ES2280857T3 - Replegado de polipeptidos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la reactivación de IGF-I incorrectamente plegado contenido en células huésped, cuyo procedimiento comprende: (a) aislar dicho IGF-I de las células huésped; (b) mantener dicho IGF-I en un tampón alcalino que comprende un agente caotrópico y una agente reductor en una concentración suficiente para su solubilización; y (c) incubar dicho IGF-I solubilizado en una concentración de 0, 1 a 15 mg/ml aproximadamente en un tampón de plegado de pH 7-12 que comprende aproximadamente un 5-40% (v/v) de un solvente aprótico alcohólico o polar, aproximadamente 0, 2 a 3 M de un alcalino térreo, metal álcali, o sal de amonio, aproximadamente 0, 1 a 9 M de un agente caotrópico y aproximadamente 0, 1 a 15 miM de una sal de cobre o manganeso, en el que se introduce una fuente de oxígeno, de manera que el replegado del IGF-I se produce durante la incubación.

Description

Replegado de polipéptidos.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere a soluciones tampón especiales y su uso para el replegado de polipéptidos.

Descripción de la técnica relacionada

Para la producción comercial de muchos polipéptidos y proteínas, las técnicas de ADN recombinante se han vuelto el procedimiento de elección debido a las grandes cantidades que pueden producirse en bacterias y otras células huésped. La fabricación de proteína recombinante implica la transfección o la transformación de células huésped con ADN que codifica la proteína exógena deseada y cultivando las células bajo condiciones que favorezcan la expresión de la proteína recombinante. E. coli y levadura son las favorecidas como huéspedes porque puede hacerse que produzcan proteínas recombinantes a títulos altos.

Existen numerosas patentes U.S. sobre la expresión bacteriana general de proteínas de ADN recombinante codificados, incluyendo la Patente U.S. Nº 4.565.785 sobre una molécula de ADN recombinante que comprende un gen bacteriano para una proteína transportadora extracelular o periplásmica y gen no bacteriano; 4.673.641 sobre la coproducción de un polipéptido extranjero con un polipéptido formador de agregados; 4.738.921 sobre un vector de expresión con un promotor/operador trp y fusión de LE trp con un polipéptido tal como el factor de crecimiento de tipo insulínico (IGF-I); 4.795.706 sobre secuencias de control de expresión para incluir con una proteína extraña; y 4.710.473 sobre plásmidos circulares específicos de ADN tales como aquellos que codifican IGF-I.

Bajo algunas condiciones, ciertas proteínas heterólogas expresadas en grandes cantidades a partir de huéspedes bacterianos se precipitan dentro de las células en agregados densos, reconocidos como manchas brillantes visibles dentro del envoltorio de las células bajo un microscopio de contraste de fases. Estos agregados de proteínas precipitadas son referidas como "cuerpos refractantes", y constituyen una porción significativa de la proteína celular total. Brems et al., Biochemistry, 24: 7662 (1985). Por otra parte, los agregados de proteína pueden no ser visibles bajo el microscopio de contraste de fases, y el término "cuerpo de inclusión" con frecuencia se utiliza para referirse a los agregados de proteína ya sean visibles o no bajo el microscopio de contraste de fases.

Se ha encontrado que la proporción soluble de proteína de alto nivel expresada en proteína en E. coli se ha incrementado dramáticamente mediante el descenso de la temperatura de la fermentación a menos de 30ºC. Una fracción considerable de varias proteínas extrañas, por ejemplo, interferón alfa humano (IFN-\alpha3), interferón gamma (IFN-\gamma=, y proteína MX murina [Schein y Noteborn, Bio/Technology, 6: 291-294 (1988)] y IFN-\beta humana [Mizukami et al., Biotechnol. Lett., 8: 605-610 (1986)], permanecen en solución. Este procedimiento representa una alternativa a la renaturalización de proteínas recuperadas a partir de cuerpos refractarios, pero requiere un sistema de expresión que se induce eficientemente a temperaturas por debajo de 30ºC. El procedimiento por lo tanto no es efectivo para todas las proteínas.

Para artículos de revisión general sobre cuerpos refractarios, ver Marston, supra; Mitraki y King, Bio/Technology, 7: 690 (1989); Marston y Hartley, Methods in Enzymol., 182: 264-276 (1990); Wetzel, "Protein Aggregation In Vivo: Bacterial Inclusion Bodies and Mammalian Amyloid", en Stability of Protein Pharmaceuticals: In Vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization, Ahern y Manning (eds.) (Plenum Press, 1991); y Wetzel, "Enhanced Folding and Stabilization of Proteins by Suppression of Aggregation In Vitro and In Vivo", en Protein Engineering-A Practical Approach, Rees, A.R. et al. (eds.) (IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1991).

La recuperación de proteínas a partir de estos cuerpos ha presentado numerosos problemas, tales como cómo separar la proteína recubierta dentro de la célula del material celular y las proteínas que la envuelven, y cómo recuperar el cuerpo de proteína de inclusión en forma biológicamente activa. Las proteínas recuperadas con frecuencia son predominantemente biológicamente inactivas porque están plegadas en una configuración tridimensional diferente de la de la proteína activa. Por ejemplo, IGF-I erróneamente plegado con pares de enlace disulfuro distintos a los hallados en IGF-I nativo tiene una actividad biológica significativamente reducida. Raschdorf et al., Biomedical and Environmental Mass Spectroscopy, 16: 3-8 (1988). El plegado erróneo se produce tanto en la célula durante la fermentación o durante el procedimiento de aislamiento. Los procedimientos para el replegado de las proteínas en la conformación correcta, biológicamente activa son esenciales para obtener proteínas funcionales.

Otra propiedad experimentada por las proteínas durante el replegado es la tendencia a producir dímeros, trímeros y multímeros con enlaces disulfuro, Morris et al., Biochem. J., 268: 803-806 (1990); Toren et al., Anal. Biochem., 169: 287-299 (1988); Frank et al., in Peptides: svnthesis-structure-function'', ed. D.H. Rich and E. Gross, pp. 729-738 (Pierce Chemical Company: Rockford, Illinois, 1981). Este fenómeno de asociación es muy común durante el replegado de la proteína, en particular a altas concentraciones de proteína, y con frecuencia parece implicar asociación a través de interacción hidrofóbica de intermediarios parcialmente plegados. Cleland and Wang, Biochemistry, 29: 11072-11078 (1990).

El plegado de proteínas está influenciado por la naturaleza del medio que contiene a la proteína y por una combinación de fuerzas intramoleculares débilmente atractivas o repelentes implicadas en la unión hidrógeno, unión iónica e interacciones hidrofóbicas. Cuando pares de residuos de cisteína se disponen muy próximos cuando se pliega el eje central del péptido, se forman fuertes uniones disulfuro covalentes entre los residuos de cisteína, sirviendo para bloquear en su sitio la conformación terciaria.

Una serie de técnicas para recuperar proteína activa a partir de los cuerpos de inclusión implica solubilizar los cuerpos de inclusión en soluciones fuertemente desnaturalizantes y luego opcionalmente intercambiando soluciones débilmente desnaturalizantes por las soluciones fuertemente desnaturalizantes (o diluyendo la solución fuertemente desnaturalizante), o utilizando un tamiz molecular o técnicas de centrifugación de alta velocidad. Dichos procedimientos de recuperación, descritos por ejemplo en las Patentes U.S. 4.512.922; 4.518.256; 4.511.502; y 4.511.503, se consideran como universalmente aplicables, sólo con mínimas modificaciones, para la recuperación de proteínas recombinantes biológicamente activas a partir de los cuerpos de inclusión. Estos procedimientos buscan eliminar los enlaces disulfuro aleatorios antes de coaxiar la proteína recombinante en su conformación biológicamente activa a través de sus otras fuerzas de estabilización.

En un procedimiento para recuperar proteína a partir de los cuerpos de inclusión, la proteína desnaturalizada deseada a replegar se purifica adicionalmente bajo condiciones reductoras que mantienen las fracciones cisteína de la proteína como grupos sulfidrilos libres. El agente reductor se diluye entonces en una solución acuosa para permitir que la proteína replegada forme las uniones disulfuro apropiadas en presencia de aire o de otro agente oxidante. Esto permite que el replegado se incorpore fácilmente en el proceso global de purificación.

En otra aproximación, el replegado de la proteína recombinante tiene lugar en presencia tanto de formas reducidas (R-SH) y oxidadas (R-S-S-R) de un compuesto sulfhidrilo. Esto permite que los grupos sulfhidrilo libres y disulfuros se forman y reforman constantemente a lo largo del proceso de purificación. Las formas reducidas y oxidadas del compuesto sulfhidrilo se proporcionan en un tampón que tiene un poder desnaturalizante suficiente para que todas las conformaciones intermedias de la proteína permanecen solubles en el transcurso del desplegado y del replegado. Se sugiere la urea como un medio tampón adecuado. La tercera alternativa en estas series se designa para romper cualquier unión disulfuro que pueden haberse formado incorrectamente durante el aislamiento de los cuerpos de inclusión y para derivar los grupos sulfhidril libres disponibles a la proteína recombinante. Este objetivo se logra sulfonando la proteína para bloquear apareamientos disulfuro aleatorios, permitiendo que la proteína se repliegue correctamente en una solución débilmente desnaturalizante, y luego desulfonando la proteína, bajo condiciones que favorecen la correcta unión disulfuro. La desulfonación tiene lugar en presencia de un compuesto sulfhidrilo y una cantidad pequeña de su correspondiente forma oxidada para asegurar que las uniones disulfuro adecuadas permanecerán intactas. El pH se eleva a un valor tal que el compuesto sulfhidrilo está al menos en parte en su forma ionizada para aumentar el desplazamiento nucleofílico del sulfonato.

Estos protocolos de replegado, mientras que son prácticos por su utilidad universal, no han mostrado ser necesariamente máximamente eficientes con, por ejemplo, IGF-I recombinante.

La recuperación de la actividad biológica requiere un procedimiento de renaturalización cuidadosamente monitorizado y puede ser muy difícil dependiendo de la proteína en cuestión. Han aparecido un número de publicaciones que informan de intentos de replegado para proteínas individuales que se producen en huéspedes baterianos o de otra forma están en una forma desnaturalizada o no activa. Por ejemplo, la formación de un factor dimérico de estimulación de colonia de macrófagos biológicamente activo (M-CSF) después de la expresión en E. coli se describe en WO 88/8003 y en Halenbeck et al., Biotechnology, 7: 710-715 (1989). Los procedimientos descritos implican las etapas de solubilización inicial de monómeros M-CSF aislados a partir de cuerpos de inclusión bajo condiciones de reducción en un ambiente caotrópico que comprende urea o hidrocloruro de guanidina, lográndose el replegado mediante la dilución en forma escalonada de los agentes caotrópicos, y la oxidación final de las moléculas replegadas en presencia de aire o de un sistema redox.

Las patentes U.S. Nº 4.923.967 y EP 361.830 describen un protocolo para solubilizar y realizar la sulfitolisis de proteína refractaria en desnaturalizante, intercambiando luego el solvente para precipitar la proteína. La proteína se resolubiliza en desnaturalizante y se deja replegar en presencia de un agente reductor. Las múltiples etapas requeridas para lograr un plegado correcto son de larga duración.

Se han informado procedimientos para replegar las proteínas para distintas proteínas tales como interleucina-2 (IL-2) [Tsuji et al., Biochemistry, 26: 3129-3134 (1987); WO 88/8849 (que describe en la página 17 el uso de altas concentraciones de cobre como oxidante], hormona de crecimiento a partir de varias fuentes [George et al., DNA, 4: 273-281 (1984); Gill et al., Bio/Technology, 3: 643-646 (1985); Sekine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4306-4310 (1985); U.S. Pat. Nº 4.985.544, implicando la última referencia añadir un agente desnaturalizante y un agente reductor para solubilizar la proteína, extraer el agente reductor, oxidar la proteína, y extraer el agente desnaturalizante], proquimosina [Green et al., J. Dairy Res., 52: 281-286 (1985)], uroquinasa [Winkler et al., Bio/Technology, 3: 990-1000 (1985)], somatotropina [U.S. Pat. Nº 4.652.630, donde se utiliza urea para la solubilización y un agente oxidante suave se utiliza luego para el replegado], interferón beta [EP 360.937 publicado Abril 4, 1990], y activador plasminogen tisular [Rudolph et al., in "623rd Biochem. Soc. Meeting", Canterbury (1987)]. Ver también Marston, Biochemical J., 240: 1-12 (1986). Un procedimiento adicional de plegado que utiliza la pro-secuencia del polipéptido producido naturalmente para fomentar el replegado de un polipéptido biológicamente inactivo a su forma activa, ejemplificado en subtilisina, se describe en la U.S. Pat. Nº 5.191.063.

En ciertas técnicas de recuperación, se ha obtenido hasta al menos un 60% de proteína extraña activa. Ver, por ejemplo, Boss et al., Nucl. Acids Res., 12: 3791-3806 (1984); Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3273-3277 (1984); Marston et al., Bio/Technology, 2: 800-804 (1984); Rudolph et al., supra.

Literatura representativa adicional sobre replegado de proteínas no nativas derivadas a partir de diferentes Fuentes incluyen un informe sobre que IL-2 e interferon-\beta (IFN-\beta) se han replegado utilizando SDS para la solubilización y iones Cu^{+2} como promotores de oxidación de las proteínas completamente reducidas. U.S. Pat. Nº 4.572.798. Se ha descrito un procedimiento para aislar proteínas refractarias recombinantes en la U.S. Pat. Nº 4.620.948 que implica utilizar soluciones fuertemente desnaturalizantes para solubilizar las proteínas, condiciones reductoras para facilitar el plegado correcto, y el reemplazo del desnaturalizante en presencia de aire u otro agente oxidante para reformar las uniones disulfuro. Las proteínas a las cuales puede aplicarse el procedimiento incluyen uroquinasa, hormona de crecimiento humana, bovina y porcina, interferón, activador de plasminogen de tipo tisular, proteína de revestimiento de fiebre aftosa (FMD), pro-renina, y una proteína src.

Se describe en WO86/5809 un procedimiento para renaturalizar proteínas desplegadas que incluye citocromo c, ovoalbúmina e inhibidor de tripsina mediante la unión reversible de la proteína desnaturalizada a una matriz sólida y renaturalizarla escalonadamente mediante la dilusión del desnaturalizante. Una forma monomérica modificada de factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas (PDGF) expresado en E. coli se ha S-sulfonatado durante la purificación para proteger las fracciones thiol y luego se dimerizan en presencia de agentes oxidantes para producir la proteína activa. Hoppe et al., Biochemistry, 28: 2956-2960 (1989).

Adicionalmente, EP 433.225 publicada el 19 de junio, 1991 describe un procedimiento para producir proteína dimérica de factor de crecimiento \beta transformador biológicamente activo o una sal del mismo en la cual la forma monomérica desnaturalizada de la proteína se somete a condiciones de replegado que incluyen un agente de solubilización tal como un detergente suave, un solvente orgánico miscible en agua, y/o un fosfolípido. La U.S. Pat. Nº 4.705.848 describe el aislamiento de hormona de crecimiento monomérica biológicamente activa a partir de cuerpos de inclusión que utiliza una etapa de desnaturalización con una sal de guanidina y una etapa de renaturalización. Ver también Bowden et al., Bio/Technology, 9: 725-730 (1991) sobre cuerpos de inclusión \beta-lactamasa citoplásmica y periplásmica, y Samuelsson et al., Bio/Technology, 9: 731 (1991) sobre replegado de mutantes de interferón-gamma humano.
Además, Hejnaes et al., Protein Engineering, 5: 797-806 (1992) describe el uso de un agente caotrópico con IGF-I.

Existen distintas referencias literarias sobre la producción de IGF-I en bacterias. Estas incluyen EP 128.733 publicada en Diciembre 19, 1984 y EP 135.094 publicada en Marzo 27, 1985, que trata expresiones de IGF-I en bacteria. La EP 288.451 trata del uso de señal lamB o ompF para secretar IGF-I en bacterias; Obukowicz et al., Mol. Gen. Genet., 215: 19-25 (1988) y Wong et al., Gene, 68: 193-203 indican en forma similar. La EP 286.345 describe la fermentación de IGF-I utilizando un promotor lambda.

