparación). Los residuos conservados dentro de la caja DEF entre las proteínas DP y E2F también se encuentran perfectamente conservados dentro de E2F-5 (figura 9c), subrayando la importancia potencial de este subdominio en la formación del heterodímero DP/E2F.

Se encuentran conservadas varias regiones adicionales entre E2F-5 y los demás miembros de la familia. La caja marcada (Lees et al., 1993) y el dominio de unión proteína de bolsillo muestra una identidad del 58% y del 50% respecto a estas regiones en E2F-1 y del 75% y del 72% respecto a las mismas regiones en E2F-4 (figuras 9b y 9c). Las posiciones de los residuos hidrofóbicos en la región de cremallera de leucina también se encuentran conservadas respecta otros miembros de la familia E2F (figura 9c). En efecto, E2F-5 puede formar una cremallera más larga que E2F-1, E2F-2 y E2F-3 debido a que los residuos hidrofóbicos en E2F-5 se unen a la repetición héptada en dos posiciones C-terminales adicionales (L144 y V151; ver la figura 9c).

Las características de E2F-5 sugieren una relación más estrecha con E2F-4 que con E2F-1, E2F-2 y E2F-3. Su organización se asemeja a la de E2F-4 en que la proteína no se extiende mucho más allá del extremo N-terminal del dominio de unión a ADN, y ambas proteínas carecen del dominio N-terminal de unión a ciclina A que se halla en las otras E2Fs (figura 9b). Además, la comparación entre las secuencias de las proteínas indica que E2F-5 y E2F-4 se encuentran más relacionadas entre sí que cualquiera de las dos a los restantes miembros de la familia. Ello resulta particularmente evidente en los dominios conservados, donde muchos residuos son comunes entre E2F-5 y E2F-4, pero no entre E2F-1, E2F-2 y E2F-3 (figura 9c). En global, E2F-5 contiene 70% de residuos aminoácidos idénticos a los de E2F-4, y 38% a los de E2F-1. De esta manera, basándose en esta similitud, E2F-5 y E2F-4 representan una subfamilia de la familia E2F de proteínas, mientras que E2F-1, E2F-2 y E2F-3, debido a su estrecha similitud, representan otra.

Unión y cooperación transcripcional de los miembros de la familia DP

La actividad de unión a ADN de DRTF1/E2F genérico surge cuando un miembro de la familia DP interacciona con un miembro de la familia E2F (La Thangue, 1984). Para DP-1 y E2F-1, la interacción resulta en la activación transcripcional cooperativa, la unión a ADN y la interacción con pRb (Bandara et al., 1993; Helin et al., 1993; Krek et al., 1993). Por lo tanto, los presentes inventores estaban interesados en determinar si E2F-5 podía cooperar con los miembros de la familia DP.

Para contestar a estas preguntas, los presentes inventores utilizaron en primer lugar el ensayo de dos híbridos en levadura con diferentes moléculas de DP representadas en el cebo híbrido como proteínas de fusión LexA (figura 8). E2F-5 o E2F-1 se expresaron como proteínas híbridas etiquetadas con dominio de activación (GAD) y el grado de activación transcripcional de un constructo informador LexA se evaluó midiendo la actividad de \beta-galactosidasa. Tanto E2F-5 como E2F-1 fueron igualmente capaces de interaccionar con todos los miembros conocidos de la familia DP de proteínas, es decir DP-1, DP-2, DP-3 y DP de Drosophila (datos no mostrados).

Los presentes inventores seguidamente evaluaron si E2F-5 podían cooperar con DP-1 en la activación de la transcripción a través del sitio de unión de E2F. Para ello, los presentes inventores utilizaron un ensayo en levadura en el que E2F-5 y DP-1 se expresaban juntos o por separado, y se midió la actividad transcripcional de un constructo informador de sitio de E2F, p4xWT CYC1 (figura 10a). En estudios anteriores, este ensayo se ha utilizado para medir la cooperación entre E2F-1 y DP-1 (Bandara et al., 1993). La actividad transcripcional del informador no se vio significativamente afectada tras la expresión de las proteínas DP-1 híbridas y sólo marginalmente por la E2F-5 híbrida (figura 10b). Sin embargo, cuando ambas se expresaron simultáneamente, la actividad informadora se vio estimulada en más de 6 veces (figura 10b). La actividad de p4xMT CYC1, un derivado de p4xWT CYC1 que porta sitios mutantes de unión de E2F (figura 10a; Bandara et al., 1993), no resultó afectada bajo las mismas condiciones (datos no mostrados). Por lo tanto, los presentes inventores concluyeron que E2F-5 cooperaba con DP-1.

Activación transcripcional y regulación de proteína de bolsillo de E2F-5

La capacidad de E2F-5 de activar la transcripción se evaluó en células tanto de levadura como de mamífero. Para ensayar la actividad transcripcional en la levadura, se fusionó una región C-terminal (entre los residuos 198 y 335) de E2F-5 con LexA, y se evaluó la actividad de un constructo informador regulado por sitios de unión de LexA (figura 11a). La proteína E2F-5 contiene un potente dominio de activación en trans debido a que la actividad del informador en la presencia de pLEX.E2F-5 es mucho mayor que cuando se expresa el vector solo (figura 11b); de manera similar, LexA E2F-1 fue capaz de activar la transcripción (figura 11b). De esta manera, E2F-5 activa la transcripción eficientemente en las levaduras.

