ES2281341T3

ES2281341T3 - Lectina humana recombinante que se une a manano.

Info

Publication number: ES2281341T3
Application number: ES00925097T
Authority: ES
Inventors: Steffen Thiel; Jens Christian Jensenius; Thomas Vorup Jensen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-10
Publication date: 2007-10-01
Anticipated expiration: 2020-05-10
Also published as: NO20015506L; DE60030173T2; US7439224B2; PT1181363E; DK1181363T3; AU779404B2; CA2372128A1; DE60033147T2; US7202207B2; AU4393500A; US20070197428A1; JP2002544286A; PT1181038E; WO2000069894A2; ATE352620T1; ATE264111T1; AU781135B2; EP1181038B1; DE60009896T2; RU2005125625A

Abstract

Un procedimiento para aislar una composición de oligómeros de lectina humana que se une a manano (MBL), que tienen una distribución de tamaños, en la que al menos 50% de los oligómeros tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa, que comprende: - obtener una preparación de oligómeros de MBL humana, - someter tal preparación a cromatografía de afinidad usando una matriz derivatizada con carbohidratos, que tiene afinidad para oligómeros de MBL, donde dicha matriz derivatizada con carbohidratos no tiene afinidad detectable para subunidades monómeras de MBL y donde la matriz como tal está exenta de carbohidratos; y - obtener un eluato que comprende la composición de MBL recombinante humana aislada.

Description

Lectina humana recombinante que se une a manano.

La invención se refiere a un procedimiento para preparar una composición que comprende MBL, y al tratamiento de enfermedades y trastornos del sistema inmunitario que comprenden el tratamiento de deficiencias en el sistema de defensa inmunitario. Más particularmente, la invención se refiere al tratamiento de enfermedades o enfermedades o deficiencias latentes de la lectina que se une a manano (MBL) que están asociadas con una susceptibilidad incrementada a las infecciones. La invención se refiere además a la preparación de una nueva construcción de expresión que codifica MBL humana, una nueva preparación recombinante de MBL humana y, además, comprende el uso de este compuesto en métodos para el tratamiento de enfermedades, como aquéllas relacionadas con quimioterapia inmunosupresiva y/o enfermedades relacionadas con deficiencias de MBL, incluyendo enfermedades latentes, es decir, que no tienen una necesidad de tratamiento en ese momento. El tratamiento está destinado a seres humanos y animales, en los que el sistema inmunitario parece actuar de forma similar al sistema inmunitario humano.

Antecedentes de la invención

El sistema inmunitario comprende un conjunto complejo de mecanismos celulares y moleculares que reconoce y elige como objetivo microorganismos patógenos o las células infectadas con los mismos. Recientemente, la MBL ha adquirido gran interés como parte importante del sistema inmunitario innato, es decir, el sistema inmunitario que es funcional en el momento de nacer, en contraste con el sistema de defensa inmunitario adaptativo, que sólo adquiere durante la infancia su poder total de protección del cuerpo (Janeway et al., 1999). Tras la unión de los carbohidratos a las superficies microbianas, la MBL interviene en la activación de la cascada del complemento, una serie de etapas de activación enzimática, que marcan eventualmente el objetivo para destrucción mediante fagocitosis o mediante lisis del microorganismo (Law & Reid, 1995). El sistema del complemento se activa al menos a través de tres vías distintas, denominadas, la vía clásica, la vía alternativa y la vía de la MBLectina (Janeway et al., 1999). La vía clásica se inicia cuando el factor 1 del complemento (C1) reconoce la inmunoglobulina unida a superficie. El complejo C1 está compuesto por dos enzimas proteolíticas, C1r y C1s, y una parte no enzimática, C1q, que contiene dominios que reconocen la inmunoglobulina. C1q y MBL comparten características estructurales, teniendo ambas moléculas la apariencia de un ramillete cuando se visualizan mediante microscopía electrónica. Asimismo, como C1q, MBL se encuentra formando un complejo con dos enzimas proteolíticas, las proteasas asociadas a lectina que se une a manano (MASP). Las tres vías generan una convertasa de factor 3 del complemento (convertasa C3), unida a la superficie de la superficie activadora, es decir, el patógeno microbiano elegido como objetivo. La conversión de C3 en C3b unida a la superficie es crucial en el procedimiento de eliminación del patógeno microbiano mediante fagocitosis o lisis (Janeway et al., 1999).

La lectina que se une a manano (MBL), también denominada proteína que se une a manano o proteína que se une a manosa (MBP), se caracterizó primeramente en conejos (Kawasaki et al., 1978). La lectina que se une a manano (MBL) pertenece a un grupo de lectinas solubles dependientes de Ca^{2+} (tipo C), que contienen un dominio de reconocimiento de carbohidratos C-terminal y una región análoga al colágeno, caracterizada por motivos de triplete de glicina (Gly) repetidos, seguidos por dos aminoácidos distintos de glicina. Por tanto, MBL pertenece al grupo de las colectinas, es decir, lectinas de tipo C con regiones análogas al colágeno, que comprende además las proteínas tensioactivas pulmonares A y D, así como la conglutinina y CL-43, éstas, sin embargo, sólo se han caracterizado en ganado vacuno (Holmskov et al., 1994). La proteína MBL humana está compuesta por, como máximo, 18 cadenas polipeptídicas de 32 kDa (Lu et al., 1990), comprendiendo cada una un segmento N-terminal corto de 21 aminoácidos que incluye tres residuos de cisteína, seguidos por 7 repeticiones del motivo análogo al colágeno Gly-X-Y, interrumpido por un residuo de Gln, seguido por otras 12 repeticiones de Gly-X-Y. Una "región de cuello" pequeña de 34 residuos une el dominio de lectina C-terminal dependiente de calcio de 93 aminoácidos con la parte de la molécula análoga al colágeno (Sastry et al., 1989). Tres cadenas polipeptídicas MBL se unen en una subunidad MBL. La MBL consiste en, como máximo, seis tallos de 15 nm de subunidades de MBL, unidos en la base del ramillete. Los últimos trabajos caracterizaron MBL en roedores (Mizuno et al., 1981; Oka et al., 1988), ganado vacuno (Holmskov et al., 1993a; Kawai et al., 1997) y pollo (Oka et al., 1985; Laursen et al., 1995; Laursen et al., 1998). En roedores (Drickamer et al., 1986) y macaco Rhesus (Mogues et al., 1996), se han identificado dos tipos de genes de MBL, denominados normalmente formas A y C. En ratas, se encontró un pseudogen MBL'B' (Drickamer et al., 1986) y, recientemente, se clonó también un pseudogen MBL del genoma humano, sugiriendo el análisis secuencial que éste era un residuo de un gen MBL-A de primate (Guo et al., 1998). La MBL humana fue caracterizada por Kawasaki et al. en 1983. Sólo se ha identificado un gen MBL humano activo, que comprende cuatro exones con tres intrones del gen de MBL que se extienden aproximadamente 6 kb, y está localizado en 10q11.2-q21 (Sastry et al., 1989; Taylor et al., 1989).

Las regiones análogas al colágeno de las tres cadenas polipeptídicas, se combinan para formar una subunidad que está estabilizada covalentemente mediante puentes disulfuro. Las subunidades individuales están unidas mediante puentes disulfuro, así como mediante interacciones no covalentes (Lu et al., 1990).

Sin embargo, la posición de estos puentes disulfuro no se ha resuelto totalmente. El análisis SDS-PAGE en condiciones no reductoras de MBL muestra bandas con un peso molecular aparente (m.w.) superior a 200 kDa, representando presumiblemente bloques de 3, 4, 5 e incluso 6 subunidades reunidas (Lu et al., 1990).

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El número real de subunidades en la proteína MBL humana natural, ha sido controvertido. Lipscombe et al. (1995) obtuvieron datos mediante el uso de ultracentrifugación, sugiriendo que el 25% de la MBL sérica humana estaba formada por 2-3 subunidades, y sólo una fracción menor alcanzaba el tamaño de 6 subunidades. La cuantificación relativa se realizó mediante densitometría de transferencias Western desarrolladas mediante quimioluminiscencia. La eficiencia inferior al transferir proteínas de elevado peso molecular sobre membranas, comparado con proteínas de peso molecular inferior, hace complicado el análisis mediante esta metodología. Lu et al. (1990) descubrieron mediante análisis SDS-PAGE de fracciones de cromatografía de intercambio iónico, que las especies predominantes de cadenas de subunidades MBL unidas covalentemente estaban formadas por tetrámeros, mientras que sólo los complejos pentámeros o hexámeros activaban el complemento. El análisis de cromatografía de permeación de gel (GPC), en contraste, sugiere que la MBL es comparable en tamaño con el complejo C1. La GPC se puede realizar en condiciones que permitan un estudio de la importancia de las interacciones proteína-proteína débiles en la formación de moléculas MBL y, en combinación con técnicas de ensayo estándar de MBL, también permite la determinación sin desviaciones del contenido de MBL en las fracciones de GPC.

El papel in vivo de la MBL parece relacionarse principalmente con el sistema inmunitario innato, como factor humoral que interviene en alguna actividad antimicrobiana, que no requiere maduración en discriminación propio/no propio como el sistema de defensa inmunitario adaptativo basado en el reconocimiento de células T- y B- (Janeway et al., 1999; Vorup-Jensen et al., 1998). En el reconocimiento de objetivos para la unión de MBL interviene el dominio de lectina tipo C. Los CRDs de tipo C se encuentran en proteínas con una aparición muy generalizada, tanto en la perspectiva filogenética como funcional. En el caso de MBL, el CRD reconoce preferentemente hexosas con grupos ecuatoriales 3- y 4-OH, como manosa y N-acetil-glucosamina, mientras que los carbohidratos que no cumplen este requerimiento estérico, como galactosa y D-fucosa, no se unen (Weis et al., 1992).

