PL204844B1

PL204844B1 - Izolowany polinukleotyd, polinukleotyd antysensowny, izolowany polipeptyd, przeciwciało monoklonalne lub jego fragment wiążący antygen, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza transformowana lub transfekowana wektorem ekspresyjnym, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie izolowanego polipeptydu

Info

Publication number: PL204844B1
Application number: PL365226A
Authority: PL
Inventors: Eric Ferrandis; Y Ferrer Jose-Antonio Camara; Jean Martinez; Christophe Thurieau
Original assignee: Centre Nat Rech Scient; Sod Conseils Rech Applic
Priority date: 2001-03-01
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2010-02-26
Also published as: FR2821624A1; JP2004527240A; CZ20032670A3; RU2307666C2; RU2003129163A; WO2002070700A1; AU2002335492B2; IL157091A0; HUP0303312A3; CA2437535C; DE60217651D1; EP1368474A1; US20040197783A1; KR100869190B1; CN1494591A; ATE351906T1; US7214533B2; CA2437535A1; BR0207253A; PL365226A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowany polinukleotyd, polinukleotyd antysensowny, izolowany polipeptyd, przeciwciało monoklonalne lub jego fragment wiążący antygen, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza transformowana lub transfekowana wektorem ekspresyjnym kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie izolowanego polipeptydu.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają modulację proliferacji komórek rakowych oraz określenie stopnia złośliwości nieprawidłowej proliferacji komórek.

Rak jest największym problemem zdrowotnym na świecie. Chociaż w ostatnich latach nastąpił znaczący postęp w wykrywaniu i leczeniu raka, aktualnie nie istnieje żadna szczepionka lub inna uniwersalna metoda zapobiegania lub leczenia raka. Umiejętne postępowanie z chorobą obejmuje połączenie możliwie wczesnej diagnozy i agresywnego leczenia obejmującego szereg elementów, takich jak chirurgia, radioterapia, chemoterapia albo również leczenie hormonalne. Wyboru sposobu leczenia danego raka często dokonuje się na podstawie parametrów prognostycznych obejmujących analizę konkretnych markerów guzów. Jednak, zastosowanie ustalonych markerów często prowadzi do wyniku, który jest trudny do interpretacji i obserwuje się stale wzrastającą śmiertelność licznych pacjentów z rakiem.

Rak sutka i rak prostaty są najczęstszymi nowotworami złośliwymi. W USA rocznie diagnozuje się 400 000 nowych przypadków i każdego roku przeciętnie 100 000 kobiet i mężczyzn umiera z powodu tej choroby (Harris i wsp., New Eng. J.Med. (1992), 327, 319, 390 i 473).

Stwierdzono, że choroby te pojawiają się podczas wieloczynnikowego procesu obejmującego mutacje w ograniczonej liczbie genów, być może 10 lub mniej. Mutacje te prowadzą do zmiany wzrostu i modulacji proliferacji komórkowej tkanek, pozwalając im na wzrost niezależnie od normalnych kontroli komórkowych i tworzenie przerzutów oraz unikanie kontrolnego mechanizmu odpornościowego. Klasy genów włączonych w raka sutka i prostaty mogą być wysoce specyficzne dla tych klas nowotworów. W szczególności, mutacje w genach włączonych w odpowiedzi hormonalne (receptory i ligandy klasy estrogenów, progesteronu albo też testosteronu) są szczególnie ważne, ponieważ prawdopodobnie kierują komórki do proliferacji przez nadawanie im oporności na przeciwnowotworowe działanie tych hormonów.

Ponadto, często występują zmiany w genach kodujących czynniki wzrostowe, cząsteczki translacji sygnału jak również czynniki transkrypcyjne i podlegają przemianom, które z kolei są włączone w rozwój i postę p nowotworu (King, Nature Genetics (1992), 2.125).

Do dnia dzisiejszego nierozwiązanym pytaniem jest natura zmian ekspresji genu, które pojawiają się w ludzkich komórkach guzowych w nieodwracalny sposób prowadząc do różnicowania komórek. Tym niemniej informacja ta jest jednak bardzo ważna dla określenia, na poziomie cząsteczkowym, diagramów regulacyjnych ekspresji genu włączonego we wzrost komórki i różnicowania się komórek ludzkich raka prostaty i sutka. Dlatego istnieje pilna potrzeba identyfikacji sekwencji genu włączonych w nieodwracalne końcowe różnicowanie.

Ostatnio, gdy zgłaszający był już w posiadaniu opisanego poniżej wynalazku, w bazie danych Genbank ujawniono sekwencję o Id. Sekw. Nr 4 pod numerem dostępu AK000755 i numerem identyfikacyjnym 7021039, jednak bez wskazania aktywności białek, które mogą być kodowane przez tę sekwencję.

Przedmiotem obecnego wynalazku jest izolowany polinukleotyd obejmujący sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 5. Przedmiotem jest też anty-sensowny polinukleotyd obejmujący sekwencję komplementarną do tego izolowanego polinukleotydu obejmującego sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 5. Wynalazek dotyczy też izolowanego polinukleotydu o sekwencji nukleotydowej Id. Sekw. Nr 9 oraz izolowanego polinukleotydu o sekwencji nukleotydowej komplementarnej do sekwencji nukleotydowej według Id. Sekw. Nr 9.

Ponadto w zakres wynalazku wchodzi izolowany polipeptyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 8. Polipeptyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 8 jest kodowany przez fragment polinukleotydy o sekwencji polinukleotydowej Id. Sekw. Nr 5 zawarty między zasadami w pozycji 420 (kodon inicjacji ATG kodujący metioninę) i 861 (kodon stop UAA) tj. przez sekwencję polinukleotydową Id. Sekw. Nr 9.

Wynalazek dotyczy też wektora ekspresyjnego obejmującego izolowany polinukleotyd, który stanowi izolowany polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej Id. Sekw. Nr 5 i komórki gospodarza transformowanej lub transferowanej wektorem ekspresyjnym według wynalazku. Ponadto wynalazek dotyczy przeciwciała monoklonalnego, lub jego fragmentu wiążącego antygen, które specyficznie wiąże izolowany polipeptyd o sekwencji według Id. Sekw. Nr 8.

PL 204 844 B1

W zakres wynalazku wchodzi również izolowany polipeptyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 8 do stosowania jako lek.

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji farmaceutycznej zawierającej substancję czynną, którą jest izolowany polipeptyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 8 oraz jedną lub więcej dopuszczalnych farmaceutycznie zaróbek.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie izolowanego polipeptydu o sekwencji Id. Sekw. Nr 8 do wytwarzania leku do leczenia choroby proliferacyjnej, którą jest rak.

Izolowany polinukleotydy obejmujący sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 5 oraz o Id. Sekw. Nr 9 może być stosowany do leczenia choroby proliferacyjnej.

Przeciwciało monoklonalne, lub jego fragment wiążący antygen, które specyficznie wiążą izolowany polipeptyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 8, tj. wiążą wyizolowany polipeptyd kodowany przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 9 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 9 może także być zastosowany do wytwarzania leku do leczenia choroby proliferacyjnej, którą jest rak.

Korzystnie opisanymi wyżej lekami leczy się raka wybranego z grupy składającej się z raka prostaty, raka sutka, raka płuc i raka okrężniczo-odbytniczego.

Polipeptydy według wynalazku można wykorzystać do określania, czy guz u pacjenta jest złośliwy, sposobem, który obejmuje określenie w próbce guza otrzymanej od pacjenta, stężenia izolowanego polipeptydu obejmującego przynajmniej:

- albo fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 5 albo przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 5,

- lub fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 4 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 4, a izolowany polipeptyd ma przynajmniej jedną odpornościową i/lub biologiczną aktywność charakterystyczną dla białka związanego z modulacją proliferacji komórkowej.

W szczególności w tym sposobie przedmiotem określania, w próbce guza otrzymanej od pacjenta, jest stężenie izolowanego polipeptydu kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 9 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 9 (innymi słowy, stężenia białka o sekwencji Id. Sekw. Nr 8).

Według korzystnego wariantu ten ostatni sposób obejmuje:

(a) wytworzenie cząsteczek cDNA z cząsteczek RNA próbki guza, następnie (b) specyficzną amplifikację cząsteczek cDNA, które są zdolne do kodowania przynajmniej jednej części polipeptydu.

Według korzystnego wykonania sposób ten obejmuje też doprowadzenie do kontaktu próbki guza z przeciwciałem monoklonalnym, które specyficznie rozpoznaje izolowany polipeptyd wspomniany wyżej (i w szczególności izolowany polipeptyd kodowany przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 9 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 9 (innymi słowy, stężenie białka o sekwencji według Id. Sekw. Nr 8).

Sposób określania, czy guz u pacjenta jest złośliwy może polegać na określeniu stężenia, w biologicznej próbce pobranej od pacjenta:

- polinukleotydu o sekwencji polinukleotydowej według Id. Sekw. Nr. 5 lub Id. Sekw. Nr 4, lub

- polinukleotydu, którego sekwencja nukleotydowa jest fragmentem sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 5 lub Id. Sekw. Nr 4, a fragment kodujący izolowany polipeptyd ma przynajmniej jedną odpornościową i/lub biologiczną aktywność charakterystyczną dla białka związanego z modulacją proliferacji komórkowej.

Izolowany polipeptyd według wynalazku umożliwia monitorowanie postępu albo cofania się choroby u pacjenta cierpiącego z powodu raka sposobem, który obejmuje:

(a) określanie, powtarzane w wy-branych odstępach czasu, w biologicznej próbce otrzymanej od pacjenta stężenia izolowanego polipeptydu obejmującego przynajmniej:

- lub fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 4 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 4, a izolowany polipeptyd ma przynajmniej jedną odpornościową i/lub biologiczną aktywność charakterystyczną dla białka związanego z modulacją proliferacji komórkowej, i (b) porównanie w czasie stężeń określonych w (a).

PL 204 844 B1

W szczególności, sposób ten do kontrolowania postępu albo cofania się choroby u pacjenta cierpiącego z powodu raka obejmuje, w Stadium (a), określenie w powtarzanych odstępach czasu, w biologicznej próbce otrzymanej od pacjenta, stężenia izolowanego polipeptydu kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 9 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 9 (innymi słowy, stężenia białka o sekwencji Id. Sekw. Nr 8). Stadium (a) powyższego sposobu będzie korzystnie obejmować doprowadzenie do kontaktu porcji biologicznej próbki z przeciwciałem monoklonalnym, które specyficznie rozpoznaje omawiany polipeptyd (w szczególności białko o sekwencji Id. Sekw. Nr 8). Według korzystnego wariantu powyższego sposobu, próbka biologiczna pobrana od pacjenta jest częścią guza.

Jeszcze inny sposób monitorowania postępu albo cofania się choroby u pacjenta cierpiącego z powodu raka obejmuje następujące stadia:

(a) określanie, powtarzane w wybranych odstępach czasu, w biologicznej próbce otrzymanej od pacjenta, stężenia RNA kodującego izolowany polipeptyd obejmujący przynajmniej:

- albo fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 5, albo przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 5,

- lub fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 4 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 4, a wyizolowany polipeptyd ma przynajmniej jedną odpornościową i/lub biologiczną aktywność charakterystyczną dla białka połączonego z modulacją proliferacji komórkowej i (b) porównanie w czasie stężeń określonych w (a).

W szczególności, ten sposób monitorowania postępu lub cofania się choroby u pacjenta cierpiącego z powodu raka będzie obejmował w Stadium (a) określanie powtarzane w wybranych odstępach czasu, w biologicznej próbce pobranej od pacjenta, stężenia RNA kodującego izolowany polipeptyd kodowany przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 9 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 9 (innymi słowy, stężenia RNA kodującego białko o sekwencji Id. Sekw. Nr 8).

Według korzystnego wariantu sposobu monitorowania opisanego powyżej, stadium (a) będzie korzystnie obejmować:

(i) wytworzenie cząsteczek cDNA z cząsteczek RNA w biologicznej próbce, i (ii) specyficzną amplifikację cząsteczek cDNA, które są zdolne do kodowania przynajmniej części tego izolowanego polipeptydu.

Wszystkie sposoby określania i/lub sposoby monitorowania opisywane powyżej są narzędziami, które po analizie wyników, pozwalają lekarzowi, na postawienie diagnozy stosownie do nasilenia i/lub postępu lub cofania się guzów dotyczących pacjenta.

Ponadto przeciwciało monoklonalne według wynalazku można wykorzystać w zestawie do diagnozowania chorób proliferacyjnych obejmującym:

(1) przeciwciało monoklonalne, które specyficznie wiąże izolowany polipeptyd obejmujący przynajmniej jeden fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 5 lub Id. Sekw. Nr 4, lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 5 lub Id. Sekw. Nr 4, (2) drugie przeciwciało monoklonalne lub jego fragment, które wiąże się albo z monoklonalnym przeciwciałem jak zdefiniowane w (1), albo z izolowanym polipeptydem jak zdefiniowany w (1), a to drugie monoklonale przeciwciało jest skoniugowane z resztą znacznikową.

