PT809695E - Factor de transcrição - e2f - 5 - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Factor de Transcrição - E2F-5" O presente invento refere-se a um novo factor de transcrição e à sua produção e utilizações.

Os acontecimentos moleculares que ocorrem durante o ciclo celular necessitam de ser integrados com o aparelho de transcrição de modo a que a expressão génica possa ser sincronizada com a progressão do ciclo celular.

Recentemente, foi identificado um factor de transcrição designado E2F ou (DRTFl) e mostrou-se que se ligava a pRb, o produto proteico do gene de susceptibilidade a retinoblastoma, um anti-oncogene ou gene supressor tumoral (ver por exemplo, Wagner e Green, Nature 352: 189-190, 1991). Crê-se amplamente que o factor de transcrição celular E2F funciona como um componente chave no controlo do ciclo celular porque se associa a importantes proteínas reguladoras do ciclo celular, tais como o produto do gene de retinoblastoma (pRb), pl07, ciclinas e quinases dependentes de ciclinas, e para além disso a sua actividade transcricional é modulada por certas oncoproteinas virais, tais como a proteína Ela adenoviral, o antigénio T grande de SV40 e E7 do virus do papiloma humano.

Crê-se que o factor de transcrição E2F (ou DRTFl) tem um papel importante na integração dos acontecimentos do ciclo celular com o aparelho de transcrição porque, durante a progressão do ciclo celular em células de mamífero, sofre uma série de interacções periódicas com moléculas que se sabe serem importantes reguladores da proliferação celular. Por exemplo, o produto do gene supressor de tumores de retinoblastoma (pRb), que regula negativamente a progressão da fase G1 para a S e que está frequentemente modificado em células tumorais, liga-se a E2F. De modo semelhante, a proteína pl07 relacionada com pRb ocorre predominantemente num complexo da fase S com E2F. Tanto pRb como pl07 reprimem a actividade transcricional de E2F, que é provavelmente fundamentalmente importante para a regulação da proliferação celular porque ocorrem locais de ligação a E2F nas regiões de controlo de uma variedade de genes que estão envolvidos na 2 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ proliferação, tais como c-myc e p34cdc2. Para além disso, proteínas Rb mutantes, codificadas por alelos isolados de células tumorais, não se conseguem ligar a E2F e são deste modo incapazes de interferir com a activação da transcrição por E2F dependente do local. Outra característica importante de E2F é que certas oncoproteínas virais, tais como a proteína Ela adenoviral, o antigénio T grande de SV40 e E7 do vírus do papiloma humano, modulam a sua actividade sequestrando pRb e pl07 do factor de transcrição inactivo. Este efeito requer regiões nestas proteínas virais que são necessárias para transformação de células em cultura de tecidos e para deste modo superar o controlo do crescimento. Assim, a capacidade destas oncoproteínas para regularem E2F pode ser o meio pelo qual elas ultrapassam os mecanismos normais de controlo do crescimento celular e, reciprocamente, a repressão da transcrição por pRb pode ser a base do controlo negativo do crescimento mediado por pRb.

Um potencial mecanismo para a integração das propriedades que regulam a transcrição de pRb e pl07 com outros acontecimentos do ciclo celular foi sugerido pela identificação da ciclina A e da quinase dependente de ciclina relacionada com cdc2, p33cdk2, no complexo de E2F. A ciclina A é necessária para a progressão através da fase S, uma função que podia talvez ser mediada através da sua capacidade para recrutar a quinase dependente de ciclina p33cdk2 para E2F. Tomados em conjunto estes dados sugerem que E2F é um factor de transcrição cujo principal papel pode ser o de transpor os acontecimentos do ciclo celular para o aparelho de transcrição através de moléculas tais como pRb, pl07, ciclinas e cdks, assegurando assim que a expressão génica é sincronizada e integrada com a progressão do ciclo celular.

Mais recentemente, um factor de transcrição com as propriedades de E2F foi clonado e sequenciado (Helin et al., Cell 70: 337-350, 1992 e Kaelin et al., Cell 70: 351-364, 1992) .

Encontrámos agora surpreendentemente mais duas novas proteínas que parecem ser novos membros da família de genes E2F, que designámos E2F-5. A sequência de ADNc da E2F-5 humana é apresentada na Figura IA, tal como a sequência de 3 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ aminoácidos desta proteína. As sequências correspondentes para E2F-5 de murídeo surgem na Figura 9A. Estas novas proteínas são referidas como E2F-5 e esta nomenclatura será utilizada neste fascículo.

Verificou-se que E2F-5 é um de uma família de componentes de factores de transcrição relacionados. Crê-se que os membros desta família interajam com proteínas DP para formar uma série de factores de transcrição. As proteínas (ou polipéptidos) DP incluem DP-1, DP-2 e DP-3 embora a primeira destas esteja habitualmente contemplada de preferência relativamente às outras. O presente invento num primeiro aspecto proporciona uma proteína tal como mostrada na Figura IA ou 9A, homólogos desta e fragmentos da sequência e seus homólogos, que podem funcionar como um factor de transcrição de mamífero. Em particular, o presente invento proporciona um polipéptido (de preferência na forma substancialmente isolada) compreendendo: (a) a proteína da Figura IA ou 9A; (b) uma proteína possuindo pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com (a) que pode funcionar como um factor de transcrição de mamífero; (c) um fragmento da proteína da Figura IA ou 9A de pelo menos 30 aminoácidos capaz de formar um complexo com uma proteína DP, pl07 e/ou pl30.

Todos os polipéptidos dentro desta definição são referidos abaixo como polipéptido(s) de acordo com o presente invento.

As proteínas pRb, pl07, DP e pl30 são aqui referidas como proteínas complexantes ou "complexadores" uma vez que podem formar um complexo com as proteínas do presente invento. Sob certas condições E2F-5 apenas se pode ligar fracamente a pRb.

Um polipéptido do presente invento estará na forma substancialmente isolada se estiver numa forma na qual esteja livre de outros polipéptidos com os quais possa estar associado no seu ambiente natural (p. ex., no corpo).

Entender-se-á que o polipéptido pode ser misturado com 4 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ transportadores ou diluentes que não interfiram com o fim pretendido do polipéptido e no entanto ser ainda considerado como substancialmente isolado. O polipéptido do presente invento pode também estar numa forma substancialmente purificada, caso em que compreenderá geralmente o polipéptido numa preparação na qual mais de 90%, p. ex. 95%, 98% ou 99% do polipéptido na preparação é um polipéptido do presente invento.

Os polipéptidos mutantes possuirão uma ou mais mutações que são adições, deleções ou substituições de resíduos de aminoácidos. De preferência, as mutações não afectarão, ou substancialmente afectarão, a estrutura e/ou função e/ou as propriedades do polipéptido. Assim, os mutantes possuirão adequadamente a capacidade de se complexarem com proteínas DP pRb, pl07 e/ou pl30. Os mutantes podem ser de ocorrência natural (isto é, purificados ou isolados a partir de uma fonte natural) ou sintéticos (por exemplo, através da realização de metagénese dirigida ao local no ADN de codificação). Será assim aparente que os polipéptidos do presente invento podem ser de ocorrência natural ou recombinantes (isto é, preparados utilizando técnicas de engenharia genética).

Uma variante alélica será uma variante que ocorrerá naturalmente num humano ou num animal, p. ex. murídeo, e que funcionará para regular a expressão génica de um modo substancialmente semelhante ao da proteína da Figura IA ou 9A.

Semelhantemente, um homólogo específico da proteína será uma proteína equivalente que ocorra naturalmente noutra espécie e que efectue a função equivalente nessa espécie à da proteína da Figura IA ou 9A. Dentro de cada espécie, pode existir um homólogo como várias variantes alélicas e estas serão todas consideradas homólogas da proteína. As variantes alélicas e os homólogos específicos podem ser obtidos através dos procedimentos aqui descritos para a produção da proteína da Figura IA ou 9A e efectuando tais procedimentos numa fonte celular adequada, p. ex. de humano ou roedor, possuindo uma variante alélica ou outra espécie. Uma vez que a proteína pode ser evolutivamente conservada será também possível utilizar um polinucleótido do presente invento para sondar bibliotecas 5 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ feitas a partir de células humanas, de roedor ou outras para obter clones codificando as variantes alélicas ou especificas. Os clones podem ser manipulados através de técnicas convencionais para identificar um polipéptido do presente invento que possa então ser produzido através de técnicas recombinantes ou sintéticas conhecidas per se. Homólogos específicos preferidos incluem homólogos de espécies de mamíferos ou anfíbios.

Uma proteína pelo menos 70% homóloga à da Figura IA ou 9A está incluída no presente invento, tal como o estão proteínas pelo menos 80 ou 90% e de preferência pelo menos 95% homólogas à proteína mostrada nestas Figuras. Isto será geralmente ao longo de uma região de pelo menos 20, de preferência pelo menos 30, por exemplo pelo menos 40, 60 ou 100 ou mais aminoácidos contíguos. Os métodos de medição da homologia proteica são bem conhecidos na arte e será entendido pelos peritos na arte que no presente contexto a homologia é habitualmente calculada com base na identidade dos aminoácidos (por vezes referida como "homologia dura").

Geralmente, os fragmentos do polipéptido na Figura IA ou 9A ou das suas variantes alélicas ou homólogos específicos destes capazes de formar um complexo com os complexadores terão pelo menos 10, de preferência pelo menos 15, por exemplo pelo menos 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 aminoácidos de comprimento.

Será possível determinar se os fragmentos formam um complexo com o complexo de proteínas proporcionando a proteína complexadora e o fragmento sob condições nas quais normalmente formam um factor de transcrição de activação em trans e determinando se se formou ou não um complexo. A determinação pode ser feita, por exemplo, através da medição da capacidade do complexo para se ligar ao local de ligação de E2F in vitro, ou alternativamente através da determinação do peso molecular do complexo putativo através de métodos tais como SDS-PAGE.

Fragmentos preferidos incluem os que são capazes de formar um complexo de activação em trans com DP-1 ou outros complexadores. Os exemplos aqui descrevem vários métodos para analisar a função da proteína e estes podem ser adaptados para 6 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ avaliar se um polipéptido é ou não capaz de formar um complexo de activação em trans com a proteína DP-1. Por exemplo, o polipéptido pode ser adicionado ao complexador na presença de uma construção de um gene repórter adaptada a ser activada pelo complexo DP-1/E2F-5 (por exemplo, ver Figura 10 de WO-A-94/10307 em nome do Medicai Research Council) . Uma tal experiência pode determinar se o fragmento peptídico possui a actividade necessária.

Um polipéptido do presente invento pode ser marcado com um marcador de revelação ou detectável. O marcador (de revelação) pode ser qualquer marcador adequado que permita que o polipéptido seja detectado. Marcadores adequados incluem radioisótopos, p. ex. 125I, enzimas, anticorpos e ligantes tais como biotina. Os polipéptidos marcados do presente invento podem ser utilizados em procedimentos de diagnóstico tais como imunoensaios para determinar a quantidade de proteína E2F-5 numa amostra.

Um polipéptido ou polipéptido marcado de acordo com o presente invento pode também ser fixado a um suporte sólido, por exemplo a parede de uma placa de imunoensaio.

Um segundo aspecto do presente invento refere-se a um polinucleótido que compreende: (a) uma sequência de nucleótidos mostrada na Figura IA ou 9A; (b) uma sequência complementar a (a); ou (c) uma sequência codificando um polipéptido tal como definido na reivindicação 1.

Para além disso, o presente invento proporciona um polinucleótido consistindo num fragmento de pelo menos 25 nucleótidos de comprimento dos polinucleótidos possuindo a sequência mostrada na Figura IA ou 9A. Os polinucleótidos do presente invento incluem uma sequência de ADN da Figura IA ou 9A e fragmentos destas capazes de hibridar selectivamente com a sequência da Figura IA ou 9A. Outra concretização do presente invento proporciona um ADN codificando para a proteína da Figura IA ou 9A ou um fragmento desta. 7 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ Ο polinucleótido pode também compreender ARN. Pode também ser um polinucleótido que inclua dentro de si nucleótidos sintéticos ou modificados. Vários tipos diferentes de modificações de oligonucleótidos são conhecidos na arte. Estes incluem estruturas de metilfosfonato e fosforotionato, adição de cadeias de acridina ou polilisina nas extremidades 3' e/ou 5' da molécula. Para fins do presente invento, entenda-se que os oligonucleótidos aqui descritos podem ser modificados através de qualquer método disponível na arte. Tais modificações podem ser realizadas para aumentar a actividade in vivo ou a vida dos oligonucleótidos do presente invento utilizados em métodos de terapia.

Um polinucleótido capaz de hibridar selectivamente com o ADN da Figura IA ou 9A será geralmente pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80 ou 90% e optimamente pelo menos 95% homólogo ao ADN da Figura IA ou 9A ao longo de uma região de pelo menos 20, de preferência pelo menos 30, por exemplo pelo menos 40, 60 ou 100 ou mais nucleótidos contíguos. Estes polinucleótidos estão dentro do presente invento.

Um polinucleótido do presente invento estará na forma substancialmente isolada se estiver numa forma na qual está livre de outros polinucleótidos com os quais pode estar associado no seu ambiente natural (habitualmente no corpo). Entender-se-á que o polinucleótido pode ser misturado com transportadores ou diluentes que não interfiram com o fim pretendido do polipéptido e no entanto ser ainda considerado como substancialmente isolado.

Um polinucleótido de acordo com o presente invento pode ser utilizado para produzir um iniciador, p. ex. um iniciador de PCR, uma sonda, p. ex. marcada com um marcador de revelação ou detectável através de meios convencionais utilizando marcadores radioactivos ou não radioactivos, ou o polinucleótido pode ser clonado num vector. Tais iniciadores, sondas e outros fragmentos do ADN da Figura IA ou 9A terão pelo menos, de preferência pelo menos 20, por exemplo pelo menos 25, 30 ou 40 nucleótidos de comprimento, e estão também englobados dentro do presente invento. 8 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Os polinucleótidos, tais como um polinucleótido de ADN de acordo com o presente invento, podem ser produzidos de forma recombinante, sinteticamente ou através de qualquer meio disponível aos peritos na arte. Pode também ser clonado através de referência às técnicas aqui divulgadas. O presente invento inclui um polinucleótido de cadeia dupla compreendendo um polinucleótido de acordo com o presente invento e o seu complemento.

Um terceiro aspecto do presente invento refere-se a um vector (p. ex. de expressão) adequado para a replicação e expressão de um polinucleótido, em particular um polinucleótido de ADN ou ARN, de acordo com o presente invento. Os vectores podem ser, por exemplo, vectores plasmídicos, virais ou fágicos proporcionados com uma origem de replicação, opcionalmente um promotor para a expressão do polinucleótido e opcionalmente um regulador do promotor. O vector pode conter um ou mais genes marcadores seleccionáveis, por exemplo um gene de resistência à ampicilina no caso de um plasmídeo bacteriano ou um gene de resistência à neomicina para um vector de mamífero. O vector pode ser utilizado in vitro, por exemplo para a produção de ARN ou utilizado para transfectar ou transformar uma célula hospedeira. O vector pode também ser adaptado a ser utilizado in vivo, por exemplo num método de terapia génica.

Os vectores do terceiro aspecto são de preferência vectores replicáveis recombinantes. 0 vector pode assim ser utilizado para replicar o ADN. De preferência, o ADN no vector está operativamente ligado a uma sequência de controlo que é capaz de proporcionar a expressão da sequência de codificação por uma célula hospedeira. O termo "operativamente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão numa relação que lhes permite funcionar do modo pretendido. Uma sequência de controlo "operativamente ligada" a uma sequência de codificação está ligada de tal forma que a expressão da sequência de codificação é alcançada sob uma condição compatível com as sequências de controlo. Tais vectores podem ser transformados ou transfectados numa célula hospedeira adequada para proporcionar a expressão de um polipéptido do presente invento. 9 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Um quarto aspecto do presente invento refere-se assim a células hospedeiras transformadas ou transfectadas com os vectores do terceiro aspecto. Isto pode permitir a replicação e expressão de um polinucleótido de acordo com o presente invento, incluindo a sequência de Figura IA ou 9A ou o enquadramento de leitura aberto desta. As células serão escolhidas para serem compatíveis com o vector e podem por exemplo ser bacterianas, de levedura, de insecto ou de mamifero.