Para confirmar estos resultados en células de mamífero y para evaluar las consecuencias funcionales de la interacción de proteínas bolsillo con E2F-5, los presentes inventores fusionaron la misma región de E2F-5 con el dominio de unión a ADN Gal4 y utilizaron ensayos de transfección transitoria para estudiar la actividad transcripcional de un constructo informador regulador por sitios de unión de Gal4, pGAL-CAT (figura 12a). En células 3T3, E2F-5 activó la transcripción eficientemente en comparación con la actividad del dominio de unión a ADN Gal4 solo (figura 12b), debido a que la actividad transcripcional de pGAL-CAT era 15 veces superior en presencia de pGAL-E2F-5 que con pG4. Se obtuvieron resultados similares en una diversidad de otros tipos celulares (datos no mostrados), indicando que E2F-5 contiene un dominio de transactivación que funciona en células de mamífero.

A continuación, los presentes inventores utilizaron la actividad transcripcional de E2F-5 para evaluar las consecuencias funcionales de una interacción con pRb o con p107. Como controles para la pRb y p107 de tipo salvaje, los presentes inventores estudiaron la actividad de Rb\Delta22, una proteína codificada por un alelo mutante natural de Rb que no consigue interaccionar con DRTF1/E2F (Zamanian y La Thangue, 1992) y la actividad de ARN antisentido de p107 (Zamanian y La Thangue, 19). Ni la pRb de tipo salvaje ni Rb\Delta22 afectaron significativamente la actividad de E2F-5, ya que en ni en presencia de pCMVHRb ni de pCMVHRb\Delta22 resultó afectada la actividad de pGAL-CAT (figura 12b). En contraste, la coexpresión de p107 (a partir de pCMV107) y de E2F-5 redujo la actividad transcripcional de E2F-5, un efecto que era específico, debido a que la p107 antisentido (de pCMV107AS) no presentaba ningún efecto (figura 12b). Los presentes inventores concluyeron que p107 inactiva la actividad transcripcional de E2F-5 en células de mamífero. Utilizando una estrategia experimental similar, se demostró que la proteína p130 inactivaba la actividad transcripcional de E2F-5 (datos no mostrados).

E2F-5 es un componente fisiológico de unión a ADN de DRTF1/E2F

Con el fin de determinar si E2F-5 era un componente fisiológico de unión a ADN de la actividad genérica de unión a ADN de DRTF1/E2F definida en extractos preparados a partir de células de mamífero, se prepararon dos sueros diferentes de péptido anti-E2F-5 contra secuencias de péptidos diferentes; ambos antisueros reaccionaron específicamente con una proteína de fusión GST-E2F-5 (datos no mostrados).

El efecto de estos antisueros sobre la actividad de unión a ADN de DRTF-1/E2F se estudió mediante ensayos de retardo en gel llevados a cabo con extractos de células de carcinoma embrionario F9 murino (F9 EC). Los estudios anteriores han demostrado que DP-1 es un componente frecuente, posiblemente universal, de la actividad de unión a ADN de DRTF1/E2F en extractos celulares F9 EC (Girling et al., 1993; Bandara et al., 1993), un ejemplo de lo cual se muestra en la figura 13 (carriles 1 a 4). Ambos sueros anti-E2F-5 alteraron la actividad de unión a ADN de DRTF1/E2F, un efecto que era específico, ya que no resultó aparente en presencia del péptido homólogo (figura 13, carriles 5 a 12). Aunque anti-E2F-5 causó una reducción significativa de la actividad de unión a ADN, el efecto resultó claramente menos marcado que el causado por anti-DP-1 (figura 13, comparar los carriles 1 a 4 con los carriles 5 a 12). Esto puede deberse a que E2F-5 se encuentra presente en una subpoblación de heterodímeros DP-1/E2F en extractos celulares F9 EC, una situación que contrasta con la observada para DP-1.

Propiedades de unión a ADN de E2F-5

Con el fin de estudiar las propiedades de unión a ADN de E2F-5, los presentes inventores expresaron y purificaron E2F-5 como proteína de fusión GST. En consistencia con resultados anteriores (Bandara et al., 1993), GST-DP-1 cooperó con GST-E2F-1 en la unión al sitio de E2F, aunque E2F-1 poseía actividad de unión a ADN significativa cuando se sometió a ensayo solo (figura 14, comparar los carriles 1 a 4). En contraste, E2F-5 solo poseía una actividad de unión a ADN prácticamente indetectable (figura 14, carriles 5 a 7). Sin embargo, la cooperación entre E2F-5 y DP-1 era considerablemente superior que entre E2F-1 y DP-1 (figura 13, carriles 8 a 10). De esta manera, E2F-5 y DP-1 cooperan en la actividad de unión a ADN.