Además, se han sugerido procedimientos para preparar IGF-I como una proteína de fusión. Por ejemplo, EL 130.166 describe una expresión de péptidos de fusión en bacterias, y la U.S. Pat. Nº 5.019.500 y EP 219.814 describe una fusión de IGF-I con un polipéptido protector para la expresión en bacterias. La EP 264.074 describe un vector de expresión dos-cistronico met-IGF-I con un péptido protector de peso molecular 500-50.000 [ver también U.S. Pat. Nº 5.028.531 y Saito et al., J. Biochem., 101: 1281-1288 (1987)]. Otras técnicas de fusión de IGF-I incluye fusión con péptido protector a partir del cual se corta un gen rop [EP 219.814], expresión multímera de IGF-I [Schulz et al., J. Bacteriol., 169: 5385-5392 (1987)], fusión de IGF-I con hormona luteinizante (LH) a través de un residuo metionil o triptofano divisibles químicamente en el sitio de unión [ver también U.S. Pat. Nº 5.028.531 y Saito et al., J. Biochem., 101: 1281-1288 (1987)], y fusión con dismutasa superóxido. La EP 196.056, Niwa et al., Ann. NY Acad. Sci., 469: 31-52 (1986) discute la síntesis química, clonado y expresión exitosa de genes para IGF-I fusionados con otros polipéptidos. Estos procedimientos utilizan proteínas de fusión, sin embargo, generalmente requieren una secuencia líder relativamente larga y se orientan a mejorar la expresión de la proteína del cuerpo de inclusión, no para mejorar el replegado de la proteína recombinante desnaturalizada.

La U.S. Pat. Nº 5.158.875 describe un procedimiento para replegar IGF-I recombinante que implica clonar el gen IGF-I con una secuencia líder cargada positivamente antes de transfectar el ADN en la célula huésped. La carga positiva adicional en el término amino del IGF-I recombinante promueve el replegado correcto cuando la proteína solubilizada se agita durante 2-16 horas en solución desnaturalizante. A continuación del replegado, la secuencia líder se divide y la proteína recombinante activa se purifica. Sin embargo, este procedimiento multi etapas es oneroso, requiriendo materiales y esfuerzos adicionales para clonar una secuencia líder heteróloga frente al gen IGF-I y luego extraer la secuencia líder de la proteína purificada.

Otro procedimiento para facilitar el replegado in vitro del IGF-I recombinante implica utilizar un socio de fusión afín solubilizado que consiste en dos dominios de unión IgG (ZZ) derivados de la proteína A de estafilococo. Ver Samuelsson et al., supra. Este procedimiento utiliza el dominio de la proteína A como un solubilizador de IGF-I mal plegado y multimérico. Mientras este procedimiento no utiliza agentes desnaturalizantes o químicos redox, implica las etapas extra fusión sobre el gen IGF-I de un gen separado y extraer el polipéptido codificado por ese gen después de la expresión del gen de fusión.

Otros investigadores han descrito estudios de replegado de IGF-I que implica el equilibrado del intercambio disulfuro de intermediarios replegados. Por ejemplo, se investigó el replegado de IGF-I utilizando tampones redox y las formas parcialmente oxidadas IGF-I producidas se caracterizaron mediante Hober et al., Biochemistry, 31: 1749-1756 (1992).

El intercambio de disulfuro puede también modularse utilizando el agente adictivo de peptidil disulfuro isomerasa (PDI) o peptidil prolil isomerasa (PPI). Ver por ejemplo, JP Pat. Appln. Nº 63294796 publicada Diciembre 1, 1988; EP 413.440 publicada Febrero 20, 1991; y EP 293.793 publicada Diciembre 7, 1988.

Se ha informado la mejora de apareamientos disulfuro seleccionados mediante la adición de 50% de metanol al tampón a baja fuerza iónica en Snyder, J. Biol. Chem., 259: 7468-7472 (1984). La estrategia implica mejorar la formación de uniones disulfuro específicas mediante el ajuste de factores electrostáticos en el medio para favorecer la yuxtaposición de amino ácidos cargados de forma opuesta que rodean los residuos cisteína seleccionados. Ver también Tamura et al., resumen y lamina presentada en el Eleventh American Peptide Symposium on July 11, 1989, recomendando la adición de acetonitrilo, DMSO, metanol, o etanol para mejorar la producción de IGF-I correctamente plegado.

Se describe un procedimiento para plegar AlaGlu-IGF-I que implica cambiar el potencial redox mediante diálisis contra un tampón que contiene a partir de 20-40% v/v de etanol durante un período de hasta cinco horas y acidificando la mezcla en WO 92/03477 publicada en Marzo 5, 1992.

Se utilizó metanol a ciertas concentraciones en la desnaturalización de ribonucleasa. Lustig and Fink, Biochim. Biophys. Acta, 1119: 205-210 (1992). Estudios de otros laboratorios indican que concentraciones moderadas de alcohol pueden reducir la asociación de péptidos similares a la insulina bajo condiciones que promueven la desestabilización de la estructura. Bryant et al., Biochemistry, 31: 5692-5698 (1992); Hua y Weiss, Biochim. Biophys. Acta, 1078: 101-110 (1991); Brems et al., Biochemistry, 29: 9289-9293 (1990); Ueda et al., JP 62-190199 publicada Julio 20, 1987.

Investigaciones de otros investigadores han mostrado que la polaridad de la solución influencia la propensión de los péptidos para adquirir cierta estructura secundaria. Jackson and Mantsch, Biochim Biophys. Acta, 1118: 139-143 (1992); Shibata et al., Biochemistry, 31: 5728-5733 (1992); Zhong and Johnson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4462-4465 (1992). En general, la polaridad reducida de la solución parece que favorece la formación de hélice alfa en péptidos cortos. Jackson and Mantsch, supra. Estudios espectroscópicos sobre insulina también indican que concentraciones moderadas de alcoholes mejoran el contenido de hélice alfa. Hua and Weiss, supra.

Existe una necesidad de un procedimiento eficiente y barato para replegar polipéptidos, incluyendo IGF-I insoluble, mal plegado y otros, en la conformación correcta de forma tal que la actividad biológica del polipéptido pueda restaurarse.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento eficiente de replegado para polipéptidos.

Es otro objetivo proporcionar un procedimiento de replegado que no utilice caros reactivos de intercambio de disulfuro tal como glutationa.

Es un objeto adicional proporcionar un procedimiento de replegado que no produzca un producto que contenga añadidos disulfuro.

Es otro objetivo adicional proporcionar condiciones de replegado que son máximamente repetibles, resistentes y escalables.

Este y otros objetivos serán evidentes para aquellos con habilidad ordinaria en la técnica.

Descripción de la invención

Se ha encontrado ahora que el uso de concentraciones bajas de cobre o manganeso facilitan enormemente la oxidación disulfuro de los polipéptidos.

La invención proporciona un procedimiento para reactivar IGF-I mal plegado contenido en células huésped, dicho procedimiento comprende:

1. (a) aislar dicho IGF-I de las células huésped;

2. (b) mantener dicho IGF-I en un tampón alcalino que comprende un agente caotrópico y un agente reductor en cantidades suficientes para la solubilización; y

3. (c) incubar dicho IGF-I solubilizado a una concentración de aproximadamente 0,1 a 15 mg/mL en un tampón de replegado de pH 7-12 que comprende aproximadamente 5-40% (v/v) de un solvente aprótico alcohólico o polar, aproximadamente 0,2 a 3 M de un metal alcalino, alcalino térreo, o sal de amonio, aproximadamente 0,1 a 9 M de un agente caotrópico, y aproximadamente 0,01 a 15 \muM de una sal de cobre o manganeso,

en la cual se introduce una fuente de oxígeno, de forma tal que el replegado del IGF-I se produce durante la incubación.

La esencia de la invención es utilizar un tampón especial que contiene una concentración mínima de sal de cobre o de manganeso para fomentar el replegado de polipéptido mal replegados. El uso de sales de cobre o de manganeso como catalizadores de oxidación evita la necesidad de agentes de intercambio de disulfuro más caros tales como glutationa. Por otra parte, el procedimiento evita la posibilidad de producir polipéptidos que contienen añadidos disulfuro que pueden resultar cuando se emplean los agentes de intercambio de disulfuro. En una realización preferida, se identifican las condiciones de solución que son favorables para replegar IGF-I recuperado a partir de cuerpos refractarios periplásmicos procarióticos para obtener IGF-I de alto rendimiento, adecuadamente replegado.

En particular, el procedimiento se prefiere para polipéptidos de mamíferos no nativo producidos de forma recombinante en células procarióticas, tales como bacterias, incluyendo E. coli, que forman cuerpos refractarios en el periplasma de las células. Además, aquí la invención resulta en altos rendimientos de proteína sin importar la concentración de proteína empleada en la mezcla de reacción.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un mapa de restricción para el plásmido p200, utilizado para producir pLamBIGF, un plásmido intermedio en la producción de pLBIGFTsc, utilizado para preparar pBKIGF-2, un plásmido intermedio en la preparación de un vector de expresión que codifica IGF-I, en concreto, pBKIGF-2B.

La figura 2 describe la secuencia de nucleótidos del fragmento EcoRI-EcoRI (desde las posiciones 1149 a 1633) de p200 que contiene las secuencias de genes MF alfa I prepro y IGF-I (SEQ. ID Nº 1).

La figura 3 describe la construcción de pLamBIGF a partir de tres fragmentos de plásmidos y una pieza de ADN sintético (SEQ. ID Nº 2 y 3). pLamBIGF es un plásmido intermediario en la producción de pLBIGFTsc, utilizado para preparar pBKIGF-2.

La figura 4 describe la construcción del plásmido intermediario pLBIGFTsc a partir de pLamBIGF.

La figura 5 describe la construcción del plásmido intermedio pRanTsc utilizado en la producción de pBKIGF-2.

La figura 6 describe la construcción de pBKIGF-2 a partir de pLS32Tsc, pLBIGFTsc, pLS33Tscm y pRanTsc.

La figura 7 describe la construcción de pBKIGF-2A, utilizado para preparar pBKIGF-2B, a partir de pLBIGFTsc, pBKIGF-2, y una pieza de ADN sintético (SEQ. ID Nº 4 y 5).

La figura 8 describe la construcción de pLamBRan, utilizado para preparar pBKIGF-2B, a partir de pLS33LamB, pRANTES y una pieza de ADN sintético (SEQ. ID Nº 6 y 7).

La figura 9 describe la construcción de un vector de expresión pBKIGF-2B a partir de pBKIGF-2, pBKIGF-2A, pLamBRan, y una pieza de ADN sintético (SEQ. ID Nº 8 y 9).

La figura 10 es una serie de tres cromatogramas HPLC que muestran la evolución de especies IGF-I (de izquierda a derecha, IGF-I mal plegado, IGF-I correctamente plegado, y IGF-I reducido) durante el replegado. Estos cromatogramas se tomaron a la iniciación del plegado (cromatograma inferior), 1 hora después de iniciarse el plegado (cromatograma del medio), y 3 horas después de iniciarse el plegado (cromatograma superior).

La figura 11 es un diagrama de fase que describe sistemas acuosos de dos fases producidos mediante la adición de sal y polímero a todo el extracto que contiene urea, DTT, IGF-I no nativo, y sólidos asociados a la célula. Los símbolos se utilizan para indicar sistemas de dos fases (círculos abiertos), sistemas de una fase (círculos llenos), sistemas de dos fases con sólidos flotantes (p), y puntos binodales publicados (X). Las curvas se utilizan para mostrar la posición aproximada del binodo (sólido), el límite para la sedimentación sólida (rayado), y el límite de relación de fase que permite una fase inferior que contiene los sólidos (punteado). La región sombreada indica la región óptima para la separación de IGF-I y sólidos asociados a la célula.

La figura 12 muestra el efecto de la concentración de cobre sobre la cinética del replegado de IGF-I. El replegado se realizó a 25ºC con concentraciones de cloruro de cobre de traza (cruz), 0,013 \muM (círculo abierto), 0,052 \muM (círculo lleno), 0,13 \muM (cuadrado abierto), 0,52 \muM (triángulo lleno), y 13 \muM (cuadrado lleno).

Descripción de las realizaciones preferidas A. Definiciones

Tal como se emplea aquí, "polipéptido de interés" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tiene más de aproximadamente 10 amino ácidos. Los polipéptidos pueden ser homólogos a la célula huésped, o preferentemente, pueden ser exógenos, significando que son heterólogos, es decir, extraños a la célula huésped que se utiliza, tales como una proteína humana producida por una célula de ovario de hámster Chino, o un polipéptido de levadura producido mediante una levadura diferente o una célula bacteriana o de mamífero. Preferentemente, se utilizan los polipéptidos de mamífero (polipéptidos que originalmente derivaba de un organismo mamífero), más preferentemente aquellos producidos en células procarióticas, más preferentemente como cuerpos de inclusión en células bacterianas, especialmente a partir del periplasma de la bacteria.

Ejemplos de polipéptidos bacterianos incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina y \beta-lactamasa. Ejemplos de polipéptido de mamíferos incluyen moléculas tales como, por ejemplo, renina, una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana; hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de hormona de crecimiento; hormona paratiroide; hormona estimulante de la tiroides; lipoproteínas; \alpha1-antitripsina; cadena insulina-A; cadena insulina-B; proinsulina; hormona estimulante del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IV, factor tisular, y factor von Willebrands; factores anti-coagulantes tales como Proteína C; factor atrial naturiético; surfactante pulmonar; un activdador de plasminogen, tal como uroquinasa u orina humana o activador de plasminogen de tipo tisular t-PA); bombesin; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor alfa y beta de necrosis tumoral; enquefalinasa; una albúmina del suero tal como albúmina del suero humano; sustancia inhibidora de mulleriana; cadena A relaxina; cadena B relaxina; prorelaxina; péptido asociado de gonadotropina de ratón; una proteína microbiana tal como una beta-lactamasa; Dnasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoideos; un factor neurotrópico tal como un factor neurotrópicco derivado del hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento del nervio tal como NGF-\beta, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento de transformación (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TGF-\beta4, o TGF-\beta5; factor de crecimiento de tipo insulina i y II (IGF-I y IGF-II), des(1-3)-IGF-I (cerebro IGF-I), proteínas de unión de factor de crecimiento de tipo insulina tal como CD-3, CD-4, CD-8, y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón-alfa, -beta y -gamma; factores de estimulación de colonias (CSFs), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleuquina (ILs), por ejemplo IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de superficie de membrana; factor acelerador de descomposición; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción del envoltorio del AIDS; proteínas de transporte; receptores homing; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos antes
mencionados.

Los polipéptidos preferidos de interés son aquellos que se producen fácilmente en células procarióticas con un mínimo de proteólisis y no necesitan se glicosiladas para su utilidad programada. Ejemplos de dichos polipéptidos de mamífero incluyen IGF-I, IGF-II, IGF-I cerebral, hormona de crecimiento, cadenas de relaxina, factor de liberación de la hormona de crecimiento, cadenas de insulina o pro-insulina, urokinasa, inmunotoxinas, NGF, NT-5, y antígenos. En particular, los polipéptidos de mamífero preferidos incluyen IGF-I, IGF-I cerebral, hormona de crecimiento, y una neurotropina tal como NGF, NT-3, NT-4, NT-5 y NT-6, incluyendo NT-5, y el polipéptido de mamífero más preferido es IGF-I.

Como se utiliza aquí "IGF-I" se refiere a factor de crecimiento tipo insulina-I a partir de cualquier especie, incluyendo bovinos, ovinos, porcinos, equinos y preferentemente humanos, en secuencia nativa o en forma variante y producida de manera recombinante. Un procedimiento para producir IGF-I se describe en la EP 128.733, publicada en Diciembre 19, 1984.

Como se utiliza aquí, el término "en una conformación no nativa" describe polipéptidos que asumen una estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria que o es el nativo equivalente. El polipéptido puede estar en una conformación tal que en cualquier punto en el proceso aquí reivindicado, ya sea antes de la etapa de contacto o durante o después del contacto con el agente caotrópico y de especies en fase de formación. El polipéptido en esta conformación no nativa puede ser soluble pero en una forma inactiva o puede ser una proteína de membrana no nativa, o puede ser insoluble y en una conformación biológicamente inactiva con uniones disulfuro mal combinadas o no formadas. Este polipéptido insoluble está preferentemente, pero no necesita estar, contenido en cuerpos refractarios, es decir, puede o no ser visible bajo un microscopio de contraste de fases.

Como se utiliza aquí, el término polipéptido "incorrectamente plegado" se refiere a polipéptidos precipitados o agregados que están contenidos dentro de los cuerpos refractarios. Polipéptidos "no nativos" se obtienen a partir de polipéptidos "incorrectamente plegados" e incluyen material correctamente plegado y mal plegado.