Los CRDs terminales están distribuidos de tal manera que, para permitir la unión de los tres dominios, las superficies elegidas como objetivo deben presentar sitios de unión con una separación de aproximadamente 53 \ring{A} (Sheriff et al., 1994; Wis & Drickamer, 1994). Esta propiedad de "reconocimiento de patrón" puede contribuir además a la unión selectiva de superficies microbianas. La selectividad del carbohidrato es, obviamente, un aspecto importante de la discriminación propio-no propio por MBL, y en él interviene probablemente la diferencia en la prevalencia de residuos de N-acetil-glucosamina sobre las superficies microbianas, siendo un ejemplo el elevado contenido de manosa en la pared celular de levaduras como Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans. Las estructuras de carbohidratos en la glicosilación de proteínas de mamíferos se completan normalmente con ácido siálico, que evita la unión de MBL a estos carbohidratos oligómeros y, por tanto, evita el reconocimiento de MBL de superficies "propias". Asimismo, la estructura trímera de cada subunidad MBL puede ser importante para el reconocimiento del objetivo.

Se han realizado diversos estudios sobre aspectos de la estructura y biosíntesis de MBL, mediante el uso de sistemas de síntesis in vitro. La estructura del CRD de MBL-A de rata se resolvió mediante cristalización de proteína recombinante producida en E. coli (Weis et al., 1992), y la estructura del CRD de MBL-C de rata se resolvió de forma similar, mediante el uso de material recombinante (Ng et al., 1996). Más recientemente, la estructura cristalina del trímero de CRDs reunida mediante la expresión de la "región del cuello" y el CRD, ha confirmado los estudios previos sobre la "región del cuello", en cuanto a la reunión de las tres cadenas mediante puentes de hidrógeno entre las hélices-\alpha de espiras arrolladas (Sheriff et al., 1994; Wis & Drickamer, 1994). Los CRDs y fragmentos "cuello-CRD" de otras colectinas se han expresado asimismo en sistemas basados en E. coli, sin el requerimiento de protocolos de replegamiento, para ganar actividad funcional. Por tanto, la síntesis in vitro de dominios MBL se puede realizar, tanto con respecto a las propiedades funcionales de reconocimiento de carbohidratos como a la propiedad estructural de trimerización, en sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos simples.

Se ha abordado la síntesis in vitro de colectinas completas mediante técnica recombinante, principalmente mediante el uso de líneas celulares de mamífero, p.ej., células CHO y COS, como células hospedadoras. Los intentos para expresar MBL en células de insecto sólo produjeron MBL de bajo peso molecular (Ma et al., 1996), estando formadas las proteínas recombinantes casi enteramente por subunidades, dímeros y trímeros de cadenas de subunidades de MBL.

Se ha descrito en diversos estudios la síntesis recombinante de MBL humana en líneas celulares de mamífero. En un estudio de la función opsónica, es decir, la capacidad de incrementar la absorción de MBL por macrófagos, Kuhlman et al. (1989) usaron rMBL producida en células CHO, que mostraba la misma actividad opsónica que la MBL natural. No se realizó la caracterización de rMBL con respecto a la estructura y modificaciones post-traducción. De forma similar, Schweinle et al. (1993) produjeron rMBL y una forma truncada de rMBL que carecía de la cola análoga al colágeno, mediante transfección estable de células CHO. La actividad de las proteínas recombinantes se midió mediante deposición de C3 sobre Salmonella Montevideo preincubada con MBL y suero humano diluido empobrecido en anticuerpos frente a S. Montevideo, como fuente de complemento. Sorprendentemente, la actividad de la MBL completa recombinante era tan elevada como para la MBL natural, aunque el análisis de rMBL yodada mediante ultracentrifugación mostraba que la mayoría de la proteína era material de peso molecular bajo. No se incluía la comparación de la rMBL producida por células CHO con MBL natural, referente al tamaño, bien a través de SDS-PAGE, ultracentrifugación o GPC. En un estudio de Super et al. (1992), se presentaron perfiles de GPC de rMBL producidos en células de hibridoma Sp2/OAg14 de ratón, indicando que la distribución por tamaños de rMBL purificada del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de afinidad de carbohidratos era notablemente diferente de la rMBL aislada a través de cromatografía de afinidad de anticuerpos anti-MBL, con respecto a la distribución por tamaños.

Recientemente, Ohtani et al., (1999) publicaron datos sobre rMBL humana producida en células CHO, que proporcionaba un rendimiento de 120 \mug por ml de medio de cultivo. Esta se obtuvo usando un vector de expresión que permitía la selección de transfectantes mediante resistencia a G418 y posterior amplificación génica a través de selección con sulfoximina de metionina (MSX). La actividad funcional relativa a la selectividad de carbohidratos era idéntica a la de la proteína natural, mientras que se descubrieron algunas diferencias en la capacidad para activar el complemento, según se midió a través de la lisis de eritrocitos. Tanto el análisis GPC como SDS-PAGE mostraron la presencia de formas de MBL de peso molecular más elevado, aunque los autores destacaron que la distribución total de tamaños difería significativamente de la MBL purificada del plasma. De forma interesante, el patrón de hidroxilación era esencialmente idéntico a la MBL natural, incluso en ausencia de ácido ascórbico añadido. En relación con las modificaciones postraducción, se debería destacar de este estudio que la hidroxilación apropiada de rMBL no garantiza una estructura similar a la MBL natural.

El locus de MBL humana es polimórfico, con tres mutaciones conocidas localizadas en la región que codifica la proteína (Sumiya et al., 1991; Lipscombe et al., 1992a; 1992b; Madsen et al., 1994) y otras que afectan a elementos reguladores del gen (Madsen et al., 1995). Todas las mutaciones conducen aparentemente a un nivel significativamente más bajo de MBL en fluidos corporales de los individuos afectados. La variación en la concentración de MBL, según se midió en el suero, es, por tanto, aproximadamente tres órdenes de magnitud, variando de 2-5 \mug de MBL/ml hasta menos de 10 ng de MBL/ml en individuos homozigóticos para las mutaciones que afectan a las regiones codificadoras de proteína. El hallazgo de que la deficiencia de MBL estaba asociada con las infecciones reiteradas en niños que fueron diagnosticados como afectados por un defecto opsónico (Super et al., 1989; Sumiya et al., 1991), enfatizó la correlación entre concentraciones de MBL insuficientes y la reducción en la defensa frente a microorganismos. Se ha sugerido que las colectinas intervienen, además de la interacción con microorganismos, en la defensa antivírica (Hartshorn et al., 1993; Malhotra et al., 1994). Los estudios in vitro sobre la interacción con el virus de la inmunodeficiencia adquirida humana (VIH) mostraron que la MBL inhibía la infección de células T CD4 positivas y células U937. Los estudios clínicos también sugieren un papel para MBL como defensa de primera línea frente al VIH. El período de tiempo desde el establecimiento de los síntomas del SIDA hasta la etapa terminal, parece diferir entre pacientes deficientes en MBL y pacientes con concentraciones normales de MBL. Asimismo, la susceptibilidad a contraer la infección parece ser significativamente mayor entre los individuos deficientes en MBL, ya que la deficiencia de MBL ocurre más frecuentemente entre pacientes infectados con VIH que en los testigos sanos (Nielsen et al., 1995; Garred et al, 1997a). Las deficiencias del complemento hereditarias contribuyen al desarrollo del lupus eritematoso sistémico (SLE), como se ha demostrado para los casos de deficiencia de C1, C2 y C4 (descrito por Tan & Arnett, 1998). Varios estudios han sugerido además que la deficiencia de MBL es un factor de riesgo en el desarrollo de SLE (Davies et al., 1995; Lau et al., 1996; Ip et al., 1998), aunque el papel de la MBL no está bien definido. Una sugerencia, resultante de las explicaciones para las otras deficiencias de complemento como sustancias causantes en SLE, argumenta que el defecto en la fijación de complemento debido a la deficiencia de MBL, conduce a una limpieza del complemento de mala calidad (Ip et al., 1998), apuntando por tanto a la MBL como participante en el mantenimiento de la homeóstasis. Otra evidencia clínica sugiere que la MBL juega un papel importante en biología reproductiva. Los trabajos recientes demuestran la asociación entre abortos repetitivos y el nivel de MBL (Kilpatrick et al., 1995; Christiansen et al., 1999).

Sólo se ha descrito en dos estudios una estrategia para tratar a individuos sintomáticos con MBL insuficiente, destinada a reconstituir la vía de la MBL. Un defecto opsónico observado entre algunos niños, hasta el momento caracterizado sólo por la manifestación clínica de infecciones frecuentes, se trató administrando plasma (Soothill & Harvey, 1976) mientras que, en un estudio más reciente, se inyectó MBL derivada del plasma en una niña de dos años (Valdimarsson et al., 1988). En ambos estudios, se describió una mejora de la salud, aunque el número pequeño de pacientes implicado en estos estudios, obviamente limita las conclusiones relativas a MBL como sustancia terapéutica. No se han realizado estudios clínicos con rMBL. Un estudio de Ma et al. (1999), mostraba una actividad antitumoral de rMBL en ratones, en la que intervenía un sistema de expresión vírico.

Según parece a partir de lo anterior, se han realizado diversos intentos para producir rMBL en sistemas in vitro de una forma, bien idéntica o con un elevado grado de similitud a la proteína natural. Sin embargo, se han demostrado limitaciones significativas en la capacidad de los sistemas de síntesis in vitro conocidos en el presente para producir dicha rMBL.