W szczególności, ten zestaw do diagnozowania chorób proliferacyjnych może być tak wybrany, że fragmentem białka kodowanym przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 5 jest izolowany polipeptyd kodowany przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 9 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej Id. Sekw. Nr 9 (innymi słowy, białka o sekwencji Id. Sekw. Nr 8).

Korzystnie, reszta znacznikowa powyższego zestawu diagnostycznego jest wybrana z grupy obejmującej radioizotopy, grupy fluoroscencyjne, grupy luminescencyjne, enzymy, biotynę i cząstki barwiące.

Izolowany polipeptyd obejmujący przynajmniej jeden fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 5 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 5, i mający co najmniej jedną odpornościową i/lub biologiczną aktywność białka związanego z modulacją proliferacji komórkowej może być wytworzony sposobem obejmującym następujące kolejne etapy:

PL 204 844 B1 (a) hodowlę, w warunkach odpowiednich do otrzymywania ekspresji tego polipeptydu w komórce gospodarza transformowanej lub transfekowanej wektorem ekspresyjnym zawierającym wyizolowany polinukleotyd obejmujący przynajmniej jeden fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 5 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 5. i (b) izolację polipeptydu z hodowli komórek gospodarza.

Sposobem tym wytwarza izolowany polipeptyd kodowany przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 9 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 9 (innymi słowy, wytwarza się białko o sekwencji Id. Sekw. Nr 8).

Izolowany polipeptyd według wynalazku może być wykorzystany do identyfikacji związków zdolnych do modulowania wzrostu komórkowego i/lub różnicowania, przy czym sposób ten obejmuje następujące kolejne etapy:

(a) doprowadzenie do kontaktu każdego związku kandydata, w warunkach i w czasie wystarczającym, aby czynnik-kandydat mógł związać się, z izolowanym polipeptydem obejmującym przynajmniej:

- albo fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 4 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 4, a izolowany polipeptyd ma przynajmniej jedną odpornościową i/lub biologiczną aktywność charakterystyczną dla białka związanego z modulacją wzrostu komórek i/lub różnicowaniem i (b) wykrywanie wiązania każdego związku-kandydata z tym polipeptydem i identyfikowanie spośród związków kandydatów związków zdolnych do modulowania wzrostu komórkowego i/lub różnicowania.

W szczególności, ten sposób identyfikowania związków zdolnych do modulowania wzrostu komórkowego i/lub różnicowania obejmuje w Stadium (a), doprowadzania do kontaktu każdego związku kandydata w warunkach i przez czas wystarczający aby czynnik-kandydat związał się z polipeptydem, z izolowanym polipeptydem kodowanym przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 9 lub przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 9 (innymi słowy, z białkiem o sekwencji Id. Sekw. Nr 8).

Alternatywny sposób identyfikowania związków zdolnych do modulowania wzrostu komórkowego i/lub różnicowania obejmuje następujące kolejne etapy:

(a) doprowadzanie do kontaktu każdego związku kandydata, z komórką zdolną do ekspresji izolowanego polipeptydu obejmującego przynajmniej albo fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 5 albo przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 5, albo fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sek. Nr 4 albo przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 4 w warunkach i przez czas wystarczający aby czynnik-kandydat i komórka mogły oddziaływać, a izolowany polipeptyd ma przynajmniej jedną odpornościową i/lub biologiczną aktywność charakterystyczną dla białka związanego z modulacją wzrostu komórkowego i/lub różnicowania, i (b) określenie wpływu każdego związku-kandydata na stężenie komórkowe polipeptydu i identyfikowanie, spośród związków-kandydatów, związków zdolnych do modulowania wzrostu komórkowego i/lub różnicowania.

W szczególności ten alternatywny sposób obejmuje, w Stadium (a), doprowadzenie do kontaktu każdego związku-kandydata, z komórką zdolną do ekspresji izolowanego polipeptydu kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 9 albo przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 9 (innymi słowy, komórką zdolną do wyrażania białka o sekwencji o Id. Sekw. Nr 8) w warunkach i przez czas wystarczający aby czynnik-kandydat i komórka mogły oddziaływać wzajemnie na siebie.

Według korzystnych wykonań sposobów identyfikowania związków zdolnych do modulowania wzrostu i/lub różnicowania opisanych powyżej, związki-kandydaci mogą pochodzić z bibliotek małych cząsteczek pochodzących z kombinatorycznych programów chemicznych.

Polinukleotydy według wynalazku mogą też być stosowane do identyfikowania związków zdolnych do modulowania ekspresji białka związanego z modulowaniem proliferacji komórkowej, sposobem, który obejmuje następujące kolejne etapy:

PL 204 844 B1 (a) doprowadzenie do kontaktu każdego związku-kandydata, z komórką transformowaną lub transfekowaną polinukleotydem obejmującym gen znacznikowy pod kontrolą endogennego promotora albo elementów regulatorowych białka połączonego z modulacją proliferacji komórkowej, w warunkach i przez czas wystarczający, aby każdy związek-kandydat mógł oddziaływać z promotorem albo jego elementem regulatorowym, w których białko obejmuje sekwencję kodowaną przez polinukleotydową sekwencję Id. Sekw. Nr 5 albo przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 5, (b) określenie wpływu każdego związku-kandydata na stężenie białka znacznikowego wytwarzanego przez komórkę, i identyfikację związków zdolnych do modulowania ekspresji białka związanego z modulacją proliferacji komórkowej.

Według korzystnego wykonania sposobu identyfikowania związków zdolnych do modulowania ekspresji białka związanego z modulacją proliferacji komórkowej opisanego powyżej, związki kandydaci pochodzą z bibliotek małych cząsteczek pochodzących z kombinatorycznych programów chemicznych.

Farmakologiczne własności polinukleotydów i polipeptydów według wynalazku sprawiają, że polipeptydy nadają się do farmaceutycznego zastosowania. Faktycznie izolowane polipeptydy obejmują przynajmniej

- albo fragment białka kodowanego przez sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 4, albo przez sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydowej o Id. Sekw. Nr 4 które mają przynajmniej jedną odpornościową i/lub biologiczną aktywność charakterystyczną dla białka związanego z modulacją proliferacji komórkowej. Również polinukleotydy kodujące te polipeptydy, mogą być podawane pacjentom z rakiem w celu opóźnienia rozwoju guzów albo powodowania regresji tych guzów.

W powyższych sposobach, białko związane z modulacją proliferacji komórkowej lub różnicowaniem może być w szczególności izolowanym polipeptydem kodowanym przez polinukleotydową o sekwencję Id. Sekw. Nr 9 albo przez sekwencję komplementarną do polinukleotydowej sekwencji o Id. Sekw. Nr 9 (innymi słowy, białka o sekwencji Id. Sekw. Nr 8).

Jak wspomniano powyżej, obecny wynalazek dotyczy produktów przeznaczonych do modulacji wzrostu komórkowego i leczenia raka. Obecny wynalazek jest oparty, w części, na identyfikacji „sekwencji związanych z modulacją proliferacji komórkowej” które są polipeptydowymi i polinukleotydowymi sekwencjami związanymi z modulacją proliferacji komórkowej. mRNA związany z różnicowaniem jest mRNA, który jest obecny na wyższym poziomie w zróżnicowanych komórkach niż w odpowiadających niezróżnicowanych komórkach (tj. poziom mRNA jest przynajmniej dwa razy wyższy). Cząsteczka cDNA związana z różnicowaniem jest sekwencją odpowiadającą mRNA związanemu z różnicowaniem (i/lub sekwencją komplementarną).

Takie cząsteczki cDNA mogą być wytwarzane z preparatów RNA albo mRNA standardowymi technikami, takimi jak odwrotna transkrypcja. Podobnie, białko albo polipeptyd związany z różnicowaniem obejmuje sekwencję kodowaną przez mRNA związane z różnicowaniem komórkowym.

Opisywane tutaj kompozycje farmaceutyczne mogą obejmować jeden albo więcej polipeptydów, sekwencji kwasów nukleinowych i/lub przeciwciał. Polipeptydy według niniejszego wynalazku obejmują przynajmniej jedną część białka związanego z modulacją proliferacji komórkowej lub jej wariantu. Sekwencje kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku obejmują sekwencje DNA albo RNA, które kodują przynajmniej część takiego polipeptydu, albo które są komplementarne do takiej kodującej sekwencji.

Przeciwciała są białkami układu odpornościowego albo ich fragmentami wiążącymi antygen, które są zdolne do wiązania części polipeptydów opisanych powyżej.

Alternatywnie, kompozycja może zawierać jeden albo więcej czynników, które modulują ekspresję genu związanego z modulacją proliferacji komórkowej.

Przedmiotem obecnego wynalazku są izolowane polinukleotydy lub polipeptydy. Polinukleotyd albo polipeptyd jest nazywany „izolowanym” jeżeli jest usunięty ze swego naturalnego środowiska. W szczególności, polinukleotyd albo polipeptyd jest izolowany, jeżeli jest oddzielony od biologicznego materiału, z którym koegzystował w naturalnym układzie.

Sekwencja polinukleotydowa, która koduje polipeptydy według wynalazku i fragmenty lub białka fuzyjne tych polipeptydów albo białek, może być zastosowana do wytwarzania cząsteczek rekombinowanego DNA, które kierują ekspresją tych polipeptydów lub białek, lub ich aktywnej części, w odpowiednich komórkach gospodarza. Alternatywnie, sekwencje polinukleotydowe, które hybrydyzują z częśPL 204 844 B1 ciami sekwencji polinukleotydowych według wynalazku mogą też być stosowane w testach hybrydyzacji kwasów nukleinowych, w metodach Southern blot, Northern blot, itd.

W zwią zku z degeneracją kodu genetycznego, inne sekwencje DNA kodują ce zasadniczo sekwencje aminokwasowe polipeptydów według wynalazku mogą być zastosowane do klonowania i ekspresji tych polipeptydów lub białek. Takie sekwencje DNA obejmują sekwencje zdolne do hybrydyzacji z sekwencjami polinukleotydowymi polinukleotydów wedł ug wynalazku w pewnych ostrych warunkach, które mogą być dostosowywane kilkoma sposobami. Na przykład, podczas łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) może być dostosowywana temperatura, przy której startery hybrydyzują z matrycą, lub stężenia MgCl2 w buforze reakcyjnym. Podczas stosowania fragmentów DNA znakowanego radioizotopami, lub oligonukleotydów do sondowania błon, ostrość może być dostosowywana przez zmianę sił jonowych roztworów do płukania lub przez uważne kontrolowanie temperatury płukania.

Warunki hybrydyzacji określa się jako ostre, gdy stosuje się temperaturę hybrydyzacji o 10°C poniżej Tm i bufory hybrydyzacji zawierające roztwór 6 x SSC (0,9 M chlorku sodu i 0,09 M cytrynianu sodu). W takich warunkach, niespecyficzne sekwencje polinukleotydowe nie hybrydyzują z polinukleotydem o sekwencji komplementarnej do sekwencji Id. Sekw. Nr 5 lub Id. Sekw. Nr 9.

Zmienione sekwencje DNA, które mogą być zastosowane jak opisano powyżej obejmują delecje, addycje lub substytucje różnych reszt nukleotydowych, dając w rezultacie sekwencję, która koduje ten sam produkt genu lub równoważną funkcję. Produkt genu może też zawierać delecje, addycje lub podstawienia reszt aminokwasowych w sekwencjach polipeptydów, które dają w wyniku zmiany zwane cichymi, dlatego produkują polipeptydy i białka o równoważnej funkcji.

Takie podstawienia aminokwasów mogą być przeprowadzone na podstawie polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilności i/lub natury amfipatycznej włączanych reszt.

Na przykład, ujemnie-naładowane aminokwasy obejmują kwas asparginowy i kwas glutaminowy; dodatnio-naładowane aminokwasy obejmują lizynę i argininę; aminokwasy z polarnymi grupami, mające zbliżone wartości hydrofobowości, obejmują leucynę, izoleucynę, walinę, glicynę, alaninę; asparaginę, glutaminę, serynę, treoninę, fenyloalaninę, tyrozynę.

Z licznych powodów sekwencje DNA mogą być modyfikowane w celu zmiany sekwencji polinukleotydowych według wynalazku, w tym, ale nie wyłącznie, z licznych względów obejmujące w sposób nie ograniczający zmiany, które modyfikują proces i ekspresję produktu genu. Na przykład, mutacje mogą być wprowadzone przy zastosowaniu technik dobrze znanych specjaliście, na przykład, ukierunkowanej mutagenezy, wstawienia nowych miejsc restrykcyjnych, zmianie glikozylacji, fosforylacji itd.

W szczególnoś ci w pewnych układach ekspresyjnych, takich jak droż d ż e, komórka gospodarza może nadglikozylować produkt genu. W takim układzie, jest korzystne zmienianie sekwencji polinukleotydowych w celu wyeliminowania miejsc glikozylacji. W polinukleotydach według wynalazku można także zmodyfikować sekwencje polinukleotydowe i połączyć je z sekwencjami heterologicznymi do kodowania białka fuzyjnego.

