ES2282991T3 - Compuestos para la fotodescontaminacion de patogenos en la sangre. - Google Patents
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Abstract
SE SINTETIZAN COMPUESTOS DE SORALENO QUE TIENE SUSTITUCIONES SOBRE LAS POSICIONES 4,4'',5'' Y 8 DEL SORALENO, QUE PERMITEN ENLACES REALZADOS AL ACIDO NUCLEICO DE PATOGENO. LOS NIVELES DE ENLACE DE SORALENO SUPERIORES U LA MUTAGENICIDAD INFERIOR SON DESCRITOS, RESULTANDO EN UNA INACTIVACION FIABLE Y MAS EFICIENTE DE MODO SEGURO DE PATOGENO EN PRODUCTOS SANGUINEOS. LA INVENCION CONTEMPLA LOS METODOS DE INACTIVACION USANDO LOS NUEVOS SORALENOS QUE NO COMPROMETEN LA FUNCION DE PRODUCTOS SANGUINEOS PARA TRANSFUSION.
Description
Compuestos para la fotodescontaminación de
patógenos en la sangre.
La presente invención proporciona un
procedimiento para inactivar patógenos en productos de sangre en
presencia de luz ultravioleta sin afectar significativamente a la
función del producto de sangre o presentar capacidad mutagénica.
La contaminación por patógenos en el suministro
de sangre sigue siendo un problema importante en todo el mundo.
Aunque los procedimientos de ensayo mejorados para la hepatitis B
(HBV), hepatitis C (HCV) y el virus de inmunodeficiencia humana
(HIV) han reducido marcadamente la incidencia de enfermedades
asociadas a la transfusión, el público está perdiendo confianza en
la seguridad del suministro de sangre debido a la publicidad de
casos de transfusiones relacionadas con la transmisión de estos
virus.
Por ejemplo, la reciente introducción de un
ensayo de sangre para HCV reducirá la transmisión de este virus;
pero tiene una sensibilidad de sólo 67% para la detección de
unidades de sangre probablemente infecciosa. La HCV es responsable
del 90% de la hepatitis asociada con la transfusión. Meinick, J.L.,
en resúmunes de Virological Safety Aspects of Plasma; Cannes,
3-6 de noviembre (1992), pág. 9. Se estima que, con
este ensayo, el riesgo de infección es de 1 entre 3000 unidades
transfundidas.
Análogamente, si bien hay disponibles ensayos
serológicos más sensibles para HIV-1 y HBV, estos
agentes pueden transmitirse a pesar de ello por donantes de sangre
seronegativos. International Forum: Vox Sang 32:346 (1977). Ward,
J. W. y otros, N. Engl. J. Med., 318:473 (1988). Hasta un 10% del
total de hepatitis relacionadas con transfusiones y un 25% de casos
de ictericia severa son debidos a HBV transmitido por donantes
negativos de antígeno de superficie de hepatitis B (HBasAg). Hasta
ahora, entre los receptores de sangre previamente ensayada como
negativa de anticuerpo a HIV-1 por el Centro de
Control de Enfermedades (CDC), se ha dado cuenta de 15 casos de
infecciones por HIV asociadas con la transfusión.
Además, rutinariamente no se ensayan otros
virus, bacterias y agentes y quedan como amenaza potencial de la
seguridad de las transfusiones. Schumunis, G.A., Transfusion
31:547-557 (1992). Además, un ensayo no garantiza
la seguridad del suministro de sangre frente a futuros patógenos
desconocidos que pueden entrar en la población de donantes, lo que
da por resultado una transmisión asociada a la transfusión antes de
que se puedan realizar ensayos sensibles.
Incluso si los ensayos de seroconversión fueran
una exploración suficiente, su aplicación puede no ser práctica.
Por ejemplo, los virus Cytomegalovirus (CMV - un virus de herpes) y
parvo B19 son comunes en seres humanos. Cuando se presentan en
adultos sanos inmunocompetentes, casi siempre dan por resultado una
seroconversión asintomática. A causa de que una gran parte de la
población es seropositiva, la exclusión de unidades positivas daría
por resultado una limitación sustancial del suministro de
sangre.
Un enfoque alternativo para eliminar la
transmisión de enfermedades virales a través de productos de sangre
es el desarrollo de medios para inactivar patógenos en productos de
transfusión. El desarrollo de una tecnología eficaz para inactivar
patógenos infecciosos en productos de sangre ofrece el potencial de
mejorar la seguridad del suministro de sangre y, acaso, de
ralentizar la introducción de nuevos ensayos, tales como el ensayo
HIV-2 recientemente introducido, para patógenos
poco frecuentes. Finalmente, la tecnología de descontaminación
podría reducir significativamente el coste de productos de sangre y
aumentar la disponibilidad de productos de sangre escasos.
Para ser útil, tal procedimiento de
descontaminación (i) no debe afectar perjudicialmente la función
para la que se transfunde el producto de sangre, (ii) debe
inactivar a fondo los patógenos existentes en el producto de sangre
y (iii) no debe afectar perjudicialmente a los receptores del
producto de sangre. Se ha dado cuenta de varios procedimientos para
la inactivación o eliminación de agentes virales en productos de
sangre exentos de eritrocitos. Sin embargo, la mayoría de estas
técnicas son completamente incompatibles con el mantenimiento de la
función de las plaquetas, un importante producto de sangre. Son
ejemplos de estas técnicas: calor (Hilfenhous, J. y otros, J. Biol.
Std. 70:589 (1987)), tratamiento con disolvente/detergente
(Horowitz, B. y otros, Transfusión 25:516 (1985)), iradiación
\gamma (Moroff, G. y otros, Transfusión 26:453 (1986)), radiación
ultravioleta (UV) combinada con propriolactona beta (Prince, A.M. y
otros, Reviews of Infect. Diseases 5:92-107 (1983)),
luz láser visible en combinación con hematoporfirinas (Matthews,
J.L. y otros, Transfusión 28:81-83 (1988), North J.
y otros, Transfusión 32:121-128 (1992)), uso de
colorantes fotoactivos ftalocianina de aluminio y merocianina 540
(Sieber F. y otros, Blood 73:345-350 (1989), Rywkin,
S. y otros, Blood 78 (supl. 1): 352a (Abstract) (1991) o UV sola
(Proudouz, K. N. y otros, Blood 70:589 (1987)).
Otros procedimientos inactivan agentes virales
por tratamiento con furocumarinas tales como psolarenos en
presencia de luz ultravioleta. Los psolarenos son compuestos
tricíclicos formados por condensación lineal de un anillo de furano
con una cumarina. Los psolarenos se pueden intercalar entre los
pares de base de ácidos nucleicos de doble cadena formando aductos
covalentes con bases de pirimidina después de absorción de luz
ultravioleta de onda larga (UVA). G. D. Cimino y otros, Ann. Rev.
Biochem. 54:1151 (1985); Hearst y otros, Quart. Rev. Biophys. 17:1
(1984). Si hay una segunda pirimidina adyacente a un monoaducto de
psolareno-pirimidina y en la cadena opuesta, la
absorción de un segundo fotón puede conducir a la formación de un
diaducto que actúa como una unión reticulada entre cadenas. S. T.
Isaacs y otros, Biochemistry 16:1058 (1977); S. T. Isaacs y otros,
Trends in Photobiology (Plenum) págs. 279-294
(1982), J. Tessman y otros, Biochem. 24:1669 (1985), Hearst y otros,
patentes U.S. n^{os}. 4.124.598, 4.169.204 y 4.196.281.
Los psolarenos unidos covalentemente actúan como
inhibidores de la replicación de DNA y tienen así el potencial de
parar el proceso de replicación. Debido a esta capacidad de unirse a
DNA, los psolarenos tienen un interés particular en cuanto a la
resolución de los problemas inherentes a la creación y mantenimiento
de un suministro de sangre con patógenos. Algunos psolarenos
conocidos han revelado que inactivan virus en algunos productos de
sangre. H. J. Alter y otros, The Lancet, (ii:1446) (1988); L. Lin y
otros, Blood 74:517 (1989) (concentrados descontaminantes de
plaquetas); G. P. Wisehahn y otros, patentes U.S. n^{os}.
4.727.027 y 4.748.120 describen el uso de una combinación de
8-metoxipsolareno (8-MOP) e
irradiación. P. Morel y otros, Blood Cells 18:276 (1992) señalan
que 300 \mug/ml de 8-MOP junto con 10 horas de
irradiación con luz ultravioleta pueden inactivar eficazmente virus
en suero humano. Otros investigadores han presentado estudios
similares usando 8-MOP y psolareno
aminometiltrimetílico (AMT). Dodd RY y otros, Transfusion
31:483-490 (1991); Margols-Nunno, H.
y otros, Thromb Haemostas 65:1162. (Abstract) (1991). En efecto, se
ha establecido la fotoinactivación de un amplio espectro de
microorganismos, incluidos HBV, HCV y HIV, en condiciones diferentes
de las usadas en la presente invención y usando derivados de
psolareno previamente conocidos. [Hanson, C. V., Blood Cells,
18:7-24 (1992); Alter, H. y otros, The Lancet ii:
1446 (1989); Margolis-Nunno, H y otros, Thromb
Haemostas 65:1162 (Abstract) (1991)].
La inactivación por psolareno es sólo factible
si la capacidad del psolareno de inactivar virus es suficiente para
asegurar un margen de seguridad en el que se producirá la
inactivación completa. Por otra parte, el psolareno no debe causar
un daño al producto de sangre. Los procedimientos descritos, cuando
se aplican a psolarenos conocidos, requieren el uso de
procedimientos difíciles y caros para evitar daños a los productos
de sangre. Por ejemplo, algunos compuestos y protocolos han
necesitado la eliminación de oxígeno molecular de la mezcla de
reacción antes de la exposición a la luz para evitar el daño de los
productos de sangre por los radicales de oxígeno producidos durante
la irradiación. Véase Lin y otros, Blood 74:517 (1989); patente U.S.
nº. 4.727.027, expedida a Wiesehahn. Este es un procedimiento
costoso y que requiere tiempo.
Finalmente, algunos compuestos comúnmente
conocidos usados en la descontaminación fotoquímica (PCD) exhiben
una capacidad mutagénica indeseable que parece que aumenta al crecer
la capacidad de matar el virus. En otras palabras, cuanto más
eficaces son los compuestos conocidos para inactivar virus, más
lesivos son los compuestos para el receptor y, por tanto, son menos
útiles en cualquier punto de un sistema de inactivación de productos
para uso in vivo.
Se necesita un nuevo compuesto psolareno que
tenga una capacidad mejorada de inactivar patógenos y una capacidad
mutagénica baja, que no cause un daño significativo a los productos
de sangre para los que se usa, y que no necesite eliminar el
oxígeno, que asegure así una inactivación segura y completa de
patógenos en los procedimientos de descontaminación de sangre.
La presente invención se define en las
reivindicaciones y proporciona un procedimiento para inactivar
patógenos en productos de sangre y productos de sangre en medios
sintéticos.
La presente invención contempla un procedimiento
para inactivar patógenos en preparados de sangre, que comprende en
el orden siguiente:
(a) proporcionar en cualquier orden,
\hskip0,4cm(i) uno o más compuestos fotoactivos, o sus sales, de la fórmula siguiente:
en la que X es una cadena de
hidrocarburo que tiene una longitud total de 2 a 20 carbonos, en la
que de 0 a 6 de estos carbonos están reemplazados
independientemente por NH u O, y cada punto de reemplazamiento está
separado de cada uno de los otros puntos de reemplazo por al menos
dos carbonos, y está separado del psolareno por al menos un
carbono, y en la que X2, X3 y X4 se seleccionan independientemente
entre el grupo constituido por H y (CH_{2})_{v}CH_{3},
en el que v es un número entero de 0 a
5;
\hskip0,4cm(ii) medios de fotoactivación para fotoactivar los mencionados compuestos o sus sales, y
\hskip0,4cm(iii) un preparado de sangre sospechoso de estar contaminado con un microorganismo que tiene ácido nucleico;
(b) añadir los mencionados compuestos o sus
sales al mencionado preparado de sangre, y
(c) fotoactivar los mencionados compuestos o sus
sales en condiciones suficientes para inactivar el microorganismo
mencionado.
Entre otras realizaciones está incluida la del
patógeno que comprende organismos unicelulares y multicelulares,
tales como bacterias, hongos, micoplasma y protozoos, o la de un
patógeno que comprende un virus. El preparado de sangre mencionado
puede comprender también plaquetas o plasma. En una realización, el
medio fotoactivante del procedimiento antes descrito comprende un
dispositivo de fotoactivación capaz de emitir una intensidad dada
de un espectro de radiación electromagnética que comprende
longitudes de onda entre 180 nm y 400 nm. En una realización, la
intensidad es de entre 1 y 30 mW/cm^{2}. En otra realización, el
preparado de sangre se somete a la mencionada intensidad durante
entre 1 segundo y treinta minutos. En otra realización, el espectro
de radiación electromagnética comprende longitudes de onda entre 320
y 380 nm.
En otra realización del procedimiento descrito,
el preparado de sangre está en un medio sintético. En otra
realización más, el compuesto se añade al preparado de sangre a una
concentración final de entre 1 y 250 \muM, o específicamente, a
una concentración final de entre 10 y 150 \muM. En otra
realización, la etapa c se realiza sin limitar la concentración de
oxígeno molecular.
En una realización de la presente invención,
4'-amino primario-sustituido
psolareno comprende: (a) un sustituyente X1 en el átomo de carbono
4', seleccionado ente el grupo que comprende:
-(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{z}-NH_{2},
-(CH_{2})_{w}-
R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{z}NH_{2} y -(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{y}-R_{4}-(CH_{2})_{z}-NH_{2}; en los que R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente entre el grupo que comprende O y NH, en el que w es un número entero de 1 a 5, x es un número entero de 2 a 5, y es un número entero de 2 a 5 y z es un número entero de 2 a 6; y (b) sustituyentes X4, X2 y X3 en los átomos de carbono 4, 5' y 8, respectivamente, seleccionados independientemente entre el grupo que comprende H y (CH_{2})_{y}CH_{3}, en el que v es un número entero de 0 a 5; o una de sus sales. En otra realización, el compuesto está en una solución antes de la etapa (c), solución que puede comprender agua, una solución salina o un medio sintético. En otra realización, el medio sintético comprende además al menos un constituyente seleccionado entre el grupo constituido por manitol y glucosa. En una realización, el medio sintético comprende además acetato sódico, cloruro potásico, cloruro sódico, citrato sódico, fosfato sódico y cloruro magnésico. En otra realización, el medio sintético comprende además al menos un constituyente seleccionado entre el grupo constituido por manitol y glucosa. En una realización alternativa, el medio sintético comprende además acetato sódico, cloruro sódico, citrato y fosfato sódico.
R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{z}NH_{2} y -(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{y}-R_{4}-(CH_{2})_{z}-NH_{2}; en los que R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente entre el grupo que comprende O y NH, en el que w es un número entero de 1 a 5, x es un número entero de 2 a 5, y es un número entero de 2 a 5 y z es un número entero de 2 a 6; y (b) sustituyentes X4, X2 y X3 en los átomos de carbono 4, 5' y 8, respectivamente, seleccionados independientemente entre el grupo que comprende H y (CH_{2})_{y}CH_{3}, en el que v es un número entero de 0 a 5; o una de sus sales. En otra realización, el compuesto está en una solución antes de la etapa (c), solución que puede comprender agua, una solución salina o un medio sintético. En otra realización, el medio sintético comprende además al menos un constituyente seleccionado entre el grupo constituido por manitol y glucosa. En una realización, el medio sintético comprende además acetato sódico, cloruro potásico, cloruro sódico, citrato sódico, fosfato sódico y cloruro magnésico. En otra realización, el medio sintético comprende además al menos un constituyente seleccionado entre el grupo constituido por manitol y glucosa. En una realización alternativa, el medio sintético comprende además acetato sódico, cloruro sódico, citrato y fosfato sódico.
En una realización del procedimiento descrito
antes, antes de la etapa (b), el mencionado medio sintético está
contenido en una primera bolsa de sangre y el mencionado preparado
de plaquetas está contenido en una segunda bolsa de sangre. En otra
realización, el medio sintético se añade al mencionado preparado de
plaquetas en la etapa (b) transfiriendo el mencionado medio
sintético de la mencionada primera bolsa de sangre a la mencionada
segunda bolsa de sangre por medio de una conexión estéril.
En otra realización, el compuesto está en una
formulación seca antes de la etapa (c). En otra realización, el
ácido nucleico es DNA o RNA, de cadena simple o doble, con un
patógeno que tiene ácido nucleico, contenido en una segunda bolsa
de sangre; (b) añadiendo el mencionado medio sintético al mencionado
preparado de plaquetas por transferir el mencionado medio sintético
de la mencionada primera bolsa de sangre a la mencionada segunda
bolsa de sangre a través de un medio de conexión estéril. y (c)
fotoactivando el mencionado compuesto de manera que se prevenga la
replicación de sustancialmente la totalidad del mencionado ácido
nucleico del patógeno sin alterar significativamente la actividad
biológica del mencionado preparado de plaquetas.
La presente invención contempla también
procedimientos de síntesis de varios compuestos de la presente
invención. En una realización, la presente invención contempla un
procedimiento de síntesis de
4'-(\omega-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno,
que comprende: (a) proporcionar
4'-(\omega-hidroxi-2-oxa)alqul-4,5'-8-trimetilpsolareno;
(b) tratar el
4'-(\omega-hidroxi-2-oxa)alqul-4,5'-8-trimetilpsolareno
con una base y cloruro de metanosulfonilo de manera que se produzca
4'-(\omega-metanosulfoniloxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno;
(c) tratar el
4'-(\omega-hmetanosulfoniloxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno
con azida sódica de manera que se produzca
4'(\omega-azido-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno,
y (d) reducir
4'(\omega-azido-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno
de manera que se produzca
4'-(\omega-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno.
En una realización de este procedimiento de síntesis, el
4'-(\omega-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno
es
4'-[(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno.
En otra realización, en la etapa (d), el
4'-[(4-azido-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
se reduce con trifenilfosina. La presente invención contempla
además un compuesto psolareno producido por el procedimiento de
síntesis descrito antes, que comprende
4'-[(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno.
La presente invención contempla un procedimiento
para sintetizar otro compuesto psolareno que tiene un sustituyente
R_{1} en el carbono 4', seleccionado entre el grupo que comprende
-(CH_{2}-O-(CH_{2})_{x}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2},
en el que x = z, y sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} en los
átomos de carbono 4, 5' y 8, respectivamente, seleccionados
independientemente entre el grupo que comprende H y
(CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero de
0 a 5, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un
4'-halometil-4-5'-8-trimetilpsolareno
seleccionado entre el grupo que comprende
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsolareno
y
4'-yodometil-4,5',8-trimetilpsolareno;
(b) tratar el mencionado
4'-halometil-4-5'-8-trimetilpsolareno
con
HO(CH_{2})_{x}O(CH_{2})_{z}OH de
manera que se produzca
4'-(\omega-hidroxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno,
en el que n = x+3; (c) tratar el mencionado
4'-(\omega-hidroxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno
con una base y cloruro de metanosulfonilo de manera que se produzca
4'-(\omega-metanosulfoniloxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno;
(d) tratar el
4'-(\omega-metanosulfoniloxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno
con azida sódica, con lo que se produce
4'-(\omega-azido-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno
y (e) reducir
4'-(\omega-azido-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno
produciéndose
4'-(\omega-amino-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno.
En una realización alternativa, la presente invención contempla un
procedimiento de síntesis de
4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetlpsolareno
que comprende las etapas de (a) proporcionar un
4'-halometil-4,5',8-trimetilpsolareno
seleccionado entre el grupo de
4'-cloro-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-bromo-4,5',8-trimetilpsolareno
y
4'-yodo-4,5',8-trimetilpsolareno;
(b) tratar el mencionado
4'-halometil-4,5',8-trimetilpsolareno
con dietilenglicol, con lo que se forma
4'-(7-hidroxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno;
(c) tratar el
4'-(7-hidroxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno
con una base y cloruro de metanosulfonilo, con lo que se produce
4'-(7-metanosulfoniloxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno;
(d) tratar
4'-(7-metano-sulfoniloxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno
con 1,4-diaminobutano con lo que se forma
4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetlpsolareno.
En otra realización más, la presente invención
contempla un procedimiento de síntesis de
4'-(\omega-amino-2-aza)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno,
que comprende: (a) proporcionar un
4'-halometil-4-5'-8-trimetilpsolareno
seleccionado entre
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsolareno
y
4'-yodo-metil-4,5',8-trimetilpsolareno;
(b) tratar el mencionado
4'-halometil-4-5'-8-trimetilpsolareno
con 1,\omega-diaminoalcano para producir
4'-(\omega-amino-2-aza)alquil-4,5',8-trimetilpsolareno.
En una realización alternativa, la presente invención contempla un
procedimiento para sintetizar
4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5',8-trimetilpsolareno,
que comprende: (a) proporcionar
4,5',8-trimetilpsolareno-4'-carboxaldehído;
(b) tratar
4,5',8-trimetilpsolareno-4'-carboxaldehído
con espermina y un agente reductor para producir
4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5',8-trimetilpsolareno.
La presente invención contempla también un
procedimiento de síntesis de
5'-(\omega-amino-2-aza)alquil-4,4',8-trimetilpsolareno,
que comprende: (a) proporcionar un
5'-halometil-4,4',8-trimetilpsolareno
seleccionado entre entre
5'-clorometil-4,5',8-trimetilpsolareno,
5'-bromometil-4,5',8-trimetilpsolareno
y
5'-yodo-metil-4,5',8-trimetilpsolareno;
(b) tratar el mencionado
5'-halometil-4,4',8-trimetilpsolareno
con un 1,\omega-diaminoalcano para producir
5'-(\omega-amino-2-aza)alquil-4,4',8-trimetilpsolareno.
Otra realización contempla un procedimiento de síntesis de
4,8-dialquil-5'-bromometil-4'-metilpsolarenos,
que comprende: (a) proporcionar un
4,8-dialquil-7-(1-metil-2-oxopropiloxi)psolareno;
(d) agitar
4,8-dialquil-4',5'-dimetilpsolareno
en tetracloruro de carbono para obtener
4,8-dialquil-5'-bromometil-4'-metilpsolareno.
Otra realización más contempla un método de síntesis de
4,8-dialquil-4'-bromometil-5'-psolarenos,
que comprende: proporcionar
4,8-dialquil-7-(1-metil-2-oxopropiloxi)-psolareno;
(d) agitar
4,8-dialquil-4',5-dimetilpsolareno
en cloruro de metileno para obtener
4,8-dialquil-4'-bromometil-5'-psolareno.
La invención contempla un compuesto que tiene la
fórmula
o una de sus sales. La invención
contempla también un compuesto psolareno que comprende: (a) un
sustituyente R_{1} en el átomo de carbono 4', seleccionado ente
el grupo que comprende:
-(CH_{2})_{u}-NH_{2}-(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{z}-NH_{2}-(CH_{2})_{w}-
R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})z-NH_{2} y -(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{y}-R_{4}-(CH_{2})_{z}-NH_{2}; en los que R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente entre el grupo que comprende O y NH, en el que u es un número entero de 1 a 10, w es un número entero de 1 a 5, x es un número entero de 2 a 5, y es un número entero de 2 a 5 y z es un número entero de 2 a 6; y (b) sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} en los átomos de carbono 4,5' y 8, respectivamente, seleccionados independientemente entre el grupo que comprende H y (CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero de 0 a 5; o una de sus sales. La presente invención contempla varias realizaciones de este compuesto, incluidos aquellos en los que: el sustituyente R_{1} es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}, y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; en los que el sustituyente R_{1} es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2} y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; en los que el mencionado sustituyente R_{1} es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-
O-(CH_{2})_{2}-NH-(CH_{2})_{4}-NH_{2} y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; en los que el mencionado sustituyente R_{1} es CH_{2}-NH-(CH_{2})_{4}-NH_{2} y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; y en los que el sustituyente R_{1} es -CH_{2}-NH-(CH_{2})_{3}-NH-(CH_{2})_{4}-NH-(CH_{2})_{3}-NH_{2} y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}.
R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})z-NH_{2} y -(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{y}-R_{4}-(CH_{2})_{z}-NH_{2}; en los que R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente entre el grupo que comprende O y NH, en el que u es un número entero de 1 a 10, w es un número entero de 1 a 5, x es un número entero de 2 a 5, y es un número entero de 2 a 5 y z es un número entero de 2 a 6; y (b) sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} en los átomos de carbono 4,5' y 8, respectivamente, seleccionados independientemente entre el grupo que comprende H y (CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero de 0 a 5; o una de sus sales. La presente invención contempla varias realizaciones de este compuesto, incluidos aquellos en los que: el sustituyente R_{1} es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}, y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; en los que el sustituyente R_{1} es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2} y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; en los que el mencionado sustituyente R_{1} es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-
O-(CH_{2})_{2}-NH-(CH_{2})_{4}-NH_{2} y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; en los que el mencionado sustituyente R_{1} es CH_{2}-NH-(CH_{2})_{4}-NH_{2} y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; y en los que el sustituyente R_{1} es -CH_{2}-NH-(CH_{2})_{3}-NH-(CH_{2})_{4}-NH-(CH_{2})_{3}-NH_{2} y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}.
En una realización alternativa, la presente
invención contempla un compuesto psolareno que comprende: un
sustituyente R_{1} en el átomo de carbono 5', seleccionado ente
el grupo que comprende: (a)
-(CH_{2})_{u}-NH_{2},
-(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{z}-
NH_{2}, -(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{z}NH_{2} y -(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{y}-R_{4}-(CH_{2})_{z}-NH_{2}; en los que R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente entre el grupo que comprende O y NH, en los que u es un número entero de 1 a 10, w es un número entero de 1 a 5, x es un número entero de 2 a 5, y es un número entero de 2 a 5 y z es un número entero de 2 a 6; y (b) sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} en los átomos de carbono 4, 4' y 8, respectivamente, seleccionados independientemente entre el grupo que comprende H y (CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero de 0 a 5, en los que, cuando R_{1} es -(CH_{2})_{u}-NH_{2}, R_{7} es (CH_{2})_{v}CH_{3} y, cuando R_{5}, R_{6} y R_{7} son (CH_{2})_{v}CH_{3}, u es un número entero de 3 a 10 ; o una de sus sales. La presente invención contempla varias realizaciones de este compuesto, incluidos aquellos en los que: el sustituyente R_{1} es -CH_{2}-NH-(CH_{2})_{2}-NH_{2}, y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; y el sustituyente R_{1} es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2} y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}.
NH_{2}, -(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{z}NH_{2} y -(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{y}-R_{4}-(CH_{2})_{z}-NH_{2}; en los que R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente entre el grupo que comprende O y NH, en los que u es un número entero de 1 a 10, w es un número entero de 1 a 5, x es un número entero de 2 a 5, y es un número entero de 2 a 5 y z es un número entero de 2 a 6; y (b) sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} en los átomos de carbono 4, 4' y 8, respectivamente, seleccionados independientemente entre el grupo que comprende H y (CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero de 0 a 5, en los que, cuando R_{1} es -(CH_{2})_{u}-NH_{2}, R_{7} es (CH_{2})_{v}CH_{3} y, cuando R_{5}, R_{6} y R_{7} son (CH_{2})_{v}CH_{3}, u es un número entero de 3 a 10 ; o una de sus sales. La presente invención contempla varias realizaciones de este compuesto, incluidos aquellos en los que: el sustituyente R_{1} es -CH_{2}-NH-(CH_{2})_{2}-NH_{2}, y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; y el sustituyente R_{1} es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2} y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}.
