ES2279981T3

ES2279981T3 - Proteinas quimericas activantes de colectina-complemento.

Info

Publication number: ES2279981T3
Application number: ES03794818T
Authority: ES
Inventors: Leif Kongerslev; Dietmar Weilguny; Finn Matthiesen
Original assignee: Natlmmune AS
Current assignee: Natlmmune AS
Priority date: 2002-09-10
Filing date: 2003-09-10
Publication date: 2007-09-01
Anticipated expiration: 2023-09-10
Also published as: US20060188963A1; DE60310736T2; WO2004024925A8; JP2005537807A; AU2003260286A1; WO2004024925A3; PT1539964E; WO2004024925A2; DK1539964T3; ATE349538T1; CN1694961A; DE60310736D1; EP1539964B1; EP1539964A2

Abstract

Una proteína de fusión que comprende i) Una primera secuencia polipeptídica derivada de una proteína que activa la ruta del complemento-lectina o de un homólogo funcional al menos 70% idéntico a dicha proteína que activa la ruta del complemento-lectina, donde dicha primera secuencia polipeptídica es capaz de activar la ruta del complemento-lectina; y ii) Una segunda secuencia polipeptídica derivada de una colectina o un homólogo funcional al menos 70% idéntico a dicha colectina, donde dicha segunda secuencia polipeptídica es capaz de asociarse a uno o más hidratos de carbono; donde dicha proteína que activa el complemento no es una colectina.

Description

Proteínas quiméricas activantes de colectina-complemento.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una proteína de fusión capaz de activar el sistema del complemento, a métodos para producir dicha proteína de fusión así como a una composición farmacéutica que comprende dicha proteína de fusión y métodos para tratar enfermedades, en particular infecciones, con dichas proteínas de fusión.

Antecedentes de la invención

Los animales han desarrollado diferentes estrategias complejas para protegerse contra las infecciones. Las respuestas inmunitarias se pueden dividir en dos grupos fundamentales, la respuesta inmunitaria adaptativa, en la que ha tenido lugar una adaptación y en la que las células desempeñan una parte dominante, y la respuesta inmunitaria innata, que está disponible al instante y que se basa fundamentalmente en moléculas presentes en los fluidos corporales. El sistema inmunitario innato está operativo en el momento del nacimiento, a diferencia de la defensa inmunitaria adaptativa que sólo durante la infancia adquiere su potencial completo de protección del cuerpo (Janeway et al., 1999).

Las bacterias que entran en el cuerpo por las superficies mucosas o a través de piel no intacta son reconocidas inmediatamente por las colectinas, una familia de proteínas solubles que reconocen configuraciones características de hidratos de carbono que están presentes en la superficie de los microbios y ausentes en las células de los organismos pluricelulares. Así, las colectinas pertenecen al amplio y diverso grupo de los receptores de reconocimiento de patrones del sistema inmunitario innato. En los seres humanos, se conocen tres colectinas, aunque pueden existir otras: Las vacas, por ejemplo, tienen más. Las colectinas señalan a las partículas a las que se unen, o bien para su captación por los fagocitos o bien para la activación de la cascada del complemento, pudiendo participar en su destrucción por ambas vías.

Todas las colectinas presentan la siguiente arquitectura: tienen una región N-terminal rica en cisteínas que parece formar puentes disulfuro intercatenarios, seguida de una región similar al colágeno, una región de \alpha-hélice doble y finalmente un dominio de lectina de tipo C que es la región de reconocimiento del patrón y se conoce como dominio de reconocimiento de hidratos de carbono (CRD, por sus siglas en inglés). El nombre colectina se debe a la presencia de dominios de colágeno y de lectina. La región de \alpha-hélice doble inicia la trimerización de los polipéptidos individuales para formar triples hélices de colágeno, generándose así subunidades de colectina cada una de las cuales consiste en 3 polipéptidos individuales, mientras que la región N-terminal participa en la formación de oligómeros de subunidades. Las diferentes colectinas presentan estructuras características de orden superior, típicamente o bien tetrámeros de subunidades o hexámeros de subunidades. El agrupamiento de gran número de dominios de unión permite a las colectinas unirse con gran avidez a las paredes de las células microbianas, a pesar de la afinidad intrínseca relativamente baja de cada CRD individual por los hidratos de carbono.

Los CRD de tipo C se encuentran en las proteínas con abundante frecuencia, tanto en perspectiva filogenética como funcional. Los diferentes CRD de las diferentes colectinas permiten que éstas reconozcan un abanico de componentes característicos de la superficie microbiana expuestos en diferentes microorganismos. Los CRD terminales están distribuidos de tal modo que los sitios de unión presentados por cada uno de los tres dominios que se unirán a la superficie diana están separados por aproximadamente 53 \ring{A} (Sheriff et al., 1994; Weis & Drickamer, 1994). Esta propiedad de reconocimiento de patrones puede contribuir además a la unión selectiva de superficies microbianas. La región colagenosa o posiblemente las colas N-terminales de las colectinas, son reconocidas por receptores específicos sobre los fagocitos, y son el sitio de unión para proteasas asociadas que se activan para iniciar la cascada del complemento tras la unión del dominio CRD a un objetivo.

La lectina que se une a manano (MBL), también llamada lectina que se une a manosa o proteína que se une a manosa, es una colectina que ha adquirido gran interés como parte importante del sistema inmunitario innato. MBL se une a estructuras específicas de los hidratos de carbono encontradas sobre la superficie de un abanico de microorganismos que incluye bacterias, levaduras, protozoos parasitarios y virus, y se ha encontrado que presentan actividad antibacteriana a través de la muerte mediada por la activación de los componentes terminales del complemento lítico o a través de la promoción de la fagocitosis. La deficiencia de MBL está asociada con susceptibilidad a infecciones frecuentes por una gama de microorganismos en la infancia y posiblemente también en la edad adulta.

El CRD de MBL reconoce preferentemente hexosas con grupos 3- y 4-OH ecuatoriales, tales como manosa, glucosa, N-acetilmanosamina y N-acetilglucosamina mientras que los hidratos de carbono que no cumplen este requisito estérico, tales como la galactosa y la D-fucosa, no se unen (Weiss et al., 1992). La selectividad en cuanto a los hidratos de carbono es obviamente un aspecto importante de la discriminación entre lo propio y lo no propio por MBL y probablemente está mediada por la diferencia en la prevalencia de restos de manosa y N-acetilglucosamina sobre superficies microbianas, siendo un ejemplo el alto contenido de manosa en la pared celular de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans. Las estructuras de los hidratos de carbono en la glicosilación de proteínas mamíferas se completan habitualmente con ácido siálico, lo que impide la unión de MBL a estos hidratos de carbono oligómeros e impide así el reconocimiento por MBL de las propias superficies. Para el reconocimiento del objetivo también puede ser importante la estructura trimérica.

El complemento es un grupo de proteínas presentes en el plasma sanguíneo y en el fluido tisular que ayuda a las defensas del cuerpo después de una infección. El sistema del complemento está siendo activado a través de al menos tres rutas diferenciadas, conocidas como la ruta clásica, la ruta alternativa y la ruta de las MBLectinas (Janeway et al., 1999). La ruta clásica se inicia cuando el factor 1 del complemento (C1) reconoce la inmunoglobulina unida a la superficie. El complejo C1 está compuesto por dos enzimas proteolíticas, C1r y C1s, y una parte no enzimática, C1q, que contiene dominios que reconocen a las inmunoglobulinas. C1q y MBL comparten características estructurales, teniendo ambas moléculas apariencia de 'ramillete' cuando se visualizan por microscopía electrónica. También, al igual que C1q, MBL se encuentra formando un complejo con dos enzimas proteolíticas, las proteasas asociadas a lectina que se une a manano (MASP). Las tres rutas generan convertasa del factor 3 del complemento (C3), lo que garantiza la unión de C3b a la superficie de la superficie activante, es decir, el patógeno microbiano tomado como objetivo. La conversión de C3 en C3b unida a la superficie es crucial en el proceso de eliminar el patógeno microbiano por fagocitosis o lisis (Janeway et al., 1999).

Se ha descrito que ciertos oligosacáridos de Salmonella específicos de O-antígenos activan el complemento en suero de cobayas deficientes en C4 y más tarde se demostró que el serogrupo C de Salmonella reaccionaba con MBL y por tanto, activaba el complemento por la ruta de las MBLectinas, que también se conoce como la ruta MBL de activación del complemento o la ruta de las lectinas.

Durante algún tiempo se ha creído que el sistema inmunitario innato puede colaborar con el sistema inmunitario adaptativo en la generación de respuestas inmunitarias específicas como lo ejemplifica la respuesta de los anticuerpos después de la infección o la vacunación. El grupo de Fearon ha demostrado que la unión del fragmento C3d del factor C3 del complemento a un antígeno proteico a través de fusión por tecnología génica puede multiplicar por 1000 o más la inmunogénesis del antígeno. Todavía se están esperando las aplicaciones de esta técnica o algún número de modificaciones.

La importancia del sistema del complemento para las respuestas inmunitarias normales fue sugerida por primera vez por Pepys, quién descubrió una alteración en las respuestas de los anticuerpos a los eritrocitos de oveja, un antígeno dependiente del timo, en ratones que habían experimentado depleción de C3 con el factor de veneno de cobra. La idea de una conexión entre la inmunidad innata y la adaptativa estuvo avalada por informes que demostraban una disminución de las respuestas primarias de los anticuerpos a los antígenos dependientes del timo y una alteración en el cambio de isotipo de IgM a IgG en pacientes y animales experimentales con deficiencias de C4, C2 y C3. El mecanismo puede implicar la generación de ligandos derivados de C3 para la unión del antígeno o de complejos que contienen el antígeno a los receptores del complemento sobre linfocitos B o células presentadoras del antígeno. Así, el bloqueo de CR1 (CD35) y CR2 (CD21) en ratones con anticuerpos específicos anti-CR1 y anti-CR2 o con proteína receptora soluble redujo la respuesta de los anticuerpos a la inmunización y los experimentos con ratones deficientes en CR1 y CR2 muestran el requisito de estos receptores para que haya respuestas a los antígenos dependientes del timo. Además, los pacientes con deficiencia de adhesión leucocitaria, que carecen de la molécula de adhesión CR3 (CD11/CD18), demuestran peores respuestas de los anticuerpos y fallo en el cambio de isotipo IgM a IgG. El fragmento C3d derivado de C3, un ligando específico de CR2, como se ha mencionado antes, presenta un fuerte efecto coadyuvante dependiente de la dosis.