Białko fuzyjne może być tak modyfikowane, aby zawierało miejsce cięcia zlokalizowane pomiędzy sekwencją białka według wynalazku (sekwencją o Id. Sekw. Nr 8) i sekwencją białka heterologicznego, w wyniku czego, sekwencja biał ka wedł ug wynalazku moż e być odcię ta od części heterologicznej.

Polinukleotydy związane z modulacją proliferacji komórkowej

Polinukleotydy, które kodują polipeptyd związany z modulacją proliferacji komórkowej lub jego część lub wariant, jak tu opisano mogą być jednoniciowe (kodujące lub antysensowne) lub dwuniciowe i mogą być DNA (genomowym, cDNA, lub syntetycznym) lub cząsteczkami RNA.

Polinukleotydy związane z różnicowaniem mogą być wytwarzane przy użyciu dowolnych technik dostępnych specjalistom w tej dziedzinie. Na przykład, taki polinukleotyd może być amplifikowany przez łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) z cDNA wytworzonego z komórek lub tkanek ludzkich.

Przy takim podejściu, konkretne startery mogą być zaprojektowane, zamówione lub zsyntetyzowane, przy czym te startery są oparte na sekwencji tego polinukleotydu. Dzięki technikom dobrze znanym specjaliście w tej dziedzinie i krótko wspomnianym powyżej, część amplifikowana może być następnie użyta do izolacji całkowitego genu z ludzkiego banku genomowego DNA lub z banku cDNA jakiejkolwiek komórki lub tkanki, normalnej, guzowatej lub zróżnicowanej. Alternatywnie, całkowity gen można skonstruować z kilku fragmentów PCR. Cząsteczki cDNA kodujące białko związane z różnicowaniem, lub jego część, mogą być również wytwarzane przez przeszukiwanie banku cDNA otrzymanego, na przykład, z mRNA komórek lub tkanek. Takie biblioteki są dostępne handlowo, lub mogą być wytworzone przy zastosowaniu standardowych technik (por. Sambrook i wsp., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY,1989).

PL 204 844 B1

Alternatywnie, mogą być stosowane inne techniki przeszukiwania dobrze znane specjalistom.

Cząsteczka cDNA związana z różnicowaniem może być sekwencjonowana przez zastosowanie standardowych technik enzymatycznych, takich jak fragment Klenowa DNA polimerazy I, Sequenase X (US Biochemical Corp., Cleveland OH, USA), polimeraza Taq (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA), termostabilna polimeraza T7 (Amersham, Chicago, IT, USA) lub kombinacja rekombinowanych polimeraz i egzonukleaz z ponownie odczytywaną aktywnością, taką jak układ amplifikacji Elongase (Gibco BRL, Gainthersburg, MD, USA). Może być stosowany automatyczny układ sekwencjonowania z użyciem instrumentów dostępnych od dostawców handlowych, takich jak Perkin Elmer i Pharmacia.

Przy użyciu standardowych technik dobrze znanych specjalistom można zastosować częściową sekwencję cDNA do identyfikowania sekwencji polinukleotydowej, która koduje kompletne białko połączone z modulacją proliferacji komórkowej. W tych technikach, bibliotekę cDNA przeszukuje się przy użyciu jednej lub więcej sond polinukleotydowych wykorzystując własności rekombinacyjne RecA (ClonCapture cDNA Selection Kit, Clontech Laboratories, USA).

Dla technik hybrydyzacji, częściową sekwencję można znakować radioizotopami (na przykład, przez nick translację lub przez znakowanie końców stosując ³²P lub ³³P) przy użyciu standardowych technik. Następnie bibliotekę bakterii lub bakteriofagów przeszukuje się przez hybrydyzację na filtrach zawierających zdenaturowane kolonie bakteryjne (lub na płytkach fagowych zawierających odbitkę) ze znakowanymi sondami (por. Sambrook i wsp., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY,1989). Kolonie lub płytki dodatnie są następnie selekcjonowane i amplifikowane, a DNA jest izolowany do dalszych analiz.

Następnie, przy użyciu standardowych technik można określić całkowitą sekwencję. Sekwencje zachodzące na siebie są następnie zestawione w jedną ciągłą sekwencję. Cząsteczkę całkowitego cDNA można wytworzyć przez zligowanie interesujących nas fragmentów przy zastosowaniu standardowych technik.

Alternatywnie, istnieje szereg technik opartych na amplifikacji do otrzymywania całkowitej sekwencji kodującej z częściowej sekwencji cDNA. Spośród tych technik, powszechnie amplifikację przeprowadza się przez PCR. Wszystkie zestawy, które są dostępne handlowo, mogą być używane do etapów amplifikacji. Można zaprojektować startery stosując, na przykład, oprogramowanie dobrze znane w stanie techniki. Startery nukleotydowe są korzystnie cząsteczkami o 20 do 30 nukleotydach mającymi przynajmniej 50% zawartość guaniny i cytozyny, i hybrydyzującymi z sekwencją docelową w temperaturze w zakresie między 50 a 72°C. Region amplifikowany można zsekwencjonować jak opisano powyżej i zachodzące na siebie sekwencje zestawić w ciągłą sekwencję.

Wśród alternatywnych podejść, przylegające sekwencje do sekwencji częściowej można znaleźć przez amplifikowanie ze starterem sekwencji wiążącej i starterem specyficznym dla znanego regionu. Następnie zamplifikowane sekwencje poddaje się drugiemu cyklowi amplifikacji.

Dodatkowe techniki obejmują wychwytującą PCR (Lagerstrom i wsp. PCR Methods Applic. (1991), 1 111-19) i postę pują cą PCR (Parker i wsp., Nucl Acids. Res. (1991), 19, 3055-60). Do otrzymania całkowitej sekwencji cDNA mogą być również wykorzystane inne sposoby stosowania amplifikacji.

Sekwencję całkowitego cDNA można otrzymać przez analizowanie sekwencji zdeponowanych w publicznych bazach danych „Expressed Sequence Tags” (ETS-y) dostę pnych z GenBanku. Badania obejmujące EST-y można przeprowadzić stosując programy komputerowe, które są dobrze znane specjalistom (na przykład NCBI BLAST) i takie EST-y można zastosować do wytwarzania ciągłej sekwencji całkowitej.

Można też otrzymać warianty sekwencji polinukleotydowych opisanych powyżej (w szczególności sekwencje o Id. Sekw. Nr 5 lub Id. Sekw. Nr 9) objęte niniejszym wynalazkiem. Warianty polinukleotydowe mogą zawierać jedno lub więcej podstawień, delecji lub insercji.

Część sekwencji komplementarnej do sekwencji kodującej (tj. polinukleotyd antysensowny) można także zastosować jako sondę lub jako modulator ekspresji genu. Konstrukty cDNA, które mogą być przepisane na antysensowny RNA, można wprowadzić do komórek lub tkanek, aby ułatwić wytwarzanie antysensownego RNA. Antysensowny polinukleotyd można zastosować, jak tu opisano, do hamowania ekspresji genu związanego z modulacją proliferacji komórkowej. Antysensowna technologia może być zastosowana do kontroli ekspresji genu przez tworzenie potrójnej helisy, która łączy zdolność podwójnej helisy do wystarczającego otwarcia dla wiązania polimeraz, czynników transkrypcyinych lub cząsteczek regulatorowych (porównaj z Gee i wsp. w Hubert i Carr, Molecular and Immunoloqic Approaches (1994), Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). Alternatywnie, cząsteczkę antysenPL 204 844 B1 sowną można zastosować do hybrydyzowania z regionem kontrolnym genu (na przykład, promotorem lub miejscem inicjacji transkrypcji) i blokowania transkrypcji genu lub blokowania translacji przez hamowanie wiązania rybosomów z transkryptem.

Polinukleotydy mogą być wtedy modyfikowane przez zwiększanie ich stabilności in vivo. Możliwe modyfikacje obejmują (ale nie są ograniczone): dodatek sekwencji do końców 5' i/lub 3'; zastosowanie fosforotionianu albo 2'O-metylu a nie wiązań fosfodwuesterazowych w szkielecie; i /lub wprowadzenie zasad, takich jak inozyna, kweozyna i wybutozyna, podobnie acetyloadenina, methyltioadenina i inne modyfikowane formy adeniny, cytydyny, guaniny, tyminy i urydyny.

Sekwencje nukleotydowe jak opisane w niniejszym wynalazku mogą być łączone z innymi sekwencjami nukleotydowymi przez zastosowanie ustalonych technik rekombinacji DNA. Na przykład, polinukleotyd może być klonowany w dużym przedziale wektorów ekspresyjnych, obejmującym plazmidy, fagemidy, pochodne faga lambda i kosmidy.

Wektory będące przedmiotem szczególnego zainteresowania obejmują wektory ekspresyjne, wektory replikacji i wektory sekwencjonowania. Ogólnie, wektor zawiera funkcjonalny początek replikacji w co najmniej jednym organizmie, odpowiednie miejsca restrykcyjne dla endonukleaz i jeden lub więcej znaczników selekcyjnych. Obecność innych elementów będzie zależeć od konkretnego zastosowania wymaganego przez specjalistę, który wybierze cechę wektora ekspresyjnego zależnie od wymagań i dostępnych technik.

Polinukleotydy mogą być formułowane w celu umożliwienia wejścia do komórki i wyrażania odpowiadającego im polipeptydu. Takie preparaty są szczególnie użyteczne w terapii jak opisano poniżej.

Dla specjalisty jest to zrozumiałe, że istnieje kilka środków dla wyrażania polinukleotydu w komórce docelowej i że można zastosować dowolne odpowiednie techniki. Na przykład, polinukleotyd może być włączony do wektora wirusowego, takiego jak adenowirus albo retrowirus (ale też do innych). Techniki włączania DNA do takich wektorów są dobrze znane specjalistom. Wektor retrowirusowy może przenosić lub włączać gen do znacznika selekcyjnego i/lub docelowej jednostki jako gen kodujący ligand specyficznego receptora komórki docelowej, w celu uzyskania docelowo - specyficznego wektora.

Inne preparaty polinukleotydów obejmują koloidalne układy dyspersyjne, takie jak makrocząsteczkowe kompleksy, nano-kapsułki, mikrokulki, perełki i układy oparte na użyciu lipidów obejmujące emulsje olej/woda, micele, mieszankę miceli i liposomy.

Korzystnym układem koloidalnym stosowanym do dostarczania produktu in vitro i in vivo jest liposom (tj. sztuczny pęcherzyk lipidowy błony).

Polipeptyd jest immunologicznie aktywny w kontekście niniejszego wynalazku, jeżeli jest rozpoznawany przez receptor powierzchniowy limfocytów B i/lub T. Aktywność immunologiczną można testować przy użyciu standardowych technik, takich jak te zestawione przez Paul, Fundamental Immunology, 3 wyd., 243-247 (Raven Press, 1993). Takie techniki obejmują przesiewanie polipeptydów pochodzących od natywnych polipeptydów w celu określenia ich zdolności do reagowania z antygenowospecyficzną surowicą odpornościową i/lub liniami limfocytów T lub klonami, które mogą być wytworzone zgodnie ze standardowymi metodami. Immunologicznie aktywna część białka związanego z modulacją proliferacji komórkowej reaguje z taką surowicą odpornościową i/lub limfocytami T i nie jest znacząco słabsza niż reaktywność całkowitego polipeptydu (np. w teście ELISA i/lub w teście reaktywności limfocytów T). Takie przeszukiwania można zwykle przeprowadzić przy użyciu sposobów dobrze znanych specjaliście, takich jak opisane w Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Epitopy limfocytów B i T można również przewidzieć stosując techniki komputerowe.

Alternatywnie, immunogenne części mogą być identyfikowane przez zastosowanie analizy komputerowej, takiej jak program Tsites® (por. Rothbard i Taylor, Embo J. (1988), 7, 93-100; Deavin i wsp., Immunol. (1996), 33, 145 155), który bada jednostki peptydowe mające zdolność do wywołania odpowiedzi. Jednostki peptydowe, które są odpowiednie do wiązania się z mysimi lub ludzkimi głównymi kompleksami zgodności tkankowej klasy I lub II (MHC) mogą być identyfikowane metodą BIMAS (Parker i wsp., J. Immunol. (1994), 152:163, 1994). Aby potwierdzić immunogenność peptyd można testować stosując mysz transgeniczną HLA A2 i/lub in vitro test stymulacyjny z zastosowaniem komórek dendrytycznych, fibroblastów lub komórek krwi obwodowej.

Podobnie, polipeptyd jest „biologicznie aktywny”, jeżeli ma jedną albo więcej strukturalnych, regulatorowych i/lub biochemicznych funkcji białka natywnego związanego z modulacją proliferacji komórkowej. Obecność biologicznej aktywności może być określona metodami dobrze znanymi specjalistom.

PL 204 844 B1

Na przykład, badania porównawcze sekwencji mogą wskazywać szczególną biologiczną aktywność białka. Wówczas mogą być używane testy prowadzące do oceny tej aktywności na bazie testu już znanego w stanie techniki. Pewne części i inne warianty takich białek również wykazywałyby tę własność w teście in vitro albo in vivo.