Um polinucleótido de acordo com o presente invento pode também ser inserido nos vectores descritos acima numa orientação anti-sentido para proporcionar a produção de ARN anti-sentido. O ARN anti-sentido ou outros polinucleótidos anti-sentido podem também ser produzidos através de meios sintéticos. Tais polinucleótidos anti-sentido podem ser utilizados num método de controlo dos níveis da proteína E2F-5 numa célula. Um tal método pode incluir a introdução na célula do polinucleótido anti-sentido numa quantidade eficaz para inibir ou reduzir o nível de tradução do ARNm de E2F-5 em proteína. A célula pode ser uma célula que esteja em proliferação de um modo descontrolado tal como uma célula tumoral.

Assim, num quinto aspecto o presente invento proporciona um processo para preparação de um polipéptido de acordo com o presente invento que compreende a cultura de uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vector (de expressão) do terceiro aspecto sob condições que proporcionem a expressão (pelo vector) de uma sequência de codificação codificando o polipéptido, e a recuperação do polipéptido expresso. São também descritos anticorpos (monoclonais ou policlonais) específicos para um polipéptido de acordo com o presente invento. Os anticorpos do presente invento incluem fragmentos destes bem como mutantes que mantenham a actividade de ligação do anticorpo. É também descrito um processo para a produção de anticorpos monoclonais ou policlonais para um polipéptido do presente invento. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados através de tecnologia de hibridoma convencional utilizando as proteínas ou fragmentos peptídicos 10 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ destas como imunogénios. Os anticorpos policlonais podem também ser preparados através de meios convencionais que compreendem a inoculação de um animal hospedeiro, por exemplo um rato ou um coelho, com um polipéptido do presente invento e a recuperação do soro imune.

Os fragmentos de anticorpos monoclonais que podem manter a sua actividade de ligação ao antigénio, tais como fragmentos Fv, F(ab') e F(ab2)' estão incluídos neste aspecto do presente invento. Adicionalmente, os anticorpos monoclonais de acordo com o presente invento podem ser analisados (p. ex. através de análise da sequência de ADN dos genes que expressam tais anticorpos) e pode ser feito um anticorpo humanizado com regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo de acordo com o presente invento, por exemplo de acordo com os métodos divulgados na EP-A-0239400 (Winter).

Os polipéptidos do presente invento podem estar presentes em composições juntamente com um transportador ou diluente. Estas composições incluem composições farmacêuticas onde o transportador ou diluente será farmaceuticamente aceitável.

Transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles utilizados em formulações adequadas para administração oral, rectal, nasal, tópica (incluindo bucal ou sublingual), vaginal ou parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e epidural). As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagens unitárias e podem ser preparadas através de qualquer um dos métodos bem conhecidos na arte farmacêutica. Tais métodos incluem o passo de colocar o ingrediente activo em associação com o transportador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral as formulações são preparadas colocando uniformemente e infimamente em associação o ingrediente activo com transportadores líquidos ou transportadores sólidos finamente divididos ou ambos, e depois, se necessário, moldando o produto.

Por exemplo, formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções de injecção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, 11 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes, e lipossomas ou outros sistemas microparticulados que sejam desenhados para direccionar o polipéptido para componentes do sangue ou um ou mais órgãos.

Os polipéptidos de acordo com o presente invento e as composições acima mencionadas podem ser utilizados para o tratamento, regulação ou diagnóstico de condições, incluindo doenças proliferativas, num mamífero incluindo o homem. Tais condições incluem as associadas a expressão anormal (p. ex. a um nível invulgarmente elevado ou baixo) e/ou aberrante (p. ex. devido a uma mutação na sequência do gene) de um ou mais factores de transcrição tais como as proteínas DP ou E2F ou membros da família aparentados. As condições incluem também as que são causadas pela expressão anormal de um gene cujo produto génico seja regulado pela proteína da Figura IA ou 9A. O tratamento ou a regulação de condições com os péptidos, anticorpos, fragmentos destes e composições, etc. acima mencionados envolverão habitualmente a administração a um receptor necessitado de tal tratamento de uma quantidade eficaz de um polipéptido, anticorpo, fragmento deste ou composição, conforme apropriado. São também descritos anticorpos e fragmentos destes direccionados para esta região para inibir a activação de factores de transcrição através da ruptura da formação do complexo E2F-5-proteína DP. É também descrito um método de realização de um imunoensaio para detecção da presença ou ausência de um polipéptido do presente invento numa amostra, compreendendo o método: (a) proporcionar um anticorpo de acordo com o presente invento; (b) incubar a amostra com o anticorpo sob condições que permitam a formação de um complexo anticorpo-antigénio; e (c) detecção, se presente, do complexo anticorpo-antigénio. 12 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Noutro aspecto, ο presente invento proporciona um novo ensaio para identificação de agentes quimioterapêuticos putativos para o tratamento de doença proliferativa ou virai que compreende o colocar em contacto uma proteina DP ou um derivado desta, um polipéptido do presente invento e um agente quimioterapêutico putativo, e medir o grau de inibição da formação do complexo proteico DP/E2F-5 causada pelo agente. Pode não ser necessário utilizar a proteina DP-1 e/ou E2F-5 completa no ensaio, desde que seja proporcionada uma parte suficiente desta para que sob as condições do ensaio na ausência de agente, estas formem um heterodimero. A clonagem e sequenciação de DP-1 (e E2F 1, 2 e 3) são conhecidas na arte e os métodos para a expressão recombinante e preparação de anticorpos para DP-1 podem ser encontrados em WO-A-94/10307.

Assim, o presente invento proporciona um método de pesquisa para identificação de agentes quimioterapêuticos putativos para o tratamento de doença proliferativa que compreende: (A) colocar em contacto: (i) um polipéptido DP; (ii) um polipéptido do primeiro aspecto; e (iii) um agente quimioterapêutico putativo; sob condições nas quais os componentes (i) e (ii) na ausência de (iii) formam um complexo; e (B) medir o grau ao qual o componente (iii) é capaz de destruir o referido complexo.

No ensaio, qualquer um ou mais dos três componentes pode ser marcado, p. ex. com um marcador radioactivo ou colorimétrico, para permitir a medição do resultado do ensaio. Os agentes quimioterapêuticos putativos incluem os péptidos do presente invento.

Variantes, homólogos e fragmentos de proteínas DP são definidos de um modo correspondente ao das variantes, homólogos e fragmentos da proteina E2F-5. 13 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ Ο complexo de (i) e (ii) pode ser medido, por exemplo, através da sua capacidade para se ligar a um local de ligação ao ADN de E2F in vitro. Alternativamente, o ensaio pode ser um ensaio in vivo no qual é medida a capacidade do complexo para activar um promotor compreendendo um local de ligação a E2F ligado a um gene repórter. O ensaio in vivo pode ser efectuado por exemplo através de referência aos exemplos que mostram um tal ensaio em células de levedura, insecto, anfíbio ou de mamífero.

Os agentes terapêuticos candidatos que podem ser medidos através do ensaio incluem não somente polipéptidos do primeiro aspecto como em particular fragmentos de 10 ou mais aminoácidos de: (a) a proteína da Figura IA ou 9A; (b) uma variante alélica ou um homólogo específico desta; ou (c) uma proteína pelo menos 70% homóloga a (a).

Os vectores possuindo um polipéptido de acordo com o presente invento ou um ácido nucleico codificando um polipéptido de acordo com o presente invento podem ser utilizados num método de terapia génica. Tal terapia génica pode ser utilizada para tratar a proliferação descontrolada de células, por exemplo, uma célula tumoral. Os métodos de terapia génica incluem a distribuição a uma célula num paciente necessitado de tratamento de uma quantidade eficaz de um vector capaz de expressar na célula um polinucleótido anti-sentido do presente invento para inibir ou reduzir a tradução do ARNm de E2F-5 na proteína E2F-5 ou um polipéptido que interfira com a ligação de E2F-5 a uma proteína DP ou a um membro da família aparentado. O vector é adequadamente um vector virai. O vector virai pode ser qualquer vector adequado disponível na arte para atingir células tumorais. Por exemplo, Huber et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 8039, 1991) relatam a utilização de retrovírus anfotróficos para a transformação de células de hepatoma, mama, cólon ou pele. Culver et al. {Science 256: 1550-1552, 1992) também descrevem a utilização de vectores retrovirais em terapia com prodrogas enzimáticas dirigidas por vírus, tal como Ram et al. (Câncer Research 53: 83-88, 1993). 14 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Englehardt et al. (Nature Genetics 4: 27-34, 1993) descrevem a utilização de vectores baseados em adenovirus na distribuição do produto de condutância transmembranar da fibrose quistica (CFTR) às células. O presente invento contempla vários ensaios. Amplamente, estes podem ser classificados como se segue. 1. Condução de um ensaio para encontrar um inibidor da activação em trans de E2F-5 (isto é, inibição da activação da transcrição). Este inibidor pode portanto inibir a ligação de E2F-5 ao ADN (habitualmente ao local de ligação de E2F). Inibidores potencialmente adequados são proteínas e podem ter o mesmo efeito ou um semelhante ao de pl07. Assim, as moléculas inibidoras adequadas podem compreender fragmentos, mutantes, variante alélicas ou homólogos específicos de pl07 do mesmo modo que definido para as proteínas do primeiro aspecto. 2. Ensaio de inibidores de (hetero)dimerização. Tais inibidores podem impedir a dimerização de E2F-5 (ou de um polipéptido do primeiro aspecto) com um complexador, por exemplo uma proteína DP, tal como DP-1. Claro que o inibidor pode ser um fragmento, mutante, variante alélica ou homólogo especifico de uma proteína DP de um modo semelhante ao definido para as proteínas do primeiro aspecto. 3. Uma terceira categoria de ensaio é encontrar inibidores de fosforilação. Pensa-se que E2F-5 (e outras proteínas do primeiro aspecto) podem ser activadas através de fosforilação. Portanto, é provável que um inibidor de fosforilação iniba as propriedades de activação em trans de E2F-5 (e possa portanto ter finalmente o mesmo efeito que os inibidores verificados num dos dois ensaios anteriores). A fosforilação é através de cdks e assim um inibidor desta fosforilação é um que esteja contemplado por tais ensaios. O presente invento contempla várias utilizações terapêuticas. Por exemplo, terapia génica utilizando um ácido nucleico com uma sequência que seja anti-sentido à de E2F-5. 15 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Moléculas que se possam ligar a uma proteína DP-1 e assim formar um complexo inactivo com a proteína DP estão adicionalmente contempladas. Moléculas adequadas incluem as do primeiro aspecto para além da própria E2F-5. Tais moléculas podem ser mutantes de E2F-5 e são frequentemente referidas na arte como moléculas negativas dominantes. O presente invento contempla o tratamento ou a profilaxia de doenças que se baseiem na proliferação descontrolada de células ou onde a proliferação descontrolada seja um aspecto patológico importante ou essencial da doença. Estas incluem cancro, doença virai, a própria auto-proliferação bem como doenças auto-imunes tais como psoríase. Pode-se também desejar inibir temporariamente o crescimento de células em divisão, por exemplo células estaminais hematopoiéticas e/ou células da medula óssea. Nestes aspectos procura-se geralmente impedir, inibir ou interferir com a actividade de E2F-5.

Em contraste algumas doenças e condições podem ser criadas através do aumento da expressão de E2F-5, por exemplo através da promoção ou indução de sobre-expressão. Isto resulta, de preferência, em apoptose, por vezes conhecida como morte celular programada. A sobre-expressão da proteína E2F-5 pode resultar em morte da célula e portanto este aspecto pode também ser utilizado no tratamento de cancro. Um objectivo é portanto o de aumentar a actividade de E2F-5. São conhecidas utilizações semelhantes para E2F-1 (Qin et al., PNAS USA 91 (no prelo)).

Deve-se ter em mente que o gene de E2F-5 pode estar mutado em células tumorais. Nesse caso, o gene mutado pode ser utilizado em diagnóstico de uma condição resultante da mutação. Presta-se também ela própria a tratamento através do gene mutado.

Os dois Exemplos seguintes descrevem o isolamento e a caracterização da nova proteína e do ADN do presente invento a partir de fontes humanas e de murídeo, respectivamente. No entanto, outras fontes, p. ex. de mamífero, estão dentro do âmbito do presente invento e outros homólogos de mamífero da proteína podem ser isolados de um modo análogo. Os Exemplos 16 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ são aqui apresentados para fins de ilustração e não devem ser entendidos como limitantes do presente invento. EXEMPLO 1

SUMÁRIO

Os locais de ligação ao ADN de E2F são verificados em vários genes cuja expressão é fortemente regulada durante o ciclo celular. A actividade dos factores de transcrição E2F é regulada através da associação a moléculas repressoras especificas que se podem ligar e inibir o dominio de transactivação de E2F. Para E2F-1, 2 e 3 o repressor é o produto do gene de retinoblastoma, pRb. E2F-4 interage com pl07 aparentada com pRb e não com a própria pRb. Recentemente, foi isolado um ADNc codificando um terceiro membro da família de genes de retinoblastoma, pl30. pl30 também interage com a actividade de ligação ao ADN de E2F, principalmente na fase Go do ciclo celular. Relatamos aqui a clonagem de um quinto membro da família de genes E2F. O ADNc de E2F-5 humano codifica uma proteína de 346 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 38 kDa. E2F-5 está mais intimamente aparentado com E2F-4 (78% de semelhança) que com E2F-1 (57% de semelhança). E2F-5 parece-se com outros E2F por se ligar a um local de consenso de E2F de um modo cooperativo com DP-1. Utilizando um anti-soro específico de E2F-5, mostramos que sob condições fisiológicas E2F-5 interage preferencialmente com pl30.

Introdução E2F é o nome dado a um grupo de factores de transcrição heterodiméricos que são compostos de uma subunidade semelhante a E2F e uma semelhante a DP [27] . Os locais de ligação ao ADN de E2F estão presentes nos promotores de vários genes cuja expressão é regulada durante o ciclo celular e existem provas que indicam que a presença destes locais de E2F contribuem para a expressão regulada no ciclo celular destes genes [13, 28, 38] . A actividade de ligação ao ADN de E2F foi verificada em complexo com a proteína de retinoblastoma (pRb) e as pl07 e pl30 aparentadas com pRb [6, 10, 29, 37] . Este grupo de proteínas partilha um motivo conservado, o "bolso", que está 17 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ envolvido na ligação a proteínas celulares e virais. Por esta razão, o grupo de proteínas semelhantes a pRb é colectivamente conhecido como a família de proteínas de bolso. É provável que os complexos entre E2F e as várias proteínas de bolso tenham diferentes funções na regulação do ciclo celular uma vez que o seu aparecimento difere durante o ciclo celular. A E2F em complexo com pRb é verificada principalmente na fase Gi do ciclo celular [5-7, 11]. Em contraste, os complexos entre pl07 e E2F persistem durante o ciclo celular, mas a sua composição é variável. Em Gx, para além de E2F e pl07, estão presentes a ciclina E e a cdk2. Na fase S, a ciclina E é substituída pela ciclina A no complexo E2F/pl07 [29, 37] . A significância funcional da presença destes complexos ciclina/cdk no complexo pl07/E2F não é actualmente clara. Em células quiescentes, um complexo entre E2F e pl30 é a espécie de ligação ao ADN de E2F mais proeminente. Este complexo desaparece à medida que as células emergem da quiescência, sugerindo um papel para a actividade do E2F que interage com pl30 na entrada do ciclo celular [10]. A capacidade de E2F para activar a transcrição é regulada através da formação de complexos com as proteínas de bolso. A formação de um complexo entre E2F e pRb está sujeita a regulação por fosforilação. Apenas as espécies hipofosforiladas de pRb interagem com E2F, indicando que a fosforilação de pRb através de complexos ciclina/cdk controla a interacção entre E2F e pRb durante o ciclo celular [5-7, 11] . O papel crucial dos factores de transcrição E2F na regulação do ciclo celular é enfatizado pela descoberta de que o reforço da expressão da actividade de ligação ao ADN de E2F leva as células a progredir de Gx para as fases S e G2/M do ciclo celular [3] e E2F pode estimular células quiescentes para iniciarem a síntese de ADN [23]. Importante, a sobre-expressão de E2F, juntamente com um oncogene ras activo pode causar transformação oncogénica de fibroblastos primários de roedor [3].