Sumario de la invención

Un aspecto de la presente invención es un procedimiento para aislar o purificar MBL humana, a fin de obtener una composición de polipéptidos que tenga una distribución de tamaños que sea, al menos, idéntica en un 50% a la MBL humana existente en la naturaleza.

Por tanto, la invención se refiere a un procedimiento para aislar una composición de oligómeros de MBL humana que tienen una distribución de tamaños en la que, al menos 50% de los oligómeros, tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa, que comprende:

-: obtener una preparación de oligómeros de MBL humana.

-: someter dicha preparación a cromatografía de afinidad, usando una matriz derivatizada con carbohidratos.

-: obtener un eluato que comprende la composición de MBL recombinante humana.

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Otro aspecto de la presente invención proporciona una nueva forma de MBL que se prepara mediante tecnología de ADN recombinante in vitro o in vivo. Más específicamente, la invención se refiere a MBL recombinante (rMBL) en una forma nueva, que los inventores encontraron sorprendentemente que se podía sintetizar mediante el siguiente procedimiento:

Un procedimiento para producir una composición de lectina recombinante humana que se une a manano (MBL), que tiene un perfil de distribución de tamaños en el que al menos 50% de los oligómeros tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa, que comprende las siguientes etapas:

-: preparar una construcción de expresión génica que codifica un péptido de MBL humana o uno de sus equivalentes funcionales, obtenido por modificación de la secuencia peptídica de la MBL humana (SEQ ID Nº:1),

-: transformar un cultivo de células hospedadoras con la construcción,

-: cultivar el cultivo de células hospedadoras, obteniendo así la expresión y secreción del polipéptido al medio de cultivo, seguido por

-: someter dicho medio de cultivo a cromatografía de afinidad, usando una matriz derivatizada con carbohidrato con afinidad para oligómeros de MBL, no teniendo dicha matriz derivatizada con carbohidrato afinidad detectable por las subunidades monómeras de MBL, y estando la matriz como tal exenta de carbohidratos; y

50% de los oligómeros tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa, cuando se analizaba mediante SDS-PAGE y/o transferencia Western. En la determinación de la cantidad de MBL con un peso molecular aparente superior a 200 kDa, se puede usar análisis densitométrico, en el que las bandas de proteína sobre un gel de SDS-PAGE se tiñen con tinción proteica, p.ej. tinción de plata o tinción de Coomassie Blue, o tinción específica con transferencia Western, usando un anticuerpo específico de MBL.

Descripción detallada de la invención

El sistema inmunitario tiene una capacidad considerable para evitar infecciones, lo cual tiene una importancia decisiva para la homeóstasis y, consecuentemente, para la supervivencia y conservación de la vida. Por tanto, tiene un interés considerable el identificar compuestos que sean activos en tales procedimientos. Una investigación intensa en esta década ha descubierto la lectina que se une a manano como una macromolécula muy versátil, que, p.ej., se cree que es activa en el sistema inmunitario innato.

Mediante la presente invención, es posible producir una composición de lectina recombinante humana que se une a manano (MBL), que tiene un perfil de distribución de tamaños idéntico, al menos en un 50%, a la MBL humana existente en la naturaleza, según se describió anteriormente.

La composición de MBL se produjo según se describió anteriormente y se sometió a una cromatografía de afinidad capaz de separar los oligómeros superiores de MBL, de los demás oligómeros.

El medio de cultivo que comprendía una diversidad de oligómeros de MBL se sometió a una cromatografía de afinidad sobre una matriz derivatizada con carbohidratos, que tenía una afinidad al menos dos veces superior para tetrámeros, pentámeros y/o hexámeros de subunidades de MBL, que para subunidades de MBL.

Por tanto, se proporciona una composición de MBL que tiene una distribución de tamaños idéntica al menos en un 50%, p.ej. idéntica en un 60%, idéntica en un 70%, idéntica en un 80%, idéntica en un 90% o idéntica en un 95%, a la MBL existente en la naturaleza. La distribución de tamaños es, preferiblemente, sustancialmente idéntica a la MBL existente en la naturaleza, lo cual significa que la identidad es al menos de 99%.

La matriz derivatizada con carbohidratos no tiene sustancialmente afinidad con subunidades y/o dímeros de subunidades de MBL. Preferiblemente, la matriz derivatizada con carbohidratos tiene afinidad para, sustancialmente, sólo subunidades de MBL recombinante tetrámeras, pentámeras y/o hexámeras.

Se prefiere que los oligómeros superiores de la subunidad, como tetrámeros, pentámeros y/o hexámeros, dominen la composición. Por tanto, en la composición la proporción de tetrámeros, pentámeros y/o hexámeros respecto a las subunidades y/o dímeros es, preferiblemente, al menos 2:1, preferiblemente al menos 5:1.

En una realización preferida, la proporción de la suma de tetrámeros, pentámeros y hexámeros a la suma de subunidades y dímeros, es preferiblemente al menos 2:1, más preferiblemente al menos 5:1.

La matriz se puede derivatizar con cualquier carbohidrato o mezcla de carbohidratos a la que se una MBL y para la que se favorezca la unión de los oligómeros superiores de MBL. La matriz es preferiblemente una matriz derivatizada con hexosa, como manosa- o una N-acetil-glucosamina, p.ej. con la mayor preferencia una matriz de manosa.

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La selectividad de la matriz derivatizada con carbohidratos se obtiene asegurando que la matriz como tal, es decir, la matriz sin derivatizar, no tiene sustancialmente afinidad para subunidades MBL, en particular no tiene afinidad para para trímeros de MBL u oligómeros más pequeños. Esto se puede asegurar cuando la matriz como tal está exenta de carbohidratos. En particular, la matriz no debería contener nada de Sepharosa o análogos. Se prefiere que la matriz esté formada por un material polímero que no contenga carbohidratos, como glóbulos de Fractogel® de TSK. La matriz puede estar en cualquier forma adecuada para la cromatografía, especialmente en forma de glóbulos, como glóbulos de plástico.

Tras la aplicación de los medios de cultivo, la columna se lava, preferiblemente usando tampones no desnaturalizantes, que tienen una composición, pH y fuerza iónica que produce la eliminación de proteínas, sin eluir los oligómeros superiores de MBL. Tal tampón puede ser TBS. La elución de MBL se realiza con una sustancia de desorción selectiva, capaz de eluir eficientemente los oligómeros superiores de MBL, como TBS que contiene una sustancia de desorción, como EDTA (5 mM por ejemplo) o manosa (50 mM por ejemplo), y se recogen los oligómeros de
MBL.

Según la invención, las secuencias del gen de MBL pueden ser del gen de MBL humano o de genes de MBL de otras especies animales, en las que el sistema inmunitario en este aspecto actúa como el sistema inmunitario humano. En el Ejemplo 1 más adelante se describe un ejemplo de una realización preferida de una preparación de una MBL recombinante según la invención, en el que dicha MBL recombinante se prepara mediante el uso de un vector de expresión que comprende secuencias del gen MBL humano. En el Ejemplo 1 y en la Figura 2 se puede encontrar una ilustración del vector de expresión en dicha realización preferida del método de preparación.

La invención se refiere también al uso de vectores de expresión que comprenden secuencias, que son derivados funcionales de las secuencias del gen MBL humano. Dichos derivados funcionales son secuencias que contienen alteraciones de pares de bases que conducen a diferencias no funcionales o esencialmente no funcionales del vector de expresión, y la MBL preparada de esta forma tiene una funcionalidad comparable a la MBL preparada mediante el uso de un vector de expresión que comprende las secuencias sin alterar del gen de MBL humana.

Además del método de purificación, se prefiere que la construcción de expresión génica y la célula hospedadora, favorezcan también la producción de oligómeros superiores.

Consecuentemente, la construcción de expresión génica comprende, preferiblemente, al menos una secuencia de intrón del gen de MBL humana o uno de sus equivalentes funcionales.

Además, la construcción de expresión génica puede comprender al menos dos secuencias de exones del gen MBL humano o uno de sus equivalentes funcionales. Más preferiblemente, la construcción de expresión génica comprende al menos tres secuencias de exones del gen MBL humano o de uno de sus equivalentes funcionales. Cuando comprende más de un exón, las secuencias de exones están preferiblemente alineadas como en el gen MBL humano.

Aunque se prefiere que la secuencia comprenda secuencias de intrones, puede ser conveniente para algunas aplicaciones que la construcción de expresión comprenda una secuencia de ADNc que codifique una subunidad MBL o uno de sus equivalentes funcionales.

La invención se refiere al uso de construcciones de expresión génica de MBL, más que a construcciones de ADNc de MBL, para la expresión de rMBL en líneas celulares de mamífero o animales transgénicos, para obtener MBL recombinante con propiedades estructurales en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes, sustancialmente similar a la MBL humana. "MBL humana recombinante" significa MBL humana que se expresa de ácidos nucleicos obtenidos mediante ingeniería genética y "construcciones de expresión génica de MBL" significa un vector de expresión adecuado para expresión en líneas celulares de mamífero, que contiene secuencias de exones y al menos una secuencia de intrón del gen de MBL humano, o de genes de MBL de otras especies animales, p.ej., pero no limitadas a, chimpancés y macacos Rhesus.

