ES2336574T3 - Compuestos para la fotodescontaminacion de patogenos en sangre. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para sintetizar 4'-(ω-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno, que comprende las etapas de: a) proporcionar 4'-(ω-hidroxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno; b) tratar 4'-(ω-hidroxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno con una base y cloruro de metanosulfonilo de forma que se produzca 4'-(ω-metanosulfoniloxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno; c) tratar 4'-(ω-metanosulfoniloxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno con azida sódica, de forma que se produzca 4'-(ω-azido-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno; y d) reducir 4'-(ω-azido-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno de forma que se produzca 4'-(ω-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
Description
Compuestos para la fotodescontaminación de
patógenos en sangre.
La presente invención proporciona psoralenos y
procedimientos de síntesis de psoralenos nuevos que poseen una
mayor capacidad de inactivar patógenos en hemoderivados en presencia
de luz ultravioleta sin afectar significativamente a la función del
hemoderivado ni presentar acción mutágena.
La contaminación por patógenos en el suministro
de sangre sigue siendo un problema médico importante en todo el
mundo. Aunque los procedimientos de ensayo mejorados para la
hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) y el virus de
inmunodeficiencia humana (HIV) han reducido marcadamente la
incidencia de enfermedades asociadas a las transfusiones, el
público está perdiendo confianza en la seguridad del suministro de
sangre debido a la publicidad de casos de transmisión de estos
virus relacionadas con las transfusiones.
Por ejemplo, la reciente introducción de un
ensayo de sangre para HCV reducirá la transmisión de este virus;
pero tiene una sensibilidad de sólo 67% para la detección de
unidades de sangre probablemente infecciosa. El HCV es responsable
del 90% de las hepatitis asociadas con las transfusiones. Melnick,
J.L., en resúmenes de Virological Safety Aspects of Plasma; Cannes,
3-6 de noviembre (1992), pág. 9. Se estima que,
usando este ensayo, el riesgo de infección es de 1 entre 3300
unidades transfundidas.
Análogamente, si bien hay disponibles ensayos
serológicos más sensibles para HIV-1 y HBV, estos
agentes pueden ser transmitidos a pesar de ello por donantes de
sangre seronegativos. International Forum: Vox Sang 32:346 (1977).
Ward, J. W. y otros, N. Engl. J. Med., 318:473 (1988). Hasta un 10%
del total de las hepatitis relacionadas con transfusiones y un 25%
de casos de ictericia grave son debidos a HBV transmitido por
donantes negativos para el antígeno superficial de la hepatitis B
(HBasAg). Hasta ahora, entre los receptores de sangre previamente
ensayada como negativa de anticuerpo contra HIV-1,
el Centro de Control de Enfermedades (CDC), ha dado cuenta de 15
casos de infecciones por HIV asociadas con la transfusión.
Además, rutinariamente no se realizar pruebas
para otros virus, bacterias y agentes y siguen siendo una amenaza
potencial para la seguridad de las transfusiones. Schumunis, G.A.,
Transfusion 31:547-557 (1992). Además, un ensayo no
garantiza la seguridad del suministro de sangre frente a futuros
patógenos desconocidos que pueden infectar a la población de
donantes, lo que da por resultado una transmisión asociada a las
transfusiones antes de que se puedan aplicar ensayos sensibles.
Incluso si los ensayos de seroconversión fueran
una exploración suficiente, su aplicación puede no ser práctica.
Por ejemplo, el Cytomegalovirus (CMV- un virus de herpes) y
parvovirus B19 son habituales en los seres humanos. Cuando se
presentan en adultos sanos inmunocompetentes, casi siempre producen
una seroconversión asintomática. A causa de que una gran parte de
la población es seropositiva, la exclusión de las unidades positivas
provocaría una limitación sustancial del suministro de sangre.
Un enfoque alternativo para eliminar la
transmisión de enfermedades virales a través de hemoderivados es el
desarrollo de medios para inactivar los patógenos en los productos
para transfusiones. El desarrollo de una tecnología eficaz para
inactivar patógenos infecciosos en hemoderivados ofrece el potencial
de mejorar la seguridad del suministro de sangre y, acaso, de
ralentizar la introducción de nuevos ensayos, tales como el ensayo
para HIV-2 recientemente introducido, para patógenos
poco frecuentes. Finalmente, la tecnología de descontaminación
podría reducir significativamente el coste de hemoderivados y
aumentar la disponibilidad de los escasos hemoderivados.
Para ser útil, tal procedimiento de inactivación
(i) no debe afectar perjudicialmente la función para la que se
transfunde el hemoderivado, (ii) debe inactivar a fondo los
patógenos existentes en el hemoderivado y (iii) no debe afectar
perjudicialmente a los receptores del hemoderivado. Se ha dado
cuenta de varios procedimientos para la inactivación o eliminación
de agentes virales en hemoderivados exentos de eritrocitos. Sin
embargo, la mayoría de estas técnicas son completamente
incompatibles con el mantenimiento de la función de las plaquetas,
un importante hemoderivado. Son ejemplos de estas técnicas: calor
(Hilfenhous, J. y otros, J. Biol. Std. 70:589 (1987)), tratamiento
con disolvente/detergente (Horowitz, B. y otros, Transfusion 25:516
(1985)), radiación \gamma (Moroff, G. y otros, Transfusion 26:453
(1986)), radiación ultravioleta (UV) combinada con propriolactona
beta (Prince, A.M. y otros, Reviews of Infect. Diseases
5:92-107 (1983)), luz láser visible en combinación
con hematoporfirinas (Matthews, J.L. y otros, Transfusion
28:81-83 (1988), North J. y otros, Transfusion
32:121-128 (1992)), uso de los tintes fotoactivos
ftalocianina de aluminio y merocianina 540 (Sieber F. y otros, Blood
73:345-350 (1989), Rywkin, S. y otros, Blood 78
(supl. 1): 352a (Abstract) (1991) o UV sola (Proudouz, K. N. y
otros, Blood 70:589 (1987)).
Otros procedimientos inactivan los agentes
virales por tratamiento con furocumarinas, tales como los
psoralenos, en presencia de luz ultravioleta. Los psoralenos son
compuestos tricíclicos formados por condensación lineal de un
anillo de furano con una cumarina. Los psoralenos se pueden
intercalar entre los pares de base de ácidos nucleicos bicatenarios
formando aductos covalentes con bases de pirimidina después de la
absorción de luz ultravioleta de onda larga (UVA). G. D. Cimino y
otros, Ann. Rev. Biochem. 54:1151 (1985); Hearst y otros, Quart.
Rev. Biophys. 17:1 (1984). Si hay una segunda pirimidina adyacente a
un monoaducto de psoraleno y pirimidina y en la cadena opuesta, la
absorción de un segundo fotón puede conducir a la formación de un
diaducto que actúa en forma de un enlace entre cadenas. S. T.
Isaacs y otros, Biochemistry 16:1058 (1977); S. T. Isaacs y otros,
Trends in Photobiology (Plenum) págs. 279-294
(1982), J. Tessman y otros, Biochem. 24:1669 (1985), Hearst y
otros, patentes de Estados Unidos N.º 4.124.598, 4.169.204 y
4.196.281.
Los psoralenos unidos covalentemente actúan como
inhibidores de la replicación de DNA y tienen así el potencial de
parar el proceso de replicación. Debido a esta capacidad de unirse a
DNA, los psoralenos tienen un interés particular en cuanto a la
resolución de los problemas inherentes a la creación y mantenimiento
de un suministro de sangre sin patógenos. Algunos psoralenos
conocidos han revelado que inactivan virus en algunos hemoderivados.
H. J. Alter y otros, The Lancet, (ii:1446) (1988); L. Lin y otros,
Blood 74:517 (1989) (descontaminan concentrados de plaquetas); G.
P. Wisehahn y otros, las patentes de Estados Unidos N.º 4.727.027 y
4.748.120 describen el uso de una combinación de
8-metoxipsoraleno (8-MOP) e
irradiación, P. Morel y otros, Blood Cells 18:276 (1992) señalan
que 300 \mug/ml de 8-MOP junto con 10 horas de
irradiación con luz ultravioleta pueden inactivar eficazmente virus
en suero humano. Otros investigadores han presentado estudios
similares usando 8-MOP y psoraleno
aminometiltrimetílico (AMT). Dodd RY y otros, Transfusion
31:483-490 (1991); Margolis-Nunno,
H. y otros, Thromb Haemostas 65:1162. (Abstract) (1991). En efecto,
se ha establecido la fotoinactivación de un amplio espectro de
microorganismos, incluidos HBV, HCV y HIV, en condiciones diferentes
de las usadas en la presente invención y usando derivados de
psoraleno previamente conocidos. [Hanson, C. V., Blood Cells,
18:7-24 (1992); Alter, H. y otros, The Lancet ii:
1446 (1989); Margolis-Nunno, H y otros, Thromb
Haemostas 65:1162 (Abstract) (1991)].
La fotoinactivación por psoraleno es sólo
factible si la capacidad del psoraleno de inactivar virus es
suficiente para asegurar un margen de seguridad en el que se
producirá la inactivación completa. Por otra parte, el psoraleno no
debe causar un daño al hemoderivado. Los procedimientos que acaban
de describirse, cuando se aplican usando psoralenos conocidos,
requieren el uso de procedimientos difíciles y caros para evitar
daños a los hemoderivados. Por ejemplo, algunos compuestos y
protocolos han necesitado la eliminación de oxígeno molecular de la
mezcla de reacción antes de la exposición a la luz para evitar
dañar los hemoderivados mediante los radicales de oxígeno
producidos durante la irradiación. Véase Lin y otros, Blood 74:517
(1989); patente de Estados Unidos N.º 4.727.027, de Wiesehahn. Este
es un procedimiento costoso y que requiere tiempo.
Finalmente, algunos compuestos comúnmente
conocidos usados en la descontaminación fotoquímica (PCD) exhiben
una acción mutágena indeseable que parece que aumenta al crecer la
capacidad de inactivar los virus. En otras palabras, cuanto más
eficaces son los compuestos conocidos para inactivar los virus, más
lesivos son los compuestos para el receptor y, por tanto, son menos
útiles en cualquier punto de un sistema de inactivación de productos
para uso in vivo.
Se necesita un nuevo compuesto psoraleno que
tenga una capacidad mejorada de inactivar patógenos y una capacidad
mutagénica baja, que no cause un daño significativo a los
hemoderivados para los que se usa, y que no necesite eliminar el
oxígeno, que asegure así una inactivación segura y completa de
patógenos en los procedimientos de descontaminación de sangre.
LEE B L ET AL: "INTERACTION OF
PSORALEN-DERIVATIZED OLIGODEOXYRIBONUCLEOSIDE
METHYLPHOSPHONATES WITH SINGLESTRANDED DNA" BIOCHEMISTRY,
AMERICAN CHEMICAL
SOCIETY. EASTON, PA, US, vol. 27, n.º 9,1988, páginas 3197-3203, divulga la síntesis de 4'-[N-(2-aminoetil)amino]metil]4,5',8-trimetilpsoraleno y 4'-[N-(2-aminobutil)amino]metil]-4,5',8-trimetilpsoraleno y dichos compuestos en sí.
SOCIETY. EASTON, PA, US, vol. 27, n.º 9,1988, páginas 3197-3203, divulga la síntesis de 4'-[N-(2-aminoetil)amino]metil]4,5',8-trimetilpsoraleno y 4'-[N-(2-aminobutil)amino]metil]-4,5',8-trimetilpsoraleno y dichos compuestos en sí.
El documento DE 38 04243 A1 divulga la síntesis
de
4'-(9''-Amino-2'',6''-diazanonil)-4,5',8-trimetilpsoraleno
a partir de
4'-Clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
y la amina correspondiente
N,N-Bis-(diaminopropil)-aminometano
y dicho compuesto per se.
LEE B L ET AL: "Interaction of
psoralen-derivatized oligodeoxyrtbonucleoside
methylphosphonates with synthetic DNA containing a promoter for T7
RNA polymerase". NUCLEIC ACIDS RESEARCH 25 NOV 1988, vol. 16, n.º
22,25 divulga el compuesto
4'-N(2-aminoetil)aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
OSER A ET AL: "Sensitive
non-radioactive dot-blot
hydridization using DNA probes labelled with chelate group
substituted psoralen and quantitative detection by europium ion
fluorescence" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS,
SURREY, GB, vol. 16, n.º 3,1988, páginas 1181-1196,
divulga la síntesis de
4'-(9''-amino2'',6''-diazanonil)-4,5',8-trimetilpsoraleno
y dicho compuesto per se.
THADEN J ET AL: "PHOTOAFFINITY BEHAVIOR
OF A CONJUGATE OF OLIGONUCLEOSIDE METHYLPHOSPHONATE,
RHODAMINE, AND PSORALEN IN THE PRESENCE OF COMPLEMENTARY
OLIGONUCLEOTIES" BIOCONJUGATE CHEMISTRY, ACS, WASHINGTON, DC, US,
vol. 4, n.º 5,1993, páginas 386-394, divulga el
compuesto
4'-[N-(2-aminoetil)aminometil]-4,5',8-trimetilpsoraleno
[(ae(AMT)].
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La presente invención se define en las
reivindicaciones y proporciona nuevos psoralenos y procedimientos de
síntesis de nuevos psoralenos que tienen una mayor capacidad de
inactivar patógenos en presencia de luz ultravioleta que no está
relacionada con la actividad mutágena. La presente invención también
proporciona procedimientos de usar compuestos nuevos y conocidos
para inactivar patógenos en productos relacionados con la sanidad
para emplear en medios sintéticos.
La presente invención contempla también
procedimientos de síntesis de varios compuestos de la presente
invención. En una realización, la presente invención contempla un
procedimiento de síntesis de
4'-(\omega-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
que comprende las etapas: (a) proporcionar
4'-(\omega-hidroxi-2-oxa)alquil-4,5'-8-trimetilpsoraleno;
(b) tratar el
4'-(\omega-hidroxi-2-oxa)alquil-4,5'-8-trimetilpsoraleno
con una base y cloruro de metanosulfonilo de manera que se produzca
4'-(\omega-metanosulfoniloxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
(c) tratar el
4'-(\omega-metanosulfoniloxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con azida sódica de manera que se produzca
4'-(\omega-azido-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
y (d) reducir
4'(\omega-azido-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
de manera que se produzca
4'-(\omega-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
En una realización de este procedimiento de síntesis, el
4'-(\omega-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
es
4'-[(4-amino-2-xa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
En otra realización, en la etapa (d), el
4'-[(4-azido-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
se reduce con trifenilfosina. La presente invención contempla
además un compuesto de psoraleno producido por el procedimiento de
síntesis descrito antes, que comprende
4'-[(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
La presente invención contempla un procedimiento
para sintetizar otro compuesto de psoraleno que tiene un
sustituyente R_{1} en el carbono 4', que se selecciona a partir
del grupo que comprende
-(CH_{2})-O-(CH_{2})_{x}-O-(CH_{2})_{z}-NH_{2},
en el que x = z, y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} en
los átomos de carbono 4, 5' y 8, respectivamente, seleccionados
independientemente entre el grupo que comprende H y
(CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero de
0 a 5, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un
4'-halometil-4-5'-8-trimetilpsoraleno
que se selecciona a partir del grupo que comprende
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
y
4'-yodometil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
(b) tratar el mencionado
4'-halometil-4-5'-8-trimetilpsoraleno
con
HO(CH_{2})_{x}O(CH_{2})_{z}OH de
manera que se produzca
4'-(\omega-hidroxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
en el que n = x+3; (c) tratar el mencionado
4'-(\omega-hidroxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con una base y cloruro de metanosulfonilo de manera que se produzca
4'-(\omega-metanosulfoniloxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
(d) tratar el
4'-(\omega-metanosulfoniloxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con azida sódica, con lo que se produce
4'-(\omega-azido-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
y (e) reducir
4'-(\omega-azido-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
produciéndose
4'-(\omega-amino-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
En una realización alternativa, la presente invención contempla un
procedimiento de síntesis de
4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetilpsoraleno
que comprende las etapas de (a) proporcionar un
4'-halometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
que se selecciona a partir del grupo que comprende
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
y
4'-yodometil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
(b) tratar el mencionado
4'-halometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con dietilenglicol, con lo que se forma
4'-(7-hidroxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
(c) tratar el
4'-(7-hidroxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con una base y cloruro de metanosulfonilo, con lo que se produce
4'-(7-metanosulfoniloxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
(d) tratar
4'-(7-metano-sulfoniloxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con 1,4-diaminobutano con lo que se forma
4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetilpsoraleno
En una realización alternativa, la presente
invención contempla un procedimiento de sintetizar
4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
que comprende:
a) proporcionar
4,5',8-trimetilpsoralen-4'-carboxaldehído;
b) tratar
4,5',8-trimetilpsoralen-4'-carboxaldehído
con espermina y un agente reductor para producir
4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecano-4,5',8-trimetilpsoraleno.
La invención contempla un compuesto que tiene la
fórmula
o una de sus sales. La invención
contempla también un compuesto psoraleno que comprende: (a) un
sustituyente R_{1} en el átomo de carbono 4', seleccionado ente el
grupo que comprende:
-(CH_{2})_{w}-O-(CH_{2})_{z}-NH_{2},
-(CH_{2})_{w}-O-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{z}-NH_{2},
y
-(CH_{2})_{w}-O-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{y}-R_{4}-(CH_{2})_{z}-NH_{2};
en los que R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente
entre el grupo que comprende O y NH, en el que w es un número
entero de 1 a 5, x es un número entero de 2 a 5, y es un número
entero de 2 a 5 y z es un número entero de 2 a 6; y (b)
sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} en los átomos de carbono
4,5' y 8, respectivamente, seleccionados independientemente entre el
grupo que comprende H y (CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que
v es un número entero de 0 a 5; o una de sus sales. La presente
invención contempla varias realizaciones de este compuesto,
incluidos aquellos en los que: el sustituyente R_{1} es
-CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2},
y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; en los
que el sustituyente R_{1} es
-CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}
y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son CH_{3}; en los
que el mencionado sustituyente R_{1} es
-CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH-(CH_{2})_{4}-NH_{2}
y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son todos CH_{3};
en los que el mencionado sustituyente R_{1} es
CH_{2}-NH-(CH_{2})_{4}-NH_{2}
y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son todos CH_{3};
y en los que el sustituyente R_{1} es
-CH_{2}-NH-(CH_{2})_{3}-NH-(CH_{2})_{4}-NH-(CH_{2})_{3}-NH_{2}
y los sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son
CH_{3}.
Finalmente, la presente invención contempla
varias realizaciones de medios sintéticos de almacenamiento de
plaquetas. En una realización, el medio sintético de almacenamiento
de plaquetas comprende una solución acuosa de: cloruro sódico
45-100 mM; cloruro potásico 4-5 mM;
citrato 10-15 mM; acetato sódico
20-27 mM; glucosa 0-2 mM, manitol
0-30 mM; fosfato sódico aproximadamente 20 mM;
cloruro magnésico 2-3 mM; y un
4'-amino primario-psoraleno, a una
concentración entre aproximadamente 1 y 250 \muM. En otra
realización, el medio sintético de almacenamiento de plaquetas
comprende una solución acuosa de: cloruro sódico
45-100 mM; citrato 8-15 mM; acetato
sódico 20-35 mM, fosfato sódico aproximadamente 26
mM; un 4'-amino primario-psoraleno a
una concentración entre aproximadamente 1 y 250 \muM.