El término "cuerpos de inclusión" o "cuerpos refractarios" se refiere a masas intracelulares densas de polipéptido agregado de interés, que constituyen una porción significativa del total de la proteína celular, incluyendo todos los componentes celulares. En algunos casos, pero no en todos los casos, estos agregados de polipéptidos pueden reconocerse como puntos brillantes visibles dentro del envoltorio de la célula bajo un microscopio de contraste de fase en aumentos de hasta 1000 veces.

Como se utiliza aquí "células" se refiere a cualquier célula; las células a partir de las cuales se recupera el polipéptido de interés puede tratarse con los reactivos de formación de fase y los reactivos de replegado sin importar su estatus. Por ejemplo, la invención engloba células en cultivos celulares (totalidad del caldo en el cual las células no están separadas independientemente del tanque en el que se cultivaron) así como aquellas que se han sometido a homogeneización o centrifugación. La frase "cultivo de células" se refiere no sólo a los cultivos celulares de mamíferos, sino a los cultivos de cualquier célula, incluyendo procariotas y células de levadura.

El término "conformadores" se refiere a polipéptidos que difieren sólo en enlace disulfuro intramolecular. Por ejemplo, IGF-I tiene una longitud de 70 amino ácidos y tiene seis residuos cisteína que forman uniones disulfuro intramoleculares. El conformador IGF-I correcto, activo tiene uniones disulfuro entre residuos de amino ácidos C6-C48, C47-C52, y C18-c61. El otro polipéptido principal es un conformador biológicamente menos activo que tiene uniones disulfuro entre residuos de amino ácidos C6-C47, C48-C52, y C18-C61.

Como se utiliza aquí, el término "cuba de fermentación" se refiere a un tanque u otro aparato en el cual tiene lugar el cultivo del huésped procariotico para producir el polipéptido de interés. EL caldo o medio de fermentación es el medio de cultivo utilizado para las células.

Como se utiliza aquí, "agente caotrópico" se refiere a un compuesto que, en una concentración adecuada en solución acuosa, es capaz de cambiar la configuración o configuración espacial de polipéptidos a través de alteraciones en la superficie del mismo para volver soluble al polipéptido en el medio acuoso. Las alteraciones pueden producirse mediante el cambio, por ejemplo, del estado de hidratación, el ambiente solvente, o la interacción solvente-superficie. La concentración de agente caotrópico afectará directamente su fuerza y su efectividad. Una solución caotrópica fuertemente desnaturalizante contiene un agente caotrópico en grandes concentraciones que, en solución, desplegarán de forma efectiva un polipéptido presente en la solución. El desplegado será relativamente caro, pero reversible. Una solución caotrópica moderadamente desnaturalizante contiene un agente caotrópico que, en concentraciones suficientes en solución, permite el plegado parcial de un polipéptido a partir de cualquier conformación contorsionada que el polipéptido haya asumido a través de intermedios solubles en la solución, en la conformación espacial en la cual el mismo se encuentra cuando opera en su forma activa bajo condiciones fisiológicas endógenas u homólogas. Ejemplos de agentes caotrópicos incluyen hidrocloruro de guanidina, urea, e hidróxidos tales como hidróxido de sodio o de potasio. Los agentes caotrópicos incluyen una combinación de estos reactivos, tales como una mezcla de base con urea o hidrocloruro de guanidina.

Como se emplea aquí, "agente reductor" se refiere a un compuesto que, en una concentración adecuada en solución acuosa, mantiene grupos sulfhidrilos de forma tal que las uniones disulfuro intra- o intermoleculares son rotas químicamente. Ejemplos representativos de agentes reductores adecuados incluyen ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), beta-mercaptoetanol (BME), cisteína, cisteamina, tioglicolate, glutationa, y borohidruro de sodio.

Como se emplea aquí, "especies de formación de fase" o "reactivos de formación de fase" se refiere a moléculas que actuarán para formar fases múltiples cuando se añaden a una solución acuosa. Una solución "acuosa" es una en la cual la mayoría de la solución (por ejemplo, mayor de aproximadamente 50%) está constituida por agua. De este modo, por ejemplo, 40% de etanol, que contiene aproximadamente 60% de agua, es un solvente adecuado para una especie de formación de fase. Ejemplos de especies de formación de fase incluyen combinaciones polímero-polímero, combinaciones solvente-sal, combinaciones polímero-sal, y combinaciones polímero-solvente. Aquí la más preferida es la combinación polímero-sal.

Como se emplea aquí, "sólidos de biomasa y ácidos nucléicos" se refiere a sólidos en partículas (no disueltos) que resultan (o se originan) a partir de las células o cultivo de células en los que se produce el polipéptido, así como ácidos nucléicos (ADN, ARN). Esto incluirá todas las fuentes distintas de la adición de componente, solubilización y extracción de líquido. Dichos sólidos incluyen, por ejemplo, restos celulares, componentes del medio, membranas y vesículas celulares, y proteínas endógenas de la célula que no son proteínas solubles u otros componentes insolubles de la célula. Al practicar el procedimiento de esta invención, los sólidos de biomasa y ácidos nucléicos se encuentran en una fase opuesta del polipéptido.

Como se emplea aquí, el término "múltiple" aplicado a fases indica más de una fase, preferentemente dos a cuatro fases, y más preferentemente a dos fases. Una fase "enriquecida en el polipéptido y reducida a sólidos de biomasa" se refiere a una fase en la cual el polipéptido tiene un coeficiente de partición mayor de uno y los sólidos de biomasa tienen un coeficiente de partición menos de uno, donde el coeficiente de partición está referido a la fase de interés. Por ejemplo, si la fase inferior está enriquecida en producto, entonces el coeficiente de partición es la concentración en la fase inferior dividida por la concentración en la fase superior.

Como se emplea aquí, "osmolito" se refiere a un agente que proporciona osmolalidad a la solución tampón o afecta hidratación o tensión superficial. Los ejemplos incluyen polioles y azúcares tales como glicerol, eritritol, arabitol, sorbitol, manitol, xilitol, manisidomanitol, glicosil glicerol, glucosa, fructosa, sacarosa, trealosa, y isofluorosido; polímeros tales como dextranos, levanos, y polietilen glicol; y algunos amino ácidos y derivados de los mismos tales como glicina, alanina, \beta-alanina, prolina, taurina, betaína, octopina, glutamato, sarcosina, ácido y-aminobutirico, y N-óxido trimetilamina (TMAO), como se describe con más detalle en Yancey et al., Science, 217: 1214-1222 (1982) y Schein, Bio/Technology, 8: 308-315 (1990).

Como se emplea aquí, "tampón" se refiere a una solución tamponada que resiste cambios en el pH mediante la acción de sus componentes conjugados ácido-base.

Como se emplea aquí, "solvente" se refiere a alcoholes y solventes apróticos polares. Los alcoholes se indican en el sentido de la terminología comúnmente utilizada para alcohol, preferentemente alcoholes con 1 a 10 átomos de carbono, más preferentemente metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, o t-butanol, así como glicerol, propilen glicol, etilen glicol, polipropilen glicol, y polietilen glicol, y más preferentemente etanol o iso-propanol. Dichos alcoholes son solventes que, cuando se añaden a una solución acuosa, incrementan la hidrofobicidad de la solución mediante la disminución de la polaridad de la solución. Los solventes polares apróticos son dichas moléculas como dimetil sulfóxido (DMSO), dimetil formamida (DMF), N-metilpirrolidina (NMP), tetrahidrofuran (THF), dioxano, acetonitrilo, etc., que pueden utilizarse en lugar de o añadidos al alcohol.

Como se emplea aquí, la frase "alcalino térreo, alcalino metálico o sal de amonio" se refiere a una sal que tiene un catión de los elementos alcalino térreos o alcalino metálicos o un catión amonio y que tiene un anión inorgánico u orgánico (base hidrocarburo). Ejemplos de dichas sales incluyen cloruro de sodio, cloruro de amonio, citrato de sodio, citrato de potasio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, fosfato de sodio, fosfato de calcio, fosfato de amonio, fosfato de amonio, fosfato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de amonio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio, sulfato de calcio, etc. Las sales aquí preferidas son cloruros o sulfatos. Aquí la sal más preferida es cloruro de sodio.

Como se emplea aquí, la frase "sal de cobre o de magnesio" se refiere a una sal de cobre o de magnesio con cualquier anión, incluyendo aniones orgánicos, que son responsables de promover la oxidación de residuos de cisteína. Los aniones adecuados incluyen sulfatos y cloruros, siendo particularmente preferido el cloruro de cobre. El cobre o manganeso pueden añadirse de forma exógena o ser residuales a partir de la fermentación o de otra forma ya presente en la solución que contiene el polipéptido de interés.

B. Modos de realizar la invención

La invención aquí se refiere a un procedimiento para aumentar el rendimiento de repliegue del polipéptido a partir de huéspedes celulares que utilizan una cantidad mínima de sal de cobre o manganeso como catalizador en un tampón. Este tampón está en un pH de 7 a 12 aproximadamente, dependiendo principalmente del tipo de polipéptido y agente reductor, preferiblemente de 8 a 11 aproximadamente, más preferiblemente un pH de 8,5 a 11, y más preferiblemente de 8,5 a 10,5.

Un ingrediente clave del tampón es un solvente aprótico alcohólico o polar con una concentración del 5 al 40% aproximadamente (v/v), preferiblemente del 10 al 30% (volumen/volumen) de la solución, dependiendo, por ejemplo, del tipo de polipéptido y solvente, y la concentración de agente caotrópico. Es más preferiblemente en una concentración del 20% aproximadamente (v/v).

Un segundo ingrediente clave en este tampón es un alcalino térreo, metal álcali, o sal de amonio, que está presente en una concentración de 0,2 a 3 M aproximadamente, preferiblemente de 0,2 a 2 M, dependiendo principalmente de de la concentración caotrópica, la concentración del solvente, y el tipo de alcalino térreo, metal álcali o sal de amonio o polipéptido utilizado. Por ejemplo, si el catión es sodio, potasio, o amonio, la concentración es de 0,5 a 3 M aproximadamente, pero si el catión es magnesio, la concentración es de 0,2 a 1 M aproximada-
mente.

Un tercer ingrediente clave del tampón en una cantidad efectiva de un agente caotrópico. La cantidad de este caotropo dependerá principalmente de la concentración de alcalino térreo, metal álcali, o sal de amonio, la concentración del solvente, el tipo específico de alcalino térreo, metal álcali, o sal de amonio utilizada, el tipo específico de agente caotrópico utilizado, y el tipo de polipéptido, así como el pH del tampón, pero en general estará comprendida entre 0,1 y 9 M aproximadamente, preferiblemente entre 0,5 y 6 M aproximadamente, y más preferiblemente entre 1,5 y 4 M. Como caotropos específicos, se utiliza preferiblemente de 0,1 a 2 M aproximadamente de hidrocloruro de guanidina, y preferiblemente de 1 a 3 M, más preferiblemente de 1 a 2,5 M aproximadamente, y más preferiblemente de 2 M aproximadamente, de urea.

Un cuarto ingrediente clave del tampón es una cantidad efectiva de una sal de metal de transición seleccionada entre sales de cobre y manganeso, de manera que se produzca la oxidación y el repliegue resultante. La cantidad de sal de cobre o manganeso depende principalmente del tipo de metal de transición y polipéptido utilizados y el nivel de oxígeno presente. Cuanto menor sea el índice de adición de oxígeno o del nivel de oxígeno, mayor será la cantidad de sal de cobre o manganeso que se puede utilizar. La concentración de sal de cobre o manganeso es típicamente de 0,01 a 15 \muM aproximadamente, preferiblemente de 0,01 a 10 \muM aproximadamente, más preferiblemente de 0,01 a 5 \muM, e incluso más preferiblemente de 0,01 a 0,5 \muM. Los rangos preferidos anteriores son particularmente preferidos para IGF-I. Si se aumenta la concentración más allá de 15 \muM aproximadamente, de una manera inesperada el rendimiento del polipéptido plegado correctamente disminuye de una manera dramática. Más preferiblemente, la concentración de una sal de cobre o manganeso es de 0,5 \muM aproximadamente. La sal del metal de transición puede estar ya presente en el tampón si la adición de sal de metal de transición exógena, por ejemplo, si es residual a partir de la fermentación, o se puede añadir al tampón, o ambos.

Células huésped adecuadas para expresar el ADN que codifica el polipéptido deseado son el procariote, levadura, o células eucariote más altas. Los procariotes adecuados para este propósito incluyen bacterias tales como archaebacteria y eubacteria. Bacterias preferidas son eubacteria, tal como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella; Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989); Pseudomonas tales como P. aeruginosa, Streptomyces; Azotobacter; Rhizobia; Vitreoscilla; y Paracoccus. Huéspedes E. coli adecuados incluyen E. coli W3110 (ATCC 27.325), E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, y E. coli X1776 (ATCC 31.537). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos.

También se pueden utilizar células mutantes de cualquiera de las bacterias citadas anteriormente. Por supuesto, es necesario seleccionar las bacterias adecuadas teniendo en consideración la capacidad de replicarse del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, especies de E. coli, Serratia, o Salmonella se pueden usar de manera adecuada como el huésped cuando se usan plásmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYA177, o pKN410 para suministrar el replicón.

La variedad E. coli W3110 es un huésped o huésped madre preferido porque es una variedad de huésped común para fermentaciones de producto de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped segregará cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la variedad W3110 puede modificarse para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas, con ejemplos de estos huéspedes que incluyen E. coli W3110 variedad 27C7. El genotipo completo de 27C7 es tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ompT\Delta degP41kan^{r}. La variedad 27C7 se depositó el 30 de Octubre de 1991 in la "American TIPO Culture Collection" como ATCC No. 55.244. Alternativamente, se puede utilizar la variedad de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en la patente U.S. No. 4.946.783, publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico.

Por ejemplo, la variedad W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas en el huésped, con ejemplos de estos huéspedes incluyendo E. coli W3110 variedad 1A2, que tiene el genotipo completo tonA\Delta; E. coli W3110 variedad 9E4, que tiene el genotipo completo tonA\Delta ptr3; E. coli W3110 variedad 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ompT\Delta degP41kan^{r}; E. coli W3110 variedad 37D6, que tiene el genotipo completo tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ompT\Delta degP41kan^{r} rbs7\Delta ilvG; E. coli W3110 variedad 40B4, que es una variedad 37D6 con una mutación de borrado degP resistente no canamicina; y una variedad E. coli que tiene la proteasa periplásmica mutante descrita en la patente U.S. No. 4.946.783 publicada el 7 de agosto de 1990.

Además de los procariotes, microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero común, es el más comúnmente usado entre los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo, una serie de otros géneros, especies, y variedades están comúnmente disponibles y son útiles aquí, tales como Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981); EP 139,383 publicada el 2 de Mayo de 1985]; huéspedes Kluyveromyces (U.S. 4.943.529; Fleer et al., supra) tal como, por ejemplo, K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)], K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., supra), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia [EP 402,226]; Pichia pastoris [EP 183 070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988)]; Candida; Trichoderma reesia [EP 244 234]; Neurospora crassa [Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979)]; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis [EP 394 538 publicada el 31 de octubre de 1990]; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium [WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991], y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)] y A. niger [Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985)].

Las células huéspedes adecuadas apropiadas para la expresión del ADN que codifica el polipéptido deseado también pueden derivarse a partir de organismos multicelulares. Dichas células huéspedes son capaces de actividades complejas de procesamiento y glicosilación. En principio, cualquier cultivo de células eucariotas superiores es adecuado, ya sea un cultivo a partir de vertebrado o de invertebrado. Ejemplos de células de invertebrado incluyen células de plantas y de insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y correspondientes células huéspedes de insectos de huéspedes como Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Ver, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology, 6: 47-55 (1988); Miller et al., in Genetic Engineering, Setlow, J.K. et al., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda et al., Nature, 315: 592-594 (1985). Una variedad de cepas víricas para la transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus pueden utilizarse como el virus mencionado según la presente invención, en particular por transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Cultivos de células de plantas de algodón, maíz, patata, soya, petunia, tomate y tabaco pueden utilizarse como huéspedes. Típicamente, las células de plantas se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que se ha manipulado previamente para contener el ADN que codifica el polipéptido deseado. Durante la incubación del cultivo de células de planta con A. tumefaciens, el ADN que codifica el polipéptido deseado se transfiere a la célula de planta huésped de forma tal que es transfectado, y que, bajo condiciones apropiadas, expresará el ADN que codifica el polipéptido deseado. Además, las secuencias reguladoras y de señal compatibles con células de plantas están disponibles, tal como la secuencia del promotor de nopalina sintasa y señal de poliadenilación. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 (1982). Además, los segmentos de ADN aislados de la región por encima del gen T-DNA 780 son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de genes expresables en plantas en ADN recombinante que contiene tejido celular. EP 321.196 publicada Junio 21, 1989.