Preferiblemente, las secuencias de ADN codifican una secuencia polipeptídica según se muestra en SEQ ID Nº:1, o un equivalente funcional, definiéndose un equivalente funcional como anteriormente. SEQ ID Nº:1 corresponde a la secuencia de MBL que tiene un Nº de acceso de la base de datos P11226. El equivalente se puede obtener mediante una modificación de la secuencia peptídica mostrada como SEQ ID Nº:1 procesando tal secuencia una propiedad correspondiente como las secuencias mencionadas en la presente invención, pero en la que uno o más aminoácidos se han sustituido con otros. Preferiblemente, un equivalente funcional contiene sustituciones conservativas, es decir, en las que uno o más aminoácidos se sustituyen por un aminoácido que tiene propiedades similares, de forma que una persona experta en la técnica de química de proteínas esperaría que la estructura secundaria y terciaria de la proteína no cambiase. Los aminoácidos adecuados para sustituciones conservativas incluyen aquellos que tienen cadenas laterales similares funcionalmente. Por ejemplo, residuos hidrófobos; p.ej. glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina y metionina pueden reemplazar otro de tales residuos. De forma similar, las sustituciones conservativas pueden implicar intercambio de residuos hidrófilos: (p.ej.: arginina y lisina, glutamina y asparagina, treonina y serina), residuos básicos (p.ej., lisina, arginina e histidina), y/o residuos ácidos (p.ej., ácido aspártico y ácido glutámico). Los equivalentes funcionales pueden modificarse también, o alternativamente, mediante, por ejemplo, la deleción o adición de aminoácidos, o la modificación química de aminoácidos, siempre que se conserve la función del polipéptido.

El péptido de MBL aislado, incluyendo cualquiera de sus equivalentes funcionales, puede comprender en una realización al menos 80 residuos aminoácidos, p.ej., al menos 100 residuos aminoácidos, p.ej., al menos 150 residuos aminoácidos, p.ej., al menos 200 residuos aminoácidos, p.ej., al menos 220 residuos aminoácidos, p.ej. al menos 250 residuos aminoácidos.

En una realización preferida, el vector de expresión es adecuado para expresión en líneas celulares de mamífero o animales transgénicos, que contienen secuencias de exones y al menos una secuencia de intrón del gen de MBL humano, o de genes de MBL de otras especies animales, p.ej., pero no limitadas a, chimpancés y macacos Rhesus. En una realización, el cultivo de la célula hospedadora se realiza en un animal transgénico. Animal transgénico, en este contexto, significa un animal que se ha modificado genéticamente para que contenga y exprese el gen de MBL humana o sus fragmentos o análogos.

En una realización preferida, la construcción de expresión de la presente invención comprende un vector basado en un virus, como un vector basado en ADN vírico, un vector basado en ARN vírico, o un vector basado en un virus quimérico. Ejemplos de virus de ADN son citomegalovirus, Herpex Simplex, virus de Epstein-Barr, virus de Simio 40, Papilomavirus Bovino; virus Adenoasociados, Adenovirus, virus Vaccinia y Baculovirus.

En células hospedadoras de mamífero se pueden utilizar diversos sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la molécula de ácido nucleico de la invención se puede ligar a un complejo de control de transcripción/traducción de Adenovirus, por ejemplo, la secuencia del promotor tardío y secuencia conductora tripartita. Este gen quimérico se puede insertar luego en el genoma de Adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, región E1 o E3), producirá un virus recombinante que es viable y capaz de expresar un producto génico MASP-3 en hospedadores infectados (por ejemplo, véase Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659, 1984). También se pueden requerir señales de iniciación específicas para la traducción eficiente de moléculas de ácido nucleico insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En casos en los que un gen o DNAc completo, incluyendo su propio codón de iniciación y secuencias adyacentes, se inserta en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control de traducción adicionales. Sin embargo, en casos en los que sólo se inserta una parte de la secuencia codificadora, se tienen que proporcionar señales de control de traducción exógenas, incluyendo, quizás, el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación tiene que estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificadora deseada, para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales exógenas de control de traducción y codones de iniciación pueden proceder de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de expresión se puede incrementar mediante la inclusión de elementos favorecedores de la transcripción, terminadores de transcripción, etc. (véase Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:516-544, 1987).

Ejemplos de virus de ARN son el virus de los bosques de Semliki, virus Sindbis, virus Poko, virus de la Rabia, virus de la Gripe, virus Sincitial Respiratorio SV5, virus de la Encefalitis Equina de Venezuela, virus Kunjin, virus Sendai, virus de la Estomatitis Vesicular, y Retrovirus.

Ejemplos de virus quiméricos son Adenovirus, virus Sindbis y virus adenoasociados a Adenovirus.

En relación con vectores específicos, se hace referencia a Makrides, S.C., "Components of vectors for gene transfer and expression in mammalian cells", que se incorpora aquí mediante referencia.

En particular, se usa un origen de replicación del virus de Epstein-Barr o sus derivados funcionales o análogos, incluyendo el vector pREP9.

En un aspecto, la invención proporciona una construcción de expresión que codifica MBL humana, caracterizada porque comprende una o más secuencias de intrones del gen de MBL humano, incluyendo sus derivados funcionales. Adicionalmente, contiene una región promotora seleccionada de genes de virus o eucariotas, incluyendo mamíferos e insectos.

La región promotora se selecciona preferiblemente para que sea diferente del promotor de MBL humano y, preferiblemente, a fin de optimizar el rendimiento de MBL y la distribución por tamaños de oligómeros de MBL, la región promotora se selecciona para que funcione óptimamente con el vector y las células hospedadoras en cuestión.

En una realización preferida, la región promotora se selecciona de un grupo que comprende el promotor repetitivo largo del virus del Sarcoma de Rous, y el promotor temprano-inmediato de citomegalovirus, y el promotor alfa del factor de alargamiento-1.

En otra realización, la región promotora se selecciona de genes de microorganismos, como otros virus, levaduras y bacterias.

A fin de obtener mayor rendimiento de MBL recombinante, la región promotora puede comprender elementos favorecedores, como el elemento QBI SP 163 de la región no traducida del extremo 5' del gen del factor de crecimiento endotelial vascular de ratón. La construcción se usa para transformar una célula hospedadora, a fin de obtener un cultivo de células hospedadoras capaz de expresar MBL.

La síntesis de MBL recombinante se puede realizar mediante el uso de cultivos in vitro o in vivo. El cultivo de células hospedadoras es, preferiblemente, un cultivo de células hospedadoras eucarióticas. Se entiende por transformación de un cultivo de células eucarióticas, en este contexto, la introducción de ADN recombinante en las células. La construcción de expresión usada en el procedimiento se caracteriza porque la región codificadora de MBL se selecciona de genes de mamífero, incluyendo genes humanos y genes con un gran parecido con los mismos, como los genes del chimpancé. La construcción de expresión usada se caracteriza además porque la región promotora se selecciona de genes de virus o eucariotas, incluyendo células de mamífero y células de insectos.

La presente invención proporciona, por tanto, MBL recombinante, que es una forma de MBL similar a MBL humana natural, porque en su forma purificada tiene un perfil de distribución de tamaño molecular más próximo a la MBL humana natural que las conocidas hasta ahora.

El procedimiento para producir MBL recombinante según la invención, se caracteriza porque el cultivo de célula hospedadora es, preferiblemente eucariótico y, por ejemplo, un cultivo celular de mamífero. Un cultivo de célula hospedadora preferido es un cultivo de células de riñón humanas y, en una forma incluso más preferida, el cultivo celular es un cultivo de células de riñón embrionario humano (células HEK). La invención caracteriza el uso de líneas celulares HEK 293 para la producción de MBL recombinante humana. "Líneas celulares HEK 293" significa cualquier línea celular derivada de tejido renal embrionario humano, p.ej., pero no limitado a, las líneas celulares depositadas en la American Type Culture Collection con los números CRL-1573 y CRL-10852.

Otras células pueden ser fibroblasto de embrión de pollo, células de ovario de hamster, células de carcinoma cervical humano, células de melanoma humano, células renales humanas, células de endotelio vascular umbilical humano, células de endotelio cerebral humano, células tumorales de la cavidad oral, células renales de mono, fibroblasto de ratón, células renales de ratón, células de tejido conectivo de ratón, células oligodendríticas de ratón, macrófagos de ratón, fibroblastos de ratón, células de neuroblastoma de ratón, células precursoras de células B de ratón, células de linfoma B de ratón, células de plasmacitoma de ratón, células de teratocarcinoma de ratón, células de astrocitoma de rata, células de epitelio mamario de rata, COS, CHO, BHK, 293, VERO, HeLa, MDCK, WI38 y NIH 3T3.

Además, se puede elegir una cepa de células hospedadoras que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y trate el producto génico de la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y tratamiento (por ejemplo, escisión) de los productos de proteína, pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el tratamiento postraducción y modificación de proteínas y productos génicos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y tratamiento correctos de la proteína extraña expresada. A este fin, se pueden usar células eucarióticas hospedadoras que poseen la maquinaria celular para el tratamiento apropiado del tránscrito primario, glicosilación y fosforilación del producto génico. Los tipos celulares de mamífero enumerados anteriormente están entre los que podrían servir como células hospedadoras adecuadas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona MBL que se prepara mediante tecnología de ADN recombinante, p.ej. en células de mamífero o en animales transgénicos. Más específicamente, la invención se refiere a MBL recombinante (rMBL), que se sintetiza mediante:

-: preparación de una construcción de expresión génica según se definió anteriormente, que codifica un polipéptido MBL humano o uno de sus equivalentes funcionales.

-: transformación de un cultivo de célula hospedadora con la construcción,

-: cultivo del cultivo de célula hospedadora, obteniendo la expresión y secreción del polipéptido al medio de cultivo, seguido de,

-: obtención de un medio de cultivo que comprende MBL humana recombinante.