Niveles de ARN de E2F-5

Los presentes inventores estaban interesados en determinar los niveles de ARN de E2F-5 en diferentes líneas celulares y, además, en comparar los niveles de E2F-5 con los de otros miembros de la familia E2F. Para ello, se preparó ARN a partir de cultivos asíncronos de células F9 EC junto con una diversidad de líneas celulares leucémicas, y se evaluó el nivel de ARN de E2F-5 mediante transferencia northern. La cantidad de ARN de E2F-5 variaba considerablemente entre líneas celulares; las células F9 EC y algunas de las líneas celulares leucémicas, por ejemplo DAUDI y RAGI, expresaban niveles elevados (figura 15, carriles 1, 7 y 8). En contraste, HL0 y TF1 contenían niveles reducidos de ARN de E2F-5 (figura 15, carriles 4 y 6). Este perfil de niveles de ARN de E2F-5 difería considerablemente de los niveles de E2F-1. Por ejemplo, se hallaban presentes niveles significativos de ARN de E2F-1 en células K562, HL60 y TF1, en contraste con E2F-5 (figura 15, carriles 3, 4 y 6). Resultaba aparente la situación inversa en células EL4, en las que los niveles de E2F-5 eran elevados y los de E2F-1, bajos (figura 15, carril 10). Los presentes inventores concluyeron que los niveles de ARN de E2F-5 se veían influidos por el tipo celular, y que existía una correlación reducida entre los niveles de ARN de E2F-5 y de E2F-1.

Comentario E2F-5 y E2F-4 son una subfamilia de proteínas E2F

Los presentes inventores dan a conocer el aislamiento y la caracterización del quinto miembro de la familia E2F de proteínas, E2F-5. Aunque muchos de los dominios en E2F-5, tales como la cremallera de leucina potencial, la caja marcada y la región de unión a proteína de bolsillo, se encuentran conservadas junto con otros miembros de la familia E2F, la falta de secuencia N-terminal fuera del dominio de unión a ADN indica una organización estructural similar a E2F-4 (Beijersbergen et al., 1994; Ginsberg et al., 1994). Los otros miembros de la familia E2F, E2F-1, E2F-2 y E2F-3 presentan extremos N-terminales extendidos dentro de los que reside un dominio capaz de interaccionar con la ciclina A (Krek et al., 1994). Se ha sugerido que el papel de este dominio es reclutar una ciclina A/quinasa cdk2 en el heterodímero DP-1/E2F que resulta en la posterior fosforilación de DP-1, siendo la consecuencia funcional la reducción de la actividad de unión a ADN del heterodímero DP-1/E2F (Krek et al., 1994). Este mecanismo puede ser importante en la regulación de la actividad transcripcional de los genes dependientes del sitio de E2F en un tiempo posterior durante la progresión del ciclo celular. La ausencia de un dominio de unión a ciclina A en E2F-5 (y en E2F-4) sugiere que la actividad de unión a ADN del heterodímero E2F-5/DP-1 puede encontrarse regulada negativamente a través de otros mecanismos. Efectivamente, un posible escenario a través del que esto podría conseguirse sería a través de las proteínas p107 y/o p130, debido a que la región espaciadora en estas proteínas puede unirse tanto al complejo ciclina A/cdk2 como al complejo ciclina E/cdk2 (Lees et al., 1993; Cobrinik et al., 1993; Hannon et al., 1993; Li et al., 1993). Resulta posible que estas proteínas de bolsillo sustituyan el papel de los miembros de la familia E2F que se unen a la ciclina A y recluten complejos de ciclina/cdk para el heterodímero DP/E2F.

La comparación de la secuencia proteica de E2F-5 con la de otros miembros de la familia E2F indica una relación más estrecha con E2F-4 que con E2F-1, E2F-2 y E2F-3. Resulta interesante que E2F-4 sea el único miembro conocido de la familia capaz de interaccionar con p107 bajo condiciones fisiológicas (Beijersbergen et al., 1994; Ginsberg et al., 1994). Los presentes inventores han demostrado que la actividad transcripcional de E2F-5 puede resultar inactivada por p107 o por p130, y no por pRb. Sin embargo, esto puede reflejar que p107 está más estrechamente relacionado con p130 que con pRb (Ewen et al., 1991; Cobrinik et al., 1993; Li et al., 1993) y por lo tanto podría no reflejar totalmente las interacciones fisiológicas. Resulta consistente con esta idea la demostración de que la E2F-5 humana interacciona con p130 bajo condiciones fisiológicas (Hijmans et al., enviado).

Cooperación entre E2F-5 y DP-1

En la unión a ADN y en la actividad transcripcional, E2F-5 cooperó con DP-1. En estos aspectos, E2F-5 posee propiedades similares a las de otros miembros de la familia E2F. Sin embargo, resulta interesante observar que la cooperación entre E2F-5 y DP-1 era considerablemente mayor que, por ejemplo, la cooperación observada entre E2F-1 y DP-1 en condiciones experimentales equivalentes (por ejemplo ver la figura 14). Si este ensayo refleja propiedades funcionales dentro de las células, resulta posible en un ambiente intracelular de exceso de DP1, que los incrementos equivalentes de la cantidad de E2F-5 y de E2F-1 resulten en un nivel relativamente superior de actividad de unión a ADN de E2F-5/DP-1. Además, si existen genes diana preferentes para heterodímeros E2F/DP particulares, estas diferencias de actividad de unión a ADN podrían reflejar diferentes de actividad transcripcional.