Ejemplos de líneas celulares de mamíferos útiles son línea CV1 de riñón de mono transformado por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón humano embrionario (293 o 293 células subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 [1977]); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 [1980]); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcionoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 [1982]); células MRC 5; células FS4; y una cepa de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transfectan y preferentemente se transforman con la expresión o vectores de clonado antes descritos de esta invención y se cultivan en medio nutricional convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformadores, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección se refiere a la suscripción de un vector de expresión por una célula huésped ya sea que de hecho se hayan expresado o no algunas secuencias de codificación. Se conocen numerosos procedimientos de transfección por parte del operario con habilidad ordinaria, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. La transfección exitosa se reconoce generalmente cuando se produce cualquier indicación de la operación de este vector dentro de la célula huésped.

La transformación significa introducir ADN en un organismo de forma tal que el ADN es replicable, ya sea como un elemento extra cromosómico o mediante un integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en 1.82 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], o la electroporación se utiliza generalmente para procariotas u otras células que contienen barreras de pared celular substanciales. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, como se describe en Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) y WO 89/05859 publicada en Junio 29, 1989. Además, las plantas pueden transformarse utilizando tratamiento de ultrasonido como se describe en WO 91/00358 publicado en Enero 10, 1991.

Para células de mamífero sin dichas paredes celulares, se prefiere el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones del sistema de células huésped de mamíferos se han descrito por Axel en U.S. 4.399.216 publicada en Agosto 16, 1983. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo típicamente según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, pueden utilizarse otros procedimientos para introducir ADN en las células tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina, etc. Para diversas técnicas para transformar células de mamíferos, ver Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology (1990) Vol. 185, pp. 527-537, y Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).

Si se utilizan células procariotas para producir el polipéptido de interés según el procedimiento de esta invención, se cultivan en medio adecuado en el cual el promotor puede inducirse constitutivamente o artificialmente como se describe generalmente, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989). Se dan a continuación ejemplos de medios adecuados en la sección de ejemplos.

También puede incluirse cualquier suplemento necesario además fuentes de carbón, nitrógeno y fosfato inorgánico en concentraciones apropiadas introducidas solas o como una mezcla con otro suplemento o medio tal como una fuente compleja de nitrógeno. El pH del medio puede ser cualquier pH desde aproximadamente 5-9, dependiendo principalmente del organismo huésped.

Si se utilizan células huéspedes de mamíferos para producir el polipéptido de esta invención, éstas pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes y Sato, Anal. Biochem., 102: 255 (1980), U.S. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; o 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; U.S. Pat. Re. 30.985; o U.S. 5.122.469, pueden utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios pueden suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como droga Gentamycin^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también puede incluirse a concentraciones apropiadas que serán conocidas para aquellos entendidos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son aquellas previamente utilizadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y que será evidente para el operario con habilidad ordinaria.

En general, principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos in vitro de células de mamíferos pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1991).

El proceso anterior puede emplearse tanto si el polipéptido es intracelular o en el espacio periplásmico. Las condiciones preferidas dadas aquí para aislar un polipéptido se dirigen principalmente a cuerpos de inclusión ubicados en el espacio periplásmico.

Con frecuencia se prefiere purificar el polipéptido de interés a partir de proteínas celulares recombinantes o polipéptidos para obtener preparaciones que son substancialmente homogéneos como el polipéptido de interés antes del replegado. En una realización, como primera etapa, el medio de cultivo o lisato se centrifuga para retirar residuos celulares en partículas. La membrana y las fracciones de proteínas solubles se pueden separar a continuación si es necesario. El polipéptido se puede purificar a continuación a partir de la fracción de proteína soluble y a partir de la fracción de membrana del lisato del cultivo, dependiendo de si el polipéptido está unido a la membrana, es soluble, o está presente en una forma agregada. El polipéptido a continuación se solubiliza y a continuación se repliega usando un tampón apropiado. Los detalles para este primer procedimiento de aislamiento se describen a continuación.

El polipéptido insoluble no nativo se aísla de las células huésped procarióticas en un tampón de aislamiento adecuado mediante cualquier técnica apropiada, por ejemplo, una que implica la exposición de las células a un tampón de resistencia iónica adecuada para solubilizar la mayoría de proteínas huésped, pero en el que el polipéptido agregado es substancialmente insoluble, rompiendo las células para liberar los cuerpos de inclusión y haciéndolos disponibles para su recuperación mediante, por ejemplo, centrifugación. Esta técnica es bien conocida, y se describe, por ejemplo, en la patente US 4.511.503.

Brevemente, las células se suspenden en el tampón (típicamente en un pH de 5 a 9, preferiblemente de 6 a 8, usando una resistencia iónica de 0,01 a 2 M aproximadamente, preferiblemente de 0,1 a 0,2 M). Cualquier sal adecuada, incluyendo cloruro de sodio, es útil para mantener un valor de resistencia iónica suficiente. Las células, mientras están suspendidas en este tampón, se rompen mediante lisis usando técnicas comúnmente utilizadas tales como, por ejemplo, procedimientos mecánicos, por ejemplo una prensa Manton-Gaulin, una prensa francesa, o un oscilador sónico, o mediante procedimientos químicos o enzimáticos.

Ejemplos de procedimientos químicos o enzimáticos de rotura celular incluyen esferoplastos, que permiten el uso de lisozima para lisar la pared bacteriana [Neu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 17: 215 (1964)], y shock osmótico, que implica el tratamiento de células viables con una solución de alta tonicidad y con lavado en agua fría de baja tonicidad para liberar los polipéptidos [Neu et al., J. Biol. Chem., 240: 3685-3692 (1965)]. Un tercer procedimiento, descrito en la patente US 4.680.262 publicada el 14 de Julio de 1987, implica contactor las células bacterianas transformadas con una cantidad efectiva de un alcanol inferior que tiene de 2 a 4 átomos de carbono durante un periodo de tiempo y a una temperatura suficiente para matar y lisar las células.

Después de romper las células, la suspensión se centrifuga típicamente para granular los cuerpos de inclusión. En una realización, esta etapa se realiza en 500 a 15.000 x g aproximadamente, preferiblemente 12.000 x g aproximadamente, en una centrífuga estándar durante un periodo de tiempo suficiente que depende del volumen y el diseño de la centrífuga, usualmente de 10 minutos a 0,5 horas aproximadamente. El gránulo resultante contiene substancialmente toda la fracción de polipéptido insoluble, pero si el proceso de rotura celular no está completo, también puede contener células intactas o fragmentos de células rotas. La finalización de la rotura celular se puede ensayar mediante la resuspensión de los gránulos en una pequeña cantidad de la misma solución tampón y el examen de la suspensión con un microscopio de contraste de fase. La presencia de fragmentos de células rotas o células completas indica que es necesaria una rotura adicional para retirar los fragmentos o células y los polipéptidos no refractantes asociados. Después de tal rotura adicional, si se requiere, la suspensión se centrifuga nuevamente y se recupera el gránulo, se resuspende, y se analiza. El proceso se repite hasta que el examen visual revela la ausencia de fragmentos de células rotas en el material de gránulo o hasta que el tratamiento adicional fracasa en reducir el tamaño del gránulo resultante.

En una realización alternativa, el polipéptido de interés, preferentemente exógeno, se aísla mediante solubilización en un tampón adecuado. Este procedimiento puede ser solubilización in situ implicando una adición directa de reactivos a la cuba de fermentación después de que el polipéptido se ha producido de forma recombinante, evitando así etapas extra de recolección, homogeneización y centrifugación para obtener el polipéptido. Las partículas remanentes pueden extraerse mediante centrifugación o filtración, o combinación de las mismas. Alternativamente, y más preferentemente, puede usarse un sistema de aislamiento/extracción de fase múltiple para purificar polipéptido a partir de las partículas remanentes.

En el sistema acuoso de aislamiento de fase múltiple, uno o más desnaturalizantes (agentes caotrópicos), tales como urea, hidrocloruro de guanidina, y/o una base, y un agente reductor, tal como ditiotreitol o cisteína, se añaden al medio que contiene polipéptido en un pH ácido y luego se añaden al caldo especies formadoras de fase. Una vez que este segundo grupo de reactivos se añade al caldo, se forman múltiples fases en las cuales una fase está enriquecida en el polipéptido y reducida en sólidos de biomasa y ácidos nucléicos. Preferentemente, el sistema tiene de dos a cuatro fases, y más preferentemente dos fases, siendo una enriquecida en polipéptido y la otra siendo enriquecida en sólidos de biomasa y ácidos nucléicos. Preferentemente, el polipéptido deseado se parte en la fase superior de forma tal que la fase superior se enriquece en el polipéptido y se reduce en los sólidos de biomasa y ácidos nucléicos.

Por lo tanto, después de que la fermentación es completa, el cultivo de células se contacta con uno o más agentes caotrópicos, un agente reductor original, y reactivos formadores de fase de forma tal que se forman múltiples fases, una fase de las cuales está enriquecida en el polipéptido de interés. Se prefiere añadir el caotrópico y el agente reductor primero para extraer el polipéptido de la célula y mantener su solubilidad en el caldo antes de que se añadan los reactivos formadores de fase. También, mientras el polipéptido de interés puede extraerse a partir de (y enriquecerse en) cualquier fase, preferentemente se recupera a partir de la fase más superior.

Más preferentemente, el agente caotrópico y agente reductor opcional se añaden directamente al caldo de fermentación en la cuba de fermentación antes del aislamiento del polipéptido de forma tal que los reactivos permeabilizan las células y el polipéptido se solubiliza y difunde al medio circundante.

Ejemplos de agentes reductores adecuados incluyen ditiotreitol (DTT), \beta-mercaptoetanol (BME), cisteína, tioglicolato, y borohidruro de sodio. La cantidad de agente reductor que debe estar presente en el tampón depende principalmente del tipo de agente reductor y del agente caotrópico, el tipo y pH del tampón empleado, y el tipo y concentración del polipéptido en el tampón. Una cantidad efectiva de agente reductor es aquella que es suficiente para eliminar la agregación intermolecular mediada por disulfuro. Por ejemplo, con 0,5-6 mg/mL IGF-I en una solución tamponada a pH 7,5 a 10,5 que contiene 1 a 4 M de urea, la concentración de DTT es de aproximadamente 1 a 20 mM, y la concentración de cisteína es de aproximadamente 10-50 mM. El agente reductor preferido es DTT en aproximadamente 2 a 10 mM o cisteína en aproximadamente 30 a 50 mM.

Los agentes caotrópicos adecuados para practicar esta invención incluyen, por ejemplo, urea y sales de guanidina o tiocianato, más preferentemente urea, hidrocloruro de guanidina, o tiocianato de sodio. La cantidad de agente caotrópico necesaria para estar presente en el tampón depende, por ejemplo, del tipo de agente caotrópico y del polipéptido presente. La cantidad de agente caotrópico a añadir al caldo de fermentación será suficientemente alto como para extraer el polipéptido de la célula y mantener su solubilidad en el caldo. Si el polipéptido debe extraerse de la fase superior, la cantidad de agente caotrópico debe ser suficientemente baja de forma tal que después de la adición de las especies formadoras de fase, la densidad no se incremente a un punto donde los sólidos se elevan hacia la parte superior en lugar de asentarse en el fondo. Generalmente la concentración de agente caotrópico es aproximadamente 0,1 a 9 M, preferentemente aproximadamente 0,5-9 M, más preferentemente aproximadamente 0,5 a 6 M, y más preferentemente aproximadamente 0,5 a 3 M. También, preferentemente el agente caotrópico se añade al medio de cultivo antes de que se añadan los agentes formadores de fase. El agente caotrópico preferido aquí utilizado es urea en aproximadamente 1,5 a 2,5 M, más preferentemente en aproximadamente 2 M, o hidrocloruro de guanidina en aproximadamente 0,5 a 3 M. Más preferentemente el agente caotrópico es urea.

La concentración del polipéptido en la solución acuosa a la cual se añaden el caotrópico y el agente reductor debe ser tal que el polipéptido será recuperado con el máximo rendimiento. La cantidad exacta a emplear dependerá, por ejemplo, del tipo de polipéptido y de las concentraciones y los tipos de otros ingredientes en la solución acuosa, en particular del agente reductor, el agente caotrópico, las especies formadoras de fase, y el pH. Para polipéptidos en general, la concentración preferida de polipéptido es aproximadamente 0,1 a 15 mg/mL. La concentración preferida de IGF-I (que resulta en el rendimiento máximo de IGF-I desnaturalizado o no nativo) está en el rango de 0,5-6 mg por mL, más preferentemente 1,5-5 mg/mL.

Los tipos de especies formadoras de fase a emplear aquí dependen de varios factores, que incluyen el tipo de polipéptido y los ingredientes en el caldo de fermentación de que se trate. Las especies deben seleccionarse de forma tal que los polipéptidos no precipitan y una fase es más hidrofóbica que la otra fase de forma tal que el polipéptido se ubicará en la fase más hidrofóbica y los sólidos de biomasa y los ácidos nucléicos se asentaran en la fase menos hidrofóbica.

Las especies formadoras de fase pueden ser una combinación de agentes, que incluyen combinaciones de polímeros (polímero-polímero), combinaciones polímero-sal, combinaciones solvente-sal, y polímero-solvente. Los polímeros adecuados son tanto polímeros altamente hidrofílicos como polímeros menos hidrofílicos, por ejemplo, cualquier polímero formador de fase que sea conocido en la técnica. Ejemplos incluyen polietilen glicol o derivados del mismo, incluyendo varios pesos moleculares de PEG tales como PEG 4000, PEG 6000, y PEG 8000, derivados de PEG descritos, por ejemplo en Grunfeld et al., supra, polivinilpirrolidona (PVP), en un rango de peso molecular preferido de aproximadamente 36.000 a 360.000, almidones tales como dextrano (por ejemplo, dextrano 70 y 500), dextrinas, y maltodextrinas (preferentemente de peso molecular entre aproximadamente 600 y 5.000), sacarosa, y polímero Ficoll-400™ (un copolímero de sacarosa y epiclorohidrina). El polímero preferido aquí es polietilen glicol, polipropilen glicol, polivinilpirrolidona, o un polisacárido tal como un dextrano. El polímero más preferido en este caso es PEG de diferentes pesos moleculares o una combinación de PEG-polipropilenglicol o copolímero.

Ejemplos de solventes orgánicos adecuados incluyen etilen glicol, glicerol, dimetil sulfóxido, polivinilalcohol, dimetilformamida, dioxano, y alcoholes tales como metanol, etanol, y 2-propanol. Dichos solventes son tales que, cuando se añaden a la solución acuosa, incrementan la hidrofobicidad de la solución.

Las sales pueden ser inorgánicas u orgánicas y preferentemente no actúan para precipitar el polipéptido. Las sales que contienen elementos de transición no son preferidas ya que tienden a precipitar el polipéptido. Se seleccionan aniones que tienen el potencial para formar sistemas acuosos de fase múltiple. Los ejemplos incluyen sulfato de amonio, fosfato dibásico de sodio, sulfato de sodio, fosfato de amonio, citrato de potasio, fosfato de magnesio, fosfato de sodio, fosfato de calcio, fosfato de potasio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio, sulfato de calcio, citrato de sodio, sulfato de manganeso, fosfato de manganeso, etc. Los tipos de sales que son útiles en la formación de sistemas acuosos bifase se evalúan más en detalle en Zaslavskii et al., J. Chrom., supra. Las sales aquí preferidas son sulfatos, fosfatos o citratos y son metales alcalinos o alcalino térreos. Más preferidos son los sulfatos y los citratos, y más preferidos son los sulfatos debido a que existen menos limitaciones de pH con los sulfatos. Las sales aquí más preferidas son sulfato de sodio y citrato de sodio.