Jak już wspominano, polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą obejmować jedną albo więcej części wariantu endogennego białka, przy czym część jest immunologicznie i/lub biologicznie czynna (tj. część ma jedną albo więcej antygenowych, immunogennych i/lub biologicznych właściwości kompletnego białka). Korzystnie, taka część jest też przynajmniej tak aktywna jak całkowite białko podczas testowania pozwalającego na wykrycie takich własności. „Wariant” polipeptydu jest polipeptydem, który różni się od białka natywnego podstawieniami, wstawkami, delecjami i/lub modyfikacjami w aminokwasach. Pewne warianty zawierają podstawienia konserwatywne. „Podstawienie konserwatywne”, jest podstawieniem, w którym aminokwas jest zastąpiony przez inny aminokwas mający te same własności, takie jak te określone przez specjalistę, który nie oczekuje żadnej zmiany w drugorzędowej strukturze, jak również w hydropatycznej naturze polipeptydu. Podstawienia aminokwasowe ogólnie mogą być wykonywane na podstawie podobieństwa polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilowości, i/lub amfipatycznej natury reszt. Na przykład, ujemnie-naładowane aminokwasy obejmują kwas asparginowy i kwas glutaminowy; dodatnio-naładowane aminokwasy obejmują lizynę i argininę; a polarne nienaładowane aminokwasy mające podobne wartości hydrofobowe obejmują leucynę, izoleucynę i walinę; glicynę i alaninę; asparaginę i glutaminę; serynę, treoninę, fenyloalaninę i tyrozynę. Innymi grupami aminokwasów, które mogą reprezentować konserwatywne zmiany, są w szczególności następujące: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; ( 2) Cys, Ser, Tyr, Thr (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His, i (5) Phe, Tyr, Trp, His.

Wariant może także, lub alternatywnie, zawierać zmiany niekonserwatywne.

Warianty stanowią polipeptydy, w których struktura pierwszorzędowa białka natywnego jest modyfikowana przez tworzenie kowalencyjnych lub niekowalencyjnych koniugatów z innymi polipeptydami albo strukturami chemicznymi, takimi jak grupy lipidowe lub glikozylowe, lub grupy acetylofosforanowe.

Polipeptydy mogą być z albo bez jednostek glikozylacji. Polipeptydy wyrażone w układach ekspresyjnych drożdży lub komórkach ssaczych mogą być, pod względem ciężaru cząsteczkowego i wzoru glikozylacji, podobne lub mogą nieznacznie różnić się od cząsteczki natywnej stosownie do zastosowanego układu ekspresji.

Wyrażanie DNA w bakteriach, takich jak E. coli prowadzi do cząsteczek nieglikozylowanych. Miejsca N-glikozylacji białek eukariotycznych są charakteryzowane przez trójkę aminokwasów Asn-AlZ, gdzie Al jest dowolnym aminokwasem z wyjątkiem Pro, a Z jest seryną albo treoniną.

Allele są alternatywnymi formami białka natywnego wynikającymi z jednej albo więcej mutacji (które mogą być stłumione, dodane lub podstawione aminokwasami), prowadzących do zmienionego RNA. Białka alleliczne mogą różnić się w sekwencji, ale ogólna struktura, jak również funkcja, jest zasadniczo podobna.

Białko związane z modulacją proliferacji komórkowej, warianty i ich części generalnie mogą być wytwarzane z kwasów nukleinowych kodujących żądany polipeptyd przy użyciu standardowych technik. Do wytwarzania endogennego białka może być użyty izolowany cDNA.

Do wytworzenia wariantu polipeptydu mogą być użyte standardowe techniki mutagenezy, takie jak mutageneza ukierunkowana, w której stosuje się oligonukleotydy ukierunkowane.

Na ogół, do wyrażania rekombinowanych polipeptydów według tego wynalazku mogą być stosowane dowolne wektory ekspresyjne znane specjaliście. Ekspresję może uzyskać w dowolnej odpowiedniej komórce gospodarza, otransformowanej lub stransfekowanej wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję DNA, która koduje rekombinowany polipeptyd. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują komórki prokariotyczne, wyższe eukariotyczne lub komórki drożdży. Korzystnie, stosowanymi komórkami gospodarza są E. coli, komórki drożdży lub komórki ssacze, takie jak COS, CHO, MCF7 (ludzkie komórki guza izolowane z raka sutka) lub DU 145 (ludzkie komórki guza izolowane z raka prostaty).

Po ekspresji, supernatant z układów gospodarz/wektor, które wydzielają rekombinowane białko lub polipeptyd w pożywce hodowlanej, najpierw może być zatężony przez zastosowanie standardowych technik, takich jak wytrącanie alkoholem albo filtracja przy użyciu handlowo dostępnych filtrów. Po etapie zatężania, uzyskany produkt może być nałożony na odpowiednią matrycę do oczyszczania,

PL 204 844 B1 taką jak matryca powinowactwa lub żywica jonowymienna. Oczyszczanie polipeptydu może być monitorowane w jednym lub więcej etapach HPLC.

Pewne części i inne warianty można również wytwarzać środkami syntetycznymi z użyciem technik, które są dobrze znane specjalistom. Na przykład, części i inne warianty mające mniej niż 500 aminokwasów, korzystnie mniej niż 100 aminokwasów i bardziej korzystnie mniej niż 50 aminokwasów, można syntetyzować na drodze chemicznej. Polipeptydy można syntetyzować przy użyciu technik syntezy na fazie stałej, które są handlowo dostępne, takich jak metoda syntezy na żywicy Merrlifield'a, gdzie w czasie syntezy aminokwasy są kolejno dodawane do łańcucha aminokwasów (patrz Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963) 85, 2149-2146). Liczne inne techniki syntezy na fazie stałej również są dostępne (na przykład metoda Roberge i wsp., Science (1995), (1995), 269, 202-204). Wyposażenie do automatycznej syntezy polipeptydów jest dostępne handlowo od dostawców, takich jak Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, USA), a synteza polipeptydów może być wtedy przeprowadzona zgodnie z rekomendacją wytwórców.

Izolowane polinukleotydy lub polipeptydy

Ogólnie, polipeptydy i polinukleotydy opisane w niniejszym wynalazku są izolowane. „Izolowany” polipeptyd lub polinukleotyd jest polinukleotydem lub peptydem usuniętym ze środowiska naturalnego. Na przykład, naturalne białko jest izolowane, jeżeli jest wydzielone z biologicznego materiału, z którym koegzystowało w układzie naturalnym. Polinukleotyd jest uważany za izolowany jeżeli, na przykład, jest wklonowany do wektora, który nie jest częścią środowiska naturalnego.

Sekwencje sygnałowe

Sposoby przewidywania, czy białko ma sekwencję sygnałową, i podobnie sposoby przewidywania punktu cięcia dla tej sekwencji, są dostępne. Na przykład, w metodzie Mc Geoch (Virus Res. (1985), 3, 271-286)) wykorzystuje się informację o krótkiej z ładunkiem na N-końcu sekwencji z nienaładowanego regionu białka całkowitego (nie ciętego). W metodzie Von Heinje (Nucleic Acid Res. (1986) 14, 4683-4690) wykorzystuje się informacje o resztach, które otaczają miejsce cięcia. Precyzja przewidywania punktów cięcia znanych wydzielniczych białek ssaków w każdej z tych metod wynosi 75 - 80%. Jednak te dwie metody nie zawsze przewidują te same miejsca cięcia dla danego białka.

W obecnym przypadku wydedukowaną sekwencję wydzielanego polipeptydu analizowano programem komputerowym SignalP (Sequence Analysis Software Package z Genetic Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, USA). Ten program komputerowy przewiduje lokalizację komórkową białka w oparciu o sekwencję aminokwasową.

Uznano także, że w pewnych przypadkach cięcie sekwencji sygnałowej wydzielanego białka nie jest jednorodne, dając tym samym w efekcie kilka rodzajów cząsteczek. Ponadto, sekwencja sygnałowa zidentyfikowana dzięki analizom wymienionym powyżej nie może przewidzieć naturalnej sekwencji sygnałowej. Na przykład, naturalna sekwencja sygnałowa może być powyżej lub poniżej przewidywanej sekwencji. Jednakże jest to prawdopodobne, że ta sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania sekrecją białka w kierunku retikulum endoplazmatycznego.

Czasami miejsca cięcia zmieniają się w zależności od gatunku i nie można ich z pewnością przewidzieć.

Sekwencje aminokwasowe, rozpoczynające się od metioniny, identyfikuje się przez określenie sekwencji kodowanych przez polinukleotydy, podczas gdy inne ramki odczytu mogą łatwo ulegać translacji, gdy stosuje się techniki biologii molekularnej, które są dobrze znane specjaliście.

Przeciwciała i ich fragmenty

Niniejszy wynalazek czynników wiążących, takich, jak przeciwciała monoklonalne lub ich fragmenty, które specyficznie wiążą białko związane z modulacją proliferacji komórkowej. Taki czynnik nazwany jest tu „specyficznie wiążącym się” z białkiem modulującym proliferację komórkową, jeżeli reaguje na wykrywalnym poziomie (na przykład, testem ELISA) z białkiem związanym z modulacją proliferacji komórkowej lub jego częścią lub wariantem i nie reaguje w wykrywalny sposób z innymi białkami. „Wiązanie” oznacza niekowalencyjne połączenie pomiędzy 2 oddzielnymi cząsteczkami w taki sposób, że tworzy się kompleks. Zdolność wiązania może być oszacowana, na przykład, przez określenie stałej wiązania dla tworzenia się kompleksu. Stała wiązania jest wartością otrzymaną, gdy wartość stężenia kompleksu jest podzielona przez iloczyn wartości stężeń składników. Ogólnie 2 produkty nazywa się „związanymi”, gdy stała wiązania osiąga 103 l/mol. Stała wiązania może być określona przy użyciu metod dobrze znanych specjalistom.

Dowolny czynnik, który spełnia powyższe kryteria, może być rozważany jako czynnik wiążący.

PL 204 844 B1

W niniejszym wynalazku czynnik wiążący jest przeciwciałem lub jego fragmentem. Przeciwciało może być wytworzone dowolnymi technikami dostępnymi specjalistom (porównaj Harlow i Lane, Antibodies, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Na ogół przeciwciała mogą być wytwarzane technikami hodowli komórek obejmującymi wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych lub via transfekcje genów przeciwciała do komórek gospodarza bakteryjnego lub ssaczego w celu wytworzenia przeciwciał rekombinowanych.

Spośród innych technik korzystne są techniki opisane poniżej. Immunogen zawierający polipeptyd wstrzykuje się grupie ssaków (na przykład myszy, szczurów, królików, owiec lub kóz). Na tym etapie polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą służyć jako immunogeny bez modyfikacji. Alternatywnie i szczególnie dla małych peptydów może być indukowana wyższa odpowiedź odpornościowa, jeżeli polipeptyd jest połączony z białkiem transportowym, takim jak albumina surowicy bydlęcej lub hemocyjanina ze skałoczepa. Immunogen wstrzykuje się gospodarzowi zwierzęcemu, korzystnie według wcześniej określonego schematu i zwierzęta skrwawia się okresowo. Przeciwciała poliklonalne specyficzne wobec polipeptydu mogą być oczyszczone z takiej surowicy odpornościowej, na przykład, przez chromatografię powinowactwa przy użyciu polipeptydu związanego z odpowiednim podłożem stałym.

Białka fuzyjne

W celu zanalizowania subkomórkowej lokalizacji białka według wynalazku o sekwencji Id. Sekw. Nr 8. Może być wytworzony dowolny gen fuz. W handlu dostępnych jest wiele konstruktów plazmidowych, takich jak białko Transferazy S Glutationowej (GST) lub białka fluorescencyjne, takie jak Green Fluorescent Protein (GFP) lub także w sposób niewyczerpujący, poli-Histydyna do znakowania.

Przed protokołem transfekcji komórki ludzkiego eukariotycznego gospodarza (na przykład HEK-293) są hodowane przez 24 godziny, co umożliwia normalny metabolizm komórkowy i lepszą wydajność transfekcji. Wzrost stężenia (1,5 i 10 μg) samego wektora zawierającego białko znacznikowe (GFP, GST lub znacznikową Histydynę) lub wektora zawierającego polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 4, stosując reagent Effectene® według wskazań producenta (Qiagen) uzyskano polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 5 lub polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 9, połączone z białkiem znacznikowym.

Następnie komórki są analizowane przez mikroskopię konfokalną, na przykład, w celu wykrycia lokalizacji białka. Jeżeli, na przykład, białko jest podejrzewane o to, że jest białkiem wydzielanym, supernatanty są odzyskiwane, liofilizowane, nakładane na żel akrylamidowy i analizowane techniką Western biot przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko białku znacznikowemu.