Finalmente, la presente invención contempla
varias realizaciones de medios sintéticos de almacenamiento de
plaquetas. En una realización, el medio sintético de almacenamiento
de plaquetas comprende una solución acuosa de: cloruro sódico
45-100 mM; cloruro potásico 4-5 mM;
citrato 10-15 mM; acetato sódico
20-27 mM; glucosa 0-2 mM, manitol
0-30 mM; fosfato sódico aproximadamente 20 mM;
cloruro magnésico 2-3 mM; y un psolareno
seleccionado entre el grupo constituido por
4'-amino primario-psolareno y
5'-amino primario-psolareno, a una
concentración entre aproximadamente 1 y 250 \muM. En otra
realización, el medio sintético de almacenamiento de plaquetas
comprende una solución acuosa de: cloruro sódico
45-100 mM; citrato 8-15 mM; acetato
sódico 20-35 mM, fosfato sódico aproximadamente 26
mM; un psolareno seleccionado entre el grupo constituido por
4'-amino primario-psolareno y
5'-amino primario-psolareno, a una
concentración entre aproximadamente 1 y 250 \muM. Específicamente,
en una realización de este medio, el medio comprende cloruro sódico
86 mM, citrato 10 mM, acetato sódico 30 mM, fosfato sódico
aproximadamente 26 mM y
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
a una concentración entre aproximadamente 1 y 250 \muM.
La invención también contempla una composición
que tiene propiedades antivirales, que comprende una solución
acuosa de un 4'-amino primario sustituido psolareno
y plaquetas adecuada para uso in vivo. En una realización,
la composición comprende además un medio sintético que comprende
acetato sódico, cloruro potásico, cloruro sódico, citrato sódico,
fosfato sódico y cloruro magnésico. En otra realización, el medio
sintético comprende además al menos un constituyente seleccionado
entre el grupo constituido por manitol y glucosa. En una realización
alternativa, la presente invención contempla una composición que
tiene propiedades antivirales, que comprende una solución acuosa de
un 5'-amino primario sustituido psolareno y
plaquetas adecuada para uso in vivo.
La Fig. 1 detalla el esquema de síntesis del
compuesto de dos isómeros de
bromometil-trialquilpsolareno.
La Fig. 2 detalla el esquema de síntesis del
compuesto de varios psolarenos 4'-amino primario
sustituidos.
La Fig. 3 detalla el esquema de síntesis del
compuesto de varios psolarenos 4'-amino primario
sustituidos.
La Fig. 4 detalla el esquema de síntesis del
compuesto de varios psolarenos que tienen una amina terminal unida
al psolareno en la posición 4' por una cadena alquilo
La Fig. 5 detalla el esquema de síntesis del
compuesto de varios psolarenos 5'-amino primario
sustituidos.
La Fig, 6 es una vista en perspectiva de una
realización del dispositivo de la presente invención.
La Fig. 7 es una vista en corte transversal del
dispositivo presentado en la Fig. 6 a lo largo de las líneas
2-2.
La Fig. 8 es una vista en corte transversal del
dispositivo presentado en la Fig. 6 a lo largo de las líneas
3-3.
La Fig. 9 es una vista en corte transversal del
dispositivo presentado en la Fig. 6 a lo largo de las líneas
4-4.
La Fig. 10A es un diagrama de vías de síntesis y
estructuras químicas de los compuestos 8, 13 y 14 de la presente
invención.
La Fig. 10B es un diagrama de vías de síntesis y
estructuras químicas de los compuestos 2, 4 y 7 de la presente
invención.
La Fig. 10C es un diagrama de vías de síntesis y
estructuras químicas de los compuestos 1, 5, 6, 9 y 10 de la
presente invención.
La Fig. 10D es un diagrama de vías de síntesis y
estructuras químicas de los compuestos 12 y 15 de la presente
invención.
La Fig. 10E es un diagrama de vías de síntesis y
estructuras químicas del compuesto 3 de la presente invención.
La Fig. 10F es un diagrama de vías de síntesis y
estructuras químicas de los compuestos 16 y 17 de la presente
invención.
La Fig. 11 presenta el impacto de la
concentración sobre el log de mort. de R17 cuando se fotoactivan los
compuestos 1-3 de la presente invención.
La Fig. 12 presenta el impacto de la
concentración sobre el log de mort. de R17 cuando se fotoactivan los
compuestos 3-6 de la presente invención.
La Fig. 13 presenta el impacto de la
concentración sobre el log de mort. de R17 cuando se fotoactivan los
compuestos 2 y 6 de la presente invención.
La Fig. 14 presenta el impacto de la
concentración sobre el log de mort. de R17 cuando se fotoactivan los
compuestos 6 y 18 de la presente invención.
La Fig. 15 presenta el impacto de la
concentración sobre el log de mort. de R17 cuando se fotoactiva el
compuesto 16 de la presente invención.
La Fig. 16 presenta el impacto de la variación
de joul/cm^{2} (watt s/cm^{2}) de irradiación sobre el log del
título de R17 para el compuesto 6 de la presente invención.
La Fig. 17 presenta el impacto de la variación
de joul/cm^{2} de irradiación sobre el log del título de R17 para
los compuestos 7, 9 y 10 de la presente invención.
La Fig. 18 presenta el impacto de la variación
de joul/cm^{2} de irradiación sobre el log del título de R17 para
los compuestos 7 y 12 de la presente invención.
La Fig. 19 presenta el impacto de la variación
de joul/cm^{2} de irradiación sobre el log del título de R17 para
el compuesto 15 de la presente invención.
La Fig. 20 presenta el impacto de la variación
de joul/cm^{2} de irradiación sobre el log del título de R17 para
el compuesto 17 de la presente invención.
Las Figs. 21 a 23, numeración.no usada.
La Fig. 24 presenta el efecto de la variación de
la concentración de los compuestos 2 y 6 de la presente invención en
medio sintético.
La Fig. 25A muestra esquemáticamente el enfoque
de separación de un producto estándar de sangre usado en bancos de
sangre.
La Fig. 25B muestra esquemáticamente una
realización de la presente invención por la que se introduce medio
sintético en concentrado de plaquetas preparado como en la Fig.
25A.
La Fig. 25C muestra esquemáticamente el enfoque
de descontaminación de la presente invención aplicada
específicamente a un concentrado de plaquetas diluido con el medio
sintético como en la Fig. 25B.
La Fig. 26A es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 2 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por recuento de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 26B es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 2 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por agregación de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 26C es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 2 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por expresión de GMP-140. "n"
representa el número de experimentos representado por el punto del
dato.
La Fig. 26D es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 2 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por el pH. "n" representa el número de
experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 27A es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 6 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por recuento de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 27B es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 6 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por agregación de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
\newpage
La Fig. 27C es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 6 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por expresión de GMP-140. "n"
representa el número de experimentos representado por el punto del
dato.
La Fig. 27D es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 6 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por el pH. "n" representa el número de
experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 28A es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 17 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por recuento de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 28B es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 17 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por agregación de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 28C es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 17 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por expresión de GMP-140. "n"
representa el número de experimentos representado por el punto del
dato.
La Fig. 28D es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 17 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por el pH. "n" representa el número de
experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 29A es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 18 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por recuento de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 29B es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 18 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por agregación de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 29C es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 18 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por expresión de GMP-140. "n"
representa el número de experimentos representado por el punto del
dato.
La Fig. 29D es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 18 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por el pH. "n" representa el número de
experimentos representado por el punto del dato.
La presente invención proporciona procedimientos
para inactivar patógenos en productos de sangre a usar in
vivo e in vitro sin afectar significativamente a la
función del producto de sangre o exhibir capacidad mutagénica.
Los procedimientos de inactivación de la
presente invención proporcionan procedimientos para inactivar
patógenos y, en particular, virus, en productos de sangre antes de
uso in vivo o in vitro. A diferencia con enfoques
anteriores, el procedimiento sólo requiere tiempos de irradiación
cortos y no hay necesidad de limitar la concentración de oxígeno
molecular.
La descripción de la invención se divide en las
secciones siguientes: (I) Dispositivos de Fotoactivación, (II)
Síntesis de Compuestos, (III) Unión de compuestos a Ácido Nucleico,
(IV) Inactivación de Contaminantes y (V) Conservación de Propiedades
Bioquímicas del Material Tratado.
La presente invención contempla procedimientos
de fotoactivación y, específicamente, de fotoactivación de
compuestos fotorreactivos que se unen a ácidos nucleicos. En
general, un dispositivo de fotoactivación para tratar compuestos
fotorreactivos comprende: (a) medios para proporcionar longitudes de
onda de radiación electromagnética apropiadas para causar la
fotoactivación de al menos un compuesto fotorreactivo; (b) medios
para soportar una pluralidad de muestras en una relación fija con
el medio que proporciona la radiación durante la fotoactivación; y
(c) medios para mantener la temperatura de las muestras en un
intervalo de temperaturas deseado durante la fotoactivación.
Las características principales de una
realización del dispositivo implican: A) una fuente barata de
radiación ultravioleta en una relación fija con el medio para
soportar los recipientes de las muestras, B) una fotoactivación
rápida, C) un procesamiento grande de muestras, D) control de la
temperatura de las muestras irradiadas y E) seguridad inherente.
En los protocolos de descontaminación con
psolarenos se han usado con éxito muchas fuentes de radiación
ultravioleta. Por ejemplo, algunos grupos han irradiado muestras de
las anteriores y las siguientes con bulbos de UVA fluorescentes de
General Electric del tipo F20T12-BLB con un soplado
suave con un ventilador eléctrico a través de la luz para enfriar
la zona. Alter, H. J. y otros, The Lancet, 24:1446 (1988). Otro
grupo ha usado lámparas de luz ultravioleta de onda larga del tipo
A405-TLGW/05, fabricadas por P. W. Allen Co.,
Londres, colocadas encima de las muestras de virus en contacto
directo con las cubiertas de discos petri que contenían las
muestras, a temperatura ambiente. La intensidad total suministrada
a las muestras en estas condiciones era de 1,3x10^{15} fotones/s
cm^{2} (o 0.7 mW/cm^{2} o 0,0007 J/cm^{2} s) en el disco
petri. Hearst, J. E. y Thiry, L. Nucleic Acids Research, 4:1339
(1977).
Un dispositivo de fotoactivación preferido tiene
una fuente barata de radiación ultravioleta en una relación fija
con el medio para soportar los recipientes de las muestras. La
radiación ultravioleta está en forma de energía que ocupa una
porción del espectro de radiación electromagnética (el espectro de
radiación electromagnética va desde los rayos cósmicos a ondas de
radio). La radiación ultravioleta puede proceder de muchas fuentes
naturales y artificiales. Dependiendo de la fuente de radiación
ultravioleta, puede estar acompañada por otros tipos (no
ultravioleta) de radiación electromagnética (por ejemplo, luz
visible).
Los tipos particulares de radiación ultravioleta
se describen aquí en términos de longitud de onda. La longitud de
onda se describe en esta memoria en téminos de nanómetros
("nM", 10^{-9}). A los fines de esta memoria, la radiación
ultravioleta se extiende desde aproximadamente 180 nm a 400 nm.
Cuando una fuente de radiación, mediante filtros u otros medios, no
permite radiaciones por debajo de una longitud de onda particular
(por ejemplo, 320 nm), se dice que tiene un "corte" del umbral
inferior a esa longitud de onda (por ejemplo, un "corte de la
longitud de onda a 300 nanómetros"). Análogamente, cuando una
fuente de radiación sólo permite radiaciones por debajo de una
longitud de onda particular (por ejemplo, 360 nm), se dice que tiene
un "corte" del umbral superior a es longitud de onda (por
ejemplo, un corte de longitud de onda a 360 nanómetros).
Para cualquier reacción fotoquímica se desea
eliminar o al menos minimizar cualesquiera recciones secundarias
perjudiciales. Algunas de estas reacciones secundarias puede estar
causadas por la excitación de cromóferos endógenos que pueden estar
presentes durante el proceso de fotoactivación. En un sistema en el
que sólo están presentes ácido nucleico y psolareno, los cromóferos
endógenos son las propias bases de ácido nucleico. Restringiendo el
proceso de fotoactivación a longitudes de onda mayores que 320 nm,
se minimiza el daño directo a los ácidos nucleicos puesto que hay
muy poca absorción por los ácidos nucleicos por encima de 313
nm.
En suero o plasma humano, típicamente, el ácido
nucleico está presente junto con constituyentes biológicos
adicionales. Si el fluido biológico es proteína, el corte a 320 nm
será adecuado para minimizar reacciones secundarias (los
aminoácidos aromáticos no absorben por encima de 320 nm). Si el
fluido biológico incluye otros analitos, puede haber constituyentes
que son sensibles a longitudes de onda de luz particulares. A la
vista de la presencia de estos constituyentes endógenos, se diseña
el dispositivo de manera que permita la irradiación dentro de un
intervalo pequeño de longitudes de onda específicas y deseables,
evitando así el daño de componentes de la sangre. El intervalo
preferido de longitudes de onda deseables es de entre 320 y 350
nm.
Se puede lograr cierta selectividad seleccionado
fuentes de irradiación comerciales. Por ejemplo, si bien los tubos
fluorescentes típicos emiten longitudes de onda que varían de 300 nm
a por encima de 400 nm (con un pico ancho centrado en torno a 360
nm), las lámparas fuorescentes de tipo BLB están diseñadas para
eliminar longitudes de onda por encima de 400 nm. Esto, sin
embargo, sólo proporciona un corte del umbral superior.
En una realización preferente, el dispositivo
comprende un medio filtrante adicional. En una realización, el
medio filtrante comprende un filtro de corte de vidrio, tal como una
pieza de vidrio de cobalto. En una realización, el medio filtrante
es vidrio BK-7, adquirible de Shott Glass
Technologies, Inc. Duryea, PA. En otra realización, el medio
filtrante comprende una solución filtrante líquida que sólo
transmite una región específica del espectro electromagnético, tal
como una solución acuosa de Co(NO_{3})_{2}. Esta
solución de sal da una ventana de transmisión de
320-400 nm. En una realización preferente, la
solución acuosa de Co(NO_{3})_{2} se usa en
combinación con NiSO_{4} para eliminar el componente de 365 nm del
espectro de emisión de la fuente fuorescente o de arco usada. La
solución de Co-Ni conserva notablemente bien su
transmisión inicial incluso después de 10 horas de exposición a la
luz directa de fuentes de alta energía.
Varias sales inorgánicas y vidrios satisfacen
los requerimientos necesarios. Por ejemplo, el sulfato cúprico es
un filtro general muy útil para eliminar el infarrojo cuando sólo se
ha de aislar el ultravioleta. Su estabilidad en fuentes intensas es
bastante buena. Los expertos en la técnica conocen otras sales. Para
conseguir longitudes de onda e intensidades específicas se pueden
usar también lámparas de abertura o reflectoras.
Cuando en este documento la radiación
ultravioleta se describe en términos de irradiación, se expresa en
términos de intensidad de flujo (millwats por cm^{2} o mW/cmo
J/cm^{2} s). "Rendimiento" abarca en esta memoria tanto la
emisión de radiación (sí o no; conectado o desconectado) como el
nivel de irradiación. En una realización preferente, la intensidad
está controlada en 4 puntos, 2 por cada lado del plano de
irradiación.
Una fuente preferida de radiación ultravioleta
es una fuente fluorescente. La fluorescencia es un caso especial de
luminiscencia. La luminiscencia implica la absorción de radiación
electromagnética por una sustancia y la conversión de la energía en
radiación de una longitud de onda diferente. Con la fluorescencia,
la sustancia que se excita por la radiación electromagnética vuelve
a su estado de base emitiendo un quantum de radiación
electromagnética. Mientras que las fuentes fluorescentes se ha
tratado hasta ahora que sean de una intensidad demasiado baja con
el fin de ser útiles para la fotoactivación, en una realización, la
presente invención usa fuentes fluorescentes para conseguir
resultados sólo alcanzables con un equipo caro.
Tal como se usa en esta memoria, relación fija
se define como que comprende un distancia y geometría fijas entre
la muestra y la fuente de luz durante la irradiación de la muestra.
La distancia se refiere a la distancia entre la fuente y la muestra
soportada. Se sabe que la intensidad de la luz de una fuente es
inversamente proporcional al cuadrado de la distancia desde el
punto en que está situada la fuente. Así, pequeños cambios de la
distancia desde la fuente pueden tener un impacto drástico sobre la
intensidad. Puesto que los cambios de intensidad pueden impactar
sobre los resultados de la fotoactivación, en los dispositivos de la
presente invención se evitan cambios de la distancia. Esto
proporciona reproductividad y repetibilidad.
Geometría se refiere a la situación de la fuente
luminosa. Por ejemplo, se puede imaginar que las fuentes de luz
pudieran colocarse en torno al soporte de la muestra de varias
maneras (en los lados, al fondo, en círculo, etc.). La geometría
usada en una realización preferente permite una exposición a la luz
uniforme de una intensidad apropiada para una rápida
fotoactivación. La geometría de un dispositivo preferido de la
presente invención implica múltiples fuentes de lámparas lineales en
oposición a fuentes puntuales individuales. Además, hay varias
superficies reflectantes y varias superficies absorbentes. A causa
de esta complicada geometría, se han de evitar cambios en la
situación o el número de las lámparas respecto a la situación de las
muestras a irradiar, ya que tales cambios darían por resultado
cambios de intensidad.
La fuente de luz de la realización preferente
permite una fotoactivación rápida. Las características de intensidad
del dispositivo de irradiación se han seleccionado para que sean
convenientes en el caso de que pueda ser necesario procesar muchas
series de muestras múltiples. En este supuesto, un tiempo de
exposición de 15 minutos o menos es un objetivo práctico.
Al diseñar los dispositivos, se ha optimizado la
posición relativa de los elementos del dispositivo preferido para
un tiempo de irradiación de aproximadamente 15 minutos de manera
que, cuando se midan longitudes de onda entre aproximadamente 320 y
350 nm, se proporcione a los recipientes de las muestras un flujo de
una intensidad mayor que aproximadamente 1 mW/cm^{2} (0,001
J/cm^{2}).
Como se ha indicado, otro rasgo importante de
los dispositivos de fotoactivación es que están dotados para
procesar un gran número de muestras. A este respecto, un elemento de
los dispositivos de la presente invención es un medio para soportar
una pluralidad de bolsas de sangre. En la realización preferente, el
medio soporte comprende un soporte de bolsas de sangre colocado
entre dos bancos de luces. Aceptando bolsas comúnmente usadas
comercialmente, el dispositivo permite procesar convenientemente un
gran número de muestras.
Como se ha indicado, uno de los rasgos
importantes de los dispositivos de fotoactivación es el control de
la temperatura. El control de la temperatura es importante porque la
temperatura de la muestra durante todo el tiempo en que se expone a
la luz puede impactar espectacularmente sobre los resultados. Por
ejemplo, las condiciones que promueven la estructura secundaria en
ácidos nucleicos también intensifican las constantes de afinidad de
muchos psolarenos a ácidos nucleicos. Hyde y Hearst, Biochemistry,
17, 1251 (1978). Estas condiciones son una mezcla de la composición
del disolvente y la temperatura. Con RNA ribosomal 5S de cadena
simple, la irradiación a baja temperatura intensifica la adición
covalente de HMT a 5S rRNA en dos veces a 4ºC en comparación a
20ºC. Thompson y otros, J. Mol. Biol.. 147:417 (1981). Incluso se ha
visto más intensificación inducida por la temperatura de la unión
de psolarenos con polinucleótidos sintéticos. Thompson y otros,
Biochemistry 21:1363 (1982).
La radiación ultravioleta puede causar
quemaduras importantes. Dependiendo de la naturaleza de la
exposición, también puede ser carcinogénica. En una realización
preferente, el usuario está protegido de la fuente de luz. Esto
contrasta con las fuentes comerciales de luz ultravioleta manuales
así como con fuentes grandes de alta intensidad. En una realización
preferente, la fuente de irradiación está contenida en una carcasa
hecha de un material que obstruye la transmisión de energía radiante
(esto es, una carcasa opaca). No se permite el paso de irradiación
al paciente. Esto permite una seguridad inherente para el
usuario.
El término "compuestos de fotoactivación"
(o "compuestos fotorreactivos") define una familia de
compuestos que experimentan un cambio químico en respuesta a la
radiación electromagnética. La Tabla 1 es una lista parcial de
compuestos de fotoactivación. Tabla 1. Compuestos de fotoactivación
Actinomicinas Antraciclinonas Antramicina Benzodipironas Fluorenos
y Fluorenonas Furocumarinas Mitomicina Monostral Norfilina A Azul
Rápido Muchos colorantes orgánicos no listados específicamente
Fenantridinas Sales de Fenazationio Fenazinas Fenotiazinas
Fenilazidas Quinolinas Tiaxantenonas.
Las especies preferidas de compuestos
fotorreactivos descritos en este contexto comúnmente se denominan
furocumarinas. En particular, la presente invención contempla los
compuestos descritos como psolarenos:
[7H-furo(3,2-g-(1)-benzo-piran-7-ona,
o \beta-lactona del ácido
6-hidroxi-5-benzofuranacrílico],
que son lineales:
y en los que los dos restos de
oxígeno anexionados al resto central aromático tienen una
orientación 1, 3 y, además, en los que el resto del anillo de
furano está unido a la posición 6 del sistema de cumarina de dos
anillos. Los derivados de psolareno derivan por sustitución de la
furocumarina lineal en las posiciones 3, 4, 5, 8, 4' o
5'.
El 8-metoxipsolareno (conocido
en la bibliografía bajo distintos nombres, por ejemplo, xantotoxina,
metoxalen, 8-MOP) es un psolareno natural con una
unión fotoactivada relativamente baja a ácidos nucleicos y una
capacidad mutagénica baja en el ensayo de Ames, que se describe en
la sección experimental siguiente. El
4'-aminometil-4,5',8
trimetilpsolareno (AMT) es uno de los derivados psolareno más
reactivos que se unen a ácidos nucleicos, que proporcionan hasta 1
aducto AMT por 3,5 pares de base de DNA. S. T. Isaacs, G. Wiessehahn
y L. M. Hallick, NCI Monograph 66:21 (1984). Sin embargo, el AMT
tambien exhibe unos niveles de capacidad mutagénica
significativamente altos. Se deseaba um nuevo grupo de psolarenos
que tuviera las mejores características de 8-MOP y
de AMT: baja capacidad mutagénica y alta afinidad de unión a ácidos
nucleicos con el fin de lograr una inactivación segura e intensa de
patógenos. Los compuestos de la presente invención se diseñaron para
que fueran compuestos de este tipo.
Los "psolarenos 4'-amino
primario-sustituido" se definen como compuestos
de psolareno que tienen un grupo NH_{2} unido a una cadena de
hidrocarburo que tiene una longitud total de 2 a 20 carbonos, en la
que de 0 a 6 de esos carbonos están reemplazados independientemente
por NH u O y cada punto de reemplazo está separado de cada uno de
los otros puntos de reemplazo por al menos dos carbonos y está
separado del psolareno por al menos un carbono. Los psolarenos
4'-amino primario-sustituidos pueden
tener sustituciones adicionales en las posiciones 4, 5' y 8 del
psolareno, sustituciones entre las que están, aunque no únicamente,
los grupos siguientes: H y (CH_{2})_{n}CH_{3}, en el
que n = 0-6.
La presente invención contempla procedimientos
de síntesis de los nuevos compuestos de la presente invención, así
como nuevos procedimientos de síntesis de intermedios conocidos.
Específicamente, los nuevos compuestos son psolarenos 4'- o
5'-amino primario- sustituidos monoalqulados,
dialquilados o trialquilados. En las Figs. 10A-10F
se presentan varios ejemplos de los esquemas discutidos en esta
sección. Para facilidad de referencia, la Tabla 2 expone la
nomenclatura usada para los derivados de psolarenos discutidos en el
documento. Las estructuras de los compuestos 1-18
también están representadas en las Figs. 10A-10F.
Nótese que en esta sección (titulada "B. Síntesis de los
psolarenos") los números romanos usados para identificar
compuestos se correlacionan sólo con los Esquemas
1-6 y no se correlacionan con los números de los
compuestos que se dan en la Tabla 2 o las Figs.
10A-10F. Los compuestos 16 a 18 no forman parte de
la presente invención.
Lo más lógico es describir primeramente los
intermedios útiles en la síntesis de muchos de los compuestos.
Entre algunos intermedios importantes están incluidos trimetil- y
tetrametilpsolarenos,
4'-halometil-4,5',8-trimetilpsolarenos
y
5'-halometil-4,4,8-trimetilpsolarenos.
La preparación de estos intermedios críticos presenta retos
difíciles.
Las síntesis anteriores de
4'-clorometil-4,5',8-trimtilpsolareno
(4'-CMT) y
4'-bromometil-4,5',8
trimetilpsolareno (4'-BrMT) parten de
4,5',8-trimetilpsolareno (5'-TMP)
que es adquirible comercialmente (Aldrich Chemical Co., Milwakee,
WI) o se puede preparar en 4 etapas como se describe más adelante
para otros psolarenos alquilados. 5'-TMP se
convierte en 4'-CMT usando un gran exceso
(20-50 equivalentes) de clorometil éter, muy
carcinogénico y volátil. La halometilación de los
4,5',8-trialquilpsolarenos con clorometil metil éter
o bromometil metil éter se describe en la patente U.S. nº.
4.124.598 expedida a Hearst. El compuesto de bromo,
4'-BrMT, se prepara análogamente usando bromometil
metil éter, que es algo menos volátil. Se obtienen rendimientos de
sólo 30-60% del intermedio deseado. El
5'-clorometil-4,4'.8-trimetilpsolareno
(5'-CMT) y
5'-bromometil-4,4',8-trimetilpsolareno
(5'-BrMT) se preparan de manera similar usando el
compuesto isómero de partida
4,4',8-trimetilpsolareno (4'-TMP)
[patente U.S. nº. 4.294.822, expedida a Kaufman; Mc Leod y otros,
Synthesis of Benzofuranoid Systems. I. Furocoumarins,
Benzofurans and Dibenzofurans, Tetrahedron Letters 237 (1972)].
Algunas figuras a las que se hace referencia en la discusión de la
síntesis que sigue contienen números romanos usados para marcar
estructuras que engloban más de un compuesto. Este sistema de
numeración es distinto del sistema de numeración de la Tabla 2
anterior, que no ha de confundirse con él, que se usó para
identificar varios compuestos específicos.
Se describe en esta memoria un procedimiento muy
mejorado que permite la síntesis de cualquier isómero de los
bromomonometil-trialquilpsolarenos a partir del
mismo precursor de psolareno mediante control cuidadoso de las
condiciones de reacción. Véase la Fig. 1. En la Fig. 1, A_{1} y
A_{2} se seleccionan independientemente entre el grupo que
comprende H y una cadena alquilo que tiene 1-6
átomos de carbono. La reacción de la
4,8-dialquil-7-hidroxicumarina
con
2-cloro-3-butanona
en condiciones básicas típicas proporciona
4,8-dialquil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxicumarina
(I). Este material se cicla por calentamiento en NaOH acuoso para
que resulte
4,8-dialquil-4',5'-dimetilpsolareno
(II). El tratamiento del psolareno tetrasustituido y
N-bromosuccinimida (NBS) en un disolvente a
temperatura ambiente hasta 150ºC conduce a la bromación en la
posición 4' o 5', dependiendo de las condiciones usadas. Se puede
añadir un catalizador tal como peróxido de dibenzoílo, pero no es
necesario. Si el disolvente usado es tetracloruro de carbono a
reflujo, se obtiene
4,8-dialquil-5'-bromometil-4'-etilpsolareno
(IV) con rendimientos de 50% o mayores. Si se usa cloruro de
metileno a temperatura ambiente, sólo se obtiene
4.8-dialquil-4'-bromometil-5'-metilpsolareno
(III) con rendimientos \geq 80%. También se puede hacer la
bromación bencílica en otros disolventes, produciéndose uno de los
productos isómeros solo o en una mezcla. Entre estos disolventes
están incluidos, aunque no únicamente,
1,2-diclorometano, cloroformo, bromotriclorometano y
benceno.