Las deficiencias de la ruta clásica del complemento (C1, C2, C4 y C3) están asociadas a infecciones por bacterias encapsuladas. La razón principal para esto probablemente sea una disminución de la eficacia de los mecanismos de defensa opsónicos y bactericidas causada por la disfunción del complemento. Sin embargo, también podrían considerarse las respuestas inmunitarias deficientes a antígenos de polisacáridos. La influencia del complemento sobre las respuestas a los antígenos independientes del timo no se ha estudiado a fondo y la información disponible es contradictoria. Así, las bajas respuestas de los anticuerpos a antígenos independientes del timo ha sido claramente documentada en ratones que presentan depleción de C3 y perros deficientes en C3. Por otro lado, algunos informes encuentran que los pacientes deficientes en C3 parecen responder con normalidad a la inmunización con vacunas de polisacáridos.

Las ficolinas, al igual que las MBL, son lectinas que contienen un dominio similar a colágeno. Sin embargo, a diferencia de MBL, tienen un dominio similar a fibrinógeno, que es similar a las cadenas \beta y \gamma. Las ficolinas también forman oligómeros de subunidades estructurales, cada uno de los cuales está compuesto por tres polipéptidos idénticos de 35 kDa. Cada subunidad se compone de una región rica en cisteínas en el extremo amino-terminal; un dominio similar a colágeno que consiste en repeticiones en tándem de secuencias de tripletes Gly-Xaa-Yaa (donde Xaa e Yaa representan cualquier aminoácido); una región de cuello; y un dominio similar a fibrinógeno. Los oligómeros de las ficolinas comprenden dos o más subunidades, especialmente se ha observado una forma tetrámera de ficolina.

Algunas ficolinas desencadenan la activación del sistema del complemento sustancialmente de forma similar a como lo hace MBL. Este desencadenamiento del sistema del complemento da como resultado la activación de nuevas serina proteasas (MASPs) como se ha descrito anteriormente.

El dominio similar a fibrinógeno de varias lectinas tiene una función similar al CRD de las lectinas de tipo C, incluyendo MBL, así que funcionan como receptores de reconocimiento de patrones para discriminar entre los patógenos y ellas mismas.

Las ficolinas de suero tienen una especificidad de unión común a GlcNAc (N-acetilglucosamina), elastina o GaINAc (N-acetil-galactosamina). El dominio similar a fibrinógeno es responsable de la unión a hidratos de carbono. En suero humano, se han identificado dos tipos de ficolina, conocidos como L-ficolina (P35, ficolina L, ficolina 2 o hucolina) y H-ficolina (antígeno de Hakata, ficolina 3 o b2-macroglicoproteína termolábil), y ambos tienen actividad de lectina. La L-ficolina reconoce GlcNAc y la H-ficolina reconoce GaINAc. Otra ficolina conocida como ficolina M (proteína relacionada con P35, Ficolina 1 o Ficolina A) no se considera que sea una proteína del suero y se encuentra en los leucocitos y en los pulmones. La L-ficolina y la H-ficolina activan la ruta del complemento-lectina en asociación con las MASP. M-Ficolina, L-ficolina y H-ficolina tienen actividad de lectina independiente del calcio.

Las MASP (serina proteasas asociadas a MBL) que comprenden MASP-1, MASP-2 y MASP-3 son enzimas proteolíticas que son responsables de la activación de la ruta de las lectinas. La estructura global de MASP se asemeja a la de los dos componentes proteolíticos del primer factor en la ruta clásica del complemento C1r y C1s. La ruta de las lectinas se inicia cuando MBL o una ficolina asociada a MASP-1, MASP-2, MASP-3 y sMAP se une a una estructura de hidrato de carbono de la superficie, p. ej. de bacterias, levaduras, protozoos parasitarios, virus. MASP-2 es el componente de la enzima que - al igual que C1s en la ruta clásica - escinde los componentes del complemento C4 y C2 para formar la C3 convertasa C4bC2a, que es común para las vías de activación de la ruta de las lectinas y de la ruta clásica.

MASP-1, MASP-2, MASP-3 y sMAP son codificadas por dos genes; sMAP es una forma truncada de MASP-2, y MASP-3 se produce a partir del gen MASP-1 por maduración por corte y empalme alternativo. El gen MASP-1 tiene una región codificante de la cadena H que es común para MASP-1 y MASP-3, que va seguida de repeticiones en tándem de regiones que codifican el dominio de proteasa que son específicas para MASP-3 y MASP-1.

La familia MASP se puede dividir en dos linajes filogenéticos - los linajes de tipo TCN y de tipo AGY. El linaje de tipo TCN, que incluye MASP-1, tiene un codón TCN (donde N representa A, G, C o T) que codifica la serina del sitio activo, la presencia de un puente disulfuro en un bucle de histidina y exones de corte y empalme. En cambio, el linaje de tipo AGY, que incluye MASP-2, MASP-3, C1r y C1s, se caracteriza por un codón AGY (donde Y representa C o T) que codifica la serina del sitio activo, la ausencia de un bucle de histidina y un solo exón.

MASP-1, MASP-2, MASP-3, C1r y C1s consisten en seis dominios: dos dominios de C1r/C1s/Uegf/proteína morfogenética ósea 1 (CUB); un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico (EGF); dos dominios de proteína de control del complemento (CCP) o repeticiones de consenso cortas (SCRs), y un dominio de serina-proteasa. Los restos de histidina (H), ácido aspártico (D) y serina (S) son esenciales para la formación del centro activo en el dominio de serina-proteasa. Sólo MASP-1 tiene dos restos de cisteína adicionales en una cadena ligera, que forman un puente disulfuro (S-S) en el bucle de histidina, como se encuentra en tripsina y quimotripsina. Al unirse MBL y ficolinas a hidratos de carbono en la superficie de un patógeno, la forma de pro-enzima de una MASP se escinde entre el segundo CCP y el dominio de proteasa, lo que da como resultado una forma activa que consiste en dos cadenas pesadas y ligeras de polipéptidos (también conocidas como cadenas A y B).

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de fusión capaces de activar el sistema del complemento. Por consiguiente, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende una primera secuencia polipeptídica derivada de una proteína que activa la ruta del complemento-lectina (=proteína que activa el complemento) o un homólogo funcional al menos 70% idéntico a dicha proteína de la ruta que activa el complemento-lectina, donde dicha primera secuencia polipeptídica es capaz de activar la ruta del complemento-lectina; y una segunda secuencia polipeptídica derivada de una colectina o un homólogo funcional al menos 70% idéntico a dicha colectina, donde dicha segunda secuencia polipeptídica es capaz de asociarse a uno o más hidratos de carbono; donde dicha proteína que activa el complemento no es una colectina.

La proteína de fusión es adecuada para uso en el tratamiento que consiste en la creación, reconstitución, intensificación y/o estimulación de la actividad opsónica y/o bactericida del sistema del complemento, es decir, en la intensificación de la capacidad de la defensa inmunitaria de reconocer y matar patógenos microbianos, y por consiguiente, la invención se refiere a un medicamento que comprende la proteína de fusión.

También, en otro aspecto, la invención se refiere al uso de la proteína de fusión que se ha definido anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cuadro clínico en un individuo que lo necesita, que comprende administrar a dicho individuo la proteína de fusión que se definió antes.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la proteína de fusión que se ha definido antes para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de un cuadro clínico, tal como infección, en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar a dicho individuo una proteína de fusión que comprende una primera secuencia polipeptídica derivada de una proteína capaz de formar oligómeros de unidades estructurales; y una segunda secuencia polipeptídica derivada de una lectina que se une a manosa (MBL) donde dicha primera secuencia polipeptídica y dicha segunda secuencia polipeptídica no se derivan de la misma proteína, y dicha proteína de fusión es capaz de asociarse a una serina-proteasa asociada a manosa (MASP). Preferiblemente, la primera secuencia polipeptídica se deriva de una proteína capaz de formar tetrámeros, pentámeros, y/o hexámeros de una unidad estructural. En una realización preferida la primera secuencia polipeptídica y la segunda secuencia polipeptídica son como se describe más adelante.

Además, la invención se refiere a un método para producir la proteína de fusión, así como una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de fusión, un vector que comprende la secuencia y una célula que comprende el vector.

Dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de L-ficolina.

La Figura 2 muestra la secuencia de MBL.

La Figura 3 muestra un ejemplo de proteína de fusión.

Las Figuras 4-8 muestran plásmidos como los descritos en el Ejemplo 1

La Figura 9 muestra una alineación de proteínas de fusión descrita en el Ejemplo 1.

La Figura 10 muestra transferencias Western como las discutidas en el Ejemplo 2.

Definiciones

Colectinas: Una familia de proteínas de la inmunidad innata que reconocen hidratos de carbono y están estructuralmente relacionadas, que incluyen la lectina que se une a manano (MBL) y las proteínas de los tensioactivos A y D. El nombre hace referencia a la presencia de una región similar a colágeno y un dominio de lectina de tipo C.

Complemento: Un grupo de proteínas presentes en el plasma sanguíneo y en el fluido tisular que ayuda a las defensas del cuerpo después de una infección. El complemento está implicado en la destrucción de células foráneas y en la atracción de los fagocitos a la zona de conflicto en el cuerpo.

Conjugado: Una asociación formada entre dos compuesto, por ejemplo, entre un determinante inmunogénico y una colectina y/o un homólogo de colectina o entre un determinante inmunogénico y un sacárido. La asociación puede ser una asociación física generada p. ej. por la formación de un enlace químico, tal como p. ej. un enlace covalente.

CRD: Dominio de reconocimiento de hidratos de carbono, un dominio de lectina de tipo C que se encuentra en el extremo C-terminal de las colectinas.

Determinante inmunogénico: Una molécula, o parte de ella, que contiene uno o más epitopos que estimularán el sistema inmunitario de un organismo anfitrión para producir una respuesta secretora, humoral y/o específica del antígeno celular, o una molécula de DNA que es capaz de producir tal inmunogénico en un vertebrado.

Respuesta inmunitaria: Respuesta a una composición inmunogénica que comprende un determinante inmunogénico. Una respuesta inmunitaria implica el desarrollo en el anfitrión de una respuesta inmunitaria celular y/o humoral a la composición o vacuna administrada en cuestión. Por lo general, una respuesta inmunitaria implica la acción de uno o más de i) los anticuerpos generados, ii) células B, iii) células T cooperantes, iv) células T supresoras, v) células T citotóxicas y iv) complemento dirigido específica o inespecíficamente a un determinante inmunogénico presente en una composición inmunogénica administrada.

Lectina: Proteínas que se unen específicamente a los hidratos de carbono.

MASP: Serina proteasa asociada a manosa

MBL: Lectina que se une a manano o lectina que se une a manosa.

Complejo de subunidades=complejo de unidades estructurales de tres proteínas de fusión individuales, similar al complejo de subunidades discutido anteriormente para MBL y ficolinas.

Descripción detallada de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar una proteína de fusión capaz de activar el sistema del complemento con el fin de ayudar a prevenir o tratar enfermedades, en particular, enfermedades infecciosas.