Kompozycje farmaceutyczne

Produkty według wynalazku, takie jak polipeptydy, przeciwciała i/lub kwasy nukleinowe mogą być włączone do kompozycji farmaceutycznych lub szczepionek. Kompozycje farmaceutyczne obejmują jeden albo więcej z tych produktów i jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. Pewne kompozycje farmaceutyczne, które ewentualnie mogą być używane jako szczepionki, mogą zawierać jeden lub więcej polipeptydów i aktywator odpowiedzi odpornościowej, taki jak adiuwant albo liposom (do którego produkt jest włączany). Kompozycje farmaceutyczne i szczepionki mogą ponadto zawierać system podawania, taki jak ulegające biodegradacji mikrokulki. Kompozycje farmaceutyczne i szczepionki mogą też zawierać inne produkty, które mogą być biologicznie aktywne lub nieaktywne.

Kompozycja farmaceutyczna lub szczepionka może zawierać DNA kodujące jeden lub więcej polipeptydów jak opisano powyżej, i wówczas polipeptyd jest wytwarzany in situ. Jak poprzednio wspominano, DNA może być obecny w dowolnej postaci podawania znanej specjaliście, obejmującej kwas nukleinowy, bakteryjne albo wirusowe systemy ekspresyjne. Odpowiednie systemy ekspresji kwasu nukleinowego zawierają sekwencje DNA potrzebne do ekspresji u pacjenta.

Systemy podawania oparte na bakterii obejmują podawanie bakterii (takiej jak Bacillus-Calmette-Guerrin), która na swojej powierzchni wyraża immunogenną część polipeptydu.

Korzystnie, DNA może być wprowadzony przy użyciu wirusowego systemu ekspresyjnego (na przykład wirusa ospy wietrznej, retrowirusa lub adenowirusa) obejmując stosowanie niepatogennych (defektywnych) czynników.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera jako substancję czynną izolowany polipeptyd o Sekw. Id. Nr 8 według wynalazku i może być stosowany dowolny, odpowiedni nośnik znany specjaliście, jednak to typ nośnika będzie się zmieniać stosownie do wybranego sposobu podawania. Kompozycje według obecnego wynalazku można formułować w postaci właściwej dla każdego sposobu podawania, który obejmuje, na przykład, drogę miejscową, donosową, dożylną, śródczaszkową, dootrzewnową, podskórną, domięśniową. Dla pozajelitowego podawania, takiego jak iniekcja podskórna, nośnik korzystnie zawiera wodę, sól, alkohol, tłuszcz, parafinę lub bufor. Dla doustnego podawania

PL 204 844 B1 może być używany dowolny nośnik wspominany powyżej albo nośnik stały, taki jak mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, talk, celuloza, glukoza, sacharoza i węglan magnezu. Jako nośniki dla kompozycji farmaceutycznych według tego wynalazku mogą być również stosowane ulegające biodegradacji mikrokulki. Dla pewnych miejscowych zastosowań korzystne są preparaty, takie jak kremy lub lotiony.

Takie kompozycje mogą też zawierać bufory (na przykład obojętne albo zbuforowane fosforanem roztwory soli), węglowodany (na przykład glukozę, mannozę, sacharozę albo dekstran), mannitol, białka, polipeptydy lub aminokwasy, takie jak glicyna, przeciwutleniacze, czynniki chelatujące, takie jak EDTA albo glutation, adiuwanty (na przykład wodorotlenek glinu) i/lub czynniki ochronne. Alternatywnie, kompozycje według obecnego wynalazku mogą mieć postać liofilizatu. Produkty mogą też być zakapsułkowane w liposomach przy użyciu standardowych technologii.

Według wynalazku każdy z rodzajów adiuwantów może być stosowany w szczepionkach do indukowania reakcji odpornościowej. Większość adiuwantów zawiera substancję chroniącą antygen przed szybkim katabolizmem, taką jak: wodorotlenek glinu lub olej mineralny i stymulator odpowiedzi odpornościowej, taki jak lipid A, białka pochodzące od Bordetella pertussis lub Mycobacterium tuberculosis. W handlu są dostępne odpowiednie adiuwanty, takie jak, na przykład, adiuwant Freunda i kompletny adiuwant (Difco Laboratories, Detroit, MIY, USA; Merck Adjuvant 65 ( Merck and Company, Inc., Rahway, NJ, USA)), ulegające biodegradacji mikrokulki; monofosforylo lipid A i cytokiny, takie jak GMCSF lub Interleukiny - 2,7 albo - 12.

Powyżej opisane kompozycje mogą być też podawane w postaci preparatu retard (tj. preparatu, takiego jak kapsułka albo gąbka, które po podaniu powoli uwalniają produkt). Takie postaci ogólnie mogą być wytwarzane przy użyciu technologii dobrze znanych specjaliście i podawane, na przykład, drogą doustną, doodbytniczą albo przez podskórne wszczepianie albo wszczepienie w żądanym docelowym miejscu. Preparaty retard mogą zawierać polipeptyd, polinukleotyd albo przeciwciało rozproszone w nośnikowej matrycy i/lub zawarte w zbiorniczku chronionym przez błonę dyfuzyjną. Nośniki do zastosowania w takich preparatach są biokompatybilne i muszą ulegać biodegradacji; korzystnie preparat dostarcza stosunkowo stałego poziomu składnika czynnego. Ilość produktu aktywnego zawartego w preparacie retard zależy od miejsca implantacji.

Terapia antyrakowa

Opisane produkty według wynalazku mogą być stosowane w terapii antyrakowej. W szczególności, polinukleotydy i polipeptydy związane z modulacją proliferacji komórkowej, mogą być używane do hamowania wzrostu i indukowania modulacji proliferacji komórkowej w konkretnych guzach sutka albo prostaty.

Takie polipeptydy albo polinukleotydy mogą też być stosowane do terapii licznych raków obejmujących czerniaka, wielorakie formy glejaków, raki płuca jak również raki odbytu. Czynniki aktywujące ekspresję takich polipeptydów lub polinukleotydów mogą być też stosowane w ramach tych terapii.

Według tych aspektów wynalazku, produkty (którymi mogą być polipeptydy albo kwasy nukleinowe) według wynalazku są korzystnie włączane do kompozycji farmaceutycznych jak opisane powyżej.

Pacjentami odpowiednimi do terapii są wszystkie ciepłokrwiste zwierzęta, a korzystnie ludzie. Pacjenci nadający się do tej terapii mogą, ale nie muszą, być zdiagnozowani jako mający raka. Innymi słowy, kompozycje farmaceutyczne opisane powyżej mogą zatem być użyte do zahamowania rozwoju raka w różnych stadiach choroby (w celu zapobiegania pojawieniu się raka albo leczenia pacjentów cierpiących na raka).

Kompozycje farmaceutyczne jak opisane powyżej są podawane w sposób właściwy dla każdego leczonego raka.

Droga, czas trwania i częstotliwość podawania będą określone na podstawie stanu pacjenta, typu i nasilenia choroby, i sposobu podawania. Droga i częstotliwość podawania mogą być różne dla każdego osobnika. Ogólnie, kompozycje farmaceutyczne i szczepionki mogą być podawane przez iniekcje (drogą na przykład śródskórną, domięśniową, dożylną lub podskórną), drogą donosową (na przykład przez inhalacje) lub doustnie. Korzystnie w ciągu 52 tygodni można podać od 1 do 10 dawek. Alternatywne schematy mogą być indywidualnie dostosowane do każdego pacjenta.

Ogólnie, właściwe dawkowanie i reżim leczenia zawiera produkt aktywny w ilości wystarczającej do dostarczenia terapeutycznych i/lub profilaktycznych korzyści. Po takiej odpowiedzi może następować ustabilizowanie i polepszenie obrazu klinicznego (na przykład częstsze remisje, przeżycie w całkowitej, częściowej albo dłuższej nieobecności choroby) u pacjentów leczonych w porównaniu z pacjentami nie leczonymi lub leczonymi niższymi dawkami.

PL 204 844 B1

Polipeptyd według wynalazku może być podawany w dawkach w zakresie od 100 μg do 5 mg. Generalnie cząsteczki DNA kodujące takie polipeptydy mogą być podawane w ilości wystarczającej do wytwarzania porównywalnych poziomów polipeptydu. Odpowiednie dawki mogą być zwykle określone przez stosowanie eksperymentalnych modeli i/lub testów klinicznych. Ogólnie, korzystne jest użycie minimalnej dawki, która jest wystarczająca do dostarczenia skutecznej terapii. Pacjenci zwykle mogą być monitorowani pod kątem skuteczności terapii do leczenia lub zapobiegania przy użyciu odpowiednich testów, które są znane specjalistom.

Metody wykrywanie i monitorowania raka

Polipeptydy, polinukleotydy i przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w licznych metodach wykrywania raka u pacjenta. Obecność polipeptydów i/lub polinukleotydów związanych z modulacją proliferacji komórkowej, takich jak opisane w niniejszym wynalazku, w komórkach gospodarza, wskazuje na zróżnicowanie i zatrzymanie wzrostu komórki. Tym samym, sekwencje związane z modulacją proliferacji komórkowej, mogą być zastosowane jako znaczniki różnicowania między normalnymi komórkami i komórkami złośliwymi (i pozwalają lekarzowi, który interpretuje wyniki, diagnozować, na przykład raka prostaty, sutka, płuca i okrężnicy). Sekwencje związane z modulacją proliferacji komórkowej mogą być także zastosowane jako znaczniki do monitorowania leczenia.

Metody, w których stosuje się przeciwciała umożliwiają badaczowi wykrywanie obecności albo nieobecności polipeptydu opisanego w niniejszym wynalazku w dowolnej dostępnej próbce biologicznej. Dostępne biologiczne próbki obejmują biopsje tkanek guzowych i tkanek zdrowych, homogenaty albo ekstrakty z takich tkanek otrzymanych od pacjenta. Jest wiele typów testów znanych specjalistom, w których stosuje się przeciwciała do wykrywania znaczników polipeptydowych w próbce (por., na przykład, Harlow i Lane, Antibodies: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988).

Na przykład, test może być przeprowadzony według techniki Western bloting, w której preparat białkowy poddaje się elektroforezie na żelu, przenosi się na odpowiednią błonę i poddaje reakcji z przeciwciałem. Obecność przeciwciała na błonie może być wtedy wykryta przez stosowanie odpowiednich odczynników, jak opisano poniżej.

Można też przeprowadzić testy, w których stosuje się przeciwciało unieruchomione na podłożu stałym związane z polipeptydem. Związany polipeptyd można wykryć stosując drugie przeciwciało albo inne odczynniki zawierające resztę znacznikową. Alternatywnie, można zastosować test współzawodnictwa, w którym polipeptyd znaczy się resztą znacznikową i pozwala się na wiązanie z przeciwciałem unieruchomionym po inkubacji przeciwciała z próbką. Zdolność składników próbki do hamowania wiązania znaczonego polipeptydu z przeciwciałem wskazuje na reaktywność próbki z unieruchomionym przeciwciałem, i w ten sposób wskazuje na stężenie polipeptydu w próbce.

Podłoże stałe może być dowolnym znanym materiałem, do którego może się przyczepiać przeciwciało. Na przykład, stałym podłożem może być studzienka testowa w płytce mikrotitracyjnej lub filtr wykonany z nitrocelulozy albo dowolna inna odpowiednia błona. Alternatywnie, podłożem może być perełka, szkło, tworzywo sztuczne albo lateks, taki jak polistyren albo polichlorek winylu. Podłożem może też być cząsteczka magnetyczna.

Przeciwciało może być unieruchamiane na podłożu stałym przy użyciu rozmaitych technik znanych specjalistom i szeroko opisanych w literaturze naukowej. W kontekście obecnego wynalazku, termin „unieruchomienie” odnosi się zarówno do połączeń nie-kowalencyjnych, takich jak adsorpcja, jak i kowalencyjnych (które mogą być bezpośrednim wiązaniem między antygenem i grupami funkcyjnymi na podłożu albo wiązaniem wytworzonym przy użyciu czynnika wiążącego). Korzystne jest unieruchomienie przez adsorpcję do studzienki płytki mikrotitracyjnej lub membrany. W tym przypadku, adsorpcję można uzyskać przez umieszczenie przeciwciała na odpowiedni czas w odpowiednim buforze, w obecności stałego podłoża. Czas kontaktu zmienia się stosownie do temperatury, ale typowo jest zawarty pomiędzy 1 godziną a 1 dniem. Na ogół, umieszczenie w plastikowej studzience (na przykład polistyrenowej lub z polichlorku winylu) płytki mikrotitracyjnej przeciwciała w ilości 1 pg do 10 ng, a korzystnie 100 do 200 ng, jest wystarczające do unieruchomienia odpowiedniej ilości polipeptydu.

Wiązanie kowalencyjne przeciwciała z podłożem stałym też może być utworzone przez reakcję podłoża z bi - funkcjonalnym odczynnikiem, który reaguje z podłożem i grupą funkcyjną, taką jak grupa hydroksylowa albo grupa aminowa na przeciwciele. Na przykład, przeciwciało może być wiązane w sposób kowalencyjny z podłożem pokrytym odpowiednim polimerem przez zastosowanie benzochinonu lub przez kondensację grupy aldehydowej z podłoża z aminą i aktywowanym wodorem na partnerze stosownie do standardowych technik.