Se considera ahora la síntesis de una subclase
de psolarenos lineales; los
4,5',8-trialquilpsolarenos se pueden hacer como
sigue. Las 4,8-dialquilcumarinas se preparan a
partir de 2-alquilrresorcinoles y un éster
3-oxoalcanoato por reacción de Pechmann (Organic
Reactions vol. VII, capít. 1, ed. Adams y otros, Wiley, NY (1953)).
El grupo hidroxi se trata con un agente de alquilación,
CH_{2}=CHX-CH(R)Y, en el que X es un
haluro o hidrógeno, Y es un haluro o sulfonato, y R es H o
(CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero de
0 a 4. El reagrupamiento de Claisen del alil éter resultante da
4,8-dialquil-6-alil-7-hidroxicumarina.
Las cumarinas se convierten en
4,5',8-trialquilpsolarenos usando procedimientos
similares a uno de los varios procedimientos descritos antes (esto
es, véase Bender y otros, J. Org. Chem. 44:2176 (1979); Kaufman,
patente U.S. n^{os}. 4.235.781 y 4.216.154. El
4,5',8-trimetilpsolareno es un producto natural y es
adquirible comercialmente (Aldrich Chemical Co., Milwakee, WI).
Los
4'-(\omega-haloalquil)trialquilpsolarenos
de cadena larga (denominados en esta memoria 4'-HATP
de cadena larga), en los que los grupos alquilo se seleccionan
entre el grupo de (CH_{2})_{2} a
(CH_{2})_{10}, se pueden preparar en condiciones de
Friedel-Crafts como se discute en otro lugar (Olah y
Kuhn, J. Org. Chem., 1964, 29, 2317; Friedel-Crafts
and Related Reactions, vol. II, parte 2, Olah, ed. Interscience, NY,
1964, pág. 749). Si bien se han descrito reacciones de los
intermedios halometilo con aminas (por ejemplo Hearst y otros,
patente U.S. nº. 4.124.598) y alcoholes (por ejemplo, Kaufman,
patente U.S. nº. 4.269.852). sólo hay dos trabajos originales sobre
la formación de aminas primarias de cadena extendida. Describen la
reacción de
4'-clorometil-4,5',8-psolareno
con H_{2}N-(CH_{2})_{n}-NH_{2}
(siendo n=2, 4, 6) (Véase Lee, B. y otros, Interaction of
Psolaren Derivatized Oligodeoxyribonucleoside Methylphosphonates
with Singled-Stranded DNA, Biochemistry 27:3197
(1988) y con
H_{2}NCH_{2}CH_{2}SSCH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2}
(Goldenberg, M. y otros, Synthesis and Properties of
Novel Psolaren Derivatives, Biochemistry 27:6971 (1988)). No se
ha dado cuenta anteriormente de la utilidad de los compuestos
resultantes para fotorreacción con ácidos nucleicos. Las
propiedades de estos materiales, tales como una capacidad mutagénica
aminorada, están basadas inesperadamente en lo que se conoce sobre
compuestos previamente preparados, tales como AMT.
En la Fig. 2 se presentan varias rutas de
síntesis. Partiendo de 4-HATP (en el que w es un
número de 1 a 5; A_{1}, A_{2} y A_{3} se seleccionan
independientemente entre el grupo que comprende H y
(CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número de 0 a 5;
y en el que X=Br, Cl o I), la reacción con un exceso de un compuesto
bis-hidroxi, HO-(B)-OH, en el que B
es: una cadena alquilo (por ejemplo,
HO-B-OH es
1,3-propanodiol), un monoéter (por ejemplo,
dietilenglicol) o un poliéter (por ejemplo, tetraetilenglicol), que
tiene una longitud de 18 átomos de carbono o menos, neto o con un
disolvente tal como acetona a 20-80ºC, y una base
para cadenas de carbono más largas que halometilo, da un
(\omega-hidroxialcoxi)alquilpsolereno. El
grupo terminal hidroxi se puede transformar en un grupo amino en
una variedad de condiciones (por ejemplo, véase Larock,
Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, NY,
1989). En particular, el grupo hidroxi se puede convertir en el
éster del ácido metanosulfónico (estructura VI) en presencia de
cloruro de metanosulfonilo (CH_{3}SO_{3}Cl). Éste se puede
convertir seguidamente en la azida en metanol a reflujo y la azida
reducir a la amina final, estructura VII (son ejemplos los
compuestos 2, 4 y 7). El procedimiento aquí descrito utiliza
trifenilfosfina y agua en tetrahidrofurano (THF) para la reducción,
pero se contemplan otros
procedimientos.
procedimientos.
Un procedimiento preferido para la preparación
de la estructura VII usa la reacción de 4'-HATP con
un alcohol lineal primario que contiene una amina protegida (por
ejemplo un grupo ftalimido) en la posición terminal, en un
disolvente adecuado tal como DMF a 25-150ºC para
obtener V. La amina se desprotege luego en condiciones estándar
(por ejemplo, hidrazina o MeNH_{2} acuosa para desproteger un
grupo ftalimido [también se contemplan alquilhidrazinas superiores,
tales como bencilhidrazinas]) para que resulte VII.
A la inversa, se puede hacer reaccionar la
estructura VI con diaminas, H_{2}N-(B')-NH_{2}
en la que B' es una cadena alquilo (por ejemplo,
1,4-butanodiamina), un monoéter (por ejemplo,
3-oxa-1,5-pentanodiamina)
o un poliéter (por ejemplo,
3,6-dioxa-1,8-octanodiamina)
para que resulte el producto final, compuesto VIII (son ejemplos de
compuestos de esta estructura los compuestos 8, 13 y 14). Esta
reacción se realiza con un exceso de diamina en acetonitrilo a
reflujo, pero son igualmente posibles otros disolventes y
temperaturas.
Se desean algunos compuestos finales en los que
la cadena de carbono está unida a la posición 4'- del anillo de
psolareno por un grupo aminoalquilo
[NH(CH_{2})_{w}] y no por un grupo oxialquilo
[O(CH_{2})_{w}]. Las rutas de síntesis para estos
compuestos se presentan en la Fig. 3. Cuando la unión entre este
nitrógeno y el nitrógeno terminal contiene sólo subunidades
CH_{2} y oxígeno pero no otros nitrógenos (estructura X) (son
ejemplos los compuestos 1, 5, 6, 9, 10 y 11), el producto puede
prepararse convenientemente a partir de 4'-HATP y
la diamina apropiada de estructura IX. Este procedimiento es también
aplicable a productos finales que contienen más de dos nitrógenos
en la cadena (estructura XIII) (son ejemplos los compuestos 12 y 15)
a partir de poliaminas de estructura XII (por ejemplo,
norespermidina o espermina [adquiribles comercialmente de Aldrich,
Milwaukee, WI]); sin embargo, en este caso también se forman
estructuras isómeras en cantidades considerables. El procedimiento
preferido para las preparación de la estructura XIII es la aminación
reductora del psolaren-4'-alcanal
(XI) con una poliamina de estructura XII y un agente reductor tal
como cianoborohidruro sódico. Esta aminación reductora es aplicable
también a la síntesis del compuesto X. Los carboxaldehídos
(estructura XI, w=0) se han preparado previamente por hidrólisis de
los compuestos 4'-halometilo y posterior oxidación
del compuesto 4'-hidroximetilo resultante. (Isaacs y
otros, J. Labelled Cmpds Radiopharm., 1982, 19, 345). Estos
compuestos también se pueden preparar convenientemente por
formilación de los compuestos 4'-hidruro con una
formamida y POCl_{3} o con hexametilentetraamina en ácido. Los
alcanales de cadena larga se pueden preparar a partir de los
compuestos 4'-HATP por conversión del grupo halo
terminal en funcionalidad aldehído (por ejemplo, Durst, Adv. Org.
Chem. 6:285 (1969)).
Otros productos finales tienen una amina
terminal unida al psolareno por una cadena alquilo. Como se presenta
en la Fig. 4, estos compuestos (estructuras XIV) (un ejemplo es el
compuesto 3) se preparan (1) por reacción del
4'-HATP con ftalimida o azida potásica y posterior
liberación de la amina deseada como antes, por ejemplo, con
hidrazina, o (2) por conversión del 4'-HATP en el
compuesto cianuro, seguida de reducción, por ejemplo con
NaBH_{4}-CF_{3}CO_{2}H.
La discusión de la conversión de
4,5',8-trialquilpsolarenos en
4'-amino
funcionalizado-4,5',8-trialquilpsolarenos
se aplica igualmente bien cuando la posición 4 y/u 8 está
sustituida con sólo un hidrógeno, obteniéndose así
4'-amino primario sustituido-5' (4 u
8)-dialquilpsolarenos y 4'-amino
primario
sustituido-5'-alquilpsolarenos.
La presente invención contempla la unión de
nuevos y de conocidos compuestos a ácido nucleico, incluidos (aunque
no limitados a) ácido nucleico viral y ácido nucleico bacteriano.
Un enfoque de la presente invención para unir compuestos de
fotoactivación a ácido nucleico es la fotounión. La fotounión se
define como la unión de compuestos de fotounión en presencia de
longitudes de onda de luz fotoactivantes. Los compuestos de
fotounión son compuestos que se unen a ácidos nucleicos en
presencia de longitudes de onda de luz fotoactivantes. La presente
unión contempla procedimientos de fotounión con compuestos de
fotounión de la presente invención.
La presente invención contempla el tratamiento
de un producto de sangre con un compuesto fotoactivante y la
irradiación para inactivar secuencias de ácidos nucleicos
contaminantes de patógenos antes de usar el producto de sangre.
El término "inactivación" se define en esta
memoria como la alteración del ácido nucleico de una unidad de
patógeno para hacer que la unidad de patógeno sea incapaz de
replicación. Esto es diferente de "inactivación total", en la
que todas las unidades de patógeno presentes en una muestra dada se
hacen incapaces de replicación, o "inactivación sustancial",
de forma que la mayoría de las unidades de patógeno presentes se
hacen incapaces de replicación. La "eficiencia de
inactivación" de un compuesto se define como el nivel de
inactivación del compuesto que se puede alcanzar a una
concentración dada del compuesto o una dosis de irradiación dada.
Por ejemplo, si 100 \muM de un hipotético compuesto X inactivan 5
logs de virus HIV mientras que, en las mismas condiciones
experimentales, la misma concentración del compuesto Y inactiva sólo
1 log de virus, el compuesto X tendría una "eficiencia de
inactivación" mejor que el compuesto Y.
Para apreciar si un procedimiento de
inactivación puede lograr o no "inactivación total", es útil
considerar un ejemplo específico. Se dice que un cultivo bacteriano
está inactivado si una parte alícuota del cultivo, cuando se pasa a
una placa de cultivo fresca y que puede crecer, es indetectable
después de un cierto período de tiempo. Para que una señal sea
detectable, se debe aplicar a la placa un número mínimo de bacterias
viables. Con el procedimiento de detección óptimo, este número
mínimo es 1 célula bacteriana. Con un procedimiento de detección
submínimo, el número mínimo de células bacterianas aplicadas de
manera que se observe una señal puede ser mucho mayor que 1. El
procedimiento de detección determina un "umbral" por debajo del
cual el "procedimiento de inactivación" es completamente
eficaz (y por encima del cual la "inactivación" es, de hecho,
sólo parcialmente eficaz).
Las mismas consideraciones de procedimiento de
detección y umbral existen cuando se determina el límite de
sensibilidad de un procedimiento de detección para ácidos nucleicos.
También aquí, "inactivación" significa que una unidad de
patógeno se convierte en incapaz de replicación.
En el caso de los procedimientos de inactivación
para material a usar por seres humanos, sea in vitro o in
vivo, teóricamente, el procedimiento de detección a seguir puede
ser la medición del nivel de infección con una enfermedad como
resultado de la exposición al material. El umbral por debajo del
cual el procedimiento de inactivación es completo se considera que
es el nivel de inactivación que es suficiente para prevenir que se
produzca enfermedad debida al contacto con el material. Se acepta
que en este escenario práctico no es esencial que los
procedimientos de la presente invención den por resultado la
"inactivación total". Esto es, la "inactivación
sustancial" será adecuada en tanto que la porción viable sea
insuficiente para causar la enfermedad. Así, "sustancialmente la
totalidad" de un patógeno está inactivada cuando cualquier
porción viable del patógeno que permanece sea insuficiente para
causar enfermedad. El procedimiento de inactivación de la presente
invención convierte en sustancialmente inactivado el ácido nucleico
de los patógenos.
Sin que se pretenda limitarse a cualquier
procedimiento por el que los compuestos inactivan patógenos, se
cree que la inactivación resulta de la unión inducida por la luz de
los psolarenos a ácido nucleico. Además, si bien no se asegura que
el procedimiento de inactivación de la presente invención esté
limitado por la naturaleza del ácido nucleico, se contempla que el
procedimiento de inactivación convierta todas las formas de ácido
nucleico (sea DNA, mRNA, etc.) en sustancialmente inactivadas.
Cuando los compuestos de fotoactivación se usan
para modificar un ácido nucleico, la interacción del ácido nucleico
del patógeno (sea DNA, mRNA, etc.) con el compuesto de
fotoactivación preferiblemente previene la replicación del patógeno
de manera que, si se expone una persona al patógeno tratado, no
resultará una infección.
"Medio sintético" se define en esta memoria
como un medio acuoso sintético de almacenamiento de sangre o un
producto de sangre. En una realización, la presente invención
contempla inactivar productos de sangre en un medio sintético que
comprende una solución salina tamponada. Este procedimiento reduce
el daño causado a productos de sangre y permite el uso de
concentraciones mucho más bajas de compuestos de fotoactivación.
El procedimiento de fotoinactivación con
psolarenos inactiva patógenos basados en ácido nucleico presentes
en la sangre por un procedimiento singular. Así, tiene potencial
para eliminar bacterias, protozoos y virus. Si hubiera estado
disponible un procedimiento de descontaminación eficaz antes de la
llegada de los AIDS, no se hubiera producido transmisión pandémica
de HIV asociada a transfusiones. La descontaminación basada en
psolarenos tiene el potencial de eliminar todos los agentes
infecciosos del suministro de sangre, independientemente del
patógeno involucrado.
Adicionalmente, la descontaminación basada en
psolarenos tiene la capacidad de esterilizar compuestos de sangre
después de su recogida y procesamiento, lo que en el caso de
concentrados de plaquetas podría resolver el problema de una
contaminación bacteriana baja y dar por resultado una vida de
almacenamiento extendida. Morrow, J. F. y otros, JAMA
266:555-558 (1991); Bertolini, F. y otros,
Transfusión 32:152-156 (1992).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En la Tabla 3 aparece una lista de virus que han
sido inactivados fotoquímicamente por uno o más psolarenos. (De la
Tabla 1 de Hanson, C.V., Blood Cells, 18:7 (1992)). En el artículo,
se señala que los piconavirus fueron fotoinactivados sólo si los
psolarenos estaban presentes durante el crecimiento del virus. Esta
lista no es exhaustiva y es meramente representativa de la gran
variedad de patógenos que pueden inactivar los psolarenos. La
presente invención contempla la inactivación de estos y otros virus
por compuestos que se describen en la presente memoria. Los
compuestos son particularmente adecuados para inactivar virus de
envoltura tales como virus HIV.
\newpage
Con el fin de evaluar un compuesto para decidir
si sería útil en los procedimientos de descontaminación fotoquímica
(PCD) de la presente invención, se deben considerar dos propiedades
importantes: (1) la capacidad del compuesto de inactivar patógenos
y (2) su capacidad mutagénica. La capacidad de un compuesto de
inactivar patógenos se puede determinar por varios procedimientos.
Una técnica es realizar una exploración bacteriófaga; un ensayo que
determina la unión de un ácido nucleico con los compuestos de
ensayo. Una exploración de este tipo, una exploración
r-17, se describe detalladamente en el Ejemplo 2. Si
la exploración r-17 revela actividad de
inactivación, es útil para ensayar directamente la capacidad del
compuesto de inactivar un virus. Un procedimiento para realizar una
exploración directa de inactivación viral se describe detalladamente
en el Ejemplo 13 para HIV exento de células.
La exploración bacteriófaga de R17 se cree que
predice la eficiencia de inactivación de HIV, así como la eficiencia
de compuestos contra muchos otros virus. Se escogió el R17 porque
se esperaba que fuera un patógeno muy difícil de inactivar. Es un
fago de RNA pequeño, de cadena simple. Sin que eso signifique una
limitación a cualquier medio por el que actúa la presente
invención, se espera que las piezas más cortas de ácido nucleico son
más difíciles de inactivar porque requieren una frecuencia más alta
de formación de aductos de psolareno que piezas más largas de ácido
nucleico. Además, los patógenos de RNA de cadena simple son más
difíciles de inactivar porque los psolarenos no se pueden
intercalar entre pares de base, como con ácidos nucleicos de cadena
doble, ni forman diaductos como reticulaciones entre cadenas. Así,
se espera que, cuando se logre la inactivación de R17, estas mismas
condiciones causarán la inactivación de muchos virus y
bacterias.
La exploración de HIV exento de células
complementa la exploración de r-17 por afirmar que
un compuesto dado que ha revelado ser positivo en la
r-17 actuará eficazmente para inactivar virus. Así,
si un compuesto revela actividad en la exploración de
r-17, seguidamente se ensaya en la exploración de
inactivación viral.
La segunda propiedad que es importante al
ensayar un compuesto para uso en los procedimientos de la presente
invención es la capacidad mutagénica. El ensayo de exploración de
mutágeno/carcinógeno más extendido es el ensayo de Ames. Este
ensayo lo describen D.M. Maron y B.N. Ames en Mutation Research
113:173 (1983) y una exploración específica se describe
detalladamente en el posterior Ejemplo 17. El ensayo de Ames utiliza
varias cepas singulares de Salmonella typhimurium que son
histidina-dependientes para el crecimiento y que
carecen de las usuales enzimas de reparación de DNA. La frecuencia
de mutaciones normales que convierten las bacterias en
independientes de la histidina (esto es, la frecuencia de
reversiones espontáneas) es baja. El ensayo permite evaluar el
impacto de un compuesto sobre esta frecuencia de reversión.
A causa de que algunas sustancias no son
mutagénicas en sí pero se convierten en mutágenas por acción
metabólica, el compuesto a ensayar se mezcla con la bacteria en
placas de agar junto con extracto de hígado. El extracto de hígado
sirve para mimetizar la acción metabólica en un animal. Las placas
de control tiene sólo la bacteria y el extracto.
Se deja incubar las mezclas. El crecimiento de
bacterias (si lo hay) se comprueba contando colonias. Un ensayo de
Ames positivo es uno en el que el número de colonias en las placas
con mezclas que contienen el compuesto excede significativamente el
número de las correspondientes placas de control.
Cuando se exploran de esta manera con el ensayo
de Ames carcinógenos conocidos, aproximadamente 90% de ellos son
positivos. Cuando se ensayan similarmente no carcinógenos conocidos,
aproximadamente 90% de ellos son negativos.
Se puede evaluar un nuevo compuesto (X) como
potencial compuesto de descontaminación de sangre, como se muestra
en la siguiente Tabla 4. X se evalúa inicialmente en la Etapa I. X
se explora en el ensayo r-17 a varias
concentraciones diferentes entre 4 y 320 \muM, como se explica en
el Ejemplo 12. Si el compuesto revela una actividad de inactivación
mayor que 1 log inactivación de r-17 (log mort) en
el ensayo r-17 a cualquier concentración, el
compuesto se explora luego en el ensayo de HIV exento de células,
como se explica en el Ejemplo 13. Si el compuesto presenta una
actividad de inactivación mayor que 1 log inactivación de HIV (log
mort) en el ensayo HIV exento de células, el compuesto y AMT se
exploran luego en el ensayo de Ames. Finalmente, si el compuesto
presenta una capacidad mutagénica inferior en el ensayo de Ames a la
de AMT, el nuevo compuesto se identifica como agente útil para la
inactivación de patógenos.
Siguiendo estas instrucciones, una persona puede
determinar rápidamente qué compuestos serían apropiados para uso en
los procedimientos de la presente invención.
La presente invención contempla varias
formulaciones y vías diferentes por las que se pueden obtener en un
procedimiento de inactivación los compuestos descritos en esta
memoria. Esta sección es meramente ilustrativa y no tiene la
finalidad de limitar la invención en forma alguna o un procedimiento
de introducir el compuesto.
Los compuestos se pueden introducir en un
procedimiento de inactivación en varias formas. Los compuestos se
pueden introducir como solución acusa en agua, solución salina o en
medio sintético tal como "Sterilyte^{MC} 3,0" (contenidos
indicados al comienzo de la sección experimental más adelante) o una
variedad de otros medios. Los compuestos se pueden proporcionar
además como formulaciones secas, con o sin coadyuvantes.
Los nuevos compuestos se pueden aportar también
por varias rutas diferentes. Por ejemplo, el compuesto se puede
introducir en el recipiente de reacción, tal como una bolsa de
sangre, en el momento de ensamblado. Alternativamente, el compuesto
se puede añadir al material a esterilizar después de haber puesto el
material en el recipiente de reacción. Además, los compuestos se
pueden introducir solos o como mezcla de diferentes compuestos.
Cuando se tratan compuestos de sangre a usar
in vivo, dos factores tienen una importancia primordial en
cuanto a los procedimientos y compuestos a usar. Primero, se debe
preguntar si el procedimiento o los compuestos usados alteran la
actividad in vivo del material tratado. Por ejemplo, la
transfusión de plaquetas es un tratamiento eficaz bien establecido
para pacientes con hemorragia trombocitopénica. Sin embargo, si el
tratamiento de descontaminación usado reduce considerablemente la
actividad coagulante de las plaquetas, el tratamiento no tiene
valor práctico alguno. Los psolarenos son útiles en procesos de
inactivación porque la reacción se puede realizar a temperaturas
compatibles con las propiedades bioquímicas de la sangre o los
productos de sangre que se retienen. Hanson, C.V., Blood Cells 18:7
(1992). Pero no todos los psolarenos o procedimientos
descontaminarán sin rebajar significativamente la actividad
biológica del material descontaminado. Compuestos y protocolos
anteriores han necesitado la eliminación de oxígeno molecular de la
reacción antes de y durante la exposición a la luz para evitar que
los radicales de oxígeno formados durante la irradiación dañen los
productos de sangre. Véase L. Lin y otros, Blood 74:517 (1989);
patente U.S. nº. 4.727.027, expedida a Wiesenhanh. La presente
invención puede usarse para descontaminar productos de sangre en
presencia de oxígeno sin destruir la actividad para la que se
preparan los productos de sangre. Además, con los procedimientos de
la presente invención no hay necesidad de reducir la concentración
de oxígeno molecular. La presente invención contempla que no se
destruya o rebaje significativamente la actividad in vivo de
un producto de sangre si una muestra de un producto de sangre que
está descontaminada por procedimientos de la presente invención da
resultados de ensayo como daría una muestra que funcionara
normalmente de un producto de sangre en ensayos conocidos para la
función de un producto de sangre. Por ejemplo, en lo concerniente a
plaquetas, la actividad in vivo no se destruye o rebaja
significativamente si los pH de las plaquetas son los mismos para
plaquetas tratadas por los procedimientos de la presente invención
almacenadas durante 5 días que para muestras de plaquetas no
tratadas almacenadas durante 5 días. "Sustancialmente el mismo
pH" significa que los valores están dentro del intervalo de error
en torno a ese punto particular del dato.
El segundo factor es si los compuestos son
tóxicos o mutagénicos para el paciente tratado. Un "compuesto que
desarrolla una capacidad mutagénica baja" se define como un
compuesto que es menos mutagénico que AMT cuando se ensaya a
concentraciones por debajo de 250 \muM en el ensayo de Ames,
descrito en la sección experimental siguiente. Los procedimientos
de inactivación de la presente invención son especialmente útiles
porque muestran la independencia entre la eficiencia de la
inactivación del patógeno y la capacidad mutagénica. Los compuestos
presentan una potente inactivación patógena sin un aumento
concomitante de la capacidad mutagénica. Los compuestos comúnmente
conocidos ensayados según protocolos de inactivación, tales como el
AMT, parece que exhiben una conexión entre eficiencia de la
inactivación del patógeno y la acción mutagénica que hasta ahora
parecía indivisible.
Si bien no se considera que la presente
invención esté limitada por cualquier teoría según la cual la
eficiencia de la inactivación del patógeno no está unida a la
mutagenia, se postula que la desunión se produce como resultado de
la longitud de los grupos sustituidos en el psolareno y la situación
de cargas en los compuestos. Se postula que las cargas positivas en
uno o ambos extremos de los compuestos mutagénicos tienen
interacciones no covalentes con el esqueleto de fosfato del DNA. Se
presume que esas interacciones se producen independientemente en
presencia de luz (llamada "unión oscura"). En teoría, de esta
manera, el psolareno bloquea estéricamente la polimerasa de la
apertura al DNA, causando capacidad mutagénica. A diferencia, los
compuestos de la presente invención tienen una carga positiva o
neutra en un grupo sustituido largo. Estos grupos sustituidos forman
una barrera estérica durante la unión oscura que es mucho más fácil
de liberar del DNA, lo que permite el paso de la polimerasa. Por
tanto, no se produce capacidad mutagénica.
Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar
ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención
y no ha de interpretarse que limitan su ámbito.
En la descripción experimental que sigue, se
usan las abreviaturas siguientes: eq (equivalentes); M (molar);
\muM (micromolar); N (normal); mol (moles); mmol (milimoles);
\mumol (micromoles); nmol (nanomoles; g (gramos); mg
(miligramos); \mug (microgramos); kg (kilogramos); l (litros); ml
(mililitros); \mul (microlitros); cm (centímetros); mm
(milímetros); \mum (micrómetros); nm (nanómetros); J (joules,
también watt s; nótese que en las Figs. 11, 13-22
Joules o J se refiere a Joules/cm^{2}); ºC (grados centígrados);
TLC (cromatografía en capa delgada); EAA (acetoacetato de etilo);
EtOH (etanol); HOAC (ácido acético); W (watts); mW (miliwats); RMN
(resonancia magnética nuclear; espectros obtenidos a temperatura
ambiente en un espectrómetro Varian Gemini 200 MHZ Fourier
Transform Spectrometer); p.f. (punto de fusión); UV (luz
ultravioleta); THF (tetrahidrofurano); DMEM (medio Eagles
modificado de Dulbecco's); FBS (suero fetal bovino); LB (caldo de
Luria); EDTA (ácido etilendiaminatetraacético); miristatoacetato de
forbol (PMA); solución salina tamponada con fosfato (PBS); BSA
(albúmina de suero bovino); PCR (reacción en cadena de polimerasa).
Además, en los ejemplos que describen síntesis de compuestos, los
rendimientos presentados son sólo para la etapa precedente y no para
la síntesis entera.