Los papeles precisos de las diferentes proteínas E2F en el control del ciclo celular todavía no han sido establecidos. Sin embargo, resulta posible que regulen la actividad transcripcional de genes diana durante etapas discretas de la progresión del ciclo celular. Por ejemplo, que E2F-1, E2F-2 y E2F-3 interaccionen con pRb (Helin et al., 1992; Kaelin et al., 1992; Ivey-Hoyle et al., 1993; Lees et al., 1993) sugiere que regulan la progresión del ciclo celular a través de G1. En contraste, p107 se asocia a DRTF1/E2F hacia el final de G, alcanzando un pico en la fase S (Shirodkar et al., 1992), mientras que p103 se asocia preferentemente en fases tempranas de la progresión del ciclo celular, sobre durante G0 (Cobrinik et al., 1993). Sin embargo, los niveles de E2F-1 y de E2F-5 en una diversidad de tipos celulares sugieren que la expresión de los miembros de la familia E2F se ve influida no sólo por la fase del ciclo celular, sino también por el fenotipo. Resulta posible que las células utilicen un subconjunto preferente de proteínas E2F que resulte más adecuado a sus requisitos en el ciclo celular.

La caracterización molecular y funcional de E2F-5 dada a conocer en la presente invención, junto con su interacción con miembros de la familia de DP, indica que una diversidad de heterodímeros entre miembros de la familia de E2F y de DP resulta teóricamente posible. Un objetivo importante de los estudios futuros será comprender el papel fisiológico de cada uno de estos factores de transcripción en el control del ciclo celular.

Materiales y métodos

Cepas, medios y métodos en levaduras. Las cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas en el presente estudio fueron las siguientes: W3031a (Mata ade2-100 trp1-1 leu2-3, 112 his3-11 ura3); CTY10-5d (Mat\alpha ade2 rp1-901 leu2-3, 112 his3-200 gal4 gal80 URA3::lexAop-lacZ) y PCY2 (Mat\alpha gal14 gal80 URA3::GAL1-lacZ lys2-801 his3-200 trp1-63 leu2 ade2-101) y JZ1 (Jooss et al., 1994; Mat\alpha lys2-801 ade2-10 leu2\Delta1 trp\Delta63 his3\Delta200 URA3::lexAop-CYC1-lacZ). Se propagaron cepas de levadura en medios YPD o YNB y se transformaron utilizando una modificación del procedimiento del acetato de litio. Se llevó a cabo el ensayo de actividad \beta-galactosidasa de color de las colonias mediante procedimientos convencionales. Se cuantificó la actividad de la \beta-galactosidasa de los transformantes individuales se cuantificó en cultivos en fase semilogarítmica durante por lo menos tres transformantes independientes.

Bibliotecas de ADN, plásmidos y oligonucleótidos. pPC67 es una biblioteca de ADNc con cebador oligo-dT de embrión de ratón CD-1 de día 14,5 fusionada corriente abajo de secuencias de levadura codificantes del dominio de trans-activación de la proteína GAL4 (GAD; Chevray y Nathans, 1992). Se aislaron clones completos de ADNc a partir de una biblioteca \lambdaZapII F9 EC de ADNc con cebador poli-dT clonado direccionalmente (Schöler et al., 1990).

El plásmido pTR27 es un derivado de pBTM116 (Bandara et al., 1993) en el que las secuencias de polilínker se han extendido; pLEX.DP-1, pGAD.E2F-1, p4xWT CYC1 y p4xMT CYC1 han sido descritos anteriormente (Bandara et al., 1993). pLEX(HIS).DP-1 codifica una fusión de la proteína LexA bacteriana completa con DP-1 (entre los residuos aminoácidos 59 y 410) en el plásmido pLEX(HIS), un derivado de pBTM116 en el que TRP1 ha sido sustituido por HIS3. pGAD.E2F-5 contiene la secuencia codificante completa de E2F-5 expresada como proteína híbrida con el dominio de activación de la proteína GAL4 de levadura (768-881) en el plásmido pACTII (Durfee et al., 1993). pLE.E2F-5 contiene la secuencia codificante de E2F-5 entre los residuos aminoácidos 198 y 335 expresada como proteína híbrida más abajo de la secuencia codificante completa de la proteína LexA en el plásmido pTR27. pLEX.E2F-1 porta E2F-1 de longitud completa (1-437) en pTR27. El plásmido pG4 (anteriormente denominado pG4m poliII; Webster et al., 1989) codifica el dominio GAL4 de unión a ADN (1-148) bajo el control del promotor temprano de SV40. El plásmido pGAL4.E2F-5 contiene la secuencia codificante de E2F-5 entre los residuos 198 y 335 fusionados corriente abajo de las secuencias GAL4 en pG4. Los plásmidos pCMVHRb, pCMVHRb\Delta22, pCMV107 y pCMV107AS han sido descritos anteriormente (Zamanian y La Thangue, 1992; 1993).