PL 204 844 B1

W pewnych przypadkach, test do wykrywania polipeptydu w próbce jest „kanapkowym” testem podwójnego przeciwciała. Ten test można przeprowadzić przez umieszczenie przeciwciała unieruchomionego na stałym podłożu, razem ze studzienką płytki mikrotitracyjnej, w obecności biologicznej próbki, tak że polipeptyd w próbce może wiązać unieruchomione przeciwciało. Niezwiązane produkty usuwa się z kompleksu polipeptyd-przeciwciało i dodaje się drugie przeciwciało (zawierające resztę znacznikową) zdolne do wiązania różnych miejsc polipeptydu. Ilość drugorzędnego przeciwciała, które pozostaje związane ze stałym podłożem, określa się stosując odpowiedni sposób specyficzny dla reszty znacznikowej.

Bardziej konkretnie, gdy przeciwciało jest unieruchamiane na określonym powyżej podłożu, typowo blokuje się miejsca wiążące białka. Może być stosowany dowolny czynnik blokujący znany specjaliście, taki jak albumina surowicy wołowej lub Tween 20™ (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA). Następnie unieruchomione przeciwciało inkubuje się z próbką i polipeptyd może wiązać przeciwciało. Próbka może być przed inkubacją rozpuszczana w odpowiednim rozcieńczalniku, takim jak buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS).

Na ogół, właściwy czas kontaktu (tj. czas inkubacji) jest okresem wystarczającym do wykrywania obecności polipeptydu w próbce otrzymanej od osobnika. Korzystnie, czas kontaktu jest definiowany jako czas wystarczający do osiągnięcia co najmniej 95% poziomu wiązania osiąganego z równowagą między peptydem związanym i niezwiązanym. Specjalista będzie wiedział, że czas konieczny do osiągnięcia równowagi musi być określony przez pomiar poziomu wiązania w czasie. W temperaturze otoczenia, na ogół wystarczający jest 30-minutowy czas inkubacji. Następnie niezwiązane produkty można usunąć przez przemywanie stałego podłoża odpowiednim buforem, takim jak roztwór buforowany fosforanem soli fizjologicznej zawierający 0,1% Tween 20™. Następnie do podłoża stałego dodaje się drugie przeciwciało zawierające resztę znacznikową.

Reszty znacznikowe korzystnie obejmują enzymy (takie jak peroksydaza), substraty, kofaktor, inhibitory barwienia, grupy luminescencyjne, grupy fluorescencyjne i biotynę. Koniugację przeciwciała z resztą znacznikową można osiągnąć przy użyciu standardowych metod znanych specjaliście.

Następnie inkubuje się drugie przeciwciało z unieruchomionym kompleksem przeciwciało-polipeptyd przez czas wystarczający do wykrycia związanego polipeptydu.

Ogólnie odpowiedni czas może być zwykle określony przez mierzenie poziomu wiązania w czasie. Wtedy drugie niezwiązane przeciwciało usuwa się, a przeciwciało związane wykrywa się przy użyciu reszty znacznikowej. Sposób stosowany do wykrywania reszty znacznikowej zależy od jej natury. Dla grup radioaktywnych stosuje się głównie scyntylację lub metody zliczania autoradiograficznego. Metody spektroskopowe mogą być stosowane do detekcji czynników znakowanych, grup fluoroscencyjnych albo luminoscencyjnych. Biotyna może być wykrywana z użyciem awidyny, związanej z resztą znacznikową (razem z radioaktywną albo fluorescencyjną grupą albo enzymem). Enzymatyczne reszty znacznikowe mogą być wykrywane przez dodanie substratu (w ciągu odpowiedniego czasu) z następującą później analizą spektroskopową (albo inną) produktów reakcji.

W celu określenia obecności albo nieobecność raka, sygnał wykrywany przez resztę znacznikową związaną ze stałym podłożem zwykle jest porównywany z sygnałem odpowiadającym ustalonej wartości dla tkanki nieguzowej. Korzystnie wartość graniczna jest średnim sygnałem otrzymywanym, gdy unieruchomione przeciwciało jest inkubowane z próbkami od pacjentów zdrowych. Na ogół, próbka generująca sygnał odpowiadający 3-krotnie większemu albo 3-krotnie mniejszemu niż odchylenie standardowe z góry określonej wartości granicznej, jest rozważana jako wskazująca.

Bardziej szczegółowe informacje, specjalista znajdzie w następującej publikacji: Sackett et al., Clinical Epidemiology. A basic Science for Clinical Medicine, p. 106-107 (Little Brown and Co., 1985).

Obecność albo nieobecność raka u pacjenta może też być określona przez ocenianie poziomu mRNA kodującego polipeptyd według niniejszego wynalazku w próbce biologicznej (na przykład biopsji) w stosunku do założonej z góry wartości granicznej.

Taką ocenę można przeprowadzić wieloma metodami znanymi specjaliście, na przykład, metodą hybrydyzacji in situ i amplifikacji przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). Sondy i startery stosowane w takich metodach mogą być wytwarzane z sekwencji opisanych w przykładach lub z podobnych sekwencji zidentyfikowanych u innych osobników. Sondy mogą być używane w standardowych technikach hybrydyzacji i mogą być znaczone czynnikiem markerowym w celu ułatwienia wykrycia sondy. Takie odczynniki obejmują (ale nie wyłącznie): radionuklidy, barwniki fluorescencyjne i enzymy zdolne do katalizowania tworzenia się wykrywalnych produktów.

PL 204 844 B1

Startery mogą być na ogół używane w metodach wykrywania obejmujących łańcuchową reakcję polimerazy (PCR), takich jak RT-PCR, w której PCR jest stosowana w połączeniu z odwrotną transkrypcją. Typowo, RNA jest ekstrahowany z próbki tkanki i transkrybowany w odwrotny sposób w celu wytworzenia cząsteczek cDNA. Amplifikacja PCR przy użyciu specyficznych starterów wytwarza cząsteczki cDNA związane z modulacją proliferacji komórkowej, które mogą być rozdzielane i wizualizowane, na przykład, metodą elektroforezy na żelu. Amplifikację typowo przeprowadza się na próbkach otrzymanych od par tkanek od tego samego osobnika guzowych i nieguzowych, albo też od par tkanek guzowych i nieguzowych od różnych osobników. Reakcję amplifikacji można przeprowadzić w kolejnych rozcieńczeniach cDNA pokrywających 2 rzędy wielkości. Modyfikacja ekspresji przez czynnik równy 2 albo więcej w rozcieńczeniach próbki guzowej w porównaniu z tym samym rozcieńczeniem próbki zdrowej typowo rozważana jest jako wskazująca.

Ponadto pewne testy, które mają na celu ustalenie diagnozy, mogą być przeprowadzone bezpośrednio na guzie.

Taki test obejmuje kontakt komórek guza z przeciwciałem albo jego fragmentem, który wiąże białko związane z modulacją proliferacji komórkowej. Związane przeciwciało lub jego fragment może być wykrywane bezpośrednio lub pośrednio przez resztę znacznikową. Takie przeciwciała mogą też być używane w badaniach histologicznych. Alternatywnie, w takich zastosowaniach może być używany polinukleotyd antysensowny.

Rozwój i/lub odpowiedź na leczenie raka mogą być monitorowane przez przeprowadzenie dowolnego z testów opisanych powyżej w czasie i ocenę zmiany w poziomie odpowiedzi (tj. wykrywanej ilości polipeptydu albo mRNA). Na przykład, testy można przeprowadzać co miesiąc przez okres 1 do 2 lat. Zwykle, rak rozwija się u pacjentów, u których poziom odpowiedzi zmniejsza się w czasie. Odwrotnie, rak nie rozwija się, gdy wykrywany sygnał pozostaje stały lub wzrasta w czasie.

Niniejszym ujawniono również zestaw do użytku we wszystkich metodach diagnozowania opisanych powyżej. Takie zestawy obejmują 2 składniki (lub więcej) konieczne do przeprowadzenia takich testów. Takimi składnikami mogą być produkty, odczynniki i/lub naczynia albo wyposażenie. Na przykład, naczynie w zestawie może zawierać monoklonalne przeciwciało lub jego fragment, które specyficznie wiąże polipeptyd związany z modulacją proliferacji komórkowej. Takie przeciwciała lub ich fragmenty mogą być dostarczane przymocowane do materiału podłoża jak opisywano powyżej. Jedno albo więcej dodatkowe naczynie może zawierać elementy, takie jak odczynniki albo bufory, używane w teście. Takie zestawy mogą też zawierać odczynnik wykrywający (na przykład przeciwciało) zawierający resztę znacznikową odpowiednią do bezpośredniego albo pośredniego wykrywania związanego przeciwciała.

Sposoby identyfikowania czynników wiążących albo modulujących

Polipeptyd według wynalazku może służyć do identyfikowania produktów, które wiążą i/lub które modulują ekspresję białek związanych z modulacją proliferacji komórkowej. Takie czynniki można identyfikować doprowadzając do kontaktu polipeptyd dostarczony w obecnym wynalazku z produktem-kandydatem/czynnikiem w warunkach i przez czas wystarczający aby zaszła interakcja z polipeptydem i/lub jego efektorem (na przykład jego receptorem). Każda różnorodność testu wiązania dobrze znana specjaliście może być przeprowadzona w celu testowania zdolności wiązania produktu-kandydata z polipeptydem albo jego efektorem (na przykład jego receptorem).

W innych testach, czynniki mogą być przesiewane z użyciem komórek, które są znane z tego, że mają zwiększoną ekspresję genu związanego z modulacją proliferacji komórkowej. Takie komórki można doprowadzić do kontaktu z czynnikami-kandydatami i ocenić ekspresję genu związanego z modulacją proliferacji komórkowej w odniesieniu do ekspresji obserwowanej podczas nieobecności czynnika-kandydata.

Alternatywnie, można przesiewać produkty, które są kandydatami, na ich zdolność do modulowania ekspresji (na przykład transkrypcji) białka związanego z modulacją proliferacji komórkowej. W celu ocenienia wpływu czynnika-kandydata na ekspresję białka połączonego z modulacją proliferacji komórkowej, promotor albo jego element regulatorowy może być związany z genem znacznikowym, jak opisano powyżej. Taki konstrukt może być transfekowany do odpowiednich komórek gospodarza, które są następnie doprowadzane do kontaktu z czynnikiem-kandydatem.

Omawiane komórki gospodarza są korzystnie używane do przeszukiwania bibliotek małych cząsteczek pochodzących z programów chemii kombinatorycznej. Według tego korzystnego wariantu, komórki są inkubowane z biblioteką, następnie komórki poddaje się lizie i supernatant analizuje się na aktywność genu znacznikowego według protokołów standardowych.

PL 204 844 B1

Produkty, które zwiększają aktywność genu znacznikowego są induktorami transkrypcji genu związanego z modulacją proliferacji komórkowej i dlatego mogą być używane do hamowania rozwoju raka.

Jeśli nie stwierdzono inaczej, wszystkie techniczne i naukowe terminy tutaj używane mają to samo znaczenie jak terminy zwykle rozumiane przez przeciętnego specjalistę w dziedzinie, do której należy ten wynalazek.

Następujące przykłady są przedstawione w celu zilustrowania procedur i w żadnym wypadku nie powinny być traktowano jako ograniczające zakres wynalazku.

Przykłady:

P r z y k ł a d 1

Izolacja i charakteryzacja fragmentów cDNA o Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 5.

Sekwencję DNA Id. Sekw. Nr. 1, obecną w publicznej bazie danych zawierającej EST-y przyjęto (Genbank, numer dostępu AA176076), i odtworzono poniżej:

ctccatgana tgccactgtt cctgaccagc cgaagtccag gcagggggag gtttccttgt €1 ccaggaggga gaggacctcc accctctgac ctttcagttt tccatagcag cccagtgtga

121 agctcggcag ngggtgggca gggcatcagg acaagatgaa gatgctggct ctggaatgag

181 gactccecfct ggcataaggg gtagtggctg gcagaggttg cccagctctt ttggaggcca

241 eagggaatag aggtggggtg gtgcttccgt tcctgtgagg cccgcccccc tgagccccct

301 ccgtcfcgctt cttgtfctggc agaaatagat gtggggcaca gcctaagaat gatgggaatc

361 tgcccaagct gtgccctctg gggaaatgaa atcttgctcc tcgtgcagct tccccttttc

421 ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggaaggggt tgctggggtg

481 ccaagctcca acctttgctc gctggcagaa ggaaggaagc acctcctgta tctttcaggg

541 ncctgaagcc antttgccfcc agagaagaga nagtcc

Dla tej sekwencji, parę starterów 5' Fwd1 i 3' Rev1 odpowiednich sekwencji Id. Sekw. Nr 2 i Id. Sekw. Nr 3 (odtworzone poniżej) syntetyzowano w celu otrzymania sondy pozwalającej na klonowanie kompletnego cDNA zawierającego kompletną otwartą ramkę odczytu kodującą odpowiadający gen.