Además, la invención se refiere a la síntesis de MBL mediante

(a): preparación de una construcción de expresión que codifica MBL humana;

(b): transformación de un cultivo celular eucariótico con dicha construcción de expresión y, de este modo, obtención de un cultivo de células hospedadoras recombinantes eucarióticas;

(c): crecimiento de dicho cultivo de células hospedadoras recombinantes, bien in vitro o en forma de un animal transgénico, y, por tanto, expresión de dicha MBL humana;

(d): recogida de dicha MBL humana expresada y purificación mediante cromatografía de afinidad, según se describió anteriormente.

El cultivo de célula hospedadora se puede realizar en cualquier medio de cultivo adecuado. Ejemplos de medios de cultivo son RPMI-1640 o DMEM, complementados con, p.ej., insulina, trasferrina, selenio y suero bovino fetal.

La invención consta además de una etapa de purificación o aislamiento de MBL humana, como MBL humana de sobrenadantes de cultivo o de fluidos corporales o tejido de animales transgénicos, mediante el uso de cromatografía de afinidad de carbohidratos, según se describió anteriormente. En una realización preferida de la invención, la cromatografía de afinidad se realiza mediante matrices de manosa, hexosa o matrices derivatizadas con N-acetil-glucosamina, que son adecuadas para cromatografía de afinidad, según se describió anteriormente. En particular, se usa cromatografía de afinidad, en la que las matrices se han derivatizado con manosa. Previamente, se han empleado matrices derivatizadas con manano para recoger MBL recombinante del medio de cultivo. Mientras que las matrices derivatizadas con manano se unen tanto a formas de MBL de peso molecular elevado como bajo, el uso de matrices derivatizadas según se describió anteriormente, p.ej., con manosa, ofrece una ventaja sorprendente en la purificación de MBL recombinante, ya que esta matriz se une selectivamente a la forma de MBL recombinante que se asemeja a la MBL natural. El grado de similitud con la MBL natural se mide como superior al 50% en análisis de distribución de tamaños mediante SDS-PAGE, seguido de tinción proteica del gel como se conoce del estado de la técnica, véase, p.ej., Ma et al. (1997).

La MBL recombinante purificada se tiene que entender en este contexto como MBL recombinante purificada de sobrenadantes de cultivos celulares o fluidos corporales o tejido de animales transgénicos, purificado mediante el uso de cromatografía de afinidad de carbohidratos. El procedimiento de aislamiento o purificación de una composición de oligómeros de MBL humana que tiene una distribución de tamaños idéntica, al menos en un 50%, a la MBL del plasma presente en la naturaleza, comprende preferiblemente:

-: obtener una preparación de oligómeros de MBL humana

-: someter dicha preparación a cromatografía de afinidad, usando una matriz derivatizada con carbohidratos, teniendo dicha matriz derivatizada con carbohidratos una afinidad dos veces superior para tetrámeros, pentámeros y/o hexámeros de MBL, que para dímeros de MBL, y

-: obtener un eluato que comprende la composición de MBL recombinante humana aislada.

La presente invención comprende una nueva forma de composición de MBL recombinante que comprende oligómeros de subunidades de MBL, siendo el perfil de distribución de tamaños de los oligómeros idéntico, al menos en un 50%, al perfil de distribución de tamaños de la MBL humana presente en el plasma. En una realización preferida, se proporciona una distribución de tamaños idéntica al menos en un 60%, p.ej., idéntica en un 70%, p.ej. idéntica en un 80%, p.ej. idéntica en un 90%, p.ej. idéntica en un 95% a la MBL existente en la naturaleza.

Cuando se estima la distribución de tamaños de los oligómeros de la composición de MBL, la distribución de tamaños se valora mediante transferencia Western sobre SDS-PAGE. Aquí se puede ver que 50% significa que más de 50% de la rMBL tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa, cuando se analiza mediante SDS-PAGE o transferencia Western.

La composición de MBL recombinante se puede purificar mediante cualquier medio apropiado desde el medio de cultivo, como mediante cualquier método de aislamiento físico-químico, incluyendo, pero no limitados a, métodos de filtración, cromatografía, como cromatografía de intercambio iónico basada en el tamaño, cromatografía de permeación en gel o cromatografía de afinidad. La composición de MBL recombinante se purifica preferiblemente del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad, según se analizó anteriormente.

La funcionalidad de la composición de MBL recombinante, se asemeja preferiblemente a la funcionalidad de MBL del suero o plasma. En el presente contexto, la funcionalidad de MBL significa la capacidad de activar el sistema del complemento, según se analizó anteriormente en relación con los equivalentes funcionales. La funcionalidad se puede expresar como la actividad específica de MBL, como unidades de actividad de MBL por ng de MBL. La funcionalidad de la composición de MBL recombinante, expresada como actividad específica, es preferiblemente al menos 25% de la actividad específica de la MBL purificada del suero, p.ej., al menos 50% de la actividad específica de MBL purificada del suero, más preferiblemente al menos 75% de la actividad específica de MBL purificada del suero.

La composición de MBL según la invención está sustancialmente exenta de cualquier impureza asociada naturalmente con la MBL, cuando se produce en un organismo hospedador nativo, como cualquier impureza asociada naturalmente con la MBL purificada del suero. Organismo hospedador nativo significa que la MBL es producida por una célula que expresa normalmente MBL.

El eluyente obtenido de cromatografía de afinidad se puede usar como tal para preparar una composición farmacéutica, o se puede someter a etapas de purificación adicionales antes de usarse.

La composición de MBL obtenida mediante la presente invención se puede usar para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de diversas enfermedades o estados.

Además de los oligómeros de MBL, la composición farmacéutica puede comprender una sustancia portadora y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

En particular, se puede añadir una sustancia estabilizadora para estabilizar las proteínas MBL. La sustancia estabilizadora puede ser un azúcar alcohol, sacárido, proteína y/o aminoácidos. Un ejemplo de sustancia estabilizadora puede ser albúmina o maltosa.

Se pueden añadir otros aditivos convencionales a la composición farmacéutica, dependiendo de la forma de administración, por ejemplo.

En una realización, la composición farmacéutica está en una forma adecuada para inyecciones. Se pueden usar vehículos convencionales, como solución salina isotónica.

En otra realización, la composición farmacéutica está en una forma adecuada para la administración pulmonar, como en forma de polvo para inhalación o crema o fluido para aplicación tópica.

La presente invención se basa en la síntesis de una nueva forma de MBL recombinante, que es más próxima a la MBL humana natural que la lograda hasta el momento, y que se puede sintetizar mediante el uso de tecnología in vitro o in vivo. Basándose en la evidencia del importante papel de la MBL en la defensa inmunitaria, esta forma de MBL recombinante proporcionada ofrece la posibilidad sorprendente de tratamiento de enfermedades como el cáncer y de infecciones relacionadas con la quimioterapia supresora. Las diferencias estructurales entre las preparaciones de MBL recombinante descritas previamente y la forma de MBL natural hacían cualquier tratamiento improbable. Asimismo, la aplicación de rMBL similar a la MBL natural en tal tratamiento, representa una gran ventaja sobre la aplicación de MBL conocida, en particular MBL humana derivada del plasma, ya que el tratamiento con rMBL confiere un riesgo muy reducido de infección vírica.

El tratamiento no tiene que ser un tratamiento de una enfermedad, trastorno o estado con una necesidad de tratamiento actual o aparente, sino que se puede usar para evitar que se produzca la enfermedad o estado.

Un tratamiento en este contexto puede comprenden la cura y/o profilaxis de p.ej., el sistema inmunitario y reproductivo mediante seres humanos y animales que tienen dichas unidades funcionales actuando a este respecto como las de seres humanos. Los estados a tratar no son necesariamente estados que se sabe que requieren tratamiento actualmente, sino que comprenden generalmente cualquier estado relacionado con una necesidad actual y/o prevista, o en relación con una mejora de un estado normal. En particular, el tratamiento es un tratamiento de una enfermedad o deficiencia de MBL.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona la fabricación de un medicamento formado por dichas composiciones farmacéuticas de MBL, incluyendo composiciones de fragmentos de rMBL o sus análogos, destinados al tratamiento de enfermedades que comprenden la curación y/o profilaxis de enfermedades y trastornos de p.ej., el sistema inmunitario y reproductor de seres humanos y de animales cuyas unidades funcionales actúan como las de los seres humanos.

Dichas enfermedades, trastornos y/o condiciones que precisan tratamiento con los compuestos de la invención comprenden p.ej. el tratamiento de enfermedades de deficiencia de MBL, tratamiento de cáncer y de infecciones relacionadas con la quimioterapia inmunosupresora, incluyendo en particular aquellas deficiencias observadas en relación con enfermedades producidas durante el tratamiento del cáncer o en conexión con el implante y/o transplante de órganos. La invención comprende asimismo el tratamiento de enfermedades relacionadas con el aborto repetitivo.

Por tanto, en particular la composición farmacéutica se puede usar para el tratamiento y/o prevención de estados clínicos seleccionados de infecciones, deficiencia de MBL, cáncer, trastornos asociados con quimioterapia, como infecciones, enfermedades asociadas con el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), enfermedades relacionadas con inmunodeficiencia congénita o adquirida. Más en particular, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP, neuropatía motora multifocal, esclerosis múltiple, miastenia grave, síndrome de Eaton-Lambert, neuritis óptica, epilepsia; síndromes antifosfolipídicos primarios: artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, escleroderma sistémica, vasculitis, granulomatosis de Wegner, síndrome de Sjögren, artritis reumatoide juvenil; neutropenia autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, neutropenia; enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca; asma, síndrome del choque séptico, síndrome de fatiga crónica, psoriasis, síndrome del choque tóxico, diabetes, sinusitis, cardiomiopatía dilatada, endocarditis, aterosclerosis. Hipo/agammaglobulinemia primaria, incluyendo inmunodeficiencia variable común, síndrome de Wiskot-Aldrich, inmunodeficiencia combinada grave (SCID), hipo/agammaglobulinemia secundaria en pacientes con leucemia linfática crónica (CLL) y mieloma múltiple, púrpura trombocitopénica idiopática crónica y aguda (ITP), trasplante de médula ósea alogénico (BTM), enfermedad de Kawasaki y síndrome de Guillan-Barre.