Cribado de bibliotecas. Se cotransformaron 40 \mug de ADN de biblioteca de pPC67 en CTY10-5d con 40 \mug de pLEX(HIS).DP-1. Se cribaron media el ensayo de \beta-galactosidasa en papel de filtro in situ aproximadamente 400.000 transformantes cultivados en placas de ágar selectivo. Para rescatar los plásmidos de la biblioteca, se aislaron y curaron colonias azules a partir de pLEX(HIS). DP-1 mediante cultivo hasta la saturación en medio líquido selectivo en presencia de histidina. Tras la siembra en placa de réplicas en ágar mínimo selectivo, se electroporaron en E. coli HW87 plásmido de ADN procedente de colonias Trp^{+}His^{-} que no proporcionaban color azul al someterlas a ensayo para \beta-galactosidasa. Los plásmidos se recuperaron y se transformaron nuevamente en CTY10-5d con pLEX(HIS). DP-1 o el plásmido de control (pLEX(HIS)). Se seleccionó para su análisis posterior un plásmido que proporcionaba un fenotipo Trp^{+} con un color azul de las colonias sólo en presencia de pLEX(HIS).DP-1. Para obtener un ADNc de longitud completa, se extrajo la inserción, se marcó radioactivamente y se utilizó para cribar aproximadamente 106 placas de la biblioteca \lambdaZapII F9EC, a partir de la que se aisló y se rescató en pBluescript un ADNc de longitud completa de E2F-5.

Transfección transitoria de células 3T3. Se llevaron a cabo transfecciones y ensayos mediante el procedimiento convencional de precipitación con fosfato de calcio tal como se ha descrito anteriormente (Zamanian y La Thangue, 1992).

Antisueros y análisis de retraso en gel. Se prepararon antisueros de conejo cultivados contra dos secuencias peptídicas diferentes derivadas de E2F-5, denominadas anti-E2F-5(1), anti-E2F-5(2) y se evaluaron para su efecto sobre la actividad de unión a ADN de DRTF1/E2F en extractos de células F9 EC tal como se ha descrito anteriormente (Girling et al., 1993). El sitio de unión de E2F se obtuvo del promotor del adenovirus E2a (La Thangue et al., 1990). Se añadió el homólogo (+) o un péptido (-) no relacionado al ensayo de unión a ADN para evaluar la especificidad tal como se ha descrito anteriormente (Girling et al., 1993). El antisuero anti-DP-1(24) se cultivo contra un péptido derivado de la secuencia C-terminal de DP-1. Se llevaron a cabo ensayos de unión a ADN con proteínas de fusión GST fueron tales como las descritas anteriormente (Bandara et al., 1993; 1994). Se expresaron GST-DP-1, -E2F-1 (Bandara et al., 1993) y -E2F-5 (residuos aminoácidos 2 a 335) y se purificaron de acuerdo con procedimientos convencionales.

Análisis northern. Se llevó a cabo un análisis northern de los niveles de ARN en ARN preparado a partir de las líneas celulares indicadas mediante procedimientos convencionales. La sonda E2F-5 contenía 840 nucleótidos que se extendían hacia el interior de la región 3' no traducida. La sonda E2F-1 contenía la secuencia codificante completa del gen generado mediante PCR y una sonda de GAPDH sirvió como control interno.

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Leyendas de las figuras Figura 1 Estructura de la E2F-5 huna

(A) Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos deducida del ADNc de E2F-5 humana.

(B) Representación esquemática de E2F-5 en comparación con E2F-1 y E2F-4. Los bordes de los dominios conservados se encuentran indicados por el número de aminoácido. SS en E2F-4 indica el motivo rico en serinas.

Figura 2 Patrón de expresión de E2F-5 en líneas celulares humanas

(A) La transferencia northern que contenía ARN citoplasmático total procedente de las líneas celulares humanas indicadas se hibridó con una sonda de ADNc de E2F-5 humana. Se utilizaron ARNs de las líneas celulares humanas siguientes: CAMA, carcinoma mamario humano; A549, carcinoma pulmonar; MDA, carcinoma mamario MDA-MD157; OVCAR, carcinoma ovárico; HS 578T, carcinoma mamario; LUCY, carcinoma ovárico; HT29, carcinoma de colon; CEM, leucemia de células T; K562, eritroleucemia. (B) El mismo filtro se hibridó con una sonda de \alpha-tubulina de rata.

Figura 3 E2F-5 presenta un dominio de trans-activación carboxilo-terminal

Se transfectaron células U-2 OS con un plásmido informador CAT que portaba sitios Gal4 corriente arriba (5 \mug) en presencia o en ausencia de vectores de expresión de Gal-4-E2F (1 \mug) y 0,2 \mug de pRSV-luciferasa como control interno. Se normalizó la actividad CAT respecto a la actividad luciferasa en cada muestra. Se sometió a ensayo la actividad CAT dos días después de la transfección. Se representa el incremento transcripcional de Gal4-E2F respecto al gen informador CAT. Los datos son representativos de por lo menos tres experimentos independientes realizados por duplicado.

Figura 4 E2F-5 y DP-1 cooperan en la transactivación

Se transfectaron células de osteosarcoma U2-OS con cantidades crecientes de vectores de expresión pJ3-E2F-5 (1, 2 ó 5 \mug) junto con 100 ng de pCMV-DP-1, tal como se indica. En cada transfección, se añadieron 2 \mug de constructo informador (E2F4-CAT) y 0,2 \mug de pRSV-luciferasa. Se normalizó la actividad CAT respecto a la actividad luciferasa en cada muestra. Los datos son representativos de por lo menos tres experimentos independientes realizados por duplicado.