Específicamente, en una realización de este medio, el medio
comprende cloruro sódico 86 mM, citrato 10 mM, acetato sódico 30
mM, fosfato sódico aproximadamente 26 mM y
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
a una concentración entre aproximadamente 1 y 250 \muM.
La Fig. 1 detalla el esquema de síntesis del
compuesto de dos isómeros de
bromometil-trialquilpsoraleno.
La Fig. 2 detalla el esquema de síntesis del
compuesto de varios psoralenos 4'-amino primario
sustituidos.
La Fig. 3 detalla el esquema de síntesis del
compuesto de varios psoralenos 4'-amino primario
sustituidos.
La Fig. 4 detalla el esquema de síntesis del
compuesto de varios psoralenos que tienen una amina terminal unida
al psoraleno en la posición 4' por una cadena alquilo
"Fig. 5 a 9" es numeración que no se
emplea.
La Fig. 10A es un diagrama de rutas de síntesis
y estructuras químicas de los compuestos 8, 13 y 14 de la presente
invención.
La Fig. 10B es un diagrama de rutas de síntesis
y estructuras químicas de los compuestos 2, 4 y 7 de la presente
invención.
La Fig. 10C es un diagrama de rutas de síntesis
y estructuras químicas de los compuestos 1, 5, 6, 9 y 10 de la
presente invención.
La Fig. 10D es un diagrama de rutas de síntesis
y estructuras químicas de los compuestos 12 y 15 de la presente
invención.
La Fig. 10E es un diagrama de rutas de síntesis
y estructuras químicas del compuesto 3 de la presente invención.
La Fig. 10F es un diagrama de rutas de síntesis
y estructuras químicas de los compuestos 16 y 17 de la presente
invención.
La Fig. 11 presenta el impacto de la
concentración sobre el log de inactivación de R17 cuando se
fotoactivan los compuestos 1-3 de la presente
invención.
La Fig. 12 presenta el impacto de la
concentración sobre el log de inactivación de R17 cuando se
fotoactivan los compuestos 3-6 de la presente
invención.
La Fig. 13 presenta el impacto de la
concentración sobre el log de inactivación de R17 cuando se
fotoactivan los compuestos 2 y 6 de la presente invención.
La Fig. 14 presenta el impacto de la
concentración sobre el log de inactivación de R17 cuando se
fotoactivan los compuestos 6 y 18 de la presente invención.
La Fig. 15 presenta el impacto de la
concentración sobre el log de inactivación de R17 cuando se
fotoactiva el compuesto 16 de la presente invención.
La Fig. 16 presenta el impacto de la variación
de julios/cm^{2} (vatios/cm^{2}) de irradiación sobre el título
logarítmico de R17 para el compuesto 6 de la presente invención.
La Fig. 17 presenta el impacto de la variación
de julios/cm^{2} de irradiación sobre el título logarítmico de
R17 para los compuestos 7, 9 y 10 de la presente invención.
La Fig. 18 presenta el impacto de la variación
de julios/cm^{2} de irradiación sobre el título logarítmico de
R17 para los compuestos 7 y 12 de la presente invención.
La Fig. 19 presenta el impacto de la variación
de julios/cm^{2} de irradiación sobre el título logarítmico de
R17 para el compuesto 15 de la presente invención.
La Fig. 20 presenta el impacto de la variación
de julios/cm^{2} de irradiación sobre el título logarítmico de
R17 para el compuesto 17 de la presente invención.
La Fig. 21 presenta el impacto de la variación
de julios/cm^{2} de irradiación sobre el título logarítmico de
R17 para los compuestos 6 y 17 de la presente invención.
La Fig. 22 presenta el impacto de la variación
de julios/cm^{2} de irradiación sobre el título logarítmico de
R17 para los compuestos 6 y 15 de la presente invención.
La Fig. 23 presenta el efecto de la variación de
la concentración de los compuestos 2 y 6 de la presente invención
en plasma.
La Fig. 24 presenta el efecto de la variación de
la concentración de los compuestos 2 y 6 de la presente invención
en medio sintético.
"Fig. 25" es numeración que no se
emplea.
La Fig. 26A es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 2 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por recuento de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 26B es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 2 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por la agregación de plaquetas. "n" representa
el número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 26C es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 2 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por la expresión de GMP-140.
"n" representa el número de experimentos representado por el
punto del dato.
La Fig. 26D es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 2 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por el pH. "n" representa el número de
experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 27A es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 6 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por recuento de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 27B es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 6 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por agregación de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 27C es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 6 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por expresión de GMP-140. "n"
representa el número de experimentos representado por el punto del
dato.
La Fig. 27D es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 6 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por el pH. "n" representa el número de
experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 28A es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 17 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por recuento de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 28B es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 17 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por agregación de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 28C es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 17 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por expresión de GMP-140. "n"
representa el número de experimentos representado por el punto del
dato.
La Fig. 28D es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 17 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por el pH. "n" representa el número de
experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 29A es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 18 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por recuento de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 29B es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 18 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por agregación de plaquetas. "n" representa el
número de experimentos representado por el punto del dato.
La Fig. 29C es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 18 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por expresión de GMP-140. "n"
representa el número de experimentos representado por el punto del
dato.
La Fig. 29D es un gráfico comparativo de un
control de un día (C1), un control almacenado 5 días (D5), luz
ultravioleta sola (uv) y tratamiento con luz ultravioleta y el
compuesto 18 a 100 \muM (PCD) por sus efectos sobre la función de
plaquetas medida por el pH. "n" representa el número de
experimentos representado por el punto del dato.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La presente invención se define en las
reivindicaciones y proporciona psoralenos novedosos y procedimientos
de síntesis de nuevos psoralenos que tienen una mayor capacidad de
inactivar patógenos en presencia de luz ultravioleta. Los nuevos
psoralenos son eficaces contra una amplia variedad de patógenos. La
presente invención también proporciona procedimientos de usar
compuestos nuevos y conocidos para inactivar patógenos en productos
sanitarios a emplear in vivo e in vitro y, en
particular a hemoderivados, sin afectar significativamente a la
función del hemoderivado ni exhibir acción mutágena.
La descripción de la invención se divide en las
secciones siguientes: (I) Síntesis de Compuestos, (II) Unión de
compuestos a Ácido Nucleico, (III) Inactivación de Contaminantes y
(IV) Conservación de Propiedades Bioquímicas del Material
Tratado.
La expresión "compuestos con
fotoactivación" (o "compuestos fotorreactivos") define una
familia de compuestos que experimentan un cambio químico en
respuesta a la radiación electromagnética. La Tabla 1 es una lista
parcial de compuestos con fotoactivación.
\vskip1.000000\baselineskip
Compuestos con
fotoactivación
- \quad
- Actinomicinas
- \quad
- Antraciclinonas
- \quad
- Antramicina
- \quad
- Benzodipironas
- \quad
- Fluorenos y Fluorenonas
- \quad
- Furocumarinas
- \quad
- Mitomicina
- \quad
- Azul Rápido de Monostral
- \quad
- Norfilina A
Muchos colorantes orgánicos no listados
específicamente Fenantridinas, Sales de Fenazationio, Fenazinas,
Fenotiazinas, Fenilazidas, Quinolinas, Tiaxantenonas.
Las especies preferidas de compuestos
fotorreactivos descritos en este contexto comúnmente se denominan
furocumarinas. En particular, la presente invención contempla los
compuestos descritos como psoralenos:
[7H-furo(3,2-g-(1)-benzo-piran-7-ona,
o \beta-lactona del ácido
6-hidroxi-5-benzofuranacrílico],
que son lineales:
y en los que los dos restos de
oxígeno anexionados al resto central aromático tienen una
orientación 1, 3 y, además, en los que el resto del anillo de
furano está unido a la posición 6 del sistema de cumarina de dos
anillos. Los derivados de psoraleno derivan por sustitución de la
furocumarina lineal en las posiciones 3, 4, 5, 8, 4' o
5'.
El 8-metoxipsoraleno (conocido
en la bibliografía bajo distintos nombres, por ejemplo, xantotoxina,
metoxalen, 8-MOP) es un psoraleno natural con una
unión fotoactivada relativamente baja a ácidos nucleicos y una
acción mutágena baja en el ensayo de Ames, que se describe en la
sección experimental siguiente. El
4'-aminometil-4,5',8
trimetilpsoraleno (AMT) es uno de los derivados de psoraleno que se
unen a ácidos nucleicos más reactivos, que proporcionan hasta 1
aducto AMT por 3,5 pares de bases de DNA. S. T. Isaacs, G.
Wiessehahn y L. M. Hallick, NCI Monograph 66:21 (1984). Sin
embargo, el AMT tambien exhibe unos niveles de acción mutágena
considerable. Se deseaba un nuevo grupo de psoralenos que tuviera
las mejores características de 8-MOP y de AMT: baja
acción mutágena y alta afinidad de unión a ácidos nucleicos con el
fin de lograr una inactivación segura y meticulosa de patógenos.
Los compuestos de la presente invención se diseñaron para que fueran
esos compuestos.
Los "psoralenos 4'-amino
primario-sustituidos" se definen como compuestos
de psoraleno que tienen un grupo NH_{2} unido a la posición 4'
del psoraleno por una cadena de hidrocarburo que tiene una longitud
total de 2 a 20 carbonos, en la que de 0 a 6 de esos carbonos están
reemplazados independientemente por NH u O y cada punto de
reemplazo está separado de cada uno de los otros puntos de reemplazo
por al menos dos carbonos y está separado del psoraleno por al
menos un carbono. Los psoralenos 4'-amino
primario-sustituidos pueden tener sustituciones
adicionales en las posiciones 4, 5' y 8 del psoraleno, sustituciones
entre las que están, aunque no únicamente, los grupos siguientes: H
y (CH_{2})_{n}CH_{3}, en el que n =
0-6.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención contempla procedimientos
de síntesis de los nuevos compuestos de la presente invención, así
como nuevos procedimientos de síntesis de intermedios conocidos.
Específicamente, los nuevos compuestos son psoralenos
4'-amino primario- sustituidos monoalquilados,
dialquilados o trialquilados. En las Fig. 10A-10F
se presentan varios ejemplos de los esquemas descritos en esta
sección. Para facilitar la referencia, la Tabla 2 expone la
nomenclatura usada para los derivados de psoralenos descritos en el
documento. Las estructuras de los compuestos 1-18
también están representadas en las Fig. 10A-10F.
Nótese que en esta sección (titulada "B. Síntesis de los
psoralenos") los números romanos usados para identificar
compuestos se correlacionan sólo con los Esquemas
1-6 y no se correlacionan con los números de los
compuestos que se dan en la Tabla 2 o las Fig.
10A-10F.
\vskip1.000000\baselineskip
Lo más lógico es describir primeramente los
intermedios útiles en la síntesis de muchos de los compuestos de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Las síntesis anteriores de
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(4'-CMT) y
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(4'-BrMT) parten de
4,5',8-trimetilpsoraleno (5'-TMP)
que es adquirible comercialmente (Aldrich Chemical Co., Milwakee,
WI) o se puede preparar en 4 etapas como se describe más adelante
para otros psoralenos alquilados. 5'-TMP se
convierte en 4'-CMT usando un gran exceso
(20-50 equivalentes) de clorometil metiléter, muy
carcinógeno y volátil. La halometilación de los
4,5',8-trialquilpsoralenos con clorometil metil éter
o bromometil metil éter se describe en la patente de Estados Unidos
N.º 4.124.598 de Hearst. El compuesto de bromo,
4'-BrMT, se prepara análogamente usando bromometil
metil éter, que es algo menos volátil. Se obtienen rendimientos de
sólo 30-60% del intermedio deseado. El
5'-clorometil-4,4',8-trimetilpsoraleno
(5'-CMT) y
5'-bromometil-4,4',8-trimetilpsoraleno
(5'-BrMT) se preparan de manera similar usando el
compuesto isómero de partida
4,4',8-trimetilpsoraleno (4'-TMP)
[patente de Estados Unidos N.º 4.294.822, de Kaufman; Mc Leod y
otros, Synthesis of Benzofuranoid Systems. I. Furocoumarins,
Benzofurans and Dibenzofurans, Tetrahedron Letters 237 (1972)].
Algunas figuras a las que se hace referencia en la descripción de
la síntesis que sigue contienen números romanos usados para marcar
estructuras que engloban más de un compuesto. Este sistema de
numeración es distinto del sistema de numeración de la Tabla 2
anterior, que se usó para identificar varios compuestos específicos,
y no ha de confundirse con aquel.
Se describe en esta memoria un procedimiento muy
mejorado que permite la síntesis de cualquier isómero de los
bromomonometil-trialquilpsoralenos a partir del
mismo precursor de psoraleno mediante control cuidadoso de las
condiciones de reacción. Véase la Fig. 1. En la Fig. 1, A_{1} y
A_{2} se seleccionan independientemente entre el grupo que
comprende H y una cadena alquilo que tiene 1-6
átomos de carbono. La reacción de la
4,8-dialquil-7-hidroxicumarina
con
2-cloro-3-butanona
en condiciones básicas típicas proporciona
4,8-dialquil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxicumarina
(I). Este material se cicla por calentamiento en NaOH acuoso para
que resulte
4,8-dialquil-4',5'-dimetilpsoraleno
(II). El tratamiento del psoraleno tetrasustituido y
N-bromosuccinimida (NBS) en un disolvente a
temperatura ambiente hasta 150ºC conduce a la bromación en la
posición 4' o 5', dependiendo de las condiciones usadas. Se puede
añadir un catalizador tal como peróxido de dibenzoílo, pero no es
necesario. Si el disolvente usado es tetracloruro de carbono a
reflujo, se obtiene
4,8-dialquil-5'-bromometil-4'-etilpsoraleno
(IV) con rendimientos de 50% o mayores. Si se usa cloruro de
metileno a temperatura ambiente, sólo se obtiene
4,8-dialquil-4'-bromometil-5'-metilpsoraleno
(III) con rendimientos \geq 80%. También se puede hacer la
bromación bencílica en otros disolventes, produciéndose uno de los
productos isómeros solo o en una mezcla. Entre estos disolventes
están incluidos, aunque no únicamente,
1,2-diclorometano, cloroformo, bromotriclorometano y
benceno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se considera ahora la síntesis de una subclase
de psoralenos lineales; los
4,5',8-trialquilpsoralenos se pueden producir como
sigue. Las 4,8-dialquilcumarinas se preparan a
partir de 2-alquilresorcinoles y un éster de
3-oxoalcanoato por reacción de Pechmann (Organic
Reactions vol. VII, capít. 1, ed. Adams y otros, Wiley, NY (1953)).
El grupo hidroxi se trata con un agente de alquilación,
CH_{2}=CHX-CH(R)Y, en el que X es un
haluro o hidrógeno, Y es un haluro o sulfonato, y R es H o
(CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero de
0 a 4. El reagrupamiento de Claisen del alil éter resultante da
4,8-dialquil-6-alil-7-hidroxicumarina.
Las cumarinas se convierten en
4,5',8-trialquilpsoralenos usando procedimientos
similares a uno de los varios procedimientos descritos antes (esto
es, véase Bender y otros, J. Org. Chem. 44:2176 (1979); Kaufman,
patente de Estados Unidos N.º 4.235.781 y 4.216.154). El
4,5',8-trimetilpsoraleno es un producto natural y es
adquirible comercialmente (Aldrich Chemical Co., Milwakee, WI).
En la Fig. 2 se presentan varias rutas de
síntesis. Partiendo de 4-HATP (en el que w es un
número de 1 a 5; A_{1}, A_{2} y A_{3} se seleccionan
independientemente entre el grupo que comprende H y
(CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número de 0 a 5;
y en el que X=Br, Cl o I), la reacción con un exceso de un compuesto
bis-hidroxi, HO-(B)-OH, en el que B
es: una cadena alquilo (por ejemplo, HO-(B)-OH es
1,3-propanodiol), un monoéter (por ejemplo,
dietilenglicol) o un poliéter (por ejemplo, tetraetilenglicol), que
tiene una longitud de 18 átomos de carbono o menos, puro o con un
disolvente tal como acetona a 20-80ºC, y una base
para cadenas de carbono más largas que halometilo, da un
(\omega-hidroxialcoxi)alquilpsolereno. El
grupo hidroxi terminal se puede transformar en un grupo amino en
una variedad de condiciones (por ejemplo, véase Larock,
Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, NY,
1989). En particular, el grupo hidroxi se puede convertir en el
éster del ácido metanosulfónico (estructura VI) en presencia de
cloruro de metanosulfonilo (CH_{3}SO_{3}Cl). Éste se puede
convertir seguidamente en la azida en metanol a reflujo y la azida
reducirse a la amina final, estructura VII (son ejemplos los
compuestos 2, 4 y 7). El procedimiento aquí descrito utiliza
trifenilfosfina y agua en tetrahidrofurano (THF) para la reducción,
pero se contemplan otros procedimientos.
Un procedimiento preferido para la preparación
de la estructura VII usa la reacción de 4'-HATP con
un alcohol lineal primario que contiene una amina protegida (por
ejemplo un grupo ftalimido) en la posición terminal, en un
disolvente adecuado tal como DMF a 25-150ºC para
obtener V. La amina se desprotege luego en condiciones estándar
(por ejemplo, hidracina o MeNH_{2} acuosa para desproteger un
grupo ftalimido [también se contemplan hidracinas de alquilos
superiores, tales como bencilhidracinas]) para que resulte VII.
Por el contrario, se puede hacer reaccionar la
estructura VI con diaminas, H_{2}N-(B')-NH_{2}
en la que B' es una cadena alquilo (por ejemplo,
1,4-butanodiamina), un monoéter (por ejemplo,
3-oxa-1,5-pentanodiamina)
o un poliéter (por ejemplo,
3,6-dioxa-1,8-octanodiamina)
para que resulte el producto final, compuesto VIII (son ejemplos de
compuestos de esta estructura los compuestos 8, 13 y 14). Esta
reacción se realiza con un exceso de diamina en acetonitrilo a
reflujo, pero son igualmente posibles otros disolventes y
temperaturas.