Para facilidad de referencia, algunos compuestos
se han asignado a un número de 1 a 18. Los números de referencia se
asignan en la Tabla 2. Sus estructuras aparecen en las Figs.
10A-10F. Los números de referencia se usan a la
largo de la sección experimental.
Cuando se aislan los compuestos en forma de sal
de adición de ácido, el ácido se selecciona preferiblemente de
manera que contenga un anión que sea no tóxico y farmacéuticamente
aceptable, al menos en las dosis terapéuticas usuales. Son sales
representativas que se incluyen en este grupo preferido los
hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos, acetatos, fosfatos,
nitratos, metanosulfonatos, etanosulfonatos, lactatos, citratos,
tartratos o bitartratos y maleatos. Otros ácidos son análogamente
adecuados y se pueden usar según se desee. Por ejemplo, también
pueden usarse como ácidos que forman sales de adición los ácidos
fumárico, benzoico, ascórbico, succínico, salicílico,
bismetilensalicílico, propiónico, glucónico, málico, malónico,
mandélico, cinámico, citracónico, esteárico, palmítico, itacónico,
glicólico, bencenosulfónico y sulfámico.
Uno de los ejemplos siguientes se refiere al
tampón HEPES. Este tampón contiene 8,0 g de NaCl 137 mM, 0,2 g de
KCl 2,7 mM, 0,203 g de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 1 mM, 1,0 g de
glucosa 5,6 mM, 1,0 g de albúmina de suero bovino (ABS) de 1 mg/ml
(adquirible de Sigma St. Louis, MO) y 4,8 g de HEPES 20 mM
(asequible de Sigma, St. Louis, MO).
En uno de los ejemplos siguientes, para el
tratamiento de plaquetas se formula un medio sintético tamponado
con fosfato. Éste se formula en una etapa, resultando una solución
de pH equilibrado (por ejemplo, pH 7,2) combinando los reactivos
siguientes en 2 litros de agua destilada:
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La solución se mezcla luego, se filtra estéril
(filtro de 0,2 \mum) y se refrigera.
\newpage
Otro medio sintético útil en la presente
invención contiene los reactivos siguientes:
La reacción en cadena de polimerasa (PCR) se usa
en uno de los ejemplos para medir si la inactivación viral por
algunos compuestos era completa. La PCR es un procedimiento para
aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en
una mezcla de DNA genómico sin clonación o purificación. Véase K.B.
Mullis y otros, patentes U.S. nº. 4.683.195 y nº. 4.683.202. En
este procedimiento, para amplificar la secuencia diana se introduce
un gran exceso de dos cebadores oligonucleótidos en la mezcla de DNA
que contiene la secuencia diana deseada, a lo que sigue una
secuencia precisa de ciclo térmico en presencia de una DNA
polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus respectivas
cadenas de la secuencia diana de doble cadena. Para efectuar la
amplificación, se desnaturaliza la mezcla y los cebadores se anillan
luego a sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana.
Después del anillamiento, los cebadores se extienden con una
polimerasa para formar un nuevo par de cadenas complementarias. Las
etapas de desnaturalización, anillamiento de cebador, y extensión
con polimerasa se pueden repetir muchas veces (esto es,
desnaturalización, anillamiento y extensión constituyen un
"ciclo"; puede haber numerosos ciclos) para obtener una
concentración alta de un segmento amplificado de la secuencia diana
deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana
deseada está determinada por las posiciones relativas entre sí de
los cebadores y, por tanto, esta longitud es un parámetro
controlable. A causa del aspecto repetitivo del procedimiento, los
inventores lo denominaron "reacción en cadena de polimerasa".
En razón a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia
diana llegan a ser las secuencias predominantes (en términos de
concentración) de la mezcla, se dice que son "amplificados por
PCR".
Con la PCR es posible amplificar una copia
individual de una secuencia diana específica en DNA genómico a un
nivel detectable por varias metodologías diferentes (por ejemplo,
hibridación con una sonda marcada; incorporación de cebadores
biotinilados seguida de detección de conjugado de
avidina-enzima; incorporación de trifosfatos de
desoxinucleótido marcado con ^{32}P, por ejemplo, dCTP o dATP en
el segmento amplificado). Además de DNA genómico, se puede
amplificar cualquier secuencia de oligonucleótido con el conjunto
apropiado de moléculas de cebador.
El procedimiento de amplificación por PCR es
conocido para alcanzar una concentración de plaquetas de secuencias
diana específicas de aproximadamente 10^{-8} M. Un volumen de
reacción típico es 100 \mul, que corresponde a un rendimiento de 6
x 10^{11} moléculas producto de doble cadena.
PCR es un protocolo de amplificación de
polinucleótidos. El factor de amplificación que se observa está
relacionado con el número (n) de ciclos de PCR que ha habido y la
eficacia de replicación de cada ciclo (E) que, a su vez, es función
de las eficacias de cebado y extensión durante cada ciclo. Se ha
observado que la amplificación sigue la forma E^{n} hasta que se
logran concentraciones altas del producto de la PCR. A estas
concentraciones altas (aproximadamente de 10^{-8}) la eficacia de
replicación disminuye drásticamente. Probablemente esto es debido
al desplazamiento de los cebadores oligonucleótidos cortos por las
cadenas complementarias más largas del producto de PCR. A
concentraciones por encima de 10^{-8}, la velocidad de las dos PCR
complementarias o concomitantes con la etapa de extensión del
procedimiento de PCR que se encuentran mútuamente durante las
reacciones de cebado llegan a ser suficientemente rápidas de manera
que ésta se produce antes de, o concomitantemente con, la etapa de
extensión del procedimiento de PCR. Esto conduce finalmente a una
eficacia reducida de cebado y, por tanto, una eficacia reducida del
ciclo. Ciclos continuados de PCR conducen a aumentos menguantes de
productos de PCR. Eventualmente, el producto de PCR alcanza una
concentración meseta.
Las secuencias de cebadores de polinucleótidos
usados en esta sección experimental son las siguientes:
Con DCD03 como cebador de avance común, los
pares generan amplicones de longitud 127, 327 y 1072 bp. Estos
oligos se seleccionaron de regiones que son absolutamente
conservadas entre 5 aislados diferentes dHBV (DHBV1, DHBV3, DHBV 16,
DHBV 22 y DHBV26), así como de HBV de garza (HHBV4).
Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar
ciertas realizaciones preferentes y aspectos de la presente
invención, y no ha de considerarse que son limitativos de su
ámbito.
Como se ha señalado antes, la presente invención
contempla procedimientos para la fotoactivación de compuestos
fotorreactivos que se unen a ácidos nucleicos. En este ejemplo, se
describe un dispositivo de fotoactivación para descontaminar
productos de sangre de acuerdo con el procedimiento de la presente
invención. Este dispositivo comprende: (a) medios para proporcionar
longitudes de onda apropiadas de radiación electromagnética para
causar la fotoactivación de al menos un compuesto fotorreactivo;
(b) medios para soportar una pluralidad de productos de sangre en
una relación fija con la radiación que proporciona medios durante la
fotoactivación, y (c) medios para mantener la temperatura del
producto de sangre dentro de un intervalo de temperaturas durante la
fotoactivación.
La Fig. 6 es una vista en perspectiva de una
realización del dispositivo que integra los rasgos antes
mencionados. La figura muestra una caja opaca (100) de la que se ha
eliminado una parte, que contiene una serie de bulbos (101) por
encima y por debajo de una pluralidad de medios (102) que contienen
productos de sangre representativos situados entre conjuntos de
placas (103, 104) que filtran ciertas longitudes de onda de luz. Los
montajes de placas (103, 104) se describen posteriormente más
detalladamente.
Los bulbos (100), que se pueden conectar a una
fuente de energía (no representada), sirven como fuente de
radiación electromagnética. Si bien no está limitada al tipo
particular de bulbo, la realización está configurada para aceptar
una lámpara de dos clavijas estándar de la industria.
La caja (100) se puede abrir con un portillo
(105) de manera que el producto de sangre se pueda colocar
adecuadamente. Como se representa en la Fig. 6, la caja (100),
cuando está cerrada, contiene completamente la irradiación de los
bulbos (101. Durante la irradiación, el usuario puede confirmar que
el dispositivo está funcionando mirando a través de un visor de
seguridad (106) que no permite que se transmita luz ultravioleta al
usuario.
La caja (100) sirve también como una base para
varios componentes electrónicos en un tablero de control (107) que
incluye, a modo de ejemplo, un conector de la energía general, un
temporizador, y un reloj. Para conveniencia, el conector de energía
puede estar conectado al temporizador que, a su vez, está conectado
en paralelo con el reloj y a la fuente de la radiación
electromagnética. El temporizador permite al usuario prefijar el
tiempo de irradiación al nivel de exposición deseado. El reloj
mantiene un registro del número total de horas de radiación que ha
proporcionado la fuente de radiación electromagnética. Este rasgo
permite controlar los bulbos (101) y cambiarlos antes de que su
producción disminuya por debajo del nivel mínimo necesario para una
fotoactivación rápida.
La Fig. 7 es una vista en corte transversal del
dispositivo de la Fig. 6 a lo largo de las líneas
2-2. La Fig. 7 muestra la disposición de los bulbos
(101) con la caja (100) abierta. Un reflector (108A, 108B) rodea
completamente cada serie de bulbos (101). El medio (102) que
contiene el producto de sangre está colocado entre los conjuntos
superior (103) e inferior (104) de placas (por ejemplo, vidrio
BK-7, Shott Glass Technologies, Inc., Duryea, PA).
Cada conjunto de placas comprende una placa superior (103A, 104A) y
una placa inferior (103B, 104B). Los conjuntos de placas (103, 104
están conectados mediante una articulación (109) diseñada para
acomodarse al espacio creado por el medio (102) que contiene el
producto de sangre. El conjunto superior de placas (103) se sitúa
para que descanse encima del medio (102) que contiene el producto de
sangre soportado por la placa inferior (104B) del conjunto inferior
de placas (104).
Los detectores (110A, 110B, 110C, 110D) se
pueden situar convenientemente entre las placas (103A, 103B, 104A,
104B) de los ensamblajes de placas (103, 104). Se pueden conectar a
un tablero (111) de circuito impreso que, a su vez, está conectado a
un tablero de control.
La Fig. 8 es una vista en corte transversal del
dispositivo representado en la Fig. 6 a lo largo de las líneas
3-3. Seis medios (102) que contienen productos de
sangre (por ejemplo, bolsas unidad de Teflon^{MC} que contienen
plaquetas) están colocados en una relación fija encima de una serie
de bulbos (101). La temperatura del producto de sangre se puede
controlar con un ventilador (112) solo o, más preferiblemente,
empleando un intercambiador de calor (113) que tiene puertos de
enfrianiento de entrada (114) y de salida (115) conectados a la
fuente de enfriamiento (no representada).
La Fig. 9 es una vista en corte transversal del
dispositivo representado en la Fig. 6 a lo largo de las líneas
4-4. La Fig. 9 representa más claramente el enfoque
de control de la temperatura de una realización preferente del
dispositivo. Las placas del conjunto superior de placas (103A, 103B)
y las placas del conjunto inferior de placas (104A, 104B) crean,
cada conjunto, una cámara de control de la temperatura (103C, 104C),
respectivamente. El ventilador (112) puede hacer circular aire
dentro de y entre las cámaras (103C, 104C). Cuando se emplea el
intercambiador de calor (113), se enfría el aire circulante y se
hace que pase entre las placas (103A, 103B, 104A, 104B).
En este ejemplo se describe la síntesis de
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsolareno.
La síntesis se realiza sin una etapa de bromometilación, lo que
hace que sea más segura que los procedimientos de síntesis
conocidos.
Etapa
1
Se añade
3-cloro-2-butanona
(29,2 ml, 0,289 mol) a una suspensión agitada mecánicamente de
7-hidroxi-4,8-dimetilcumarina
(50,00 g, 0,263 mol) y K_{2}CO_{3} en polvo (54 g, 0,391 mol)
en acetona. La suspensión se mantiene a reflujo durante 15 horas y
luego se elimina el disolvente. Para eliminar la sal, el sólido se
agitó en 1,2 l de agua, se filtró y se enjuagó hasta que el pH de
las aguas madre era neutro (pH 5-7). El filtrado de
color marrón se disolvió en metanol a ebullición (150 ml), se dejó
enfriar a temperatura ambiente para formar una pasta espesa y se
enjuagó con metanol frío (hielo) para eliminar la mayor parte de la
impureza marrón, obteniéndose
4,8-dimetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-cumarina
(67,7 g, rend. de 99,9%) como un sólido blancuzco. p.f.
95-96ºC. RMN: \delta 1,57 (d, J = 6,7 Hz, 3H),
2,19 s, 2H), 2,39 (s, 6H), 4,73 (q, J = 6,9 Hz, 1H), 6,17 (s, 1H),
6,63 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 8,9 Hz, 1H).
Etapa
2
Se calentó durante 2-4 horas a
70-85ºC una suspensión de
4,8-dimetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-cumarina
(67,5 g, 0,260 mol), NaOH acuoso al 10% (114 ml, 0,286 mol) y agua
(900 ml). Se dejó luego enfriar la mezcla a temperatura ambiente.
Se filtró el sólido y luego se enjuagó con agua fría (1,5 l) hasta
que las aguas madre eran incoloras y el pH era neutro (pH
5-7). El producto se secó al aire y en vacío,
obteniéndose 4,4',5',8-tetrametilpsolareno (56,3 g,
89,5%) como un sólido blanco. p.f. 197-199ºC. RMN:
\delta 2,19 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,56 (s, 3H),
6,23 (s, 1H), 7,40 (s, 1H).
Etapa
3
Se disolvió
4,4',5',8-tetrametilpsolareno seco (10,00 g, 41,3
mmol) en cloruro de metileno (180 ml) a temperatura ambiente. Se
añadió N-bromo-succinimida (8,09 g,
45,3 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 4,5 horas. Se
eliminó completamente el disolvente y el sólido resultante se agitó
con agua (200 ml) durante 0,5-1 h, se filtró y se
trituró en frío con más agua (aproximadamente 500 ml) para eliminar
completamente el subproducto succinimida. El producto en bruto
(esto es,
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsolareno)
se secó en un desecador a vacío con P_{2}O_{5} y luego se
recristalizó, obteniéndose
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsolareno
(10,2 g), un sólido de color amarillo pálido. Se apuraron las aguas
madre y se recristalizó nuevamente con tolueno (6t0 ml),
obteniéndose una segunda cosecha de producto (1,08 g, rend.
combinado 85,1%, pureza > 99% por RMN). p.f.
206-207º. RMN: \delta 2,50 (s, 3H), 2,54 (d, J =
1,2 Hz, 3H), 2,58 (s, 3H), 4,63 (s, 2H), 6,28, (q aparente, J = 1,3
Hz, 1H), 7,59 (s, 1H).
En este ejemplo se describen dos procedimientos
de síntesis del compuesto 2. El primer procedimiento se realizó como
sigue:
Etapa
1
Se agitaron en dimetiformamida seca (65 ml)
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsolareno
(3,09 g, 9,61 mmol) (síntesis descrita en el Ejemplo 2) y
N-(2-hidroxietil)ftalimida (4,05 g, 21,2
mmol. Se hizo burbujear nitrógeno gas seco suavemente en la mezcla
de reacción. La mezcla de reacción se agitó a 100ºC durante 4,5
horas y luego se dejó que enfriara a temperatura ambiente y se
mantuvo en la nevera durante varias horas. Se filtró el producto
cristalino y se lavó con MeOH y seguidamente con H_{2}O. El sólido
se trituró con MeOH (100 ml) para eliminar las impurezas. El
producto en bruto se secó al aire y se disolvió en CHCl_{3} (150
ml). Se añadió carbón activo y gel de sílice para decolorar y se
eliminó completamente el CHCl_{3}. El producto blanco resultante,
4'-[4-(N-ftalimido)-.2-oxa]butil-4,5',8-trimetilpsolareno,
(1,56 g, rend. 37,5%) tenía una pureza >99% tanto por RMN como
por HPLC. p.f. 224-225ºC. RMN.(CDCl_{3}): \delta
2,37 (s, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 3,78 (s, 4H), 4,59 (s,
2H), 6,22 (s, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,50 (m, 4H).
Etapa
2
Se puso en suspensión
4'-[4-(N-ftalimido)-.2-oxa]butil-4,5',8-trimetilpsolareno
(1,56 g, 3,61 mmol) en tetrahidrofurano (75 ml) a temperatura
ambiente. A la suspensión se añadió metilamina (solución acuosa al
40%, 25 ml, 290 mmol) y se agitó durante la noche. Se eliminaron
completamente el disolvente y la metilamina. El sólido resultante
se recibió en solución acusa 0,3N de HCl (25 ml). La suspensión
ácida se enjuagó tres veces con 40 ml de CHCl_{3} y luego se
llevó a pH 11 con NaOH acuoso al 20%. Se usó CHCl_{3} (3x60 ml
para extraer el producto (esto es,
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno)
de la capa basificada. Se combinaron las capas de CHCl_{3} y la
combinación se lavó con H_{2}O (100 ml) y seguidamente con
salmuera (100 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se
concentró, obteniéndose
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno.
p.f. 139-141ºC. La pureza era mayor que 99% por
RMN. RMN (CDCl_{3}): \delta 2,50 (s, 6H), 2,58 (s, 3H), 2,90
(t, J = 5,27 Hz, 2H) 3,53 (t, J = 5,17 Hz, 2H), 4,66 (s, 2H), 6,25
(s, 1H), 7,61 (s, 1H). El
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
se disolvió en etanol absoluto (150 ml), se añadió una solución
1,0M de HCl en éter (10 ml) y la solución se enfrió durante la
noche en nevera. Después de filtración y lavado con éter, el sólido
se secó en vacío, obteniéndose cristales de color amarillo pálido
(0,76 g, rend. de 62%). p.f. 235-236ºC.
Alternativamente, la Etapa 2 se puede realizar
usando hidrazina o butilamina en vez de metilamina. Para síntesis a
gran escala se prefiere el procedimiento que usa butilamina porque,
si bien es cierto que se necesita un exceso de metilamina debido a
volatilización, no éste el caso para la butilamina. El procedimiento
usando butilamina se realizó como sigue: se han desprotegido con
n-butilamina en propanol 28,3 g de fatalimida. La
solución de reacción en bruto se trata luego con HCl para precipitar
el producto. Así, la mezcla de reacción en 285 ml de
1-propanol se trató con HCl gas a pH 2. La mezcla se
agitó a 5ºC durante 0,5 horas, luego se filtró y lavó con
disolvente frío (3x15 ml), obteniéndose 20,5 g de
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
en bruto (rend. de 92%).
El procedimiento que usa hidrazina se realizó
como sigue. Se desprotegió con hidrazina el precursor de ftalimida
(6 mol) y, después de concentración y extracciones
ácido-base, se obtuvo la amina en bruto en 30 l de
dicloruro de etileno. A éste se añadió HCl gas (0,14 kg) mediante
un tubo de dispersión durante 40 min manteniendo la temperatura a
15-25ºC. La suspensión resultante se agitó durante 1
hora más. Se recogieron los sólidos en un embudo Buchner. Después
de secar en un secador de aire a 80ºC durante 2 horas, se obtuvieron
0,945 kg de
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
en bruto. 0,94 kg de producto en una mezcla de 7,5 kg de
isopropanol y 1,88 kg de agua se mantuvo a reflujo durante 30 min y
luego se filtró en caliente. La solución se enfrió a temperatura
ambiente durante 1 hora y luego se enfrió a 15-20ºC
durante 0,5 horas. Los sólidos se recogieron en un embudo Buchner y
luego se lavaron con isopropanol frío (0,3 l). Los sólidos húmedos
se pasaron a bandejas de vidrio y se secaron en vacío (más de 28
min) a aproximadamente 75ºC durante 11,5 horas. El contenido de
humedad era de 0,5%. Se obtuvieron 0,758 g (rend. de 81%). El
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
era analíticamente puro. Según RMN, el isopropanol residual era de
aproximadamente 1700 ppm.
El primer procedimiento es una realización
preferente de la presente invención a causa de su alto rendimiento y
pureza.
El segundo procedimiento se inicia con la
preparación de
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsolareno
a partir de 4,5',8-trimetilpsolareno comercial como
se ha descrito antes. La síntesis de hidrocloruro de
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
se hace en 4 etapas.
Etapa
1
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsolareno
(550 mg, 1,99 mmol) y etilenglicol (6,8 ml, 121,9 mmol) se
calentaron en acetona (6 ml) a 50-60ºC durante 3,5
h. Después de calentar durante 2 h, la suspensión blanca se había
convertido en una solución ligeramente amarilla. Se eliminaron la
acetona y el etilenglicol en un rotoevaporador y al residuo se
añadió agua (50 ml). La suspensión resultante se filtró, se lavó con
agua fría y luego se secó en horno de vacío, obteniéndose 574 mg
(96%) de
4'-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno.
RMN (CDCl_{3}) \delta: 2,51 (s, 6H), 2,58 (s, 3H), 3,62 (t, J =
4,5 Hz, 2H), 3,78 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 4,70 (s, 2H), 6,26 (d, J =
1,1 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H).
Etapa
2
Se disolvió
4'-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
(574 mg, 1,9 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (6 ml) bajo nitrógeno a
\leq10ºC. Se añadió trietilamna (359 mg, 3,55 mmol). Se añadió
lentamente gota a gota cloruro de metanosulfonilo (305 mg, 266
mmol) manteniendo la temperatura por debajo de 10ºC. Finalizada la
adición, la mezcla se agitó durante 15 min más y luego se agitó a
temperatura ambiente durante 10 horas. A la suspensión que había
reaccionado se añadió CH_{2}Cl_{2} (45 ml) y la mezcla se lavó
con agua (3x20 ml), luego se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro.
La concentración a 30ºC o menos seguida de secado en vacío dio
4'-[(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
como un sólido amarillo (706 mg, 98%). p.f
138-140ºC. RMN \delta: 2,51 (s, 3H), 2,52 (d, 3H),
2,58 (s, 3H), 2,99 (s, 3H), 3,77 (m, 2H), 4,39 (m, 2H), 4,71 (s,
2H), 6,26 (s, 1H), 7,62 (s, 1H).
Etapa
3
Se mantuvieron a reflujo durante 8 horas en
alcohol etílico al 96%
4'-[(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
(706 mg, 1,86 mmol) y azida sódica (241 mg, 3,71 mmol). La solución
de reacción se enfrió y se añadió agua fría (55 ml). El sólido
blancuzco se filtro y se lavó con agua fría. Después de secar en
vacío, se obtuvo la azida (esto es,
4'-(4-azido-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno)
como un sólido ligeramente amarillento (575 mg, 95%). p.f.
105-106ºC. RMN: \delta 2,51 (s, 6H), 2,58 (s, 3H),
3,41 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 3,67 (t aparente, J = 4,9 Hz, 2H), 4,70
(s, 2H), 6,26 (s, 1H), 7,66 (s, 1H).
Etapa
4
El
4'-(4-azido-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
(1,65 g, 5,03 mol) se disolvió en tetrahidrofurano (10 ml). A la
solución anterior se añadieron trifenilfosfina (1,59 g, 6,08 mmol) y
seis gotas de agua. Después de agitar a temperatura ambiente
durante la noche, se concentró la solución de color amarillo claro.
El residuo se disolvió en CHCl_{3} (90 ml) y se sometió a
extracción con HCl acuoso 0,3N (30 ml, luego 2x5 ml). La
combinación de las capas de HCl se trató cuidadosamente con
K_{2}CO_{3} hasta saturación. La solución básica se sometió a
extracción con CHCl_{3} (3x60 ml). Las capas de CHCl_{3}
combinadas se lavaron con 60 ml de agua, 60 ml de de salmuera y se
secaron sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. Después de concentración y
secado en vacío, se obtuvo la amina como un sólido amarillo (1,25 g,
82%). p.f. 139-141ºC. RMN \delta 2,48 (s, 6H),
2,55 (s, 3H), 2,89 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,52 t, J = 6 Hz, 2H), 4,64 s,
2H), 6,22 (s, 1H), 7,59 (s, 1H).
La amina se disolvió en etanol absoluto (40 ml)
y se añadieron 20 ml de HCl 1N en etil éter. Después de dejar en
reposo durante la noche a 5ºC, se filtró el precipitado y se enjuagó
con éter, obteniéndose 1,25 g del compuesto 2. p.f. 236ºC
(descomp.). RMN ^{13}C: 8,54, 12,39, 19,18, 38,75, 62,26, 65,80,
108,01, 112,04, 112,42, 112,97, 116,12, 125,01, 148,76, 153,97,
154,37, 155,76, 160,34.
Análisis calculado para
C_{17}H_{20}ClNO_{4}: C 60,45; H 5,97; N 4,15. Hallado: C
60,27; H 5,88; N 4,10.
Se preparó análogamente, haciendo reaccionar
4'-CMT con 1,3-propanodiol según la
Etapa 1 y procediendo análogamente a lo largo de la Etapa 4,
4'-(5-amino-2-oxa)pentil-4,5',8-trimetilpsolareno
(compuesto 4). p.f. 212-214ºC (descomp.). RMN de la
base libre: \delta 1,73 (pent, J = 6,4 Hz, 2H), 2,45 (s, 3H), 2,51
(s, 3H), 2,78 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 3,54 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 4,59
(s, 2H), 6,18 (s, 1H), 7,54 (s, 1H).
Sólido naranja, sublima a \geq 250ºC; se
descompone a más de 300ºC. RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta 2,54
(d, J = 1 Hz, 3H), 2,64 (s, 2H), 2,68 (s, 3H), 6,32 (d aparente, J =
1 Hz, 1H), 7,55 (s, 1H), 10,07 (s, 1H).
Se agitó en EtOH marca 200 (250 ml)
4,4',8-trimetilpsolaren-carboxaldehído
7,50 g, 29,3 mmol). Se añadió borohidruro sódico y la suspensión se
agitó durante la noche. Para parar la reacción se añadió
agua-hielo (150 ml) y solución acuosa de NaCO_{3}
al 10% (50 ml). Después de agitar durante 45 min, es separó por
filtración el precipitado y se enjuagó con agua hasta neutralidad
(pH = 5-7). El producto se secó en un desecador a
vacío con P_{2}O_{5}, obteniéndose
5'-hidroximetil-4,4',8-trimetilpsolareno
(7,46 g, 98,5%) como un sólido amarillo pálido. p.f.
244-245ºC. RMN ^{1}H (CDCl_{3}): 1,97 (t, J = 6
Hz, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,51 (d, J = 1 Hz, 3H), 2,58 (s, 3H), 4,79
(d, J = 6 Hz, 2H), 6,25 (d aparente, J = 11 Hz, 1H), 7,49 (s,
1H).
A una suspensión de
5'-hidroximetil-4,4',8-trimetilpsolareno
(15,42 g, 59,7 mmol) en dicloroetano (500 ml), en agitación,
enfriada con agua-hielo, se añadió a gotas
tribromuro de fósforo (6,17 ml, 65,7 mmol). La mezcla de reacción
se protegió de la humedad y se dejó en agitación durante la noche a
temperatura ambiente. La mezcla se agitó luego con 300 ml de
agua-hielo durante 1 hora. El sólido se separó por
filtración, se secó, se disolvió en tolueno caliente, se filtró a
través de papel de filtro y se apuró, obteniéndose
5'-bromometil-4,4',8-trimetilpsolareno
(3,43 g). Se separaron los disolventes de reacción (dicloroetano y
agua) y la capa acuosa se sometió tres veces a extracción con
dicloroetano. Se combinaron las capas orgánicas, la combinación se
lavó con salmuera, luego se secó (Na_{2}SO_{4} anhidro) y se
apuró en vacío, obteniéndose el grueso del producto
5'-bromometil-4,4',8-trimetilpsolareno
(13,13 g, rend. combinado de 86,4%) como un sólido de color
amarillo pálido. p.f. 201-202ºC. RMN ^{1}H
(CDCl_{3}): 2,29 (s, 3H), 2,52 (d, J = 1 Hz, 3H), 2,60 (s, 2H),
4,64 (s, 2H), 6,27 (d aparente, J = 1 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H).