Figura 5 Inhibición de la transactivación de E2F-5 por parte de proteínas de bolsillo

Las células U2-OS se transfectaron con 5 \mug de pJ3-E2F-5 y 100 ng de pCMV-DP-1 en combinación con pCMV-Rb (50 y 100 ng), pCMV-RbA22 (100 ng), pCMV-p107 (50 y 100 ng), pCMVp107DE (100 ng) o pCMV-HA-p130 (50, 100 y 500 ng). Junto con los plásmidos de expresión, las células se transfectaron con 2 \mug de E2F4-CAT y 0,2 \mug de pRSV-luciferasa. La actividad CAT se normalizó respecto al control interno luciferasa. Se calculó el incremento transcripcional respecto al nivel basal de E2F4-CAT, que se fijó en la unidad (1,0). Los datos son representativos de por lo menos tres experimentos independientes realizados por duplicado.

Figura 6 Complejos que contienen E2F en células U2-OS transfectadas transitoriamente

Se transfectaron transitoriamente células de osteosarcoma U2-OS con vectores de expresión de E2F-5 y DP-1 en presencia o en ausencia de vectores de expresión pRb, p107 o p130 tal como se indica. Tras dos días, se prepararon extractos celulares completos y se incubaron con un oligonucleótido marcado con [31P] que contenía un sitio de unión a ADN de consenso de E2F y se sometió a electroforesis en gel. Se indica la posición de la sonda libre, de complejo de ADN de E2F-5/DP1 y el complejo de E2F-5/proteína de bolsillo.

Figura 7 E2F-5 interacciona preferentemente con p130 in vivo

Se marcaron con [^{32}P]-ortofosfato células de carcinoma mamario humano CAMA y se sometieron lisados de detergente no iónico a inmunoprecipitación secuencial. En una primera inmunoprecipitación, se incubaron lisados con anticuerpo de pRb, de p107 o de p130 tal como se indica. El panel A muestra las primeras inmunoprecipitaciones con anticuerpos específicos para pRb-p107 y para p130 procedentes de células CAMA. Las proteínas asociadas a pRb, a p107 y a p130 se liberaron de las proteínas de bolsillo inmunoprecipitadas mediante ebullición en tampón que contenía SDS y se inmunoprecipitaron nuevamente con antisuero específico para E2F-5 (panel B). Como control, las proteínas liberadas de inmunoprecipitados de pRb y de p107 se inmunoprecipitaron nuevamente con anticuerpo anti-E2F-1 (KH20) o de E2F-4 (RK13) (panel C). Las proteínas inmunoprecipitadas se separaron en geles de SDS-poliacrilamida al 7,5%, los geles se secaron y las proteínas se detectaron mediante autorra-
diografía.

Figura 8 Estrategia para aislar E2F-5 murina

Se utilizó el "cebo" LEXA DP-1 para cribar una biblioteca de ADNc etiquetada con dominio de activación de embrión de ratón de día 14,5.

Figura 9 Secuencia y comparación de E2F-5 murina con otros miembros de la familia de E2F

(a) Secuencia de nucleótidos junto con la secuencia teórica de residuos aminoácidos de E2F-5.

(b) Representación diagramática y comparación de E2F-5 (parte intermedia) con E2F-1 (parte superior) y E2F-4 (parte inferior). Las identidades en porcentaje a nivel de secuencia de proteína se indican entre E2F-5 y E2F-1, y E2F-5 y E2F-4. Se indican los dominios compartidos entre los miembros de la familia de E2F (Lees et al., 1993).

(c) Comparación de la secuencia de residuos aminoácidos en los dominios conservados dentro de los miembros de la familia de E2F. Los residuos subrayados son comunes a todos los miembros de la familia, mientras que los residuos en cajas son comunes a E2F-4 y a E2F-5. Los residuos en negrita en la región de la cremallera de leucina indican los residuos hidrofóbicos en una repetición de héptada. Se indican con líneas los residuos en la región de caja DEF compartidos entre miembros de la familia E2F y DP-1.

Figura 10 Activación de transcripción sitio-dependiente de E2F por E2F-5 y DP-1 en levaduras

(a) Resumen de constructos de informador y de efector.

(b) Los vectores de expresión de E2F-5 y de DP-1 indicados se transformaron en levadura solos (carriles 2 y 3) o juntos (carril 4) y se evaluó la actividad de p4xWT CYC1, que porta cuatro sitios de E2F de tipo salvaje. En experimentos paralelos, la actividad de p4xMT CYC1 no resultó afectada en cualquiera de las condiciones. Los datos presentados se derivaron de lecturas por triplicado.

Figura 11 Activación transcripcional por E2F-5 en levaduras

(a) Resumen de constructos de informador y de efector.

(b) Se evaluó la actividad transcripcional de pLEX.E2F-1 (carril 2) y pLEX.E2F-5 (carril 3) en levaduras mediante el ensayo de la actividad de pLexA-CYC1-lacZ. Los datos presentados se derivaron de lecturas por triplicado.