Se desean algunos compuestos finales en los que
la cadena de carbono está unida a la posición 4'- del anillo de
psoraleno por un grupo aminoalquilo
[NH(CH_{2})_{w}] y no por un grupo oxialquilo
[O(CH_{2})_{w}]. Las rutas de síntesis para estos
compuestos se presentan en la Fig. 3. Cuando la unión entre este
nitrógeno y el nitrógeno terminal contiene sólo subunidades
CH_{2} y oxígeno pero no otros nitrógenos (estructura X) (son
ejemplos los compuestos 1, 5, 6, 9, 10 y 11), el producto puede
prepararse convenientemente a partir de 4'-HATP y
la diamina apropiada de estructura IX. Este procedimiento es también
aplicable a productos finales que contienen más de dos nitrógenos
en la cadena (estructura XIII) (son ejemplos los compuestos 12 y 15)
a partir de poliaminas de estructura XII (por ejemplo,
norespermidina o espermina [adquiribles comercialmente de Aldrich,
Milwaukee, WI]); sin embargo, en este caso también se forman
estructuras isómeras en cantidades considerables. El procedimiento
preferido para la preparación de la estructura XIII es la aminación
reductora del psolaren-4'-alcanal
(XI) con una poliamina de estructura XII y un agente reductor tal
como cianoborohidruro sódico. Esta aminación reductora es aplicable
también a la síntesis de los compuestos X. Los carboxaldehídos
(estructura XI, w=0) se han preparado previamente por hidrólisis de
los compuestos de 4'-halometilo y posterior
oxidación del compuesto de 4'-hidroximetilo
resultante. (Isaacs y otros, J. Labelled Cmpds Radiopharm., 1982,
19, 345). Estos compuestos también se pueden preparar
convenientemente por formilación de los compuestos de
4'-hidruro con una formamida y POCl_{3} o con
hexametilentetraamina en ácido. Los alcanales de cadena más larga
se pueden preparar a partir de los compuestos
4'-HATP por conversión del grupo halo terminal en
una función aldehído (por ejemplo, Durst, Adv. Org. Chem. 6:285
(1969)).
Otros productos finales tienen una amina
terminal unida al psoraleno por una cadena alquilo. Como se presenta
en la Fig. 4, estos compuestos (estructuras XIV) (un ejemplo es el
compuesto 3) se preparan (1) por reacción del
4'-HATP con ftalimida o azida potásica y posterior
liberación de la amina deseada como antes, por ejemplo, con
hidracina, o (2) por conversión del 4'-HATP en el
compuesto de cianuro, seguida de reducción, por ejemplo con
NaBH_{4}-CF_{3}CO_{2}H.
La consideración sobre la conversión de
4,5',8-trialquilpsoralenos en
4'-amino
funcionalizado-4,5',8-trialquilpsoralenos
se aplica igualmente bien cuando la posición 4 y/u 8 está
sustituida con sólo un hidrógeno, obteniéndose así
4'-amino primario sustituido-5' (4 u
8)-dialquilpsoralenos y 4'-amino
primario
sustituido-5'-alquilpsoralenos.
La presente invención contempla la unión de
compuestos nuevos a ácido nucleico, incluidos ácido nucleico viral
y ácido nucleico bacteriano. Un enfoque de la presente invención
para unir compuestos con fotoactivación a ácido nucleico es la
fotounión. La fotounión se define como la unión de compuestos con
fotounión en presencia de longitudes de onda de luz fotoactivantes.
Los compuestos de fotounión son compuestos que se unen a ácidos
nucleicos en presencia de longitudes de onda de luz fotoactivantes.
La presente unión contempla procedimientos de fotounión con
compuestos de fotounión de la presente invención.
Una realización del procedimiento de la presente
invención para la fotounión supone las etapas: a) proporcionar un
compuesto con fotounión de la presente invención; y b) mezclar el
compuesto con fotounión con ácido nucleico en presencia de
longitudes de fotoactivación de radiación electromagnética.
La invención además contempla un procedimiento
para modificar ácido nucleico que comprende las etapas: a)
proporcionar un compuesto con fotounión de la presente invención y
ácido nucleico; y b) fotounir el compuesto con fotounión al ácido
nucleico, de forma que se forme un complejo entre el compuesto y
ácido nucleico. Sin pretender limitarse a ningún método por el que
los compuestos de la presente invención previenen la replicación,
se cree que la estructura de dicho complejo entre compuesto y ácido
nucleico sirve para prevenir la replicación del ácido nucleico al
evitar que actúe la polimerasa necesaria en la región en la que se
unió el compuesto.
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La presente invención contempla el tratamiento
de un hemoderivado con un compuesto con fotoactivación y la
irradiación para inactivar secuencias de ácidos nucleicos
contaminantes de patógenos antes de usar el hemoderivado.
El término "inactivación" se define en esta
memoria como la alteración del ácido nucleico de una unidad de
patógeno para hacer que la unidad de patógeno sea incapaz de
replicarse. Esto es diferente de "inactivación total", en la
que todas las unidades de patógeno presentes en una muestra dada se
hacen incapaces de replicación, o "inactivación sustancial",
en la que la mayoría de las unidades de patógenos presentes se hacen
incapaces de replicación. La "eficiencia de inactivación" de
un compuesto se define como el nivel de inactivación del compuesto
que se puede alcanzar a una concentración dada del compuesto o una
dosis de irradiación dada. Por ejemplo, si 100 \muM de un
hipotético compuesto X inactivan 5 logs de virus HIV mientras que,
en las mismas condiciones experimentales, la misma concentración
del compuesto Y inactiva sólo 1 log de virus, el compuesto X
tendría una "eficiencia de inactivación" mejor que el compuesto
Y.
Para apreciar si un procedimiento de
"inactivación" puede lograr o no "inactivación total", es
útil considerar un ejemplo específico. Se dice que un cultivo
bacteriano está inactivado si una parte alícuota del cultivo,
cuando se pasa a una placa de cultivo fresca y se deja que se
desarrolle, es indetectable después de un cierto período de tiempo.
Para que una señal sea detectable, se debe aplicar a la placa un
número mínimo de bacterias viables. Con el procedimiento de
detección óptimo, este número mínimo es 1 célula bacteriana. Con un
procedimiento de detección subóptimo, el número mínimo de células
bacterianas aplicadas de manera que se observe una señal puede ser
mucho mayor que 1. El procedimiento de detección determina un
"umbral" por debajo del cual el "procedimiento de
inactivación" parece ser completamente eficaz (y por encima del
cual la "inactivación" es, de hecho, sólo parcialmente
eficaz).
Las mismas consideraciones de procedimiento de
detección y umbral existen cuando se determina el límite de
sensibilidad de un procedimiento de detección para ácidos nucleicos.
También aquí, "inactivación" significa que una unidad de
patógeno se convierte en incapaz de replicarse.
En el caso de los procedimientos de inactivación
para material a usar por seres humanos, sea in vitro o in
vivo, teóricamente, el procedimiento de detección a seguir puede
ser la medición del nivel de infección con una enfermedad como
resultado de la exposición al material. El umbral por debajo del
cual el procedimiento de inactivación es completo se considera que
es el nivel de inactivación que es suficiente para prevenir que se
produzca enfermedad debida al contacto con el material. Se acepta
que en este escenario práctico no es esencial que los
procedimientos de la presente invención den por resultado la
"inactivación total". Esto es, la "inactivación
sustancial" será adecuada en tanto que la porción viable sea
insuficiente para causar la enfermedad. Así, "sustancialmente la
totalidad" de un patógeno está inactivada cuando cualquier
porción viable del patógeno que permanece sea insuficiente para
causar enfermedad. El procedimiento de inactivación de la presente
invención convierte en sustancialmente inactivado el ácido nucleico
de los patógenos. En una realización, el procedimiento de
inactivación convierte en sustancialmente inactivado el ácido
nucleico de los patógenos en preparaciones hemáticas.
Sin que se pretenda quedar limitado a cualquier
procedimiento por el que los compuestos inactivan patógenos, se
cree que la inactivación resulta de la unión inducida por la luz de
los psoralenos a ácido nucleico. Además, si bien no se asegura que
el procedimiento de inactivación de la presente invención esté
limitado por la naturaleza del ácido nucleico, se contempla que el
procedimiento de inactivación convierta todas las formas de ácido
nucleico (sea DNA, mRNA, etc.) en sustancialmente inactivadas.
Cuando los compuestos de fotoactivación se usan
para modificar un ácido nucleico, la interacción del ácido nucleico
del patógeno (sea DNA, mRNA, etc.) con el compuesto de
fotoactivación preferiblemente previene la replicación del patógeno
de manera que, si se expone una persona al patógeno tratado, no
resultará una infección.
"Medio sintético" se define en esta memoria
como un medio acuoso sintético de almacenamiento de sangre o un
hemoderivado. En una realización, la presente invención contempla
inactivar hemoderivados en un medio sintético que comprende una
solución salina tamponada. Este procedimiento reduce el daño causado
a hemoderivados y permite el uso de concentraciones mucho más bajas
de compuestos con fotoactivación.
\newpage
El procedimiento de fotoinactivación con
psoralenos inactiva patógenos basados en ácido nucleico presentes
en la sangre en un único procedimiento. Así, tiene potencial para
eliminar bacterias, protozoos y virus. Si hubiera estado disponible
un procedimiento de descontaminación eficaz antes de la llegada del
SIDA, no se hubiera producido transmisión pandémica de HIV asociada
a transfusiones. La descontaminación basada en psoralenos tiene el
potencial de eliminar todos los agentes infecciosos del suministro
de sangre, independientemente del patógeno involucrado.
Adicionalmente, la descontaminación basada en psoralenos tiene la
capacidad de esterilizar hemoderivados después de su recogida y
procesamiento, lo que en el caso de concentrados de plaquetas podría
resolver el problema de una contaminación bacteriana baja y dar por
resultado una vida de almacenamiento extendida. Morrow, J. F. y
otros, JAMA 266:555-558 (1991); Bertolini, F. y
otros, Transfusión 32:152-156 (1992).
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 3 aparece una lista de virus que han
sido inactivados fotoquímicamente por uno o más psoralenos. (De la
Tabla 1 de Hanson, C.V., Blood Cells, 18:7 (1992)). En el artículo,
se señala que los piconavirus fueron fotoinactivados sólo si los
psoralenos estaban presentes durante el crecimiento del virus. Esta
lista no es exhaustiva y es meramente representativa de la gran
variedad de patógenos que pueden inactivar los psoralenos. La
presente invención contempla la inactivación de estos y otros virus
por compuestos que se describen en las reivindicaciones. Los
compuestos de la presente invención son particularmente adecuados
para inactivar virus con cubierta tales como virus HIV.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de evaluar un compuesto para decidir
si sería útil en los procedimientos de descontaminación fotoquímica
(PCD) de la presente invención, se deben considerar dos propiedades
importantes: (1) la capacidad del compuesto de inactivar patógenos
y (2) su acción mutágena. La capacidad de un compuesto de inactivar
patógenos se puede determinar por varios procedimientos. Una
técnica es realizar una exploración con bacteriófagos; un ensayo
que determina la unión de ácido nucleico con los compuestos de
ensayo. Una exploración de este tipo, una exploración con
r-17, se describe detalladamente en el Ejemplo 12.
Si la exploración con r-17 revela actividad de
inactivación, es útil para ensayar directamente la capacidad del
compuesto de inactivar un virus. Un procedimiento para realizar una
exploración directa de inactivación viral se describe detalladamente
en el Ejemplo 13 para HIV acelular.
La exploración con bacteriófagos de R17 se cree
que predice la eficacia de inactivación de HIV, así como la
eficacia de compuestos contra muchos otros virus. Se escogió el R17
porque se esperaba que fuera un patógeno muy difícil de inactivar.
Es un fago de RNA pequeño, monocatenario. Sin que eso signifique una
limitación a cualquier medio por el que actúa la presente
invención, se espera que los trozos más cortos de ácido nucleico
son más difíciles de inactivar porque requieren una frecuencia más
alta de formación de aductos de psoraleno que los trozos más largos
de ácido nucleico. Además, los patógenos de RNA monocatenarios son
más difíciles de inactivar porque los psoralenos no se pueden
intercalar entre pares de bases, como en los ácidos nucleicos
bicatenarios, ni forman diaductos que actúan como enlaces entre
cadenas. Así, se espera que, cuando se logre la inactivación de
R17, estas mismas condiciones causarán la inactivación de muchos
virus y bacterias.
La exploración con HIV acelular complementa la
exploración con r-17 por afirmar que un compuesto
dado que ha revelado ser positivo contra r-17
actuará eficazmente para inactivar virus. Así, si un compuesto
revela actividad en la exploración de r-17,
seguidamente se ensaya en la exploración de inactivación viral.
La segunda propiedad que es importante al
ensayar un compuesto para uso en los procedimientos de la presente
invención es la acción mutágena. El ensayo de exploración de
mutágeno/carcinógeno más extendido es el ensayo de Ames. Este
ensayo lo describen D.M. Maron y B.N. Ames en Mutation Research
113:173 (1983) y una exploración específica se describe
detalladamente en el posterior Ejemplo 17. El ensayo de Ames utiliza
varias cepas singulares de Salmonella typhimurium que son
dependientes de histidina para el crecimiento y que carecen de las
usuales enzimas de reparación de DNA. La frecuencia de mutaciones
normales que convierten las bacterias en independientes de la
histidina (esto es, la frecuencia de reversiones espontáneas) es
baja. El ensayo permite evaluar el impacto de un compuesto sobre
esta frecuencia de reversión.
A causa de que algunas sustancias no son
mutagénicas en sí pero se convierten en mutágenas por acción
metabólica, el compuesto a ensayar se mezcla con las bacterias en
placas de agar junto con extracto de hígado. El extracto de hígado
sirve para mimetizar la acción metabólica en un animal. Las placas
de control tienen sólo las bacterias y el extracto.
Se deja incubar las mezclas. El crecimiento de
bacterias (si lo hay) se comprueba contando colonias. Un ensayo de
Ames positivo es uno en el que el número de colonias en las placas
con mezclas que contienen el compuesto excede significativamente el
número de las correspondientes placas de control.
Cuando se exploran de esta manera con el ensayo
de Ames carcinógenos conocidos, aproximadamente 90% de ellos son
positivos. Cuando se ensayan similarmente sustancias no carcinógenas
conocidas, aproximadamente 90% de ellos son negativos.
Se puede evaluar un nuevo compuesto (X) como
potencial compuesto de descontaminación de sangre, como se muestra
en la siguiente Tabla 4. X se evalúa inicialmente en la Etapa I. X
se explora en el ensayo r-17 a varias
concentraciones diferentes entre 4 y 320 \muM, como se explica en
el Ejemplo 12. Si el compuesto revela una actividad de inactivación
superior a 1 log inactivación de r-17 (inactivación
logarítmica) en el ensayo con r-17 a cualquier
concentración, el compuesto se explora luego en el ensayo con HIV
acelular, como se explica en el Ejemplo 13. Si el compuesto
presenta una actividad de inactivación superior a 1 log inactivación
de HIV (inactivación logarítmica) en el ensayo HIV acelular, el
compuesto y AMT se exploran luego en el ensayo de Ames. Finalmente,
si el compuesto presenta una acción mutágena inferior a la de AMT en
el ensayo de Ames, el nuevo compuesto se identifica como agente
útil para la inactivación de patógenos.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo estas instrucciones, una persona puede
determinar rápidamente qué compuestos serían apropiados para uso en
los procedimientos de la presente invención.
La presente invención contempla varias
formulaciones y vías diferentes por las que se pueden suministrar
los compuestos descritos tal como se definen en las
reivindicaciones en un procedimiento de inactivación. Esta sección
es meramente ilustrativa y no tiene la finalidad de limitar la
invención a ninguna forma ni un procedimiento de introducir el
compuesto.
Los compuestos de la presente invención se
pueden introducir en un procedimiento de inactivación en varias
formas. Los compuestos se pueden introducir como solución acusa en
agua, solución salina o en medio sintético tal como
"Sterilyte^{TM} 3.0" (cuyo contenido se indica al comienzo de
la sección experimental más adelante) o una variedad de otros
medios. Los compuestos se pueden proporcionar además como
formulaciones secas, con o sin coadyuvantes.
Los nuevos compuestos se pueden aportar también
por varias rutas diferentes. Por ejemplo, el compuesto se puede
introducir en el recipiente de reacción, tal como una bolsa de
sangre, en el momento de la producción. Alternativamente, el
compuesto se puede añadir al material a esterilizar después de haber
puesto el material en el recipiente de reacción. Además, los
compuestos se pueden introducir solos o como mezcla de diferentes
compuestos.
Cuando se tratan compuestos de sangre a usar
in vivo, dos factores tienen una importancia primordial en
cuanto a los procedimientos y compuestos a usar. Primero, se debe
preguntar si el procedimiento o los compuestos usados alteran la
actividad in vivo del material tratado. Por ejemplo, la
transfusión de plaquetas es un tratamiento eficaz bien establecido
para pacientes con hemorragia trombocitopénica. Sin embargo, si el
tratamiento de descontaminación usado reduce considerablemente la
actividad coagulante de las plaquetas, el tratamiento no tiene
valor práctico alguno. Los psoralenos son útiles en procesos de
inactivación porque la reacción se puede realizar a temperaturas
compatibles con el mantenimiento de las propiedades bioquímicas de
la sangre y los hemoderivados. Hanson, C.V., Blood Cells 18:7
(1992). Pero no todos los psoralenos o procedimientos
descontaminarán sin rebajar significativamente la actividad
biológica del material descontaminado. Los compuestos y protocolos
anteriores han necesitado la eliminación de oxígeno molecular de la
reacción antes de y durante la exposición a la luz para evitar que
los radicales de oxígeno formados durante la irradiación dañen los
hemoderivados. Véase L. Lin y otros, Blood 74:517 (1989); patente de
Estados Unidos N.º 4.727.027, de Wiesenhanh. La presente invención
puede usarse para descontaminar hemoderivados en presencia de
oxígeno sin destruir la actividad para la que se preparan los
hemoderivados. Además, con los procedimientos de la presente
invención no hay necesidad de reducir la concentración de oxígeno
molecular. La presente invención contempla que no se destruya ni
rebaje significativamente la actividad in vivo de un
hemoderivado si una muestra de un hemoderivado que ha sido
descontaminada por procedimientos de la presente invención da
resultados en los ensayos similares a los que daría una muestra que
funcionara normalmente de un hemoderivado en ensayos conocidos para
determinar la función de un hemoderivado. Por ejemplo, en lo
concerniente a plaquetas, la actividad in vivo no se destruye
ni se rebaja significativamente si los pH de las plaquetas son los
mismos para plaquetas tratadas por los procedimientos de la
presente invención almacenadas durante 5 días que para muestras de
plaquetas no tratadas almacenadas durante 5 días.
"Sustancialmente el mismo pH" significa que los valores están
dentro del intervalo de error en torno a ese punto particular del
dato.
El segundo factor es si los compuestos son
tóxicos o mutagénicos para el paciente tratado. Un "compuesto que
presenta una acción mutágena baja" se define como un compuesto
que es menos mutagénico que AMT cuando se ensaya a concentraciones
por debajo de 250 \muM en el ensayo de Ames, descrito en la
sección experimental siguiente. Los procedimientos de inactivación
de la presente invención son especialmente útiles porque muestran la
independencia entre la eficacia de la inactivación del patógeno y
la acción mutágena. Los compuestos presentan una potente
inactivación patógena sin un aumento concomitante de la acción
mutágena. Los compuestos comúnmente conocidos ensayados según
protocolos de inactivación, tales como el AMT, parece que exhiben
una conexión entre eficacia de la inactivación del patógeno y la
acción mutagénica que hasta ahora parecía indivisible.