Até à data foram isolados quatro polipéptidos diferentes semelhantes a E2F. E2F-1, 2 e 3 verificam-se apenas em complexos com pRb, enquanto que E2F-4 interage de preferência 18 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ com ρ107 [3, 15, 19, 22, 24, 30, 36]. É actualmente desconhecido como é regulada a formação de complexos entre E2F e pl07 e E2F e pl30. Para começar a abordar a regulação do complexo E2F/pl07 e do complexo E2F/pl30, pesquisámos membros adicionais da família de genes E2F. Relatamos aqui a clonagem de um quinto membro da família de genes E2F que interage preferencialmente com pl30.

Materiais e Métodos

Pesquisa de duplos-híbridos de levedura A estirpe de levedura Y190 [17], contendo o plasmídeo "isco" pPC97-pl07, foi transformada com uma biblioteca de embrião de ratinho CD1 de 14,5 dias [8] utilizando o método de acetato de lítio [34] . Dois milhões de transformantes foram seleccionados quanto ao crescimento em placas sem histidina e suplementadas com 3-aminotriazole 25 mM e subsequentemente analisados quanto à actividade de β-galactosidase tal como anteriormente descrito [12] . Os plasmídeos da biblioteca de ADNc derivados de colónias de levedura duplamente positivas foram testados quanto à especificidade do alvo através de re-transformação com diferentes plasmídeos de fusão Gal4-DBD: pPC97-pl07, pPC97-bmí e pPC97 sem inserção. 0 ADNc parcial de E2F-5 de ratinho foi utilizado para pesquisar bibliotecas de ADNc humano adicionais. 0 ADNc de E2F-5 humano inteiro aqui descrito foi isolado a partir da biblioteca de carcinoma de cólon T84 (Stratagene).

Plasmídeos O pPC97-pl07 foi gerado através de clonagem da região de bolso de pl07 (aminoácidos 240-816) enquadrada com o domínio de ligação ao ADN de Gal4 (aminoácidos 1-147) de pPC97 [8]. pGST-E2F-5 (A) e (B) foram construídos através da clonagem de um fragmento de ADNc de E2F-5 humano codificando os aminoácidos 89-200 (A) ou os aminoácidos 89-346 (B) em pGEX-2T. Para as experiências de transfecção foram utilizados os seguintes plasmídeos: pSG-Gal4-E2F-l contém os aminoácidos 284-437 de E2F-1 humana [19] . pJ3-Gal-E2F-4 e pJ3-Gal4-E2F-5 foram obtidos através da clonagem de um fragmento do ADNc humano de E2F-4 (codificando os aminoácidos 276-412) ou E2F-5 (codificando os aminoácidos 222-346) enquadrado com o domínio de ligação ao ADN de Gal4 em pJ3Q [33] . pJ3-E2F-5 foi 19 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ construído através de clonagem do ADNc humano inteiro de E2F-5 (sem os últimos 184 nucleótidos da sequência 3' não codificante) no vector de expressão de mamífero pJ3Q. O codão de início da tradução de E2F-5 foi precedido pelo epítopo de 10 aminoácidos (HA) que é reconhecido pelo anticorpo monoclonal 12CA5. pCMV-DP-1, pCMV-pRb, pCMV-pl07, pCMV-pl07DE, pCMV-pRbA22 foram descritos anteriormente [20, 41].

Linhas celulares Células U2-OS e CAMA foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal de vitelo a 20%, respectivamente. As transfecções foram efectuadas utilizando a técnica de precipitação em fosfato de cálcio [39].

Ensaios CAT Células U2-OS foram transientemente transfectadas com os vectores de expressão tal como indicado juntamente com 5 pg de (Gal4)s-CAT [25] ou 2 pg de E2F4-CAT [20], 0,2 pg de RSV-luciferase e ADN transportador de esperma de arenque até uma quantidade total de 20 pg/placa de 10 cm. As células foram ensaiadas quanto à actividade de CAT e luciferase tal como descrito anteriormente [2, 3].

Análise "Northern blot"

Para a análise da expressão de E2F-5, foi preparado ARN citoplasmático total a partir de um painel de linhas celulares. 20 mg de ARN celular total foram sujeitos a electroforese através de um gel de agarose com formaldeído a 1% tal como descrito [4], transferidos para nitrocelulose e sondados com um ADNc de E2F-5 humano parcial marcado com 32P (nt. 666-1038). Subsequentemente, o mesmo filtro foi sondado com um ADNc de α-tubulina de rato para controlar a quantidade de ARN carregada em cada pista.

Reagentes imunológicos e imunoprecipitações

Para gerar anticorpos contra E2F-5, proteínas GST-E2F-5 (A) e (B) (ver plasmídeos) foram produzidas em E. coli e purificadas utilizando contas de glutationa-Sepharose. Ambas as proteínas foram injectadas num coelho em quantidades iguais. Após três ciclos de imunização obteve-se soro policlonal. Os anticorpos monoclonais contra E2F-1 (KH20), 20 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ E2F-4 (RK13), pRb (ΧΖ77) e plO7 (SD-4 e 9) foram descritos anteriormente [3, 20, 21, 41] . O anti-soro policlonal de coelho de pl30 (C20) foi obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology inc. Células CAMA e células U2-OS transfectadas foram marcadas e imunoprecipitadas tal como descrito anteriormente [3].

Ensaios de retardamento em gel

Os ensaios de retardamento em gel para células U2-OS transientemente transfectadas foram efectuados tal como descrito anteriormente [20] com pequenas modificações. 10 pg de extracto celular inteiro foram utilizados num tampão de ligação contendo HEPES 20 mM (pH 7,4), KC1 0,1 M, MgCl2 1 mM, EDTA 0,1 mM, glicerol a 7%, NaF 1 mM e 1 pg de ADN de esperma de salmão sujeito a ultra-sons num volume reaccional de 20 pl com 0,5 ng de oligonucleótidos marcados com 32P especificando o local de consenso de ligação ao ADN de E2F-5 (Santa Cruz Biotechnology). Deixou-se formar os complexos ADN-proteina durante uma incubação de 20 min. à ta. Os produtos da reacção foram separados num gel de poliacrilamida a 3,5% em TBE 0,25x a 90 V à TA durante 2,5 horas. O gel foi então seco e exposto a pelicula.

Resultados

Isolamento de proteínas de ligação a pl07

Para identificar ADNc codificando polipéptidos que interagem com pl07, foi efectuada uma pesquisa de duplos-híbridos de levedura [14]. A estirpe de levedura Y190 [17], que contém dois genes repórter indutíveis por Gal4 localizados no cromossoma: His3 e LacZ [12], foi co-transformada com o plasmídeo "isco" contendo a região de bolso (aminoácidos 240-816) de pl07 fundida com o domínio de ligação ao ADN (DBD) de Gal4 e uma biblioteca de ADNc de embrião de ratinho CD1 de 14,5 dias na qual cada ADNc está individualmente fundido com o domínio de transactivação de Gal4 [8] . Um total de 2 milhões de transformantes foi colocado sob selecção em placas sem histidina. Oitenta e sete colónias sobreviventes foram pesquisadas quanto à expressão de β-galactosidase. Plasmídeos contendo ADNc foram recuperados a partir de dezasseis colónias de levedura duplamente positivas. A especificidade da ligação a pl07 foi confirmada através da re-transformação com 21 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ plasmídeos codificando outras fusões Gal4-DBD. Verificou-se que todas as dezasseis proteínas híbridas interagiam especificamente com Gal4-pl07. A análise da sequência de ADN mostrou que os dezasseis plasmídeos da biblioteca de adnc recuperados das leveduras foram derivados de 10 genes diferentes. Três ADNc eram derivados do mesmo gene e mostravam uma homologia significativa com os quatro E2F conhecidos. Devido a isto designámos a proteína codificada por este ADNc E2F-5. O ADNc parcial de E2F-5 de ratinho foi então utilizado para obter um clone de ADNc humano inteiro através da pesquisa de uma biblioteca de ADNc de carcinoma do cólon humano. O ADNc mais longo (2,1 kb) foi sequenciado e continha um enquadramento de leitura aberto de 1038 pb codificando uma proteína de 346 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 38 kDa. A Fig. IA mostra a sequência de ADNc de E2F-5 e a sequência de aminoácidos deduzida. E2F-5 é mais intimamente aparentado com E2F-4 (78% de semelhança) que com E2F-1 (57% de semelhança). Em comparação com E2F-1 e E2F-4, podem ser observadas três regiões de homologia em E2F-5 (Fig. 1B) . O domínio de ligação ao ADN (aminoácidos 43-115 de E2F-5) partilha 93% de semelhança com a região de ligação ao ADN de E2F-4, enquanto que o domínio de dimerização de DP-1 justaposto é 81% semelhante entre E2F-4 e E2F-5. Finalmente, os domínios de interacção da proteína de bolso do terminal carboxilo de E2F-4 e 5 são 83% semelhantes. E2F-4 e E2F-5 diferem de E2F-1 por ambas as proteínas não terem o motivo amino-terminal de E2F-1 que está envolvido na ligação da ciclina A. E2F-5 difere de E2F-4 por não possuir a região de repetição de serina de E2F-4.

Para analisar os níveis de expressão do ARNm de E2F-5, foi utilizado um ADNc de E2F-5 humano para sondar um Northern blot contendo ARN citoplasmático total de várias linhas celulares humanas. A sonda de E2F-5 detectou um nível baixo de um único transcrito de 2,1 kb na maioria das linhas celulares. A linha celular de carcinoma da mama CAMA humana expressou níveis um pouco mais elevados de E2F-5 (Fig. 2). 22 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ E2F-5 contém um domínio de transactivação carboxi-terminal E2F-1 e E2F-4 contêm um domínio de transactivação carboxi-terminal que se sobrepõe ao local de ligação da proteína de bolso [3, 18] . Para testar se E2F-5 também contém um domínio de transactivação, fundimos o terminal carboxilo da E2F-5 humana ao domínio de ligação ao ADN de Gal4 no vector de expressão de mamífero pJ3Q. Células de osteossarcoma U2-OS foram transientemente transfectadas com um gene repórter CAT ancorando cinco locais Gal4 a montante ou co-transfectadas com vectores de expressão do gene repórter e Ga4-E2F. A Fig. 3 mostra que a co-transfecção do plasmídeo repórter de Gal4 com os vectores de expressão de Gal4-E2F-5 resultou numa activação de 50 vezes do gene repórter CAT. A co-transf ecção com Gal4-E2F-1 ou Gal4-E2F-4 resultou numa activação duas a três vezes maior do gene repórter CAT (Fig. 3). Concluímos que E2F-5 contém um potente domínio de transactivação carboxi-terminal.

E2F-5 requer DP-1 para ligação ao ADN

Tanto E2F-1 como E2F-4 requerem dimerização com DP-1 para uma eficiente ligação ao ADN [1, 3, 20, 26] . Para investigar se E2F-5 se pode ligar a um local de consenso de ligação ao ADN de E2F e se E2F-5 requer dimerização de DP-1 para se ligar ao ADN, efectuámos uma experiência de transfecção transiente. Células de osteossarcoma U2-OS humanas foram transfectadas com um plasmídeo repórter CAT no qual um promotor central foi ligado a quatro locais de E2F a montante. A Fig. 4 mostra que o plasmídeo repórter E2F-CAT apenas possui pouca actividade quando transfectado sozinho para as células de osteossarcoma. A transfecção dos vectores de expressão de DP-1 ou E2F-5 separadamente não resultou em activação do repórter E2F-CAT (Fig. 4, pistas 2 e 6). A co-transfecção dos vectores de expressão de DP-1 e E2F-5 resultou numa forte activação sinergística dependente da dose do repórter CAT (Fig. 4, pistas 3-5). Estes dados indicam que E2F-5 se pode ligar ao local de consenso de E2F e que a ligação ao ADN é dependente de DP-1. Baseados nestes resultados concluímos que E2F-5 é um membro genuíno da família de genes E2F. A transactivação de E2F-5 é suprimida por proteínas de bolso A transactivação de E2F-1 e E2F-4 é suprimida pela ligação da proteína de bolso porque o domínio de transactivação destas E2F se sobrepõe à superfície de 23 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ interacção da proteína de bolso. Para testar o efeito da expressão da proteína de bolso na transactivação de E2F-5 utilizámos um ensaio de transfecção transiente. Uma vez que E2F-1 e E2F-4 requerem ambas dimerização de DP-1 para uma liqação eficiente às suas respectivas proteínas de bolso [3, 20], medimos o efeito da expressão da proteína de bolso na transcrição activada por E2F-5 mais DP-1. Células U2-OS foram transfectadas com o plasmídeo repórter de E2F-CAT juntamente com E2F-5 e DP-1. A Fiq. 5 (pista 3) mostra que a co-transfecção de E2F-5 e DP-1 resultou numa activação mais de 100 vezes superior do gene repórter E2F-CAT. A transcrição estimulada por E2F-5 foi inibida pela co-transfecção com vectores de expressão de pRb, pl07 e pl30 de um modo dependente da dose. Mutantes de pRb (pRbA22) e pl07 (pl07DE) que não possuíam um domínio de bolso intacto foram incapazes de suprimir a transactivação de E2F-5 (Fig. 5, pistas 6 e 9) . Significativamente, estas formas mutantes de pRb e pl07 também não possuíam actividade inibidora do crescimento [41]. Assim, embora esta experiência não tenha permitido uma identificação inequívoca do parceiro de ligação de E2F-5 preferido, indicou que a transactivação de E2F-5 é inibida pela ligação da proteína de bolso e que existe uma forte correlação entre a capacidade de pRb e pl07 para causar uma paragem do crescimento e a sua capacidade para inibir a transactivação de E2F-5. É importante realçar que as células U2-OS utilizadas nesta experiência são insensíveis a paragem do crescimento induzida por pRb ou pl07 [41]. É portanto improvável que os efeitos observados na transactivação de E2F-5 sejam devidos a efeitos não específicos do ciclo celular de pRb ou pl07. E2F-5 interage preferencialmente com pl30 num ensaio de deslocamento de bandas

Para continuar a investigar a especificidade da ligação de E2F-5 à proteína de bolso, efectuámos um ensaio de alteração da mobilidade por electroforese (EMSA). Células U2-0S foram transientemente transfectadas com vectores de expressão de DP-1 e E2F-5 com ou sem vectores de expressão de pRb, pl07 ou pl30. Dois dias após a transfecção, foram preparados extractos de células inteiras a partir de células transfectadas e incubadas com um oligonucleótido marcado com 32P que especifica um local de consenso de E2F. Os complexos ADN-proteína foram separados num gel de poliacrilamida e 24 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ visualizados através de radiografia. A Fig. 6 mostra que a transfecção dos vectores de expressão de E2F-5 e DP-1 conduz ao aparecimento de um novo complexo que não foi observado nas células falsamente transfectadas (Fig. 6, comparar as pistas 1 e 2) . Este complexo pôde ser super-deslocado através de co-transfecção do vector de expressão de pl30, mas não pelos vectores de expressão de pl07 ou pRb (Fig. 6, pistas 3-5) . Estes dados sugerem que das três proteinas de bolso testadas, pl30 tinha a maior afinidade para o heterodímero E2F-5/DP-1. E2F-5 interage preferencialmente com pl30 in vivo

Sob condições fisiológicas, E2F-1 liga-se de preferência a pRb e E2F-4 a pl07 [3, 15, 19, 24]. No entanto, em experiências de transfecção transiente a expressão génica activada tanto por E2F-1 como E2F-4 pode ser suprimida tanto por pRb como por pl07 [3, 40]. Esta perda de especificidade é provavelmente causada pela sobre-expressão transiente destas proteinas. Para abordar qual dos três membros da família de proteínas de retinoblastoma interage com E2F-5 sob condições fisiológicas, gerámos um anti-soro policlonal de coelho contra a E2F-5 humana. As experiências iniciais de imunoprecipitação utilizando E2F-1, E2F-4 e E2F-5 transcritas e traduzidas in vitro indicaram que o soro policlonal de E2F-5 reconhecia especificamente E2F-5 (dados não mostrados). O anti-soro de E2F-5 foi então utilizado numa experiência de imunoprecipitação sequencial. As células de carcinoma da mama CAMA foram metabolicamente marcadas com 32P-ortofosfato e foram preparados lisados de detergente não iónico. Estes lisados foram sujeitos a imunoprecipitação com anticorpo específico de pRb, anticorpo de pl07 ou anti-soro especifico de pl30. As proteínas que foram co-imunoprecipitadas com pRb, pl07 ou pl30 foram libertadas fervendo-as em tampão contendo SDS, diluídas e re-imunoprecipitadas com anti-soro específico de E2F-5. O painel B da Fig. 6 mostra que uma proteína de 47 kDa podia ser especificamente re-imunoprecipitada com anti-soro de E2F-5 a partir do imunoprecipitado de pl30, mas não a partir dos imunoprecipitados de pRb ou pl07. Esta proteína de 47 kDa co-migra em géis de SDS-poliacrilamida com E2F-5 transientemente transfectada (dados não mostrados). Como controlo verificámos se os imunoprecipitados de pRb e pl07 continham as suas respectivas E2F. O painel C da Fig. 6 mostra que pRb co-imunoprecipitou de facto E2F-1 e pl07 e trouxe 25 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ junto E2F-4. Tomados em conjunto, estes dados indicam que E2F-5 interage de preferência com pl30 in vivo.