La proteína de fusión se compone de:

- una primera secuencia polipeptídica derivada de una proteína que activa la ruta del complemento-lectina (=proteína que activa el complemento) o de un homólogo funcional al menos 70% idéntica a dicha proteína de la ruta que activa el complemento-lectina, donde dicha primera secuencia polipeptídica es capaz de activar la ruta del complemento-lectina; y

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- una segunda secuencia polipeptídica derivada de una colectina o de un homólogo funcional al menos 70% idéntico a dicha colectina, donde dicha segunda secuencia polipeptídica es capaz de asociarse a uno o más hidratos de carbono;

donde dicha proteína que activa el complemento no es una colectina.

Combinando una secuencia polipeptídica derivada de una proteína que activa la ruta de las lectinas-complemento y una secuencia polipeptídica derivada de una colectina, es posible diseñar una proteína de fusión que tiene afinidad por un abanico de hidratos de carbono, preferiblemente hidratos de carbono bacterianos y virales y, al mismo tiempo, tiene actividad activante del sistema del complemento.

Primera secuencia polipeptídica

La primera secuencia polipeptídica puede derivarse de cualquier proteína activante de la ruta de las lectinas-complemento. Dicha proteína activante de la ruta de las lectinas-complemento puede ser proteína activante de la ruta de las lectinas-complemento, de origen natural, así como variantes u homólogos de dichas proteínas activantes de la ruta de las lectinas-complemento, donde dichas variantes u homólogos han mantenido la actividad de activación de la ruta lectina-complemento.

Se prefiere que la proteína de fusión sea capaz de formar complejos de subunidades, consistiendo cada uno en 3 proteínas de fusión como se han definido anteriormente.

También, la primera secuencia polipeptídica es preferiblemente capaz de formar complejos oligómeros con la primera secuencia polipeptídica de otra proteína de fusión, donde dicha otra proteína de fusión puede ser idéntica a la primera proteína de fusión. De este modo, se puede proporcionar el complejo oligómero de dos o más proteínas de fusión o dos o más complejos de subunidades, teniendo dicho complejo oligómero mayor avidez de unión hacia los hidratos de carbono bacterianos o virales que la proteína de fusión monómera. En una realización preferida, el complejo oligómero es un complejo dímero de subunidades, más preferiblemente un complejo trímero de subunidades, más preferiblemente un complejo tetrámero de subunidades.

En una realización preferida, la proteína activante de la ruta de las lectinas-complemento es una ficolina como se ha definido anteriormente. Dicha ficolina puede ser L-ficolina, H-ficolina o M-ficolina o variantes u homólogos de la misma. En una realización preferida la proteína activante de la ruta de las lectinas-complemento es L-ficolina.

En otra realización, la primera secuencia polipeptídica comprende el dominio de fibrinógeno de la lectina, y/o la región de cuello de un lectina, tal como una ficolina o uno de sus homólogos o variantes.

Cuando la primera secuencia polipeptídica se deriva de ficolina o de una variante o un homólogo de ficolina, se prefiere que la primera secuencia polipeptídica comprenda el dominio similar a colágeno de ficolina o de una variante u homólogo de ficolina. En otra realización, se prefiere que la primera secuencia polipeptídica comprenda el dominio rico en cisteínas de ficolina o de una variante u homólogo de ficolina. Es aún más preferido que la primera secuencia polipeptídica comprenda el dominio similar a colágeno y el dominio rico en cisteínas de ficolina o de una variante u homólogo de ficolina.

Es más preferido que la primera secuencia polipeptídica comprenda el dominio similar a colágeno de L-ficolina o de una variante u homólogo de L-ficolina. En otra realización, es más preferido que la primera secuencia polipeptídica comprenda el dominio rico en cisteínas de L-ficolina o de una variante u homólogo de L-ficolina. Es aun más preferido que la primera secuencia polipeptídica comprenda la región N-terminal de L-ficolina incluyendo dos restos del aminoácido cisteína.

Es aún más preferido que la primera secuencia polipeptídica comprenda el dominio similar a colágeno y el dominio rico en cisteínas de L-ficolina o de una variante u homólogo de L-ficolina.

En una realización preferida particular, la ficolina tiene una de las secuencias enumeradas más abajo con referencia a su base de datos y su número de acceso. Para cada una de las secuencias, se describe la región rica en cisteína y la región similar a colágeno.

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8

9

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El primer polipéptido preferiblemente comprende al menos 10, tal como al menos 12, por ejemplo al menos 15, tal como al menos 20, por ejemplo al menos 25, tal como al menos 30, por ejemplo al menos 35, tal como al menos 40, por ejemplo al menos 50 restos de aminoácidos consecutivos de la proteína activante del complemento o de una variante o un homólogo de dicha proteína. Dicha variante u homólogo es preferiblemente al menos 70%, tal como 80%, por ejemplo 90%, tal como 95% idéntica a la proteína activante del complemento.

La primera secuencia polipeptídica de la proteína de fusión es preferiblemente capaz de activar la ruta de las lectinas-complemento cuando se unen directa o indirectamente a un objetivo, tal como una bacteria o un virus. En una realización preferida, la primera secuencia polipeptídica es capaz de asociarse con al menos una proteína MASP, tal como una proteína MASP seleccionada del grupo que consiste en MASP-1, MASP-2 y MASP-3 u homólogos funcionales o variantes de los mismos. En particular, el primer polipéptido es capaz de asociarse con dicha al menos una proteína MASP cuando forma parte de la proteína de fusión. De este modo, la primera secuencia polipeptídica es capaz de proporcionar la proteína de fusión con actividad activante del sistema del complemento.

En una realización preferida particular, la primera secuencia polipeptídica comprende al menos los restos de aminoácidos correspondientes a las posiciones 1-54 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1, tal como 1-55 de la secuencia de L-ficolina de la Figura 1, tal como 1-69 de la secuencia de L-Ficolina de a Figura 1, tal como 1-77 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1, tal como 1-90 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1, tal como 1-93 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1, tal como 1-131 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1, tal como 1-207 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1. En particular, la primera secuencia polipeptídica comprende los restos de aminoácidos seleccionados de: 1-55 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1, 1-54 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1, 1-50, o 1-77 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1. En una realización más preferida, la primera secuencia polipeptídica tiene los restos de aminoácidos seleccionados de: 1-55 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1, 1-54 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1, 1-50, o 1-77 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1. En otra realización, la primera secuencia polipeptídica comprende al menos los restos de aminoácidos correspondientes a 60-90 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1, tal como 55-90 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1, tal como 54-92 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1.

Se prefiere que la primera secuencia polipeptídica y la segunda secuencia polipeptídica se seleccionen para incluir el motivo X-X-G-X-X-G al menos 5 veces, tal como al menos 7 veces, preferiblemente en una secuencia consecutiva. Es más preferido seleccionar la primera secuencia polipeptídica y la segunda secuencia polipeptídica de tal manera que el motivo antes mencionado esté sustituido una vez por el motivo X-X-G-X-G. En los motivos, X representa cualquier aminoácido distinto de Glicina, y G significa glicina.

Segunda secuencia polipeptídica

La segunda secuencia polipeptídica es preferiblemente capaz de asociarse con uno o más hidratos de carbono. Esto se puede conseguir incorporando al menos el dominio de la colectina que reconoce el hidrato de carbono en cuestión. Por consiguiente, la segunda secuencia polipeptídica preferiblemente comprende el dominio CRD de una colectina o uno de sus homólogos o variantes.

Preferiblemente la colectina se selecciona del grupo que consiste en MBL (lectina que se une a manosa), SP-A (proteína A de tensioactivo pulmonar), SP-D (proteína D de tensioactivo pulmonar), BK (o BC, conglutinina bovina) y CL-43 (colectina-43). Lo más preferiblemente, la colectina es MBL.

En una realización preferida particular, la colectina tiene una de las secuencias enumeradas más adelante con referencia a su base de datos y nº de acceso.

Colectinas

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\vskip1.000000\baselineskip

1070

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Proteína de tensioactivo pulmonar

4100

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Lectina que se una a manosa

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El segundo polipéptido preferiblemente comprende al menos 10, tal como al menos 12, por ejemplo al menos 15, tal como al menos 20, por ejemplo al menos 25, tal como al menos 30, por ejemplo al menos 35, tal como al menos 40, por ejemplo al menos 50 restos de aminoácidos consecutivos de la colectina o de una variante o un homólogo de dicha proteína. Dicha variante u homólogo es preferiblemente al menos 70%, tal como 80%, por ejemplo 90%, tal como 95% idéntica a la colectina.

En una realización preferida, la segunda secuencia polipeptídica comprende el dominio CRD de MBL o la región de cuello de MBL o el dominio similar a colágeno de MBL. Más preferiblemente, El segundo polipéptido comprende la región de cuello y el dominio CRD de MBL. En una realización muy preferida, la segunda secuencia polipeptídica comprende el dominio similar a colágeno, la región de cuello y el dominio CRD de MBL. MBL es como se ha definido anteriormente.

Preferiblemente, la segunda secuencia polipeptídica comprende al menos los aminoácidos 170-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 160-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 150-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 140-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 130-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 120-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 110-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 100-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 90-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 80-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 70-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 60-200 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2, tal como al menos los aminoácidos 80-228 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2.

Preferiblemente, la segunda secuencia polipeptídica comprende los aminoácidos 80-228 de SEQ ID. NO 2.

En una realización preferida, la segunda secuencia polipeptídica es capaz de asociarse con al menos una proteína MASP, tal como una proteína MASP seleccionada del grupo que consiste en MASP-1, MASP-2 y MASP-3 u homólogos funcionales o variantes de los mismos. En particular, el segundo polipéptido es capaz de asociarse con dicha al menos una proteína MASP cuando forma parte de la proteína de fusión. De este modo, la segunda secuencia polipeptídica es capaz de proporcionar la proteína de fusión con actividad activante del sistema del complemento. En una realización más preferida, la segunda secuencia polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: 56-228 de SEQ ID. NO 2, 55-228 de SEQ ID. NO 2, 54-228 de SEQ ID. NO 2, y 50-228 de SEQ ID. NO 2.

En una realización más preferida, la segunda secuencia polipeptídica tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de: 56-228 de SEQ ID. NO 2, 55-228 de SEQ ID. NO 2, 54-228 de SEQ ID. NO 2, y 50-228 de SEQ ID. NO 2.

En otra realización, El segundo polipéptido comprende la región rica en cisteínas de la colectina, tal como la región N-terminal de la colectina.

Proteína de fusión

La proteína de fusión comprende el primer y el segundo polipéptido conectados entre sí, opcionalmente a través de una región enlazadora: En una realización preferida, la primera secuencia polipeptídica está colocada en posición N-terminal en la proteína de fusión y la segunda secuencia polipeptídica está colocada en posición C-terminal.

Ejemplos específicos de los componentes de las proteínas de fusión son:

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas y el dominio similar a colágeno de L-ficolina y el dominio CRD de MBL.