Se disolvió
N-hidroxietilftalimida (3,00 g, 15,5 mml) en DMF (5
ml) a 60-64ºC mientras que se hacia burbujear
nitrógeno en la solución. Se añadió yoduro sódico (0,01 g, 0,067
mmol) y
5'-bromometil-4,4',8-trimetilpsolareno
(1,00 g, 3,11 mmol) y la suspensión se agitó en estas condiciones
durante la noche. La mezcla de reacción, espesa y de color
amarillo, se dejó que se enfriara a temperatura ambiente, se enfrió
más en baño de hielo-agua, se filtró y se enjuagó
con MeOH enfriado con hielo, obteniéndose el producto en bruto (1
g). El sólido se recristalizó en dicloretano (100 ml), resultando
4,4',8-trimetil-5'-[2-(N-ftalimido)-2-oxa]butilpsolareno
(0,68 g, 50,8%) como un sólido blancuzco. p.f.
225-228ºC. RMN ^{1}H (CDCl_{3}): 2,26 (s, 3H),
2,46 (s, 3H), 2,51 (d, J = 1 Hz, 3H), 3,87 (m, 4H), 4,64 (s, 2H),
6,26 (d aparente, J = 1 Hz, 1H), 7,64 (multiplete, 4H).
4,4',8-trimetil-5'-[4'-(N-ftalimido)-2-oxa]butilpsolareno
(1,61 g, 3,73
En este ejemplo se describe la síntesis del
compuesto 7. La síntesis de hidrocloruro de
4'-(7-amino-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno
se realiza en 4 etapas:
Etapa
1
Se calentaron a reflujo durante 11,5 horas
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsolareno
(589 mg, 2,13 mmol), dietilenglicol (15,4 g, 145 mmol) y acetona
(13 ml). La solución de reacción se concentró para eliminar la
acetona y parte del dietilenglicol. A la solución marrón claro
resultante se añadió CHCl_{3} (40 ml), luego se lavó con agua
varias veces. La capa de CHCl_{3} se secó sobre Na_{2}SO_{4}
anhidro y se concentró, resultando 781 mg de producto,
4'-(7-hidroxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno
(\approx100%). RMN \delta 2,46 (d, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,51 (s,
3H), 3,58-3,67 (m, 8H), 4,67 (s, 2H), 6,18 (s, 1H),
7,57 (s, 1H).
Etapa
2
Se disolvió
4'-(7-hidroxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno
(781 mg, 2,25 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (2,5 ml) bajo corriente de
N_{2} a menos de 10ºC. Se añadió trietilamina (363 mg, 3,59 mmol).
Se añadió a gotas lentamente cloruro de metanosulfonilo (362 mg,
3,16 mmol) manteniendo la temperatura por debajo de 10ºC. Terminada
la adición, la mezcla se mantuvo por debajo de 10ºC durante 15
minutos más. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la
noche y luego se añadió CH_{2}Cl_{2} (50 ml). La solución se
lavó con agua (3x60 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y
se concentró a \leq30ºC. Después de secado en vacío, se obtuvo un
líquido espeso de color marrón claro
[4'-(7-metenosulfoniloxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno];
437 mg (76%). RMN \delta 2,50 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,58 (s,
3H), 3,01 (s, 3H), 3,66 (m, 4H), 3,77 (t, J = 4,6 Hz, 2H), 4,37 (t,
J = 6 Hz, 2H), 4,69 (s, 2H), 6,25 (s, 1H), 7,61 (s, 1H).
Etapa
3
Se tuvieron a reflujo en 3 ml de alcohol etílico
del 95% durante 8 horas
[4'-(7-metanosulfoniloxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno]
(288 mg, 0,678 mmol) y azida sódica (88,2 mg, 1,36 mmol). Se dejó
enfriar la solución de reacción y se añadió agua fría. Se desechó
la capa de agua. El material en bruto se purificó por cromatografía
sobre gel de sílice (con cloroformo como eluyente) en un
cromatógrafo Chromatotron (Harrison Research, Inc., Palo Alto, CA) y
se secó en vacío para obtener un líquido espeso ligeramente
amarillo,
4'-(7-azido-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno
(123 mg, 49%). RMN \delta 2,50 (s, 6H), 2,57 (s, 3H), 3,39 (t, J
= 5,2 Hz, 2H), 3,68 (m, 6H), 4,70 (s, 2H), 6,24 (s, 1H), 7,62 (s,
1H).
Etapa
4
Se disolvieron
4'-(7-azido-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno
(122 mg, 0,33 mmol), trifenilfosfina (129 mg, 0,49 mmol) y varias
gotas de agua en tetrahidrofurano (2 ml). La solución transparente
de color ligeramente amarillo se agitó a temperatura ambiente
durante el fin de semana; no se detectó por TLC material de partida.
Se concentró la solución de reacción y el residuo se disolvió e
CHCl_{3} (20 ml). La solución se sometió a extracción con
solución acuosa 0,15N de HCl (10 ml, luego 2x5 ml) y las capas de
HCl se llevaron a pH 13 añadiendo solución acuosa de NaOH al 20%.
La solución básica es sometió a extracción con CHCl_{3} (3x15
ml). Se combinaron las capas de CHCl_{3} y la combinación se lavó
con agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se concentró y se
secó en vacío, obteniéndose 63,9 mg de producto,
4'-(7-amino-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno
(56%). La TLC reveló sólo una mancha. RMN \delta 2,50 (s, 3H),
2,50 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,57 (s, 3H), 2,86 (t, J = 5,3 Hz, 2H),
3,50 (t, J = 5,3 Hz, 2H), 3,63 (s, 4H), 4,70 (s, 2H), 6,24 (s, 1H),
7,62 (s, 1H). p.f. 170-173ºC.
El sólido se disolvió en etanol absoluto. Luego
se añadió HCl 1M en etil éter, se filtró la suspensión y el producto
se enjuagó con éter y se secó.
La síntesis de dihidrocloruro de
4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5'.8-trimetilpsolareno
se realiza en una etapa a partir del producto del Ejemplo 5,
procedimiento 2, Etapa 2: Una solución de
4'-(7-metanosulfoniloxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno
(108 mg, 0,253 mmol) en 8 ml de acetonitrilo se añadió lentamente a
1,4-diaminobutano (132 mg, 1,49 mmol) en 2,8 ml de
acetonitrilo. Después de calentar a reflujo durante 8 horas, no
quedaba material de partida según TLC. La mezcla de reacción se
enfrió a temperatura ambiente y se añadió CHCl_{3} (25 ml) y
solución acuosa 1N de NaOH (25 ml). Se separaron las capas y se usó
CHCl_{3} (2x10 ml) para lavar la capa acuosa. Para extraer el
producto de las capas orgánicas combinadas se usó HCl acuoso (0,3N,
3x10 ml). Las capas de HCl se trataron con solución acuosa de NaOH
al 20% hasta pH 13. La combiación de capas básicas se sometió luego
a extracción con CHCl_{3} (3x20 ml). La capa de CHCl_{3} se
lavó con solución acuosa saturada de NaCl (10 ml) y luego se secó
sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. Después de concentración y secado en
vacío, se obtuvieron 63 mg de producto, dihidrocloruro de
4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5'.8-trimetilpsolareno
(60%). RMN \delta 1,45 (m, 2H), 2,49 (s, 6H), 2,55 (s, 3H), 2,58
(t, 2H), 2,66 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 2,76 (m, 4H),
3,55-3,61 (m, 6H), 4,68 (s, 2H), 6,22 (s, 1H), 7,61
(s, 1H).
La síntesis de
4'-(2-aminoetil)-4,5',8-trimetilpsolareno
se efectúa en una etapa: se obtuvo trifluoroacetoxiborohidruro
sódico añadiendo ácido trifluoroacético (296 mg, 2,60 mmol) en 2 ml
de THF a una suspensión en agitación de borohidruro sódico (175 mg,
4,63 mmol) en 2 ml de THF a lo largo de 10 minutos a temperatura
ambiente. La suspensión resultante se añadió a una suspensión de
4'-cianometil-4,5',8-trimetilpsolareno
(Kaufman y otros, J. Heterocyclic Chem. 19:1051 (1982)) (188 mg,
0,703 mmol) en 2 ml de THF. La mezcla se agitó durante la noche a
temperatura ambiente. A la solución transparente ligeramente
amarillo resultante de la reacción se añadieron varias gotas de
agua a menos de 10ºC para descomponer el exceso de reactivo. La
mezcla resukltante se concentró y se añadió solución acuosa 1N de
NaOH (30 ml). Se usó luego cloroformo (5 ml) para extraer la amina
resultante. Se combinaron las capas de CHCl_{3} y la combinación
se secó con solución saturada de NaCl. La amina se extrajo luego en
HCl 0,3N (10, 5, 5 ml) y las capas ácidas se llevaron a pH 13 con
solución acuosa de NaOH al 20%, . Se usó CHCl_{3} (3x10 ml) para
extraer la amina de la combinación de capas básicas, luego se lavó
con agua (2 ml) y se secó sobre sulfato sódico anhidro. Después de
concentración y secado en vacío es obtuvo la amina como un sólido;
pureza >95% según RMN. RMN \delta 2,45 (s, 3H), 2,47 (s, 3H),
2,53 (s, 3H), 2,78 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,00 (t, J = 6,5 Hz, 2H),
6,20 (s, 1H), 7,44 (s, 1H). El sólido se disolvió en etanol
absoluto. Se añadió una solución de cloruro de hidrógeno en dietil
éter (1N, 1 ml). La suspensión se filtró para obtener el compuesto
3, un sólido morado claro (32,7 mg, rend. 15%). p.f.> 237ºC
(descomp.)
La síntesis de
4'-(6-amino-2-aza)hexil-4,5',8-trimetilpsolareno
se efectúa en una etapa como sigue: Se añadió una solución de
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsolareno
(188 mg, 0,68 mmol) en 30 ml de acetonitrilo a una solución de
1,4-diaminobutano (120 mg, 1,4 mmol) en 7 ml de
acetonitrilo. Después de agitar durante la noche, se eliminó el
disolvente a presión reducida. Al residuo se añadió cloroformo (10
ml) y NaOH 1N (10 ml) y la mezcla se sacudió y separó. La solución
acuosa se sometió a extracción con más CHCl_{3} (2x10 ml) y la
combinación de los extractos se enjuagó con agua. El producto se
extrajo luego de la solución de CHCl_{3} con HCl acuoso 0,3N y la
capa ácida es llevó a pH 12 con solución concentrada de NaOH. La
suspensión básica se sometió a extracción con CHCl_{3} que luego
se enjuagó con agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró a
presión reducida, obteniéndose la amina como base libre. RMN
(CDCl_{3}): \delta 1,33 (m, 3H), 1,52 (m, 4H), 2,47 (s, 3H),
2,49 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,68 (q, J = 6,5 Hz, 4H),
3,86 (s, 2H), 6,21 (d aparente, J = 1,1 Hz, 1H), 7,60 (s, 1H).
La base libre, disuelta en aproximadamente 6 ml
de etanol absoluto, se trató con una solución de HCl en éter (1,0M,
3 ml). La sal HCl resultante se filtró, se enjuagó con EtOH absoluto
y se secó en vacío, obteniéndose 150 mg del compuesto 6 (55%). p.f.
290ºC (descomp.). Análisis calculado para
C_{19}H_{26}C_{12}N_{2}O_{3}\cdotH_{2}O: C 54,42; H
6,73; N 6,68. Hallado: C 54,08; H 6,45; N 6,65.
De manera similar se prepararon los compuestos
siguientes, indicándose las diferencias en la síntesis:
(a) dihidrocloruro de
4'-(4-amino-2-aza)butil-4,5',8-trimetilpsolareno
(compuesto 1). p.f. 320-322ºC (descomp.). En esta
síntesis se usó etilendiamina como diamina.
(b) dihidrocloruro de
4'-(5-amino-2-aza)pentil-4,5',8-trimetilpsolareno
(compuesto 5). p.f. 288ºC (descomp.). RMN de la base libre:
\delta 1,33 (s anc, 3H), 1,66 (pent, J = 6,8 Hz, 2H), 2,47 (s,
3H), 2,50 (d, J = 1 Hz, 3H), 2,55 (s, 3H), 2,6-2,85
(m, 4H), 3,89 (s, 2H), 6,22 (d aparente, J = 1 Hz, 1H), 7,62 (s,
1H). Para esta síntesis se usó 1,3-diaminopropano
como diamina.
(c) dihidrocloruro de
4'-(7-amino-2-aza)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno
(compuesto 10). p.f. 300ºC (descomp.). RMN de la base libre:
\delta 1,22 (s anc), 1,3-1,6 (m, total 9H), 2,44
(s), 2,50 (s, total 9H), 2,63 (m, 4H), 6,17 (s, 1H), 7,56 (s, 1H).
Aquí se uso 1,5-diaminopentano como diamina.
La síntesis de
4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5'-8-trimetilpsolareno
se realiza en una etapa como sigue: A una solución de 0,5 g (2,5
mmol) de espermina (Aldrich, Milwakee, WI) en 10 ml de metanol se
añadió una solución metanólica 5N de HCl (HCl concentrado diluido
con HCl a 5N) para ajustar el pH a 5-6 y
seguidamente 0,128 g (0,5 mmol) de
4,5',8-trimetlpsolaren-4'-carboxaldehído,
20 mg (0,3 mmol) de NaBH_{3}CN y 3 ml de MeOH. La mezcla de
reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió
una solución metanólica 5N de HCl hasta pH<2 y se eliminó el
metanol a presión reducida. El residuo se recibió en aproximadamente
100 ml de agua y se enjuagó con tres porciones de CHCl_{3}. Se
combinaron estos extractos finales y la combinación se lavó con
agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó, obteniéndose la base
libre de la amina. Pureza \geq 95 por RMN. RMN (CDCl_{3}):
\delta 1,31 (m, 5H), 1,45 (pent, J = 3,41 Hz, 4H), 1,65 (m, 4H),
2,46 (s, 3H), 2,49 (d, J = 1,14 Hz, 3H), 2,66 (m, 15H), 3,85 (s,
2H), 6,21 (s, 1H), 7,60 (s, 1H).
La amina libre es disolvió en etanol absoluto y
se añadió HCl (anhidro, 1N en etil éter). Se filtró la sal
hidrocloruro, se lavó con etanol absoluto y se secó e vacío a
temperatura ambiente, obteniéndose 80,2 mg de producto,
tetrahidrocloruro de
4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5'-8-trimetilpsolareno,
como un sólido de color amarillo pálido.
Se usó en este ejemplo un ensayo del
bacteriófago r-17 para predecir la eficiencia de
inactivación del patógeno y determinar la unión a ácido nucleico de
los compuestos de unión fotorreactivos de la presente invención. En
el ensayo de r-17, el bacteriófago se puso en
solución con cada compuesto ensayado y luego se irradió. Se midió
la capacidad del fago de infectar seguidamente bacterias e inhibir
su crecimiento. El bacteriófago se seleccionó por su ácido nucleico
relativamente accesible de manera que la inhibición del crecimiento
del cultivo reflejaría con precisión el daño del ácido nucleico por
los compuestos a ensayar. El ensayo de bacteriófago para unir ácido
nucleico a compuestos a ensayar ofrece un procedimiento seguro y
barato para identificar compuestos que probablemente presentan una
inactivación eficaz de patógenos. Experimentos anteriores revelan
que el ensayo de r-17 mide con precisión la
sensibilidad de HIV-1 a compuestos similares.
Se hizo crecer r-17 en bacterias
Hfr 3000, de título aproximadamente 5x10^{11} (R17 y Hfr 3000 se
obtuvieron de la American Tissue Culture Collection (ATCC),
Washington, DC). El acopio de fago R17 se añadió a una solución de
suero fetal bovino al 15% en medio Eagles modificado de Dulbecco's
(DMEM) a una concentración final de fagos de 10^{9}/ml. Se pasó
una parte alícuota (0,5 ml) a un tubo de polietileno de 1,5 ml de
cierre por arriba. Se añadió al tubo una parte alícuota
(0,004-0,040 ml) de la solución de acopio del
compuesto a ensayar preparada en agua, etanol o dimetilsulfóxido a
0,80-8,0 mM. Los compuestos se ensayaron a
concentraciones entre 4 \muM y 320 \muM. (AMT es asequible
comercialmente de HRI Inc., Concord, CA; 8-MOP es
asequible experimentalmente de Sigma, St. Louis, MO). Los tubos se
pusieron en un dispositivo de luz como se describe en el Ejemplo 1
y se irradiaron entre 1 y 10 minutos. Se prepararon tubos de
dilución de 13 ml estériles; cada compuesto de ensayo requería un
tubo con 0,4 ml de caldo de Luria (LB) y 5 tubos que contenían 0,5
ml de caldo LB. Para hacer las diluciones, se añadió una parte
alícuota de 0,100 ml de la solución irradiada de fago y compuesto a
ensayar al primer tubo de dilución de 0,4 ml de medio y luego se
añadieron 0,020 ml de esta solución al segundo tubo de 0,05 ml de
medio (1:25). Luego se diluyó serialmente (1:25) la segunda
solución en los tubos restantes. A cada muestra diluida se añadieron
0,050 ml de bacterias Hfr 3000 cultivadas durante la noche y 3 ml
de agar superior con LB fundido, y los materiales mezclados es
vertieron en placas de caldo LB. Después de que hubiera endurecido
el agar de cobertura, se incubaron las placas a 37ºC durante la
noche. Se contaron a la mañana siguiente las unidades que formaban
placa y se calculó el título de los fagos remanentes después del
fototratamiento basádose en los factores de dilución.
Se realizaron los controles siguientes: el
"fago solo", en el que no se trató el fago con el compuesto a
ensayar y no se irradió (designado "título de partida" en las
tablas siguientes); el "UV sola", en el que el fago se irradió
sin estar presente el compuesto a ensayar; y el control
"oscuro", en el que la solución de fago/compuesto a ensayar no
se irradió antes de que se diluyera y cultivara.
La Tabla 5 que sigue presenta tres diferentes
experimentos en los que se ensayó el compuesto 1 de acuerdo con el
protocolo de R17 justo descrito en los que antecede. Una comparación
de los valores para las muestras de control en las tandas
1-3 (valores en negrita) revela que ni los controles
"UV sola" ni "oscuro" dan por resultado una mortalidad
significativa de bacterias. (como máximo, 3 logs mort en el control
"UV sola" y 0,1 logs mort en el control "oscuro").
El control "UV sola" se repitió en muchos
experimentos similares con otros compuestos de la presente invención
y consistentemente no presentó mortalidad significativa. (Datos no
presentados). Así, el control "UV sola" no se presenta en las
tablas y figuran siguientes, aunque se realizó en cada experimento
de este ejemplo. Para el control "oscuro", después de muchos
intentos con varios compuestos de la presente invención, no se
observó inactivación bacteriana significativa experimentalmente sin
irradiación. (Datos no representados). Por ejemplo, en la Tabla 5,
el experimento 1 muestra 0,1 logs de mort. Con el compuesto 1 en
oscuro. A diferencia, cuando el compuesto 1 se irradia durante
justamente 1 minuto, la caída del título resultante es >6,7 logs.
Por tanto, los controles "oscuros" no se realizaron para
compuestos ensayados más tarde y no se presentan en las tablas y
cifras que siguen.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las siguientesTablas 6-9 y Figs.
11-13 presentan los resultados del ensayo de R17
para varios compuestos de 4'-amino
primario-sustituido psolareno. Los datos de las
Tablas 7 y 8 aparecen en las Figs. 11 y 12, respectivamente. Los
compuestos de psolareno 5'-sustituidos con amino
primario (ejemplos comparativos) que tienen sustituciones en la
posición 5' similares a los compuestos de psolareno
4'-sustituidos con amino primario, se ensayaron
también a concentraciones variables, como se ha descrito antes en
este ejemplo, y presentan una eficiencia de inactivación
comparable. Los resultados de estos compuestos se presentan en las
Figs. 14 y 15.
Los compuestos que tienen sustituciones en la
posición 4' del anillo de psolareno demostraron ser activos para
matar R17 como se muestra en las tablas siguientes:
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En la Tabla 7 se ve que el compuesto 1 exhibe
una eficiencia de inactivación de R17 mucho más alta que
8-MOP. Como se ve en la Tabla 7 y la Fig.11, el
compuesto 1 es uno de los compuestos menos activos. Ambos
compuestos, 2 y 3, presentan un log de inactivación más alto que el
compuesto 1 en cada punto de concentración. Estos resultados
soportan que generalmente los compuestos son mucho más activos que
el 8-MOP.
Los compuestos tienen también una eficiencia de
inactivación de R17 similar o mejor que AMT. En las Tablas 7 y 8 y
las Figs. 11-15, todos los compuestos de la presente
invención consiguen un log de inactivación de R17 a niveles
comparable a los de AMT. Los compuestos 2 y 3 (Tabla 6, Fig. 11),
los compuestos 5 y 6 (Tabla 8, Fig. 12) y el compuesto 16 (Fig. 15)
presentan una eficiencia de inactivación significativamente más alta
que AMT.
Los compuestos se ensayaron también a niveles
constantes para dosis variables de luz UV. Se prepararon tres
conjuntos de tubos de 1,5 ml que contenían partes alícuotas de 0,6
ml de R17 en DMEM (preparado como se ha descrito antes). El
compuesto ensayado se añadió a la concentración deseada y las
muestras se agitaron remolineando. Las muestras se irradiaron luego
a intervalos de 1,0 J/cm^{2} hasta alcanzar 3,0 J/cm^{2}. Entre
cada intervalo de 1,0 J/cm^{2} se extrajeron de cada muestra 100
\mul y se pusieron en el correspondiente primer tubo de dilución.
Luego se realizaron 5 diluciones secuenciales para cada compuesto
ensayado, a las 3 dosis de irradiación, como se ha descrito antes en
este ejemplo.
Luego se añadieron a cada tubo 50 \mul de
bacterias Hfr 3000, 3 ml de agar de cobertura y se volvió a
remolinear el contenido de los tubos. El contenido de cada tubo se
vertió en su propia placa de LB y las placas se incubaron durante
la noche a 37ºC. Se hizo el recuento de las placas por inspección
visual a la mañana siguiente.
En las Figs. 16-22 se presentan
los resultados del ensayo para varios compuestos de psolareno 4'- y
5'-amino primario-sustituidos. Este
dato confirma además que los compuestos son comparables con AMT en
cuanto a su capacidad de inactivar R17. Además, los compuestios 6
(Fig. 16), 10 (Fig. 18), 15 (Fig. 19 y 22) y 17 (Fig. 20) eran más
eficientes en la para inactivación de R17 que AMT.
Se evaluó la eficiencia de inactivación de
patógenos de varios compuestos examinando la capacidad de los
compuestos para inactivar virus exentos de células (HIV). La
inactivación de HIV exento de células se realizó omo sigue:
Como en el ensayo de R17, se añadieron pequeñas
partes alícuotas de los compuestos de las Tablas 10 y 11, a las
concentraciones dadas en las tablas, a HIV-1 de
acopio a un total de 0,5 ml. El HIV del acopio
(10^{5}-10^{7} unidades/ml que forman placa)
estaba en DMEM/FBS al 15%. Las partes alícuotas de 0,5 ml se
pusieron en placas de cultivo de poliestireno de 24 pocillos y se
irradiaron con 320-400 nm (20 mW/cm^{2}) durante 1
min en un dispositivo similar al dispositivo del Ejemplo 1. El
dispositivo de fotoactivación usado se ensayó previamente y se
encontró que daba resultados de exposición a la luz comparables con
los del dispositivo del Ejemplo 1. (Datos no representados). Los
controles incluían acopio de HIV-1 solo,
HIV-1 más UVA sola y HIV-1 más la
máxima concentración de cada psolareno ensayado, sin UVA. Después
de la irradiación, todas las muestras se almacenaron congeladas a
-70ºC hasta que se ensayaron en cuanto a la capacidad de infección
por el ensayo en placa de microtitulación. Se separaron las partes
alícuotas para la medición de la capacidad de infección por HIV en
las muestras tratadas con un compuesto de la presente invención y se
cultivaron.
La capacidad residual de infección por HIV se
ensayó usando un ensayo de capacidad de infección
MT-2. (Descrito previamente por Hanson, C.V.,
Crowford-Miksza, L y Sheppard, H.W., J. Clin. Micro
28:2030 (1990)). El medio de ensayo era DMEM al 85% (con una
concentración alta en glucosa) que contenía 100 \mug de
estreptomicina, 100 U de penicilina, 50 \mug de gentamicina y 1
\mug de anfotericina B por ml, 15% de FBS y 2 \mug de Polybrene
(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) por ml. Las muestras de ensayo y
las de control se diluyeron en 50% de medio de ensayo y 50% de
plasma normal humano combinado. Las muestras se diluyeron
serialmente directamente en placas de 96 pocillos (Corning Glass
Works, Corning, N.Y.). Las placas se mezclaron en una mesa de
sacudidas oscilante durante 30 segundos y se incubaron a 37ºC en
atmósfera con 5% de CO_{2} durante 1-18 horas. A
cada pocillo se añadieron células MT-2 (0,025 ml)
[clon alfa-4, asequibles (nº. de catalogo 237) de
National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent
Program, Rockville, Md] para obtener una concentración de 80.000
células por pocillo. Después de 1 hora más de incubación a 37ºC en
atmósfera con 5% de CO_{2}, se añadieron a cada pocillo 0,075 ml
de medio de ensayo que contenía 1,6% de agarosa SeaPlaque (FMC
Bioproducts, Rockland, Maine), precalentado a 38,5ºC. Las placas se
mantuvieron a 37ºC durante unos pocos minutos hasta que se habían
acumulado varias placas y luego se centrifugaron en soportes de
placas a 600xg durante 20 min en una centrifugadora preenfriada a
10ºC. En la centrifugadora se formaron monocapas de células antes de
que gelificara la capa de agarosa. Las placas se incubaron a 37ºC
durante 5 días en atmósfera con 5% de CO_{2} y se tiñeron
añadiendo a cada pocillo 0,05 ml de yoduro de propidio (Sigma
Chemical Co.) en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4).
Después de 24 a 48 horas, se examinaron visualmente las microplacas
teñidas en rojo por fluorescencia poniendo las placas en una caja
de luz ultravioleta de 304 nm de 8.000 \muW/cm^{2} (Fotodyne,
Inc., New Berlin, Wis.). Las placas se contaron a un aumento de x20
a x25 con un estereomicroscopio. Los resultados se presentan en las
siguientes Tablas 10 y 11. "n" representa el número de tandas
para las que el punto de datos es una media.