Discussão

Relatamos aqui o isolamento de um quinto membro da família de genes E2F. E2F-5 possui todas as características de um membro genuíno da família E2F: contém um domínio de ligação ao ADN altamente conservado, um domínio de dimerização com DP-1 e um domínio de transactivação carboxi-terminal. Para além disso, E2F-5 liga-se a um local de consenso de ligação ao ADN de E2F de um modo cooperativo com DP-1 e pode activar a expressão de um gene repórter contendo um local de E2F.

Efectuámos três tipos de experiências para perceber com qual das três proteínas de bolso a E2F-5 interage preferencialmente in vivo. Em experiências de transfecção transiente, a transactivação de E2F-5 podia ser suprimida por todos os três membros da família de proteínas de retinoblastoma, pRb, pl07 e pl30. Neste aspecto E2F-5 parece-se com E2F-1 e E2F-4 uma vez que tanto a transactivação de E2F-1 como de E2F-4 pode ser inibida em ensaios de transfecção transiente por pRb bem como por pl07 [3, 40]. Esta aparente falta de especificidade num ensaio de transfecção transiente é provavelmente o resultado dos elevados níveis de expressão transiente tanto de E2F-5 como das proteínas de bolso nas células transientemente transfectadas. O nível relativamente baixo de inibição da transactivação de E2F-5 por pl30 na experiência de transactivação transiente (Fig. 5) é o resultado do baixo nível de expressão de pl30 uma vez que nas células transfectadas de forma transiente se verificou que pl07 era expressa a um nível 10 vezes superior em comparação com pl30 (dados não mostrados). Foram efectuadas duas experiências adicionais para abordar a especificidade das proteínas de bolso de E2F-5. Na primeira experiência as células foram transientemente transfectadas com vectores de expressão de E2F-5 e DP-1 na presença ou ausência de vectores de expressão para todas as três proteínas de bolso. Subsequentemente, foram efectuados ensaios de deslocamento de bandas utilizando extractos das células transfectadas com um oligonucleótido especificando um local de consenso de ligação de E2F. Apenas a co-transfecção de pl30 podia causar um super-deslocamento do complexo E2F-5/DP-1 (Fig. 6). Na experiência 26 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ de deslocamento de bandas, apenas os complexos entre as proteínas de bolso e E2F-5 que são estáveis durante períodos de tempo prolongados são detectados como complexos E2F/proteína de bolso "super-deslocados". Assim, apesar de pl30 ser expressa a um nível mais baixo que pl07, o complexo entre E2F-5 e pl30 era mais estável que o complexo pl07/E2F-5 (Fig. 6). Numa experiência semelhante, fomos capazes de "super-deslocar" um complexo de ligação ao ADN de E2F-4 com pl07, mas não com pRb (R.L.B. e R.B., dados não publicados). Este resultado sugere que as experiências de alteração de mobilidade podem ser potencialmente úteis para abordar a especificidade das proteínas de bolso para E2F. Consistente com os resultados do ensaio de alteração de mobilidade, verificámos que em células de carcinoma da mama CAMA não transfectadas marcadas metabolicamente, E2F-5 podia ser co-imunoprecipitada com pl30 e não com pl07 ou pRb (Fig. 7) . Tomados em conjunto, os nossos dados indicam que sob condições fisiológicas, E2F-5 se associa de preferência com pl30. A descoberta de que E2F-5 interagia com pl30 mas não com pl07 foi de algum modo inesperada porque pl30 e pl07 são estruturalmente intimamente aparentadas e de facto pl07 e 130 partilham a capacidade para se ligar às ciclinas A e E [16, 32, 41]. Por outro lado, pl07 e pl30 diferem na sua capacidade para interagir com as ciclinas de tipo D in vivo uma vez que apenas pl07, e não pl30, co-imunoprecipita com anticorpos anti-ciclinas de tipo D [32] . Importante, o aparecimento dos complexos pl30/E2F e pl07/E2F difere no ciclo celular [9, 10, 29, 35, 37] . Isto sugere que pl07 e pl30 possuem funções distintas durante o ciclo celular. A ligação preferencial de pl30 a E2F-5 é consistente com um tal papel distinto de pl30 na regulação do ciclo celular. A nossa descoberta de que E2F-5 não se pode ligar a um local de consenso de E2F exclui a possibilidade de E2F-5 interagir com um subconjunto discreto de locais de E2F in vivo que é distinto dos locais de E2F a que se ligam outros membros da família de genes E2F. Consistente com uma tal preferência de locais de ligação dos diferentes E2F é a descoberta de que os locais E2F que estão presentes no promotor do gene da timidina-quinase e no promotor de b-myb interagem preferencialmente com complexos E2F/pl07 [28,31]. Uma vez que 27 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ complexos entre E2F e ρ130 se verificam principalmente em células quiescentes e desaparecem rapidamente após as células emergirem da quiescência, é provável que os genes que respondem a E2F-5 estejam envolvidos nas respostas iniciais de células em repouso à estimulação por factores de crescimento [10] . A disponibilidade da E2F-5 que interage com pl30 deve permitir-nos identificar genes que respondem a E2F-5.

Agradecimentos

Agradecemos a P. Chevray pela oferta da biblioteca de ADNc de embrião de ratinho e dos vectores de expressão de levedura, a S. Elledge pela estirpe de levedura Y1090, a M. Alkema pelo vector de expressão de levedura Gal4-i>mi, a G. Hannon pela oferta do vector de expressão de pl30, a A. Bes-Gennissen pela oferta de ARN da linha celular humana e a Y. Ramos pela preparação do Northern blot. Este trabalho foi apoiado por um projecto de Netherlands Organization for Scientific Research (NWO).

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Sumário O factor de transcrição DRTF1/E2F está implicado no controlo da proliferação celular devido à sua interacção com reguladores chave da progressão do ciclo celular, tais como o produto do gene supressor de tumores de retinoblastoma e proteinas de bolso aparentadas, ciclinas e quinases dependentes de ciclinas. A actividade de ligação ao adn de 32 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ DRTF1/E2F surge quando um membro de duas famílias de proteínas distintas, DP e E2F, interagem como heterodímeros DP/E2F. Aqui, relatamos o isolamento e a caracterização de um novo membro da família de proteínas E2F, designado E2F-5. E2F-5 foi isolada através de um ensaio de duplos-híbridos de levedura no qual uma biblioteca de embrião de ratinho de 14,5 d.p.c. foi pesquisada quanto a moléculas capazes de se ligar a DP-1 de murídeo, mas que também interagem com todos os membros conhecidos das família de proteínas DP. E2F-5 existe como um heterodímero fisiológico com DP-1 na actividade genérica de ligação ao ADN de DRTF1/E2F presente em extractos celulares de mamífero, uma interacção que resulta numa actividade de ligação ao ADN cooperativa e na activação da transcrição através do local E2F. Um potente domínio de activação da transcrição, que funciona tanto em células de levedura como de mamífero e reside na região C-terminal de E2F-5, e a expressão da proteína pl07 aparentada com pRb, em vez de pRb, inactiva a actividade de transcrição de E2F-5. A comparação da sequência de E2F-5 com outros membros da família indica que E2F-5 mostra um maior nível de semelhança com E2F-4 que com E2F-1, 2 e 3. A semelhança estrutural e funcional de E2F-5 e E2F-4 define uma subfamília de proteínas E2F.

Introdução

Provas consideráveis sugerem que o factor de transcrição celular DRTF1/E2F está envolvido na coordenação da transcrição com a progressão do ciclo celular. Por exemplo, DRTF1/E2F parece ser um dos principais alvos através do qual o produto do gene supressor de tumores de retinoblastoma (pRb) exerce os seus efeitos negativos na proliferação celular (La Thangue, 1994). Assim, através da regulação da actividade de transcrição de DRTF1/E2F e deste modo da actividade de genes alvo, muitos dos quais codificam proteínas necessárias para a progressão do ciclo celular (Nevins, 1992), pRb é capaz de influenciar a progressão através do ciclo celular inicial. Mutações naturais em Rb, que ocorrem em células tumorais humanas, codificam proteínas que não se conseguem ligar a DRTF1/E2F (Bandara et al., 1992; Heibert et al., 1992; Zamanian e La Thangue, 1992), realçando a correlação entre a desregulação de DRTF1/E2F e o crescimento celular aberrante. Para além disso, a actividade transformante de oncoproteínas virais, tais como a Ela de adenovírus, a E7 do vírus do 33 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ papiloma humano e ο antigénio Τ grande de SV40, correlaciona-se com a sua capacidade para desregular DRTF1/E2F através do sequestro de pRb e de proteínas aparentadas (Nevins, 1992), proporcionando mais apoio a esta visão.

Outras moléculas que têm um papel central no ciclo celular interagem também com DRTF1/E2F. As ciclinas A e E, juntamente com a subunidade catalítica cdk2, ligam-se a DRTF1/E2F directamente através de contacto com os componentes de ligação ao ADN no factor de transcrição (Krek et al., 1994) ou indirectamente através de contactos que ocorrem na região espaçadora das proteínas de bolso aparentadas com pRb pl07 ou pl30 (Lees et al., 1992; Cobrinik et al., 1993). Embora o papel do complexo ciclina-cdk que se associa a pl07 e pl30 esteja ainda por resolver, mostrou-se que a interacção directa entre o complexo ciclina A/cdk2 e DRTF1/E2F afecta a sua actividade de ligação ao ADN (Krek et al., 1994). A composição molecular de DRTF1/E2F está a começar a ser descoberta. É agora claro que a actividade de ligação ao ADN genérica de DRTF1/E2F surge quando membros de duas famílias de proteínas distintas interagem como heterodímeros DP/E2F (La Thangue, 1994), sendo as moléculas protótipo de cada família DP-1 (Girling et al., 1993) e E2F-1 (Helin et al., 1992; Kaelin et al., 1992; Shan et al., 1992). Uma pequena região de semelhança entre ambas as proteínas permite-lhes interagir como um heterodímero (Bandara et al., 1993; Helin et al., 1993; Krek et al., 1993), sendo esta região conservada em todos os membros das famílias DP e E2F isolados até à data (Girling et al., 1994), permitindo assim que ocorram diversas interacções combinatórias.

Durante a progressão do ciclo celular a associação de pRb, pl07 e pl30 ocorre de um modo temporariamente regulado, possuindo cada proteína o seu próprio perfil característico de interacções com DRTF1/E2F (Shirodkar et al., 1992; Schwarz et al., 1993; Cobrinik et al., 1993). Dos membros da família E2F isolados até à data, E2F-1, 2 e 3 reconhecem pRb (Ivey-Houle et al., 1993; Lees et al., 1993) e E2F-4 a proteína pl07 (Beijersbergen et al., 1994; Ginsberg et al., 1994), sendo uma explicação provável que as interacções temporais das proteínas de bolso reflectem a composição regulada e/ou a 34 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ disponibilidade do membro da familia E2F no heterodimero E2F/DP.

Embora em muitos tipos de células, dp-1 seja um componente de DRTF1/E2F frequente de ligação ao ADN, estando presente nas várias formas que ocorrem durante a progressão do ciclo celular (Bandara et ai., 1994), outros membros da familia DP, tais como DP-2, são expressos de um modo restrito ao tecido (Girling et al., 1994). Parceria portanto provável que a composição molecular de DRTF1/E2F fosse influenciada pela progressão do ciclo celular e pelo fenótipo da célula. A complexidade da familia de proteínas E2F está ainda por ser elucidada. Para abordar esta questão efectuámos uma pesquisa baseada em duplos-hibridos de levedura para definir novos membros da familia. Aqui, relatamos o isolamento e a caracterização de E2F-5 de murideo, um novo membro da família E2F-5. E2F-5 interage com todos os membros conhecidos da família de proteínas DP. Em extractos de células de mamífero existe um heterodimero fisiológico com DP-1, uma interacção que resulta na ligação cooperativa ao ADN e na activação da transcrição através do local E2F. E2F-5 possui um potente domínio de activação em trans que é especificamente inactivado após ligação da proteína de bolso. A sequência proteica e a organização molecular de E2F-5 é mais intimamente aparentada com E2F-4 que com outros membros da família, definindo pela primeira vez uma subfamília de proteínas E2F que são funcionalmente e estruturalmente aparentadas.

Resultados

Isolamento de E2F-5

Para explorar a diversidade da família de proteínas E2F empregámos uma estratégia baseada em duplos-híbridos de levedura (Fields e Song, 1989) para identificar novos membros (Figura 8). Escolhemos utilizar DP-1 como isco, uma vez que DP-1 é um parceiro fisiológico e frequente para os membros da família E2F (Bandara et al., 1993; Bandara et al., 1994). Uma biblioteca de ADNc marcada com um domínio de activação preparada a partir de um embrião de ratinho de 14,5 d.p.c. (Chevray e Nathans, 1992) foi pesquisada quanto a proteínas híbridas capazes de interagir com LexA-DP-1. Um dos clones 35 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ identificados codificava uma proteína híbrida que através de vários critérios interagia especificamente com LexA-DP-1. A análise parcial da sequência de ADNc indicou uma semelhança extensa dos membros da família de E2F e assim foi ainda

isolado um clone de ADNc codificando a sequência proteica completa a partir de uma biblioteca de ADNc de F9 EC. A comparação da sequência proteica com outros membros da família E2F indicou que o clone de ADNc codificava um novo membro. Seguindo a designação adoptada para as proteínas E2F anteriormente isoladas tal como E2F-1, 2, 3 e 4, referimo-nos a este clone por E2F-5. O tamanho previsto da E2F-5 de murídeo é de 335 resíduos (Figura 9a) . Esta previsão baseia-se na posição da primeira potencial metionina de iniciação, juntamente com a extensa homologia que existe com a sequência da E2F-5 humana na qual a tradução se inicia na mesma metionina (Hijmans et al., submetido). E2F-5 contém uma extensa semelhança de sequência com os domínios conservados entre outros membros da família E2F (Ivey-Holey et al., 1993; Lees et al., 1993; Beijersbegen et al., 1994; Ginsberg et al., 1994). Por exemplo, o domínio de ligação ao ADN apresenta 48% de identidade com E2F-1 e 87% com E2F-4 (Figura 9b e c) . Dentro desta área, um sub-domínio C-terminal contém a única região de semelhança com membros da família DP (indicado nas Figuras 9b e c) . Esta região, que é conhecida como a caixa DEF (Girling et al., 1994; Lam e La Thangue, 1994), está infimamente envolvida na formação do heterodímero DP/E2F (Bandara et al., 1993; Bandara e La Thangue, em preparação). Os resíduos conservados dentro da caixa DEF entre as proteínas DP e E2F estão também perfeitamente conservados dentro de E2F-5 (Figura 9c), realçando a potencial importância deste sub-domínio na formação do heterodímero DP/E2F. Várias regiões adicionais são conservadas entre E2F-5 e os outros membros da família. A caixa marcada (Lees et al., 1993) e o domínio de ligação à proteína de bolso mostram 58% e 50% de identidade com estas regiões em E2F-1 e 75% e 72% com as mesmas regiões em E2F-4 (Figura 9b e 9c) . As posições dos resíduos hidrófobos na região do fecho de leucina são também conservadas com outros membros da família E2F (Figura 9c) . De facto, E2F-5 pode formar um fecho maior que E2F-1, 2 e 3 36 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ porque os resíduos hidrófobos em E2F-5 estão em consonância com a hepta-repetição em mais duas posições C-terminais (L144 e V151; ver Figura 9c).