Si bien no se pretende que la presente invención
esté limitada por ninguna teoría según la cual la eficacia de la
inactivación del patógeno no está unida a la mutagenia, se postula
que el desacoplamiento se produce como resultado de la longitud de
los grupos sustituidos en el psoraleno y la situación de cargas en
los compuestos. Se postula que las cargas positivas en uno o ambos
extremos de los compuestos mutagénicos tienen interacciones no
covalentes con el esqueleto de fosfato del DNA. Se presume que esas
interacciones se producen independientemente de la presencia de luz
(llamada "unión oscura"). En teoría, de esta manera, el
psoraleno bloquea estéricamente la polimerasa para que no abra el
DNA, causando acción mutágena. Por el contrario, los compuestos de
la presente invención tienen una carga positiva o neutra en un
grupo sustituido largo. Estos grupos sustituidos forman una barrera
estérica durante la unión oscura que es mucho más fácil de liberar
del DNA, lo que permite el paso de la polimerasa. Por tanto, no se
produce acción mutágena.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar
ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención
y no ha de interpretarse que limitan su ámbito.
En la descripción experimental que sigue, se
usan las abreviaturas siguientes: eq (equivalentes); M (molar);
\muM (micromolar); N (normal); mol (moles); mmol (milimoles);
\mumol (micromoles); nmol (nanomoles; g (gramos); mg
(miligramos); \mug (microgramos); kg (kilogramos); l (litros); ml
(mililitros); \mul (microlitros); cm (centímetros); mm
(milímetros); \mum (micrómetros); nm (nanómetros); J (julio,
también vatio; nótese que en las Fig. 11, 13-22
Julios o J se refiere a Julios/cm^{2}); ºC (grados centígrados);
TLC (cromatografía en capa fina); EAA (acetoacetato de etilo); EtOH
(etanol); HOAC (ácido acético); W (vatios); mW (miliwats); RMN
(resonancia magnética nuclear; espectros obtenidos a temperatura
ambiente en un espectrómetro con transferencia de Fourirer Varian
Gemini 200 MHz); p.f. (punto de fusión); UV (luz ultravioleta); THF
(tetrahidrofurano); DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco); FBS
(suero bovino fetal); LB (caldo Luria); EDTA (ácido
etilendiaminatetraacético); miristatoacetato de forbol (PMA);
solución salina tamponada con fosfato (PBS); BSA (albúmina de suero
bovino); PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Además, en los
ejemplos que describen la síntesis de compuestos, los rendimientos
presentados son sólo para la etapa precedente y no para la síntesis
entera.
Para facilidad de referencia, a algunos
compuestos se les ha asignado un número de 1 a 18. Los números de
referencia se asignan en la Tabla 2. Sus estructuras aparecen en las
Fig. 10A-10F. Los números de referencia se usan a
la largo de la sección experimental.
Cuando se aíslan los compuestos en forma de sal
de adición de ácido, el ácido se selecciona preferiblemente de
manera que contenga un anión que sea no tóxico y farmacéuticamente
aceptable, al menos en las dosis terapéuticas usuales. Son sales
representativas que se incluyen en este grupo preferido los
hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos, acetatos, fosfatos,
nitratos, metanosulfonatos, etanosulfonatos, lactatos, citratos,
tartratos o bitartratos y maleatos. Otros ácidos son análogamente
adecuados y se pueden usar según se desee. Por ejemplo, también
pueden usarse como ácidos que forman sales de adición los ácidos
fumárico, benzoico, ascórbico, succínico, salicílico,
bismetilensalicílico, propiónico, glucónico, málico, malónico,
mandélico, cinámico, citracónico, esteárico, palmítico, itacónico,
glicólico, bencenosulfónico y sulfámico.
Uno de los ejemplos siguientes se refiere al
tampón HEPES. Este tampón contiene 8,0 g de NaCl 137 mM, 0,2 g de
KCl 2,7 mM, 0,203 g de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 1 mM, 1,0 g de
glucosa 5,6 mM, 1,0 g de albúmina de suero bovino (ABS) de 1 mg/ml
(adquirible de Sigma St. Louis, MO) y 4,8 g de HEPES 20 mM
(asequible de Sigma, St. Louis, MO).
En uno de los ejemplos siguientes, para el
tratamiento de plaquetas se formula un medio sintético tamponado
con fosfato. Este puede formularse en una etapa, resultando una
solución de pH equilibrado (por ejemplo, pH 7,2) combinando los
reactivos siguientes en 2 litros de agua destilada:
La solución se mezcla luego, se filtra estéril
(filtro de 0,2 \mum) y se refrigera.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro medio sintético útil en la presente
invención contiene los reactivos siguientes:
La reacción en cadena de polimerasa (PCR) se usa
en uno de los ejemplos para medir si la inactivación viral por
algunos compuestos era completa. La PCR es un procedimiento para
aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en
una mezcla de DNA genómico sin clonación o purificación. Véase K.B.
Mullis y otros, patentes de Estados Unidos N.º 4.683.195 y nº.
4.683.202. En este procedimiento, para amplificar la secuencia
diana se introduce un gran exceso de dos cebadores oligonucleótidos
en la mezcla de DNA que contiene la secuencia diana deseada, a lo
que sigue una secuencia precisa de ciclado térmico en presencia de
una DNA polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus
respectivas cadenas de la secuencia diana bicatenaria. Para efectuar
la amplificación, se desnaturaliza la mezcla y los cebadores se
hibridan luego a sus secuencias complementarias dentro de la
molécula diana. Después de la hibridación, los cebadores se
extienden con una polimerasa para formar un nuevo par de cadenas
complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación del
cebador, y extensión con polimerasa se pueden repetir muchas veces
(es decir, desnaturalización, hibridación y extensión constituyen
un "ciclo"; puede haber numerosos ciclos) para obtener una
concentración alta de un segmento amplificado de la secuencia diana
deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana
deseada está determinada por las posiciones relativas entre sí de
los cebadores y, por tanto, esta longitud es un parámetro
controlable. A causa del aspecto repetitivo del procedimiento, los
inventores lo denominaron "reacción en cadena de polimerasa".
Dado que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana
llegan a ser las secuencias predominantes (en términos de
concentración) de la mezcla, se dice que son "amplificados por
PCR".
\newpage
Con la PCR es posible amplificar una copia
individual de una secuencia diana específica en DNA genómico a un
nivel detectable por varias metodologías diferentes (por ejemplo,
hibridación con una sonda marcada; incorporación de cebadores
biotinilados seguida de detección de conjugado de
avidina-enzima; incorporación de desoxinucleótido
trifosfatos marcados con ^{32}P, por ejemplo, dCTP o dATP en el
segmento amplificado). Además de DNA genómico, se puede amplificar
cualquier secuencia de oligonucleótido con el conjunto apropiado de
moléculas de cebador.
Es sabido que procedimiento de amplificación por
PCR alcanza una meseta de secuencias diana específicas de
aproximadamente 10^{-8} M. Un volumen de reacción típico es 100
\mul, que corresponde a un rendimiento de 6 x 10^{11} moléculas
de producto bicatenario.
PCR es un protocolo de amplificación de
polinucleótidos. El factor de amplificación que se observa está
relacionado con el número (n) de ciclos de PCR que ha habido y la
eficacia de replicación de cada ciclo (E) que, a su vez, está en
función de las eficacias de cebado y extensión durante cada ciclo.
Se ha observado que la amplificación sigue la forma E^{n} hasta
que se logran concentraciones altas del producto de la PCR. A estas
concentraciones altas (aproximadamente de 10^{-8}) la eficacia de
replicación disminuye drásticamente. Probablemente esto es debido
al desplazamiento de los cebadores oligonucleotídicos cortos por las
cadenas complementarias más largas del producto de PCR. A
concentraciones por encima de 10^{-8} M, la velocidad de las dos
hebras producto amplificadas por PCR que se encuentran mutuamente
durante las reacciones de cebado llegan a ser tan rápidas que ésta
se produce antes de, o concomitantemente con, la etapa de extensión
del procedimiento de PCR. Esto conduce finalmente a una eficacia
reducida de cebado y, por tanto, una eficacia reducida de los
ciclos. Los ciclos continuados de PCR conducen a aumentos
menguantes de las moléculas producto de PCR. Finalmente, las
moléculas de producto de PCR alcanza una concentración meseta.
Las secuencias de los cebadores de
polinucleótidos usados en esta sección experimental son las
siguientes:
Con DCD03 como cebador directo común, los pares
generan amplicones con longitudes de 127, 327 y 1072 bp. Estos
oligos se seleccionaron entre regiones que están absolutamente
conservadas entre 5 aislados diferentes de dHBV (DHBV1, DHBV3, DHBV
16, DHBV 22 y DHBV26), así como de HBV de garza (HHBV4).
Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar
ciertas realizaciones preferentes y aspectos de la presente
invención.
"Ejemplo 1" es numeración que no se
emplea.
En este ejemplo se describe la síntesis de
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
La síntesis se realiza sin una etapa de bromometilación, lo que hace
que sea más segura que los procedimientos de síntesis conocidos.
Etapa
1
Se añade
3-cloro-2-butanona
(29,2 ml, 0,289 mol) a una suspensión agitada mecánicamente de
7-hidroxi-4,8-dimetilcumarina
(50,00 g, 0,263 mol) y K_{2}CO_{3} en polvo (54 g, 0,391 mol)
en acetona (500 ml). La suspensión se mantuvo a reflujo durante 15
horas y luego se eliminó el disolvente. Para eliminar la sal, el
sólido se agitó en 1,2 l de agua, se filtró y se enjuagó con agua
hasta que el pH de las aguas madre fue neutro (pH
5-7). El filtrado de color marrón se disolvió en
metanol a ebullición (150 ml), se dejó enfriar a temperatura
ambiente para formar una pasta espesa y se enjuagó con metanol frío
(hielo) para eliminar la mayor parte de la impureza marrón,
obteniéndose
4,8-dimetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-cumarina
(67,7 g, rend. de 99,9%) en forma de un sólido blancuzco. p.f.
95-96ºC. RMN: \delta 1,57 (d, J = 6,7 Hz, 3H),
2,19 (s, 2H), 2,39 (s, 6H), 4,73 (q, J = 6,9 Hz, 1H), 6,17 (s, 1H),
6,63 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 8,9 Hz, 1H).
Etapa
2
Se calentó durante 2-4 horas a
70-85ºC una suspensión de
4,8-dimetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-cumarina
(67,5 g, 0,260 mol), NaOH acuoso al 10% (114 ml, 0,286 mol) y agua
(900 ml). Se dejó luego enfriar la mezcla a temperatura ambiente.
Se filtró el sólido y luego se enjuagó con agua fría (1,5 l) hasta
que las aguas madre eran incoloras y el pH era neutro (pH
5-7). El producto se secó al aire y en vacío,
obteniéndose 4,4',5',8-tetrametilpsoraleno (56,3 g,
89,5%) en forma de un sólido blanco. p.f. 197-199ºC.
RMN: \delta 2,19 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,56 (s,
3H), 6,23 (s, 1H), 7,40 (s, 1H).
Etapa
3
Se disolvió
4,4',5',8-tetrametilpsoraleno seco (10,00 g, 41,3
mmol) en cloruro de metileno (180 ml) a temperatura ambiente. Se
añadió N-bromo-succinimida (8,09 g,
45,3 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 4,5 horas. Se
eliminó completamente el disolvente y el sólido resultante se agitó
con agua (200 ml) durante 0,5-1 h, se filtró y se
trituró en frío con más agua (aproximadamente 500 ml) para eliminar
completamente el subproducto de succinimida. El producto en bruto
(esto es,
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno)
se secó en un desecador a vacío con P_{2}O_{5} y luego se
recristalizó, obteniéndose
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(10,2 g), un sólido de color amarillo pálido. Se limpiaron las
aguas madre y se recristalizó nuevamente con tolueno (660 ml),
obteniéndose una segunda cosecha de producto (1,08 g, rend.
combinado 85,1%, pureza > 99% por RMN). p.f.
206-207º. RMN: \delta 2,50 (s, 3H), 2,54 (d, J =
1,2 Hz, 3H), 2,58 (s, 3H), 4,63 (s, 2H), 6,28, (q aparente, J = 1,3
Hz, 1H), 7,59 (s, 1H).
"Ejemplo 3" es numeración que no se
emplea.
En este ejemplo se describen dos procedimientos
de síntesis del compuesto 2. El primer procedimiento se realizó como
sigue:
Etapa
1
Se agitaron en dimetiformamida seca (65 ml)
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(3,09 g, 9,61 mmol) (síntesis descrita en el Ejemplo 2) y
N-(2-hidroxietil)ftalimida (4,05 g, 21,2
mmol. Se hizo burbujear nitrógeno gas seco suavemente en la mezcla
de reacción. La mezcla de reacción se agitó a 100ºC durante 4,5
horas y luego se dejó que enfriara a temperatura ambiente y se
mantuvo en la nevera durante varias horas. Se filtró el producto
cristalino y se lavó con MeOH y seguidamente con H_{2}O. El sólido
se trituró con MeOH (100 ml) para eliminar las impurezas. El
producto en bruto se secó al aire y se disolvió en CHCl_{3} (150
ml). Se añadió carbono activado y gel de sílice para decolorar y se
eliminó completamente el CHCl_{3}. El producto blanco resultante,
4'-[4-(N-ftalimido)-2-oxa]butil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
(1,56 g, rend. 37,5%) tenía una pureza >99% tanto por RMN como
por HPLC. p.f. 224-225ºC. RMN.(CDCl_{3}): \delta
2,37 (s, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 3,78 (s, 4H), 4,59 (s,
2H), 6,22 (s, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,50 (m, 4H).
Etapa
2
Se puso en suspensión
4'-[4-(N-ftalimido)-2-oxa]butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(1,56 g, 3,61 mmol) en tetrahidrofurano (75 ml) a temperatura
ambiente. A la suspensión se añadió metilamina (solución acuosa al
40%, 25 ml, 290 mmol) y se agitó durante la noche. Se eliminaron
completamente el disolvente y la metilamina. El sólido resultante
se recibió en solución acusa 0,3N de HCl (25 ml). La suspensión
ácida se enjuagó tres veces con 40 ml de CHCl_{3} y luego se
llevó a pH 11 con NaOH acuoso al 20%. Se usó CHCl_{3} (3x60 ml
para extraer el producto (esto es,
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno)
de la capa basificada. Se combinaron las capas de CHCl_{3} y la
combinación se lavó con H_{2}O (100 ml) y seguidamente con
salmuera (100 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se
concentró, obteniéndose
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno,.
p.f. 139-141ºC. La pureza era mayor que 99% por
RMN. RMN (CDCl_{3}): \delta 2,50 (s, 6H), 2,58 (s, 3H), 2,90
(t, J = 5,27 Hz, 2H) 3,53 (t, J = 5,17 Hz, 2H), 4,66 (s, 2H), 6,25
(s, 1H), 7,61 (s, 1H). El
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
se disolvió en etanol absoluto (150 ml), se añadió una solución
1,0M de HCl en éter (10 ml) y la solución se enfrió durante la
noche en nevera. Después de filtración y lavado con éter, el sólido
se secó en vacío, obteniéndose cristales de color amarillo pálido
(0,76 g, rend. de 62%). p.f. 235-236ºC.
Alternativamente, la Etapa 2 se puede realizar
usando hidracina o butilamina en vez de metilamina. Para síntesis a
gran escala se prefiere el procedimiento que usa butilamina porque,
si bien es cierto que se necesita un exceso de metilamina debido a
volatilización, no éste el caso para la butilamina. El procedimiento
usando butilamina se realizó como sigue: se han desprotegido con
n-butilamina en propanol 28,3 g de ftalimida. La
solución de reacción en bruto se trata luego con HCl para precipitar
el producto. Así, la mezcla de reacción en 285 ml de
1-propanol se trató con gas HCl a pH 2. La mezcla se
agitó a 5ºC durante 0,5 horas, luego se filtró y lavó con
disolvente frío (3x15 ml), obteniéndose 20,5 g de
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
en bruto (rend. de 92%).
El procedimiento que usa hidracina se realizó
como sigue. Se desprotegió con hidracina el precursor de ftalimida
(6 mol) y, después de concentración y extracciones
ácido-base, se obtuvo la amina en bruto en 30 l de
dicloruro de etileno. A éste se añadió Gas HCl (0,14 kg) mediante
un tubo de dispersión durante 40 min manteniendo la temperatura a
15-25ºC. La suspensión resultante se agitó durante 1
hora más. Se recogieron los sólidos en un embudo Buchner. Después
de secar en un secador de aire a 80ºC durante 2 horas, se obtuvieron
0,945 kg de
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
en bruto. 0,94 kg de producto en una mezcla de 7,5 kg de
isopropanol y 1,88 kg de agua se mantuvo a reflujo durante 30 min y
luego se filtró en caliente. La solución se enfrió a temperatura
ambiente durante 1 hora y luego se enfrió a 15-20ºC
durante 0,5 horas. Los sólidos se recogieron en un embudo Buchner y
luego se lavaron con isopropanol frío (0,3 l). Los sólidos húmedos
se pasaron a bandejas de vidrio y se secaron en vacío (\geq28
min) a aproximadamente 75ºC durante 11,5 horas. El contenido de
humedad era de 0,5%. Se obtuvieron 0,758 g (rend. de 81%). El
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
era analíticamente puro. Según RMN, el isopropanol residual era de
aproximadamente 1700 ppm.
El primer procedimiento es una realización
preferente de la presente invención a causa de su alto rendimiento
y pureza.
El segundo procedimiento se inicia con la
preparación de
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
a partir de 4,5',8-trimetilpsoraleno comercial como
se ha descrito antes. La síntesis de hidrocloruro de
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
se hace en 4 etapas.
Etapa
1
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(550 mg, 1,99 mmol) y etilenglicol (6,8 ml, 121,9 mmol) se
calentaron en acetona (6 ml) a 50-60ºC durante 3,5
h. Después de calentar durante 2 h, la suspensión blanca se había
convertido en una solución ligeramente amarilla. Se eliminaron la
acetona y el etilenglicol en un rotoevaporador y al residuo se
añadió agua (50 ml). La suspensión resultante se filtró, se lavó con
agua fría y luego se secó en horno de vacío, obteniéndose 574 mg
(96%) de
4'-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
RMN (CDCl_{3}) \delta: 2,51 (s, 6H), 2,58 (s, 3H), 3,62 (t, J =
4,5 Hz, 2H), 3,78 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 4,70 (s, 2H), 6,26 (d, J =
1,1 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H).
Etapa
2
Se disolvió
4'-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(574 mg, 1,9 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (6 ml) bajo nitrógeno a
\leq10ºC. Se añadió trietilamina (359 mg, 3,55 mmol). Se añadió
lentamente gota a gota cloruro de metanosulfonilo (305 mg, 266
mmol) manteniendo la temperatura por debajo de 10ºC. Finalizada la
adición, la mezcla se agitó durante 15 min más y luego se agitó a
temperatura ambiente durante 10 horas. A la suspensión que había
reaccionado se añadió CH_{2}Cl_{2} (45 ml) y la mezcla se lavó
con agua (3x20 ml), luego se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro.
La concentración a 30ºC o menos seguida de secado en vacío dio
4'-[(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
en forma de un sólido amarillo (706 mg, 98%). p.f
138-140ºC. RMN \delta: 2,51 (s, 3H), 2,52 (d, 3H),
2,58 (s, 3H), 2,99 (s, 3H), 3,77 (m, 2H), 4,39 (m, 2H), 4,71 (s,
2H), 6,26 (s, 1H), 7,62 (s, 1H).