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas de L-ficolina y el dominio similar a colágeno, la región de cuello y el dominio CRD de MBL.

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas y el dominio similar a colágeno de H-ficolina y el dominio CRD de MBL.

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas de H-ficolina y el dominio similar a colágeno, la región de cuello y el dominio CRD de MBL.

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas y el dominio similar a colágeno de M-ficolina y el dominio CRD de MBL.

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas de M-ficolina y el dominio similar a colágeno, la región de cuello y el dominio CRD de MBL.

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas de MBL, y el dominio CRD de ficolina.

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas de MBL y el dominio similar a colágeno, la región de cuello y el dominio CRD de ficolina.

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas y el dominio similar a colágeno de L-ficolina y el dominio CRD de la proteína D asociada al tensioactivo pulmonar.

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas de L-ficolina y el dominio similar a colágeno, la región de cuello y el dominio CRD de la proteína D asociada al tensioactivo pulmonar.

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas y el dominio similar a colágeno de una ficolina y el dominio CRD de una colectina-43.

- Una proteína de fusión que comprende la región rica en cisteínas de una ficolina y el dominio similar a colágeno, la región de cuello y el dominio CRD de una colectina-43.

Una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos definida por la secuencia indicada en la Figura 3, o un homólogo funcional de la misma, preferiblemente una proteína de fusión que consiste en la secuencia de aminoácidos que se indica en la Figura 3. En otra realización, la proteína de fusión tiene la secuencia de aminoácidos 1-50 de la secuencia de aminoácidos indicada en la Figura 1 y la secuencia de aminoácidos 54-228 de la secuencia de aminoácidos indicada en la Figura 2.

Como se ha discutido más arriba, la proteína de fusión es preferiblemente capaz de formar complejos de subunidades así como oligómeros de complejos de subunidades. Preferiblemente, la proteína de fusión forma sustancialmente sólo oligómeros trímeros, tetrámeros, pentámeros y hexámeros de subunidades, tal como oligómeros trímeros, tetrámeros y pentámeros de subunidades, tal como oligómeros trímeros o tetrámeros de subunidades, más preferiblemente sustancialmente sólo oligómeros tetrámeros de subunidades, con el fin de obtener una composición más homogénea de proteínas de fusión.

Homólogos

En el presente contexto los términos homólogo o variante y homólogos funcionales se usan como sinónimos, donde un homólogo de una proteína presenta una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de uno o más restos de aminoácidos. Los fragmentos son un subgrupo de homólogos que son truncaciones de la proteína.

Un homólogo de la proteína puede comprender una o más sustituciones conservadas de aminoácidos, tal como al menos 2 sustituciones conservadas de aminoácidos, por ejemplo al menos 3 sustituciones conservadas de aminoácidos, tal como al menos 5 sustituciones conservadas de aminoácidos, por ejemplo al menos 10 sustituciones conservadas de aminoácidos, tal como al menos 20 sustituciones conservadas de aminoácidos, por ejemplo al menos 50 sustituciones conservadas de aminoácidos tal como al menos 75 sustituciones conservadas de aminoácidos, por ejemplo al menos 100 sustituciones conservadas de aminoácidos. Sustituciones conservadas de aminoácidos, dentro del contexto de la presente invención, es la sustitución de un aminoácido dentro de un grupo predeterminado de aminoácidos por otro aminoácido dentro del mismo grupo predeterminado, que presenta características similares o sustancialmente similares. Dichos grupos predeterminados son, por ejemplo:

cadenas laterales polares (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, y Cys,)

cadenas laterales no polares (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, y Met)

cadenas laterales alifáticas (Gly, Ala Val, Leu, Ile)

cadenas laterales cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro)

cadenas laterales aromáticas (Phe, Tyr, Trp)

cadenas laterales ácidas (Asp, Glu)

cadenas laterales básicas (Lys, Arg, His)

cadenas laterales amídicas (Asn, Gln)

cadenas laterales hidroxílicas (Ser, Thr)

cadenas laterales que contienen azufre (Cys, Met), y

aminoácidos que son ácidos monoamino-dicarboxílicos o ácidos monoamino-monocarboxi-monoamidocarboxílicos (Asp, Glu, Asn, Gln).

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Las sustituciones conservadas se pueden introducir en cualquier posición de una proteína preferida. Sin embargo, puede ser deseable también introducir sustituciones no conservadas. Una sustitución no conservada dará lugar a la formación de un homólogo de una proteína capaz de ejercer una función similar a la función de dicha proteína. Tal sustitución podría, por ejemplo i) diferir sustancialmente en hidrofobia, por ejemplo la sustitución de un resto hidrófilo tal como Arg, Lys, Trp o Asn por un resto hidrófobo (Val, Ile, Leu, Phe o Met), o la sustitución de un resto hidrófobo por un resto hidrófilo tal como Thr, Ser, His, Gln, Asn, Lys, Asp, Glu o Trp; y/o ii) diferir sustancialmente en su efecto sobre la orientación de la cadena peptídica tal como la sustitución de Pro o Gly por otro resto, o viceversa; y/o iii) diferir sustancialmente en carga eléctrica, por ejemplo la sustitución de un resto cargado positivamente tal como Lys, His o Arg por un resto cargado negativamente tal como Glu o Asp (y viceversa); y/o iv) diferir sustancialmente en impedimento estérico, por ejemplo la sustitución de un resto con una cadena lateral pequeña, p. ej. Ala, Gly o Ser por uno más voluminoso tal como His, Trp, Phe o Tyr (y viceversa).

En una realización adicional, la presente invención se refiere a homólogos de una proteína preferida, donde tales homólogos comprenden aminoácidos sustituidos que tienen índices hidrófilos o hidropáticos que están dentro de +/-2.5, por ejemplo dentro de +/- 2.3, tal como dentro de +/- 2.1, por ejemplo dentro de +/- 2.0, tal como dentro de +/-1.8, por ejemplo dentro de +/- 1.6, tal como dentro de +/- 1.5, por ejemplo dentro de +/- 1.4, tal como dentro de +/-1.3 por ejemplo dentro de +/- 1.2, tal como dentro de +/- 1.1, por ejemplo dentro de +/- 1.0, tal como dentro de +/- 0.9, por ejemplo dentro de +/- 0.8, tal como dentro de +/- 0.7, por ejemplo dentro de +/- 0.6, tal como dentro de +/- 0.5, por ejemplo dentro de +/- 0.4, tal como dentro de +/-0.3, por ejemplo dentro de +/- 0.25, tal como dentro de +/- 0.2 del valor del aminoácido que se ha sustituido.

La importancia de los índices de aminoácidos hidrófilos e hidropáticos en la concesión de función biológica interactiva a una proteína es bien entendida en la técnica (Kyte & Doolittle, 1982 y Hopp, Patente de EE.UU. nº 4,554,101, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria por referencia).

Los valores de los índices hidropáticos de los aminoácidos que se utilizan aquí son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina
(-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4.5) (Kyte & Doolittle, 1982).

Los valores de hidrofilia de los aminoácidos son: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0.+-.1); glutamato (+3,0.+-.1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5.+-.1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); glicina (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4) (patente de EE.UU. 4,554,101).

Por lo tanto, en una realización, la sustitución de aminoácidos se puede hacer basándose en su valores de hidrofobia e hidrofilia y la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, incluyendo la carga, el tamaño y similares. Ejemplos de sustituciones de aminoácidos que tienen en cuenta algunas de las características anteriores son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Más aún, un homólogo puede comprender la adición o deleción de un aminoácido, por ejemplo la adición o deleción de 2 a 100 aminoácidos, tal como de 2 a 50 aminoácidos, por ejemplo de 2 a 20 aminoácidos, tal como de 2 a 10 aminoácidos, por ejemplo de 2 a 5 aminoácidos, tal como de 2 a 3 aminoácidos. Sin embargo, las adiciones de más de 100 aminoácidos, tal como adiciones de 100 a 500 aminoácidos, también están comprendidas dentro de la presente invención.

Las proteínas que comparten al menos alguna homología con una proteína preferida se considera que caen dentro del alcance de la presente invención cuando son al menos aproximadamente 40 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, siendo la proteína preferida, tal como al menos aproximadamente 50 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, por ejemplo al menos aproximadamente 60 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, tal como al menos aproximadamente 70 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, por ejemplo al menos aproximadamente 75 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, tal como al menos aproximadamente 80 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, por ejemplo al menos aproximadamente 85 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, tal como al menos aproximadamente 90 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, por ejemplo al menos 92 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, tal como al menos 94 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, por ejemplo al menos 95 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, tal como al menos 96 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, por ejemplo al menos 97 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, tal como al menos 98 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, por ejemplo al menos 99 por ciento homólogas, o preferiblemente idénticas, con la proteína preferida.

Las proteínas preferidas son proteínas activantes del complemento que comprenden colectinas y lectinas y homólogos de los mismos.

Homólogos de colectinas

Un homólogo de una colectina, incluida MBL, dentro del alcance de la presente invención se entenderá que es cualquier proteína capaz de ejercer una función similar a la función de una colectina y que comprende una o más de las variaciones descritas más arriba. En particular, esa función es la capacidad de activar el complemento tras unirse a uno o más hidratos de carbono.

Los términos homólogos funcionales de colectina usados aquí se refieren a equivalentes funcionales o un fragmento de colectina que comprende una secuencia de aminoácidos predeterminada, y tales homólogos se definen como:

a) Un homólogo que comprende una secuencia de aminoácidos capaz de reconocer y unirse a glucanos, lipofosfoglicanos y glicoinositol fosfolípidos que contienen azúcar con grupos 3- o 4-hidroxilo en el anillo de piranosa (i.e. Man, Glc, Fuc o GlcNAc) ya sea a solas o cuando está complejándose con la subunidad como se ha descrito más arriba y/o

b) Un homólogo que comprende la secuencia de aminoácidos capaz de formar asociación con un componente de la ruta de las lectinas/MBL tal como unión a MASP-1, MASP-2, MASP-3 y/o sMAP ya sea a solas o cuando está complejándose con la subunidad como se ha descrito más arriba, donde dicha unión da como resultado la activación de la ruta de las lectinas/MBL y/o

c) Un homólogo que comprende una secuencia de aminoácidos capaz de formar, por el dominio similar a colágeno, una estructura oligómera de dos o más subunidades, donde una subunidad comprende tres polipéptidos idénticos de una región rica en cisteínas, un dominio similar a colágeno, una región de cuello y un dominio de reconocimiento de hidratos de carbono.

Homólogos de lectinas

Un homólogo de una lectina, incluidas las ficolinas, dentro del alcance de la presente invención se entenderá que es cualquier proteína capaz de ejercer una función similar a la función de una lectina y que comprende una o más de las variaciones descritas más arriba. En particular, esa función es la capacidad de activar el complemento que se une a uno o más hidratos de carbono.