Las cantidades de especies formadoras de fase a añadir al polipéptido de interés para obtener un sistema de fase múltiples satisfactorio son aquellas conocidas en la técnica. La cantidad de especies formadoras de fase añadidas al polipéptido dependerá de factores tales como, por ejemplo, la cantidad de agente caotrópico y agente reductor, si los hay, ya presentes en el caldo de fermentación, la naturaleza del medio de cultivo celular, el tipo de células usadas en la fermentación, el tipo de polipéptido que se trata, si el polipéptido se recuperará a partir de la fase inferior o superior, y el tipo o tipos de especies formadoras de fase que se añaden. La concentración general del polímero utilizado es del 5% (w/w) aproximadamente hasta el límite de solubilidad para el polímero y la concentración de sal utilizada es del 3% (w/w) aproximadamente hasta el límite de solubilidad para la sal, dependiendo del tamaño de la relación entre la fase y el volumen necesaria. La relación entre la fase y el volumen ha de ser suficiente para acomodar los sólidos de biomasa. Los tipos y las cantidades de las especies formadoras de fase que son efectivas se pueden determinar mediante diagramas de fase y mediante la evaluación del resultado final, es decir, el grado de pureza y el rendimiento de polipéptido de interés. Si las especies formadoras de fase son una combinación de polímero y sal, preferiblemente la concentración de sal añadida es del 4 al 15% (w/w) aproximadamente y la concentración de polímero es del 5 al 18% (w/w) aproximadamente, de manera que el polipéptido deseado estará en una fase opuesta de aquella en la que los sólidos de biomasa y los ácidos nucleicos están presentes.

Si el sistema deseado es uno donde el polipéptido está distribuido en la fase más alta y los sólidos de biomasa y los ácidos nucleicos están en la fase más baja, entonces hay una ventana de concentraciones de especies formadoras de fase. Cuando se añaden cantidades mayores de agente caotrópico para mantener la solubilización, mayor es la cantidad de las especies formadoras de fase requeridas. Sin embargo, una alta concentración de todos estos reagentes aumentará la densidad de la solución. Una alta densidad provocará que los sólidos de biomasa se depositen menos fácilmente. Una densidad demasiado alta provocará que los sólidos de biomasa floten sobre la superficie. Así, las concentraciones de agente caotrópico y especies formadoras de fase han de ser suficientemente altas para mantener un polipéptido completamente solubilizado, pero lo suficientemente bajas para permitir que los sólidos de biomasa y los ácidos nucleicos sedimenten en la fase opuesta (inferior).

Si el polipéptido se ha de recuperar en la fase superior, típicamente la concentración de sal será del 4 al 7% (w/w) aproximadamente y la concentración de polímero será del 12 al 18% (w/w) aproximadamente, dependiendo, por ejemplo, del tipo de sal, polímero, y polipéptido. Si se añade un solvente orgánico como una especie formadora de fase, tal como etanol, se añade preferiblemente en una cantidad del 10 al 30% (volumen/volumen) aproximadamente de la solución, dependiendo, por ejemplo, del tipo de polipéptido y alcohol y si está presente cualquier otra especie formadora de fase, preferiblemente en una concentración del 20% (v/v) aproximadamente.

Las condiciones exactas para contactar el cultivo celular con los diferentes reagentes dependerá, por ejemplo, del pH del tampón, los tipos de reagentes formadores de fase, y los tipos y concentraciones de polipéptido y agentes caotrópicos y reductores. La temperatura de reacción es generalmente de 20 a 40ºC aproximadamente, más preferiblemente temperatura ambiente. La etapa de contacto se realizará generalmente durante por lo menos unos 30 minutos, preferiblemente de 30 minutos a 12 horas aproximadamente dependiendo de si se producirán reacciones laterales, más preferiblemente de 30 minutos a 8 horas aproximadamente, y más preferiblemente de 30 minutos a 1,5 horas aproximadamente.

Si el polipéptido se despliega, el grado de desplegado se determina de una manera adecuada mediante cromatografía del polipéptido no nativo, incluyendo cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía de intercambio de iones. Un área de pico en aumento para el material no nativo indica cuánto polipéptido no nativo está presente.

Una vez se establece el sistema de múltiples fases, una fase se enriquecerá en el polipéptido y se reducirá en las partículas rotas y células que comprenden los sólidos de biomasa y ácidos nucleicos. En un sistema de dos fases, preferiblemente la fase más alta está enriquecida en el polipéptido, mientras que en la fase más baja se enriquece en las partículas rotas y células. El polipéptido se puede recuperar fácilmente mediante separación de las fases. Esta etapa de recuperación se puede realizar mediante la decantación de la fase superior, mediante el drenaje de la fase inferior, o mediante centrifugación. El polipéptido se puede aislar a continuación desde la fase en la que está contenida cambiando el pH de la fase para precipitar el polipéptido o añadiendo un solvente adecuado, con lo cual el polipéptido precipitado se recupera de una manera adecuada mediante centrifugación o filtración o como un fango. Alternativamente, el polipéptido se puede recuperar a partir de la fase que contiene el polímero mediante reextracción mediante la adición de un polímero adecuado, sal, o solvente. En el caso de IGF-I, el polipéptido se recupera a partir de la fase de polímero aislada disminuyendo el pH de manera que el IGF-I se precipitará, resultando en un rendimiento de IGF-I de como máximo o más del 97% aproximadamente.

Una vez obtenido a partir de la fase líquida del sistema de múltiples fases, o en una etapa posterior de purificación, el polipéptido se repliega de manera adecuada en una conformación activa usando la invención aquí descrita.

Si el polipéptido no está listo en forma soluble antes de que se repliegue, se puede solubilizar mediante incubación en tampón alcalino que contenga un agente caotrópico y agente reductor en las cantidades necesarias para solubilizar substancialmente el polipéptido. Esta incubación se realiza bajo condiciones de concentración de polipéptido, tiempo de incubación, y temperatura de incubación que permitirán que la solubilización del polipéptido se produzca en el tampón alcalino.

La medición del grado de solubilización del polipéptido en el tampón se realiza de manera adecuada mediante la determinación de la turbidez, mediante el análisis del fraccionamiento del polipéptido entre el sobrenadante y el gránulo después de su centrifugación en geles SDS reducidos, mediante ensayo de proteínas (por ejemplo, el equipo de ensayo de proteínas Bio-Rad), o mediante HPLC.

El rango de pH del tampón alcalino para la solubilización típicamente es por lo menos de 7,5, siendo el rango preferido de 8 a 11 aproximadamente. Ejemplos de tampones que proporcionarán un pH dentro de este último rango incluyen glicina, CAPSO (3-[Ciclohexilamino]-2-hidroxi-1-ácido propanosulfónico), AMP (2-Amino-2-metil-1-propanol), CAPS (3-[Ciclohexilamino]-1-ácido propanosulfónico), CHES (2-[N-Ciclohexilamino] ácido etanosulfónico), y TRIS HCl hidrocloruro (Tris[hidroximetil] aminometano). El tampón preferido aquí es glicina o CAPSO, preferiblemente con una concentración de 20 mM aproximadamente, con un pH de 8,5 a 11 aproximadamente, preferiblemente de 10 a 11 aproximadamente.

La concentración del polipéptido en la solución tamponada para la solubilización ha de ser tal que el polipéptido estará substancialmente solubilizado o parcial o completamente reducido y desnaturalizado. Alternativamente, el polipéptido puede ser inicialmente insoluble. La cantidad exacta a utilizar dependerá, por ejemplo, de las concentraciones y tipos de otros ingredientes en la solución tamponada, particularmente el tipo de polipéptido utilizado, el tipo y cantidad de agente reductor, el tipo y cantidad de agente caotrópico, y el pH del tampón. Por ejemplo, la concentración de IGF-I se puede aumentar por lo menos tres pliegues si la concentración del agente reductor, por ejemplo DTT, se aumenta al mismo tiempo, para mantener una relación de DTT:IGF-I de entre 3:1 y 10:1 aproximadamente. Es deseable producir una solución de proteína solubilizada más concentrada antes del repliegue de disolución. Así, la concentración preferida de polipéptido es por lo menos de 30 mg/mL aproximadamente, con un rango más preferido de 30 a 50 mg por mL. Por ejemplo, el IGF-I se puede solubilizar en una concentración de unos 30 a 50 mg/mL en 2M de urea, 10 mM de DTT y diluirse, por ejemplo, en 1 mg/mL aproximadamente para el plegado.

Después de solubilizar el polipéptido, se coloca o diluye en el tampón que contiene el solvente, el agente caotrópico, y las sales tal como se ha descrito anteriormente. El tampón puede ser cualquiera de los indicados anteriormente para la primera solución tamponada, prefiriéndose CAPSO, glicina, y CAPS con un pH de 8,5 a 11, particularmente en una concentración de unos 20 mM, y más preferiblemente CAPSO y glicina. El polipéptido se puede diluir con el tampón de repliegue, preferiblemente por lo menos cinco pliegues, más preferiblemente por lo menos unos diez pliegues. Alternativamente, el polipéptido se puede dializar contra el tampón de repliegue. El replegado se realiza típicamente entre 0 y 45ºC, preferiblemente entre 20 y 40ºC, más preferiblemente entre 23 y 37ºC, incluso más preferiblemente entre 25 y 37ºC, y más preferiblemente a unos 25ºC durante por lo menos una hora aproximadamente. La temperatura preferida no se ve afectada aparentemente por los niveles de sal, solvente y agente caotrópico, pero puede verse afectada por la presencia de sucrosa y glicerol, en cuyo caso se ha de mantener por encima de 20ºC aproximadamente. La solución opcionalmente también contiene un agente reductor y un osmolito.

El agente reductor se selecciona de una manera adecuada entre los descritos anteriormente para la etapa de solubilización en el rango de concentración dado. Esta concentración dependerá especialmente de las concentraciones de alcalino térreo, metal álcali, o sal de amonio, polipéptido y solvente. Preferiblemente, la concentración de agente reductor es de 0,5 a 8 mM aproximadamente, más preferiblemente entre 1 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,5 y 2 mM. Los agentes reductores preferidos son DTT y cisteína.

El osmolito opcional es preferiblemente sucrosa (en una concentración de 0,25 a 1 M aproximadamente) o glicerol (en una concentración de 1 a 4 M aproximadamente). Más preferiblemente, la concentración de sucrosa es de 1 M aproximadamente y la concentración de glicerol es de 4 M aproximadamente.

La concentración inicial de polipéptido en el tampón de plegado es tal que la relación se maximizará la relación entre conformador recuperado correctamente plegado y mal plegado, tal como se determina mediante HPLC, RIA o bioensayo. La concentración exacta dependerá, por ejemplo, del tipo de polipéptido utilizado. La concentración preferida de polipéptido (resultante en el rendimiento máximo del conformador correctamente plegado) está en el rango de 0,1 a 15 mg/mL aproximadamente, más preferiblemente entre 0,1 y 6 mg/mL aproximadamente, y más preferiblemente entre 0,2 y 5 mg/mL aproximadamente.

Además, se introduce una fuente de oxígeno tal como aire o gas oxígeno o se introduce de otra manera en el tampón para realizar la oxidación junto con la sal de cobre o manganeso. El oxígeno puede estar presente en el tampón en cualquier punto en el tiempo, incluyendo antes de añadir al tampón el polipéptido o cualesquiera otros reagentes.

La cantidad de fuente de oxígeno introducida dependerá, por ejemplo, del tipo de recipiente utilizado, el tipo y concentración del polipéptido, el tipo de fuente de oxígeno, el tipo y cantidad de sal de cobre o manganeso, y el tipo y cantidad de agente reductor presente, si lo hay, y el tipo y cantidad de agente caotrópico presente, así como el pH del tampón. Generalmente, la fuente de oxígeno se introducirá mediante medios pasivos (por ejemplo, como aire en la cámara de aire en una relación de espacio de aire y volumen de fluido de 2:1) usando un agitador. Alternativamente, la fuente de oxígeno se puede introducir mediante burbujas a través de un pulverizador. El índice de introducción del oxígeno ha de ser suficiente para permitir el plegado para conseguir la finalización en preferiblemente de 1 a 12 horas aproximadamente, más preferiblemente de 1 a 6 horas aproximadamente, y más preferiblemente de 1 a 3 horas aproximadamente. La adición de oxígeno molar es proporcional a la concentración de reducción y la concentración de polipéptido, pero inversamente proporcional a la concentración de sal de cobre o magnesio. El índice de oxidación está limitado por el nivel del catalizador, no por el índice de adición del oxígeno. Un índice de pulverización mayor se requiere para un volumen mayor de plegado.

El grado de replegado que se produce bajo esta segunda incubación se determina de una manera adecuada mediante el título RIA del polipéptido o mediante análisis HPLC usando, por ejemplo, una columna Vydac o Baker C-18, con un título RIA en aumento o un tamaño de pico de polipéptido correctamente plegado directamente correlacionado con cantidades en aumento de conformador de polipéptido biológicamente activo correctamente plegado presente en el tampón. La incubación se realiza para maximizar el rendimiento del conformador de polipéptido correctamente plegado y la relación de conformador de polipéptido correctamente plegado en conformador de polipéptido mal plegado recuperado, tal como se determina mediante RIA o HPLC, y para minimizar el rendimiento de polipéptido multimérico asociado tal como se determina mediante equilibrio de masa.

Después de que el polipéptido se haya replegado, los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados para obtener una mayor pureza: columnas de fraccionamiento o inmunoactividad o intercambio de iones; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio de iones tal como S-Sefarosa y DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; y filtración de gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.

La invención se entenderá de una manera más completa con referencia a los siguientes ejemplos, que están pensados para ilustrar la invención.

Ejemplo I A. Construcción de una variedad de células huésped 37D6

El huésped usado para producir IGF-I humano recombinante en la fermentación descrita en este ejemplo era un derivado de E. coli W3110, designado 37D6. El genotipo completo de 37D6 es tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Deltarbs7 ilvG \Delta(argF-lac)169 ompT\Delta degP41Kan^{r}. La derivación de la variedad 27C7, que es una variedad madre para 37D6 que tiene el genotipo tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ompT\Delta degP41kan^{r}, se indica en el documento WO 93/11240 publicado el 10 de junio de 1993, cuya descripción se incorpora aquí como referencia. La variedad 27C7 se depositó el 30 de octubre de 1991 in la "American TIPO Culture Collection" como ATCC No. 55.244.

La variedad 37D6 es la misma que la 27C7 descrita anteriormente excepto que tiene una eliminación rbs7 (menos utilización de ribosa) y tiene un locus ilvG restaurado. Ambos marcadores se pueden introducir mediante transducción P1.

B. Descripción/Construcción de Plásmido de Expresión IGF-I

pBKIGF2B

En el plásmido pBKIGF-2B que expresa IGF-I, las secuencias de transcripción y translación requeridas para la expresión del gen IGF-I en E. coli se proporcionan mediante el promotor de fosfatasa alcalina y la secuencia Shine-Dalgarno trp. El terminador lambda t_{o} de transcripción está situado adyacente al codón de terminación IGF-I. La secreción de la proteína desde el citoplasma está dirigida mediante la secuencia de señal lamB o alternativamente mediante la secuencia de señal STII. La mayoría de rhIGF-I se encuentra en el espacio periplásmico de la célula. El plásmido pBKIGF-2B confiere resistencia a la tetraciclina sobre el huésped transformado.

El plásmido pBKIGF-2B se construyó en varias etapas usando como intermedios plásmidos pLS32Tsc,
pLBIGFTsc, pLS33Tsc, y pRanTsc.

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Etapa 1

pLS32Tsc

El plásmido de secreción pLS32Tsc contiene el gen IGF-I. Las secuencias de transcipción y translación requeridas ara la expresión del gen IGF.I en E. coli se proporcionan mediante el promotor de fosfatasa alcalina y la secuencia Shine-Dalgarno trp. El terminador lambda t_{o} de transcripción está situado adyacente al codón de terminación IGF-I. La secreción de la proteína desde el citoplasma está dirigida mediante la secuencia de señal lamB o alternativamente mediante la secuencia de señal STII. La mayoría de rhIGF-I se encuentra en el espacio periplásmico de la célula. El plásmido pLS32Tsc confiere resistencia a la tetraciclina sobre el huésped transformado.

El plásmido pLS32Tsc se construyó en varias etapas usando como intermedios plásmidos pLS32T, pAPlamB, pLS321amB, pLS331amB, y pLS33Tsc, tal como se describe en detalle en el documento WO 93/11240, supra.