Etapa
3
Se mantuvieron a reflujo durante 8 horas en
alcohol etílico al 95%
4'-[(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(706 mg, 1,86 mmol) y azida sódica (241 mg, 3,71 mmol). La solución
de reacción se enfrió y se añadió agua fría (55 ml). El sólido
blancuzco se filtro y se lavó con agua fría. Después de secar en
vacío, se obtuvo la azida (esto es,
4'-(4-azido-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno)
en forma de un sólido ligeramente amarillento (575 mg, 95%). p.f.
105-106ºC. RMN: \delta 2,51 (s, 6H), 2,58 (s, 3H),
3,41 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 3,67 (t aparente, J = 4,9 Hz, 2H), 4,70
(s, 2H), 6,26 (s, 1H), 7,66 (s, 1H).
Etapa
4
El
4'-(4-azido-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(1,65 g, 5,03 mol) se disolvió en tetrahidrofurano (10 ml). A la
solución anterior se añadieron trifenilfosfina (1,59 g, 6,08 mmol) y
seis gotas de agua. Después de agitar a temperatura ambiente
durante la noche, se concentró la solución de color amarillo claro.
El residuo se disolvió en CHCl_{3} (90 ml) y se sometió a
extracción con HCl acuoso 0,3N (30 ml, luego 2x5 ml). La
combinación de las capas de HCl se trató cuidadosamente con
K_{2}CO_{3} hasta saturación. La solución básica se sometió a
extracción con CHCl_{3} (3x60 ml). Las capas de CHCl_{3}
combinadas se lavaron con 60 ml de agua, 60 ml de de salmuera y se
secaron sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. Después de concentración y
secado en vacío, se obtuvo la amina en forma de un sólido amarillo
(1,25 g, 82%). p.f. 139-141ºC. RMN \delta 2,48
(s, 6H), 2,55 (s, 3H), 2,89 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,52 t, J = 6 Hz,
2H), 4,64 (s, 2H), 6,22 (s, 1H), 7,59 (s, 1H).
La amina se disolvió en etanol absoluto (40 ml)
y se añadieron 20 ml de HCl 1N en etil éter. Después de dejar en
reposo durante la noche a 5ºC, se filtró el precipitado y se enjuagó
con éter, obteniéndose 1,25 g del compuesto 2. p.f. 236ºC
(descomp.). RMN ^{13}C: 8,54, 12,39, 19,18, 38,75, 62,26, 65,80,
108,01, 112,04, 112,42, 112,97, 116,12, 125,01, 148,76, 153,97,
154,37, 155,76, 160,34.
Análisis calculado para
C_{17}H_{20}ClNO_{4}: C 60,45; H 5,97; N 4,15. Hallado: C
60,27; H 5,88; N 4,10.
Se preparó análogamente, haciendo reaccionar
4'-CMT con 1,3-propanodiol según la
Etapa 1 y procediendo análogamente a lo largo de la Etapa 4,
4'-(5-amino-2-oxa)pentil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(compuesto 4). p.f. 212-214ºC (descomp.). RMN de la
base libre: \delta 1,73 (pent, J = 6,4 Hz, 2H), 2,45 (s, 3H), 2,51
(s, 3H), 2,78 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 3,54 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 4,59
(s, 2H), 6,18 (s, 1H), 7,54 (s, 1H).
"Ejemplo 5" es numeración que no se
emplea.
En este ejemplo se describe la síntesis del
compuesto 7. La síntesis de hidrocloruro de
4'-(7-amino-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
se realiza en 4 etapas:
Etapa
1
Se calentaron a reflujo durante 11,5 horas
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(589 mg, 2,13 mmol), dietilenglicol (15,4 g, 145 mmol) y acetona
(13 ml). La solución de reacción se concentró para eliminar la
acetona y parte del dietilenglicol. A la solución marrón claro
resultante se añadió CHCl_{3} (40 ml), luego se lavó con agua
varias veces. La capa de CHCl_{3} se secó sobre Na_{2}SO_{4}
anhidro y se concentró, resultando 781 mg de producto,
4'-(7-hidroxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(\approx100%). RMN \delta 2,46 (d, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,51 (s,
3H), 3,58-3,67 (m, 8H), 4,67 (s, 2H), 6,18 (s, 1H),
7,57 (s, 1H).
Etapa
2
Se disolvió
4'-(7-hidroxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(781 mg, 2,25 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (2,5 ml) bajo corriente de
N_{2} a menos de 10ºC. Se añadió trietilamina (363 mg, 3,59 mmol).
Se añadió lentamente cloruro de metanosulfonilo (362 mg, 3,16 mmol)
gota a gota manteniendo la temperatura por debajo de 10ºC.
Terminada la adición, la mezcla se mantuvo por debajo de 10ºC
durante 15 minutos más. La mezcla se agitó a temperatura ambiente
durante la noche y luego se añadió CH_{2}Cl_{2} (50 ml). La
solución se lavó con agua (3x60 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4}
anhidro y se concentró a \leq30ºC. Después de secado en vacío, se
obtuvo un líquido espeso de color marrón claro
[4'-(7-metanosulfoniloxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno];
437 mg (76%). RMN \delta 2,50 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,58 (s,
3H), 3,01 (s, 3H), 3,66 (m, 4H), 3,77 (t, J = 4,6 Hz, 2H), 4,37 (t,
J = 6 Hz, 2H), 4,69 (s, 2H), 6,25 (s, 1H), 7,61 (s, 1H).
Etapa
3
Se tuvieron a reflujo en 3 ml de alcohol
etílico al 95% durante 8 horas
[4'-(7-metanosulfoniloxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno]
(288 mg, 0,678 mmol) y azida sódica (88,2 mg, 1,36 mmol). Se dejó
enfriar la solución de reacción y se añadió agua fría (50 ml). Se
desechó la capa de agua. El material en bruto se purificó por
cromatografía sobre gel de sílice (con cloroformo como eluyente) en
un cromatógrafo Chromatotron (Harrison Research, Inc., Palo Alto,
CA) y se secó en vacío para obtener un líquido espeso ligeramente
amarillo,
4'-(7-azido-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(123 mg, 49%). RMN \delta 2,50 (s, 6H), 2,57 (s, 3H), 3,39 (t, J
= 5,2 Hz, 2H), 3,68 (m, 6H), 4,70 (s, 2H), 6,24 (s, 1H), 7,62 (s,
1H).
Etapa
4
Se disolvieron
4'-(7-azido-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(122 mg, 0,33 mmol), trifenilfosfina (129 mg, 0,49 mmol) y varias
gotas de agua en tetrahidrofurano (2 ml). La solución transparente
de color ligeramente amarillo se agitó a temperatura ambiente
durante el fin de semana; no se detectó por TLC material de partida.
Se concentró la solución de reacción y el residuo se disolvió e
CHCl_{3} (20 ml). La solución se sometió a extracción con
solución acuosa 0,15N de HCl (10 ml, luego 2x5 ml) y las capas de
HCl se llevaron a pH 13 añadiendo solución acuosa de NaOH al 20%.
La solución básica se sometió a extracción con CHCl_{3} (3x15
ml). Se combinaron las capas de CHCl_{3} y la combinación se lavó
con agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se concentró y se
secó en vacío, obteniéndose 63,9 mg de producto,
4'-(7-amino-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(56%). La TLC reveló sólo una mancha. RMN \delta 2,50 (s, 3H),
2,50 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,57 (s, 3H), 2,86 (t, J = 5,3 Hz, 2H),
3,50 (t, J = 5,3 Hz, 2H), 3,63 (s, 4H), 4,70 (s, 2H), 6,24 (s, 1H),
7,62 (s, 1H). p.f. 170-173ºC.
El sólido se disolvió en etanol absoluto. Luego
se añadió HCl 1M en etil éter, se filtró la suspensión y el producto
se enjuagó con éter y se secó.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de dihidrocloruro de
4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetilpsoraleno
se realiza en una etapa a partir del producto del Ejemplo 5,
procedimiento 2, Etapa 2: Una solución de
4'-(7-metanosulfoniloxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(108 mg, 0,253 mmol) en 8 ml de acetonitrilo se añadió lentamente a
1,4-diaminobutano (132 mg, 1,49 mmol) en 2,8 ml de
acetonitrilo. Después de calentar a reflujo durante 8 horas, no
quedaba material de partida según TLC. La mezcla de reacción se
enfrió a temperatura ambiente y se añadió CHCl_{3} (25 ml) y
solución acuosa 1N de NaOH (25 ml). Se separaron las capas y se usó
CHCl_{3} (2x10 ml) para lavar la capa acuosa. Para extraer el
producto de las capas orgánicas combinadas se usó HCl acuoso (0,3N,
3x10 ml). Las capas de HCl se trataron con solución acuosa de NaOH
al 20% hasta pH 13. La combinación de capas básicas se sometió luego
a extracción con CHCl_{3} (3x20 ml). La capa de CHCl_{3} se
lavó con solución acuosa saturada de NaCl (10 ml) y luego se secó
sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. Después de concentración y secado en
vacío, se obtuvieron 63 mg de producto, dihidrocloruro de
4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(60%). RMN \delta 1,45 (m, 2H), 2,49 (s, 6H), 2,55 (s, 3H), 2,58
(t, 2H), 2,66 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 2,76 (m, 4H),
3,55-3,61 (m, 6H), 4,68 (s, 2H), 6,22 (s, 1H), 7,61
(s, 1H).
La síntesis de
4'-(2-aminoetil)-4,5',8-trimetilpsoraleno
se efectúa en una etapa: se obtuvo trifluoroacetoxiborohidruro
sódico añadiendo ácido trifluoroacético (296 mg, 2,60 mmol) en 2 ml
de THF a una suspensión en agitación de borohidruro sódico (175 mg,
4,63 mmol) en 2 ml de THF a lo largo de 10 minutos a temperatura
ambiente. La suspensión resultante se añadió a una suspensión de
4'-cianometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(Kaufman y otros, J. Heterocyclic Chem. 19:1051 (1982)) (188 mg,
0,703 mmol) en 2 ml de THF. La mezcla se agitó durante la noche a
temperatura ambiente. A la solución transparente ligeramente
amarilla resultante de la reacción se añadieron varias gotas de
agua a menos de 10ºC para descomponer el exceso de reactivo. La
mezcla resultante se concentró y se añadió solución acuosa 1N de
NaOH (30 ml). Se usó luego cloroformo (30 ml, después 10 ml, 5 ml)
para extraer la amina resultante. Se combinaron las capas de
CHCl_{3} y la combinación se secó con solución saturada de NaCl.
La amina se extrajo luego en HCl 0,3N (10, 5, 5 ml) y las capas
ácidas se llevaron a pH 13 con solución acuosa de NaOH al 20%. Se
usó CHCl_{3} (3x10 ml) para extraer la amina de la combinación de
capas básicas, luego se lavó con agua (2 ml) y se secó sobre
sulfato sódico anhidro. Después de concentración y secado en vacío
se obtuvo la amina en forma de un sólido; pureza >95% según RMN.
RMN \delta 2,45 (s, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,53 (s, 3H), 2,78 (t, J =
6,6 Hz, 2H), 3,00 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 6,20 (s, 1H), 7,44 (s, 1H).
El sólido se disolvió en etanol absoluto. Se añadió una solución de
cloruro de hidrógeno en dietil éter (1N, 1 ml). La suspensión se
filtró para obtener el compuesto 3, un sólido morado claro (32,7 mg,
rend. 15%). p.f.> 237ºC (descomp.)
(Referencia)
La síntesis de
4'-(6-amino-2-aza)hexil-4,5',8-trimetilpsoraleno
se efectúa en una etapa como sigue: Se añadió una solución de
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(188 mg, 0,68 mmol) en 30 ml de acetonitrilo a una solución de
1,4-diaminobutano (120 mg, 1,4 mmol) en 7 ml de
acetonitrilo. Después de agitar durante la noche, se eliminó el
disolvente a presión reducida. Al residuo se añadió cloroformo (10
ml) y NaOH 1N (10 ml) y la mezcla se sacudió y separó. La solución
acuosa se sometió a extracción con más CHCl_{3} (2x10 ml) y la
combinación de los extractos se enjuagó con agua. El producto se
extrajo luego de la solución de CHCl_{3} con HCl acuoso 0,3N y la
capa ácida se llevó a pH 12 con solución concentrada de NaOH. La
suspensión básica se sometió a extracción con CHCl_{3} que luego
se enjuagó con agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró a
presión reducida, obteniéndose la amina como base libre. RMN
(CDCl_{3}): \delta 1,33 (m, 3H), 1,52 (m, 4H), 2,47 (s, 3H),
2,49 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,68 (q, J = 6,5 Hz, 4H),
3,86 (s, 2H), 6,21 (d aparente, J = 1,1 Hz, 1H), 7,60 (s, 1H).
La base libre, disuelta en aproximadamente 6 ml
de etanol absoluto, se trató con una solución de HCl en éter (1,0M,
3 ml). La sal HCl resultante se filtró, se enjuagó con EtOH absoluto
y se secó en vacío, obteniéndose 150 mg del compuesto 6 (55%). p.f.
290ºC (descomp.). Análisis calculado para
C_{19}H_{26}C_{12}N_{2}O_{3}\cdotH_{2}O: C 54,42; H
6,73; N 6,68. Hallado: C 54,08; H 6,45; N 6,65.
De manera similar se prepararon los compuestos
siguientes, indicándose las diferencias en la síntesis:
(a) dihidrocloruro de
4'-(4-amino-2-aza)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(compuesto 1). p.f. 320-322ºC (descomp.). En esta
síntesis se usó etilendiamina como diamina.
(b) dihidrocloruro de
4'-(5-amino-2-aza)pentil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(compuesto 5). p.f. 288ºC (descomp.). RMN de la base libre: \delta
1,33 (s anc, 3H), 1,66 (pent, J = 6,8 Hz, 2H), 2,47 (s, 3H), 2,50
(d, J = 1 Hz, 3H), 2,55 (s, 3H), 2,6-2,85 (m, 4H),
3,89 (s, 2H), 6,22 (d aparente, J = 1 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H). Para
esta síntesis se usó 1,3-diaminopropano como
diamina.
(c) dihidrocloruro de
4'-(7-amino-2-aza)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
(compuesto 10). p.f. 300ºC (descomp.). RMN de la base libre:\delta
1,22 (s anc), 1,3-1,6 (m, total 9H), 2,44 (s), 2,50
(s, total 9H), 2,63 (m, 4H), 6,17 (s, 1H), 7,56 (s, 1H). Aquí se uso
1,5-diaminopentano como diamina.
"Ejemplo 10" es numeración que no se
emplea.
La síntesis de tetrahidrocloruro de
4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5'-8-trimetilpsoraleno
se realiza en una (1) etapa como sigue: A una solución de 0,5 g
(2,5 mmol) de espermina (Aldrich, Milwakee, WI) en 10 ml de metanol
se añadió una solución metanólica 5N de HCl (HCl concentrado diluido
con HCl a 5N) para ajustar el pH a 5-6 y
seguidamente 0,128 g (0,5 mmol) de
4,5',8-trimetilpsolaren-4'-carboxaldehído,
20 mg (0,3 mmol) de NaBH_{3}CN y 3 ml de MeOH. La mezcla de
reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se
añadió una solución metanólica 5N de HCl hasta pH<2 y se eliminó
el metanol a presión reducida. El residuo se recibió en
aproximadamente 100 ml de agua y se enjuagó con tres porciones de
CHCl_{3}. La solución acuosa se llevó a pH > 10 con NaOH
concentrado y se extrajo con tres porciones de CHCl_{3}. Se
combinaron estos extractos finales y la combinación se lavó con
agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó, obteniéndose la base
libre de la amina. Pureza \geq 95% por RMN. RMN (CDCl_{3}):
\delta 1,31 (m, 5H), 1,45 (pent, J = 3,41 Hz, 4H), 1,65 (m, 4H),
2,46 (s, 3H), 2,49 (d, J = 1,14 Hz, 3H), 2,66 (m, 15H), 3,85 (s,
2H), 6,21 (s, 1H), 7,60 (s, 1H).
La amina libre se disolvió en etanol absoluto y
se añadió HCl (anhidro, 1N en etil éter). Se filtró la sal
hidrocloruro, se lavó con etanol absoluto y se secó a vacío a
temperatura ambiente, obteniéndose 80,2 mg de producto,
tetrahidrocloruro de
4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5'-8-trimetilpsoraleno,
en forma de un sólido de color amarillo pálido.
Se usó en este ejemplo un ensayo del
bacteriófago r-17 para predecir la eficacia de
inactivación del patógeno y determinar la unión a ácido nucleico de
los compuestos de unión fotorreactivos de la presente invención. En
el ensayo de r-17, el bacteriófago se puso en
solución con cada compuesto ensayado y luego se irradió. Se midió
la capacidad del fago de infectar seguidamente bacterias e inhibir
su crecimiento. El bacteriófago se seleccionó por su ácido nucleico
relativamente accesible de manera que la inhibición del crecimiento
del cultivo reflejaría con precisión el daño del ácido nucleico por
los compuestos a ensayar. El ensayo de bacteriófago para unir ácido
nucleico a compuestos a ensayar ofrece un procedimiento seguro y
barato para identificar compuestos que probablemente presentan una
inactivación eficaz de patógenos. Experimentos anteriores revelan
que el ensayo de r-17 mide con precisión la
sensibilidad de HIV-1 a compuestos similares.
Se hizo crecer r-17 en bacterias
Hfr 3000, de título aproximadamente 5x10^{11} (R17 y Hfr 3000 se
obtuvieron de la American Tissue Culture Collection (ATCC),
Washington, DC). La solución madre de fago R17 se añadió a una
solución de suero fetal bovino al 15% en medio Eagle modificado de
Dulbecco (DMEM) a una concentración final de fagos de 10^{9}/ml.
Se pasó una parte alícuota (0,5 ml) a un tubo de polietileno de 1,5
ml de cierre superior de apertura rápida. Se añadió al tubo una
parte alícuota (0,004-0,040 ml) de la solución madre
del compuesto a ensayar preparada en agua, etanol o sulfóxido de
dimetilo a 0,80-8,0 mM. Los compuestos se ensayaron
a concentraciones entre 4 \muM y 320 \muM. (AMT es asequible
comercialmente de HRI Inc., Concord, CA; 8-MOP es
asequible comercialmente de Sigma, St. Louis, MO). Los tubos se
pusieron en un dispositivo de luz como se describe en el Ejemplo 1
y se irradiaron entre 1 y 10 minutos. Se prepararon tubos de
dilución de 13 ml estériles; cada compuesto de ensayo requería un
tubo con 0,4 ml de caldo Luria (LB) y 5 tubos que contenían 0,5 ml
de caldo LB. Para hacer las diluciones, se añadió una parte alícuota
de 0,100 ml de la solución irradiada de fago y compuesto a ensayar
al primer tubo de dilución de 0,4 ml de medio y luego se añadieron
0,020 ml de esta solución al segundo tubo de 0,5 ml de medio
(1:25). Luego se diluyó serialmente (1:25) la segunda solución en
los tubos restantes. A cada muestra diluida se añadieron 0,050 ml de
bacterias Hfr 3000 cultivadas durante la noche y 3 ml de agar de
cobertura de LB, y los materiales mezclados se vertieron en placas
de caldo LB. Después de que hubiera endurecido el agar de
cobertura, se incubaron las placas a 37ºC durante la noche. Se
contaron a la mañana siguiente las unidades que formaban placas y se
calculó el título de los fagos remanentes después del
fototratamiento basándose en los factores de dilución.