Los resultados revelan que los compuestos son
eficaces para inactivar HIV. De hecho, los datos para
concentraciones de 64 \muM de compuesto o más altas sugieren que
los compuestos 2 y 3 son significativamente más activos que AMT,
que anteriormente se había pensado que era uno de los psolarenos
antivirales más activos. A concentraciones más bajas, el compuesto
6 es capaz de matar un log de HIV más alto (3,1 logs a 32 \muM)
que el AMT (2,5 logs a 32 \muM). Los otros compuestos de la Tabla
9 presentan una eficiencia de inactivación del mismo intervalo que
AMT.
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Este ejemplo describe el protocolo de
inactivación del virus de hepatitis B de pato (DHBV), un modelo para
el virus de hepatitis B, usando compuestos de la presente
invención.
Se añadió DHBV en yema de huevo de pato a un
concentrado de plaquetas (PC) a una concentración final de 2 x
10^{7} partículas por ml y se mezcló sacudiendo suavemente durante
15 min o más. Se añadieron los psolarenos S-70,
S-59 AMT a partes alícuotas de 3 ml de PC en
minibolsa de Teflón^{MC} a concentraciones de 35, 70 y 100 mM.
Las muestras, incluidos los controles sin psolareno añadido, se
irradiaron con 5 J/cm^{2} de UVA, mezclando a incrementos de 1
J/cm^{2}. Después de la irradiación, se separaron por
centrifugación los leucocitos y las plaquetas del virus. El
material sobrenadante que contenía DHBV es digirió a 55ºC durante la
noche con 50 \mug/ml de proteinaza K en uin tampón que contenía
0,5% de dodecilsulfato sódico, tampón Tris 20 mM, pH 8,0, y EDTA 5
mM. Las muestras se sometieron a extracción con
fenol-cloroformo y cloroformo, a lo que siguió
precipitación con etanol. Se usó luego DNA purificado en reacciones
de amplificación por PCR con una entrada de arranque de 10^{6}
genomas DHVD de cada muestra. Los amplicones de PCR se generaron
usando pares de cebadores DCD03/DCD05 (127 bp), DCD03/DCD06 (327
bp) y DCD03/DCD07 (1072 bp). La PCR se realizó en tampón estándar de
PCR que contenía 0,2 mM de cada desoxinucleósido
5'-trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 0,05 mM de
cada cebador y 0,5 unidades de Taq polimerasa por 100 ml de
reacción. Se realizaron 30 ciclos de amplificación con el siguiente
perfil térmico: 95ºC 30 s, 60ºC 30 s, 72ºC 1 min. A la amplificación
siguió una incubación durante 7 min a 72ºC para que resultaran
productos de longitud entera. Se añadió [lambda -^{32}P] dcTP en
ujna cantidad de 10 mCi por 100 ml con el fin de detectar y
cuantificar los productos resultantes. Los productos se separaron
por electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida y se
contaron. La ausencia de señal en una reacción dada se tomó como
indicación de inactivación eficaz
de DHBV.
de DHBV.
Los resultados revelaron que los amplicones
menores mostraban una inactivación creciente en función de la
concentración de psolareno para todos los psolarenos ensayados. A
las mismas concentraciones, S-59 y
S-70 inhibían la PCR de los amplicones menores
mejor que el AMT. Para el amplicón de 1072 bp, se observó inhibición
completa de PCR a todas las cioncentraciones de
S-59 y S-70, mientras que la muestra
sin psolareno dio una señal fuerte. AMT inhibía la amplificación
por PCR del amplicón de 1072 bp a los niveles de 70 y 100 mM, pero
se pudo detectar una señal cuando se usó AMT a una concentración
final de 35 mM.
En el Ejemplo 10, se ensayaron los compuestos en
cuanto a su capacidad para inactivar virus en DMEM/FBS al 15%. En
este ejemplo, los compuestos se ensayan en 100% de plasma y en medio
predominantemente sintético para demostrar que los procedimientos
de la presente invención no están restringidos a cualquier tipo
particular de
medio.
medio.
Para las muestras en medio sintético, se
centrifugaron concentrados de plaquetas humanas estándar para
separar el plasma. Luego se expresó 85% del plasma y se reemplazó
con un medio sintético (denominado "Sterilyte^{MC} 3.0") que
contenía acetato sódico 2 mM, glucosa 2 mM; KCl 4 mM, NaCl 100 mM,
citrato trisósico 10 mM, NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 20 mM
y MgCl_{2} 2 mM. SE añadieron células H9 infectadas con HIV a los
concentrados de plaquetas en Starilyte^{MC} 3,0 al 85% o a
concentrados de plaquetas humanas estándar (2,5x10^{7} células por
concentrado) a una concentración final de 5x10^{5} células/ml.
Los concentrados de plaquetas se pusieron en FL20 modificado de
Teflón^{MC} o minibolsas de Teflón^{MC} (American Fluoroseal
Co., Silver Springs, MD), se trataron con uno de los compuestos de
la Fig. 24 a las concentraciones indicadas y luego se irradiaron con
320-400 nm (20 mW/cm^{2}) para 5 J/cm^{2} (para
muestras de plasma) o 2 J/cm^{2} (para muestras con 85% de
Sterilyte^{MC}) en un dispoitivo similar al del Ejemplo 1. El
dispositivo de fotoactivación usado en este ejemplo había sido
ensayado previamente y se encontró que daba por resultado una
exposición a la luz comparable a la del dispositivo del Ejemplo 1.
(Datos no presentados). Se separaron y cultivaron partes alícuotas
para medir la capacidad infectiva del HIV residual en las muestras
tratadas con un compuesto de la presente invención.
Para muestras en plasma: células H9 infectadas
con HIV se añadieron a concentrados de plaquetas hmanas estásndar
(2,5 x 10^{7} células por concetrado), concentración final 5 x
10^{5} células/ml. Se pusieron en cámaras de Pyrex con camisa de
agua partes alícuotas (5 ml) de concentrados de plaquetas
contaminadas con HIV. Las cámaras habían sido revestidas
previamente en el interior con silicio. Los concentrados de
plaquetas se trataron con uno de los compuestos de las Tablas 10 y
11 a las concentraciones dadas en las tablas, y luego se irradiaron
con 320-400 nm (20 mW/cm^{2}) durante 1 min en un
dispositivo similar al del Ejemplo 1. El dispositivo de
fotoactivación udsado en este ejemplo había sido previamente
ensayado y se encontró que daba una exposición a la luz comparable
a la del dispositivo del Ejemplo 1. (Datos no representados). Se
separaron y cultivaron partes alícuotas para medir la capacidad
infectiva del HIV residual en las muestras en plasma y
Sterilyte^{MC} al 85% usando un ensayo de capacidad infectiva
MT-2 (detallado en el Ejemplo 13 y descrito
anteriormente por Hanson, C.V y otros, J. Clin. Micro 28:2030
(1990)). Los resultados se dan en la Fig. 24.
Los resultados revelan que los compuestos son
eficaces para inactivar HIV en plasma y en medio sintético.
Comparando las Figs. 18 y 19, parecen ambas curvas de inactivación
iguales, logrando ambas aproximadamente 5 logs de inactivación a
concentraciones 64 \muM de compuesto. Sin embargo, la inactivación
en medio sintético se realizó con solo 2 J/cm^{2}de irradiación,
3 J/cm^{2} menos que la requerida para alcanzar la misma
inactivación en plasma. Así, parece a la vista de estos datos que el
medio sintético facilita los procedimientos de inactivación de la
presente
invención.
invención.
En este ejemolo se midió, en función de la
capacidad de las bacterias de replicar posteriormente, la
inactivación bacteriana por los compuestos fotorreactivos que se
unen a ácido nucleico. Se escogió una bacteria gram negativa como
representativa de las cepas de bacterias más difíciles de
inactivar.
La bacteria, una cepa de Pseudomonus, se
inoculó en LB con un lazo estéril y se hizo crecer durante la noche
en una mesa de sacudidas a 37ºC. Basándose en el supuesto aproximado
de que un OD a 610 nm es equivalente a 5 x 10^{6} unidades que
forman colonia (cfu)/ml, se midió una dilución 1:10 del cultivo en
un espectrómetro (fabricado por Shimatsu). El cultivo de bacterias
se añadió a una solución de 15% de suero fetal bovino en DMEM a una
concentración final de bacterias de aproximadamente 10^{6}/ml. Se
pasó una parte alícuota (0,8 ml) a un tubo de polietileno de 1,5 ml
con cierre arriba. Se añadió al tubo una parte alícuota
(0,004-0,040 ml) de la solución de acopio del
compuesto a ensayar preparada en agua, etanol o dimettilsulfóxido a
0,80-8,0 mM. Los compuestos se ensayaron a una
concentración de 16 \muM. Los tubos se pusieron en un dispositivo
lumínico como se ha descrito en el Ejemplo 1 y se irradiaron con 1,3
J/cm^{2}, 1,2 J/cm^{2} y finalmente 2,5 J/cm^{2}, con un
total de 5 J/cm^{2}. Se tomaron 150 \mul para ensayo después de
cada período de pulsación. Se prepararon tubos de dilución de 13 ml
estériles; cada compuesto a ensayar requería un tubo con 0,4 ml de
caldo LB y 4 tubos que contenían 0,5 ml de caldo LB. Para hacer las
diluciones, se añadieron al primer tubo de dilución de 0,5 ml de
medio, una parte alícuota de 0,050 ml de la solución de fago
irradiada y luego, 0,050 ml de la solución así diluida se añadieron
a un segundo tubo de dilución de 0,5 ml de medio (1:10). La segunda
solución se diluyó luego serialmente (1:10) en los tubos restantes.
100 \mul de la muestra original y cada dilución se cultivan
separadamente sobre placas de agar con LB y se incuban durante la
noche a 37ºC. La mañana siguiente se hizo el recuento de las
unidades que forman colonia y, basándose en los factores de
dilución, se calculó el título del fago remanente después del
fototratamiento.
Se hicieron los controles siguientes:
"bacteria sola", en el que la bacteria no se trató con el
compuesto a ensayar y no se irradió (indicado "título de
partida" en las tablas); "UV sola", en el que la bacteria se
irradió en ausencia de compuesto a ensayar. No se hicieron
controles oscuros por las razones expuestas en el anterior Ejemplo
12.
Los resultados fueron como sigue: El título de
partida de la bacteria era de 6,5 logs. Después de 5 j/cm^{2} de
irradiación, los log mort para los avrios compuestos ensayados
fueron los siguientes: 8-MOP - 1,9 logs; AMT - 5,2
logs, compuesto 2 - >5,5, compuesto 6 - >5,5. Es evidente
según estos resultados que los compuestos son más eficaces que AMT y
8-MOP para inactivar una bacteria gram negativa.
En los ejemplos anteriores, los psolarenos han
demostrado ser eficaces para inactivar patógenos tales como
bacterias (pseudomonus), bacteriófagos (R17) y virus (HIV y DHBV).
Sin que ello suponga limitarse a cualquier procedimiento por el que
los compuestos inactivan patógenos, se cree que la inactivación es
resultado de la unión inducida por la luz de los psolarenos al
ácido nucleico de los patógenos. Como se ha discutido en lo
anterior, el AMT es conocido por su eficiencia de inactivación de
patógenos y su acción mutagénica acompañante en la oscuridad a
concentraciones bajas. A diferencia, los psolarenos menos activos,
tales como 8-MOP, que se han examinado antes,
presentan una capacidad mutagénica significativamente menor. Este
ejemplo establece que la fotounión y la capacidad mutagénica no son
un fenómeno unido en los compuestos de la presente invención. Los
psolarenos de la presente invención tienen una eficiencia
excepcional de inactivación de patógenos mientras que presentan sólo
una capacidad mutagénica mínima.
En este ejemplo, los compuestos se ensayan en
cuanto su capacidad mutagénica sin haber sido irradiados usando el
ensayo de Ames. Se siguieron exactamente los procedimentos usados
para el ensayo de capacidad mutagénica de Salmonella descrito
detalladamente por Maron y Ames. Maron, D.M. y B.N. Ames, Mutation
Research 113:173 (1983). Se describe aquí brevemente cada
procedimiento. Las cepas para el ensayo TA97a, TA98, TA100, TA102,
TA1537 y TA1538 se obtuvieron del Dr. Ames. TA97a, TA98, TA1537 y
TA1538 son cepas de ensayo de desplazamiento de marco. TA100 y
TA102 son cepas de ensayo de sustitución de base. Después de
recibirlas, cada cepa se cultivó en una variedad de condiciones
para confirmar los genotipos específicos para las cepas.
Las cepas de ensayo de Salmonella estándar
usadas en este estudio requieren histidina para crecer dado que
cada cepa de ensayo contiene un tipo de mutación diferente en el
operón de histidina. Además, estas cepas de ensayo contienen otras
mutaciones, que se describen seguidamente, que aumentan mucho su
capacidad de detectar mutágenos.
Dependencia de la histidina: El
requerimiento en cuanto a histidina se ensayó extendiendo
primeramente cada cepa en un cultivo mínimo de glucosa suplementda
sólo con biotina y luego en un cultivo mínimo de glucosa
suplementada con biotina e histidina. Todas las cepas crecieron
revelando la falta de crecimiento de las cepas en ausencia de
histidina.
Mutación de rfa: Se confirmó una mutación
que causa pérdida parcial de la barrera de lipopolisacárido que
reviste la superficie de la bacteria aumentando así la permeabilidad
para moléculas grandes, exponiendo una placa de agar con nutriente
revestida con la cepa de ensayo a violeta cristal. Primeramente se
añadieron 100 \mul de cada cultivo a 2 ml de agar de cobertura
mínima fundido y se vertió sobre una placa nutriente con agar.
Luego se puso un disco de papel de filtro estéril saturado con
violeta cristal en el centro de cada placa. Después de 16 horas de
incubación a 37ºC, se almacenaron las placas y se encontró en torno
al disco una zona clara sin crecimiento bacteriano, lo que confirmó
la mutación de rfa.
Mutación de uvrB: Tres cepas usadas en
este estudio contienen un sistema de reparación de UV (TA97a, TA98,
TA100, TA1537 y TA1538). Este rasgo se ensayó extendiendo las cepas
sobre una placa de agar nutriente que cubría la mitad de la placa e
irradiando la cara expuesta de la placa con lámparas germicidas.
Después de la incubación, se vió incubación sólo en la cara de la
placa protegida contra la irradiación UV.
Factor R: Las cepas de ensayo (TA97a,
TA98, TA100 y TA102) contienen el plásmido pKM101 que aumenta su
sensibilidad a mutágenos. El plásmido confiere también a las
bacterias ressitencia a la ampicilina. Esto fue confirmado por el
crecimiento de cepas en presencia de ampicilina.
PAQ1: La cepa TA 102 contiene también el
plásmido pAQ1 que aumenta más su sensibilidad a mutágenos. Esta
plásmido también codifica resistencia a la tetraciclina. Para
ensayar la presencia de este plásmido, se extendió TA102 sobre una
placa de glucosa mínima que contenía histidina, biotina y
tetraciclina. La placa se incubó durante 16 h a 37ºC. La cepa
presentó un crecimiento normal que revelaba la presencia del
plásmido pAQ1.
Los mismos cultivos usados para el ensayo de
genotipos se cultivaron nuevamente y partes alícuotas se congelaron
en condiciones controladas. Los cultivos se ensayaron de nuevo en
cuanto al genotipo para confirmar la fidelidad del genotipo después
de la manipulación en la preparación de muestras permanentes
congeladas.
Los primeros ensayos hechos con las cepas eran
para determinar el intervalo de reversión espontánea para cada una
de las cepas. Con cada experimento de capacidad mutagénica se midió
la reversión espontánea de las cepas de ensayo a la independencia
de la histidina y se expresó como el número de agentes de reversión
espontánea por placa. Estos sirvieron como controles de fondo. En
cada cepa de ensayo se incluyó un control positivo de mutagénesis
usando un mutágeno dianóstico adecuado para esa cepa
(2-aminofluoreno a 5 mg/placa para TA98 y azide
sódica a 1,5 mg/placa para TA 100).
Para todos los experimentos se usó el
procedimiento de preincubación. En este procedimiento se descongeló
un vial de cada cepa de ensayo y 20 \mul de este cultivo se
añadieron a 6 ml de caldo nº. 2 Oxoid Nutrient. Esta solución se
sacudió durante 10 horas a 37ºC. En el procedimiento de
preincubación, se añadió 0,1 ml de este cultivo nocturno a cada uno
de un número requerido de tubos de ensayo estériles. A la mitad de
los tubos, 0,5 ml de una solución al 10% de S-9 que
contenía Aroclor 1254 indujeron extracto de hígado de rata
(Molecular Toxicology Inc, Annapolis, MD), y se añadió MgCl_{2},
KCl, 6-fosfato de glucosa, NADP y tampón de fosfato
sódico (Sigma, St. Luis, Missouri). En la otra mitad de los tubos se
usaron 0,5 ml de tampón de fosfato sódico 0,2M, pH 7,4, en vez de
la mezcla de S-9 (muestras -S9). Finalmente, se
añadieron 0,1 ml de la solución de ensayo que contenía 0, 0,1, 0,5,
1, 5, 10, 50, 100, 250 o 500 \mug/ml del compuesto a ensayar. La
mezcla de 0,7 ml es agitó por remolinado y luego se preincubó
mientras que se sacudía durante 20 min a 37ºC. Después de haber
sido sacudida, a la mezcla de 0,7 ml se añadieron 2 ml de agar de
cobertura fundido suplementado con histidina y biotina e
inmediatamente se vertió en una placa de agar con glucosa mínima (el
volumen de agar de base era de 20 ml). Se dejó durante 30 min que
solidificara el agar de cobertura y luego se invirtieron las placas
y se incubaron a 37ºC durante 44 horas. Después de la incubación, se
contó el número de colonias que revierten en cada placa. Los
resultados aparecen en las Tablas 12(A)-18
(B) seguidamente ("n" representa el número de replicados
realizados para cada punto de datos).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Maron y Ames (1983) describen los puntos de
vista conflictivos en cuanto al tratamiento estadístico de datos
generados en el ensayo. A la luz de ello, este ejemplo adopta el
modelo simple de capacidad mutagénica que se caracteriza por un
aumento de dos veces o más en el número de agentes que revierten por
encima del fondo (en negritas en las tablas), así como la respuesta
mutagénica dependiente dec la dosis al fármaco.
En cuanto a 8-MOP, la única
respuesta mutagénica detectada fue un mutágeno de sustitución débil
de una base en TA102 a 500 \mug/placa (Tabla 13 (B)).
En contraste marcado, el AMT (Tabla 12 (A) y 12
(B)) presentaba una capacidad mutagénica de desplazamiento de marco
entre 5 y 10 \mug/placa en TA97a y TA98, a 5 \mug/placa en
TA1537 y a 1 \mug/placa a TA1538. El AMT no presentaba mutaciones
significativas de sustitución de base.
En cuanto al compuesto 1, la única respuesta
mutagénica detectada fue un mutágeno débil de desplazamiento de
marco en TA1538 a 5 \mug/placa en presencia de S9. El compuesto 1
presentó también mutación en la cepa TA100, pero sólo en ausencia
de S9. El compuesto 2 también presentó capacidad mutagénica de
desplazamiento de marco débil en presencia de S9 en TA98 y TA1537.
Los compuestos 3 y 4 no presentaban capacidad mutagénica. El
compuesto 6 no tenía capacidad mutagénica de sustitución de base
pero presentaba una respuesta de desplazamiento de marco en TA98 en
presencia de S9 a concentraciones de 250 \mug/placa y más. También
presentó una respuesta a 50 \mug/placa en TA1537 en presencia de
S9. El compuesto 18 presentó sólo una respuesta débil a
concentraciones altas en presencia de S9 en las cepas TA 90 y TA
1537. La respuesta era más alta en ausencia de S9, pero todavía
seguía siendo significativamente inferior a la de AMT, que
presentaba capacidad mutagénica a concentraciones mucho menores (5
\mug/placa).
Se deduce claramente de estos datos que los
compuestos son menos mutagénicos que el AMT, según el ensayo de
Ames. Al mismo tiempo, estos compuestos presentan una eficiencia de
inactivación mucho más alta que el 8-MOP, como se
ve en los Ejemplos 16 y 18. Estos dos factores demuestran que los
compuestos combinan los mejores rasgos de AMT y
8-MOP, alta eficiencia de inactivación y baja
capacidad mutagénica.
En el Ejemplo 12, los compuestos presentan la
capacidad de inactivar patógenos en medios sintéticos. Este ejemplo
describe procedimientos en los que se pueden introducir y usar
medios sintéticos y compuestos para inactivar patógenos en sangre.
La Fig. 25A presenta esquemáticamente el enfoque de separación de
productos estándar de sangre usado actualmente en bancos de sangre.
Se integran tres bolsas con una tubulatura flexible para hacer un
ensamblaje de transferencia de sangre (200) (por ejemplo, adquirible
comercialmente de Baxter, Deerfiled, Ill.). Después de haber
aportado sangre a la primera bolsa (201), se somete a centrifugación
el dispositivo entero (por ejemplo, la centrifugadora de balsa
oscilante Sorvall^{MC}, Dupont), lo que da por resultado glóbulos
rojos empaquetados y plasma rico en plaquetas en la pimera bolsa. El
plasma se expresa por exclusión de la primera bolsa (201) (por
ejemplo, usando un dispositivo Fenwall^{MC} para expresión de
plasma) a través de la tubulatura y a la segunda bolsa. Se separa
luego la primera bolsa (201) y el conjunto de dos bolsas se
centrífuga para crear concentrado de plaquetas y plasma pobre en
plaquetas; éste último se saca de la segunda bolsa (202) a la
tercera bolsa (203).
La Fig. 25B representa esquemáticamente una
realización de la presente invención con la que el medio sintético
y el compuesto de fotoactivación se introducen en el concentrado de
plaquetas como se indica en la Fig. 25A Un conjunto de dos bolsas
(300) ha sido recortado por esterilidad con la bolsa de concentrado
de plaquetas (202) (indicado como "P.C"). El recorte por
esterilidad es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo,
patente U.S. nº. 4.412.835, expedida a D.W.C. Spencer. Véanse
también las patentes U.S. nº. 4.157.723 y nº. 4.265.280. Los
dispositivos de recorte por esterilidad son asequibles
comercialmente (por ejemplo, Terumo, Japón).
Una de las bolsas (301) del conjunto de dos
bolsas (300) contiene una formulación de medio sintético (indicado
como "STERILYTE"). En la segunda etapa representada en la Fig.
25B, el concentrado de plaquetas se mezcla con el medio sintético
pasando el concentrado de plaquetas a la bolsa con medio sintético
(301) por paso del concentrado de plaquetas desde la primera bolsa
de sangre a la segunda bolsa de sangre a través del medio de
conexión estéril. El compuesto de fotoactivación puede estar en la
bolsa que contiene medio sintético (301), añadido cuando se monta.
Alternativamente, el compuesto se puede mezclar con la sangre en el
punto de recogida, si el compuesto se añade a la bolsa de recogida
de sangre (Fig. 25A, 201) cuando se monta. El compuesto puede estar
en forma seca o en una solución compatible con la conservación de la
sangre.
La Fig. 25C representa esquemáticamente una
realización del enfoque de descontaminación de la presente invención
aplicada específicamente a un concentrado de plaquetas diluido con
medio sintético según la Fig. 28B. En esta realización, las
plaquetas se han pasado a una bolsa (301) con medio sintético. El
compuesto de fotoactivación ha sido introducido ya en la bolsa de
recogida de sangre (201) o, está en la bolsa (301) de medio
sintético. Entonces, las plaquetas se pasan a la bolsa de medio
sintético a través del medio estéril de conexión o el medio
sintético se pasa a la bolsa de plaquetas. Luego, la bolsa que
contiene la mezcla de concentrado de plaquetas y medio sintético
(301), que tiene unas propiedades de transmisión de luz UV y otras
características adecuadas para la presente invención, se pone en un
dispositivo (tal como el descrito en el Ejemplo 1) y se ilumina.
Seguidamente al fototratamiento, las plaquetas
descontaminadas se pasan desde la bolsa (301) de medio sintético a
la bolsa de almacenamiento (302) del conjunto de dos bolsas (300).
La bolsa de almacenamiento puede ser una bolsa de almacenamiento
disponible en el comercio (por ejemplo, la bolsa CLX de Cutter).
La Fig. 25D representa esquemáticamente una
realización del enfoque de descontaminación de la presente invención
que incluye un dispositivo de captura para eliminar el compuesto de
fotoactivación del material tratado después del fototratamiento. La
presente invención contempla varios materiales absorbentes que se
pueden usar en un dispositivo de captura para eliminar compuestos
de inactivación de los que los siguientes son una lista no
exclusiva: Amberlite XAD-4 (asequible de Rohm and
Haas Ltd., Croydon, Surrey, RU) ("Resin hemoperfusion fot Acute
Drug Intoxication", Arch Intern Med 136:263 (1976)); Amberlite
XAD-7 ("Albumin.Coated Amberlite
XAD-7 Resin for Hemoperfusion in Acute Liver
Failure", Artificial Organs, 3:20 (1979); Amberlite 200,
Amberlite DP-1, Amberlite XAD-2,
Amberlite XAD-16; carbones activos ("Charcoal
hemoperfusion in Drug Intoxication", British J. Hospital Med.
49:493 (1993); sílice ("In vitro Studies of the Efficacy of
Reversed Phae Silica Gel as a Sorbent for Hemo- and
Plasmaperfusion", Clinical Toxicology 30:69 (1992)). En una
realización, la presente invención contempla un material
absorbrente que actúa junto con un medio filtrante para eliminar
compuestos.
Este Ejemplo implica una estimación del impacto
de los procedimientos de la presente invención sobre la función de
las plaquetas. Se emplearon cuatro indicadores de la viabilidad y
función de las plaquetas: (1) expresión de GMP-140,
(2) mantenimiento del pH; (3) agregación de plaquetas y (4) recuento
de plaquetas.
Para medir los efectos de los presentes
compuestos y procedimientos de descontaminación sobre la función de
las plaquetas usando estos cuatro indicadores, se prepararon cuatro
muestras de cada compuesto ensayado, dos muestras de control y dos
que contenían compuesto. Se obtuvieron tres unidades de plaquetas
humanas de Sacramento Blood Centre, Sacramento, CA. Cada una de
éstas se pasó en condiciones estériles a un tubo de centrifugadora
de 50 ml y luego partes alícuotas de cada unidad se pasaron a una
segunda serie de tubos estériles de 50 ml de centrifugadora. A cada
tubo de centrifugadora que contenía concentrado de plaquetas (PC) se
añadió una parte alícuota del acopio de compuesto para tener una
concentración final de 100 \mug de compuesto. Los compuestos
ensayados en este experimento fueron el compuesto 2 (36 \mul de 10
mM de acopio añadidos a 4 ml de PC), el compuesto 6 (173,5 \mul
de 9,8 mM de acopio añadidos a 16,8 ml de PC), el compuesto 17 (2,0
ml de 1 mM de acopio añadidos a 18 ml de PC), y el compuesto 18
(0,842 ml de 2,0 mM de acopio añadidos a 16 ml de PC). Las muestras
se pipetearon suavemente hacia arriba y abajo para mezclar. Luego se
pasaron partes alícuotas (de 3 ml u 8 ml) de cada muestra a dos
Medi-bags^{MC} de Teflon^{MC} estériles
(American Fluoroseal Co., Silver Springs, DM) (actualmente
propiedad de The West Company, Lionville, PA). Las muestras se
trataron en una de dos bolsas de diferente tamaño que tenían 3 ml u
8 ml de capacidad. Las bolsas tenían aproximadamente la misma
relación de superficie a volumen, y experimentos previos han
demostrado que las dos bolsas tienen aproximadamente propiedades
equivalentes durante la irradiación de las muestras. (Datos no
representados). Para cada compuesto ensayado, se prepararon dos
muestras de control extrayendo partes alícuotas de concentrado de
plaquetas (17 ml si se usaba una bolsa de 8 ml, 4 ml si se usaba una
bolsa de 3 ml) de la misma primera serie de tubos de centrifugadora
de 50 ml de la que se extrajo la muestra de compuesto, y
dividiéndola, como antes, en las semibolsas. Una de cada par de
semibolsas que contenían compuesto y una de cada par de semibolsas
de control se iluminaron con 5 Joules/cm^{2} en el dispositivo
descrito antes en el Ejemplo 1. Luego, todas las semibolsas
experimentales y de control se pusieron en una mesa de sacudida de
plaquetas para almacenarlas durante 5 días. Los mismos experimentos
se repitieron varias veces para obtener más datos estadísticamente
significativos, indicados como "n", el número de puntos de
datos representados, en los gráficos de las Figs.