La vía de administración puede ser cualquier vía adecuada, como intravenosa, intramuscular, subcutánea o intradérmica. Asimismo, se prevé la administración pulmonar o tópica mediante la presente invención.

En particular, la composición de MBL se puede administrar para evitar y/o tratar infecciones en pacientes que tienen síntomas clínicos asociados con deficiencia de MBL congénita o adquirida, o que tienen riesgo de desarrollar tales síntomas. Una amplia variedad de enfermedades pueden conducir a una susceptibilidad incrementada a las infecciones en individuos deficientes en MBL, como la quimioterapia u otros tratamientos terapéuticos citotóxicos, cáncer, SIDA, disposición genética, infecciones crónicas y neutropenia.

Parece que los pacientes de cáncer tratados con quimioterapia son a menudo susceptibles de infección, debido a los efectos adversos del régimen farmacológico sobre las células del sistema inmunitario, que constituyen los antecedentes para el uso de terapia de MBL en el tratamiento de esta enfermedad. Las concentraciones plasmáticas bajas de MBL observadas (inferiores a 500 ng/ml) son indicativas de una susceptibilidad incrementada a las infecciones clínicas significativas, y la defensa inmunitaria de estos pacientes se puede reforzar mediante administración de MBL recombinante o derivada del plasma natural.

La composición farmacéutica se puede administrar, por tanto, durante un período antes del comienzo de la administración de quimioterapia o similar, y durante al menos una parte de la quimioterapia.

La composición de MBL se puede administrar como un "impulsor" general antes de la quimioterapia, o se puede administrar a aquellos que sólo presentan riesgo de desarrollar deficiencia de MBL. El grupo de pacientes de riesgo se puede determinar midiendo la concentración de MBL antes del tratamiento y sometiendo a tratamiento sólo a aquellos cuya concentración de MBL en inferior a una concentración predeterminada. El límite para determinar una concentración baja de MBL se evalúa para que esté por debajo de 500 ng/ml para la mayoría de los grupos. La concentración de MBL se puede determinar mediante fluoroinmunoanálisis de resolución tardía, según se describe en el Ejemplo 9, ELISA, RIA o nefelometría.

Otra indicación para administrar MBL es cuando la concentración de MBL es inferior a 50% de la concentración normal, p.ej., inferior a 300 ng/ml o inferior a 200 ng/ml.

La composición de MBL se administra en regímenes de dosificación adecuados, en particular se administra a intervalos adecuados, p.ej., una vez o dos a la semana durante la quimioterapia.

Normalmente se administrar de 1-100 mg por dosis, como 2-10 mg, con la máxima preferencia de 5-10 mg por dosis. principalmente se administra aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal.

Por tanto, en un aspecto la invención se refiere a MBL, incluyendo rMBL, sus fragmentos o análogos, para uso en el tratamiento del cáncer y de estados de enfermedad y trastornos de, p.ej. el sistema inmunitario y reproductivo, consistiendo dicho tratamiento en la creación, reconstitución, incremento y/o estimulación de la actividad opsónica y/o bactericida del sistema del complemento, es decir, favoreciendo la capacidad del sistema de defensa inmunitario de reconocer y destruir los patógenos microbianos.

Asimismo, un aspecto de la presente invención es el uso de una composición recombinante según la presente invención, en un kit que comprende además otro medicamento. En particular, el otro medicamento puede ser un medicamento antimicrobiano, como antibióticos.

En referencia al aborto, se ha descrito que la frecuencia de concentraciones plasmáticas bajas de MBL se incrementa en pacientes con abortos repetitivos no sin otra explicación, que son los antecedentes para reducir la susceptibilidad al aborto mediante una reconstitución de la concentración de MBL, mediante administración de MBL recombinante en estos casos.

En cuanto a la naturaleza de los compuestos de la invención, parece, en su aspecto amplio, que la presente invención se refiere a compuestos que son capaces de actuar como opsoninas, es decir, capaces de incrementar la absorción por macrófagos, bien a través de interacción directa entre el compuesto y el macrófago, o a través de la intervención en la deposición del complemento sobre la superficie elegida como objetivo. Un ejemplo particular de esto es MBL, uno de sus fragmentos o análogos. La presente invención se basa en la descripción de una síntesis de MBL humana recombinante, que parece ser más próxima a la estructura de la MBL humana natural que la obtenida en el pasado.

La invención se ha explicado y justificado en varios aspectos y con el detalle adecuado, pero se ilustrará adicionalmente más adelante mediante las figuras 1 y 2.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra análisis comparados de MBL recombinante purificada y nativa en estado no reducido, mediante SDS-PAGE y tinción con plata (bloque de gel incluido). La banda "S" se cargó con 24 ng de MBL natural (MO-04, The State Serum Institute), banda "HEK" con 60 ng de rMBL producida en células HEK 293EBNA y la banda "Hyb" con 12 ng de rMBL producida en células Sp2/OAg14 (proporcionadas por Dr. R.A.B. Ezekowitz). La flecha muestra la posición de la forma predominante en la rMBL producida por la células de hibridoma. Aunque la cantidad de rMBL en la banda "HEK" es 5 veces superior que en la banda "Hyb", no se puede observar ninguna banda de 55 kDa en la banda "HEK", sugiriendo una diferencia significativa en la formación del puente disulfuro de las dos subunidades rMBL (según se analiza en el Ejemplo 6).

La Figura 2 muestra un esquema de una construcción de expresión preferida según la invención, es decir, la construcción MBUpREP9, según se analizó en el Ejemplo 1.

La Figura 3 muestra las concentraciones de MBL en fracciones (expresadas como volumen de elución) de análisis de cromatografía de permeación en gel (Ejemplo 7).

La Figura 4 muestra un análisis de transferencia Western de rMBL purificada mediante glóbulos de manosa-TSK, glóbulos de manano-TSK, glóbulos de manosa-sefarosa, glóbulos de manano-sefarosa y glóbulos de sefarosa 4B sin derivatizar. Para comparación, se incluyó sobrenadante de cultivo sin fraccionar, de células MBUpREP9 sin transfectar (Ejemplo 3).

La Figura 5 muestra una transferencia Western de dos preparaciones de rMBL analizadas en estado no reducido, 50 ng de rMBL producidos según la presente invención ("células EBNA 293") y 50 ng de preparaciones de rMBL producidas según el método descrito por Super et al., 1992 ("células Sp2/OAg 14"). La MBL natural se purificó de suero humano, según se describe por Lu et al. 1990 ("Natural MBL") (Ejemplo 6).

Ejemplos Ejemplo 1 Diseño de la construcción de expresión génica de MBL

Se aisló ADN genómico humano de 20 ml de sangre extraída en EDTA. El EDTA/sangre se mezcló con 80 ml de Tris-HCl 10 mM (4ºC), MgCl_{2} 5 mM, Triton X-100 al 1% (v/v), sacarosa 0,32 mM, y se dejó incubar a 4ºC durante 30 min. con agitación ocasional. La muestra se centrifugó a 1000xg durante 30 min. a 4ºC, seguido por descarga del sobrenadante y un breve aclarado del sedimento que contenía núcleos, en aproximadamente 10 ml de NaCl al 0,9% (p/v). Los núcleos recogidos se volvieron a suspender en 6 ml de NaCl 75 mM, EDTA 24 Mm [pH 8,0] y se añadieron 460 \mul de SDS al 10% (p/v) y 1 mg de pronasa (Nº de catálogo 165921, Boehringer-Mannheim, Mannheim, Alemania). Después de la incubación durante la noche a temperatura ambiente con agitación cuidadosa, se añadieron 2 ml de una solución de NaCl (\sim6 M) saturada. Después de la agitación vigorosa, se eliminó el desecho mediante centrifugación a 1000xg. Se añadió isopropanol 1:1 al sobrenadante, y el vial se agitó suavemente hasta que apareció un precipitado de ADN. El precipitado filamentoso se recogió en una pipeta Pasteur sellada, se lavó el extremo sellado en etanol al 70% (v/v), se secó al aire y finalmente se volvió a poner en suspensión en 1 ml de tampón TE. La amplificación por PCR del gen MBL se realizó con un cebador sentido, modificado para que contuviese un sitio XhoI: 5'-AGATTAACCTTCCtcGAGTTTTCTCACACC-3'. el cebador antisentido se modificó para que contuviese un sitio BamHI: 5'-TAACggaTCCACTCCAATAATACATACAC-3' (los sitios de restricción obtenidos por ingeniería genética en las secuencias están subrayados, y los pares de bases modificados comparados con la secuencia génica natural publicada por Sastry et al. (1989), se muestran como letras minúsculas en ambas secuencias cebadoras. Los cebadores se produjeron mediante tecnología de ADN (Aarhus, Dinamarca). Los cebadores sentido y antisentido se localizaron en las UTRs (regiones no traducidas) 5' y 3', respectivamente. Las condiciones de reacción para la PCR consistían en dATP 200 \muM, dCTP 200 \mum, dGTP 200 \mum, dTTP 200 \mum (nº de catálogo 1969064, Boehringer-Mannheim), tampón de reacción con fuerza 1x, 0,75 \mul de enzima (nº de catálogo 1732641, Expand High Fidelity®, Boehringer-Mannheim, tampón de reacción suministrado con enzima), DNA genómico (100 ng), y agua, hasta un volumen final de 50 \mul. El programa térmico de PCR realizaba 1 ciclo a 96ºC durante 3 min., 10 ciclos a 94ºC durante 15 s, 60ºC durante 30 s y 72ºC durante 5 min., seguido por 20 ciclos a 94ºC durante 15 s, 60ºC durante 30 s y 68ºC durante 5 min., con un incremento temporal de 20 s por ciclo, seguido por una etapa final de alargamiento a 72ºC durante 5 min. (ciclador térmico Omn-E®, Hybaid, Ashford, UK). La colonación del producto de PCR de 6,2 kb en el vector pCR2, usando el kit de clonación TA® (nº de catálogo K2000-01, Invitrogen, Leek, Paises Bajos), se realizó según las recomendaciones del fabricante. El gen MBL se aisló del pCR2 mediante digestión del vector con enzimas NotI y BamHI (n^{os} de catálogo 15441-025 & 15201-023, GibcoBRL, Paisley, Reino Unido) durante 6 h a 37ºC, en un tampón apropiado. El inserto de ADN, es decir, el fragmento 5'-NotI-MBL-BamHI-3', se aisló de un gel de agarosa al 1% (p/v), usando el kit Bandprep® de Pharmacia (nº de catálogo 27-9285-01, Pharmacia, Uppsala, Suecia). El vector pREP9 (nº de catálogo V009-50, Invitrogen) se digirió, según se describió para el vector MBLIpCR2, y el producto de restricción, es decir, el vector linealizado, se aisló de forma análoga desde agarosa, para minimizar la contaminación con vector sin digerir. En un volumen final de 10 \mul, 1 \mul (\sim100 ng) de vector pREP9 digerido, 4 \mul (\sim400 ng) de 5'-NotI-MBL-BamHI-3', tampón de ligamiento a una fuerza de 1 x y 20 unidades de ligasa T4 (nº de catálogo 202S, New England Biolabs, Beverly, MA, tampón de reacción suministrado con enzima) se incubaron durante la noche a 14ºC. Células TOPF10 de E. coli se hicieron competentes para transformación mediante permeabilización con CaCl_{2} y se transformaron con el producto de ligamiento mediante choque térmico, según se describió por Hanahan (1983). Las bacterias se extendieron sobre placas de LB-agar, complementadas con 50 \mug de ampicilina/ml, y las colonias aparecieron tras incubación durante la noche a 37ºC.