Sekwencje o Id. Sekw. Nr 2 i Id. Sekw. Nr 3 są następujące:

Sekw. Id. Nr2 : 5’-CTG ACC TTT CAG TTT TCC ATA GC-3’

Sekw. Id. Nr 3 :

5-ATC TAT TTC TGC CAA ACA AGA A-3’

W początkowej fazie, łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) przeprowadza się na serii handlowo dostępnych banków cDNA stosując startery sekwencji o Id. Sekw. Nr 2 i Id. Sekw. Nr 3. Warunki reakcji obejmują 0,5 μΜ Fwd1 (Id. Sekw. Nr 2) i Rev1 (Id. Sekw. Nr 3), 200 μΜ trifosforanów dezoksynukleotydów (lub dNTPs: dATP, dCTP, dGTP i dTTP), 10 mM Tris HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ i 0,5 U polimerazy DNA Taq w objętości końcowej 50 gl. Parametry cyklu termicznego obejmują denaturację przy 94°C w ciągu 30 sekund, hybrydyzację starterów przy 60°C w ciągu 1 minuty i rozszerzenie polimeryzacji przy 72°C w ciągu 30 sekund (z końcowym rozszerzeniem 5 minut).

Produkty otrzymywane przez PCR rozdziela się na 1% żelu agarozowym i wizualizuje się przy pomocy barwienia bromkiem etydyny. Wyniki pokazują prążek 245 par zasad w bankach cDNA z ludzkiego mózgu, przysadki, płuca, nerki i jelita (Quantum)i 290 par zasad w banku cDNA z ludzkiego sutka i prostaty. Wyniki te są odtworzone na figurze 1.

Produkty tak otrzymywane przez PCR oczyszcza się przez elektrowymywanie i używa się jako sondy do klonowania cDNA zawierającego kompletną otwartą ramkę odczytu stosując wskazówki producenta do zastosowania zestawu do klonowania cDNA ClonCapture (Clontech).

Sekwencje kwasu nukleinowego pozytywnych klonów określa się przy użyciu automatycznego sekwenatora. To są sekwencje o Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 5 przedstawione poniżej: Id. Sekw. Nr 4:

PL 204 844 B1 aggagggtct gaaggtggga gggcagctcc atgagcagcc actgttcctg aęcagccgaa 61 gtgccaggca gggggaggtt tccatgtcca ggagggagag gacctccacc ctctgacctt 121 tcagttttcc atagcagccc agtgtgaagc tcggcggggg tgggcagggc atcaggacaa 181 gatgaagatg ctggctctgg aatgaggact ccccttgggc taaggggtag tggctggcag 241 aggttgccca gctcttttgg aggccacagg gaatagaggt ggggtggtgc ttccgttcct 301 gtgaggcccg cccccctgag ccccctcgtc tgcttcttgt ttggcagaaa tagatgtggg 361 gcacagcccc tagatgatgg gaatctgccc aagctgtgtc ctctggggaa tgaaatcttg 421 ctcctcatgc agcttcccct ttcccttgcg gggtgggggc tgggggtgcc aaggctccac 481 ccttggaggg ggttgctggg ggtgccaagg ctccaccctt tgctcgctgg gcagagggaa 541 ggaagcacct ccctgtatgc tctgcagggg cccctgcagg ccactttgcc tcagaggaag 601 gaggagaggt cccctgggaa aatgcgcaca cacacacaca cacacacacg cacacacaca 661 cgcacatgca cacacgcacg catgcacaca cacacacata tgtgcagggg tgcagcctaa

721 gtcagtggag ccaggactgg ctgcgcagct gggcctgccc cattcttgga gtcccoaggg 781 aatgagcctc aggatccact tcgtcccttg tttctaagcc aggctgcacg gccgttcctg 841 ggtgtgaaag cattctgtcc tgtctccagt cagagggaac cgcccccaaa ctagaaagct 901 aatttccccc gaaggttoat gaagccagag geatgcoott gggggttggt cgggagaagg 961 gtgagaggca gtgctgtgga aggggcctgg cccctgctgc ctgcgattc

Id. Sekw. Nr5

1	aggagggtct	gaaggtggga	gggcagctcc	atgagcagcc	actgttcctg	accagccgaa
61	gtgccaggca	gggggaggtt	tccatgtcca	ggagggagag	gacctccacc	ctctgacctt
121	tcagttttcc	atagcagccc	agtgtgaagc	tcggcggggg	tgggcagggc	atcaggacaa
181	gatgaagatg	ctggctctgg	aatgaggact	ccccttgggc	taaggggtag	tggctggcag
241	aggttgccca	gctcttttgg	aggccacagg	gaatagaggt	ggggtggcaa	caggaaatag
301	ggtgtgggct	gtagaccata	gtgggtgggg	tggtgcttcc	gttcctgtga	ggcccgcccc
361	cctgagcccc	ctcgtctgct	tcttgtttgg	cagaaataga	tgtggggcac	agcccctaga
421	tgatgggaat	ctgcccaagc	tgtgtcctct	ggggaatgaa	atcttgctcc	tcatgcagct
481	tcccctttcc	cttgcggggt	gggggctggg	ggtgccaagg	ctccaccctt	ggagggggtt
541	gctgggggtg	ccaaggctcc	accctttgct	cgctgggcag	agggaaggaa	gcacctccct
601	gtatgctctg	caggggcccc	tgcaggccac	tttgcctcag	aggaaggagg	agaggtcccc
661	tgggaaaatg	cgcacacaca	cacacacaca	cacacgcaca	cacacacgca	catgcacaca
721	cgcacgcatg	cacacacaca	cacatatgtg	caggggtgca	gcctaagtca	gtggagccag
781	gactggctgc	gcagctgggc	ctgccccatt	cttggagtcc	ccagggaatg	agcctcagga
841	tccacttcgt	cccttgtttc	taagccaggc	tgcacggccg	ttcctgggtg	tgaaagcatt
901	ctgtcctgtc	tccagtcaga	gggaaccgcc	cccaaactag	aaagctaatt	tcccccgaag
961	gttcatgaag	ccagaggcat	gcccttgggg	gttggtcggg	agaagggtga	gaggcagtgc
1021	tgtggaaggg	gcctggcccc	tgctgcctgc	gattc

PL 204 844 B1

P r z y k ł a d 2

Klonowanie w wektorze ekspresyjnym Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 5

Sekwencje kwasu nukleinowego o Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 5 dają początek syntezie nowych starterów 5'F1 i 3'R1 odpowiednich sekwencji Id. Sekw. Nr 6 i Id. Sekw. Nr 7 (przedstawionych poniżej). Te sekwencje odpowiednio zawierają miejsca restrykcyjne Hindlll i EcoRI.

Sekwencje Id. o Sekw. Nr 6 i Id. Sekw. Nr 7 są następujące:

Id. o Sekw. Nr 6:

5'- GCA AGC TTG CGG GGG AGG AGG AGG G -3'

Id. o Sekw. Nr 7:

5'- CGG AAT TCC CGG GGG GAA TCG CAG -3'

Reakcję PCR przeprowadza się stosując takie same warunki reakcji jak opisywane w przykładzie 1 ze starterami o Id. Sekw. Nr 6 i Id. Sekw. Nr 7. Produkty otrzymane w tej reakcji PCR mogą być wstawiane bezpośrednio do wektora ekspresyjnego typu, ale nie jedynie w ten sposób, pCDNA3.1 (InVitrogen). Po stadium amplifikacji PCR, produkty poddaje się hydrolizie Hindlll i EcoRI w celu uwolnienia końców zawierających te sekwencje, następnie oczyszcza się z żelu agarozowego przez elektrowymywanie.

Następnie wstawia się sekwencje o Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 5, na przykład, do wektora ekspresyjnego, takiego jak pCDNA3.1 (InVitrogen). Analiza przez trawienie odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi różnych klonów bakteryjnych, które otrzymały ten wektor ekspresyjny, dała możliwość Izolacji bakteryjnych klonów zawierających nowy konstrukt „wektor ekspresyjny/Id. Sekw. Nr 4” albo „wektor ekspresyjny/Id. Sekw. Nr 5”.

Te konstrukty plazmidowe wytwarza się w dużych ilościach stosując zestaw do oczyszczania plazmidowego DNA (Qiagen).

Własności polinukleotydów o sekwencji Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 5

Ekspresja polinukleotydów o sekwencji Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 5 w tkankach ludzkich guzów.

Przygotowywanie RNA z hodowli komórkowych i tkanek guzowych

Komórki w hodowli tkanek guzowych trzyma się w -80°C przed etapami ekstrakcji całkowitych RNA. Ekstrakcja całkowitych RNA opiera się na technice opisywanej w literaturze naukowej (Chomczyński i Sacchi, Anal. Biochem. (1987), 162, 156) przy użyciu odczynnika Trizol (Gibco/BRL). Jakość tak ekstrahowanych RNA analizuje się na 1% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny.

Transkrypcja odwrotna z RNA

Całkowite RNA transkrybuje się w odwrotny sposób ze starterami oligonukleotydowymi Oligo (dT) przy użyciu Superscript® odwrotnej transkryptazy zgodnie ze wskazówkami producenta (Gibco/BRL).

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) na produktach otrzymanych w wyniku odwrotnej transkrypcji

Analizę ekspresji sekwencji o Id. Sekw. Nr 4 albo Id. Sekw. Nr 5 przeprowadza się przez łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) na produktach odwrotnej transkrypcji przy użyciu starterów 5' Fwd1 i 3' Rev1 poszczególnych sekwencji Id. Sekw. Nr 2 i Id. Sekw. Nr 3. Warunki reakcji obejmują 0,5 μM Fwd1 i Rev1,200 μM dNTP, 10 mM Tris HCl (pH 8,3) 50 mM KCl 1,5 mM MgCl₂ i 0,5 j polimerazy Taq DNA w końcowej objętości 50 μΕ Parametry cyklu termicznego obejmują denaturowanie przy 94°C przez 30 sekund, hybrydyzację starterów przy 60°C przez 1 minutę i rozszerzenie polimeryzacji przy 72°C przez 30 sekund (z końcowym rozszerzeniem do 5 minut).

Produkty otrzymywane przez PCR są rozdzielane na 1% żelu agarozowym i wizualizowane przy użyciu barwienia bromkiem etydyny.

W pewnych przypadkach, analizę hybrydyzacji na nylonowej błonie przeprowadzano przy użyciu jako sondy sekwencje o Id. Sekw. Nr 4 znaczonej alpha P32 dCTP, stosując przypadkowy zestaw znakujący (Pharmacia). Następnie błonę przemywano w mało ostrych warunkach (2 XSSC, 0,1% SDS przy 60°C) następnie w warunkach wysokiej ostrości (0,1 XSSC, 0,1% SDS przy 65°C). Następnie błonę eksponuje się na film Kodak XAR.

Analiza ekspresji polinukleotydów o sekwencji Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 5 w próbkach guza sutka.

Analizę ekspresji polinukleotydów sekwencji Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 5 przeprowadzono na 15 próbkach chirurgicznie usuwanych od pacjentów z guzami sutka. cDNA otrzymywane według protokołu opisanego powyżej standaryzowano stosując znacznik G3PDH (dehydrogenazę gliceroaldehydo-3-fosforanową) wyrażany w stabilny sposób w celu kontrolowania różnic w ilości RNA albo cDNA między próbkami. Następnie produkty reakcji PCR hybrydyzowano na błonie nylonowej według protokołu opisanego powyżej.

PL 204 844 B1

Otrzymane wyniki, przedstawiane na figurze 2, pokazują, że w taki sposób obecność polinukleotydu o sekwencji Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 5 może być wizualizowana w próbkach guzów z raków sutka.

Zahamowanie proliferacji komórkowej przez polinukleotydy o Id. Sekw. Nr 4 i Id. Sekw. Nr 5

Komórki guza prostaty DU 145 (Kod ATCC) hoduje się w pożywce DMEM (Dulbecco's Modyfied

Eagle's Medium) zawierającej 100 j/ml penicyliny i 100 μg/ml siarczanu streptomycyny, uzupełnionej 10% surowicą płodową cielęcia. Komórki hoduje się 24 godziny przed protokołem transfekcyjnym pozwalając na normalny metabolizm komórek i lepszą wydajność transfekcji. Stosując odczynnik Effelctone® zgodnie z zaleceniami producenta (Qiagen) uzyskano zwiększając stężenie (1,5 i 10 μg) samego wektora (pCDNA 3.1) albo wektora zawierającego sekwencję polinukleotydową Id. Sekw. Nr 4 (1,5 i 10 μg) lub sekwencję polinukleotydową Id. Sekw. Nr 5 (1,5 i 10 μg). Komórki odzyskuje się 48 godzin po transfekcji przez traktowanie trypsyną, a następnie liczy się. W tej samej temperaturze, komórki wiruje się przy 5000 obr./min, następnie mrozi przy - 80°C dla ekstrakcji RNA jak opisano powyżej (por. część zatytułowana „Preparacja RNA z hodowli komórkowych i tkanek guzowych”).