Figura 12 Regulación por proteína de bolsillo de E2F-5

(a) Resumen de constructos de informador y de efector.

\newpage

(b) Se evaluó la actividad transcripcional de Gal-E2F-5 (carril 2) en presencia de pRb de tipo salvaje (carril 3), pRb\Delta22 (carril 4), p107 (carril 5) y p107AS (carril 6). Para la comparación, se llevaron a cabo tratamientos similares con pG4 (carriles 7 a 10). Los datos presentados se derivaron de lecturas por triplicado.

Figura 13 E2F-5 es un componente fisiológico de unión a ADN de DRTF1/E2F en células F9 EC

Dos tipos de antisueros cultivados contra péptidos diferentes de regiones diferentes dentro de E2F-5 se evaluaron para su efecto sobre la actividad de unión a ADN de DRTF1/E2F de células F9 EC. Los sueros anti-E2F-5, antipéptido 1 (carriles 5 a 8) y antipéptido 2 (carriles 9 a 12) se evaluaron en presencia del péptido homólogo (+; carriles 5, 7, 9 y 11) o un péptido no relacionado (-; carriles 6, 8, 10 y 12). A título de comparación, se evaluó el efecto de anti-DP-1 (24) (carriles 1 a 4) en presencia del péptido homólogo (carriles 1 a 3) o de un péptido no relacionado (carriles 2 y 4). Cada par de carriles (+ junto con -) representa el tratamiento con una preparación diferente de antisuero. Se indican los complejos de unión a ADN DRTF1/E2F b/c (La Thangue et al., 1990).

Figura 14 Propiedades de unión a ADN de E2F-5

Se expresaron E2F-5, E2F-1 y DP-1 como proteínas de fusión GST, se purificaron y se sometió a ensayo su actividad de unión a ADN mediante retraso en gel. Se sometieron a ensayo E2F-1 o E2F-5 solos (carriles 1 y 2, y 5, 6 y 7, respectivamente) o junto con una concentración constante de DP-1 (carriles 3 y 4, y 8, 9 y 10). El carril 11 muestra la sonda sola. La cantidad de proteínas añadida para E2F-1 fue de aproximadamente 50 ng (carriles 1 y 3) o de 100 ng (carriles 2 y 4), para E2F-5, de 25 ng (carriles 5 y 8), de 50 ng (carriles 6 y 9) o de 100 ng (carriles 7 y 10) y para DP-1, de 50 ng en todos los carriles.

Figura 15 Niveles de ARN de E2F-5

Se compararon los niveles de ARN de E2F-5 con los de E2F-1 en las líneas celulares indicadas. Se evaluó el nivel de ARN de GAPDH como control interno.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: THE MEDICAL RESEARCH COUNCIL

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 20 PARK CRESCENT

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: LONDRES

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: REINO UNIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): W1N 4AL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: VERENIGING HET NEDERLANDS KANKER INSTITUUT

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: PLESMANLAAN 121

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: AMSTERDAM

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PAÍS: PAÍSES BAJOS

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1066 CX

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: LA THANGUE, NICHOLAS BARRIE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: LABORATORY OF EUKARYOTIC MOLECULAR GENETICS, MRC NATIONAL INSTITUTE OF MEDICAL RESEARCH, THE RIDGEWAY, MILL HILL

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: LONDRES

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: REINO UNIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): NW7 1AA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: BERNARDS, RENE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: DIVISION OF MOLECULAR CARCINOGENESIS, THE NETHERLANDS CANCER INSTITUTE, PLESMANLAAN 121

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: AMSTERDAM

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: PAÍSES BAJOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1066 CX

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: HIJMANS, ELEONORE MARIELLE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: DIVISION OF MOLECULAR CARCINOGENESIS, THE NETHERLANDS CANCER INSTITUTE, PLESMANLAAN 121

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: AMSTERDAM

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: PAÍSES BAJOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1066 VCX

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN E2F-5

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30 (EP0)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.748 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 31..1068

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 346 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:

3

\hskip2,7cm

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.340 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 16..1020

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:

5

6

\hskip2,3cm

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 335 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 74 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 74 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 74 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 69 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 75 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 74 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Thr Gln Asp Leu Arg Gln Leu Gln Glu Ser Glu Gln Gln Leu Asp}

\sac{His Leu Met Asn Ile Cys Thr Thr Gln Leu Arg Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Gln Glu Leu Lys Glu Leu Met Asn Thr Glu Gln Ala Leu Asp}

\sac{Gln Leu Ile Gln Ser Cys Ser Leu Ser Phe Lys His Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Lys Glu Val Thr Glu Leu Ser Gln Glu Glu Lys Lys Leu Asp}

\sac{Glu Leu Ile Gln Ser Cys Thr Leu Asp Leu Lys Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Lys Ala Glu Ile Glu Glu Leu Gln Gln Arg Glu Gln Glu Leu Asp}

\sac{Gln His Lys Val Trp Val Gln Gln Ser Ile Arg Asn Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Lys Ala Glu Ile Glu Asp Leu Glu Leu Lys Glu Arg Glu Leu Asp}