La Figura 2 muestra un esquema de una construcción de expresión preferida según la invención, es decir, la construcción MBL/pREP9. La parte del gen de MBL amplificada por PCR (la localización de los cebadores sentido y antisentido se indica en negro mediante flechas) contenía los cuatro exones, incluyendo la región 3' sin traducir conocida del exon 4, según se determinó por Sastry et al., 1989. El fragmento se fusionó con el vector de expresión, denominado pREP9, en los sitios de restricción de las endonucleasas NotI y Bam HI (también están indicados los sitios de las endonucleasas de restricción EcoRV, XbaI, BgIII, XmnI, ClaI, StuI y SacI en la secuencia del vector). La transcripción del fragmento MBL clonado en el vector de expresión pREP9 se controló mediante el promotor de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (P_{RSV}), localizado aguas arriba del sitio de clonación (la dirección de transcripción para los elementos del vector está indicada con cabezas de flecha) y con un sitio de poliadenilación similar del virus de simio 40 (SV40). La propagación bacteriana, es decir, la producción del vector de ADN en E. coli, se obtuvo a través de un marcador de resistencia a ampicilina (Amp) y un "origen de replicación" procariótico ColE1. El mantenimiento del vector en células KEK293EBNA se confirió mediante el origen de replicación del virus de Epstein-Barr (OriP) y la expresión del antígeno 1 nuclear del virus de Epstein-Barr (EBNA-1), que une el vector a los cromosomas de la célula hospedadora.

Ejemplo 2 Expresión de MBL recombinante en células de mamífero

Células HEK 293EBNA, cultivadas hasta su confluencia en matraces de 150 cm^{2} (nº de catálogo 9075, TPP AG) que contenían DMEM (Biological Industries) complementado con FBS al 10%, glutamina, 200 \mug de G418/ml (Geneticin®, nº de catálogo G9516, Sigma) y antibióticos (10.000 unidades de penicilina y 0,1% (p/v) de estreptomicina), se recogieron mediante tripsinación y se sembraron en matraces de 150 cm^{2} (nº de catálogo 90150, TPP) a densidad cuatro veces inferior (\sim25% de confluencia), 24 h. antes de la transfección. Tres horas antes de la transfección se renovó todo el medio. En un volumen total de 1680 \mul, 60 \mug del DNA del plásmido MBL/pREP (se hace referencia al Ejemplo 1) se mezcló con NaCl 150 mM, EDTA 1 Mm, Tris-HCL 10 mM (pH 7,12) y CaCl_{2} 268 mM. Al ADN se le añadió una solución de calcio en 1680 \mul de HEPES 50 mM, NaCl 250 mM, Na_{2}HPO4 1,5 mM + NaH_{2}PO_{4} ajustada a pH 7,12. Las células se cultivaron durante 14-16 h con el precipitado de DNA/Ca \cdot PO_{4}, se aclararon dos veces en PBS y se incubaron nuevamente con medio RPMI-1640 (50 ml por botella), complementado con glutamina, antibióticos (penicilina y estreptomicina) y solución de insulina-transferrina-selenio (ITS) (nº de catálogo 51300-44, GibcoBRL), durante 6-8 días.

Ejemplo 3 Purificación de rMBL usando matrices derivatizadas con carbohidratos

Se activaron glóbulos TSK HW-75 de Fractogel (nº de catálogo 14985, Merck KgaA, Darmstadt, Alemania), mezclando 50 ml de glóbulos con 50 ml de Na_{2}CO_{3} 0,5 M (pH 11) y 10 ml de vinil-sulfona (nº de catálogo V370-0, Aldrich, Milwaukee, WI), seguido de incubación con agitación durante 1½ h. a temperatura ambiente. Los glóbulos se recogieron en un filtro de vidrio y se lavaron una vez en H_{2}O y una vez en Na_{2}CO_{3} 0,5 M (pH 11). Los glóbulos se volvieron a poner en suspensión en Na_{2}CO_{3} 0,5 M (pH 11) y se añadió manosa hasta una concentración final de 10% (p/v). La mezcla se dejó incubar con agitación durante la noche a temperatura ambiente. Después del aclarado en H_{2}O, los grupos reactivos residuales se bloquearon incubando los glóbulos en etanolamina 0,1 M (pH 9) durante 2 h. Tras un aclarado en H_{2}O y TBS, se rellenó una columna de cromatografía con 5 ml de TSK-75 unido a manosa, y se lavó con 15 ml de glicina 0,1 M (pH 3,0) y se equilibró con TBS/Tween-20 al 0,05% (v/v), CaCl_{2} 2 mM, hasta que la absorción de UV permaneció estable. El medio de cultivo de las células transfectadas MBL/pREP9, aclarado mediante centrifugación a 5000xg, se hizo pasar a través de la columna a razón de 0,4 ml/min. La columna se lavó en 75 ml de TBS, CaCl_{2} 2 mM, y la rMBL unida se eluyó en TBS, EDTA 5 mM y se recogió en fracciones de 500 \mul. Para preparar glóbulos de TSK con manano (purificados de levadura según se describió por Nakajuma & Balou, 1974), los glóbulos se activaron según se describió anteriormente y se incubaron con 25 mg de manano/ml de Na_{2}CO_{3} 0,5 M (pH 11), seguido del mismo tratamiento que para la preparación de glóbulos derivatizados con manosa. Los glóbulos de Sefarosa 4B (nº de catálogo 17-0120-01, Pharmacia, Uppsala, Suecia) se derivatizaron con manosa y manano, según se describió para los glóbulos TSK. Los eluatos de las tres matrices se analizaron mediante transferencia Western, según se describe en el Ejemplo A, cargando 7 ng de rMBL purificada mediante glóbulos TSK-manosa, glóbulos TSK-manano, glóbulos manosa-Sefarosa y glóbulos Sefarosa-manano, en bandas separadas en gel SDS-PAGE. Para comparación, se cargó en una banda un sobrenadante de cultivo sin fraccionar, correspondiente a 7 ng de rMBL. La transferencia Western se muestra en la Figura 4.

Ejemplo 4 Análisis de MBL en condiciones no desnaturalizantes, mediante cromatografía de permeación en gel

La cromatografía de permeación de rMBL purificada o medio de cultivo que contenía rMBL, se realizó sobre una columna de Superose-6 (Superose 6® HR 10/30, nº de catálogo 17-0537-01, Pharmacia) equilibrada en EDTA 5 mM, TBS, Tween 20 al 0,01% (v/v) [pH 7,4]. Se hizo pasar a través de la columna un volumen de muestra de 100 \mul, con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Se recogieron fracciones de 5 ml después de la inyección de la muestra, en volúmenes de 250 \mul.