26-29 que se discuten más adelante. También en las
Figs. 26-29, "C1" representa un control no
tratado del día 1, "D5" representa un control no tratado
después de almacenamiento durante 5 días, "uv" representa una
muestra que ha sido tratada sólo con luz ultravioleta y "PCD"
representa la muestra de ensayo tratada con luz ultravioleta y un
compuesto de la presente invención
Para obtener datos para muestras de control el
día 1, se extrajeron aproximadamente 3 ml del volumen restante de
cada una de las tres unidades y se dividieron en dos tubos de 1,5
ml. Estas muestras se ensayaron en cuanto al pH como se describe
seguidamente. También se hizo un recuento de plaquetas a una
dilución 1:3 como se describe luego. El concentrado residual de
plaquetas de cada unidad se agitó durante 10 min a 3800 rpm (3000 g)
en una centrifugadors Sorval RC3B (DuPont Company, Wilmington,
Delaware) a plaquetas en pellas. Luego se decantó el plasma en 2
tubos estériles de 50 ml (uno el día 1 y el otro almacenado a 4ºC
para el día 5) para uso en el ensayo de agregación.
Cuando se activaron las plaquetas, una
glcoproteína alfa de membrana de gránulo, denominada
p-selectina
(GMP140), queda expuesta en la superficie de la plaqueta. Menos de 5% de plaquetas normales no estimuladas, frescas, expresan por citometría de flujo niveles detectables de GMP. Véase en general M.J. Metzelaar, Studies on the Expresión of Activation-Markers on Human Platelets (Tesis 1991).
(GMP140), queda expuesta en la superficie de la plaqueta. Menos de 5% de plaquetas normales no estimuladas, frescas, expresan por citometría de flujo niveles detectables de GMP. Véase en general M.J. Metzelaar, Studies on the Expresión of Activation-Markers on Human Platelets (Tesis 1991).
Para medir GMP-140, una pequeña
parte alícuota de plasma rico en plaquetas se pone en tampón HEPES
que contiene un anticuerpo que se une a GMP 140 o un Isótopo de
control de IgG de ratón. CD62 es un anticuerpo moclonal disponible
comercialmente que se une a GMP 140 (adquirible de Sanbio, Ud,
Países Bajos; Caltag Labs, So. San Francisco, CA, y Becton
Dickinson, Mountain View, CA). Después de una incubación a
temperatura ambiente durante 15 min, se añade al tubo, en
cantidades de saturación, IgG antirraton F(ab')_{2} de
cabra conjugado a FITC (Caltag Laboratories, So. San Francisco, CA)
y se deja que incube a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
Finalmente, las células se diluyen en 1% de paraformaldehído en
solución salina tamponada con fosfato y se analiza en un
FACSCAN^{MC} (Becton Dickinson, Mountain View, CA). El control
positivo se hace añadiendo al sistema, a una concentración final de
2 x 10^{-7}M, miristato acetato de forbol (PMA).
En este ejemplo se empleó CD62 para medir el
impacto, si hubiera, de la irradiación en presencia de varios
compuestos de la presente invención sobre la activación de
plaquetas. El anticuerpo se mezcló con tampón HEPES (10 \mul de
anticuerpo [0,1 mg/ml]:2,49 ml de tampón) y se almacenó en 50 \mul
de alícuotas a -40ºC antes de uso. Un control positivo estaba
constituido por: 10 \mul de CD62, 8 \mul de PMA y 2,482 ml de
tampón HEPES. También se empleó un concentrado 5x de control de
IgG1 de ratón (0,05 mg/ml) (Becton Dickinson, Mountain View, CA
#9040). El anticuerpo se diluyó en tampón HEPES (20 \mul de
anticuerpo:2,48 ml de tampón) y se almacenó a -40ºC. Se almacenó
miristato acetato de forbol (PMA) (Sigma, St. Louis, MO). Al usarlo,
éste se diluyó en DMSO (la concentración de trabajo era de 10
\mug/ml).
Se preparó paraformaldehído al 1% (PFA) (Sigma,
St. Louis, MO) añadiendo 10 g de paraformaldehído a 1 l de PBS. La
mezcla se calentó a 70ºC y luego se añadió a gotas NaOH 3M hasta que
la solución era transparente. Se enfrió la solución y el pH se
ajustó a 7,4 con HCl 1N. La solución se filtró y almacenó.
El procesamiento de cada una de las muestras de
concentrados de plaquetas después de tratamiento implicaba la
adición de 5 microlitros de concentrado de plaquetas, diluido 1:3 en
tampón HEPES, a cada tubo de centrifugadora que contenía el
anticuerpo CD62 y los reactivos apropiados y una mezcla suave por
remolinado. Las muestras se incubaron luego durante 15 min a
temperatura ambiente.
A cada tubo se añadió (5 microlitros) el
IgG-FITC antirratón de cabra y la solución se mezcló
remolineando suavemente. Las muestras se incubaron durante 15 min
más a temperatura ambiente. Seguidamente, a cada tubo se añadió 1
ml de PFA al 1% en PBS y se mezcló suavemente. Se analizaron las
plaquetas en el FACSCAN^{MC}. Los resultados se presentan en las
Figs. 26C, 27C, 28C y 29C (la Fig. 26 corresponde al compuesto 2, la
Fig. 27 corresponde al compuesto 6, la Fig. 28 corresponde al
compuesto 17 y la Fig. 29 corresponde al compuesto 18). Claramente,
tres de los cuatro compuestos ensayados, 2, 6 y 17, presentan una
diferencia pequeña o no presentan diferencia entre el control no
tratado el día 5 (D5) y la muestra tratada con luz y compuesto
psolareno (PCD). Sólo el compuesto 18 presentaba un aumento notable
por encima del control. Pero el valor seguía siendo inferior al
valor de control positivo.
Los cambios del pH de plaquetas en el
concentrado pueden alterar sus características morfológicas y su
supervivencia después de transfusión. Moroff, G. y otros,
Factors Influencing Changes in pH during Storage of Platelet
Concentrates at 20-24ºC, Vox Sang, 42:33
(1982). El intervalo de pH en el que funcionan normalmente las
plaquetas es de aproximadamente 6,0-6,5 a 7,6.
Stack, G. y E.L. Snyder, Storage of Platelet Concentrate,
Blood Separation and Platelet Fractionation 99 a 107 (1991). Para
medir el pH de las muestras se usó un analizador
CIBA-CORNING 238 pH/Blood Gas
(CIBA-CORNING, Norwood, MA). Se introdujo en el
analizador de pH/gas de sangre una pequeña cantidad de concentrado
de plaquetas de cada muestra. Las mediciones de pH se hicieron para
todas las muestras al tiempo cero y después de 5 días de
almacenamiento. Las Figs.26D, 27D, 28D y 29D son gráficos de barras
que indican los resultados del pH para un control oscuro, un control
con luz y un compuesto experimental de luz más compuesto. Estos
gráficos indican que el pH de las muestras de concentrado de
plaquetas después de iluminación en presencia de cualquiera de los
compuestos permanece por encima de pH 6,5. Así, las plaquetas
permanecen a pH aceptable para plaquetas almacenadas después del
tratamiento de fotoinactivación usando compuestos de la presente
invención.
La agregación de plaquetas se mide por el cambio
de la transmisión óptica que una muestra de plaquetas exhibe
después de estimular la agregación. La agregación de plaquetas se
midió usando un Whole Blood Aggregometer
(Chrono-Log Corp., Havertown, PA, modelo 560 VS). Se
controló el número de plaquetas de cada muestra para que fuera
constante para cada medida. Se usó un contador de células Sysmex
modelo F800 (Toa Medical Electronics, Kobe, Japón) para el recuento
de plaquetas en las muestras de plaquetas y se usó plasma autólogo
para ajustar a 300.000/ml el número de plaquetas del concentrado de
plaquetas.
Para el proceso, todas las muestras se incubaron
en un tubo de plástico con tapón durante 30 min a 37ºC para la
activación. El agregómetro se calentó a 37ºC. Para medir la
agregación de plaquetas se usó el canal óptico. La velocidad
magnética del agregómetro se fijó a 600 rpm. El concentrado de
plaquetas restante, del que no se extrajo muestra para tratamiento,
se centrífugo a alta velocidad (14.000 g) con una
microcentrifugadora durante 5 min para obtener recipientes de
plasma pobre en plaquetas autólogo a la muestras experimentales.
Para comenzar, se añadieron 0,45 ml del plasma
autólogo pobre en plaquetas junto con 0,5 ml de solución salina a
una cubeta de vidrio y se pusieron en el canal de PPP. Luego se
añadieron a una cubeta de vidrio (que contenía un imán pequeño)
0,45 ml del concentrado muestra de plaquetas y 0,50 ml de solución
salina. Después de un minuto, se añadieron a la cubeta de la
muestra los reactivos ADP y colágeno (10 \mul de cada uno). La
concentración final de ADP era de 10 \muM y la concentración
final de colágeno era de 5 \mug/ml. La agregación de plaquetas se
registró durante aproximadamente 8-10 min o hasta
que se alcanzó la lectura máxima.
Los resultados aparecen en las Figs. 26B, 27B,
28B y 29B. La línea de 100% de agregación es el nivel al que el
registrador se puso a cero. La línea de 0% de agregación es el nivel
al que transmitían las plaquetas antes de haber añadido ADP y
colágeno. El valor de agregación de plaquetas de la muestra se
determina tomando el valor máximo de agregación como porcentaje del
intervalo total. Tres o cuatro compuestos ensayados presentaban una
diferencia pequeña o no presentaban diferencia en los niveles de
agregación entre las muestras tratadas con compuesto y las muestras
no tratadas que se almacenaron durante 5 días. El compuesto 2
presentaba una pequeña reducción de la agregación, de
aproximadamente 8% desde el control el día 1. La agregación para la
muestra tratada con compuesto y uv era la misma que la de la muestra
tratada sólo con uv. Esto soporta la evidencia de que los
compuestos descontaminantes ensayados no tienen efecto significativo
sobre la agregación de plaquetas cuando se usan en los procedimentos
de la presente invención.
Para el recuento de plaquetas se usó un contador
de células Sysmex. Las muestras se diluyeron 1:3 en solución salina
de banco de sangre.
Los resultados de las mediciones del recuento de
plaquetas aparecen en las Figs. 26A, 27A, 28A y 29A. Para cada uno
de los compuestos, las muestrras no presentan una caída, o presentan
una caída pequeña, del número de plaquetas entre el control del día
5 y la muestra tratada el día 5. Es interesante que las muestras
tratadas con los compuestos 6, 17 y 18 presentan un número de
plaquetas más alto que las muestras tratadas sólo con luz. Por
ejemplo, las muestras tratadas con el compuesto 6 tenían unos
recuentos equivalentes al del control del día 5, pero las muestras
tratadas sólo con luz ultravioleta tenía una reducción de
aproximadamente 33% en el recuento de plaquetas. Así, el
tratamiento con los compuestos de la presente invención no sólo es
compatible con el mantenimiento del número de plaquetas, sino que
realmente evita la caída del número de plaquetas causada por la
exposición a la luz ultravioleta.
Un compuesto preferido para descontaminar sangre
a usar posteriormente in vivo no debe ser mutagénico para el
receptor de la sangre. En la primera parte de este experimento, se
exploraron algunos compuestos para determinar su nivel de
genotoxicidad en comparación con el aminometiltrimetilpsolareno. En
la segunda parte, se midió la capacidad clastogénica in vivo
de algunos compuestos de la presente invención observando la
formación de micronúcleos en reticulocitos de ratón.
Los cultivos de células mamíferas son
herramientas valiosas para estimar el potencial clastogénico de
productos químicos. En tales estudios, las células se exponen a los
productos químicos con y/o sin sistema de activación metabólica de
rata S-9 (S-9) y luego se examinan
en cuanto a la supervivencia de células (para exploración de la
genotoxicidad) o cambios en la estructura del cromosoma (para un
ensayo de aberración de cromosomas).
Se usaron células de ovario de hamster chino
(CHO; ATCC CCL 61 CHO-K1) para los ensayos de
genotoxicidad y aberración cromosómica. Las células CHO se usan
extensamente para el ensayo citogénico porque tienen un número
relativamente bajo de cromosomas (2n=20) y una velocidad de
multiplicación rápida (\approx12 a 14 horas dependiendo de las
condiciones de cultivo). Las células crecieron en una atmósfera con
5% de CO_{2} a aproximadamnete 37ºC en medio de McCoy's 5a con
15% de suero fetal bovino (FBS), L-glutamina 2 mM y
solución de 1% de penicilina-estreptomicina para
mantener un crecimiento exponencial. Este medio se usó también
durante la exposición de las células al compuesto a ensayar cuando
no se usó S-9. Se mantuvieron los cultivos de
células y las exposiciones de células se realizaron en matraces
T-75 o T-25.
Cada uno de los compuestos de muestra se ensayó
a siete diluciones, 1, 3, 10, 33, 100, 333 y 1000 \mug/ml. El
compuesto se añadió en medio McCoy's 5a completo. Después de haber
añadido el compuesto, se hicieron crecer las células en la
oscuridad a aproxikmadamente 37ºC durante aproximadamente 3 horas.
Luego se aspiró el medio que contenía el compuesto, se lavaron las
células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS)
a aproximadamente 37ºC y se añadió medio McCoy's 5a completo fresco.
El control positivo era metilmetanosulfonato. El control disolvente
era dimetilsulfóxido (DMSO) diluido en medio de cultivo. Para los
ensayos en que se usaba activación metabólica (véase seguidamente)
la mezcla de activación se añadió también al control de disolvente.
Los cultivos se incubaron luego durante un tiempo adicional de
aproximadamente 12 horas antes de la cosecha. Se añadió colquicina
(concentración final, 0,4 \mug/ml) aproximadamente 2,5 horas antes
de la cosecha.
Después de aproximadamente 2,5 horas en
colquicina, se cosecharon las células. Las células se eliminaron de
la superficie de los matraces usando un rascador de células. La
suspensión de células resultante se centrifugó, se aspiró el
material sobrenadante y se añadieron 4 ml de una solución hipotónica
de KCl 0,075M a las células durante 15 min a aproximadamente 37ºC.
Luego se centrifugaron las células, se aspiró el material
sobrenadante y las células se pusieron en suspensión en un fijador
de metanol:ácido acético (3:1). Después de cambiar tres veces el
fijador, se prepararon muestras sobre portaobjetos con células de
todos los matraces, que se secaron al aire. La densidad de células
y la calidad de la metafase en el portaobjetos inicial de cada
matraz se controlaron usando un microscopio de contraste de fase;
de cada matraz se prepararon al menos dos portaobjetos. Los
portaobjetos se tiñeron en Giemsa al 3% durante 3 min, se
enjuagaron en agua desionizada y se pasaron por xileno. Se montaron
cubreobjetos con Permount. Las muestrras se exminaron luego para
determinar qué concentración de cada compuesto a ensayar
representaba una dosis tóxica.
Un análisis de los resultados reveló que el AMT
era genotóxico a 30 \mug/ml. A diferencia, los compuestos 2 y 6
eran genotóxicos sólo a 100 \mug/ml, más de tres veces la dosis
tóxica de AMT.
En este experimento se ensayó también un
compuesto psolareno con una estructura distinta de la de los
compuestos usados en la presente invención,
8-aminometil-4,4',5'-trimetilpsolareno,
que reveló ser tóxico a 10 \mug/ml. Si bien el compuesto
aminometil-8-sustituido y
estructuras similares pueden no ser adecuados para los
procedimientos de la presente invención, pueden ser útiles para
fines alternativos. A la luz de la capacidad de los compuestos de
prevenir la replicación de ácidos nucleicos en combinación con su
extrema toxicidadad, los compuestos podrían usarse, por ejemplo,
para tratar enfermedades caracterizadas por un crecimiento celular
incontrolado, tales como cáncer.
Se prepararon soluciones salinas para los
compuestos 2, 6, 17 y 18 a varias concentraciones. Se inyectaron
0,1 ml de una solución de compuesto en vena de la cola a ratones
Balb/c macho. Al menos se inyectaron 3 ratones por nivel de dosis.
La solución salina sólo se usó como control negativo. Para control
positivo se administró ciclofosfamida (cicloPP) a una dosis de 30
mg/kg. En el grupo experimental, las inyecciones se repitieron una
vez al día durante 4 días. En el grupo de control positivo, la
muestra se administró sólo una vez, el día 3. El día 5 se
extrajeron varios microlitros de sangre de cada sujeto y se
esparcieron sobre un portaobjetos de vidrio. Las células se fijaron
en etanol absoluto y se almacenaron en un estante de
portaobjetos.
Para el análisis, las células se tiñeron con
naranja de acridina y se examinaron con un microscopio de
fluorescencia por recuento de: (i) el número de reticulocitos por
5000 eritrocitos, y (ii) el número de reticulocitos micronucleados
por 1000 reticulocitos. Los reticulocitos se distinguían por su
fluorescencia roja debida a la presencia de RNA. Se distinguían
micronúcleos por su fluorescencia verde debida a la presencia de
DNA. Se calculó luego el porcentaje de reticulocitos (%PCE). Una
disminución de la frecuencia de eritrocitos, representada por un
aumento del porcentaje de reticulocitos, es una indicación de
toxicidad en la médula ósea. Se calculó también el valor porcentual
de reticulocitos con micronúcleos (%PCE con MN). Un aumento de %PCE
con MN es una medida de clastogenia.
Después de haber determinado los resultados
iniciales, se repitió el experimento usando niveles de dosis
aumentados, hasta que: (i) se vió formación de micronúcleo, (ii) se
observó toxicidad en médula ósea, o (iii) se alcanzó la dosis
letal, o (iv) se administró una dosis de 5 g/kg. Para los ensayos
con cada uno de los compuestos 2, 6, 17 y 18, se alcanzó la dosis
letal antes de que hubiera señales de toxicidad en médula ósea o
formación de micronúcleo. Los resultados del experimento se
presentan en la Tabla 20. De los datos de la tabla se deduce de no
se observó toxicidad en la médula ósea para ninguno de los
compuestos en las dosis ensayadas. El valor porcentual de
reticulocitos para tratamiento con cada compuesto permanecía próximo
al valor de control negativo. Esto contrasta con una caída de
aproximadamente 2-2,5%PCE/RBC vista en el control
positivo, lo que representa un empobrecimiento de eritrocitos
debido a la toxicidad en médula ósea. Ninguno de los compuestos
presentó acción clastogénica.
En el Ejemplo 10 se muestra la inactivación de
virus HIV exento de células usando los procecimientos de la
invención. Este ejemplo presenta la inactivación de HIV asociado a
células usando también compuestos de la presente invención.
Se usaron células H9 infectadas crónicamente con
HIV_{IIIB}.
(H9/HTLV-III-B-NIH
1983, nº de catál. 400). Cultivos de estas células se mantuvieron
en medio Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con
L-glutamina 2 mM, 200 u/ml de penicilina, 200
\mug/ml de estreptomicina y 9% de suero fetal bovino (Intergen
Company, Purchase, NY). Para el mantenimiento, el cultivo se hendió
una vez a la semana a una densidad de 3 x 10^{5} a 4 x 10^{5}
células/ml y aproximadamente cuatro días después de hendirlo se
añadió bicarbonato sódico al 3,3% según era necesario. Para el
proceso de inactivación, las células se usaron tres días después de
que fueran hendidas. Se peletizaron del medio de cultivo a 400 g x
10 min, el material sobrenadante se descartó y se volvió a poner en
suspensión las células en un concentrado de plaquetas humanas de
1-5 dias (PC) (pH 7,5-7,6) a una
concentración de 2 x 10^{6} células/ml. Se hicieron partes
alícuotas de la suspensión de células infectadas con PC para
controles oscuros libres de psolareno, para soluciones sólo con UVA
sin psolareno, para controles oscuros con psolareno y para la
muestra experimental de psolareno más UVA. Se diluyeron con agua
soluciones de acopio concentradas esterilizadas por filtración de
cada psolareno en las proporciones adecuadas para una concentración
final de 150 \muM. (Un acopio 10 mM del compuesto 18 se diluyó
aproximadamente 67 veces y un acopio 2 mM del compuesto 2 se diluyó
aproximadamente 13 veces). Después de un período de equilibrado de
aproximadamente 30 min a temperatura ambiente, 0,5 ml de cada uno de
los controles oscuros se puso en un criovial y se almacenó en la
oscuridad a -80ºC. Para iluminación con UVA, 8 ml de la alícuota
exenta de psolareno y 8 ml de cada alícuota que contenía psolareno
se introdujeron en una bolsa de Teflon^{MC} Fl20 modificada
(modificada para que tuviera una superficie total de 92 cm^{2},
The West Co., Phoenixvill, PA) con una jeringa de plástico
desechable de 10 ml conectada a uno de los puertos de polipropileno
de la bolsa. Esto dio una longitud media del paso de 0,17 cm. Las
bolsas se iluminaron luego a una exposición total de 3
Joules/cm^{2} en el dispositivo descrito en el Ejemplo 1, unido a
un ensamblaje de refrigeración con baño de agua circulante fijado a
4ºC que mantenía la temperatura en la bolsa a aproximadamente
22-25ºC. Durante la exposición, el dispositivo se
sacudió sobre una mesa de sacudidas de plaquetas (Helmer Labs,
Noblesville, IN). Después de la exposición, los contenidos de las
bolsas se extrajeron con una jeringa fresca a través del otro
puerto, no usado, de la bolsa y se pusieron en crioviales para
almacenamiento a -80ºC hasta su análisis.
Las muestras almacenadas se descongelaron a
37ºC, luego se titularon en un ensayo de microplaca descrito por
Hanson, C.V., Crawford-Miksza, L. y Sheppard, H.W.,
J. Clin. Micro 28:2030 (1990), descrito en el Ejemplo 13 anterior,
con las modificaciones siguientes. La eliminación de coágulos de
cada muestra se realizó antes de cultivo. A causa de que se deseaba
el cultivo de un volumen diana de 4 ml después de eliminar el
coágulo, se pasó un exceso de la muestra (6 ml) a un tubo de
polipropileno y se diluyó a un volumen total de 60 ml con muestras
de ensayo y control del proceso de inactivación que se diluyeron en
50% de medio de ensayo y 50% de plasma humano normal combinado. Las
muestras se diluyeron serialmente en placas de 96 pocillos (Corning
Glass Works, Corning, NY). Las placas se mezclaron en una mesa de
sacudidas oscilante durante 30 segundos y se incubaron a 37ºC en
atmósfera con 5% de CO_{2} durante 1-18 horas. A
cada pocillo se añadieron células MT-2 (0,025 ml)
[clon alfa-4, obtenible (nº de catálogo 237) de los
National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent
Program, Rockville, Md.] para obtener una concentración de 80.000
células por pocillo. Después de 1 hora más de incubación a 37ºC en
atmósfera con 5% de CO_{2}, se añadieron a cada pocillo 0,075 ml
de medio de ensayo que contenía 1,6% de agarosa SeaPlaque (FMC
Bioproducts, Rockland, Maine) y precalentado a 38,5ºC. Las placas
se mantuvieron a 37ºC durante unos pocos minutos hasta que se habían
acumulado varias placas y luego se centrifugaron en soportes de
placas a 600 x g a 37ºC durante 20 minutos en una centrifugadora
preenfriada a 10ºC. En la centrifugadora se formaron monocapas antes
de que gelificara la capa de agarosa. Las placas se incubaron a
37ºC durante 5 días en atmósfera con 5% de CO_{2} y se tiñeron
añadiendo a cada pocillo 0,05 ml de yoduro de propidio (Sigma
Chemical Co.) 50 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato
(pH 7,4). Después de 24-48 horas, se examinaron
visualmente las microplacas teñidas en rojo por fluorescencia
poniendo las placas en una caja de luz UV de 304 nm de 8.000
\muW/cm^{2} (Fotodyne, Inc., New Berlin, Wis.). El recuento de
las placas se hizo a un aumento de 20x a 25x con un
estereomicroscopio.
Los resultados fueron como sigue: El compuesto 2
(150 \muM) inactivó >6,7 logs de HIV después de irradiación de
3 joules/cm^{2} (en comparación con controles oscuro y con luz de
0 log de inactivación, a partir de log del título de 6,1
unidades/ml que forman placa). A la misma concentración e igual
tiempo de irradiación, el compuesto 18 inactivó >7,2 logs de HIV
(en comparación con un control oscuro de 0 logs y un control de luz
de 0,1 logs, a partir del título 6,.6). Este ejemplo confirma que
los compuestos de la presente invención son eficaces para inactivar
virus asociados a células.
Este ejemplo implica una estimación de
formulaciones de medios sintéticos mediante los siguientes ensayos
de la función de plaquetas in vitro: (1) mantenimiento del
pH; (2) agregación de plaquetas ("Agg") y (3) expresión de
GMP-40. Los ensayos para cada uno de estas
determinaciones han sido descritos antes.
Se prepararon cuatro formulaciones: S 2.19, S
2.22, S 3.0 y S 4.0. La composición de estas formulaciones se recoge
en la Tabla 21.
Una unidad de plasma humano rico en plaquetas
(PRP) se obtuvo del banco de sangre de Sacramento. La unidad se
centrífugo a temperatura ambiente durante 6 minutos a 4000 rpm y
luego se pasó a una unidad de prensado. Usando una línea de
transferencia conectada, se extrajo el plasma de la unidad dejando
aproximadamente 9,4 ml de plasma residual.
Se dejó la unidad en reposo durante 1 hora y
después se amasó suavemente para poner las plaquetas en suspensión.
A 0,6 ml de la suspensión se añadieron 2,4 ml de plasma y el
contenido total se pasó a una minibolsa de Teflon^{MC}. Se
determinó el pH de la unidad reconstituida y se hicieron otros
ensayos el día siguiente con los resultados siguientes:
| Agg = agregación |
El resto de la unidad se usó luego para evaluar
el medio sintético en cuanto al almacenamiento de plaquetas con y
sin fotodescontaminación. A cada formulación se añadieron partes
alícuotas (0,8 ml) de la unidad en tubos. 3 ml de cada mezcla se
pasaron a una miniobolsa de Teflon^{MC} (concentración final de
plasma 20%).
Cinco días después se evaluó la función de las
plaquetas usando la batería de ensayos descrita antes. En la
siguiente Tabla 22 se presentan los resultados para cada una de las
formulaciones de medios sintéticos.
Como se ve, el medio sintético que contenía
glucosa 2 mM (esto es, S2.22) mantenía la función de las plaquetas,
medida por GMP140 y la agregación, mejor que el medio sintético que
no contenía glucosa (esto es, S2.19).