Los términos homólogos funcionales de lectina usados aquí se refieren a equivalentes funcionales de un fragmento de lectina que comprende una secuencia de aminoácidos predeterminada, y tales homólogos se definen como:

a) Un homólogo que comprende una secuencia de aminoácidos capaz de reconocer y unirse a N-acetil-glucosamina (GlcNAc), o N-acetil-galactosamina (GalNAc), o elastina ya sea a solas o cuando está complejada con una subunidad como se ha descrito más arriba y/o

c) Un homólogo que comprende una secuencia de aminoácidos capaz de formar, por el dominio similar a colágeno, una estructura oligómera de dos o más subunidades, donde una subunidad comprende tres polipéptidos idénticos de una región rica en cisteínas, un dominio similar a colágeno, una región de cuello y un dominio de similar a fibrinógeno.

La activación de la ruta de las lectinas/MBL, i.e. la actividad de la proteína de fusión para activar el sistema del complemento se puede analizar evaluando el efecto lisante C4 de la proteína de fusión o complejos de subunidades u oligómeros de complejos de los mismos por el siguiente método que comprende las etapas de:

- aplicar una muestra que comprende una cantidad predeterminada de proteína de fusión así como una cantidad predeterminada de MASP-1, MASP-2 o MASP-3, aplicar al menos un factor del complemento a la muestra,

- detectar la cantidad de factores del complemento escindidos,

- correlacionar la cantidad de factores del complemento escindidos con la cantidad de proteína, y

- determinar la actividad de la proteína de fusión.

El factor del complemento usado preferiblemente en el presente método es un factor del complemento escindible por el complejo MBUMASP-2, tal como C4. Sin embargo, el factor del complemento también se puede seleccionar de C3 y C5.

El factor del complemento escindido puede ser detectado por diversos medios, tal como por medio de anticuerpos dirigidos al factor del complemento escindido.

El ensayo se lleva a cabo en condiciones que minimizan o eliminan la interferencia de la ruta clásica de activación del complemento y la ruta alternativa de activación del complemento.

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Preferiblemente, un homólogo de una colectina y/o una lectina presenta dos de las funciones definidas más arriba, más preferiblemente tres de las funciones definidas más arriba.

Preparación de la proteína de fusión

La proteína de fusión puede ser preparada por cualquier método adecuado conocido por el experto en la técnica. A continuación, se describen varios de los métodos de preparación de la proteína de fusión, sin embargo la invención no se limita a esos métodos.

Preparación por síntesis

Cuando es apropiado, en particular dependiendo del tamaño de la proteína de fusión, la proteína de fusión puede ser producida por síntesis. Los métodos para la producción de péptidos por síntesis son bien conocidos en la técnica. Se pueden encontrar descripciones detalladas así como consejos prácticos para producir péptidos por síntesis en Synthetic Peptides: A User's Guide (Advances in Molecular Biology), Grant G. A. ed., Oxford University Press, 2002, o en: Pharmaceutical Formulation: Development of Peptides and Proteins, Frokjaer and Hovgaard eds., Taylor y Francis, 1999.

Preparación recombinante

Las proteínas de fusión de la invención se producen preferiblemente mediante el uso de la tecnología del DNA recombinante. La secuencia de DNA que codifica cada parte de la proteína de fusión puede prepararse por fragmentación de las secuencias de DNA que codifican la proteína de longitud completa, (DNA genómico o cDNA) de la que se deriva la parte de la proteína de fusión, usando DNAasa I de acuerdo con un protocolo clásico (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual. 2ª ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Después se pueden unir las secuencias de DNA obtenidas que codifican las partes individuales de la proteína de fusión.

La secuencia de DNA también se puede preparar por reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 4,683,202 o Saiki et al., 1988, Science 239:487-491.

La secuencia de DNA que codifica una proteína de fusión de la invención puede prepararse por síntesis empleando métodos clásicos establecidos, p. ej. el método de la fosfamidina descrito por Beaucage y Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1869, o el método descrito por Matthes et al., 1984, EMBO J. 3:801-805. De acuerdo con el método de la fosfamidina, se sintetizan oligonucleótidos, p. ej. en un sintetizador automático de DNA, y se purifican, reasocian, ligan y clonan en vectores adecuados.

Luego, la secuencia de DNA se puede insertar en un vector de expresión recombinante, que puede ser cualquier vector que pueda someterse convenientemente a procedimientos de DNA recombinante. La elección del vector dependerá habitualmente de la célula anfitriona en la que va a ser introducido. Así, el vector puede ser un vector que se replica autónomamente, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula anfitriona, se integra en el genoma de la célula anfitriona y se replica junto con el o los cromosomas en los que se ha integrado.

En el vector, la secuencia de DNA que codifica una proteína de fusión deberá estar operativamente conectada a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de DNA que presente actividad transcripcional en la célula anfitriona de elección y se puede derivar de genes que codifican proteínas ya sea homólogas o heterólogas para la célula anfitriona. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de DNA codificante en células mamíferas son el promotor de SV 40 (Subramani et al., 1981, Mol. Cell Biol. 1:854-864), el promotor de MT-1 (gen de metalotioneína)(Palmiter et al., 1983, Science 222: 809-814) o el promotor tardío principal de adenovirus 2. Un promotor adecuado para uso en células insectiles es el promotor de polihedrina (Vasuvedan et al., 1992, FEBS Lett. 311:7-11). Los promotores adecuados para uso en células anfitrionas de levadura incluyen promotores de genes glicolíticos de levadura (Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:12073-12080; Alber y Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 419-434) o los genes de alcohol deshidrogenasa (Young et al., 1982, en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al, eds., Plenum Press, New York), o los promotores de TP11 (Patente de EE.UU. 4,599,311) o ADH2-4c (Russell et al., 1983, Nature 304:652-654). Los promotores adecuados para uso en células hospedantes de hongos filamentosos son, por ejemplo, el promotor de ADH3 (McKnight et al., 1985, EMBO J. 4:2093-2099) o el promotor de tpiA.

La secuencia de DNA codificante también puede conectarse operativamente a un terminador adecuado, tal como el terminador de la hormona humana del crecimiento (Palmiter et al., op. cit.) o (para anfitriones fúngicos) los promotores de TPI1 (Alber and Kawasaki, op. cit.) o ADH3 (McKnight et al., op. cit.). El vector puede comprender además elementos tales como señales de poliadenilación (p. ej. de SV 40 o la región E1b de adenovirus 5), secuencias potenciadoras de la transcripción (p. ej. el potenciador de SV 40) y secuencias potenciadoras de la traducción (p. ej. las que codifican RNAs de adenovirus VA).

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El vector de expresión recombinante puede comprender además una secuencia de DNA que permite al vector replicarse en la célula anfitriona en cuestión. Un ejemplo de dicha secuencia (cuando la célula anfitriona es una célula de mamífero) es el origen de replicación de SV 40. El vector también puede comprender un marcador seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto suple un defecto en la célula anfitriona, tal como el gen que codifica dihidrofolato reductasa (DHFR) o uno que confiere resistencia a un fármaco, p. ej. neomicina, hidromicina o metotrexato.

Los procedimientos usados para ligar las secuencias de DNA que codifican las proteínas de fusión, el promotor y el terminador, respectivamente, y para insertarlas en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidas por el experto en la técnica (véase por ejemplo, Sambrook et al., op. cit).

La síntesis de la proteína de fusión recombinante puede hacerse usando cultivos in vitro e in vivo. Preferiblemente, el cultivo de células anfitrionas es un cultivo de células anfitrionas eucarióticas. Por transformación de un cultivo de células eucarióticas en este contexto se entiende la introducción de DNA recombinante en las células. La construcción para expresión usada en el proceso se caracteriza por tener la región codificante seleccionada de genes mamíferos incluyendo genes humanos y genes con gran parecido con éstos, tales como los genes del chimpancé. Además, la construcción de expresión usada se caracteriza porque la región promotora se caracteriza a partir de genes de virus o eucariotas, incluidas las células mamíferas y las células insectiles.

El procedimiento para producir MBL recombinante de acuerdo con la invención se caracteriza porque el cultivo de células anfitrionas es preferiblemente eucariótico, por ejemplo, un cultivo de células mamíferas. Un cultivo preferido de células anfitrionas es un cultivo de células de riñón humano y en una forma aún más preferida el cultivo de células anfitrionas es un cultivo de células embrionarias de riñón humano (células HEK), tales como las líneas celulares HEK 293 para la producción de MBL humano recombinante. Por "líneas de células HEK 293" se entiende cualquier línea celular derivada de tejido de riñón embrionario humano tal como, pero sin limitarse a ellas, las líneas de células depositadas en la Colección americana de Cultivos Tipo con los números CRL-1573 y CRL-10852.

Otras células pueden ser fibroblastos embrionarios de pollo; células de ovario de hámster, células renales de crías de hámster, células de carcinoma cervical humano, células de melanoma humano, células de riñón humano, células de endotelio vascular umbilical humano, células de endotelio cerebral humano, células tumorales de la cavidad oral humana, células renales de mono, fibroblastos de ratón, células renales de ratón, células de tejido conjuntivo de ratón, células oligodendríticas de ratón, macrófagos de ratón, fibroblastos de ratón, células de neuroblastoma de ratón, pre-células B de ratón, células B de linfoma de ratón, células de plasmacitoma de ratón, células de teratocarcinoma de ratón, células de astrocitoma de rata, células de epitelio mamario de rata, COS, CHO, BHK, VERO, HeLa, MDCK, WI38, Y NIH 3T3.

Alternativamente, como células anfitrionas se pueden usar las células fúngicas (incluidas las células de levadura. Ejemplos de células de levadura adecuadas incluyen las células de Saccharomyces spp. o Schizosaccharomyces spp., En particular cepas de Saccharomyces cerevisiae. Ejemplos de otras células fúngicas son las células de hongos filamentosos, p. ej. Aspergillus spp. o Neurospora spp., en particular cepas de Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. El uso de Aspergillus spp. para la expresión de proteínas se describe en, p. ej., en la patente europea EP 238 023.

Además, se puede elegir una cepa de una célula anfitriona que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamientos (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Las diferentes células anfitrionas tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación post-traduccional de proteínas y productos génicos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas anfitriones apropiados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína foránea expresada. Para este fin, se pueden usar células anfitrionas eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento conveniente del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Los tipos de células mamíferas enumeradas más arriba están entre las que podrían servir como células anfitrionas adecuadas.

Los métodos de transfección de células mamíferas y expresión de secuencias de DNA introducidas en las células están descritos, p. ej. en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, págs. 601-621; Southern y Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341; Loyter et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 422-426; Wigler et al., 1978, Cell 14:725; Corsaro y Pearson, 1981, in Somatic Cell Genetics 7, p. 603; Graham y van der Eb, 1973, Virol. 52:456; y Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841-845.