Etapa 2

pLBIGFTsc

Etapa a

pLamBIGF

Para la primera parte del ligado, se aisló el fragmento de vector EcoRI-PstI del pBR322. Para la segunda parte del ligado, se aisló un fragmento de PstI-NcoI 1244-bp del pAPLamB. Para la tercera parte del ligado, se aisló el fragmento de HaeII-EcoRI 196-bp que contiene el gen IGF-I excepto el extremo inicial 5' del plásmido p200. El p200 es un plásmido derivado del pBR322 que tiene, en el orden 5' a 3', el promotor de quelatina, la secuencia de señal prepo MF alfa I, IGF-I maduro que codifica ADN, y el terminador 2-micron. Contiene el origen ColE1 de replicación para las bacterias y el origen 2-micron para la levadura. Un diagrama de plásmido de enzima de restricción de p200 se proporciona en la figura 1. La secuencia de nucleótido (SEQ. ID Nº 1) del fragmento de EcoRI (empezando en la posición 1149) a EcoRI (empezando en la posición 1628) de p200 que contiene el prepo MF alfa I y el gen IGF-I se proporciona en la figura 2. Los sitios de restricción HaeII, PstI, BamHI, and SalI que están también en el diagrama de la figura 2 están indicados en la secuencia mediante subrayado. Una pieza de ADN sintético que enlaza la secuencia de señal con el gen IGF-I (NcoI a HaeII) se preparó teniendo la siguiente secuencia:

5'-CATG GCC GGT CCG GAA ACT CTG TGC GGC GC	(SEQ. ID NO. 2)
3'-CGG CCA GGC CTT TGA GAC ACG C	(SEQ. ID NO. 3)

Los tres fragmentos de plásmido y el AND sintético se ligaron juntos para formar pLamBIGF, tal como se muestra en la figura 3.

Etapa b

pLBIGFTsc

El fragmento de vector XbaI-BamHI se aisló del pLS18 como el primer fragmento de ligado. La segunda parte del ligado fue un fragmento 412-bp StuI-BamHI a partir del plásmido pdH108-4 descrito anteriormente. La tercera parte del ligado se preparó mediante una digestión EcoRI de pLamBIGF, seguida por tratamiento con fragmento Klenow de polimerasa de ADN, seguido por una digestión XbaI. El fragmento resultante 302-bp se aisló. Estos tres fragmentos se ligaron para producir pLBIGFTsc, tal como se muestra en la figura 4.

Etapa 3

pRanTsc

El fragmento de vector XbaI-BamHI se aisló del pLS18 como el primer fragmento de ligado. La segunda parte del ligado fue un fragmento 412-bp StuI-BamHI a partir del plásmido pdH108-4 descrito anteriormente. La tercera parte del ligado se preparó a partir de pRANTES. pRANTES es un plásmido basado en pBR322 que contiene un fragmento de un enlace XbaI seguido por la señal STII, seguido por el RANTES que codifica ADNc [tal como se publicó por parte de Schall et al., J. Immunol., 141: 1018 (1988)], seguido por el enlace BamHI. El tercer fragmento se preparó mediante digestión de pRANTES con BamHI, seguido por tratamiento con fragmento Klenow de polimerasa de ADN, seguido por una digestión de XbaI. El fragmento 303-bp resultante se aisló. Estos tres fragmentos se ligaron para producir pRanTsc, tal como se muestra en la figura 5.

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Etapa 4

pBKIGF-2

Tal como se muestra en la figura 6, el fragmento de EcoRI-PstI 540-bp que contiene el promotor de fosfatasa alcalina, la secuencia de señal lamB, y el ADN que codifica los primeros 15 aminoácidos de IGF-I se eliminaron del pLS32Tsc. El fragmento Pst-Bsp1286I (\sim70 bp) que contiene el ADN que codifica los aminoácidos 16 a 38 de IGF-I se eliminaron del pLBIGFTsc. El fragmento Bsp1286I-HindIII (-179-bp) que contiene el ADN que codifica los aminoácidos 39 a 70 de IGF-I, el terminador lambda, y el promotor Tc se eliminaron del pLS33Tsc. Finalmente, el fragmento de vector EcoRI-HindIII \sim4331-bp (basado en pBR322) se eliminó del pRanTsc. Estos cuatro fragmentos se ligaron para proporcionar pBKIGF-2, que contiene el promotor AP, la secuencia de señal lamB, el ADN que codifica toda la proteí-
na IGF-I, el terminador de transcripción, el promotor Tc, y los marcadores de resistencia de tetraciclina y ampicilina.

Etapa 5

pBKIGF-2A

Se digirió pBKIGF-2 con PstI y ClaI y se aisló el fragmento \sim245-bp. Este contiene los aminoácidos 16 a 70 de IGF-I y el terminador lambda t_{o}. Se digirió pLBIGFTsc con NcoI y ClaI y se aisló el fragmento del vector. Este fragmento de vector contiene el promotor AP, la señal lamB, y el gen Tet^{r}. Estos dos fragmentos se ligaron a una pieza de ADN sintético que reemplaza el extremo 5' del ADN de IGF-I desde NcoI a PstI con codones derivados sintéticamente como sigue:

5'-CATGGCC GGT CCC GAA ACT CTG TGC GGT GCT GAA CTG GTT GAC GCT CTG CA-3'

3'-CGG CCA GGG CTT TGA GAC ACG CCA CGA CTT GAC CAA CTG CGA G-5'

(SEQ. ID Nº 4 y 5, respectivamente).

El plásmido resultante se designó pBKIGF-2A. La construcción se muestra en la figura 7.

Etapa 6

pLamBRan

Este plásmido se preparó mediante digestión de pLS33LamB con NcoI y BamHI y se aisló el fragmento del vector. El pLS33LamB es un plásmido hecho a partir de pBR322 en el que se ha insertado el promotor AP, la señal lamB, y el gen IGF-I. El BamHI se corta en la porción Tc del plásmido y el NcoI se corta en el extremo 5' del gen IGF-I. El segundo fragmento se generó digiriendo pRANTES con BsaJI y BamHI y aislando el fragmento -200-bp resultante. El tercer fragmento era una pieza de ADN sintético para enlazar el gen RANTES con la secuencia de señal desde NcoI a BsaJI. Este ADN sintético tiene la secuencia:

NcoI

\hskip3.8cm

BsaJI

5'-CATGGCCTCCCCATATTC-3'

\hskip0.5cm

3'-CGGAGGGGTATAAGGAGC-5'

(SEQ. ID Nº 6 y 7, respectivamente).

El vector resultante fue llamado pLamBRan, y su construcción se muestra en la figura 8.

Etapa 7

pBKIGF-2B

La construcción de este plásmido se muestra en la figura 9. El pLamBRan se digirió con NcoI y SphI y el fragmento del vector se aisló conteniendo el promotor y la secuencia de señal. El pBKIGF-2 se digirió con DdeI y SphI y el fragmento -600-bp se aisló conteniendo el terminador de transcripción lambda y el extremo 5' del gen Tet^{R}. El pBKIGF-2A se digirió con NcoI y Bsp1286I y el fragmento \sim110-bp se aisló conteniendo el ADN que codifica los aminoácidos 1 a 38 de IGF-I. Estos tres fragmentos se ligaron juntos con DMA sintético que codifica los aminoácidos 39 a 70 de IGG-I para producir pBKIGF-2B. Este enlace sintético tiene la secuencia:

1

C. Procedimiento de Fermentación y Recuperación i. Transformación

Células competentes de E. coli 27C7 se transformaron con pBKIGF-2B mediante técnicas estándar de transformación. Los transformadores se seleccionaron y se purificaron en placas LB que contenían 20 mg/L de tetraciclina. Este medio tenía la siguiente composición: 10 g/L Bacto-Triptona, 5 g/L extracto de levadura, 10 g/L de cloruro de sodio, y 20 mg/L de tetraciclina-HCl.

ii. Inoculo de fermentación

Se preparó un inoculo de fermentación 10-L inoculando primero un matraz de agitación de dos litros que contenía aproximadamente 500 mL de medio LB estéril que contenía tetraciclina con el vial de 1-2 mL de cultivo recién descongelado antes descrito. Este matraz se incubó a 35-39ºC durante 8 horas y se transfirió a un fermentador de 10 litros que contenía el medio de producción en el rango de aquel descrito en la sección C de este ejemplo. El inoculo de fermentación se incubó a 35-39ºC a pH 7,1-7,5 durante 6-12 horas. La tasa de agitación se ajustó a 650-1000 rpm y la tasa de aireación a 0,7-1,5 volúmenes de aire por volumen de cultivo por minuto. El inoculo se transfirió luego asépticamente a una cuba de fermentación de 1000-L donde se introdujo glucosa desde del fondo.

El inoculo de 10-L se cultivó como el cultivo del matraz de agitación 500-mL a una fase exponencial media (cultivo por lotes). Toda la glucosa se añadió al fermentador 10-L al principio de la fermentación. Sólo la fermentación 1000-L utilizó alimentación de glucosa.

iii. Procedimiento de Fermentación

La cuba de 1000-L inicialmente contenía 600-800 litros de medio de fermentación compuesto como sigue a continuación:

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2

3

El procedimiento de la fermentación se realizó a 35-39ºC a pH 7,1-7,5 durante 24-48 horas. La tasa de agitación se ajustó a 200 rpm y la tasa de aireación a 0,7-1,5 volúmenes de aire por volumen de cultivo por minuto. La producción de IGF-I se produjo después de que se redujo el fosfato en el medio. Este procedimiento resulta en un caldo de fermentación que contiene aproximadamente 18% de volumen de células empaquetadas y por encima de 3g/L de IGF-I, que se hallaba principalmente en el espacio periplásmico con bajos niveles en el medio extracelular.

D. Solubilización in-situ

Al final de la fermentación, todos los añadidos y controladores, con la excepción de la temperatura, se apagaron. Se mantuvo el control de temperatura a 37ºC. La aspersión se apagó y la presión trasera del fermentador se liberó. El volumen del caldo se drenó hasta 1200 L y la agitación se disminuyó de 200 rpm a 150 rpm. Las líneas de aspersión y la cámara de aire del fermentador se purgaron entonces con gas nitrógeno, primero a una tasa de 150 Lpm durante 1 minuto, luego a 50 Lpm por el resto del procedimiento. Un lodo de 220-L que contenía 174 kg de urea se bombeó rápidamente dentro del fermentador, seguido inmediatamente por aproximadamente 8 L de hidróxido de sodio 50% (peso/peso), suficiente para ajustar el pH a 10,0. Una solución de 20-L que contenía 2,9 kg de ditiotreitol se añadió entonces y el pH se reajustó a 10,0 con aproximadamente 3 litros adicionales de hidróxido de sodio 50%. El lote se mantuvo con agitación a 37ºC durante 60 minutos, después de lo cual se enfrió a 22ºC y se transfirió a un tanque de retención para una extracción acuosa de dos fases. Los ensayos mediante HPLC de fase reversa mostraron que el título de IGF-I fue de 3,8 g/L, y después de la solubilización se liberó IGF-I de las células cuantitativamente.

E. Extracción acuosa de dos fases líquido-líquido

La temperatura del lote se mantuvo a 22ºC y la cámara de aire se purgó con nitrógeno. Al caldo tratado, que tenía un volumen de 1450 L, se añadieron 250 kg de PEG-8000 y 90 kg de sulfato de sodio. El lote se agitó durante 40 minutos aproximadamente. La centrifugación y el análisis de las muestras mostraron que la relación de fase y volumen (Kv) se estabilizó en 2,6 y el coeficiente de distribución (Kc) de IGF-I era de 8,5. El lote se separó usando un separador Westfalia SB-7, produciendo aproximadamente 1300 L de fase ligera y 550 L de fase pesada. Los ensayos mediante HPLC de fase inversa mostraron que la fase ligera aislada contenía aproximadamente un 88% del IGF-I en los 1450 L iniciales de caldo tratado. La fase ligera se mantuvo bajo nitrógeno y la fase pesada se descartó.

F. Precipitación de IGF-I

Se añadieron aproximadamente 36 L de 2 M de ácido fosfórico a la fase ligera para ajustar el pH a 7,0 a 22ºC. El lote se mantuvo durante 8 horas aproximadamente con una mezcla suave, en cuyo punto el ensayo mediante HPLC de fase inversa mostró que aproximadamente el 96% del IGF-I había precipitado. El gránulo se recogió entonces usando un clarificador Westfalia SB-7. La masa del fango de gránulos era aproximadamente de 88 kg.

G. Replegado

Una alícuota del fango de gránulos, que tenía una masa de 17,6 kg, se disolvió añadiendo suficiente urea sólida para llegar a la concentración final de 2 M, añadiendo suficiente ditiotreitol para llegar a la concentración de 10 mM, y ajustando el pH a 10,0 con hidróxido de sodio al 50% (w/w). A continuación se añadieron a 700 L de tampón de plegado que tenía una composición de 2 M de urea, 1 M de cloruro de sodio, etanol 19% (v/v), 20 mM de glicina, 0,5 \muM de cobre, pH 10,5. La concentración final de ditiotreitol se ajustó a continuación a 1 mM. Se realizó el plegado a 22ºC con mezcla suave mediante pulverización en gas oxígeno a 280 mL/minuto. El progreso del plegado se monitorizó mediante HPLC de fase inversa. Los cromatogramas HPLC representativos tomados al inicio, la mitad, y después de la terminación del plegado se muestran en la figura 10. Después de 3 horas aproximadamente, el plegado se terminó mediante la cesación de la pulverización de oxígeno y la valoración del lote a pH 3,5 con aproximadamente 1,6 L de ácido fosfórico de reagente. El ensayo mediante HPLC de fase inversa mostró que el rendimiento de plegado era del 50%.

Ejemplo II

La construcción del huésped, la construcción del plásmido, y la fermentación se realizaron tal como se describe en el Ejemplo I, partes A a C. La solubilización in-situ se realizó tal como se describe en el Ejemplo I, parte D, excepto que en lugar de usar DTT, el caldo se redujo mediante la adición de suficiente L-cisteína para llevar la concentración final a 50 mM (aproximadamente 8,8 kg). Al final de la solubilización, el ensayo mediante HPLC de fase inversa mostró que se liberó de las células el 93% del IGF-I.

El posterior aislamiento se realizó mediante versiones escaladas hacia abajo de las operaciones descritas en el Ejemplo I, Partes E a G.

Ejemplo III

Se preparo IGF-I no nativo usando el procedimiento de huésped, plásmido, fermentación, y solubilización in-situ descrito en el Ejemplo I, partes A a D.

Se produjeron sistemas acuosos de dos fases usando el siguiente procedimiento: (1) se colocaron especies formadoras de fase en un tubo de cultivo de poliestireno graduado de 15 ml; (2) se añadieron 7 mL de todo el extracto desde la solubilización in-situ, los contenidos se mezclaron, y la cámara de aire se purgó con nitrógeno; (3) la composición se incubó durante dos horas a temperatura ambiente o a 37ºC con una mezcla de punta a punta. Se añadieron polímeros de soluciones de stock (50% w/w polímero PEG Mr 3350, 50% w/w polímero PEG Mr 8000, y 100% w/w polímero de marca DOW Polyglycol 15-200™), mientras se añadieron sales como productos químicos de secado. Se añadieron componentes para conseguir una composición predeterminada sobre una base de peso a peso, asumiendo que todo el extracto tiene una densidad de 1 g/mL.

Se separaron las fases mediante centrifugación a 25ºC o 37ºC en unos 1300 g durante 20 minutos. La concentración de IGF-I en la fase más alta se determinó mediante análisis HPLC de fase inversa. La concentración de IGF-I en la fase más inferior se calculó usando una suposición de equilibrio de masa.

Se realizaron tres experimentos en los que se varió la concentración y el tipo de polímero formador de fase, la concentración y el tipo de sal formadora de fase, la concentración y el tipo de sal no formadora de fase, y la temperatura. Los sistemas resultantes se pudieron caracterizar visualmente como pertenecientes a una de las cinco categorías listadas: (1) sistemas de una fase, (2) sistemas de dos fases en los que los sólidos sedimentan en la fase del fondo, (3) sistemas de dos fases en los que algunos sólidos flotan en la fase del fondo; (4) sistemas de dos fases en los que los sólidos están distribuidos a lo largo de las fases superior e inferior, y (5) sistemas de dos fases en los que los sólidos están distribuidos en la fase más alta.