Para confirmar este hallazgo, se repitieron los
experimentos (siendo "n" el número de experimentos repetidos)
con estas formulaciones así como con formulaciones adicionales
exentas de glucosa (3.0 y 4.0). La función de las plaquetas se
evaluó antes y después de almacenamiento y junto con
descontaminación. En las siguientes Tablas 4, 5 y 6 se presenta un
resumen de los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (23)
1. Un procedimiento de inactivar microorganismos
en preparaciones de sangre que comprende, en el orden siguiente:
(a) proporcionar en cualquier orden,
\hskip0,4cm(i) uno o más compuestos fotoactivos, o sus sales, de la fórmula siguiente:
en la que X es una cadena de
hidrocarburo que tiene una longitud total de 2 a 20 carbonos, en la
que de 0 a 6 de estos carbonos están reemplazados independientemente
por NH u O, y cada punto de reemplazo está separado de cada uno de
los otros puntos de reemplazo por al menos dos carbonos, y está
separado del psolareno por al menos un carbono, y en la que X2, X3 y
X4 se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por
H y (CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero
de 0 a
5;
\hskip0,4cm(ii) medios de fotoactivación para fotoactivar los mencionados compuestos o sus sales, y
\hskip0,4cm(iii) una preparación de sangre sospechosa de estar contaminada con un microorganismo que tiene ácido nucleico;
(b) añadir los mencionados compuestos o sus
sales a la mencionada preparación de sangre, y
(c) fotoactivar los mencionados compuestos o sus
sales en condiciones suficientes para inactivar el microorganismo
mencionado sin limitar la concentración de oxígeno molecular.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que X es
- -(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{z}-,
- -(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{z}-, o
- -(CH_{2})_{w}-R_{2}-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{y}-R_{4}-(CH_{2})_{z}-,
y R_{2}, R_{3} y R_{4} son,
independientemente, O o NH, y w es un número entero de 1 a 5, x es
un número entero de 2 a 5, y es un número entero de 2 a 5 y z es un
número entero de 2 a 6.
3. El procedimento de la reivindicación 2, en el
que el compuesto mencionado es
4'-(4-amino-2-aza)butil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(2-aminoetil)-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(5-amino-2-oxa)pentil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(5-amino-2-aza)pentil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(6-amino-2-aza)hexil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(7-amino-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(13-amino-2-aza-6,11-dioxa)tridecil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(7-amino-2-aza)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(7-amino-2-aza-5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(9-amino-2,6-diaza)nonil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(8-amino-5-aza-2-oxa)octil-4,5',8-trimetilpsolareno,
4'-(9-amino-5-aza-2-oxa)nonil-4,5',8-trimetilpsolareno
o
4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5',8-trimetilpsolareno.
4. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que los mencionados microorganismos
comprenden bacterias.
5. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que los mencionados microorganismos
comprenden bacterias gram negativas.
6. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que los mencionados microorganismos
comprenden un virus
7. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la mencionada preparación de
sangre comprende plaquetas.
8. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la mencionada preparación de
sangre comprende plasma.
9. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la mencionada preparación de
sangre comprende además un medio sintético.
10. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el mencionado medio de
fotoactivación comprende un dispositivo de fotoactivación capaz de
emitir una intensidad dada de un espectro de radiación
electromagnética que comprende longitudes de onda entre 180 nm y 400
nm.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que el mencionado espectro de radiación electromagnética
comprende longitudes de onda entre 320 nm y 380 nm.
12. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que la mencionada intensidad es de entre 1 y 30 mW/cm^{2}.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que la mencionada preparación de sangre se expone a la mencionada
intensidad durante entre 1 segundo y treinta minutos.
14. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el mencionado compuesto se añade a
la mencionada preparación de sangre a una concentración final entre
0,1 y 250 \muM.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que el mencionado compuesto se añade a la mencionada preparación
de sangre a una concentración final entre 10 y 150 \muM.
16. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que están presentes al menos dos de
los mencionados compuestos.
17. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el mencionado compuesto está en
solución antes de tener contacto con el producto de sangre.
18. El procedimiento de la reivindicación 17, en
el que la mencionada solución comprende agua, solución salina o un
medio sintético.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que el mencionado medio sintético comprende acetato sódico,
cloruro potásico, cloruro sódico, citrato sódico, fosfato sódico y
cloruro magnésico.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en
el que el mencionado medio sintético comprende además al menos un
constituyente seleccionado entre el grupo constituido por manitol y
glucosa.
21. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que la mencionada solución está contenida en una primera bolsa de
sangre y el mencionado producto de sangre está contenido en una
segunda bolsa de sangre.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en
el que el contacto mencionado se realiza transfiriendo la mencionada
solución desde la mencionada primera bolsa de sangre a la mencionada
segunda bolsa de sangre a través de una conexión estéril.
23. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el mencionado compuesto está en
estado seco antes de que establezca contacto.
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|---|---|---|---|
| US83459 | 1993-06-28 | ||
| US08/083,459 US5399719A (en) | 1993-06-28 | 1993-06-28 | Compounds for the photodecontamination of pathogens in blood |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05015467T Expired - Lifetime ES2336574T3 (es) | 1993-06-28 | 1994-06-24 | Compuestos para la fotodescontaminacion de patogenos en sangre. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US5399719A (es) |
| EP (3) | EP1776952A3 (es) |
| JP (1) | JP4047374B2 (es) |
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| WO (1) | WO1995000141A1 (es) |
Families Citing this family (76)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6433343B1 (en) | 1992-03-02 | 2002-08-13 | Cerus Corporation | Device and method for photoactivation |
| WO1996014740A1 (en) | 1992-03-02 | 1996-05-23 | Cerus Corporation | Synthetic media for blood components |
| US5712085A (en) | 1993-06-28 | 1998-01-27 | Cerus Corporation | 5'-(4-amino-2-oxa)butye-4,4', 8-trinethylpsoralen in synthetic medium |
| US6004741A (en) * | 1993-06-28 | 1999-12-21 | Cerus Corporation | Method for the photoactivation of 4' and 5' primary aminoalkyl psoralens in platelet preparations |
| US6420570B1 (en) | 1993-06-28 | 2002-07-16 | Cerus Corporation | Psoralen compounds |
| US5399719A (en) * | 1993-06-28 | 1995-03-21 | Steritech, Inc. | Compounds for the photodecontamination of pathogens in blood |
| US5691132A (en) | 1994-11-14 | 1997-11-25 | Cerus Corporation | Method for inactivating pathogens in red cell compositions using quinacrine mustard |
| US6177441B1 (en) | 1995-06-05 | 2001-01-23 | Cerus Corporation | Treating red blood cell solutions with anti-viral agents |
| DE69638094D1 (de) * | 1995-06-07 | 2010-01-21 | Cerus Corp | Verfahren und vorrichtungen zur entfernung von psoralenen aus blutprodukten. |
| JP2009051846A (ja) * | 1995-06-07 | 2009-03-12 | Cerus Corp | 血液製剤からソラレンを除去するための方法およびデバイス |
| EP0773716A4 (en) * | 1995-06-07 | 1999-08-04 | Cerus Corp | TREATMENT OF RED BLOOD CELL SOLUTIONS WITH ANTIVRAL ACTIVE SUBSTANCES |
| WO1996039820A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Cerus Corporation | Methods of inactivating leukocytes and inhibiting cytokine production in blood products |
| AU6267596A (en) * | 1995-12-14 | 1997-07-03 | Steritech, Inc. | Inactivation of non-enveloped virus |
| ES2251020T3 (es) * | 1996-03-29 | 2006-04-16 | Therakos, Inc. | Tratamiento por fotoferesis de infecciones por hcv cronicas. |
| AU710242B2 (en) * | 1996-03-29 | 1999-09-16 | Therakos, Inc. | Photopheresis treatment of leukocytes |
| AU2453697A (en) * | 1996-04-10 | 1997-10-29 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Use of photopheresis in the treatment of chronic infection by hepatitis c virus |
| US20020115585A1 (en) * | 1996-06-07 | 2002-08-22 | Hei Derek J. | Method and devices for the removal of psoralens from blood products |
| US5925514A (en) * | 1996-12-10 | 1999-07-20 | The Regents Of The University Of California | Apparatus for testing for infection by a retrovirus |
| US5968731A (en) * | 1996-12-10 | 1999-10-19 | The Regents Of The University Of California | Apparatus for automated testing of biological specimens |
| US5841975A (en) * | 1996-12-10 | 1998-11-24 | The Regents Of The University Of California | Method and apparatus for globally-accessible automated testing |
| US6514987B1 (en) * | 1997-01-06 | 2003-02-04 | Cerus Corporation | Frangible compounds for pathogen inactivation |
| US6093725A (en) * | 1997-01-06 | 2000-07-25 | Cerus Corporation | Frangible compounds for pathogen inactivation |
| WO1999002215A1 (en) * | 1997-07-10 | 1999-01-21 | Therakos, Inc. | Treatment of inflammatory disorders of the bowel and urinary bladder |
| ES2210846T3 (es) * | 1997-11-20 | 2004-07-01 | Cerus Corporation | Nuevos psoralenos para inactivar agentes patogenos. |
| US7611831B2 (en) * | 1998-01-06 | 2009-11-03 | Cerus Corporation | Adsorbing pathogen-inactivating compounds with porous particles immobilized in a matrix |
| US6277337B1 (en) | 1998-07-21 | 2001-08-21 | Gambro, Inc. | Method and apparatus for inactivation of biological contaminants using photosensitizers |
| US6258577B1 (en) | 1998-07-21 | 2001-07-10 | Gambro, Inc. | Method and apparatus for inactivation of biological contaminants using endogenous alloxazine or isoalloxazine photosensitizers |
| US7498156B2 (en) | 1998-07-21 | 2009-03-03 | Caridianbct Biotechnologies, Llc | Use of visible light at wavelengths of 500 to 550 nm to reduce the number of pathogens in blood and blood components |
| US20070099170A1 (en) * | 1998-07-21 | 2007-05-03 | Navigant Biotechnologies, Inc. | Method for treatment and storage of blood and blood products using endogenous alloxazines and acetate |
| US7049110B2 (en) | 1998-07-21 | 2006-05-23 | Gambro, Inc. | Inactivation of West Nile virus and malaria using photosensitizers |
| US6255324B1 (en) | 1998-11-25 | 2001-07-03 | Ned D. Heindel | Amino-and mercurio-substituted 4′,5'-dihydropsoralens and therapeutical uses thereof |
| ES2183636T3 (es) * | 1998-11-30 | 2003-03-16 | Buckman Labor Inc | 4'-sustituido-4', 5'-dihidropsoralenos y sus usos terapeuticos. |
| US7094378B1 (en) | 2000-06-15 | 2006-08-22 | Gambro, Inc. | Method and apparatus for inactivation of biological contaminants using photosensitizers |
| US7220747B2 (en) * | 1999-07-20 | 2007-05-22 | Gambro, Inc. | Method for preventing damage to or rejuvenating a cellular blood component using mitochondrial enhancer |
| US6268120B1 (en) | 1999-10-19 | 2001-07-31 | Gambro, Inc. | Isoalloxazine derivatives to neutralize biological contaminants |
| US6576201B1 (en) | 2000-01-28 | 2003-06-10 | Baxter International Inc. | Device and method for pathogen inactivation of therapeutic fluids with sterilizing radiation |
| US6596230B1 (en) | 2000-01-28 | 2003-07-22 | Baxter International Inc. | Device and method for pathogen inactivation of therapeutic fluids with sterilizing radiation |
| TW590780B (en) * | 2000-06-02 | 2004-06-11 | Gambro Inc | Additive solutions containing riboflavin |
| US7648699B2 (en) * | 2000-06-02 | 2010-01-19 | Caridianbct Biotechnologies, Llc | Preventing transfusion related complications in a recipient of a blood transfusion |
| US7985588B2 (en) * | 2000-06-02 | 2011-07-26 | Caridianbct Biotechnologies, Llc | Induction of and maintenance of nucleic acid damage in pathogens using riboflavin and light |
| US9044523B2 (en) | 2000-06-15 | 2015-06-02 | Terumo Bct, Inc. | Reduction of contaminants in blood and blood products using photosensitizers and peak wavelengths of light |
| US7381976B2 (en) | 2001-03-13 | 2008-06-03 | Triton Thalassic Technologies, Inc. | Monochromatic fluid treatment systems |
| US20030228564A1 (en) * | 2001-05-30 | 2003-12-11 | Edrich Richard Alan | Nitric oxide in a pathogen inactivation process |
| EP1990055A3 (en) | 2001-11-29 | 2011-11-16 | Therakos, Inc. | Methods for pretreating a subject with extracorporeal photopheresis and/or apoptotic cells |
| US6936413B1 (en) * | 2001-12-05 | 2005-08-30 | Baxter International Inc. | Methods and systems for preparing blood products |
| US7235392B2 (en) * | 2001-12-07 | 2007-06-26 | The Ohio State University Research Foundation | Apoptotic EBV-transformed lymphocytes, a therapeutic agent for post-transplant lymphoproliferative disorder |
| WO2003057129A1 (en) * | 2001-12-28 | 2003-07-17 | Terumo Kabushiki Kaisha | Blood bag system and method of inactivating pathogenic microorganisms |
| US20040127840A1 (en) | 2002-03-04 | 2004-07-01 | Steve Gara | Blood separation apparatus and method of using the same |
| US7479123B2 (en) | 2002-03-04 | 2009-01-20 | Therakos, Inc. | Method for collecting a desired blood component and performing a photopheresis treatment |
| US6933285B2 (en) | 2002-05-10 | 2005-08-23 | The Ohio State University | Flavin N-oxides: new anti-cancer agents and pathogen eradication agents |
| KR101192652B1 (ko) * | 2003-02-06 | 2012-10-19 | 앤저 테라퓨틱스 인코퍼레이티드 | 비포식 세포로의 침투가 약화된 리스테리아, 리스테리아를 포함하는 백신, 및 그것의 사용방법 |
| US7695725B2 (en) * | 2003-02-06 | 2010-04-13 | Aduro Biotech | Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof |
| KR101173871B1 (ko) * | 2003-02-06 | 2012-08-16 | 앤저 테라퓨틱스 인코퍼레이티드 | 변형된 독립생존 미생물, 백신 조성물 및 그것의 사용방법 |
| US7026076B2 (en) * | 2003-03-03 | 2006-04-11 | Freescale Semiconductor, Inc. | Method of patterning photoresist on a wafer using a reflective mask with a multi-layer ARC |
| US7534348B2 (en) * | 2003-09-12 | 2009-05-19 | Fenwal, Inc. | Flow-through removal device and system using such device |
| AU2004237844B2 (en) | 2003-12-23 | 2011-01-27 | Mallinckrodt Pharmaceuticals Ireland Limited | Extracorporeal photopheresis in combination with anti-TNF treatment |
| NZ544247A (en) | 2004-12-22 | 2007-06-29 | Omj Ireland Ltd | Phototherapy using psoralen derivatives and a UVB absorber |
| EP1951036A4 (en) | 2005-11-02 | 2009-05-27 | Therakos Inc | USE OF APIVOTIC CELLS EX VIVO FOR GENERATING REGULATORY T CELLS |
| MX2008014110A (es) | 2006-05-02 | 2008-11-14 | Therakos Inc | Metodos y reactivos para detectar la susceptibilidad a la enfermedad del injerto versus el hospedero o mortalidad relacionada con el transplante. |
| DE102008051123A1 (de) * | 2008-10-09 | 2010-04-15 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Beutel, Beutelset, Verfahren und Behandlungsvorrichtung zum Behandeln wenigstens einer Blutkomponente |
| ES2656498T3 (es) | 2010-09-07 | 2018-02-27 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Células para inmunoprecipitación de cromatina y procedimiento de fabricación de las mismas |
| US20140127077A1 (en) | 2012-11-05 | 2014-05-08 | Gail Rock | Device and method for sterilization of instruments and surfaces |
| WO2016073381A1 (en) | 2014-11-03 | 2016-05-12 | Cerus Corporation | Compositions and methods for improved car-t cell therapies |
| EP3313418B1 (en) | 2015-06-26 | 2024-03-13 | Cerus Corporation | Cryoprecipitate compositions and methods of preparation thereof |
| ES3000416T3 (en) * | 2015-07-23 | 2025-02-28 | Terumo Bct Biotechnologies Llc | Flow-through pathogen reduction |
| CA3003097A1 (en) | 2015-10-23 | 2017-04-27 | Cerus Corporation | Plasma compositions and methods of use thereof |
| JP6895426B2 (ja) | 2016-03-23 | 2021-06-30 | テルモ株式会社 | 光照射装置 |
| US20190369087A1 (en) | 2016-12-23 | 2019-12-05 | Cerus Corporation | Systems and methods for testing and screening using compound bound substrates |
| CA3055203A1 (en) | 2017-03-03 | 2018-09-07 | Cerus Corporation | Kits and methods for preparing pathogen-inactivated platelet compositions |
| AU2018338097B2 (en) | 2017-09-20 | 2023-07-13 | Cerus Corporation | Compositions and methods for pathogen inactivation of platelets |
| AU2018395525B2 (en) * | 2017-12-29 | 2023-09-14 | Cerus Corporation | Systems and methods for treating biological fluids |
| EP3829668B1 (en) | 2018-07-27 | 2026-04-15 | Terumo BCT Biotechnologies, LLC | Fluid flow-through |
| JP7571063B2 (ja) | 2019-06-22 | 2024-10-22 | シーラス コーポレイション | 生物学的流体の処理を実施するシステム及び方法 |
| US12011510B2 (en) | 2019-06-22 | 2024-06-18 | Cerus Corporation | Biological fluid treatment systems |
| CN114269394A (zh) | 2019-06-28 | 2022-04-01 | 塞鲁斯公司 | 用于实现生物流体处理装置的系统和方法 |
| US20220370506A1 (en) | 2019-12-26 | 2022-11-24 | Figene, Llc | Augmentation of fibroblast mediated regeneration of intravertebral discs |
Family Cites Families (65)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US451313A (en) * | 1891-04-28 | Gustav weinmann | ||
| US4124598A (en) * | 1976-10-20 | 1978-11-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Psoralens |
| US4196281A (en) * | 1976-10-20 | 1980-04-01 | Regents Of The University Of California | Psoralens |
| US4169204A (en) * | 1976-10-20 | 1979-09-25 | Regents Of The University Of California | Psoralens |
| US4157723A (en) * | 1977-10-19 | 1979-06-12 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Method of forming a connection between two sealed conduits using radiant energy |
| US4265280A (en) * | 1979-01-23 | 1981-05-05 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Connector member for sealed conduits |
| US4216154A (en) * | 1979-03-15 | 1980-08-05 | Thomas C. Elder, Inc. | Process for making α-loweralkylfurocoumarins |
| US4370344A (en) * | 1979-09-10 | 1983-01-25 | Elder Pharmaceuticals, Inc. | 5'-Aminoalkyl-4'-alkylpsoralens |
| US4328239A (en) * | 1979-09-10 | 1982-05-04 | Elder Pharmaceuticals, Inc. | 8-Aminoalkylpsoralens |
| US4298614A (en) * | 1979-09-10 | 1981-11-03 | Thomas C. Elder, Inc. | 5'-Aminoalkyl-4',4-dialkylpsoralens |
| US4269852A (en) * | 1979-09-10 | 1981-05-26 | Thomas C. Elder, Inc. | 4'-Substituted-4,5',8-trialkylpsoralens |
| US4269851A (en) * | 1979-09-10 | 1981-05-26 | Thomas C. Elder, Inc. | 8-Aminoalkyl-4-alkylpsoralens |
| US4235781A (en) * | 1979-09-20 | 1980-11-25 | Thomas C. Elder, Inc. | 6 Or 8 Haloallyl substituted 7-hydroxycoumarins |
| US4321919A (en) | 1979-12-11 | 1982-03-30 | Leukocyte Research, Inc. | Method and system for externally treating human blood |
| US4279922A (en) * | 1980-07-29 | 1981-07-21 | Thomas C. Elder, Inc. | Photosensitizing benzofuranacrylics |
| US4294822A (en) * | 1980-07-29 | 1981-10-13 | Thomas C. Elder, Inc. | 5-Aminoalkyl-4,4,8-trialkylpsoralens |
| US4294847A (en) * | 1980-07-29 | 1981-10-13 | Thomas C. Elder, Inc. | 8-Aminoalkyl-4-alkylisopsoralens |
| US4412835A (en) * | 1982-07-06 | 1983-11-01 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Sterile docking process, apparatus and system |
| US4613322A (en) | 1982-12-08 | 1986-09-23 | Edelson Richard Leslie | Method and system for externally treating the blood |
| EP0124363B1 (en) * | 1983-05-02 | 1990-12-19 | Diamond Scientific Co. | Photochemical decontamination treatment of whole blood or blood components |
| US4727027A (en) * | 1983-05-02 | 1988-02-23 | Diamond Scientific Co. | Photochemical decontamination treatment of whole blood or blood components |
| US4748120A (en) * | 1983-05-02 | 1988-05-31 | Diamond Scientific Co. | Photochemical decontamination treatment of whole blood or blood components |
| US4599303A (en) | 1983-12-12 | 1986-07-08 | Hri Associates, Inc. | Nucleic acid hybridization assay employing probes crosslinkable to target sequences |
| US4582789A (en) * | 1984-03-21 | 1986-04-15 | Cetus Corporation | Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives |
| US4751313A (en) * | 1984-03-21 | 1988-06-14 | Cetus Corporation | Precursor to nucleic acid probe |
| US4617261A (en) * | 1984-03-21 | 1986-10-14 | Cetus Corporation | Process for labeling nucleic acids and hybridization probes |
| US4803297A (en) * | 1984-03-21 | 1989-02-07 | Cetus Corporation | Carbamic acid ester useful for preparing a nucleic acid probe |
| US4705886A (en) * | 1984-03-21 | 1987-11-10 | Cetus Corporation | Precursor to nucleic acid probe |
| US4754065A (en) * | 1984-12-18 | 1988-06-28 | Cetus Corporation | Precursor to nucleic acid probe |
| US5026840A (en) * | 1985-01-10 | 1991-06-25 | Molecular Diagnostics, Inc. | Photochemical nucleic acid-labeling reagent having a polyalklamine spacer |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4822731A (en) * | 1986-01-09 | 1989-04-18 | Cetus Corporation | Process for labeling single-stranded nucleic acids and hybridizaiton probes |
| US4950770A (en) * | 1987-06-16 | 1990-08-21 | Elder Pharmaceuticals, Inc. | Psoralens aminomethylation |
| US4878891A (en) | 1987-06-25 | 1989-11-07 | Baylor Research Foundation | Method for eradicating infectious biological contaminants in body tissues |
| WO1988010272A1 (en) | 1987-06-26 | 1988-12-29 | Garth Alexander Nicholson | Method of preserving a body fluid sample, prior to assay for hiv (aids) infection |
| DE3804243A1 (de) | 1988-02-11 | 1989-08-24 | Max Planck Gesellschaft | Teils einzel- und teils doppelstraengige nukleinsaeuresonde und verfahren zu ihrer herstellung |
| GB8807380D0 (en) | 1988-03-29 | 1988-05-05 | Gunn A | Blood processing apparatus |
| US5571666A (en) | 1988-10-28 | 1996-11-05 | Oklahoma Medical Research Foundation | Thiazine dyes used to inactivate HIV in biological fluids |
| US5356929A (en) | 1989-01-23 | 1994-10-18 | Lehigh University | Reduced and quaternized psoralens as photo-activated therapeutics |
| US5041078A (en) | 1989-03-06 | 1991-08-20 | Baylor Research Foundation, A Nonprofit Corporation Of The State Of Texas | Photodynamic viral deactivation with sapphyrins |
| DE3928900A1 (de) * | 1989-08-31 | 1991-03-07 | Europ Lab Molekularbiolog | Neue nucleotidderivate, ihre herstellung und ihre verwendung |
| DE3930510A1 (de) | 1989-09-13 | 1991-03-21 | Blutspendedienst Dt Rote Kreuz | Verfahren zur inaktivierung von viren in blut und blutprodukten |
| US5556958A (en) | 1989-10-26 | 1996-09-17 | Steritech, Inc. | Inactivation of pathogens in clinical samples |
| US5184020A (en) | 1989-10-26 | 1993-02-02 | Hearst David P | Device and method for photoactivation |
| US5049578A (en) * | 1990-03-09 | 1991-09-17 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | 1-aroyl or 1-acyl-2-2pyrrolidinyl-3,5-dihydroxy alkanoic and alkenoic acids, salts, esters and lactones |
| ZA912842B (en) | 1990-04-16 | 1992-03-25 | Cryopharm Corp | Method of inactivation of viral and bacterial blood contaminants |
| US5418130A (en) | 1990-04-16 | 1995-05-23 | Cryopharm Corporation | Method of inactivation of viral and bacterial blood contaminants |
| JP3182145B2 (ja) * | 1990-04-16 | 2001-07-03 | 日本赤十字社 | 血小板保存液 |
| US5587490A (en) | 1990-04-16 | 1996-12-24 | Credit Managers Association Of California | Method of inactivation of viral and bacterial blood contaminants |
| US5120649A (en) | 1990-05-15 | 1992-06-09 | New York Blood Center, Inc. | Photodynamic inactivation of viruses in blood cell-containing compositions |
| NZ239252A (en) | 1990-08-09 | 1997-07-27 | Genta Inc | Reagent for attaching a psoralen-containing moiety to an oligonucleotide(derivative); oligonucleotide(derivative)-psoralen conjugates |
| US5376524A (en) * | 1991-04-01 | 1994-12-27 | Thomas Jefferson University | Platelet storage medium containing acetate and phosphate |
| CA2060804C (en) | 1992-02-06 | 1999-10-05 | Luis P. Cardenas | Cigarette-lighter-extinguisher-cigarette holder with or without butt ejector |
| US5709991A (en) | 1992-03-02 | 1998-01-20 | Cerus Corporation | Proralen inactivation of microorganisms and psoralen removal |
| US5288605A (en) * | 1992-03-02 | 1994-02-22 | Steritech, Inc. | Methods for inactivating bacteria in blood preparations with 8-methoxypsoralen |
| US5459030A (en) * | 1992-03-02 | 1995-10-17 | Steritech, Inc. | Synthetic media compositions for inactivating bacteria and viruses in blood preparations with 8-methoxypsoralen |
| AU6402494A (en) * | 1993-03-11 | 1994-09-26 | Steritech, Inc. | Decontaminating clinical samples |
| US5712085A (en) | 1993-06-28 | 1998-01-27 | Cerus Corporation | 5'-(4-amino-2-oxa)butye-4,4', 8-trinethylpsoralen in synthetic medium |
| US6004742A (en) | 1993-06-28 | 1999-12-21 | Cerus Corporation | Method for inactivation of pathogens in platelets using 4' and 5' primary amino-substituted psoralens |
| US5593823A (en) * | 1993-06-28 | 1997-01-14 | Cerus Corporation | Method for inactivating pathogens in blood using photoactivation of 4'-primary amino-substituted psoralens |
| US5871900A (en) | 1993-06-28 | 1999-02-16 | Cerus Corporation | Method of inactivating pathogens in biological fluids using photoactivated 5-primaryamino psoralens |
| US5399719A (en) | 1993-06-28 | 1995-03-21 | Steritech, Inc. | Compounds for the photodecontamination of pathogens in blood |
| US6004741A (en) | 1993-06-28 | 1999-12-21 | Cerus Corporation | Method for the photoactivation of 4' and 5' primary aminoalkyl psoralens in platelet preparations |
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