También se prevé que se pueden utilizar otros sistemas de producción eucarióticos en la presente invención, tal como la producción de la proteína de fusión en una planta transgénica o un animal no humano.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una proteína de fusión mediante:

- preparación de una construcción de expresión génica como se ha definido más arriba, que codifica una proteína de fusión,

- transformación de un cultivo de células anfitrionas con la construcción,

\newpage

- cultivo del cultivo de células anfitrionas, con lo que se obtiene la expresión y secreción del polipéptido en el medio de cultivo, seguido de

- obtención de un medio de cultivo que comprende proteína de fusión recombinante, y

- purificación de la proteína de fusión.

El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer células mamíferas, tal como medio que contiene suero o medio exento de suero que contiene suplementos apropiados, o un medio adecuado para hacer crecer células de insectos, levaduras u hongos. Los medios adecuados son obtenibles a partir de fuentes comerciales o se pueden preparar de acuerdo con recetas publicadas (p. ej. en catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo). Son ejemplos de medios de cultivo RPMI-1640 o DMEM completado con, p. ej., insulina, transferrina, selenio, y suero bovino fetal.

Las proteínas de fusión producidas recombinantemente por las células pueden recuperarse después del medio de cultivo por procedimientos convencionales que incluyen la separación de las células anfitrionas del medio por centrifugación o filtración, la precipitación de los componentes proteicos del sobrenadante o filtrado por medio de una sal, p. ej., sulfato de amonio, la purificación por diversos procedimientos cromatográficos, p. ej. HPLC, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.

En una realización preferida, la proteína de fusión se purifica por el uso de cromatografía de afinidad con hidratos de carbono como se ha descrito más arriba. En una realización preferida de la invención la cromatografía de afinidad se realiza por medio de matrices que han sido modificadas con manosa, hexosa o N-acetilglucosamina, que son adecuadas para cromatografía de afinidad. En particular, se usa cromatografía de afinidad, cuyas matrices han sido modificadas con manosa.

En este contexto, se ha de entender que una proteína de fusión recombinante es una proteína de fusión recombinante purificada a partir de sobrenadantes de cultivo celular o fluidos corporales o tejido de animales transgénicos purificado por el uso de, por ejemplo, cromatografía de afinidad con hidratos de carbono.

Después de la aplicación del medio de cultivo, la columna se lava, preferiblemente usando tampones no desnaturalizantes, que tienen una composición, un pH y una fuerza iónica que da como resultado la eliminación de proteínas, sin eluir la proteína de fusión. Dicho tampón puede ser TBS. La elución de la proteína de fusión se realiza con un agente desorbente selectivo, capaz de producir la elución eficiente de la proteína de fusión, tal como TBS que contiene un agente desorbente, tal como EDTA (5 mM por ejemplo) o manosa (50 mM por ejemplo), y se recogen proteínas de fusión.

Composición farmacéutica y tratamiento

La proteína de fusión obtenida por la presente invención puede ser usada para la preparación de un composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de diversas enfermedades o afecciones. En el presente contexto, la expresión composición farmacéutica se usa con el mismo significado que la expresión medicamento.

Además de la proteína de fusión, la composición farmacéutica puede comprender una sustancia portadora y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

En particular, se puede añadir un agente estabilizante para estabilizar las proteínas de fusión. El agente estabilizante puede ser un alcohol de azúcar, sacárido, proteína y/o aminoácidos. Un ejemplo de un agente estabilizante puede ser albúmina o maltosa.

Se pueden añadir otros aditivos convencionales a la composición farmacéutica dependiendo, por ejemplo, de la forma de administración.

En una realización, la composición farmacéutica está en una forma adecuada para inyectarse. Se pueden usar sustancias portadoras convencionales, tales como solución salina isotónica.

En otra realización la composición farmacéutica está en una forma adecuada para administrarse por vía pulmonar, tal como en forma de un polvo para inhalarse o una crema o fluido para aplicación tópica.

En este contexto, un tratamiento puede comprender cura y/o profilaxis de, p. ej., el sistema inmunitario y el sistema reproductor por seres humanos y animales que tienen dichas unidades funcionales que actúan a este respecto como las de los seres humanos. Por estados que han de tratarse no se entiende necesariamente las estados actualmente conocidos y en necesidad de tratamiento, sino que ese término comprende generalmente cualquier alteración relacionada con la necesidad actual y/o futura o en relación con una mejoría de una situación normal. En particular, el tratamiento es un tratamiento de una situación de deficiencia de lectinas, tal como deficiencia de MBL.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona la fabricación de un medicamento que consiste en dichas composiciones farmacéuticas de proteínas de fusión destinadas al tratamiento de estados que comprenden la cura y/o profilaxis de enfermedades y trastornos de p. ej. el sistema inmunitario y el sistema reproductor en seres humanos y animales que tienen dichas unidades funcionales que actúan como en los seres humanos.

Dichas enfermedades, trastornos y/o estados en necesidad de tratamiento con los compuestos de la invención comprende, p. ej. el tratamiento de estados de deficiencia de MBL, el tratamiento del cáncer y de infecciones relacionadas con la quimioterapia inmunosupresora, incluyendo en particular las infecciones que se observan en relación con estados durante el tratamiento del cáncer o en relación con la implantación y/o el trasplante de órganos. La invención también comprende el tratamiento de estados relacionados con abortos recurrentes.

Así, en particular la composición farmacéutica puede usarse para el tratamiento y/o la prevención de estados clínicos seleccionados de infecciones, deficiencias de MBL, cáncer, trastornos asociados con quimioterapia, tales como infecciones, enfermedades asociadas al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), enfermedades relacionadas con inmunodeficiencias congénitas o adquiridas. De modo más particular, polineuropatía desmielinante inflamatoria crónica (CIDP), neuropatía motora multifocal, esclerosis múltiple, miastenia gravis, síndrome de Eaton-Lambert, neuritis óptica, epilepsia; síndrome antifosfolipídico primario; artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia sistémica, vasculitis, granulomatosis de Wegner; síndrome de Sjogren, artritis reumatoide juvenil; neutropenia autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, neutropenia; enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca; asma, síndrome de choque séptico, síndrome de fatiga crónica, psoriasis, síndrome de choque tóxico, diabetes, sinusitis, cardiomiopatía dilatada, endocarditis, aterosclerosis, hipo/agammaglobulinemia primaria incluyendo la inmunodeficiencia variable común, síndrome de Wiskot-Aldrich e inmunodeficiencia combinada severa (SCDI), hipo/agammaglobulinemia en pacientes con leucemia linfática crónica (CLL) y mieloma múltiple, púrpura trombocitopénica idiopática aguda y crónica (ITP), transplante alógeno de médula ósea (BTM), enfermedad de Kawasaki y síndrome de Guillan-Barre.

La ruta de administración puede ser cualquier ruta adecuada, tal como intravenosa, intramuscular, subcutánea o intradérmica. También se tiene en cuenta la administración pulmonar o tópica en la presente invención.

En particular, la proteína de fusión puede administrarse para prevenir y/o tratar infecciones en pacientes que tienen síntomas clínicos asociados con la deficiencia de MBL congénita o adquirida o que están en riesgo de desarrollar tales síntomas. Una amplia gama de estados puede conducir a un aumento de la susceptibilidad a las infecciones en individuos deficientes en MBL; tal como la quimioterapia u otros tratamientos terapéuticos citotóxicos, cáncer, SIDA, disposición genérica, infecciones crónicas y neutropenia.

Así, la composición farmacéutica se puede administrar durante un período de tiempo antes del comienzo de la administración de quimioterapia o similares y durante al menos una parte de la quimioterapia.

La proteína de fusión se puede administrar como un "refuerzo" general antes de la quimioterapia, o se puede administrar sólo a pacientes en riesgo de desarrollar deficiencia en MBL. Midiendo el nivel de MBL antes del tratamiento puede determinarse el grupo de pacientes que está en riesgo y someter a tratamiento sólo a los pacientes cuyo nivel de MBL está por debajo de un nivel predeterminado.

La proteína de fusión se administra en regímenes de dosificación adecuados, en particular se administra habitualmente a intervalos adecuados, p. ej. una o dos veces por semana durante la quimioterapia.

Normalmente se administran 1-100 mg por dosis, tal como 2-10 mg, generalmente 5-10 mg por dosis. Generalmente se administran aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal.

Además, un aspecto de la presente invención es el uso de una composición recombinante según la presente invención en un kit que comprende además otro medicamento. En particular, el otro medicamento puede ser un medicamento antimicrobiano, tal como un antibiótico.

En lo que se refiere a los abortos, se ha informado que la frecuencia de bajos niveles plasmáticos de MBL es alta en pacientes que sufren abortos recurrentes sin explicación alguna, lo que constituye la base para disminuir la susceptibilidad a sufrir abortos mediante la reconstitución del nivel de MBL por administración de MBL recombinante en estos casos.

En cuanto a la naturaleza de los compuestos de la invención, parece que, en su aspecto más amplio, la presente invención se refiere a compuestos que son capaces de actuar como opsoninas, es decir, capaces de intensificar la captación por macrófagos, o bien a través de la interacción directa entre el compuesto y el macrófago o por mediación del depósito de complemento sobre la superficie diana.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación plasmídica de FCNMBL-r1, -r2, -r3,-r4,-r5,-r6 y -r7. 1.1 Compendio

Se construyeron una serie de plásmidos para la expresión en células mamíferas de fusiones proteicas entre el gen humano recombinante de lectina 2 que se une a manosa (rhMBL) y la ficolina 2 humana (FCN2). El vector se deriva de un plásmido basado en ColE1 con alto número de copias y está diseñado para permitir la expresión de proteínas en sistemas mamíferos. Las expresiones de las proteínas de fusión son conducidas por el promotor precoz inmediato de citomegalovirus humano (CMV) para promover la expresión constitutiva. La selección es hecha posible en bacterias por el gen de resistencia a ampicilina bajo el control del promotor de \beta-lactamasa procariótica. El gen de resistencia a neomicina es conducido por el promotor precoz de SV40, lo que proporciona la selección estable con G418 en células mamíferas.

1.2 Construcciones y trabajo experimental

Con el fin de expresar proteínas de fusión entre Ficolina2 y MBL, se han diseñado y construido una serie de plásmidos. Los nuevos plásmidos recombinantes se basan en el pcDNA2001-cintMBLcDNA previamente clonado. Este plásmido contiene un intrón sintético junto con el cDNA para MBL humano. Se diseñaron las siguientes fusiones (la fuente subrayada indica la parte FCN2 - cursiva indica la parte MBL de la proteína de fusión.)