El trazado mostrado en la figura 11 representa esta relación entre la composición del sistema y la disposición para sistemas compuestos solamente por todo el extracto, PEG-8000 y Na_{2}SO_{4}. En este trazado, "sistemas de dos fases con sólidos flotando" indica todos los sistemas de dos fases en los que los sólidos no sedimentan en la fase de fondo. El trazado también indica el límite que describen los sistemas, en los que los sólidos sedimentan en una fase inferior que es justo suficientemente grande para alojar su volumen. Los sistemas más preferibles en los cuales los sólidos sedimentan en la fase de fondo, el volumen de la fase inferior es suficiente para alojar sólidos, y la relación entre la fase y el volumen es mayor que 1 aproximadamente están contenidos en la zona sombreada.

Estos tres experimentos también proporcionaron datos que permiten comparar cuantitativamente los diferentes sistemas acuosos de dos fases, tal como se muestra en la Tabla I. Para reducir errores y permitir que sea más evidente el efecto de un cambio dado, los datos de la relación de volumen y el coeficiente de partición se promediaron para varios sistemas diferentes, tal como se ha indicado. Los resultados de este análisis indican varias tendencias. Los polímeros PEG-8K y PEG-4K (que tienen valores Mr de 8000 y 3350, respectivamente) forman sistemas que tienen relaciones de volumen similares en particiones de IGF-I no nativo de una manera similar. Incluyendo NaCl en sistemas de fase examinados no afectan a la relación de volumen, pero no disminuyen el coeficiente de partición IGF-I. Añadiendo el polietileno glicol aleatorio, copolímero polipropileno glicol polímero marca DOW Polyglycol 15-200™ (Mr - 2500) no altera la relación de volumen o el coeficiente de partición. Incluyendo el citrato de sal formadora de fase en PEG-8000 y Na_{2}SO_{4} los sistemas cambian la posición de la curva binodal pero no afecta a la partición de IGF-I. La conducción acuosa de la extracción de dos fases a 37ºC disminuye la relación de volumen y el coeficiente de partición respecto a 25ºC.

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Ejemplo IV

Se preparó IGF-I no nativo usando el procedimiento de huésped, plásmido, fermentación y solubilización in-situ descrito en el Ejemplo I, partes A a D.

Se produjeron sistemas acuosos de dos fases tal como se describe en el Ejemplo III con la excepción que se añadió PEG-8000 en forma seca, más que una solución de stock. Las concentraciones de IGF-I en la fase superior y en la fase de fondo líquida se determinaron mediante análisis HPLC de fase inversa. La fase líquida de fondo se sometió a filtración de 0,2 \mum antes del análisis para retirar los sólidos suspendidos residuales.

Los resultados de la determinación directa del coeficiente de partición del IGF-I no nativo en sistemas acuosos de dos fases se muestran en la Tabla II. Con una condición del 5% (w/w) de Na_{2}SO_{4}, 14% (w/w) PEG-8000, el coeficiente de distribución tiene una magnitud de 9 a 10. Un aumento del 1% (w/w) en la concentración de sal o un aumento del 2% (w/w) en la concentración de polímero dobla su magnitud. Los aumentos combinados en las concentraciones de sal y polímero provocan un aumento de cuatro pliegues, en un valor de casi 40. Esta última combinación provoca la formación de un sistema de dos fases con sólidos flotando.

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TABLA II

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Ejemplo V

Se preparó IGF-I no nativo usando los procedimientos de fermentación, solubilización in-situ y extracción acuosa de dos fases tal como se describe en el Ejemplo I, partes A a E. Para la precipitación de IGF-I, una porción de la fase ligera se dividió en varias alícuotas que se clasificaron a aproximadamente pH 6 usando uno de los siguientes ácidos: ácido fosfórico 2 N, acético 2 N, sulfúrico 2 N, hidroclórico 2 N, cítrico 2 N, o nítrico 2 N. Las alícuotas se centrifugaron brevemente a continuación a aproximadamente 5000 x g durante 15 minutos y los líquidos sobrenadantes se decantaron. Los ensayos mediante HPLC de fase inversa mostraron que, en todos los casos, se recuperó por lo menos el 93% del IGF-I inicial en el gránulo. Se realizó un posterior replegado de proteína de los gránulos mediante una versión de escalado inferior del procedimiento descrito en el Ejemplo I, Parte G.

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Ejemplo VI

Se preparó IGF-I no nativo usando los procedimientos de fermentación, solubilización in-situ y extracción acuosa de dos fases tal como se describe en el Ejemplo I, partes A a E.

Una muestra de la fase ligera de la parte E del Ejemplo I se dividió en varias alícuotas más pequeñas, y se inició una precipitación ácida mediante valoración de estas alícuotas a pH 10, 4,5, 4,0, 3,5, o 3,0 usando 2 M de ácido sulfúrico. Cada uno de estos cinco stocks se dividió más a continuación en cinco alícuotas, que recibieron sulfato de sodio sólido suficiente para dar una concentración final del 3, 4, 5, 6 ó 7% en peso. Las muestras se incubaron durante dos horas a 25ºC con mezclado suave. Las fases se separaron a continuación después de centrifugación a aproximadamente 5000 x g durante 20 minutos. La concentración de IGF-I en ambas fases se ensayó mediante HPLC de fase
inversa.

Para todos los niveles de sulfato de sodio en pH 10, más del 95% del IGF-I permaneció en la fase superior. Para todas las muestras en todos los otros pHs (4,5 a 3,0), más del 98% del IGF-I se recuperó en la fase de fondo.

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Ejemplo VII

Se preparó IGF-I no nativo usando los procedimientos de fermentación, solubilización in-situ, extracción acuosa de dos fases y precipitación de neutralización tal como se describe en el Ejemplo I, partes A a G.

Se preparó una suspensión que contiene IGF-I reducido a partir del gránulo de IGF-I obtenido mediante precipitación de neutralización. Para producir esta suspensión se resuspendieron 30 g de gránulos mojados conteniendo IGF-I en una solución que contenía 20 mM de glicina (pH 10,5), 2 M de urea, y 10 mM de DTT a un volumen final de 100 mL. El pH de la suspensión resultante se ajustó a un pH de 10,5 mediante la adición de NaOH y HCl tal como se requería. El análisis HPLC de fase inversa de la suspensión indicó que contenía 35 mg/mL de IGF-I.

Se prepararon tampones de replegado en tubos de cultivo de poliestireno de 15 mL mediante la adición de cantidades apropiadas de las siguientes soluciones de stock: 1 M de glicina (pH 10,5) y 25 \muM de CuCl_{2}, 9 M de urea, 100% etanol, 1,8 M de Na_{2}SO_{4}, 20% (v/v) de PEG-3350, y 20% (v/v) de PEG-8000. Cada tubo recibió 0,1 mL de la solución de stock de tampón 50x que contiene glicina y CuCl_{2}. Otros stocks se añadieron para tener la concentración indicada en un volumen final de 5 mL. Cada tubo que contenía componentes de tampón de replegado se llevó a un volumen final de 4 mL.

El replegado de IGF-I se inició diluyendo 1 mL de suspensión de IGF-I reducido en los tampones de replegado preparados previamente, proporcionando una concentración de IGF-I inicial de 7 mg/mL. Los tubos se taparon y se agitaron horizontalmente en un agitador orbital. Cada tubo contenía 5 mL de líquido y 10 mL de aire. El replegado se dejó que se produjese durante tres horas, después de las cuales se recogieron las muestras, diluidas mediante un factor de 10 en un tampón ácido que contenía 20 mM de glicina (pH 3), 2 M de urea, y se analizó mediante HPLC de fase inversa para determinar el contenido de IGF-I correctamente plegado.

El objetivo de este ejemplo es mostrar el efecto de los componentes acuosos formadores de fase en la obtención de IGF-I correctamente plegado obtenido durante el replegado. Los componentes formadores de fase específicos investigados fueron Na_{2}SO_{4}, PEG-3350, PEG-8000, y etanol. Las concentraciones examinadas eran consistentes con aquellas que se pueden producir diluyendo una fase acuosa aislada mediante un factor de 10 a 15.

Los resultados, mostrados en la Tabla III, indican que el rendimiento de IGF-I correctamente plegado se mejora replegando IGF-I en presencia de los componentes formadores de fase etanol y Na_{2}SO_{4}. El rendimiento de IGF-I no se ve afectada por la presencia de los componentes formadores de fase PEG-3350 o PEG-8000.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo VIII

Se preparó IGF-I no nativo usando los procedimientos de fermentación, solubilización in-situ, extracción acuosa de dos fases y precipitación de neutralización tal como se describe en el Ejemplo I, partes A a G.

Se preparó una suspensión que contiene IGF-I reducido a partir del gránulo de IGF-I obtenido mediante precipitación de neutralización. Para producir esta suspensión se resuspendieron 10 g de gránulos mojados conteniendo IGF-I en 45 mL de una solución que contenía 20 mM de glicina (pH 10,5), 2 M de urea, y 10 mM de DTT. El pH de la suspensión resultante se ajustó a un pH de 10,5 mediante la adición de NaOH y HCl tal como se requería. El análisis HPLC de fase inversa de la suspensión indicó que contenía 15 mg/mL de IGF-I. La suspensión con el pH ajustado se remató con una solución de DTT concentrada para obtener una concentración de DTT final de 15 mM. La suspensión de IGF-I reducida resultante contenía 15 mg/mL de IGF-I, 20 mM de glicina (pH 10,5), 2 M de urea, y 15 mM de DTT.

Se prepararon tampones de replegado en tubos de cultivo de poliestireno de 15 mL mediante la adición de cantidades apropiadas de variaciones soluciones de stock y componentes químicos secos. Cada tubo recibió 0,1 mL de solución de stock de tampón 50 X que contenía 1 M de glicina (pH 10,5), y 25 \muM de CuCl_{2}. Se añadieron cantidades apropiadas de otros componentes químicos para tener la concentración indicada en un volumen final de 5 mL. Se añadieron etanol y glicerol como líquidos. Se añadieron urea, NaCl y Na_{2}SO_{4} en forma seca. Cada tubo que contenía componentes de tampón de replegado se llevó a un volumen final de 4,7 ó 3,7 mL dependiendo de si el replegado se tenía que realizar en 1 ó 4 mg/mL de IGF-I, respectivamente.

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El replegado de IGF-I se inició diluyendo 0,3 ó 1,3 mL de suspensión de IGF-I reducida, para replegar en 1 ó 4 mg/mL de IGF-I, respectivamente, en los tampones de replegado preparados previamente. Los tubos se taparon y se agitaron en horizontal en un agitador orbital. Cada tubo contenía 5 mL de líquido y 10 mL de aire. Se dejó que se produjera el replegado durante 8 horas, después de las cuales se recogieron las muestras, acidificadas, y se analizaron mediante HPLC de fase inversa para determinar el contenido de IGF-I correctamente plegado.

Se investigaron los siguientes aspectos de la composición de tampón de replegado: tipo y concentración de sal (0, 0,5, 1,0 M de NaCl; o 0, 0,2, 0,6 M de Na_{2}SO_{4}), concentración de caótropo (1, 2, 3 M de urea), concentración de solvente (etanol 0, 10, 20% v/v), concentración de osmolito (glicerol 0, 20, 30% v/v), y concentración de IGF-I inicial (1, 4 mg/mL). Los rendimientos obtenidos con las combinaciones seleccionadas de estos componentes se muestran en la Tabla IV. La inspección muestra que el mayor rendimiento de IGF-I correctamente plegado se obtuvo replegando en la siguiente condición: 1 mg/mL de IGF-I, 20 mM de glicina (pH 10,5), 2 M de urea, 1 M de NaCl, etanol 20% (v/v), y 0,5 \muM de CuCl_{2} (muestra # 0).

El experimento descrito en este ejemplo se diseñó para permitir un análisis estadístico multifactorial de los datos de rendimiento de IGF-I correctamente plegado para indicar la importancia de todos los factores por separado y todas las interacciones de dos factores. Los resultados de este análisis estadístico se muestran en las Tablas V y VI. La inspección de estos resultados muestra que, bajo las condiciones experimentales empleadas, las siguientes tendencias son evidentes: (1) los mejores rendimientos se obtuvieron mediante el replegado con baja concentración de IGF-I; (2) incluyendo sal en una concentración de 1 M aproximadamente se mejora el rendimiento de replegado particularmente en presencia de etanol; (3) NaCl es una sal más preferida que Na_{2}SO_{4}; (4) se obtiene mejor rendimiento con el replegado en 2 a 3 M de urea respecto a una menor concentración de urea, aunque la diferencia disminuye en presencia de etanol; (5) se obtiene un rendimiento mejorado en presencia de etanol 20% (v/v) respecto a ausencia de solvente; y (6) la inclusión de glicerol mejora el rendimiento, pero esta ventaja se reduce en presencia de etanol.

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Ejemplo IX

Se preparó una solución de stock de IGF-I reducido a partir de IGF-I correctamente plegado muy purificado. Se colocó una solución que contiene 1 mg/mL de IGF-I, 20 mM de glicina (pH 10,5), 2 mM de citrato, 0,1 M de NaCl, y 2 M de urea en un vial tapado y el espacio de aire se hizo salir con gas argón humidificado durante una hora aproximadamente con giros ocasionales. Después de la desoxigenación de la solución, se añadió DTT mediante una jeringuilla desde una solución de stock de 117 mM a una concentración final de 1,17 mM. Después de la adición de DTT, la solución se incubó durante dos horas con la retirada del espacio de aire con argón continuo.

Se prepararon soluciones de replegado a partir de una solución de stock de tampón común que contenía 20 mM de glicina (pH 10,5), 0,1 M de NaCl, y 2 M de urea. Este stock de tampón se suministró en viales y se añadieron CuCl_{2}, NiCl_{2}, ZnCl_{2}, CoCl_{2}, MnCl_{2}, and FeCl_{3} por separado a partir de soluciones de stock de 1,3 mM. Se taparon los viales que contienen las soluciones resultantes, y el líquido se aspergieron con argón u oxígeno humidificado.

Para iniciar la reacción de replegado, se diluyó rápidamente una alícuota de solución de stock de IGF-I reducido mediante un factor de 10 en una solución de replegado. La solución de stock de IGF-I se transfirió mediante una jeringuilla para iniciar el replegado. Se realizaron simultáneamente las reacciones de control al replegado (faltando la sal de metal de transición) y las reacciones de prueba del replegado y compartieron una fuente de gas común.

Las muestras se recogieron con jeringuilla de las reacciones del replegado después de 18 minutos de oxidación y se añadieron rápidamente a microviales cubiertos con septo que contienen una pequeña cantidad de HCl 6 N. La extensión del replegado de IGF-I se determinó mediante el análisis de las muestras mediante HLPC de fase inversa.

Tal como se muestra en la Tabla VII, la exposición de IGF-I reducido a oxígeno en presencia de CuCl_{2} o MnCl_{2} provocó la oxidación de IGF-I reducido y la formación de IGF-I correctamente plegado. La presencia de CoCl_{2} provocó la oxidación de IGF-I reducido, pero la formación de IGF-I plegado menos correctamente. Ambos NiCl_{2} y FeCl_{2} produjeron una oxidación todavía menor de IGF-I reducido y la formación de IGF-I correctamente plegado. La respuesta al ZnCl_{2} no fue diferente del de los elementos de traza.

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Ejemplo X

Se preparó una solución de stock de IGF-I reducido a partir de IGF-I correctamente plegado muy purificado, tal como se describe en el ejemplo IX.

Se prepararon soluciones de replegado a partir de una solución de stock de tampón común que contenía 20 mM de glicina (pH 10,5), 0,1 M de NaCl, y 2 M de urea. Este stock de tampón se suministró en viales y se añadió CuCl_{2} por separado tal como se requería a partir de soluciones de stock de 1,3, 0,13, 0,013, y 0,0013 mM que se habían preparado previamente mediante disolución en serie. Después de añadir el CuCl_{2} se taparon los viales y el líquido se aspergió de manera continua con argón u oxígeno humidificado.

Para iniciar la reacción de replegado, se diluyó rápidamente una alícuota de solución de stock de IGF-I reducido mediante un factor de diez en una solución de replegado. La solución de stock de IGF-I reducido se transfirió mediante una jeringuilla para iniciar el replegado. Se realizaron simultáneamente las reacciones de control al replegado (faltando CuCl_{2}) y las reacciones de prueba del replegado y compartieron una fuente de gas común.

Las muestras se recogieron con jeringuilla de las reacciones del replegado en intervalos predeterminados y se añadieron rápidamente a microviales cubiertos con septo que contienen una pequeña cantidad de HCl 6 N. Este tratamiento baja el pH de la muestra a pH 3 y enfría de manera efectiva la reacción de replegado. Las muestras se recogieron y se enfriaron en los siguientes tiempos de iniciación del post-replegado: 0, 2, 4, 6, 10, 20, 40, 60, 100 y 200 minutos. La extensión del replegado de IGF-I a lo largo del tiempo se determinó mediante el análisis de las muestras en el transcurso del tiempo mediante HLPC de fase inversa.