Se realizaron los controles siguientes: el
"fago solo", en el que no se trató el fago con el compuesto a
ensayar y no se irradió (designado "título de partida" en las
tablas siguientes); el "UV sola", en el que el fago se irradió
sin estar presente el compuesto a ensayar; y el control
"oscuro", en el que la solución de fago/compuesto a ensayar no
se irradió antes de que se diluyera y plaqueara.
La Tabla 5 que sigue presenta tres experimentos
diferentes en los que se ensayó el compuesto 1 de acuerdo con el
protocolo de R17 que acaba de describirse. Una comparación de los
valores para las muestras de control en las tandas
1-3 (valores en negrita) revela que ni los controles
"UV sola" ni "oscuro" dan por resultado una mortalidad
significativa de bacterias. (como máximo 0,3 logs inactivados en el
control "UV sola" y 0,1 logs inactivados en el control
"oscuro").
El control "UV sola" se repitió en muchos
experimentos similares con otros compuestos de la presente invención
y consistentemente no presentó mortalidad significativa. (No se
muestran datos). Así, el control "UV sola" no se presenta en
las tablas y figuran siguientes, aunque se realizó en cada
experimento de este ejemplo. Para el control "oscuro", después
de muchos intentos con varios compuestos de la presente invención,
era obvio que no se observó inactivación bacteriana significativa
experimentalmente sin irradiación independientemente del tipo de
sustitución en la posición 4' del psoraleno. (No se muestran datos).
Por ejemplo, en la Tabla 5, el experimento 1 muestra 0,1 logs
inactivados. Con el compuesto 1 a oscuras. Por el contrario, cuando
el compuesto 1 se irradió durante solamente 1 minuto, la caída del
título resultante es >6,7 logs. Por tanto, los controles
"oscuros" no se realizaron para compuestos ensayados más tarde
y no se presentan en las tablas y cifras que siguen.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes Tablas 6-9 y Fig.
11-13 presentan los resultados del ensayo de R17
para varios compuestos de psoraleno 4'-sustituidos
con amino primario. Los datos de las Tablas 7 y 8 aparecen en las
Fig. 11 y 12, respectivamente. Los compuestos de psoraleno
5'-sustituidos con amino primario (ejemplos
comparativos) que tienen sustituciones en la posición 5' similares
a los compuestos de psoraleno 4'-sustituidos con
amino primario, se ensayaron también a concentraciones variables,
como se ha descrito antes en este ejemplo, y presentan una eficacia
de inactivación comparable. Los resultados de estos compuestos se
presentan en las Fig. 14 y 15.
\newpage
Los compuestos de la presente invención que
tienen sustituciones en la posición 4' del anillo de psoraleno
demostraron ser activos para inactivar R17 como se muestra en las
tablas siguientes:
En la Tabla 7 es aparente que el compuesto 1
exhibe una eficacia de inactivación de R17 mucho más alta que
8-MOP. Como se ve en la Tabla 7 y la Fig.11, el
compuesto 1 es uno de los compuestos menos activos. Ambos
compuestos, 2 y 3, presentan un log de inactivación más alto que el
compuesto 1 en cada punto de concentración. Estos resultados apoyan
la teoría de que generalmente los compuestos son mucho más activos
que el 8-MOP.
Los compuestos de la presente invención tienen
también una eficacia de inactivación de R17 similar o mejor que
AMT. En las Tablas 7 y 8 y las Fig. 11-15, todos los
compuestos de la presente invención consiguen un log de
inactivación de R17 a niveles comparables a los de AMT. Los
compuestos 2 y 3 (Tabla 6, Fig. 11), los compuestos 5 y 6 (Tabla 8,
Fig. 12) y el compuesto 16 (Fig. 15) presentan una eficacia de
inactivación significativamente más alta que AMT.
Los compuestos de la presente invención se
ensayaron también a niveles constantes para dosis variables de luz
UV. Se prepararon tres conjuntos de tubos de 1,5 ml que contenían
partes alícuotas de 0,6 ml de R17 en DMEM (preparado como se ha
descrito antes). El compuesto ensayado se añadió a la concentración
deseada y las muestras se agitaron en un vórtice. Las muestras se
irradiaron luego a intervalos de 1,0 J/cm^{2} hasta alcanzar 3,0
J/cm^{2}. Entre cada intervalo de 1,0 J/cm^{2} se extrajeron de
cada muestra 100 \mul y se pusieron en el primer tubo de dilución
correspondiente. Luego se realizaron 5 diluciones secuenciales para
cada compuesto ensayado, a las 3 dosis de irradiación, como se ha
descrito antes en este ejemplo.
Luego se añadieron a cada tubo 50 \mul de
bacterias Hfr 3000, 3 ml de agar de cobertura y se volvió a agitar
en un vórtice el contenido de los tubos. El contenido de cada tubo
se vertió en su propia placa de LB y las placas se incubaron
durante la noche a 37ºC. Se hizo el recuento de las placas por
inspección visual a la mañana siguiente.
En las Fig. 16-22 se presentan
los resultados del ensayo para varios compuestos de psoraleno 4'- y
5'-amino primario-sustituidos.
Estos datos confirman además que los compuestos son comparables con
AMT en cuanto a su capacidad de inactivar R17. Además, los
compuestos 6 (Fig. 16), (10 (Fig. 17), 12 (Fig. 18), 15 (Fig. 19 y
22) y el compuesto 17 (Fig. 20) eran más eficaces en la para
inactivación de R17 que AMT.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la eficacia de inactivación de
patógenos de varios compuestos de la presente invención examinando
la capacidad de los compuestos para inactivar virus acelulares
(HIV). La inactivación de HIV acelular se realizó como sigue:
Como en el ensayo de R17, se añadieron pequeñas
partes alícuotas de los compuestos de las Tablas 10 y 11,
siguientes a las concentraciones dadas en las tablas, a una solución
madre de HIV-1 a un total de 0,5 ml. La solución
madre de HIV (10^{5}-10^{7} unidades/ml que
forman placa) estaba en DMEM/FBS al 15%. Las partes alícuotas de
0,5 ml se pusieron en placas de cultivo de poliestireno de 24
pocillos y se irradiaron con 320-400 nm (20
mW/cm^{2}) durante 1 min en un dispositivo similar al dispositivo
del Ejemplo 1. El dispositivo de fotoactivación usado aquí se
ensayó previamente y se encontró que daba resultados de exposición a
la luz comparables con los del dispositivo del Ejemplo 1. (No se
muestran datos). Los controles incluían la solución madre de
HIV-1 solo, HIV-1 más UVA sola y
HIV-1 más la máxima concentración de cada psoraleno
ensayado, sin UVA. Después de la irradiación, todas las muestras se
almacenaron congeladas a -70ºC hasta que se ensayaron para
determinar a la capacidad de infección por el ensayo en placa de
microtitulación. Se separaron las partes alícuotas para la medición
de la capacidad de infección por HIV en las muestras tratadas con un
compuesto de la presente invención y se cultivaron.
La capacidad residual de infección de HIV se
ensayó usando un ensayo de capacidad de infección
MT-2. (Descrito previamente por Hanson, C.V.,
Crowford-Miksza, L y Sheppard, H.W., J. Clin. Micro
28:2030 (1990)). El medio de ensayo era DMEM al 85% (con una
concentración alta en glucosa) que contenía 100 \mug de
estreptomicina, 100 U de penicilina, 50 \mug de gentamicina y 1
\mug de anfotericina B por ml, 15% de FBS y 2 \mug de Polybrene
(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) por ml. Las muestras de ensayo y
las de control del procedimiento de inactivación se diluyeron en
50% de medio de ensayo y 50% de plasma normal humano combinado. Las
muestras se diluyeron serialmente directamente en placas de 96
pocillos (Corning Glass Works, Corning, N.Y.). Las placas se
mezclaron en una mesa con agitación oscilante durante 30 segundos y
se incubaron a 37ºC en atmósfera con 5% de CO_{2} durante
1-18 horas. A cada pocillo se añadieron células
MT-2 (0,025 ml) [clon alfa-4,
asequibles (nº. de catalogo 237) de National Institutes of Health
AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, Md] para
obtener una concentración de 80.000 células por pocillo. Después de
1 hora más de incubación a 37ºC en atmósfera con 5% de CO_{2}, se
añadieron a cada pocillo 0,075 ml de medio de ensayo que contenía
1,6% de agarosa SeaPlaque (FMC Bioproducts, Rockland, Maine),
precalentado a 38,5ºC. Las placas se mantuvieron a 37ºC durante
unos pocos minutos hasta que se habían acumulado varias placas y
luego se centrifugaron en soportes de placas a 600xg durante 20 min
en una centrifugadora preenfriada a 10ºC. En la centrifugadora se
formaron monocapas de células antes de que gelificara la capa de
agarosa. Las placas se incubaron a 37ºC durante 5 días en atmósfera
con 5% de CO_{2} y se tiñeron añadiendo a cada pocillo 0,05 ml de
yoduro de propidio (Sigma Chemical Co.) en solución salina
tamponada con fosfato (pH 7,4). Después de 24 a 48 horas, se
examinaron visualmente las microplacas teñidas en rojo por
fluorescencia poniendo las placas en una caja de luz ultravioleta
de 304 nm de 8.000 \muW/cm^{2} (Fotodyne, Inc., New Berlin,
Wis.). Las placas se contaron a un aumento de x20 a x25 con un
estereomicroscopio. Los resultados se presentan en las siguientes
Tablas 10 y 11. "n" representa el número de tandas para las
que el punto de datos es una media.
Los resultados revelan que los compuestos son
eficaces para inactivar HIV. De hecho, los datos para
concentraciones de 64 \muM de compuesto o más altas sugieren que
los compuestos 2 y 3 son significativamente más activos que AMT,
que anteriormente se había pensado que era uno de los psoralenos
antivirales más activos. A concentraciones más bajas, el compuesto
6 es capaz de matar un log de HIV más alto (3,1 logs a 32 \muM)
que el AMT (2,5 logs a 32 \muM). Los otros compuestos de la Tabla
9 presentan una eficacia de inactivación del mismo intervalo que
AMT.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe el protocolo de
inactivación del virus de hepatitis B de pato (DHBV), un modelo para
el virus de hepatitis B, usando compuestos de la presente
invención.
Se añadió DHBV en yema de huevo de pato a un
concentrado de plaquetas (PC) a una concentración final de 2 x
10^{7} partículas por ml y se mezcló sacudiendo suavemente durante
15 min o más. Se añadieron los psoralenos S-70,
S-59 AMT a partes alícuotas de 3 ml de PC en
minibolsa de Teflón^{TM} a concentraciones de 35, 70 y 100 mM.
Las muestras, incluidos los controles sin psoraleno añadido, se
irradiaron con 5 J/cm^{2} de UVA, mezclando a incrementos de
1J/cm^{2}. Después de la irradiación, se separaron por
centrifugación los leucocitos y las plaquetas del virus. El
material sobrenadante que contenía DHBV se digirió a 55ºC durante la
noche con 50 \mug/ml de proteinasa K en un tampón que contenía
0,5% de dodecilsulfato sódico, tampón Tris 20 mM, pH 8,0, y EDTA 5
mM. Las muestras se sometieron a extracción con
fenol-cloroformo y cloroformo, a lo que siguió
precipitación con etanol. Se usó luego DNA purificado en reacciones
de amplificación por PCR con una cantidad inicial de 10^{6}
genomas DHVD de cada muestra. Los amplicones de PCR se generaron
usando pares de cebadores DCD03/DCD05 (127 bp), DCD03/DCD06 (327
bp) y DCD03/DCD07 (1072 bp). La PCR se realizó en tampón estándar de
PCR que contenía 0,2 mM de cada desoxinucleósido
5'-trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 0,05 mM de
cada cebador y 0,5 unidades de Taq polimerasa por 100 ml de
reacción. Se realizaron 30 ciclos de amplificación con el siguiente
perfil térmico: 95ºC 30 s, 60ºC 30 s, 72ºC 1 min. A la amplificación
siguió una incubación durante 7 min a 72ºC para que resultaran
productos de longitud entera. Se añadió [lambda -^{32}P] dcTP en
una cantidad de 10 mCi por 100 ml con el fin de detectar y
cuantificar los productos resultantes. Los productos se separaron
por electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida y se
contaron. La ausencia de señal en una reacción dada se tomó como
indicación de inactivación eficaz de DHBV.
Los resultados revelaron que los amplicones
menores mostraban una inactivación creciente en función de la
concentración de psoraleno para todos los psoralenos ensayados. A
las mismas concentraciones, S-59 y
S-70 inhibían la PCR de los amplicones menores
mejor que el AMT. Para el amplicón de 1072 bp, se observó inhibición
completa de PCR a todas las concentraciones de S-59
y S-70, mientras que la muestra sin psoraleno dio
una señal fuerte. AMT inhibía la amplificación por PCR del amplicón
de 1072 bp a los niveles de 70 y 100 mM, pero se pudo detectar una
señal cuando se usó AMT a una concentración final de 35 mM.
En el Ejemplo 13, se ensayaron los compuestos en
cuanto a su capacidad para inactivar virus en DMEM/FBS al 15%. En
este ejemplo, los compuestos se ensayan en 100% de plasma y en medio
predominantemente sintético para demostrar que los procedimientos
de la presente invención no están restringidos a un tipo particular
de medio.
Para las muestras en medio sintético, se
centrifugaron concentrados de plaquetas humanas estándar para
separar el plasma. Luego se expresó 85% del plasma y se reemplazó
con un medio sintético (denominado "Sterilyte^{TM} 3.0") que
contenía acetato sódico 2 mM, glucosa 2 mM; KCl 4 mM, NaCl 100 mM,
citrato trisódico 10 mM, NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 20 mM
y MgCl_{2} 2 mM. Se añadieron células H9 infectadas con HIV a los
concentrados de plaquetas en Sterilyte^{TM} 3,0 al 85% o a
concentrados de plaquetas humanas estándar (2,5x10^{7} células por
concentrado) a una concentración final de 5x10^{5} células/ml.
Los concentrados de plaquetas se pusieron en FL20 modificado con
Teflón^{TM} o minibolsas de Teflón^{TM} (American Fluoroseal
Co., Silver Springs, MD), se trataron con uno de los compuestos de
la Fig. 23 y 24 a las concentraciones indicadas y luego se
irradiaron con 320-400 nm (20 mW/cm^{2}) para 5
J/cm^{2} (para muestras de plasma) o 2 J/cm^{2} (para muestras
con 85% de Sterilyte^{TM}) en un dispositivo similar al del
Ejemplo 1. El dispositivo de fotoactivación usado en este ejemplo
había sido ensayado previamente y se encontró que daba por
resultado una exposición a la luz comparable a la del dispositivo
del Ejemplo 1. (No se muestran datos). Se separaron y cultivaron
partes alícuotas para medir la capacidad infectiva del HIV residual
en las muestras tratadas con un compuesto de la presente
invención.
Para muestras en plasma: células H9 infectadas
con HIV se añadieron a concentrados de plaquetas humanas estándar
(2,5 x 10^{7} células por concentrado), concentración final 5 x
10^{5} células/ml. Se pusieron en cámaras de Pyrex con camisa de
agua partes alícuotas (5 ml) de concentrados de plaquetas
contaminadas con HIV. Las cámaras habían sido revestidas
previamente en el interior con silicio. Los concentrados de
plaquetas se trataron con uno de los compuestos de las Tablas 10 y
11 a las concentraciones dadas en las tablas, y luego se irradiaron
con 320-400 nm (20 mW/cm^{2}) durante 1 min en un
dispositivo similar al del Ejemplo 1. El dispositivo de
fotoactivación usado en este ejemplo había sido previamente ensayado
y se encontró que daba una exposición a la luz comparable a la del
dispositivo del Ejemplo 1. (No se muestran datos). Se separaron y
cultivaron partes alícuotas para medir la capacidad infectiva del
HIV residual en las muestras en plasma y Sterilyte^{TM} al 85%
usando un ensayo de capacidad infectiva MT-2
(detallado en el Ejemplo 13 y descrito anteriormente por Hanson, C.V
y otros, J. Clin. Micro 28:2030 (1990)). Los resultados se dan en
las Fig. 23 y 24.
Los resultados revelan que los compuestos de la
presente invención son eficaces para inactivar HIV en plasma y en
medio sintético. Comparando las Fig. 18 y 19, parecen ambas curvas
de inactivación iguales, logrando ambas aproximadamente 5 logs de
inactivación a concentraciones 64 \muM de compuesto. Sin embargo,
la inactivación en medio sintético se realizó con solo 2
J/cm^{2}de irradiación, 3 J/cm^{2} menos que la requerida para
alcanzar la misma inactivación en plasma. Así, parece a la vista de
estos datos que el medio sintético facilita los procedimientos de
inactivación de la presente invención.
En este ejemplo se midió, en función de la
capacidad de las bacterias de replicar posteriormente, la
inactivación bacteriana por los compuestos fotorreactivos que se
unen a ácido nucleico. Se escogió una bacteria gram negativa como
representativa de las cepas de bacterias más difíciles de
inactivar.
La bacteria, una cepa de Pseudomonas, se
inoculó en LB con un lazo estéril y se hizo crecer durante la noche
en una mesa oscilante a 37ºC. Basándose en el supuesto aproximado de
que una DO a 610 nm es equivalente a 5 x 10^{8} unidades
formadoras de colonias (ufc)/ml, se midió una dilución 1:10 del
cultivo en un espectrómetro (fabricado por Shimatsu). El cultivo de
bacterias se añadió a una solución de 15% de suero fetal bovino en
DMEM a una concentración final de bacterias de aproximadamente
10^{6}/ml. Se pasó una parte alícuota (0,8 ml) a un tubo de
polietileno de 1,5 ml con cierre superior de apertura rápida. Se
añadió al tubo una parte alícuota (0,004-0,040 ml)
de la solución madre del compuesto a ensayar preparada en agua,
etanol o sulfóxido de dimetilo a 0,80-8,0 mM. Los
compuestos se ensayaron a una concentración de 16 \muM. Los tubos
se pusieron en un dispositivo lumínico como se ha descrito en el
Ejemplo 1 y se irradiaron con 1,3 J/cm^{2}, 1,2 J/cm^{2} y
finalmente 2,5 J/cm^{2}, con un total de 5 J/cm^{2}. Se tomaron
150 \mul para las pruebas después de cada período de pulsación.
Se prepararon tubos de dilución de 13 ml estériles; cada compuesto a
ensayar requería un tubo con 0,4 ml de caldo LB y 4 tubos que
contenían 0,5 ml de caldo LB. Para hacer las diluciones, se
añadieron al primer tubo de dilución de 0,5 ml de medio, una parte
alícuota de 0,050 ml de la solución de fago irradiada y luego,
0,050 ml de la solución así diluida se añadieron a un segundo tubo
de dilución de 0,5 ml de medio (1:10). La segunda solución se
diluyó luego serialmente (1:10) en los tubos restantes. Se
cultivaron separadamente 100 \mul de la muestra original y cada
dilución sobre placas de agar con LB y se incubaron durante la
noche a 37ºC. La mañana siguiente se hizo el recuento de las
unidades formadoras de colonias y, basándose en los factores de
dilución, se calculó el título del fago remanente después del
fototratamiento.