As características de E2F-5 sugerem uma relação mais íntima com E2F-4 do que com E2F-1, 2 e 3. A sua organização parece-se com a de E2F-4 por a proteína não se prolongar muito para além do terminal N do domínio de ligação ao ADN e ambas as proteínas não possuem o domínio de ligação da ciclina A N-terminal que ocorre nas outras E2F (Figura 9b) . Para além disso, a comparação da sequência proteica indica que E2F-5 e 4 estão mais próximas uma da outra do que cada uma delas com os restantes membros da família. Isto é particularmente evidente ao longo dos domínios conservados, onde muitos resíduos são comuns entre E2F-5 e 4 mas não entre E2F-1, 2 e 3 (Figura 9c). Globalmente, E2F-5 contém 70% de resíduos de aminoácidos idênticos com E2F-5 e 38% com E2F-1. Assim, com base nesta semelhança, E2F-5 e 4 representam uma subfamília da família de proteínas E2F enquanto que E2F-1, 2 e 3, devido à sua íntima semelhança, representam outra.

Ligação e cooperação na transcrição com membros da família DP A actividade de ligação genérica ao ADN de DRTF1/E2F surge quando um membro da família DP interage com um membro da família E2F (La Thangue, 1994). Para DP-1 e E2F-1, a interacção resulta na activação cooperativa da transcrição, na ligação ao ADN e na interacção com pRb (Bandara et al., 1993; Helin et al., 1993; Krek et al., 1993). Interessámo-nos portanto em determinar se E2F-5 podia cooperar com membros da família DP.

Para responder a estas questões, utilizámos primeiro o ensaio de duplos-híbridos de levedura com diferentes moléculas de DP representadas no isco híbrido como proteínas de fusão LexA (Figura 8). E2F-5 ou E2F-1 foi expressa como proteína híbrida marcada com um domínio de activação (GAD) e o grau de activação da transcrição de uma construção repórter LexA foi avaliado através da medição da actividade da β-galactosidase. Tanto E2F-5 como E2F-1 foram igualmente capazes de interagir com todos os membros conhecidos da família de proteínas DP, isto é DP-1, 2 e 3 e DP de Drosophila (dados não mostrados). 37 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Avaliámos de seguida se E2F-5 podia cooperar com DP-1 para activar a transcrição através do local de ligação de E2F. Para isso utilizámos um ensaio de levedura no qual E2F-5 e DP-1 foram expressas juntas ou sozinhas e a actividade de transcrição de uma construção repórter do local de E2F, p4xWT CYC1, foi medida (Figura 10a). Em estudos anteriores, este ensaio foi utilizado para medir a cooperação entre E2F-1 e DP-1 (Bandara et al., 1993). A actividade de transcrição do repórter não foi significativamente afectada após a expressão das proteínas híbridas DP-1 e foi afectada apenas marginalmente pelo híbrido E2F-5 (Figura 10b) . No entanto, quando ambas foram expressas juntas, a actividade repórter foi estimulada mais de 6 vezes (Figura 10b). A actividade de p4xMT CYC1, um derivado de p4xWT CYC1 que possui locais de ligação de E2F mutantes (Figura 10a; Bandara et al., 1993) não foi afectada nas mesmas condições (dados não mostrados) .

Concluímos portanto que E2F-5 coopera com DP-1.

Activação na transcrição e regulação pela proteína de bolso de E2F-5 A capacidade de E2F-5 para activar a transcrição foi avaliada tanto em células de levedura como de mamífero. Para ensaiar a actividade de transcrição em levedura, uma região C-terminal (do resíduo 198 ao 335) de E2F-5 foi fundida com LexA e foi avaliada a actividade de uma construção repórter conduzida por locais de ligação LexA (Figura 11a). A proteína E2F-5 contém um potente domínio de activação em trans uma vez que a actividade do repórter na presença de pLEX.E2F-5 foi muito maior do que quando foi expresso o vector sozinho (Figura 11b); de modo semelhante, LexA E2F-1 foi capaz de activar a transcrição (Figura 11b). Assim, E2F-5 activa eficientemente a transcrição em levedura.

Para confirmar estes resultados em células de mamífero e avaliar as consequências funcionais da interacção das proteínas de bolso com E2F-5, fundimos a mesma região de E2F-5 com o domínio de ligação ao ADN de Gal4 e utilizámos ensaios de transfecção transiente para estudar a actividade de transcrição de uma construção repórter dirigida por locais de ligação de Gal4, pGAL-CAT (Figura 12a). Em células 3T3, E2F-5 activou eficientemente a transcrição relativamente à actividade do domínio de ligação ao ADN de Gal4 sozinho 38 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ (Figura 12b) uma vez que a actividade de transcrição de pGAL-CAT foi 15 vezes maior na presença de pGAL-E2F-5 relativamente a pG4. Resultados semelhantes foram obtidos numa variedade de outros tipos celulares (dados não mostrados), indicando que E2F-5 contém um domínio de activação em trans que funciona em células de mamífero.

Utilizámos depois a actividade de transcrição de E2F-5 para avaliar as consequências funcionais de uma interacção com pRb ou pl07. Como controlos para pRb e pl07 de tipo selvagem, estudámos a actividade de RbA22, uma proteína codificada por um alelo mutante de Rb de ocorrência natural que não consegue interagir com DRTF1/E2F (Zamanian e La Thangue, 1992) e a actividade de ARN anti-sentido de pl07 (Zamanian e La Thangue, 1993). Nem pRb de tipo selvagem nem RbA22 afectaram significativamente a actividade de E2F-5, uma vez que na presença de pCMVHRb ou pCMVHRbh22 a actividade de pGAL-CAT não foi afectada (Figura 12b). Em contraste, a co-expressão de pl07 (a partir de pCMVl07) com E2F-5 reduziu a actividade de transcrição de E2F-5, um efeito que era específico uma vez que pl07 anti-sentido (a partir de pCMV107AS) não teve qualquer efeito (Figura 12b). Concluímos que pl07 inactiva a actividade de transcrição de E2F-5 em células de mamífero. Utilizando uma estratégia experimental semelhante, mostrámos que a proteína pl30 inactiva a actividade de transcrição de E2F-5 (dados não mostrados).

E2F-5 é um componente fisiológico de ligação ao ADN de DRTF1/E2F

Para determinar se E2F-5 é um componente fisiológico de ligação ao ADN da actividade de ligação genérica ao ADN de DRTF1/E2F definida em extractos preparados a partir de células de mamífero, foram preparados dois soros anti-péptido E2F-5 diferentes contra sequências peptídicas distintas; ambos os anti-soros reagiram especificamente com uma proteína de fusão GST-E2F-5 (dados não mostrados). O efeito destes anti-soros na actividade de ligação ao ADN de DRTF1/E2F foi estudado através de ensaios de retardamento em gel efectuados com extractos de células de carcinoma embrionário F9 de murídeo (F9 EC). Estudos anteriores mostraram que DP-1 é um componente frequente, 39 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ possivelmente universal, da actividade de ligação ao ADN de DRTF1/E2F em extractos de células F9 EC (Girling et ai., 1993; Bandara et al., 1993), um exemplo dos quais é mostrado na Figura 13 (pistas 1 a 4). Ambos os soros anti-E2F-5 destruíram a actividade de ligação ao ADN de DRTF1/E2F, um efeito que era específico uma vez que não era aparente na presença do péptido homólogo (Figura 13, pistas 5 a 12) . Embora anti-E2F-5 tenha causado uma diminuição significativa na actividade de ligação ao ADN, o efeito foi claramente menos marcado que o causado pelo anti-DP-1 (Figura 13, comparar as pistas 1 a 4 com as pistas 5 a 12). Isto pode ser porque E2F-5 está presente numa subpopulação de heterodímeros DP-1/E2F em extractos de células F9 EC, uma situação que contrasta com a observada para DP-1.

Propriedades de ligação ao ADN de E2F-5

Para estudar as propriedades de ligação ao ADN de E2F-5 expressámos e purificámos E2F-5 como uma proteína de fusão de GST. Consistente com resultados anteriores (Bandara et al., 1993), GST-DP-1 cooperou com GST-E2F-1 na ligação ao local E2F, embora E2F-1 possuísse uma significativa actividade de ligação ao ADN quando ensaiada sozinha (Figura 14, comparar pistas 1 a 4) . Em contraste, E2F-5 sozinha possuía uma actividade de ligação ao ADN quase indetectável (Figura 14, pistas 5 a 7). No entanto, a cooperação entre E2F-5 e DP-1 foi consideravelmente maior que entre E2F-1 e DP-1 (Figura 13, pistas 8 a 10). Assim, E2F-5 e DP-1 cooperam na actividade de ligação ao ADN. Níveis de ARN de E2F-5

Estávamos interessados em determinar os níveis de ARN de E2F-5 em diferentes linhas celulares e, para além disso, comparar os níveis de E2F-5 com outros membros da família E2F. Para isto, foi preparado ARN a partir de culturas assíncronas de células F9 EC juntamente com uma variedade de linhas celulares leucémicas e o nível de ARN de E2F-5 foi avaliado através de Northern blotting. A quantidade de ARN de E2F-5 variou consideravelmente de linha celular para linha celular; as células F9 EC e algumas das linhas celulares leucémicas, por exemplo, DAUDl e RAGI expressaram níveis elevados (Figura 15, pistas 1, 7 e 8) . Em contraste, HL60 e TFl continham níveis baixos de ARN de E2F-5 (Figura 15, pistas 4 e 6). Este perfil de níveis de ARN de E2F-5 diferiu consideravelmente dos 40 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ níveis de E2F-1. Por exemplo, estavam presentes níveis significativos de ARN de E2F-1 em células K562, HL60 e TFl em contraste com E2F-5 (Figura 15, pistas 3, 4 e 6) . A situação inversa era aparente em células EL4 onde os níveis de E2F-5 eram elevados e de E2F-1 baixos (Figura 15, pista 10). Concluímos que os níveis de ARN de E2F-5 são influenciados pelo tipo celular e que existe pouca correlação entre os níveis de ARN de E2F-5 e E2F-1.

Discussão

E2F-5 e E2F-4 são uma subfamília de proteínas E2F

Relatamos o isolamento e a caracterização do quinto membro da família de proteínas E2F, E2F-5. Embora muitos dos domínios em E2F-5, tais como o potencial fecho de leucina, a caixa marcada e a região de ligação à proteína de bolso, sejam conservados com outros membros da família E2F, a falta da sequência N-terminal fora do domínio de ligação ao ADN indica uma organização estrutural semelhante a E2F-4 (Beijersbergen et al.r 1994; Ginsberg et al., 1994). Os outros membros da família E2F, E2F-1, 2 e 3, possuem terminais N prolongados dentro dos quais reside um domínio capaz de interagir com a ciclina A (Krek et al., 1994). Foi sugerido que o papel deste domínio é o de recrutar uma ciclina A/quinase cdk2 para o heterodímero DP-1/E2F que resulta na subsequente fosforilação de DP-1, sendo a consequência funcional uma reduzida actividade de ligação ao ADN do heterodímero DP-1/E2F (Krek et al., 1994). Um tal mecanismo pode ser importante na regulação da actividade de transcrição de genes dependentes do local de E2F num momento mais tardio da progressão do ciclo celular. A ausência de um domínio de ligação à ciclina A em E2F-5 (e E2F-4) sugere que a actividade de ligação ao ADN do heterodímero E2F-5/DP-1 pode ser sub-regulada através de outros mecanismos. De facto, um cenário possível através do qual isto podia ser alcançado seria através das proteínas pl07 e/ou pl30 uma vez que a região espaçadora nestas proteínas se pode ligar a complexos ciclina A/cdk2 ou ciclina E/cdk2 (Lees et al., 1993; Cobrinik et al., 1993; Hannon et al., 1993; Li et al., 1993). É possível que estas proteínas de bolso substituam o papel dos membros da família E2F que se ligam à ciclina A e recrutem complexos ciclina/cdk para o heterodímero DP/E2F. 41 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ A comparação da sequência proteica de E2F-5 com outros membros da família E2F indicou uma relação mais próxima com E2F-4 que com E2F-1, 2 e 3. Interessante, E2F-4 é o único membro conhecido da família que é capaz de interagir com pl07 em condições fisiológicas (Beijersbergen et al., 1994; Ginsberg et al., 1994). Mostrámos que a actividade de transcrição de E2F-5 pode ser inactivada através de pl07 ou pl30 em vez de através de pRb. No entanto, isto pode reflectir a relação mais próxima de pl07 com pl30 do que com pRb (Ewen et al., 1991; Cobrinik et al., 1993; Li et al., 1993) e pode portanto não reflectir inteiramente interacções fisiológicas. Consistente com esta ideia é o resultado de que se mostrou que a E2F-5 humana interage com pl30 em condições fisiológicas (Hijmans et al., submetido).

Cooperação entre E2F-5 e DP-1

Na actividade de ligação ao ADN e transcrição E2F-5 cooperou com DP-1. Nestes aspectos, E2F-5 possui propriedades semelhantes a outros membros da família E2F. No entanto, é interessante observar que a cooperação entre E2F-5 e DP-1 era consideravelmente maior que, por exemplo, a cooperação observada entre E2F-1 e DP-1 em condições experimentais equivalentes (por exemplo ver Figura 14) . Se este ensaio reflectir propriedades funcionais dentro das células, então é possível que num ambiente intracelular de excesso de DP-1 aumentos equivalentes da quantidade de E2F-5 e E2F-1 resultem num nível relativamente maior de actividade de ligação ao ADN de E2F-5/DP-1. Para além disso, se houver genes alvo preferidos para determinados heterodímeros E2F/DP então estas diferenças na actividade de ligação ao ADN podem reflectir diferenças na actividade de transcrição.

Os papéis exactos das diferentes proteínas E2F no controlo do ciclo celular não foram ainda estabelecidos. No entanto, é possível que regulem a actividade de transcrição de genes alvo durante fases discretas da progressão do ciclo celular. Por exemplo, que E2F-1, 2 e 3 interage com pRb (Helin et al., 1992; Kaelin et al., 1992; Ivey-Hoyle et al., 1993; Lees et al., 1993) sugere que estes regulam a progressão do ciclo celular ao longo de G1. Em contraste, pl07 associa-se a DRTF1/E2F para o final de Gl, atingindo um pico na fase S (Shirodkar et al., 1992) enquanto que pl30 se associa de 42 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ preferência durante a progressão inicial do ciclo celular, principalmente durante GO (Cobrinik et al., 1993). No entanto, os níveis de E2F-1 e E2F-5 numa variedade de tipos celulares sugerem que a expressão de membros da família E2F não é apenas influenciada pela fase do ciclo celular mas também pelo fenótipo. É possível que as células utilizem um subconjunto preferido de proteínas E2F que sejam mais adequadas aos seus requisitos do ciclo celular. A caracterização molecular e funcional da E2F-5 aqui relatada, juntamente com a sua interacção com membros da família DP, indica que é teoricamente possível uma variedade de heterodímeros entre membros das famílias E2F e DP. Um objectivo principal de futuros estudos será o de compreender o papel fisiológico de cada um destes factores de transcrição no controlo do ciclo celular.