Se investigaron las siguientes concentraciones de CuCl_{2}: traza, 0,013 \muM, 0,052 \muM, 0,13 \muM, 0,52 \muM, 1,3 \muM, 5,2 \muM, y 13 \muM de CuCl_{2}. Un trazado de la evolución del IGF-I correctamente plegado durante la catálisis de oxidación aeróbica en estas concentraciones de CuCl_{2} se muestra en la figura 12.

Los resultados muestran que durante la catálisis de oxidación aeróbica, una baja concentración de CuCl_{2} (entre 0,05 \muM y 15 \muM aproximadamente, preferiblemente entre 0,05 y 0,5 \muM) proporciona un mayor rendimiento de polipéptido plegado correctamente que mayores concentraciones (mayores de 15 \muM aproximadamente) y proporciona una cinética de oxidación más rápida y reproducible que la catálisis del elemento de traza.

Los resultados mostrados en la figura 12 se obtuvieron mediante IGF-I replegado en soluciones sin solvente aprótico alcohólico o polar. Experimentos adicionales mostraron que la inclusión de alcohol en el tampón de replegado no influenció la dependencia de la cinética y el rendimiento de replegado de IGF-I sobre la concentración de CuCl_{2}, y no se esperaba que influyera en la dependencia sobre la concentración de otros metales de transición. Los experimentos también mostraron que la inclusión de EDTA (relación molar 1:1 respecto al CuCl_{2}) o o-fenantrolina (relación molar 3:1 respecto al CuCl_{2}) en las soluciones de repliegue que contienen 1,3 \muM de CuCl_{2} no afectaban la cinética de oxidación del IGF-I aeróbico catalizado con CuCl_{2}.

Ejemplo XI Fermentación

La construcción del plásmido de expresión phGH4R usado para la expresión y secreción de hGH se detalla en Chang et al., Gene, 55: 189-196 (1987).

La variedad E. coli 40G3 es un derivado de E. coli W3110. El genotipo completo de 40G3 es tonA\Delta phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 deoC \DeltaompT degP41 (\DeltaPstI-kan^{r}) ilvG2096^{R} phn(EcoB). La variedad 40G3 se puede derivar de E. coli W3110 variedad 16C9, que tiene el genotipo tonA\Delta phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 deoC. La eliminación ompT se introdujo mediante cotransducción P1 con una inserción Tn10 enlazada en el gen purE. Esta variedad se transdujo a prototrofia de purina para retirar el transposón. La mutación degP41 (\DeltaPstI-kan^{r}) se introdujo mediante selección para resistencia a la canamicina. El gen ilvG2096^{R} se introdujo reparando un auxotrofo de isoleucina/valina a prototrofia usando transducción P1. Finalmente, el operón phn(EcoB) se introdujo en el huésped mediante transducción P1 de los genes E. coli phn.

Las células E. coli 40G3 competentes se transformaron con phGH4R mediante técnicas de transformación estándar. Los transformantes se seleccionaron y purificaron en placas LB que contenían 20 mg/L de tetraciclina. Este medio tenía la siguiente composición: 10 g/L de Bacto-Tryptone, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de cloruro de sodio, y 20 mg/L de tetraciclina-HCl.

Un inóculo de fermentación de 10 L se preparó inoculando primero un vaso de agitación de dos litros que contenía aproximadamente 500 mL de medio estéril LB que contenía 5 mg/L de tetraciclina con 0,5 mL de cultivo de stock acabado de descongelar. Este vaso se incubó a 35-39ºC durante 8 horas y se transfirió a un fermentador de 10 litros que contenía el medio de producción en el rango del descrito posteriormente.

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El cultivo de 10 litros creció a 35-39ºC en un pH de 7,2 a 7,4 durante 42 a 48 horas. El índice de agitación se ajustó a 650 a 1000 rpm y el índice de aeración en 0,7 a 1,5 volúmenes de aire por volumen de cultivo por minuto.

El cultivo de 10 litros creció con suministro de glucosa continuo durante la fermentación. La producción de gGH se produjo después de reducir el fosfato en el medio.

Solubilización y Extracción Acuosa de la Hormona de Crecimiento Humano

La hGH del caldo de fermentación anterior se solubilizó añadiendo 240 g de urea, 20 mL de 1 M de glicina (pH 10), y 10 mL de 1 M de ditiotreitol (DTT) a 1 L de caldo de fermentación contenido en una botella de 2 L. El pH de la mezcla resultante se ajustó a pH 10 mediante la adición de 1 M de NaOH. Durante la incubación, la mezcla se agitó de manera continua con un impulsor accionado con un motor sumergido y el espacio de aire se retiró con nitrógeno. Después de 2 horas de incubación, se recogió una alícuota, se centrifugaron los sedimentos sólidos y el sobrenadante se ensayó para el contenido de hGH. El análisis HPLC de fase inversa mostró que el 31% del hGH total estaba en el sobrenadante de centrifugación.

A continuación se extrajo hGH añadiendo 308 g de PEG-8000 y 103 g de Na_{2}SO_{4}, a la mezcla de solubilización. El sistema de fase resultante se incubó con una agitación continua y se suministró nitrógeno durante una hora adicional. La inspección de una alícuota de 14,5 mL centrifugada del sistema de fases mostró que contenía 11,2 mL de fase ligera clara y 3,3 mL de fase pesada que contenía sólidos. Después de la incubación, el sistema de fase se dividió entre dos botellas de centrifugación de 1 L y se centrifugó para separar las fases. La decantación de las fases separadas resultó en 1,2 L de la fase ligera clara. El análisis HPLC de fase inversa mostró que la fase ligera contenía un 82% de la hGH contenida en el sobrenadante de solubilización.

Se precipitó hGH desde la fase ligera aislada mediante el ajuste del pH a 4. Una alícuota de la suspensión de precipitado se colocó en un tubo tapado de 15 mL y se clarificó mediante centrifugación. Después de la centrifugación, el sobrenadante claro se decantó en un nuevo tubo y el gránulo se resuspendió en 2,5 mL en 6 M de guanidina-HCl, 50 mM de Tris-HCl (pH 9), 0,1 M de DTT. El análisis HPLC de fase inversa mostró que el gránulo resuspendido contenía un 92% del hGH originalmente contenido en la fase ligera, mientras que el sobrenadante contenía menos de 1%.

Replegado de la Hormona de Crecimiento Humano

Se preparó la fase ligera que contenía hGH no nativo usando el procedimiento de solubilización y extracción acuosa descrito anteriormente. Se prepararon tampones de replegado en tubos de cultivo de poliestireno de 15 mL mediante la adición de cantidades apropiadas de los siguientes componentes químicos en seco: urea, guanidina-HCl, NaCl, Na_{2}SO_{4}, y etanol de grado reagente. Cada tubo recibió 0,1 mL de una solución de stock de tampón 50X que contenía 1 M de Tris-HCl (pH 8), 25 \muM de CuCl_{2} o 1 M de glicina (pH 10), 25 \muM de CuCl_{2}. Se añadieron otros componentes químicos para tener la concentración indicada en un volumen final de 5 mL. Cada tubo que contenía componentes de tampón de replegado se llevó a un volumen final de 4,5 mL con agua purificada.

Se inició el replegado de hGH diluyendo 0,5 mL de fase ligera que contenía hGH reducida en los tampones de replegado preparados previamente proporcionando una concentración de hGH inicial de unos 0,05 mg/mL. Los tubos se taparon y se agitaron en horizontal en un agitador orbital. Cada tubo contenía 5 mL de líquido y 10 mL de aire. Se dejó que se produjera en replegado durante 12 horas, después de las cuales las muestras se recogieron, se diluyeron mediante un factor de 2 en un tampón acidificado que contenía 50 mM de ácido acético (pH 3), 50 mM de NaCl y se analizaron mediante HPLC de fase inversa para determinar el contenido de hGH plegado correctamente.

El objetivo de este experimento es mostrar el efecto de la composición de tampón de replegado sobre el rendimiento de la hGH correctamente plegada obtenida durante el replegado. Se investigaron los siguientes aspectos de la composición de tampón de replegado: tipo y concentración de sal (0,2 M de Na_{2}SO_{4}, 0,5 M de NaCl), tipo y concentración de caótropo (0,5, 4 M de urea; o 0,5, 2 M de guanidina-HCl), concentración de solvente (0,10% [v/v] etanol), y tipo y pH del tampón (Tris-HCl pH 8, glicina pH 10). Los rendimientos obtenidos con las combinaciones seleccionadas de estos componentes se muestran en la Tabla VIII. La inspección muestra que el mayor rendimiento de gGH correctamente plegado se obtuvo mediante replegado bajo las siguiente condiciones: 20 mM de glicina (pH 10), 0,5 M de guanidina, 0,5 M de NaCl, 10% (v/v) etanol, y 0,5 \muM de CuCl_{2} (muestra # 5).

TABLA VIII

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El experimento descrito en este ejemplo se diseñó para permitir un análisis estadístico multifactorial de los datos de rendimiento de hGH correctamente replegado para determinar la importancia de todos los factores por separado. Los resultados de este análisis estadístico se muestran en la Tabla IX.

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TABLA IX

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Los resultados anteriores muestra que se puede solubilizar y excretar hGH recombinante a partir de células mediante la adición de caótropo y reductante al caldo de fermentación alcalino (rendimiento del 30% aproximadamente de promedio). Se pueden obtener rendimientos durante la solubilización si las células se lisan antes de la adición de agentes de solubilización (un 50% de mejora del rendimiento aproximadamente). Otras pequeñas diferencias durante la solubilización incluyen un rendimiento mayor con guanidina que con urea (aproximadamente una mejora del rendimiento del 10%) y un mayor rendimiento con una concentración de caótropo moderada que con una concentración de caótropo baja (aproximadamente un 20% de mejora del rendimiento usando 4 M más que 2 M).

El procedimiento de extracción acuosa se comportó de una manera virtualmente idéntica durante la separación de hGH no nativa de la biomasa que durante la separación de IGF-I no nativo de la biomasa. La única diferencia de nota implica una pequeña preferencia para la concentración de caótropo mayor durante la extracción (aproximadamente un 5% de mejora del rendimiento usando 4 M de urea más que 2 M). La inclusión de una concentración de caótropo mayor durante la extracción no afectó de manera significativa la concentración de polímero y sal necesarios para producir un sistema de dos fases en el que el polipéptido no nativo deseado se enriquece en fase ligera y los elementos sólidos de la biomasa sedimentan en la fase pesada. De una manera similar, la lisis mecánica de las células antes de la solubilización no afectó al rendimiento de la extracción.

Tomadas juntas, estas diferencias indican en general que la hGH de proteína mayor prefiere condiciones caotrópicas de desnaturalización más fuertes para la solubilización y se excreta menos fácilmente de la célula permeabilizada que la proteína IGF-I menor.

En conclusión, los resultados descritos anteriormente para hGH muestran claramente que el procedimiento reivindicado es aplicable al aislamiento de hGH no nativa y a IGF-I. La IGF-I y la hGH son proteínas substancialmente diferentes, ya que difieren de manera significativa en muchas de sus propiedades. Específicamente, tienen diferentes secuencias de aminoácidos, diferentes pesos moleculares, diferentes números y diseños de uniones de disulfuro, y diferentes puntos isoeléctricos. A pesar de estas diferencias, la IGF-I y la hGH presentan un comportamiento muy similar durante su separación extractiva de los sólidos de la biomasa mediante el procedimiento de la presente invención.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

\hskip3.9cm

Builder, Stuart

\hskip3.9cm

Hart, Roger

\hskip3.9cm

Lester, Phillip

\hskip3.9cm

Reifsnyder, David

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Replegado de Polipéptidos

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 460 Point San Bruno Blvd

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(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

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(E)

COUNTRY: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO QUE SE PUEDE LEER CON ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Diskette 5,25 pulgadas, 360 Kb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: patin (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/110664

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-AGOSTO-1993

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Hasak, Janet E.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 28.616

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/DOCKET NUMBER: 804P1PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 415/225-1896

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 415/952-9881

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 910/371-7168

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 485 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\hskip0.89cm

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGGCCGGT CCGGAAACTC TGTGCGGCGC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCCAGGCC TTTGAGACAC GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

1000

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCCAGGGC TTTGAGACAC GCCACGACTT GACCAACTGC GAG

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGGCCTCC CCATATTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGAGGGGTA TAAGGAGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 67 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

1001

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

1002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1 DNA Way

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): CA 94080-4990

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Replegado de Polipéptidos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMATO QUE SE PUEDE LEER CON ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Diskette 3,5 pulgadas, 1,44 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WinPatIn (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: EP 04006513.8

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: EP 94927917.8

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-AGOSTO-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US94/09120

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-AGOSTO-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/110,664

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-AUG-1993

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 485 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGGCCGGT CCGGAAACTC TGTGCGGCGC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCCAGGCC TTTGAGACAC GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

1003

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCCAGGGC TTTGAGACAC GCCACGACTT GACCAACTGC GAG

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGGCCTCC CCATATTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGAGGGGTA TAAGGAGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 67 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

1004

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

1006

Claims (14)

1. Procedimiento para la reactivación de IGF-I incorrectamente plegado contenido en células huésped, cuyo procedimiento comprende:

(a) aislar dicho IGF-I de las células huésped;

(b) mantener dicho IGF-I en un tampón alcalino que comprende un agente caotrópico y una agente reductor en una concentración suficiente para su solubilización; y

(c) incubar dicho IGF-I solubilizado en una concentración de 0,1 a 15 mg/ml aproximadamente en un tampón de plegado de pH 7-12 que comprende aproximadamente un 5-40% (v/v) de un solvente aprótico alcohólico o polar, aproximadamente 0,2 a 3 M de un alcalino térreo, metal álcali, o sal de amonio, aproximadamente 0,1 a 9 M de un agente caotrópico y aproximadamente 0,1 a 15 \muM de una sal de cobre o manganeso, en el que se introduce una fuente de oxígeno, de manera que el replegado del IGF-I se produce durante la incubación.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente caotrópico se selecciona entre tiocianato de sodio, hidrocloruro de guanidina o urea.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el tampón de plegado comprende además un agente reductor.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, para la etapa (c) el agente caotrópico es urea en una concentración de 1 a 3 M aproximadamente y el agente reductor es uno seleccionado entre ditiotreitol, o cisteína en una concentración de 1 a 5 mM aproximadamente en un pH de 8 a 11 aproximadamente o es hidrocloruro de guanidina en una concentración de 0,1 y 0,5 M aproximadamente y el agente reductor es ditiotreitol, o cisteína en una concentración de 1 a 5 mM aproximadamente en un pH de 8 a 11 aproximadamente.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el solvente es metanol, etanol, iso-propanol, n-propanol, t-butanol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, N-metilpirrolidona, tetrahidrofurano, dioxano, glicerol, acetonitrilo, o propileno glicol, y/o el alcalino térreo, metal álcali, o sal de amonio es NaCl, Na_{2}SO_{4}, MgCl_{2}, MgSO_{4}, NH_{4}Cl, o (NH_{4})_{2}SO_{4}, y la sal de cobre o manganeso es un cloruro, o un sulfato.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el tampón de plegado está en una concentración de aproximadamente 20 mM de glicina en un pH de 10-11 aproximadamente y comprende aproximadamente un 20% de etanol, aproximadamente 1 M de NaCl, aproximadamente 1 mM de ditiotreitol, aproximadamente 2 M de urea, y aproximadamente 0,01 a 0,5 \muM de cloruro de cobre.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el IGF-I se aísla de células procarióticas.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que para la etapa (b) el pH está comprendido entre 8 y 11.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que para el etapa (c) el replegado se realiza a una temperatura comprendida entre 25ºC y 37ºC.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que para la etapa (b) y/o la etapa (c) el tampón se selecciona entre CAPSO, AMP, CAPS, CHES, TRIS HCL o glicina.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el tampón está en una concentración de aproximadamente 20 mM y en un pH de entre 8,5 y 11.

12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que para la etapa (c) el tampón de plegado incluye un osmolito, seleccionado entre 0,25 y 1 M de sucrosa o 1 a 4 M de glicerol.

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que para la etapa (c) el polipéptido se diluye con el décimo tampón de replegado.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que para la etapa (c) el polipéptido se dializa contra el tampón de replegado.