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FCN2MBLr1 (SEQ ID NO:118):

FCN2 (secuencia señal+ colágeno+"bisagra" a aa131 de dominio de ficolina) MBL (de aa129 de dominio de unión a hidratos de carbono)

115

\vskip1.000000\baselineskip

FCN2MBLr2 (SEQ ID NO: 119):

FCN2 (secuencia señal+ colágeno+"bisagra"+parte del dominio de ficolina que contiene doble hélice predicho a aa207) MBL (de aa129 de dominio de unión a hidratos de carbono)

116

\newpage

FCN2MBLr3 (SEQ ID NO: 120):

FCN2 (secuencia señal+ colágeno a aa92) MBL (de aa101 doble hélice + dominio de unión a hidratos de carbono)

117

\vskip1.000000\baselineskip

FCN2MBLr4 (SEQ ID NO: 121):

FCN2 (secuencia señal+ parte de colágeno a cons.K en aa93) MBL (de cons.K en el resto aa77 de colágeno+doble hélice + dominio de unión a hidratos de carbono)

118

\vskip1.000000\baselineskip

FCN2MBLr5 (SEQ ID NO: 122):

FCN2 (secuencia señal+ parte de colágeno a cons.G en aa69) MBL (de cons.G en resto de aa.64 de colágeno (que contiene "kick")+doble hélice + dominio de unión a hidratos de carbono)

119

\newpage

FCN2MBLr6 (SEQ ID NO: 123):

MBL (colágeno MBL reemplazado (aa.41 a aa 99)+doble hélice + dominio de unión a hidratos de carbono) FCN2 (colágeno insertado aa.54 a aa.92)

120

FCN2MBLr7 (SEQ ID NO: 124):

MBL (secuencia señal a aa.25)FCN2 (colágeno a aa93) MBL (de aa100 doble hélice + dominio de unión a hidratos de carbono)

121

Plásmidos parentales usados para todas las construcciones

- pcDNA2003-cintMBLcDNA

- Invitrogen Genestorm clon RG000632 (nº Cat. H-K1000 Invitrogen). Las construcciones fueron hechas por recombinación usando el kit de clonación PCR BD In-Fusion™ PCR forma BD (nº Cat. 631774). El kit In-Fusion permite la clonación de los productos PCR basándose sólo en homología 2 x 15 pb entre el vector y el extremo del producto PCR. Cuando se la hace la clonación con este kit, la ligasa y la fosfatasa son innecesarias. La enzima In-Fusion captura los extremos del fragmento de DNA y fusiona el inserto en el vector.

Los cebadores usados para las reacciones se indican en la Tabla 1.

Reacciones PCR y linealización del vector para la recombinación

Se hicieron reacciones PCR en el plásmido "Genestorm RG000632" lote N135-15C digerido con Bstz17I (N135-20B). Se usaron pares de cebadores como se describe a continuación. Kit para reacciones PCR: Mezcla maestra PCR PfuUltra™ Hotstart, Stratagen #600630. Los tubos de reacción PCR se pusieron en el ciclador-i BioRAD usando el perfil de temperaturas indicado en la tabla 2.

Para las reacciones de recombinación, el vector pcDNA2001-cintMBLcDNA se linealizó por digestión con enzimas de restricción, usando las enumeradas a continuación.

FCN2MBLr1:

PCR usando cebadores: Pr1-xho-MBLFCN + Pr4-Xmn-FCNMBL-rev (producto de 463 pb) Digestión de pcDNA2001-cintMBLcDNA: XhoI + XmnI (parcial)

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FCN2MBLr2:

PCR usando cebadores: Pr1-xho-MBLFCN + Pr5-Xmn-FCNMBL-rev Digestión de pcDNA2001-cintMBLcDNA: XhoI + XmnI (parcial)

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FCN2MBLr3:

PCR usando cebadores: Pr1-xho-MBLFCN + Pr6-b-Bsp-FCNMBL-rev Digestión de pcDNA2001-cintMBLcDNA: XhoI + BspEI

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FCN2MBLr4:

PCR usando cebadores: Pr1-xho-MBLFCN + Pr2-apa-FCNNIBL-rev Digestión de pcDNA2001-cintMBLcDNA: XhoI + ApaI

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FCN2MBLr5:

PCR usando cebadores: Pr1-xho-MBLFCN + Pr3-apa-FCNMBL-rev Digestión de pcDNA2001-cintMBLcDNA: XhoI + ApaI

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FCN2MBLr6:

PCR usando cebadores: Pr8-BstAP-MBLFCN + Pr6-b-Bsp-FCNMBL-rev Digestión de pcDNA2001-cintMBLcDNA: parcial BstAPI + BspEI

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FCN2MBLr7:

PCR usando cebadores: Pr7-Alw-MBLFCN + Pr6-b-Bsp-FCNMBL-rev Digestión de pcDNA2001-cintMBLcDNA :parcial AlwNI + BspEI

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Reacciones de recombinación PCR In-Fusión

Las reacciones de recombinación PCR In-Fusión se llevaron a cabo usando aproximadamente 50-100 ng de productos PCR purificados en Quiagen Minelute junto con 50-100 ng de pcDNA2001-cintMBLcDNA linealizado purificado con Quiagen Minelute.

1/10 de las reacciones de recombinación se transformaron en células competentes DH5\alpha de eficiencia MAX (Invitrogen nº Cat. 18258-012). 1/10 y 9/10 de cada transformación se rociaron sobre placas LB separadas que contenían 200 ug/ml ampicilina. Las placas se incubaron a 37°C durante una noche. Escrutinio en busca de clones positivos: Se recogieron al menos 6 colonias de cada placa experimental para el aislamiento del DNA plasmídico miniprep. Para determinar la presencia del inserto, se analizó el DNA por análisis de digestión por restricción con la enzima PstI. Se eligieron tres clones positivos individuales de cada reacción para trabajo adicional.

Análisis de restricción

Para verificar los plásmidos recombinantes individuales seleccionados después del escrutinio primario, se realizó un análisis intensivo por digestión con enzimas de restricción sobre el DNA plasmídico aislado.

El DNA plasmídico de los recombinantes se digirió con la enzima indicada en la tabla 3. Los fragmentos esperados se enumeran también en la tabla. Todos los clones recombinantes ensayados presentaron el patrón esperado. La digestión con EcoRl no fue como se había predicho. Se observó un fragmento adicional tanto en la digestión del plásmido recombinante como del plásmido parental. La discrepancia se puede explicar por un sitio EcoRI adicional en el plásmido parental.

Resultados

Los plásmidos recombinantes obtenidos se muestran esquemáticamente en las figuras 4-8 para las construcciones r1, -r2, -r3,-r4, y -r5.

Ejemplo 2 Experimentos con expresión pasajera de proteínas de fusión recombinantes de MBL humano y FCN2 humano 2.1 Compendio

Se describe la expresión de proteínas de fusión humanas recombinantes FCNMBLr1, FCNMBLr4, FCNMBLr5 y MBL en células HEK293 y Per.C6. Se halló que las líneas celulares en el experimento de transfección pasajera eran capaces de producir al menos las proteínas de fusión FCNMBLr4 y FCNMBLr5 ensambladas en oligómeros activos con una estructura primaria similar a las formas oligómeras 3 y 4 de MBL. Las proteínas de fusión FCNMBLr4 y FCNMBLr5 se comportaron igual que MBL en la unión a una superficie de hidrato de carbono y en la activación de la cascada del complemento.

2.2 Introducción

El objeto de los estudios fue dilucidar la posibilidad de crear una proteína híbrida consistente en la parte de colágeno de la ficolina 2 humana y la lectina humana que se una a manosa (MBL). Además, se deseaba aclarar si estas moléculas seguirían teniendo la capacidad de unirse a estructuras complejas de hidratos de carbono y si seguirían siendo capaces de activar el complemento.

Se usaron dos líneas celulares eucarióticas de origen humano, HEK293 y Per.C6, como líneas celulares anfitrionas para transfecciones pasajeras con los respectivos plásmidos de expresión. La transcripción fue conducida por el potenciador del promotor CMV-IE.

2.3 Experimentos Materiales y Métodos Plásmidos usados para los experimentos de transfección

pME607-FCNMBL-r1, -r2, -r3,-r4,-r5,-r6 y-r7 (descritos en el Ejemplo 1)

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Origen de las células usadas

Se obtuvieron células PerC6 a partir de Crucell.

Se obtuvieron células HEK 293 Freestyle a partir de InVitrogen.

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Medios de cultivo

Se cultivaron células PerC6 a 37°C en 10% (vol/vol) de CO_{2} mantenidas como monocapas en medio exento de suero.

Se cultivaron células HEK 293 Freestyle a 37°C en 8% (vol/vol) de CO_{2} mantenidas como suspensión en un medio Freestyle de Invitrogen.

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Transfecciones y recogida de los medios

Las células Per.C6 en medio que contenía suero se transfectaron con el DNA usando el reactivo de transfección Lipofectamine. Un día después de la transfección, el medio se repuso con medio exento de suero.

Las células HEK293 en medio Freestyle libre de suero se transfectaron con el DNA usando el reactivo de transfección 293fect. El medio se recogió después de aproximadamente 4 días de incubación después de la transfección.

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Cuantificación de MBL

Ensayo de MBL recombinante (TRIFMA) usando placas revestidas de manano o placas revestidas de mAb-131-01. Para la cuantificación de MBL, se llevó a cabo inmunofluorimetría resuelta en función del tiempo.

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SDS-PAGE y análisis por transferencia Western

Se llevó a cabo la SDS-PAGE con transferencia subsiguiente de proteínas a membranas de difluoruro de polivinilideno y detección de MBL usando anticuerpos monoclonales anti-MBL.

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Ensayo de C4

El ensayo está diseñado para medir la capacidad de MBL y rMBL para iniciar la ruta de MBL lectina del sistema del complemento. Serina proteasa asociada con MBL(MASP 2), asociada con MBL, escinde el factor del complemento C4 liberando C4a y C4b.

El depósito de C4b en las placas de ELISA revestidas con manano se detecta con anticuerpos marcados con biotina frente a C4b y estreptavidina marcada con Europio.

2.4 Resultados

En los experimentos descritos aquí, fue posible expresar FCN2MBLr4, FCN2MBLr5 y MBL pasajeramente tanto en células HEK293 como Per.C6 en condiciones libres de suero.

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Forma oligómera de las proteínas de fusión

Las formas oligómeras de las proteínas de fusión se examinaron por SDS PAGE desnaturalizante no reductora, seguida de una transferencia Western. El anticuerpo detector reconoce la parte CDR de MBL (y puede ser parte de la región doble hélice). Los resultados se muestran en la Figura 10. A partir de la figura, es evidente que la forma más prominente de las proteínas de fusión FCN2MBLr4 y FCN2MBLr5 es aproximadamente 250 kDa correspondientes a un 3- o 4-mero de subunidades que consisten en 3 cadenas proteicas individuales (24 kDa). La apariencia de la forma oligómera era independiente de las células anfitrionas usadas. Se produjo MBL en un amplio abanico de formas oligómeras.