Materiais e Métodos

Estirpes de levedura, meios e métodos. As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo foram como se segue: W3031a (Mata ade2-100 trpl-1 leu2-3, 112 his3-ll ura3); CTYlO-5d (Mata ade2 trpl-901 leu2-3, 112 his3-200 gal4 gal80 URA3::lexAop-lacZ) e PCY2 (Mata gall4 gal80 URA3::GAL1-lacZ lys2-801 his3-200 trpl-63 leu2 ade2-101) e JZ1 (Jooss et al., 1994; Mata lys2-801 ade2-10 leu2Al trpA63 his3A200 URA3::lexAop-CYCl-lacZ). As estirpes de levedura foram propagadas em meio YPD ou YNB e transformadas utilizando uma modificação do método de acetato de lítio. O ensaio de actividade da β-galactosidase por cor das colónias foi efectuado através de procedimentos convencionais. A actividade da β-galactosidase de cada transformante foi quantificada em culturas de fase semi-logarítmica para pelo menos três transformantes independentes.

Biblioteca de ADN, plasmídeos e oligonucleótidos. pPC67 é uma biblioteca de ADNc iniciada com oligo-dT de embrião de ratinho CD-I de 14,5 d.p.c. fundida a jusante das sequências de levedura codificando o domínio de activação em trans da proteína GAL4 (GAD; Chevray e Nathans, 1992) . Clones de ADNc completos foram isolados a partir de uma biblioteca AZapII de 43 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ F9 EC de ADNc iniciado com poli-dT clonado direccionalmente (Schõler et al., 1990). O plasmideo pTR27 é um derivado de ρΒΤΜϋβ (Bandara et al., 1993) no qual as sequências poliligantes foram prolongadas; pLEX.DP-1, pGAD.E2F-l, p4xWT CYC1 e p4xMT CYC1 foram descritos anteriormente (Bandara et al., 1993). pLEX(HIS).DP-1 codifica uma fusão da proteína bacteriana completa LexA com DP-1 (do resíduo de aminoácido 59 ao 410) no plasmideo pLEX(HIS), um derivado de ρΒΤΜίΙβ no qual TRPl foi substituído por HIS3. pGAD.E2F-5 contém a sequência de codificação inteira de E2F-5 expressa como uma proteína híbrida com o domínio de activação da proteína GAL4 de levedura (768-881) no plasmideo pACTll (Durfee et al., 1993). pLEX.E2F-5 contém a sequência de codificação de E2F-5 do resíduo de aminoácido 198 ao 335 expressa como uma proteína híbrida a jusante da sequência de codificação completa da proteína LexA no plasmideo pTR27. pLEX.E2F-l possui a E2F-1 inteira (1-437) em pTR27. O plasmideo pG4 (anteriormente designado pG4m polill; Webster et al., 1989) codifica o domínio de ligação ao ADN de GAL4 (1-148) sob o controlo do promotor inicial de SV40. O plasmideo pGAL4.E2F-5 contém a sequência de codificação de E2F-5 do resíduo 198 ao 335 fundida a jusante das sequências GAL4 em pG4. Os plasmídeos pCMVHRb, pCMVHRbA22, pCMVl07 e pCMVl07AS foram descritos anteriormente (Zamanian e La Thangue, 1992; 1993) .

Pesquisa da biblioteca. 40 yg de ADN da biblioteca pPC67 foram co-transformados em CTYlO-5d com 40 yg de pLEX(HIS).DP-1. Aproximadamente 400000 transformantes a crescer em placas de ágar selectivas foram pesquisados através do ensaio in situ de β-galactosidase em papel de filtro. Para recuperar os plasmídeos da biblioteca, as colónias azuis foram isoladas e curadas de pLEX(HIS).DP-1 crescendo até à saturação em meios líquidos selectivos na presença de histidina. Após plaqueamento em réplica em ágar mínimo selectivo, o ADN plasmídico das colónias Trp+His“ que não conseguiram dar uma cor azul quando ensaiadas quanto à β-galactosidase foram electroporadas em E. coli HW87. Os plasmídeos foram recuperados e retransformados em CTYlO-5d com pLEX(HIS).DP-1 ou com o plasmideo de controlo (pLEX(HIS)). Um plasmideo conferindo um fenótipo Trp+ que deu uma colónia de cor azul 44 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ apenas na presença de pLEX(HIS).DP-1 foi seleccionado para mais análises. Para obter um ADNc inteiro, a inserção foi excisada, radiomarcada e utilizada para pesquisar aproximadamente 106 placas da biblioteca Xzapii de F9 EC da qual foi isolado um ADNc de E2F-5 inteiro e recuperado para pBluescript.

Transfecção transiente de células 3T3. As transfecções e os ensaios foram efectuados através do método convencional de precipitação em fosfato de cálcio tal como descrito anteriormente (Zamanian e La Thangue, 1992). A actividade de β-galactosidase derivada de pCMV-Bgal como controlo interno foi medida tal como anteriormente descrito (Zamanian e La Thangue, 1992) .

Anti-soros e análise de retardamento em gel. Os anti- soros de coelho criados contra duas sequências peptidicas distintas derivadas de E2F-5, referidos como anti-E2F-5(1) e anti-E2F-5(2) foram preparados e avaliados quanto ao efeito na actividade de ligação ao ADN de DRTF1/E2F em extractos de células F9 EC tal como anteriormente descrito (Girling et al., 1993). O local de ligação de E2F foi tomado a partir do promotor E2a de adenovirus (La Thangue et al., 1990). O péptido homólogo (+) ou não relacionado (-) foi adicionado ao ensaio de ligação ao ADN para avaliar a especificidade tal como descrito anteriormente (Girling et al., 1993). O anti-soro anti-DP-1 (24) foi criado contra um péptido derivado da sequência C-terminal de DP-1. Os ensaios de ligação ao ADN efectuados com proteínas de fusão GST foram tal como descrito anteriormente (Bandara et al., 1993; 1994), GST-DP-1, -E2F-1 (Bandara et al., 1993) e -E2F-5 (do residuo de aminoácido 2 ao 335) foram expressas e purificadas de acordo com procedimentos convencionais.

Análise de Northern. A análise de Northern dos níveis de ARN foi efectuada em ARN preparado a partir das linhas celulares indicadas através de procedimentos padrão. A sonda de E2F-5 continha 840 nucleótidos prolongando-se para a região não traduzida a 3'. A sonda de E2F-1 continha a sequência de codificação inteira do gene gerado por PCR e uma sonda para GAPDH serviu como controlo interno. 45 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

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Legendas das Figuras

Figura 1. Estrutura da E2F-5 humana. (A) Sequência nucleotidica e sequência de aminoácidos deduzida do ADNc da E2F-5 humana. (B) Representação esquemática da E2F-5 em comparação com E2F-1 e E2F-4. Os limites dos domínios conservados estão indicados através do número do aminoácido. SS em E2F-4 indica o motivo rico em serina.

Figura 2. Padrão de expressão da E2F-5 em linhas celulares humanas. (A) O Northern blot contendo ARN citoplasmático total das linhas celulares humanas indicadas foi hibridado com uma sonda de ADNc de E2F-5 humana. Foi utilizado ARN das seguintes linhas celulares humanas: CAMA, carcinoma da mama humana; A549, carcinoma do pulmão; MDA, carcinoma da 48 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ mama MDA-MD15 7; OVCAR, carcinoma do ovário; HS 578T, carcinoma da mama; LUCY, carcinoma do ovário; HT29, carcinoma do cólon; CEM, leucemia de células T; K562, eritroleucemia. (B) O mesmo filtro hibridou com uma sonda de a-tubulina de rato.

Figura 3. A E2F-5 possui um domínio de transactivação carboxi-terminal. Células U2-OS foram transfectadas com um plasmídeo repórter CAT ancorando a montante locais Gal4 (5 pg) na presença ou ausência de vectores de expressão Gal-4-E2F (1 pg) e 0,2 pg de pRSV-luciferase como controlo interno. A actividade de CAT foi normalizada para a actividade da luciferase para cada amostra. A actividade de CAT foi avaliada dois dias após a transfecção. Estão representadas as vezes de activação de Gal4-E2F sobre o gene repórter CAT sozinho. Os dados são representativos para pelo menos três experiências independentes feitas em duplicado.

Figura 4. E2F-5 e DP-1 cooperam na transactivação. Células U2-OS de osteossarcoma foram transfectadas com quantidades crescentes do vector de expressão pJ3-E2F-5 (1, 2 ou 5 pg) juntamente com 100 ng de pCMV-DP-1, tal como indicado. Em cada transfecção foram adicionados 2 pg de construção repórter (E2F4-CAT) e 0,2 pg de pRSV-Luciferase. A actividade de CAT foi normalizada para a actividade da luciferase para cada amostra. Os dados são representativos para pelo menos três experiências independentes feitas em duplicado.

Figura 5. Inibição da transactivação de E2F-5 por proteínas de bolso. Células U2-OS foram transfectadas com 5 pg de pJ3-E2F-5 e 100 ng de pCMV-DP-1 em combinação com pCMV-Rb (50 e 100 ng), pCMV-RbA22 (100 ng), pCMV-pl07 (50 e 100 ng), pCMVpl07DE (100 ng) ou pCMV-HA-pl30 (50, 100 e 500 ng). Juntamente com os plasmídeos de expressão, as células foram transfectadas com 2 pg de E2F4-CAT e 0,2 pg de pRSV-Lucif erase. A actividade de 49 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ CAT foi normalizada para ο controlo interno de luciferase. As vezes de activação foram calculadas relativamente ao nivel basal de E2F4-CAT que foi regulado para a unidade (1,0). Os dados são representativos para pelo menos três experiências independentes feitas em duplicado.

Figura 6. Complexos contendo E2F em células U2-OS transfectadas transientemente. Células de osteossarcoma U2-OS foram transientemente transfectadas com os vectores de expressão de E2F-5 e DP-1 na presença ou ausência dos vectores de expressão de pRB, pl07 ou pl30 tal como indicado. Após dois dias, extractos celulares inteiros foram preparados e incubados com um oligonucleótido marcado com 32P contendo um local de consenso de ligação ao ADN de E2F e foram sujeitos a electroforese em gel. A posição da sonda livre, do complexo de ADN E2F-5/DP-1 e do complexo E2F-5/proteina de bolso está indicada.

Figura 7. E2F-5 interage preferencialmente com pl30 in vivo. Células de carcinoma da mama CAMA humanas foram marcadas com [32P]-ortofosfato e os lisados de detergente não iónico foram sujeitos a imunoprecipitação sequencial. Numa primeira imunoprecipitação os lisados foram incubados com anticorpo de pRb, pl07 ou pl30 tal como indicado. O painel A mostra as primeiras imunoprecipitações com anticorpos específicos para pRb, pl07 e pl30 a partir de células CAMA. As proteínas associadas a pRb, pl07 e pl30 foram libertadas das proteínas de bolso imunoprecipitadas através de fervura em tampão contendo SDS e novamente imunoprecipitadas com anti-soro específico para E2F-5 (painel B) . Como controlo, as proteínas libertadas dos imunoprecipitados de pRB e pl07 foram novamente imunoprecipitadas com anticorpo anti-E2F-l (KH20) ou E2F-4 (RK13) (painel C) . As proteínas imunoprecipitadas foram separadas em géis de SDS-poliacrilamida a 7,5%, os géis foram secos e as proteínas foram detectadas através de autorradiografia. 50 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Figura 8

Estratégia para isolamento de E2F-5 de murídeo O "isco", lexa DP-1, foi utilizado para pesquisar uma biblioteca de ADNc marcada com um domínio de activação de embrião de ratinho de 14,5 d.p.c.

Figura 9

Sequência e comparação de E2F-5 de murídeo com outros membros da família E2F (a) Sequência nucleotídica juntamente com a sequência de resíduos de aminoácidos prevista de E2F-5. (b) Representação em diagrama e comparação de E2F-5 (meio) com E2F-1 (topo) e E2F-4 (baixo). A percentagem de identidades ao nível da sequência proteica está indicada entre E2F-5 e E2F-1, e E2F-5 e E2F-4. Os domínios partilhados entre os membros da família E2F estão indicados (Lees et ai., 1993). (c) Comparação da sequência de resíduos de aminoácidos nos domínios conservados dentro dos membros da família E2F. Os resíduos realçados são comuns a todos os membros da família, enquanto que os resíduos na caixa são comuns a E2F-4 e E2F-5. Os resíduos a cheio na região do fecho de leucina indicam hidrófobos numa hepta-repetição. Os resíduos na região da caixa DEF que são partilhados entre os membros da família E2F e DP-1 estão indicados pelas linhas.

Figura 10

Activação da transcrição dependente do local de E2F por E2F-5 e DP-1 em levedura (a) Sumário das construções repórter e efectora. (b) Os vectores de expressão de E2F-5 e dp-1 indicados foram transformados para levedura sozinhos (pistas 2 e 3) ou juntos (pista 4) e a actividade de p4xWT CYC1, que possui quatro locais E2F de tipo selvagem, foi avaliada. Em experiências paralelas, a actividade de p4xMT CYC1 não foi afectada em nenhuma das condições. Os dados apresentados derivaram de leituras em triplicado. 51 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Figura 11

Activação da transcrição por E2F-5 em levedura (a) Sumário das construções repórter e efectora. (b) A actividade de transcrição de pLEX.E2F-l (pista 2) ou pLEX-E2F-5 (pista 3) foi avaliada em levedura através do ensaio da actividade de pLexA-CYCl-lacZ. Os dados apresentados derivaram de leituras em triplicado.

Figura 12

Regulação pela proteína de bolso de E2F-5 (a) Sumário das construções repórter e efectora. (b) A actividade de transcrição de Gal-E2F-5 (pista 2) foi avaliada na presença de pRb de tipo selvagem (pista 3), pRbA22 (pista 4), pl07 (pista 5) e pl07AS (pista 6). Para comparação, foram efectuados tratamentos semelhantes com pG4 (pistas 7 a 10) . Os dados apresentados derivaram de leituras em triplicado.

Figura 13

E2F-5 é um componente fisiológico da ligação ao ADN de DRTF1/E2F em células F9 EC

Dois tipos de anti-soros criados contra péptidos distintos de diferentes regiões dentro de E2F-5 foram avaliados quanto ao seu efeito na actividade de ligação ao ADN de DRTF1/E2F em células F9 EC. Os soros anti-E2F-5, anti-péptido 1 (pistas 5 a 8) e anti-péptido 2 (pistas 9 a 12) foram avaliados na presença do péptido homólogo (+; pistas 5, 7, 9 e 11) ou não aparentado (-; pistas 6, 8, 10 e 12) . Para comparação, foi avaliado o efeito de anti-DP-1 (24) (pistas 1 a 4) na presença do péptido homólogo (pistas 1 e 3) ou de um péptido não aparentado (pistas 2 e 4) . Cada par de pistas (+ junto com -) representa tratamento com uma preparação de anti-soro diferente. Os complexos de ligação ao ADN DRTF1/E2F b/c (La Thangue et al.r 1990) estão indicados. 52 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Figura 14

Propriedades de ligação ao ADN de E2F-5 E2F-5, E2F-1 e DP-1 foram expressas como proteínas de fusão GST, purificadas e a sua actividade de ligação ao ADN avaliada através de retardamento em gel. Quer E2F-1 quer E2F-5 foram ensaiadas sozinhas (pistas 1 e 2, e 5, 6 e 7, respectivamente) ou juntas com uma concentração constante de DP-1 (pistas 3 e 4, e 8, 9 e 10) . A pista 11 mostra a sonda sozinha. A quantidade de proteína adicionada para E2F-1 foi de aproximadamente 50 ng (pistas 1 e 3) ou 100 ng (pistas 2 e 4), para E2F-5 25 ng (pistas 5 e 8), 50 ng (pistas 6 e 9) ou 100 ng (pistas 7 e 10), e para DP-1 50 ng em todas.