Ejemplo 5 Análisis de MBL en condiciones desnaturalizantes mediante SDS-PAGE/tinción con plata

Se prepararon geles de gradiente 4%-20% de SDS-PAGE y se usaron en electroforesis según se describió por Jensen et al. (1997). El procedimiento de tinción con plata se adoptó de Nesterenko et al. (1994). Los geles PAGE se fijaron en 100 ml de acetona al 50% (v/v), 6,25 ml de ácido tricloroacético, formaldehído al 0,85% (v/v) durante 15 min., seguido de un aclarado instantáneo en H_{2}O y lavado durante 15 min. en H_{2}O. El gel se incubó en 100 ml de acetona al 50% (v/v) durante 15 min. seguido de incubación durante 1 min. en Na_{2}S_{2}O_{3} 0,67 mM, y tres aclarados en H_{2}O. La impregnación del gel con nitrato de plata se realizó en AgNO_{3} 15 mM, formaldehído 0,9% (v/v), seguido de aclarado tres veces en H_{2}O. El gel se desarrolló mediante incubación en Na_{2}CO_{3} 0,19 mM, formaldehído al 0,9% (v/v), Na_{2}S_{2}O_{3} 0,67 mM, durante aproximadamente 3 min. La precipitación se detuvo mediante incubación del gel durante 3 min. en ácido acético al 1% (v/v) y se conservó en etanol al 25% (v/v) y glicerol al 3% (v/v).

Ejemplo 6 Análisis de rMBL mediante SDS-PAGE seguido de transferencia Western

Se preparó solución salina tamponada con Tris (TBS) y solución salina tamponada con fosfato (PBS), ambas ajustadas a pH 7,4, según se describió por Sambrook et al. (1989). Para bloquear las interacciones proteicas no específicas, los tampones se complementaron con Tween-20 al 0,05% (v/v) (TBS/Tw y PBS/Tw). Se prepararon gradientes de geles SDS-PAGE 4%-20% y se usaron en electroforesis según se describió por Jensen et al. (1997). 50 ng de rMBL producidos en células HEK 293EBNA (preparadas según la presente invención), 50 ng de rMBL preparados según se describió por Super et al. (1992), y 50 ng de MBL preparados de plasma humano (MO012, State Serum Institute) se cargaron sobre el gen en estado no reducido. Las proteínas se transfirieron sobre una membrana Amersham's Hybond®-P (nº de catálogo RPN303F) mediante transferencia semiseca en base Tris 50 mM, glicina 40 mM, SDS al 3,7% (p/v), etanol al 20% (v/v), durante 60 Vxh. Las interacciones proteicas inespecíficas se bloquearon incubando la membrana con Tween-20 al 0,1% durante ½ h. Para la detección de MBL, la membrana se incubó con un anticuerpo monoclonal obtenido frente a MBL humana (Hyb 131-1, State Serum Institute), diluido hasta 1 \mug/ml en TBS, Tween-20 al 0,05%, EDTA 1 mM, 1 mg de HSA/ml (nº de catálogo 440511, State Serum Institute), 1 mg de IgG humana/ml (nº de catálogo 007740, Centeon Pharma GmbH, Marburg, Alemania) durante la noche, a temperatura ambiente. Después de 3 lavados en tampón TBS/Tw, la membrana se incubó con IgG de conejo anti-ratón conjugada con HRP (nº de catálogo P0260, Dako A/S, Copenague, Dinamarca), diluida 2.500 veces en TBS/Tw, EDTA 1 mM, con 100 \mug de IgG humana/ml, durante 2 h. a temperatura ambiente. Finalmente, la membrana se lavó 5 veces en TBS/Tw y se desarrolló con sustrato de quimioluminiscencia de Pierce (SuperSignal®, nº de catálogo 34080, Pierce, Rockford, IL) sobre películas fotográficas (Kodak, NY).

Ejemplo 7 Análisis de rMBL mediante cromatografía de permeación en gel

Se realizó cromatografía de permeación en gel de rMBL purificada o medio de cultivo que contenía rMBL, sobre una columna de Superose-6 (Superose 6® HR 10/30, nº de catálogo 17-0537-01, Pharmacia), equilibrada en EDTA 5 mM, TBS, Tween-20 al 0,01% (v/v) [pH 7,4]. Se hizo pasar un volumen de muestra de 100 \mul (correspondiente a 100 ng de rMBL o MBL natural) sobre la columna, con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Se recogieron fracciones 5 ml después de la inyección de la muestra, en volúmenes de 250 \mul. Las fracciones se diluyeron dos veces en TBS/Tw, EDTA 10 mM, y se analizaron mediante fluoroinmunoanálisis de resolución tardía (TRIFMA), según se describió en el Ejemplo 8.

Ejemplo 8 Análisis de rMBL mediante un fluoroinmunoanálisis de resolución tardía (TRIFMA)

Se recubrieron placas de microvaloración Flourosorp® (nº de catálogo 437958, Nunc, Kamstrup, Dinamarca), durante la noche, con 100 \mul (por pocillo) de MAb 131-1 anti-MBL (Statens Serum Institut, Copenague, Dinamarca), a razón de 5 \mug/ml de PBS, y se lavaron instantáneamente con TBS/Tw. Un suero estándar con una concentración de MBL conocida (3,6 \mug de MBL/ml) se diluyó 20 veces en EDTA 10 mM, TBS/Tw, y se usó como tal, así como en diluciones adicionales de 5 veces con pocillos duplicados, que recibían cada uno 100 \mul de la dilución. Tres sueros testigo, uno con una concentración elevada de MBL (1,2 \muL de MBL/ml), uno con una concentración media de MBL (250 ng de MBL/ml), y uno con una concentración baja de MBL (50 ng de MBL/ml), se aplicaron diluidos 20 veces en TBS/Tw/EDTA. De forma similar, un suero deficiente en MBL se diluyó 20 veces y se añadió a la placa como testigo negativo. Los sobrenadantes de cultivo, que contenían FBS o exentos de suero, se diluyeron típicamente 20 y 100 veces. Tras incubación durante la noche, la placa se lavó instantáneamente en TBS/Tw y cada pocillo recibió 100 \mul de MAb 131-1 anti-MBL marcado con Eu^{3+}, a razón de 125 ng/ml, EDTA 25 \muM, TBS/Tw.

El anticuerpo marcado se preparó esencialmente según el protocolo de Wallac (Wallac, Turku, Finlandia). El revelado y la medición de europio unido se realizó mediante procedimientos estándar para fluoroinmunoanálisis de resolución tardía, según se describe en otro documento (Hemmila et al., 1993).

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<110> Jensenius, Jens Christian y Thiel, Steffen

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<120> Lectina humana recombinante que se une a manano

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<130> p 433 DK00

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<140>

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<141>

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<160> 1

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 248

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<300>

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<308> Swissprot: P11226

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<400> 1

1

2

Claims

1. Un procedimiento para aislar una composición de oligómeros de lectina humana que se une a manano (MBL), que tienen una distribución de tamaños, en la que al menos 50% de los oligómeros tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa, que comprende:

-: obtener una preparación de oligómeros de MBL humana,

-: someter tal preparación a cromatografía de afinidad usando una matriz derivatizada con carbohidratos, que tiene afinidad para oligómeros de MBL, donde dicha matriz derivatizada con carbohidratos no tiene afinidad detectable para subunidades monómeras de MBL y donde la matriz como tal está exenta de carbohidratos; y

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la matriz está formada por glóbulos de plástico.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el aislamiento de la composición polipeptídica se realiza sobre una matriz de hexosa.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que el aislamiento de la composición polipeptídica se realiza sobre una matriz de manosa.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que la matriz derivatizada con carbohidratos tiene una afinidad al menos dos veces superior para los tetrámeros, pentámeros y/o hexámeros de subunidades de MBL, que para dímeros y/o monómeros de subunidades de MBL.

6. Un procedimiento para producir una composición de lectina que se une a manano (MBL) recombinante, que tiene un perfil de distribución de tamaños en el que al menos 50% de los oligómeros tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa, que comprende las etapas de:

-: preparar una construcción de expresión génica que codifica péptido de MBL humana o uno de sus equivalentes funcionales, obtenido mediante una modificación de la secuencia peptídica de la MBL humana (SEQ ID Nº:1),

-: transformar un cultivo de células hospedadoras con la construcción,

-: cultivar el cultivo de células hospedadoras, obteniendo así la expresión y secreción del polipéptido en el medio de cultivo, seguido por

-: someter dicho medio de cultivo a cromatografía de afinidad, usando una matriz derivatizada con carbohidratos con afinidad para oligómeros de MBL, donde dicha matriz derivatizada con carbohidratos no tiene afinidad detectable para subunidades monómeras de MBL, y donde dicha matriz como tal está exenta de carbohidatos; y

-: obtener un eluato que comprende la composición de MBL recombinante.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que la construcción de expresión génica comprende al menos dos secuencias de exones del gen de la MBL humana o uno de sus equivalentes funcionales.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que la construcción de expresión génica comprende una secuencia de ADNc que codifica una subunidad de MBL o uno de sus equivalentes funcionales.

9. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el cultivo de células hospedadoras se cultiva in vitro.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el cultivo de células hospedadoras es un cultivo de células hospedadoras de mamífero.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que la matriz está formada por glóbulos de plástico.

12. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el aislamiento de la composición polipeptídica se realiza sobre una matriz derivatizada con hexosa.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que el aislamiento de la composición polipeptídica se realiza sobre una matriz derivatizada con manosa.

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14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6-13, en el que la matriz derivatizada con carbohidratos tiene una afinidad al menos dos veces mayor para tetrámeros, pentámeros y/o hexámeros de subunidades de MBL, que para dímeros y/o monómeros de subunidades de MBL.

15. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que al menos 60% de los oligómeros tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa.

16. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que al menos 70% de los oligómeros tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa.

17. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que al menos 80% de los oligómeros tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa.

18. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que al menos 90% de los oligómeros tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa.

19. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que al menos 95% de los oligómeros tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa.

20. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que al menos 99% de los oligómeros tiene un peso molecular aparente superior a 200 kDa.