Se hicieron los controles siguientes:
"bacteria sola", en el que la bacteria no se trató con el
compuesto a ensayar y no se irradió (indicado "título de
partida" en las tablas); "UV sola", en el que la bacteria se
irradió en ausencia de compuesto a ensayar. No se hicieron
controles oscuros por las razones expuestas en el anterior Ejemplo
12.
Los resultados fueron como sigue: El título de
partida de las bacterias era de 6,5 logs. Después de 5 j/cm^{2}
de irradiación, los inactivación logarítmica para los diversos
compuestos ensayados fueron los siguientes: 8-MOP -
1,9 logs; AMT - 5,2 logs, compuesto 2 - >5,5, compuesto 6 -
>5,5. Es evidente según estos resultados que los compuestos son
más eficaces que AMT y 8-MOP para inactivar una
bacteria gram negativa.
En los ejemplos anteriores, los psoralenos de la
presente invención han demostrado ser eficaces para inactivar
patógenos tales como bacterias (pseudomonas), bacteriófagos (R17) y
virus (HIV y DHBV). Sin que ello suponga limitarse a cualquier
procedimiento por el que los compuestos inactivan patógenos, se cree
que la inactivación es resultado de la unión inducida por la luz de
los psoralenos al ácido nucleico de los patógenos. Como se ha
discutido en lo anterior, el AMT es conocido por su eficacia de
inactivación de patógenos y su acción mutagénica acompañante en la
oscuridad a concentraciones bajas. A diferencia, los psoralenos
menos activos, tales como 8-MOP, que se han
examinado antes, presentan una acción mutágena significativamente
menor. Este ejemplo establece que la fotounión y la acción mutágena
no son fenómenos ligados en los compuestos de la presente invención.
Los psoralenos de la presente invención tienen una eficacia
excepcional de inactivación de patógenos mientras que presentan
sólo una acción mutágena mínima.
En este ejemplo, los compuestos se ensayan en
cuanto su acción mutágena sin haber sido irradiados usando el
ensayo de Ames. Se siguieron exactamente los procedimientos usados
para el ensayo de acción mutágena de Salmonella descrito
detalladamente por Maron y Ames. Maron, D.M. y B.N. Ames, Mutation
Research 113:173 (1983). Se describe aquí brevemente cada
procedimiento. Las cepas para el ensayo TA97a, TA98, TA100, TA102,
TA1537 y TA1538 se obtuvieron del Dr. Ames. TA97a, TA98, TA1537 y
TA1538 son cepas para analizar el desplazamiento de marco. TA100 y
TA102 son cepas para analizar la sustitución de bases. Después de
recibirlas, cada cepa se cultivó en una variedad de condiciones
para confirmar los genotipos específicos para las cepas.
Las cepas de ensayo de Salmonella estándar
usadas en este estudio requieren histidina para crecer dado que
cada cepa de ensayo contiene un tipo de mutación diferente en el
operón de histidina. Además, de la mutación para la histidina estas
cepas de ensayo contienen otras mutaciones, que se describen
seguidamente, que aumentan mucho su capacidad de detectar
mutágenos.
Dependencia de la histidina: La necesidad
de histidina se ensayó extendiendo primeramente cada cepa en un
cultivo mínimo de glucosa suplementada sólo con biotina y luego en
un cultivo mínimo de glucosa suplementada con biotina e histidina.
Todas las cepas crecieron revelando la falta de crecimiento de las
cepas en ausencia de histidina.
Mutación de rfa: Se confirmó una mutación
que causa pérdida parcial de la barrera de lipopolisacárido que
reviste la superficie de la bacteria aumentando así la permeabilidad
para moléculas grandes, exponiendo una placa de agar con nutrientes
plaqueada con la cepa de ensayo a violeta cristal. Primeramente se
añadieron 100 \mul de cada cultivo a 2 ml de agar de cobertura
mínima fundido y se vertió sobre una placa nutriente con agar.
Luego se puso un disco de papel de filtro estéril saturado con
violeta cristal en el centro de cada placa. Después de 16 horas de
incubación a 37ºC, se almacenaron las placas y se encontró en torno
al disco una zona clara sin crecimiento bacteriano, lo que confirmó
la mutación de rfa.
Mutación de uvrB: Tres cepas usadas en
este estudio contienen un sistema diferente de reparación contra UV
(TA97a, TA98, TA100, TA1537 y TA1538). Este rasgo se ensayó
extendiendo las cepas sobre una placa de agar nutriente que cubría
la mitad de la placa e irradiando la cara expuesta de la placa con
lámparas germicidas. Después de la incubación, se vió desarrollo
sólo en la cara de la placa protegida contra la irradiación UV.
Factor R: Las cepas de ensayo (TA97a,
TA98, TA100 y TA102) contienen el plásmido pKM101 que aumenta su
sensibilidad a mutágenos. El plásmido confiere también a las
bacterias resistencia a la ampicilina. Esto fue confirmado por el
crecimiento de cepas en presencia de ampicilina.
PAQ1: La cepa TA 102 contiene también el
plásmido pAQ1 que aumenta más su sensibilidad a mutágenos. Esta
plásmido también codifica la resistencia a la tetraciclina. Para
ensayar la presencia de este plásmido, se extendió TA102 sobre una
placa de glucosa mínima que contenía histidina, biotina y
tetraciclina. La placa se incubó durante 16 h a 37ºC. La cepa
presentó un crecimiento normal que revelaba la presencia del
plásmido pAQ1.
Los mismos cultivos usados para el ensayo de
genotipos se cultivaron nuevamente y partes alícuotas se congelaron
en condiciones controladas. Los cultivos se ensayaron de nuevo en
cuanto al genotipo para confirmar la fidelidad del genotipo después
de la manipulación en la preparación de muestras permanentes
congeladas.
Los primeros ensayos hechos con las cepas eran
para determinar el intervalo de reversión espontánea para cada una
de las cepas. Con cada experimento de acción mutágena se midió la
reversión espontánea de las cepas de ensayo a la independencia de
la histidina y se expresó en términos del número de agentes de
reversión espontánea por placa. Estos sirvieron como controles de
fondo. En cada cepa de ensayo se incluyó un control positivo de
mutagénesis usando un mutágeno de diagnóstico adecuado para esa cepa
(2-aminofluoreno a 5 mg/placa para TA98 y azida
sódica a 1,5 mg/placa para TA 100).
Para todos los experimentos se usó el
procedimiento de preincubación. En este procedimiento se descongeló
un vial de cada cepa de ensayo y 20 \mul de este cultivo se
añadieron a 6 ml de caldo Oxoid Nutrient nº. 2. Esta solución se
agitó durante 10 horas a 37ºC. En el procedimiento de preincubación,
se añadió 0,1 ml de este cultivo durante toda la noche a cada uno
de un número requerido de tubos de ensayo estériles. A la mitad de
los tubos, se añadieron 0,5 ml de una solución al 10% de
S-9 que contenía extracto de hígado de rata inducido
con Aroclor 1254 (Molecular Toxicology Inc, Annapolis, MD), y se
añadió MgCl_{2}, KCl, glucosa 6-fosfato, NADP y
tampón de fosfato sódico (Sigma, St. Luis, Missouri). En la otra
mitad de los tubos se usaron 0,5 ml de tampón de fosfato sódico
0,2M, pH 7,4, en vez de la mezcla de S-9 (muestras
-S9). Finalmente, se añadieron 0,1 ml de la solución de ensayo que
contenía 0, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50, 100, 250 o 500 \mug/ml del
compuesto a ensayar. La mezcla de 0,7 ml se agitó en un vórtice y
luego se preincubó mientras que se agitaba durante 20 min a 37ºC.
Después de haber sido agitada, a la mezcla de 0,7 ml se añadieron 2
ml de agar de cobertura fundido suplementado con histidina y
biotina e inmediatamente se vertió en una placa de agar con glucosa
mínima (el volumen de agar de base era de 20 ml). Se dejó durante
30 min que solidificara el agar de cobertura y luego se invirtieron
las placas y se incubaron a 37ºC durante 44 horas. Después de la
incubación, se contó el número de colonias que revierten en cada
placa. Los resultados aparecen en las Tablas
12(A)-18 (B) seguidamente ("n"
representa el número de replicados realizados para cada punto de
datos).
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Maron y Ames (1983) describen los puntos de
vista conflictivos en cuanto al tratamiento estadístico de datos
generados en el ensayo. A la luz de ello, este ejemplo adopta el
modelo simple de acción mutágena que se caracteriza por un aumento
de dos veces o más en el número de agentes que revierten por encima
del ruido de fondo (en negrita en las tablas), así como la
respuesta mutagénica dependiente de la dosis al fármaco.
En cuanto a 8-MOP, la única
respuesta mutagénica detectada fue un mutágeno débil de sustitución
de una base en TA102 a 500 \mug/placa (Tabla 13 (B)).
En claro contraste, el AMT (Tabla 12 (A) y 12
(B)) presentaba una acción mutágena de desplazamiento de marco
entre 5 y 10 \mug/placa en TA97a y TA98, a 5 \mug/placa en
TA1537 y a 1 \mug/placa a TA1538. El AMT no presentaba mutaciones
significativas de sustitución de bases.
En cuanto al compuesto 1, la única respuesta
mutagénica detectada fue un mutágeno débil de desplazamiento de
marco en TA1538 a 5 \mug/placa en presencia de S9. El compuesto 1
presentó también mutación en la cepa TA100, pero sólo en ausencia
de S9. El compuesto 2 también presentó acción mutágena débil de
desplazamiento de marco en presencia de S9 en TA98 y TA1537. Los
compuestos 3 y 4 no presentaban acción mutágena. El compuesto 6 no
tenía acción mutágena de sustitución de bases pero presentaba una
respuesta de desplazamiento de marco en TA98 en presencia de S9 a
concentraciones de 250 \mug/placa y superior. También presentó una
respuesta a 50 \mug/placa en TA1537 en presencia de S9. El
compuesto 18 presentó sólo una respuesta débil a concentraciones
altas en presencia de S9 en las cepas TA 90 y TA 1537. La respuesta
era más alta en ausencia de S9, pero todavía seguía siendo
significativamente inferior a la de AMT, que presentaba acción
mutágena a concentraciones mucho menores (5 \mug/placa).
Se deduce claramente de estos datos que los
compuestos son menos mutagénicos que el AMT, según el ensayo de
Ames. Al mismo tiempo, estos compuestos presentan una eficacia de
inactivación mucho más alta que el 8-MOP, como se
ve en los Ejemplos 12 y 16. Estos dos factores demuestran que los
compuestos combinan los mejores rasgos de AMT y
8-MOP, alta eficacia de inactivación y baja acción
mutágena.
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En el Ejemplo 15, los compuestos de la presente
invención presentan la capacidad de inactivar patógenos en medios
sintéticos. Este ejemplo describe procedimientos en los que se
pueden introducir y usar medios sintéticos y compuestos de la
presente invención para inactivar patógenos en sangre. La Fig. 25A
presenta esquemáticamente el enfoque de separación de productos
estándar de sangre usado actualmente en bancos de sangre. Se unen
tres bolsas con tubos flexibles para hacer un ensamblaje de
transferencia de sangre (200) (por ejemplo, adquirible
comercialmente de Baxter, Deerfiled, Ill.). Después de introducir
sangre en la primera bolsa (201), se somete a centrifugación el
dispositivo entero (por ejemplo, la centrifugadora de rotor
oscilante Sorvall^{TM}, Dupont), lo que da por resultado glóbulos
rojos empaquetados y plasma rico en plaquetas en la primera bolsa.
El plasma se extrae por exclusión de la primera bolsa (201) (por
ejemplo, usando un dispositivo Fenwall^{TM} para extracción de
plasma) a través de los tubos y a la segunda bolsa. Se separa luego
la primera bolsa (201) y el conjunto de dos bolsas se centrífuga
para crear concentrado de plaquetas y plasma pobre en plaquetas;
éste último se saca de la segunda bolsa (202) a la tercera bolsa
(203).
La Fig. 25B representa esquemáticamente una
realización de la presente invención con la que el medio sintético
y el compuesto de fotoactivación se introducen en el concentrado de
plaquetas como se indica en la Fig. 25A Un conjunto de dos bolsas
(300) ha sido acoplado de forma estéril con la bolsa de concentrado
de plaquetas (202) (indicado como "P.C"). El acoplamiento
estéril es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, patente
de Estados Unidos N.º 4.412.835, de D.W.C. Spencer. Véanse también
las patentes de Estados Unidos N.º 4.157.723 y nº. 4.265.280. Los
dispositivos de acoplamiento estéril son asequibles comercialmente
(por ejemplo, Terumo, Japón).
Una de las bolsas (301) del conjunto de dos
bolsas (300) contiene una formulación de medio sintético (indicado
como "STERILYTE"). En la segunda etapa representada en la Fig.
25B, el concentrado de plaquetas se mezcla con el medio sintético
pasando el concentrado de plaquetas a la bolsa con medio sintético
(301) por paso del concentrado de plaquetas desde la primera bolsa
de sangre a la segunda bolsa de sangre a través del medio de
conexión estéril. El compuesto de fotoactivación puede estar en la
bolsa que contiene medio sintético (301), añadido en el momento de
la producción. Alternativamente, el compuesto se puede mezclar con
la sangre en el punto de extracción, si el compuesto se añade a la
bolsa de recogida de sangre (Fig. 25A, 201) en el momento de la
producción. El compuesto puede estar en forma seca o en una solución
compatible con la conservación de la sangre.
La Fig. 25C representa esquemáticamente una
realización del enfoque de descontaminación de la presente invención
aplicada específicamente a un concentrado de plaquetas diluido con
medio sintético según la Fig. 25B. En esta realización, las
plaquetas se han pasado a una bolsa (301) con medio sintético. El
compuesto de fotoactivación ha sido introducido ya en la bolsa de
recogida de sangre (201) o, está en la bolsa (301) de medio
sintético. Entonces, las plaquetas se pasan a la bolsa de medio
sintético a través del medio estéril de conexión o el medio
sintético se pasa a la bolsa de plaquetas. Luego, la bolsa que
contiene la mezcla de concentrado de plaquetas y medio sintético
(301), que tiene unas propiedades de transmisión de luz UV y otras
características adecuadas para la presente invención, se pone en un
dispositivo (tal como el descrito en el Ejemplo 1) y se ilumina.
Seguidamente al fototratamiento, las plaquetas
descontaminadas se pasan desde la bolsa (301) de medio sintético a
la bolsa de almacenamiento (302) del conjunto de dos bolsas (300).
La bolsa de almacenamiento puede ser una bolsa de almacenamiento
disponible en el comercio (por ejemplo, la bolsa CLX de Cutter).
La Fig. 25D representa esquemáticamente una
realización del enfoque de descontaminación de la presente invención
que incluye un dispositivo de captura para eliminar el compuesto de
fotoactivación del material tratado después del fototratamiento. La
presente invención contempla varios materiales absorbentes que se
pueden usar en un dispositivo de captura para eliminar compuestos
de inactivación de los que los siguientes son una lista no
exclusiva: Amberlite XAD-4 (asequible de Rohm and
Haas Ltd., Croydon, Surrey, RU) ("Resin hemoperfusion for Acute
Drug Intoxication", Arch Intern Med 136:263 (1976)); Amberlite
XAD-7 ("Albumin-Coated Amberlite
XAD-7 Resin for Hemoperfusion in Acute Liver
Failure", Artificial Organs, 3:20 (1979); Amberlite 200,
Amberlite DP-1, Amberlite XAD-2,
Amberlite XAD-16; carbonos activados ("Charcoal
hemoperfusion in Drug Intoxication", British J. Hospital Med.
49:493 (1993); sílice ("In vitro Studies of the Efficacy of
Reversed Phase Silica Gel as a Sorbent for Hemo- and
Plasmaperfusion", Clinical Toxicology 30:69 (1992)). En una
realización, la presente invención contempla un material absorbente
que actúa junto con un medio filtrante para eliminar compuestos.
Este Ejemplo implica una estimación del impacto
de los procedimientos de la presente invención sobre la función de
las plaquetas. Se emplearon cuatro indicadores de la viabilidad y
función de las plaquetas: (1) expresión de GMP-140,
(2) mantenimiento del pH; (3) agregación de plaquetas y (4) recuento
de plaquetas.
Para medir los efectos de los presentes
compuestos y procedimientos de descontaminación sobre la función de
las plaquetas usando estos cuatro indicadores, se prepararon cuatro
muestras de cada compuesto ensayado, dos muestras de control y dos
que contenían compuesto. Se obtuvieron tres unidades de plaquetas
humanas de Sacramento Blood Centre, Sacramento, CA. Cada una de
éstas se pasó en condiciones estériles a un tubo de centrifugadora
de 50 ml y luego partes alícuotas de cada unidad se pasaron a una
segunda serie de tubos estériles de 50 ml de centrifugadora. A cada
tubo de centrifugadora que contenía concentrado de plaquetas (PC) se
añadió una parte alícuota dla solución madre de compuesto para tener
una concentración final de 100 \mug de compuesto. Los compuestos
ensayados en este experimento fueron el compuesto 2 (36 \mul de 10
mM de la solución madre añadidos a 4 ml de PC), el compuesto 6
(173,5 \mul de 9,8 mM de la solución madre añadidos a 16,8 ml de
PC), el compuesto 17 (2,0 ml de 1 mM de la solución madre añadidos a
18 ml de PC), y el compuesto 18 (0,842 ml de 2,0 mM de la solución
madre añadidos a 16 ml de PC). Las muestras se pipetearon suavemente
hacia arriba y abajo para mezclar. Luego se pasaron partes
alícuotas (de 3 ml u 8 ml) de cada muestra a dos
Medi-bags^{TM} de Teflon^{TM} estériles
(American Fluoroseal Co., Silver Springs, DM) (actualmente propiedad
de The West Company, Lionville, PA). Las muestras se trataron en
una de dos bolsas de diferente tamaño que tenían 3 ml u 8 ml de
capacidad. Las bolsas tenían aproximadamente la misma relación de
superficie a volumen, y experimentos previos han demostrado que las
dos bolsas tienen aproximadamente propiedades equivalentes durante
la irradiación de las muestras. (No se muestran datos). Para cada
compuesto ensayado, se prepararon dos muestras de control
extrayendo partes alícuotas de concentrado de plaquetas (17 ml si se
usaba una bolsa de 8 ml, 4 ml si se usaba una bolsa de 3 ml) de la
misma primera serie de tubos de centrifugadora de 50 ml de la que se
extrajo la muestra de compuesto, y dividiéndola, como antes, en las
Medibags. Una de cada par de Medibags que contenían compuesto y una
de cada par de Medibags de control se iluminaron con 5
Julios/cm^{2} en el dispositivo descrito antes en el Ejemplo 1.