Figura 15 Níveis de ARN de E2F-5

Os níveis de ARN de E2F-5 foram comparados com E2F-1 nas linhas celulares indicadas. O nível de ARN de GAPDH foi avaliado como controlo interno.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:

(A) NOME: THE MEDlCAL RESEARCH COUNCIL

(B) RUA: 20 PARK CRESCENT

(C) CIDADE: LONDON

(E) PAÍS: REINO UNIDO

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): WIN 4AL

(A) NOME: VERENIGING HET NEDERLANDS KANKER INSTITUUT (B) RUA: PLESMANLAAN 121

(C) CIDADE: AMSTERDAM

(E) PAÍS: HOLANDA

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1066 CX

(A) NOME: NICHOLAS BARRIE LA THANGUE (B) RUA: LABORATORY OF EUKARYOTIC MOLECULAR GENETICS,

MRC NATIONAL INSTITUTE OF MEDlCAL RESEARCH, THE

RIDGEWAY, MILL HILL

(C) CIDADE: LONDON

(E) PAÍS: REINO UNIDO

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): NW7 1AA 53 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

(Α) ΝΟΜΕ: RENE BERNARDS

(Β) RUA: DIVISION OF MOLECULAR CARCINOGENESIS, THE

NETHERLANDS CÂNCER INSTITUTE, PLESMANLAAN 121 (C) CIDADE: AMSTERDAM

(E) PAÍS: HOLANDA

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1066 CX

(A) NOME: ELEONORE MARIELLE HIJMANS

(B) RUA: DIVISION OF MOLECULAR CARCINOGENESIS, THE NETHERLANDS CÂNCER INSTITUTE, PLESMANLAAN 121

(C) CIDADE: AMSTERDAM

(E) PAÍS: HOLANDA

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1066 CX (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: FACTOR DE TRANSCRIÇÃO E2F-5 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 25 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1748 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 31..1068 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l: 54 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ GGGGCCCGAC CACCGCGGGG CCGGGACGCG ATG GCG GCG GCA GAG CCC GCG AGC 54

Met Ala Ala Ala Glu Pro Ala Ser 1 5 TCG GGC CAG CAG GCG CCG GCA GGG CAG GGG CAG GGC CAG CGG CCG CCG 102 Ser Gly Gin Gin Ala Pro Ala Gly Gin Gly Gin Gly Gin Arg Pro Pro 10 15 20 CCG CAG CCT CCG CAG GCG CAA GCC CCG CAG CCG CCC CCG CCG CCG CAG 150 Pro Gin Pro Pro Gin Ala Gin Ala Pro Gin Pro Pro Pro Pro Pro Gin 25 30 35 40 CTC GGG GGC GCG GGG GGC GGC AGC AGC AGG CAC GAG AAG AGC CTG GGG 198 Leu Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Arg His Glu Lys Ser Leu Gly 45 50 55 CTG CTC ACT ACC AAG TTC GTG TCG CTG CTG CAG GAG GCC AAG GAC GGC 246 Leu ! λ , , LCU TL,* llll llll nu^ ΓΙIC W-.1 να i Ser 1 , LCU LCU PT ^ U 1 1 i Γ*1 , , U 1 U Λ 1 - Λ\ια Lys Asp Γ' 1 .. U 1^ 60 65 70 GTT CTG GAT CTC AAA GCG GCT GCT GAT ACT TTG GCT GTG AGG CAA AAA 294 Vai Leu Asp Leu Lys Ala Ala Ala Asp Thr Leu Ala Vai Arg Gin Lys 75 80 85 AGG AGA ATT TAT GAT ATC ACC AAT GTC TTA GAG GGA Απ GAC TTG ATT 342 Arg Arg Ile Tyr Asp Ile Thr Asn Vai Leu Glu Gly Ile Asp Leu Ile on nc j-j 1 ΛΛ 1UU GAA AAA AAG TCA AAA AAC AGT ATC CAG TGG AAA GGT GTA GGT GCT GGC 390 Glu Lys Lys Ser Lys Asn Ser Ile Gin Trp Lys Gly Vai Gly Ala Gly 105 110 115 120 TGT AAT ACT AAA GAA GTC ATA GAT AGA TTA AGA TAT cn AAA GCT GAA 438 Cys Asn Thr Lys Glu Vai Ile Asp Arg Leu Arg Tyr Leu Lys Ala Glu 125 130 135 ATT GAA GAT CTA GAA CTG AAG GAA AGA GAA CTT GAT CAG CAG AAG TTG 486 11 e Glu Asp Leu Glu Leu Lys Glu Arg Glu Leu Asp Gin Gin Lys Leu 140 145 150 TGG CTA CAG CAA AGC ATC AAA AAT GTG ATG GAC GAT TCC ATT AAT AAT 534 Trp Leu Gin Gin Ser Ile Lys Asn Vai Met Asp Asp Ser ile Asn Asn 155 160 165 AGA TTT TCC TAT GTA ACT CAT GAA GAC ATC TGT AAT TGC TTT AAT GGT 582 Arg Phe Ser Tyr Vai Thr His Glu Asp Ile Cys Asn Cys Phe Asn Gly 170 175 180 GAT ACA cn TTG GCC ATT CAG GCA CCT TCT GGT ACA CAA CTG GAG GTA 630 Asp Thr Leu Leu AI a Ile Gin Ala Pro Ser Gly Thr Gin Leu Glu Vai 185 190 195 200 CCC ATT CCA GAA ATG GGT CAG AAT GGA CAA AAG AAA TAC CAG ATC AAT 678 726 55 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Pro Ile Pro Glu Met Gly Gin Asn Gly Gin Lys Lys Tyr Gin Ile Asn 205 210 215 CTA AAG AGT CAT TCA GGA CCT ATC CAT GTG CTG CTT ATA AAT AAA GAG Leu Lys Ser His Ser Gly Pro Ile His Vai Leu Leu Ile Asn Lys Glu 220 225 230 TCG AGT TCA TCT AAG CCC GTG GTT TTT CCT GTT CCC CCA CCT GAT GAC Ser Ser Ser Ser Lys Pro Vai Vai Phe Pro Vai Pro Pro Pro Asp Asp 235 240 245 CTC ACA CAG CCT TCC TCC CAG TCC TTG ACT CCA GTG ACT CCA CAG AAA Leu Thr Gin Pro Ser Ser Gin Ser Leu Thr Pro Vai Thr Pro Gin Lys 250 255 260 TCC AGC ATG GCA ACT CAA AAT CTG CCT GAG CAA CAT GTC TCT GAA AGA Ser Ser Het Ala Thr Gin Asn Leu Pro Glu Gin His Vai Ser Glu Arg 265 270 275 280 AGC CAG GCT CTG CAG CAG ACA TCA GCT ACA GAT ATA TCT TCA GCA GGA Ser Gin Ala Leu Gin Gin Thr Ser Ala Thr Asp Ile Ser Ser Ala Gly 285 290 295 TCT ATT AGT GGA GAT ATC ATT GAT GAG TTA ATG TCT TCT GAC GTG TTT Ser Ile Ser Gly Asp Ile Ile Asp Glu Leu Met Ser Ser Asp Vai Phe 300 305 310 CCT CTC TTA AGG CTT TCT CCT ACC CCG GCA GAT GAC TAC AAC TTT AAT Pro Leu Leu Arg Leu Ser Pro Thr Pro Ala Asp Asp Tyr Asn Phe Asn 315 320 325 TTA GAT GAT AAC GAA GGA GTT TGT GAT CTG TTT GAT GTC CAG ATA CTA Leu Asp Asp Asn Glu Gly Vai Cys Asp Leu Phe Asp Vai Gin Ile Leu 330 335 340

ΑΑΤ ΤΑΤ TAGATTCCAT GGAAACTTGG GACTGTTATC TACCTCTAAC TGTGTAACAT

Asη Tyr 345

TTTAGACTTC TTAATAACCT ΑΑΑΤΑΤΓΤΑΑ AATAATGAAT GTAACACCTT TTTTAGTTCA CTGATTCTGA AGTGTTCTTC CCTAATACTT TCTnACTTC ACAAAACTTC AACCATAAAA ACAAAGGGCT CTGATTGCTT TAGGGGATAA GTGA1TTAAT ATTCACAAAC GTCCCCACTC CCAAAAGTAA CTATATTCTG GATTTCAACT TTTCTTCTAA TTGTGAATCC TTCCGTTTTT TCTTCTTAAG GAGGAAAGTT AAAGGACACT ACAGGTCATC AAAAACAAGT TGGCCAAGGA CTCATTACTT GTCTTATATT TTTACTGCCA CTAAACTGCC TGTATTTCTG TATGTCCTTC TATCCAAACA GACGTTCACT GCCACTTGTA AAGTGAAGGA TGTAAACGAG GATATATAAC TGTTTCAGTG AACAGATTTT GTGAAGTGCC TTCTGmTA GCACTTTAAG TTTATCACAT TTTGTTGACT TCTGACATTC CACTTTCCTA GGTTATAGGA AAGATCTGTT TATGTAGTTT GTTTTTAAAA TGTGCCAATG CCTGTACATT AACAAGATTT TTAAAAATAA AATTGTATAA AACATTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 346 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 774 822 870 918 966 1014 1062 1118 1178 1238 1298 1358 1418 1478 1538 1598 1658 1718 1748 56 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met Ala Ala Ala Glu Pro Ala Ser Ser Gly Gin Gin Ala Pro Ala Gly 1 5 10 15 Gin Gly Gin Gly Gin Arg Pro Pro Pro Gin Pro Pro Gin Ala Gin Ala 20 25 30 Pro Gin Pro Pro Pro Pro Pro Gin Leu Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Ser Arn Hi s Glu Lys Ser Leu Gly Leu Leu Thr Thr Lys Phe Vâl Ssr *50 "55 '60 Leu Leu Gin Glu Ala Lys Asp Gly Vai Leu Asp Leu Lys Ala Ala Ala 65 70 75 80 Asp Thr Leu Ala Vai Arg Gin Lys Arg Arg Ile Tyr Asp Ile Thr Asn 85 90 95 Vai Leu Glu Gly Ile Asp Leu Ile Glu Lys Lys Ser Lys Asn Ser Ile 100 105 110 Gin Trp Lys Gly Vai Gly Ala Gly Cys Asn Thr Lys Glu Vai Ile Asp 115 120 125 Arg Leu Arg Tyr Leu Lys Ala Glu Ile Glu Asp Leu Glu Leu Lys Glu 130 135 140 Arg Glu Leu Asp Gin Gin Lys Leu Trp Leu Gin Gin Ser Ile Lys Asn 145 150 155 160 Vai Met Asp Asp Ser Ile Asn Asn Arg Phe Ser Tyr Vai Thr His Glu 165 170 175 Asp Ile Cys Asn Cys Phe Asn Gly Asp Thr Leu Leu Ala Ile Gin Ala 180 185 190 Pro Ser Gly Thr Gin Leu Glu Vai Pro Ile Pro Glu Met Gly Gin Asn 195 200 205 Gly Gin Lys Lys Tyr Gin Ile Asn Leu Lys Ser His Ser Gly Pro Ile 210 215 220 His Vai Leu Leu Ile Asn Lys Glu Ser Ser Ser Ser Lys Pro Vai Vai 225 230 235 240 Phe Pro Vai Pro Pro Pro Asp Asp Leu Thr Gin Pro Ser Ser Gin Ser 245 250 255

Leu Thr Pro Vai Thr Pro Gin Lys Ser Ser Met Ala Thr Gin Asn Leu 57 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ 260 265 270 Pro Glu Gin His Vai Ser Glu Arg Ser Gin Ala Leu Gin Gin Thr Ser 275 280 285 Ala Thr Asp Ile Ser Ser Ala Gly Ser Ile Ser Gly Asp Ile Ile Asp 290 295 300 Glu Leu Het Ser Ser Asp Vai Phe Pro Leu Leu Arg Leu Ser Pro Thr 305 310 315 320 Pro Ala Asp Asp Tyr Asn Phe Asn Leu Asp Asp Asn Glu Gly Vai Cys 325 330 335 Asp Leu Phe Asp Vai Gin Ile Leu Asn Tyr 340 345 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1340 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 16..1020 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: 51 99 147 195 243 291 AGGGCCGCGG CGGTG ATG GCG GCG GCG GAG CCC ACG AGC TCT GCT CAG CCC Met Ala Ala Ala Glu Pro Thr Ser Ser Ala Gin Pro 350 355

ACG CCG CAG GCC CAG GCT CAG CCG CCG CCG CAT GGG GCG CCA TCC TCG Thr Pro Gin Ala Gin Ala Gin Pro Pro Pro His Gly Ala Pro Ser Ser 360 365 370 CAG CCG TCG CGG CG C TCG CGG GGG GGC AGC AGC CGG CAC GAG AAG AGC Gin Pro Ser Arg Arg Ser Arg Gly Gly Ser Ser Arg His Glu Lys Ser 375 380 385 390 CTG GGC TTG CTT ACC ACC AAA TC GTG TCG TTG CTG CAG GAG GCG CAG Leu Gly Leu Leu Thr Thr Lys Phe Vai Ser Leu Leu Gin Glu Ala Gin 395 400 405 GAC GGC GTC CTG GAT CTC AAA GCG GCT GCA GAT ACC TTG GCT GTG AGG Asp Gly Vai Leu Asp Leu Lys Ala Ala Ala Asp Thr Leu Ala Vai Arg 410 415 420 CAA AAG CGA AGA ATT TAT GAT ATC ACC AAT GTC TTA GAG GGA ATT GAT Gin Lys Arg Arg lie Tyr Asp Ile Thr Asn Vai Leu Glu Gly Ile Asp 425 430 435 CTA ATT GAA AAA AAA TCA AAG AAC AGT ATC CAG TGG AAG GGT GTA GGT 339 58 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Leu Ile Glu Lys Lys Ser Lys Asn Ser Ile Gin Trp Lys Gly Vai Gly. 440 445 450 GCT GGC TGT AAT ACT AAA GAA GTT ATC GAT AGA TTA AGG TGT CTT AAA 387 Ala Gly Cys Asn Thr Lys Glu Vai Ile Asp Arg Leu Arg Cys Leu Lys 455 460 465 470 GCT GAA ATT GAA GAT CTC GAA TTG AAG GAA AGA GAA cn GAC CAG CAG 435 Ala Glu Ile Glu Asp Leu Glu Leu Lys Glu Arg Glu Leu Asp Gin Gin 475 480 485 AAG TTG TGG CTA CAG CAA AGC ATC AAA AAT GTG ATG GAA GAC TCC ATT 483 Lys Leu Trp Leu Gin Gin Ser Ile Lys Asn Vai Met Glu Asp Ser Ile 490 495 500 AAT AAC AGA TTT TCT TAT GTA ACT CAC GAA GAC ATC TGC AAT TGC TTT 531 Asn Asn Arg Phe Ser Tyr Vai Thr His Glu Asp Ile Cys Asn Cys Phe 505 510 515 CAT GGT GAT ACA CTG TTG GCC ATT CAG· GCA CCT TCT GGT ACA CAG CTG 579 His Gly Asp Thr Leu Leu Ala Ile Gin Ala Pro Ser Gly Thr Gin Leu 520 525 530 GAA GTA CCT ATT CCA GAA ATG GGA CAG AAT GGA CAA AAG AAA TAC CAG 627 Glu Vai Pro Ile Pro Glu Met Gly Gin Asn Gly Gin Lys Lys Tyr Gin 535 540 545 550 ATA AAT CTG AAG AGT CAC TCA GGG CCT ATC CAT GTG CTA CTT ATA AAT 675 Ile Asn Leu Lys Ser His Ser Gly Pro Ile His Vai Leu Leu Ile Asn 555 560 565 AAA GAG TCC AGT TCA TCT AAG CCA GTG GTT ITT CCT GTT CCC CCA CCT 723 Lys Glu Ser Ser Ser Ser Lys Pro Vai Vai Phe Pro Vai Pro Pro Pro 570 575 580 GAT GAC CTC ACA CAG CCT TCC TCC CAG TCC TCA ACT TCA GTG ACT CCA 771 Asp Asp Leu Thr Gin Pro Ser Ser Gin Ser Ser Thr Ser Vai Thr Pro 585 590 595 CAG AAA TCC ACC ATG GCT GCT CAA AAC CTG CCT GAG CAG CAT GTT TCC 819 Gin Lys Ser Thr Met Ala Ala Gin Asn Leu Pro Glu Gin His Vai Ser 600 605 610 GAA AGA AGC CAG ACT TTC CAG CAG ACA CCA GCT GCA GAA GTA TCT TCA 867 Glu Arg Ser Gin Thr Phe Gin Gin Thr Pro Ala Ala Glu Vai Ser Ser 615 620 625 630 GGA TCT ATT AGT GGA GAC ATC ATT GAT GAA CTG ATG TCT TCT GAT GTG 915 Gly Ser Ile Ser Gly Asp Ile Ile Asp Glu Leu Met Ser Ser Asp Vai 635 640 645 TTT CCT CTT TTA CGG CTT TCT CCT ACC CCA GCA GAT GAC TAC AAC TTT 963 Phe Pro Leu Leu Arg Leu Ser Pro Thr Pro Ala Asp Asp Tyr Asn Phe 650 655 660 AAT TTA GAT GAT AAT GAA GGA GTT TGT GAT CTG TTT GAT GTT CAG ATA 1011 Asn Leu Asp Asp Asn Glu Gly Vai Cys Asp Leu Phe Asp Vai Gin Ile 665 670 675 CTA MT ΤΑΤ TAGATTCCAT GGAAACTTGG GACTATTATC TACCTCTATA 1060 1120 59 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Leu Asn Tyr 680 1180 1240 1300 1340