Wyniki przedstawiono na figurze 3 (polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 4) i na figurze 4 (polinukleotyd sekwencji Id. Sekw. Nr 5). Wskazują one, że cDNA kodujący polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 4 albo kodujący polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 5 jest wyrażany w stosunku do ilości wektora ekspresyjnego zawierającego polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 4 albo polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 5 (Część A).

Ponadto, wyniki wskazują, że wzrost komórek jest znacząco hamowany w obecności zwiększonego stężenia wektora ekspresyjnego zawierającego polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 4 albo polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 5 w stosunku do wzrostu komórek transfekowanych 10 μg samego wektora (Część B). Korelacja między hamowaniem wzrostu komórek guzowych i ilością transfekowanego wektora zawierającego polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 4 albo polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 5 jest równa odpowiednio 1 albo 0,96.

Polipeptyd kodowany od fragmentu sekwencji Id. Sekw. Nr 5

W sekwencji o Id. Sekw. Nr 5 obserwuje się otwartą ramkę odczytu z kodonem inicjacji (ATG) kodującym początkową metioninę w pozycji 420 i kodonu stop (UAA) w pozycji 861. Białko o sekwencji Id. Sekw. Nr 8, składające się ze 147 aminokwasów odpowiada właśnie ulegającemu translacji polinukleotydowi i jest przedstawione poniżej:

MMGICPSCVLWGMKSCSSCSFPFPLRGGGW 30

GCQGSTLGGGCWGCQGSTLCSLGRGKEAPP 60

CMLCRGPCRPLCLRGRRRGPLGKCAHTHTH 90

THAHTHAHAHTHACTHTHICAGVQPKSVBP 120

GLAAQLGLPHSWSPQGMSLRIHFVPCF 147

Polinukleotyd, któremu odpowiada białko o sekwencji Id. Sekw. Nr 8, ma sekwencję nukleotydową Id. Sekw. Nr 9 przedstawioną poniżej:

atgatgggaa tctgcccaag ctgtgtcctc tggggaatga aatcttgctc ctcatgcagc ttcccctttc ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggagggggt

121 tgctgggggt gccaaggctc caccctttgc tcgctgggca gagggaagga agcacctccc

181 tgtatgctct gcaggggccc ctgcaggcca ctttgcctca gaggaaggag gagaggtccc

241 ctgggaaaat gcgcacacac acacacacac acacacgcac acacacacgc acatgcacac

301 acgcacgcat gcacacacac acacatatgt gcaggggtgc agcctaagtc agtggagcca

361 ggactggctg cgcagctggg cctgccccat tcttggagtc cccagggaat gagcctcagg

421 atccacttcg tcccttgttt ctaa

PL 204 844 B1

Legenda do figur

Na figurze 1 przedstawiono wyniki otrzymane przez PCR po rozdzieleniu na 1% żelu agarozowym i wizualizacji przy użyciu barwienia bromkiem etydyny.

Na figurze 2 przedstawiono wyniki otrzymane metodą Southern blot na 15 próbkach raków sutka (nazwanych S1 do S15).

Na figurze 3 przedstawiono w Części A, ekspresję cDNA kodującego polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 4 w komórkach DU 145 (guz prostaty), a w Części B zahamowanie wzrostu komórek w obecności wzrastających stężeń wektora ekspresyjnego zawierającego polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 4.

W końcu, na figurze 4 przedstawiono, w Części A, ekspresję cDNA kodującego polinukleotydu o sekwencji Id. Sekw. Nr 5 w komórkach Du 145 (guza prostaty), a w części B zahamowanie wzrostu komórek w obecności wzrastającego stężenia wektora ekspresyjnego zawierającego polinukleotyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 5.

PL 204 844 B1 . Lista sekwencji <110> Societó de Conseils de Recherches et d’Application < 12 0> Polinukleotyd przydatny do modulowania proliferacji komórki rakowej <130 RS 314 PCT - Hap-1 <140 <141>

<150 FR 01/02801 <151> 2001-03-01 <160 9 <170 Patent w wersji 2.1 <210 l <211> 576 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctccatgana tgccactgtt cctgaccagc cgaagtccag gcagggggag gtttccttgt 60 ccaggaggga gaggacctcc accctctgac ctttcagttt tccatagcag cccagtgtga 120 agctcggcag ngggtgggca gggcatcagg acaagatgaa gatgctggct ctggaatgag 180 gactcccctt ggcataaggg gtagtggotg gcagaggttg cccagctctt ttggaggcca 240 cagggaatag aggtggggtg gtgcttccgt tcctgtgagg cccgcccccc tgagccccct 300 ccgtctgctt cttgtttggc agaaatagat gtggggcaca gcctaagaat gatgggaatc 360 tgcccaagct gtgccctctg gggaaatgaa atcttgctcc tcgtgcagct tccccttttc 420 ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggaaggggt tgctggggtg 480 ccaagctcca acctttgctc gctggcagaa ggaaggaagc acctcctgta tctttcaggg 540 ncctgaagcc antttgcctc agagaagaga nagtcc 576 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> ·

Sztuczna sekwencja <220>

<223> Qpi_s sztucznej oligonukleotydowej sekwencji 5’ <400> 2 ctgacctttc agttttccat agc

PL 204 844 B1 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opi_s sztucznej oligonukłeotydowej sekwencji 3’ <400> 3 atctatttct gccaaacaag aa <210> 4 <211> 1009 <212> DNA <213> Homo sapiens <300>

<308> GenBank: AK000755 <400> 4 aggagggtct gaaggtggga gggcagctcc gtgccaggca gggggaggtt tccatgtcca tcagttttcc atagcagccc agtgtgaagc gatgaagatg ctggctctgg aatgaggact aggttgccca gctcttttgg aggccacagg gtgaggcccg cccccctgag ccccctcgtc gcacagcccc tagatgatgg gaatctgccc ctcctcatgc agcttccoct ttcccttgcg ccttggaggg ggttgctggg ggtgccaagg ggaagcacct ccctgtatgc tctgcagggg gaggagaggt cccctgggaa aatgcgcaca cgcacatgca cacacgcacg catgcacaca gtcagtggag ccaggactgg ctgcgcagct aatgagcctc aggatccact tcgtcccttg ggtgtgaaag cattctgtcc tgtctccagt aatttccccc gaaggttcat gaagccagag gtgagaggca gtgctgtgga aggggcctgg <210> 5 <211> 1055 <212> DNA <213> Homo sapiens atgageagee actgttcctg accagccgaa €0 ggagggagag gacctccacc ctctgacctt 120 tcggcggggg tgggcagggc atcaggacaa 1B0 ccccttgggc taaggggtag tggctggcag 240 gaatagaggt ggggtggtgc ttccgttoct 300 tgcttcttgt ttggcagaaa tagatgtggg 360 aagctgtgtc ctctggggaa tgaaatcttg 420 gggtgggggc tgggggtgcc aaggctocac 480 ctccaccctt tgctcgctgg gcagagggaa 540 cccctgcagg ccactttgcc tcagaggaag 600 cacacacaca cacacacacg cacacacaca 660 cacacacata tgtgcagggg tgcagcctaa 720 gggcctgccc cattcttgga gtccccaggg 780 tttctaagcc aggctgcacg gccgttcctg 840 cagagggaac cgcccccaaa ctagaaagct 900 gcatgccctt gggggttggt cgggagaagg 960 cccctgctgc ctgcgattc 1009

PL 204 844 B1 <400> 5 aggagggtct gaaggtggga gggcagctcc atgagcagcc actgttcctg accagccgaa 60 gtgccaggca gggggaggtt tccatgtcca ggagggagag gacctccacc ctctgacctt 120 tcagttttcc atagcagccc agtgtgaagc tcggcggggg tgggcagggc atcaggacaa 180 gatgaagatg ctggctctgg aatgaggact ccccttgggc taaggggtag tggctggcag 240 aggttgccca gctcttttgg aggccacagg gaatagaggt ggggtggcaa caggaaatag 300 ggtgtgggct gtagaccata gtgggtgggg tggtgcttcc gttcctgtga ggcccgcccc 360 cctgagcccc ctcgtctgct tcttgtttgg cagaaataga tgtggggcac agcccctaga 420 tgatgggaat ctgcccaagc tgtgtcctct ggggaatgaa atcttgctcc tcatgcagct 480 tcccctttcc cttgcggggt gggggctggg ggtgccaagg ctccaccctt ggagggggtt 540 gctgggggtg ccaaggctcc accctttgct cgctgggcag agggaaggaa gcacctccct 600 gtatgctctg caggggcccc tgcaggccac tttgcctcag aggaaggagg agaggtcccc 660 tgggaaaatg cgcacacaca cacacacaca cacacgcaca cacacacgca catgcacaca 720 cgcacgcatg cacacacaca cacatatgtg caggggtgca gcctaagtca gtggagccag 780 gactggctgc gcagctgggc ctgccccatt cttggagtcc ccagggaatg agcctcagga 840 tccacttcgt cccttgtttc taagccaggc tgcacggccg ttcctgggtg tgaaagcatt 900 ctgtcctgtc tccagtcaga gggaaccgcc cccaaactag aaagctaatt tcccccgaag 960 gttcatgaag ccagaggcat gcccttgggg gttggtcggg agaagggtga gaggcagtgc 1020 tgtggaaggg gcctggcccc tgctgcctgc gattc 1055 <210 6 <211> 25 <212> DNA <213^> Sztuczna sekwencja <220 <22 3> Opis sztucznej oligonukleotydowej sekwencji 5’ <400> 6 gcaagcttgc gggggaggag gaggg ₂₅ <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opi_s sztucznej oligonukleotydowej < sekwencji 3’ <400> 7 cggaattccc ggggggaatc gcag ’ ₂4 <210> 8

PL 204 844 B1 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400

> 8

Met

Gly

Ile

Cys

Pro

Ser

Cys

Val

leu

Trp

Gly

Met

Lys

Ser

Cys

1

5

10

15

Ser

Sez

Cys

Ser

Phe

Pro

Phe

Pro

Leu

Arg

Gly

Trp

Gly

Cys

20

25

30

Gin

Gly

Ser

Thr

Leu

Gly

Cys

Trp

Gly

Cys

Gin

Gly

Ser

Thr

35

40

45

Leu

Cys

Ser

leu

Gly

Arg

Gly

Lys

Glu

Ala

Pro

Cys

Met

Leu

Cys

50

55

60

Arg

Gly

Pro

Cys

Arg

Pro

Leu

Cys

Leu

Arg

Gly

Arg

Gly

Pro

65

70

75

80

Leu

Gly

Lys

Cys

Ala

His

Thr

His

Thr

His

Thr

His

Ala

His

Thr

His

85

90

95

Ala

His

Ala

His

Thr

His

Ala

Cys

Thr

His

Thr

His

Ile

Cys

Ala

Gly

100

105

110

Val

Gin

Pro

Lys

Sez

Val

Glu

Pro

Gly

Leu

Ala

Gin

Leu

Gly

Leu

115

120

125

Pro

His

Ser

Trp

Sez

Pro

Gin

Gly

Met

Ser

Leu

Arg

Ile

His

Phe

Val

130 . 135 140

Pro Cys Phe 145 <210> 9 <211> 444 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgatgggaa tctgcccaag ctgtgtcctc tggggaatga aatcttgctc ctcatgcagc 60 ttcccctttc ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggagggggt 120 tgctgggggt gccaaggctc caccctttgc tcgctgggca gagggangga agcacctccc 180 tgtatgctct gcaggggccc ctgcaggcca ctttgcctca gaggaaggag gagaggtccc 240 ctgggaaaat gcgcacacac acacacacac acacacgcac acacacacgc acatgcacac 300 acgcacgcat gcacacacac acacatatgt gcaggggtgc agcctaagtc agtggagcca 360 ggactggctg cgcagctggg cctgccccat tcttggagtc cccagggaat gagcctcagg 420 atccacttcg tcccttgttt ctaa 444

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Izolowany polinukleotyd obejmujący sekwencję polinukleotydową o Id. Sekw. Nr 5.
2. Polinukleotyd antysensowny obejmują cy sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydu określonego w zastrz. 1.
3. Izolowany polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej Id. Sekw. Nr 9.
4. Izolowany polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej komplementarnej do sekwencji nukleotydowej o Id. Sekw. Nr 9.
5. Izolowany polipeptyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 8.
6. Przeciwciał o monoklonalne, lub jego fragment wiążący antygen, które specyficznie wiążą izolowany polipeptyd określony w zastrz. 5.
7. Wektor ekspresyjny obejmują cy izolowany polinukleotyd, który stanowi izolowany polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej Id. Sekw. Nr 5.
8. Komórka gospodarza transformowana lub transfekowana wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 7.
9. Izolowany polipeptyd określony w zastrz. 5 do stosowania jako lek.
10. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną z jedną lub więcej dopuszczalną farmaceutycznie zaróbką, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera izolowany polipeptyd o sekwencji Id. Sekw. Nr 8.
11. Zastosowanie izolowanego polipeptydu o sekwencji Id. Sekw. Nr 8 do wytwarzania leku do leczenia choroby proliferacyjnej, którą jest rak.