\sac{Gln Gln Lys Leu Trp Leu Gln Gln Ser Ile Lys Asn Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Phe Gln Ile Ser Leu Lys Ser Lys Gln Gly Pro Ile Asp Val Phe}

\sac{Leu Cys Pro Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Gln Ile Tyr Leu Lys Ser Thr Gln Gly Pro Ile Glu Val Tyr}

\sac{Leu Cys Pro Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Gln Ile His Leu Ala Ser Ile Gln Gly Pro Ile Glu Val Tyr}

\sac{Leu Cys Pro Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Try Gln Ile His Leu Lys Ser Val Ser Gly Pro Ile Glu Val Leu}

\sac{Leu Val Asn Lys Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Tyr Gln Ile Asn Leu Lys Ser His Ser Gly Pro Ile His Val Leu}

\sac{Leu Ile Asn Lys Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Asp Tyr His Phe Gly Leu Glu Glu Gly Glu Gly Ile Arg Asp}

\sac{Leu Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Asp Asp Tyr Leu Trp Gly Leu Glu Ala Gly Glu Gly Ile Ser Asp}

\sac{Leu Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Glu Asp Tyr Leu Leu Ser Leu Gly Glu Glu Glu Gly Ile Ser Asp}

\sac{Leu Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 24:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp His Asp Tyr Ile Tyr Asn Leu Asp Glu Ser Glu Gly Val Cys Asp}

\sac{Leu Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Asp Tyr Asn Phe Asn Leu Asp Asp Asn Glu Gly Val Cys Asp Leu}

\sac{Phe Asp}

Claims (22)

1. Polipéptido, que comprende:

(a) la proteína de la figura 1A o 9A;

(b) una proteína con por lo menos el 90% de identidad de aminoácidos con (a) que puede funcionar como factor transcripcional de mamífero;

(c) un fragmento de la proteína de la figura 1A o 9A de por lo menos 30 aminoácidos capaz de formar un complejo con una proteína DP, p107 y/o p130.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que porta un marcaje revelador o detectable.

3. Polipéptido según la reivindicación 1 ó 2 fijo a una fase sólida.

4. Composición que comprende un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2 junto con un portador o un diluyente.

5. Polinucleótido, que comprende:

(a)

una secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1A o 9A;

(b)

una secuencia complementaria a (a); o

(c)

una secuencia codificante de un polipéptido según se define en la reivindicación 1.

6. Polinucleótido según la reivindicación 5 que es un polinucleótido de ADN.

7. Polinucleótido de doble cadena que comprende un polinucleótido según la reivindicación 5 ó 6 y su secuencia complementaria.

8. Polinucleótido que consiste de un fragmento de por lo menos 25 nucleótidos de longitud de los polinucleótidos que presentan la secuencia mostrada en la figura 1A o 9A.

9. Polinucleótido según la reivindicación 5 ó 6 que porta un marcaje revelador o detectable.

10. Vector que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 ó 9.

11. Vector según la reivindicación 10, que es un vector replicable recombinante que comprende una secuencia codificante que codifica un polipéptido según se define en la reivindicación 1.

12. Célula huésped que comprende un vector según la reivindicación 10.

13. Célula huésped según la reivindicación 12 transformada o transfectada con un vector recombinante según la reivindicación 11.

14. Célula huésped transformada con un vector recombinante según la reivindicación 10, en la que la secuencia codificante se encuentra operablemente ligada a una secuencia de control capaz de permitir la expresión de la secuencia codificante por parte de la célula huésped.

15. Procedimiento para preparar un polipéptido según se define en la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 bajo condiciones que permiten la expresión del vector recombinante de la secuencia codificante, y recuperar el polipéptido expresado.

16. Ensayo de cribado para identificar agentes quimioterapéuticos putativos para el tratamiento de una enfermedad proliferativa o vírica, que comprende:

(A) poner en contacto:

(i)

un polipéptido DP;

(ii)

un polipéptido según se define en la reivindicación 1; y

(iii)

un agente quimioterapéutico putativo;

bajo condiciones en las que los componentes (i) e (ii) en la ausencia de (iii) forman un complejo; y

(B) medir el grado con el que el componente (iii) es capaz de alterar, interferir o inhibir la actividad del complejo.

17. Ensayo según la reivindicación 16, en el que el complejo de (i) e (ii) se mide por su capacidad de unirse a un sitio de unión a ADN de E2F in vitro.

18. Ensayo según la reivindicación 16, en el que el complejo de (i) e (ii) se mide por su capacidad de activar in vivo un promotor que comprende un sitio de unión de E2F ligado a un gen informador.

19. Ensayo según la reivindicación 18, en el que el ensayo se lleva a cabo en una célula de levadura, célula de insecto o célula de mamífero.

20. Ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que el agente quimioterapéutico putativo es un fragmento de 10 o más aminoácidos de un polipéptido según se define en las partes (a) a (c) de la reivindicación 1.

21. Polipéptido según la reivindicación 1, un vector según se define en la reivindicación 10 ú 11 o una célula huésped según se define en la reivindicación 12, 13 ó 14 para la utilización en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal.

22. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido según se define en la reivindicación 1, un vector según se define en la reivindicación 10 ú 11, o una célula huésped según se define en la reivindicación 12, 13 ó 14 y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.