ACATTTTAGA ATTCTTTAAT AACCTAAGTA TTTAAAATTA TGAATGTAAC ACCTfTTTAG TTCACTGATT CTGAAGTGTT CTTCCCTAAC ΑΤΠΤΑΓΠΤ TTACTTCACA AAACTTGAAA GGGATATGCT GCTTCTGGGG GGTAGAGGTA AGATTACCTG TCCAGCAGCT GCCCCTCCAG TGACCACATT CAGirTCTIT CAGTAGCTTC CTCTCCTGAG AGGCAGTTAC AGCAGGCTCA GTTCATCCAA ACAAAACATT GTCAGAAGTA CACTTATTTG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 335 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Met Ala Ala Ala Glu Pro Thr Ser Ser Ala Gin Pro Thr Pro Gin Ala 1 5 10 15 Gin Ala Gin Pro Pro Pro His Gly Ala Pro Ser Ser Gin Pro Ser Arg 20 25 30 Arg Ser Arg Gly Gly Ser Ser Arg His Glu Lys Ser Leu Gly Leu Leu 35 40 45 Thr Thr Lys Phe Vai Ser Leu Leu Gin Glu Ala Gin Asp Gly Vai Leu 50 55 60 Asp Leu Lys Ala Ala Ala Asp Thr Leu Ala Vai Arg Gin Lys Arg Arg 65 70 75 80 Ile Tyr Asp Ile Thr Asn Vai Leu Glu Gly Ile Asp Leu Ile Glu Lys 85 90 95 1 wr ujro C/N·* 30 1 Λ r* tr» nai i 30 Πθ Π ~ um Trp Lys Π .. uiy ll~T Vd í my AI. Hld Λ1 . . tuy Cys Asn 100 105 110 Thr Lys Glu Vai Ile Asp Arg Leu Arg Cys Leu Lys Ala Glu Ile Glu 115 120 125 Asp Leu Glu Leu Lys Glu Arg Glu Leu Asp Gin Gin Lys Leu Trp Leu 130 135 140 Gin Gin Ser Ile Lys Asn Vai Met Glu Asp Ser Ile Asn Asn Arg Phe 145 150 155 160 Ser Tyr Vai Thr His Glu Asp Ile Cys Asn Cys Phe His Gly Asp Thr 165 170 175 Leu Leu Ala Ile Gin Ala Pro Ser Gly Thr Gin Leu Glu Vai Pro Ile 180 185 190 60 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ

Pro Glu Met Gly Gin Asn Gly Gin Lys Lys Tyr Gin Ile Asn Leu Lys 195 200 205 Ser His Ser Gly Pro Ile His Vai Leu Leu Ile Asn Lys Glu Ser Ser 210 215 220 Ser Ser Lys Pro Vai Vai Phe Pro Vai Pro Pro Pro Asp Asp Leu Thr 225 230 235 240 Gin Pro Ser Ser Gin Ser Ser Thr Ser Vai Thr Pro Gin Lys Ser Thr 245 250 255 Met Ala Ala Gin Asn Leu Pro Glu Gin His Vai Ser Glu Arg Ser Gin 260 265 270 Thr Phe Gin Gin Thr Pro Ala Ala Glu Vai' Ser Ser Gly Ser Ile Ser 275 280 285 Gly Asp Ile Ile Asp Glu Leu Met Ser Ser Asp Vai Phe Pro Leu Leu 290 295 300 Arg Leu Ser Pro Thr Pro Ala Asp Asp Tyr Asn Phe Asn Leu Asp Asp 305 310 315 320 Asn Glu Gly Vai Cys Asp Leu Phe Asp Vai Gin Ile Leu Asn Tyr 325 330 335 INFORMAÇÃO PARA ; SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Lys Ser Pro Gly Glu Lys Ser Arg Tyr Glu Thr Ser Leu Asn Leu Thr 1 5 10 15 Thr Lys Arg Phe Leu Glu Leu Leu Ser His Ser Ala Asp Gly Vai Vai 20 25 30 Asp Leu Asn Trp Ala Ala Glu Vai Leu Lys Vai Gin Lys Arg Arg Ile 35 40 45 Tyr Asp Ile Thr Asn Vai Leu Glu Gly Ile Gin Leu Ile Ala Lys Lys 50 55 60 Ser Lys Asn His Ile Gin Trp Leu Gly Ser 65 70 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 61 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Lys Ser Pro Gly Glu i— << to Thr Arg Tyr Asp Thr ' Ser Leu Asn Leu Leu 1 5 10 15 Pro Lys Lys Phe Ile Tyr Leu Leu Ser Glu Ser Glu Asp Gly Vai Leu 20 25 30 Acrs 1 Ckl 1 Uty Aco nj 1 1 T rr» 1 1 u Λ1 ^ r\ i u AI * Γ\ 1 Q m.. U 1 u v α i 1 /“\ Γ 1 LCU Lys v α i m * VJ | | I 1 W l~ L Λ /-\i U Λ Ml U TI ~ 1 1 tí njK 35 1 I p 40 j 45 ' 11 j • >1 3 Tyr Asp Ile Thr Asn Vai Leu Glu Gly Ile Gin i Leu Ile Arg Lys Lys 50 55 60 Arg Lys Asn His Ile Gin Trp Vai Gly Arg 65 70 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:

Lys Ser Pro Gly Glu Lys Thr Arg Tyr Asp Thr Ser Leu Asn Leu Leu 1 5 10 15 Thr Lys Lys Phe Ile Gin Leu Leu Ser Gin Ser Pro Asp Gly Vai Leu 20 25 30 Asp Leu Asn Lys Ala Ala Glu Vai Leu Lys Vai Gin Lys Arg Arg Ile 35 40 45 Tyr Asp Ile Thr Asn Vai Leu Glu Gly Ile His Leu Ile Lys Lys Lys 50 55 60 Ser Lys Asn His Vai Gin Trp Met Gly Cys 65 70 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 69 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 62 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Ser Arg Hls Glu Lys Ser Leu Asn Leu Leu Thr Thr Lys Phe Vai Gin 1 5 10 15

Leu Leu Gin Glu Ala Lys Asp Gly Vai Leu Asp Leu Lys Leu Ala Ala 20 25 30 '

Δςη Thr I pii Δ1Ά \/al Arn Gin I vc Am ârn Tio Tyr 4cn Tio Thr Arn ' ιι·ι i- ^ »«i ν<·ιι i-j·^ ' ί y » u y 1 I ^ 1^1 TIO 1 I V< ilil ΠΟΙ I 35 40 45

Vai Leu Glu Gly IIe Gly Leu Ile Glu Lys Lys Ser Lys Asn Ser Thr 50 55 60

Gin Trp Arg Gly Vai 65 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 75 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:

Arg Ser Arg Gly Gly Ser Ser Arg His Glu Lys Ser Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 Thr Thr Lys Phe Vai Ser Leu Leu Gin Glu Ala Gin Asp Gly Vai Leu 20 25 30 Asp Leu Lys Ala Ala Ala Asp Thr Leu Ala Vai Arg Gin Lys Arg Arg 35 40 45 Ile Tyr Asp. Ile Thr Asn Vai Leu Glu Gly Ile Asp Leu Ile Glu Lys 50 55 60 Lys Ser Lys Asn Ser Ile Gin Trp Lys Gly Vai 65 70 75 INFORMAÇÃC ) PARA SEQ ID NO: : 10 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 63 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10:

Ser Met Lys Vai Cys Glu Lys Gin Arg Lys Gly Thr Thr Ser Tyr Asn 1 5 10 15 Glu Vai Ala Asp Glu Leu Vai Ala Glu Phe Ser Ala Ala Asp Asn His 20 25 30 11 e Leu Pro Asn Glu Ser Ala Tvr Asp Gin Lvs Asn Ile Arg Arg Arg 35 40 45 Vai Tyr Asp Ala Leu Asn Vai Leu Met Ala Met Asn Ile Ile Ser Lys 50 55 60 Glu Lys Lys Glu 11 e Lys Trp 11 e Gly Leu 65 70 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

Leu Thr Gin Asp Leu Arg Gin Leu Gin Glu Ser Glu Gin Gin Leu Asp 1 5 10 15

His Leu Met Asn IIe Cys Thr Thr Gin Leu Arg Leu Leu 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

Leu Gly Gin Glu Leu Lys Glu Leu Met Asn Thr Glu Gin Ala Leu Asp 15 10 15

Gin Leu IIe Gin Ser Cys Ser Leu Ser Phe Lys His Leu 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 64 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13:

Leu Ser Lys Glu Vai Thr Glu Leu Ser Gin Glu Glu Lys Lys Leu Asp 15 10 15

Glu Leu IIe Gin Ser Cys Thr Leu Asp Leu Lys Leu Leu 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14:

Leu Lys Ala Glu Ile Glu Glu Leu Gin Gin Arg Glu Gin Glu Leu Asp 1 5 10 15

Gin His Lys Vai Trp Vai Gin Gin Ser Ile Arg Asn Vai 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15:

Leu Lys Ala Glu Ile Glu Asp Leu Glu Leu Lys Glu Arg Glu Leu Asp 1 5 10 15

Gin Gin Lys Leu Trp Leu Gin Gin Ser Ile Lys Asn Vai 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16:

Asn Phe Gin Ile Ser Leu Lys Ser Lys Gin Gly Pro Ile Asp Vai Phe 1 5 10 15

Leu Cys Pro Glu Glu 20 - 65 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID Ν0:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

Asn Leu Gin Ile Tyr Leu Lys Ser Thr Gin Gly Pro Ile Glu Vai Tyr 15 10 15

Leu Cys Pro Glu Glu 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18:

Ser Leu Gin Ile His Leu Ala Ser Ile Gin Gly Pro Ile Glu Vai Tyr 15 10 15

Leu Cys Pro Glu Glu 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19:

Lys Tyr Gin Ile His Leu Lys Ser Vai Ser Gly Pro Ile Glu Vai Leu 15 10 15

Leu Vai Asn Lys Glu 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ 6 6 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20:

Lys Tyr Gin IIe Asn Leu Lys Ser His Ser Gly Pro IIe His Vai Leu 1 ' 5 10 15

Leu IIe Asn Lys Glu 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21:

Ala Leu Asp Tyr His Phe Gly Leu Glu Glu Gly Glu Gly IIe Arg Asp 1.5 10 15

Leu Phe Asp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0: 22:

Gln Asp Asp Tyr Leu Trp Gly Leu Glu Ala Gly Glu Gly IIe Ser Asp 1 5 10 15

Leu Phe Asp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 67 ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23:

Gin Glu Asp Tyr Leu Leu Ser Leu Gly Glu Glu Glu Gly Ile Ser Asp 15 10 15

Leu Phe Asp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) .TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24:

Asp His Asp Tyr Ile Tyr Asn Leu Asp Glu Ser Glu Gly Vai Cys Asp 15 10 15

Leu Phe Asp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25:

Asp Asp Tyr Asn Phe Asn Leu Asp Asp Asn Glu Gly Vai Cys Asp Leu 15 10 15

Phe Asp

Lisboa

Claims (22)

1. ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido compreendendo: (a) a proteína da Figura IA ou 9A; (b) uma proteína possuindo pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com (a) que pode funcionar como factor de transcrição de mamífero; (c) um fragmento da proteína da Figura IA ou 9A de pelo menos 30 aminoácidos capaz de formar um complexo com uma proteína DP, pl07 e/ou pl30.
2. 2. Polipéptido de acordo coma reivindicação 1 possuindo um marcador de revelação ou detectável.
3. 3. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2 fixado numa fase sólida.
4. 4. Composição compreendendo um polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2 juntamente com um transportador ou um diluente.
5. 5. Polinucleótido que compreende: (a) uma sequência de nucleótidos mostrada na Figura IA ou 9A; (b) uma sequência complementar a (a); ou (c) uma sequência codificando um polipéptido tal como definido na reivindicação 1.
6. 6 . Polinucleótido de acordo com a reivindicação 5 que é um polinucleótido de ADN.
7. 7. Polinucleótido de cadeia dupla compreendendo um polinucleótido de acordo com a reivindicação 5 ou 6 e a sua sequência complementar.
8. 8. Polinucleótido consistindo num fragmento de pelo menos 25 nucleótidos de comprimento dos polinucleótidos possuindo a sequência mostrada na Figura IA ou 9A.
9. 9. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 5 ou 6 possuindo um marcador de revelação ou detectável. ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ 2/3
10. 10. Vector compreendendo um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7 ou 9.
11. 11. Vector de acordo com a reivindicação 10 que é um vector replicável recombinante compreendendo uma sequência de codificação que codifica um polipéptido tal como definido na reivindicação 1.
12. 12. Célula hospedeira compreendendo um vector de acordo com a reivindicação 10.
13. 13. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12 transformada, ou transfectada, com um vector recombinante de acordo com a reivindicação 11.
14. 14. Célula hospedeira transformada com um vector recombinante de acordo com a reivindicação 10 em que a sequência de codificação está operativamente ligada a uma sequência de controlo capaz de proporcionar a expressão da sequência de codificação pela célula hospedeira.
15. 15. Processo para preparação de um polipéptido tal como definido na reivindicação 1, compreendendo o processo a cultura de uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14 sob condições que proporcionam a expressão do vector recombinante da sequência de codificação, e recuperação do polipéptido expresso.
16. 16. Ensaio de pesquisa para identificação de agentes quimioterapêuticos putativos para o tratamento de doença proliferativa ou virai que compreende: (A) colocar em contacto: (i) um polipéptido DP; (ii) um polipéptido tal como definido na reivindicação 1; e (iii) um agente quimioterapêutico putativo; sob condições nas quais os componentes (i) e (ii) na ausência de (iii) formam um complexo; e (B) medir o grau no qual o componente (iii) é capaz de destruir, interferir ou inibir a actividade do complexo. ΕΡ Ο 809 695 /ΡΤ 3/3
17. 17. Ensaio de acordo com a reivindicação 16 em que o complexo de (i) e (ii) é medido pela sua capacidade para se ligar a um local de ligação ao ADN de E2F in vitro.
18. 18. Ensaio de acordo com a reivindicação 16 em que o complexo de (i) e (ii) é medido pela sua capacidade para activar in vivo um promotor compreendendo um local de ligação de E2F ligado a um gene repórter.
19. 19. Ensaio de acordo com a reivindicação 18 em que o ensaio é efectuado numa célula de levedura, numa célula de insecto ou numa célula de mamífero.
20. 20. Ensaio de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19 em que o agente quimioterapêutico putativo é um fragmento de 10 ou mais aminoácidos de um polipéptido tal como definido nas partes (a) a (c) da reivindicação 1.
21. 21. Polipéptido tal como definido na reivindicação 1, vector tal como definido na reivindicação 10 ou 11 ou célula hospedeira tal como definida na reivindicação 12, 13 ou 14, para utilizar num método de tratamento do corpo humano ou animal.
22. 22. Composição farmacêutica compreendendo um polipéptido tal como definido na reivindicação 1, um vector tal como definido na reivindicação 10 ou 11 ou uma célula hospedeira tal como definida na reivindicação 12, 13 ou 14 e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Lisboa