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Propiedades de unión

La proteínas de fusión se sometieron a ensayo de funcionalidad del dominio de unión a hidratos de carbono de MBL mediante unión a una superficie de manano y detección con un anticuerpo que reconoce la parte CDR de MBL (y puede ser parte de la región de doble hélice). Los resultados se muestran en la Figura 4. Se puede llegar a la conclusión de que FCN2MBLr4 y FCN2MBLr5 se expresaban tan bien como MBL en las células anfitrionas y que las proteínas de fusión se unen a una superficie de manano.

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Unión a MASP-2 y escisión de C4

Las proteínas de fusión se ensayaron además para determinar la capacidad de unirse a MASP-2 y de activar la serina proteasa de MASP-2. Esto se hizo midiendo la escisión del factor del complemento C4 del sustrato ASP-2 tras la unión de la proteína de fusión a una superficie de manano. Los resultados se muestran en la tabla 5. A partir de estos resultados se puede llegar a la conclusión de que las proteínas de fusión FCN2MBLr4 y FCN2MBLr5 conservaron la capacidad de unión y activación de MASP-2.

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Discusión

Los resultados descritos aquí indican claramente que es posible construir proteínas de fusión de FCN 2 y MBL con las siguientes propiedades:

1.: La estructura oligómera de las proteínas de fusión es más simple que la de la proteína MBL.

2.: Las proteínas de fusión conservan la propiedad esencial de activación por MBL de la cascada del complemento tras unirse a una densa estructura de hidratos de carbono.

123

TABLA 2

124

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TABLA 3

125

TABLA 4 Unión de MBL a manano medida por TRIFMA

126

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TABLA 5 Actividad de las proteínas de fusión sobre C4

127

<110> NatImmune A/S

\hskip1cm

Weilguny, Dietmar

\hskip1cm

Kongerslev, Leif

\hskip1cm

Matthiesen, Finn

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<120> Quimeras de colectina-proteína activante del complemento

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<130> P 703 PC00

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<160> 127

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 185

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 1

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128

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<210> 2

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<211> 244

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

130

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<210> 3

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<211> 239

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 3

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132

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<210> 4

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<211> 652

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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134

135

136

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<210> 5

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<211> 644

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 5

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137

139

140

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<210> 6

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<211> 688

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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141

142

143

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 652

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

145

146

147

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

149

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

151

152

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 643

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

153

155

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 686

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

157

158

159

160

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

161

162

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 728

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

163

164

165

166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 699

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

167

169

170

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (91)..(116)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Desconocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

171

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

172

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

173

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

174

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

175

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 381

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Macaca nemestrina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

176

178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Carassius auratus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

179

180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Danio rerio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

181

182

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cyprinus carpio

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

183

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

186

187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

188

189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

190

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

192

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

193

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

195

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

197

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

198

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

199

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

201

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

203

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

204

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

205

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 652

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

207

209

210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Danio rerio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

211

212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cyprinus carpio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

213

214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 652

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

215

216

217

218

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 742

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

219

220

221

222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

223

224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 371

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

225

226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

227

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 420

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

229

230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 742

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

231

232

233

234

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Danio rerio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

235

236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 742

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

237

238

239

240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 622

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

242

243

244

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 742

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

245

246

247

248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

249

250

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

251

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

254

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 742

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

256

257

258

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Carassius auratus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

259

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Danio rerio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

262

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cyprinus carpio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

263

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

265

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 371

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

266

267

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

268

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

269

270

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

271

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 378

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

272

273

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

274

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

275

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

276

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2412

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

278

280

281

282

283

284

285

286

287

288

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

289

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

291

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Tyr Cys Asp Lys Pro Glu Glu Lys Met Tyr Ser Cys Pro Ile}

\sac{Ile Gln Cys Ser Ala Pro Ala Val Asn Gly Leu Pro Gly Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

293

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Desconocida

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

294

295

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

296

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

297

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

298

299

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

300

301

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 374

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

302

303

304

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

305

306

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryctolagus cuniculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

307

308

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 374

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

309

310

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

311

312

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

313

314

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

315

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

316

317

318

319

320

321

322

323

324

325

326

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2413

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

327

328

329

330

331

332

333

334

335

336

337

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1785

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

338

339

340

341

342

343

344

345

346

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ile Pro Cys Cys Pro Val Asn Ile Lys Arg Leu Leu Ile Val Val}

\sac{Val Val Val Val Leu Leu Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met}

\sac{Gly Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Ile Pro Cys Phe Pro Ser Ser Leu Lys Arg Leu Leu Ile Ile}

\sac{Val Val Val Ile Val Leu Val Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu}

\sac{Met Gly Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 371

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

347

348

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

3490

350

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

351

352

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

353

354

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

355

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

357

358

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

359

360

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

361

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 378

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

362

363

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

364

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

365

366

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

367

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2412

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

369

370

371

372

373

374

375

376

377

378

379

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2413

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

380

381

382

383

384

385

386

387

388

389

390

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 374

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

391

392

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Ile Pro Cys Phe Pro Ser Ser Leu Lys Arg Leu Leu Ile Ile}

\sac{Val Val Val Ile Val Leu Val Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu}

\sac{Met Gly Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ile Pro Cys Cys Pro Val Asn Ile Lys Arg Leu Leu Ile Val Val}

\sac{Val Val Val Val Leu Leu Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met}

\sac{Gly Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gln Ser Ile Thr Phe Asp Ala Gly Lys Glu Gln Cys Val Glu Met}

\sac{Tyr Thr Asp Gly Gln Trp Asn Asp Arg Asn Cys Leu Tyr Leu Thr Ile}

\sac{Cys Glu Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 370

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryctolagus cuniculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

393

394

395

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryctolagus cuniculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

396

397

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

398

400

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7) .. (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

401

402

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

403

404

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

405

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryctolagus cuniculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

407

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(130)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica del dom aa131 de ficolina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (131)..(251)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de MBL aa129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

409

410

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(206)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica del dominio de ficolina que contiene doble hélice pred. a aa207

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (207) .. (329)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de MBL

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

411

412

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25) .. (91)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de colágeno

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (92)..(240)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de MBL

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

413

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(82)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de colágeno a K cons. en aa 93

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (83)..(255)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de MBL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

415

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(69)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de colágeno

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (70)..(254)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de MBL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

417

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)..(41)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de MBL colágeno

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (42)..(232)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de colágeno

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

419

420

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21) .. (89)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de colágeno

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (90)..(237)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia polipeptídica de MBL

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

421

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

422

423

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

424

425

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

426

427

Claims

1. Una proteína de fusión que comprende

i) Una primera secuencia polipeptídica derivada de una proteína que activa la ruta del complemento-lectina o de un homólogo funcional al menos 70% idéntico a dicha proteína que activa la ruta del complemento-lectina, donde dicha primera secuencia polipeptídica es capaz de activar la ruta del complemento-lectina; y

ii) Una segunda secuencia polipeptídica derivada de una colectina o un homólogo funcional al menos 70% idéntico a dicha colectina, donde dicha segunda secuencia polipeptídica es capaz de asociarse a uno o más hidratos de carbono;

donde dicha proteína que activa el complemento no es una colectina.

2. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde dicha primera secuencia polipeptídica es capaz de asociarse con al menos una proteína MASP.

3. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde dicha primera secuencia polipeptídica es capaz de asociarse con una proteína MASP seleccionada del grupo que consiste en MASP-1, MASP-2 y MASP-3 u homólogos funcionales o variantes de los mismos.

4. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína activante del complemento es una ficolina.

5. La proteína de fusión según la reivindicación 4, donde la ficolina se selecciona del grupo que consiste en L-ficolina, H-ficolina y M-ficolina.

6. La proteína de fusión según la reivindicación 4, donde la ficolina es L-ficolina.

7. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la primera secuencia polipeptídica comprende el dominio similar a colágeno de una ficolina o un homólogo funcional o una variante del mismo.

8. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la primera secuencia polipeptídica comprende la región rica en cisteínas de una ficolina o un homólogo funcional de la misma.

9. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la primera secuencia polipeptídica comprende la región rica en cisteínas y el dominio similar a colágeno de una ficolina o un homólogo funcional o una variante del mismo.

10. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la primera secuencia polipeptídica comprende los aminoácidos 1-77 de la secuencia de L-Ficolina de la Figura 1 (SEQ ID. NO 125).

11. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la colectina se selecciona del grupo que consiste en MBL (lectina que se une a manosa), SP-A (proteína A de tensioactivo pulmonar), SP-D (proteína D de tensioactivo pulmonar), BK (o BC, conglutinina bovina) y CL-43 (colectina-43).

12. La proteína de fusión según la reivindicación 15, donde la colectina es MBL.

13. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la segunda secuencia polipeptídica comprende el dominio CRD de una colectina o un homólogo funcional o una variante del mismo.

14. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la segunda secuencia polipeptídica comprende el dominio CRD de MBL.

15. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la segunda secuencia polipeptídica comprende la región de cuello de MBL.

16. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la segunda secuencia polipeptídica comprende el dominio rico en colágeno de MBL.

17. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la segunda secuencia polipeptídica comprende la región de cuello y el dominio CRD de MBL.

18. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la segunda secuencia polipeptídica comprende el dominio similar a colágeno, la región de cuello y el dominio CRD de MBL.

19. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la segunda secuencia polipeptídica comprende los aminoácidos 80-228 de la secuencia de MBL mostrada en la Figura 2 (SEQ ID. NO 126).

\newpage

20. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína de fusión comprende la región rica en cisteínas y el dominio similar a colágeno de L-ficolina y el dominio CRD de MBL.

21. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína de fusión comprende la región rica en cisteínas de L-ficolina y el dominio similar a colágeno, la región de cuello y el dominio CRD de MBL.

22. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos definida por la secuencia indicada en la Figura 3 (SEQ ID. NO. 127), o un homólogo funcional al menos 70% idéntico a la misma.

23. La proteína de fusión según la reivindicación 1, donde la proteína de fusión consiste en la secuencia de aminoácidos definida por la secuencia indicada en la Figura 3 (SEQ ID. NO. 127).

24. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

25. Un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 29.

26. Una célula que comprende el vector según la reivindicación 30.

27. Una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para uso como medicamento.

28. Uso de la proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una infección en un individuo con necesidad de ello.

29. El uso según la reivindicación 40, donde el individuo es un ser humano.

30. El uso según la reivindicación 40, donde el individuo es un ser humano que padece un mayor riesgo de sufrir una infección.

31. El uso según la reivindicación 40, donde el individuo es un ser humano con un nivel sérico de MBL inferior al normal.

32. El uso según la reivindicación 40, donde el individuo es un ser humano con un nivel sérico de MBL normal.

33. Un medicamento para el tratamiento o la prevención de un estado clínico en un individuo con necesidad de ello, que comprende la proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

34. El medicamento según la reivindicación 45, donde el estado clínico es una infección.

35. El medicamento según la reivindicación 45, donde el individuo es un ser humano.