Luego, todas las Medibags experimentales y de control se pusieron en
un agitador de plaquetas para almacenarlas durante 5 días. Los
mismos experimentos se repitieron varias veces para obtener más
datos estadísticamente significativos, indicados como "n", el
número de puntos de datos representados, en los gráficos de las
Fig. 26-29 que se discuten más adelante. También en
las Fig. 26-29, "C1" representa un control no
tratado del día 1, "D5" representa un control no tratado
después de almacenamiento durante 5 días, "uv" representa una
muestra que ha sido tratada sólo con luz ultravioleta y "PCD"
representa la muestra de ensayo tratada con luz ultravioleta y un
compuesto de la presente invención.
Para obtener datos para muestras de control el
día 1, se extrajeron aproximadamente 3 ml del volumen restante de
cada una de las tres unidades y se dividieron en dos tubos de 1,5
ml. Estas muestras se ensayaron en cuanto al pH como se describe
seguidamente. También se hizo un recuento de plaquetas a una
dilución 1:3 como se describe luego. El concentrado residual de
plaquetas de cada unidad se agitó durante 10 min a 3800 rpm (3000 g)
en una centrifugadora Sorval RC3B (DuPont Company, Wilmington,
Delaware) a plaquetas sedimentadas. Luego se decantó el plasma en 2
tubos estériles de 50 ml (uno el día 1 y el otro almacenado a 4ºC
para el día 5) para uso en el ensayo de agregación.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se activaron las plaquetas, una
glucoproteína de membrana de gránulo alfa, denominada
p-selectina (GMP140), queda expuesta en la
superficie de la plaqueta. Menos de 5% de plaquetas normales no
estimuladas, frescas, expresan por citometría de flujo niveles
detectables de GMP. Véase en general M.J. Metzelaar, Studies on
the Expression of Activation-Markers on Human
Platelets (Tesis 1991).
Para medir GMP-140, una pequeña
parte alícuota de plasma rico en plaquetas se pone en tampón HEPES
que contiene un anticuerpo que se une a GMP 140 o un Isótopo de
control de IgG de ratón. CD62 es un anticuerpo moclonal disponible
comercialmente que se une a GMP 140 (adquirible de Sanbio, Ud,
Países Bajos; Caltag Labs, So. San Francisco, CA, y Becton
Dickinson, Mountain View, CA). Después de una incubación a
temperatura ambiente durante 15 min, se añade al tubo, en
cantidades de saturación, F(ab')_{2} de cabra contra IgG de
ratón conjugado a FTTC (Caltag Laboratories, So. San Francisco, CA)
y se deja que incube a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
Finalmente, las células se diluyen en 1% de paraformaldehído en
solución salina tamponada con fosfato y se analiza en un
FACSCAN^{TM} (Becton Dickinson, Mountain View, CA). El control
positivo se hace añadiendo al sistema, a una concentración final de
2 x 10^{-7}M, miristato acetato de forbol (PMA).
En este ejemplo se empleó CD62 para medir el
impacto, si hubiera, de la radiación en presencia de varios
compuestos de la presente invención sobre la activación de
plaquetas. El anticuerpo se mezcló con tampón HEPES (10 \mul de
anticuerpo [0,1 mg/ml]:2,49 ml de tampón) y se almacenó en 50 \mul
de alícuotas a -40ºC antes de uso. Un control positivo estaba
constituido por: 10 \mul de CD62, 8 \mul de PMA y 2,482 ml de
tampón HEPES. También se empleó un concentrado 5x de control de
IgG1 de ratón (0,05 mg/ml) (Becton Dickinson, Mountain View, CA
#9040). El anticuerpo se diluyó en tampón HEPES (20 \mul de
anticuerpo:2,48 ml de tampón) y se almacenó a -40ºC. Se almacenó
miristato acetato de forbol (PMA) (Sigma, St. Louis, MO). Al usarlo,
éste se diluyó en DMSO (la concentración de trabajo era de 10
\mug/ml).
Se preparó paraformaldehído al 1% (PFA) (Sigma,
St. Louis, MO) añadiendo 10 g de paraformaldehído a 1 l de PBS. La
mezcla se calentó a 70ºC y luego se añadió a gotas NaOH 3M hasta que
la solución era transparente. Se enfrió la solución y el pH se
ajustó a 7,4 con HCl 1N. La solución se filtró y almacenó.
El procesamiento de cada una de las muestras de
concentrados de plaquetas después de tratamiento implicaba la
adición de 5 microlitros de concentrado de plaquetas, diluido 1:3 en
tampón HEPES, a cada tubo de centrifugadora que contenía el
anticuerpo CD62 y los reactivos apropiados y una mezcla suave por
remolinado. Las muestras se incubaron luego durante 15 min a
temperatura ambiente.
A cada tubo se añadieron (5 microlitros) el
IgG-FITC antirratón de cabra y la solución se mezcló
en un vórtice suavemente. Las muestras se incubaron durante 15 min
más a temperatura ambiente. Seguidamente, a cada tubo se añadió 1
ml de PFA al 1% en PBS y se mezcló suavemente. Se analizaron las
plaquetas en el FACSCAN^{TM}. Los resultados se presentan en las
Fig. 26C, 27C, 28C y 29C (las Fig. 26 corresponden al compuesto 2,
las Fig. 27 corresponden al compuesto 6, las Fig. 28 corresponden
al compuesto 17 de referencia y las Fig. 29 corresponden al
compuesto 18 de referencia). Claramente, tres de los cuatro
compuestos ensayados, 2, 6 y 17, presentan una diferencia pequeña o
no presentan diferencia entre el control no tratado el día 5 (D5) y
la muestra tratada con luz y compuesto psoraleno (PCD). Sólo el
compuesto 18 presentaba un aumento notable por encima del control.
Pero el valor seguía siendo inferior al valor de control
positivo.
Los cambios del pH de plaquetas en el
concentrado pueden alterar sus características morfológicas y su
supervivencia después de transfusión. Moroff, G. y otros,
Factors Influencing Changes in pH during Storage of Platelet
Concentrates at 20-24ºC, Vox Sang, 42:33 (1982).
El intervalo de pH en el que funcionan normalmente las plaquetas es
de aproximadamente 6,0-6,5 a 7,6. Stack, G. y E.L.
Snyder, Storage of Platelet Concentrate, Blood Separation
and Platelet Fractionation 99 a 107 (1991). Para medir el pH de las
muestras se usó un analizador CIBA-CORNING 238
pH/Blood Gas (CIBA-CORNING, Norwood, MA). Se
introdujo en el analizador de pH/gas de sangre una pequeña cantidad
de concentrado de plaquetas de cada muestra.
Las mediciones de pH se hicieron para todas las
muestras al tiempo cero y después de 5 días de almacenamiento. Las
Fig.26D, 27D, 28D y 29D son gráficos de barras que indican los
resultados del pH para un control oscuro, un control con luz y un
compuesto experimental de luz más compuesto. Estos gráficos indican
que el pH de las muestras de concentrado de plaquetas después de
iluminación en presencia de cualquiera de los compuestos permanece
por encima de pH 6,5. Así, las plaquetas permanecen a pH aceptable
para plaquetas almacenadas después del tratamiento de
fotoinactivación usando compuestos de la presente invención.
La agregación de plaquetas se mide por el cambio
de la transmisión óptica que una muestra de plaquetas exhibe
después de estimular la agregación. La agregación de plaquetas se
midió usando un Whole Blood Aggregometer
(Chrono-Log Corp., Havertown, PA, modelo 560 VS). Se
controló el número de plaquetas de cada muestra para que fuera
constante para cada medida. Se usó un contador de células Sysmex
modelo F800 (Toa Medical Electronics, Kobe, Japón) para el recuento
de plaquetas en las muestras de plaquetas y se usó plasma autólogo
para ajustar a 300.000/ml el número de plaquetas del concentrado de
plaquetas.
Para el proceso, todas las muestras se incubaron
en un tubo de plástico con tapón durante 30 min a 37ºC para la
activación. El agregómetro se calentó a 37ºC. Para medir la
agregación de plaquetas se usó el canal óptico. La velocidad
magnética del agregómetro se fijó a 600 rpm/min. El concentrado de
plaquetas restante, del que no se extrajo muestra para tratamiento,
se centrífugo a alta velocidad (14.000 g) con una
microcentrifugadora durante 5 min para obtener recipientes de
plasma pobre en plaquetas autólogo a la muestras experimentales.
Para comenzar, se añadieron 0,45 ml del plasma
autólogo pobre en plaquetas junto con 0,5 ml de solución salina a
una cubeta de vidrio y se pusieron en el canal de PPP. Luego se
añadieron a una cubeta de vidrio (que contenía un imán pequeño)
0,45 ml del concentrado muestra de plaquetas y 0,50 ml de solución
salina. Después de un minuto, se añadieron a la cubeta de la
muestra los reactivos ADP y colágeno (10 \mul). La concentración
final de ADP era de 10 \muM y la concentración final de colágeno
era de 5 \mug/ml. La agregación de plaquetas se registró durante
aproximadamente 8-10 min o hasta que se alcanzó la
lectura máxima.
Los resultados aparecen en las Fig. 26B, 27B,
28B y 29B. La línea de 100% de agregación es el nivel al que el
registrador se puso a cero. La línea de 0% de agregación es el nivel
al que transmitían las plaquetas antes de haber añadido ADP y
colágeno. El valor de agregación de plaquetas de la muestra se
determina tomando el valor máximo de agregación como porcentaje del
intervalo total. Tres o cuatro compuestos ensayados presentaban una
diferencia pequeña o no presentaban diferencia en los niveles de
agregación entre las muestras tratadas con compuesto y las muestras
no tratadas que se almacenaron durante 5 días. El compuesto 2
presentaba una pequeña reducción de la agregación, de
aproximadamente 8% desde el control el día 1. La agregación para la
muestra tratada con compuesto y uv era la misma que la de la muestra
tratada sólo con uv. Esto soporta la evidencia de que los
compuestos descontaminantes ensayados no tienen efecto significativo
sobre la agregación de plaquetas cuando se usan en los
procedimientos de la presente invención.
Para el recuento de plaquetas se usó un contador
de células Sysmex. Las muestras se diluyeron 1:3 en solución salina
de banco de sangre.
Los resultados de las mediciones del recuento de
plaquetas aparecen en las Fig. 26A, 27A, 28A y 29A. Para cada uno
de los compuestos, las muestras no presentan una caída, o presentan
una caída pequeña, del número de plaquetas entre el control del día
5 y la muestra tratada el día 5. Es interesante que las muestras
tratadas con los compuestos 6, 17 de referencia y 18 de referencia
presentan un número de plaquetas más alto que las muestras tratadas
sólo con luz. Por ejemplo, las muestras tratadas con el compuesto 6
tenían unos recuentos equivalentes al del control del día 5, pero
las muestras tratadas sólo con luz ultravioleta tenía una reducción
de aproximadamente 33% en el recuento de plaquetas. Así, el
tratamiento con los compuestos de la presente invención no sólo es
compatible con el mantenimiento del número de plaquetas, sino que
realmente evita la caída del número de plaquetas causada por la
exposición a la luz ultravioleta.
\vskip1.000000\baselineskip
Un compuesto preferido para descontaminar sangre
a usar posteriormente in vivo no debe ser mutagénico para el
receptor de la sangre. En la primera parte de este experimento, se
exploraron algunos compuestos para determinar su nivel de
genotoxicidad en comparación con el aminometiltrimetilpsoraleno. En
la segunda parte, se midió la capacidad clastógena in vivo
de algunos compuestos de la presente invención observando la
formación de micronúcleos en reticulocitos de ratón.
Los cultivos de células mamíferas son
herramientas valiosas para estimar el potencial clastógeno de
productos químicos. En tales estudios, las células se exponen a los
productos químicos con y/o sin sistema de activación metabólica de
rata S-9 (S-9) y luego se examinan
para determinar la supervivencia de las células (para exploración
de la genotoxicidad) o cambios en la estructura del cromosoma (para
un ensayo de aberración de cromosomas).
Se usaron células de ovario de hámster chino
(CHO; ATCC CCL 61 CHO-K1) para los ensayos de
genotoxicidad y aberración cromosómica. Las células CHO se usan
extensamente para el ensayo citógeno porque tienen un número
relativamente bajo de cromosomas (2n=20) y una velocidad de
multiplicación rápida (12 a 14 horas dependiendo de las condiciones
de cultivo). Las células crecieron en una atmósfera con 5% de
CO_{2} a aproximadamente 37ºC en medio de McCoy's 5a con 15% de
suero fetal bovino (FBS), L-glutamina 2 mM y
solución de 1% de penicilina-estreptomicina para
mantener un crecimiento exponencial. Este medio se usó también
durante la exposición de las células al compuesto a ensayar cuando
no se usó S-9. Se mantuvieron los cultivos de
células y las exposiciones de células se realizaron en matraces
T-75 o T-25.
Cada uno de los compuestos de muestra se ensayó
a siete diluciones, 1, 3, 10, 33, 100, 333 y 1000 \mug/ml. El
compuesto se añadió en medio McCoy's 5a completo. Después de haber
añadido el compuesto, se hicieron crecer las células en la
oscuridad a aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 3 horas.
Luego se aspiró el medio que contenía el compuesto, se lavaron las
células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS)
a aproximadamente 37ºC y se añadió medio McCoy's 5a completo fresco.
El control positivo era metilmetanosulfonato. El control disolvente
era sulfóxido de dimetilo (DMSO) diluido en medio de cultivo. Para
los ensayos en que se usaba activación metabólica (véase
seguidamente) la mezcla de activación se añadió también al control
de disolvente. Los cultivos se incubaron luego durante un tiempo
adicional de aproximadamente 12 horas antes de la cosecha. Se
añadió colquicina (concentración final, 0,4 \mug/ml)
aproximadamente 2,5 horas antes de la cosecha.
Después de aproximadamente 2,5 horas en
colquicina, se cosecharon las células. Las células se eliminaron de
la superficie de los matraces usando un rascador de células. La
suspensión de células resultante se centrifugó, se aspiró el
material sobrenadante y se añadieron 4 ml de una solución hipotónica
de KCl 0,075M a las células durante 15 min a aproximadamente 37ºC.
Luego se centrifugaron las células, se aspiró el material
sobrenadante y las células se pusieron en suspensión en un fijador
de metanol:ácido acético (3:1). Después de cambiar tres veces el
fijador, se prepararon muestras sobre portaobjetos con células de
todos los matraces, que se secaron al aire. La densidad de células
y la calidad de la metafase en el portaobjetos inicial de cada
matraz se controlaron usando un microscopio de contraste de fase;
de cada matraz se prepararon al menos dos portaobjetos. Los
portaobjetos se tiñeron en Giemsa al 3% durante 3 min, se
enjuagaron en agua desionizada y se pasaron por xileno. Se montaron
cubreobjetos con Permount. Las muestras se examinaron luego para
determinar qué concentración de cada compuesto a ensayar
representaba una dosis tóxica.
Un análisis de los resultados reveló que el AMT
era genotóxico a 30 \mug/ml. Por el contrario, los compuestos 2 y
6 eran genotóxicos sólo a 100 \mug/ml, más de tres veces la dosis
tóxica de AMT.
En este experimento se ensayó también un
compuesto psoraleno con una estructura distinta de la de los
compuestos usados en la presente invención,
8-aminometil-4,4',5'-trimetilpsoraleno,
que reveló ser tóxico a 10 \mug/ml. Si bien el compuesto
aminometil-8-sustituido y
estructuras similares pueden no ser adecuados para los
procedimientos de la presente invención, pueden ser útiles para
fines alternativos. A la luz de la capacidad de los compuestos de
prevenir la replicación de ácidos nucleicos en combinación con su
extrema toxicidadad, los compuestos podrían usarse, por ejemplo,
para tratar enfermedades caracterizadas por un crecimiento celular
incontrolado, tales como cáncer.
Se prepararon soluciones salinas para los
compuestos 2, 6, 17 de referencia y 18 de referencia a varias
concentraciones. Se inyectaron 0,1 ml de una solución de compuesto
en vena de la cola a ratones Balb/c macho. Al menos se inyectaron 3
ratones por nivel de dosis. La solución salina sólo se usó como
control negativo. Para control positivo se administró
ciclofosfamida (cicloPP) a una dosis de 30 mg/kg. En el grupo
experimental, las inyecciones se repitieron una vez al día durante
4 días. En el grupo de control positivo, la muestra se administró
sólo una vez, el día 3. El día 5 se extrajeron varios microlitros
de sangre de cada sujeto y se esparcieron sobre un portaobjetos de
vidrio. Las células se fijaron en etanol absoluto y se almacenaron
en una gradilla de portaobjetos.
Para el análisis, las células se tiñeron con
naranja de acridina y se examinaron con un microscopio de
fluorescencia por recuento de: (i) el número de reticulocitos por
5000 eritrocitos, y (ii) el número de reticulocitos micronucleados
por 1000 reticulocitos. Los reticulocitos se distinguían por su
fluorescencia roja debida a la presencia de RNA. Se distinguían
micronúcleos por su fluorescencia verde debida a la presencia de
DNA. Se calculó luego el porcentaje de reticulocitos (%PCE). Una
disminución de la frecuencia de eritrocitos, representada por un
aumento del porcentaje de reticulocitos, es una indicación de
toxicidad en la médula ósea. Se calculó también el valor porcentual
de reticulocitos con micronúcleos (%PCE con MN). Un aumento de %PCE
con MN es una medida de clastogenia.
Después de haber determinado los resultados
iniciales, se repitió el experimento usando niveles de dosis
aumentados, hasta que: (i) se vio formación de micronúcleo, (ii) se
observó toxicidad en médula ósea, o (iii) se alcanzó la dosis
letal, o (iv) se administró una dosis de 5 g/kg. Para los ensayos
con cada uno de los compuestos 2, 6, 17 y 18, se alcanzó la dosis
letal antes de que hubiera señales de toxicidad en médula ósea o
formación de micronúcleo. Los resultados del experimento se
presentan en la Tabla 20. De los datos de la tabla se deduce de no
se observó toxicidad en la médula ósea para ninguno de los
compuestos en las dosis ensayadas. El valor porcentual de
reticulocitos para tratamiento con cada compuesto permanecía próximo
al valor de control negativo. Esto contrasta con una caída de
aproximadamente 2-2,5%PCE/RBC vista en el control
positivo, lo que representa un empobrecimiento de eritrocitos
debido a la toxicidad en médula ósea. Ninguno de los compuestos
presentó acción clastógena.
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En el Ejemplo 13 se muestra la inactivación de
virus HIV acelular usando los procecimientos de la invención. Este
ejemplo presenta la inactivación de HIV asociado a células usando
también compuestos de la presente invención.
Se usaron células H9 infectadas crónicamente con
HIV_{IIIB}.
(H9/HTLV-III-B-NIH
1983, nº de catál. 400). Cultivos de estas células se mantuvieron
en medio Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con
L-glutamina 2 mM, 200 u/ml de penicilina, 200
\mug/ml de estreptomicina y 9% de suero fetal bovino (Intergen
Company, Purchase, NY). Para el mantenimiento, el cultivo se
dividió una vez a la semana a una densidad de 3 x 10^{5} a 4 x
10^{5} células/ml y aproximadamente cuatro días después de
dividirlo se añadió bicarbonato sódico al 3,3% según era necesario.
Para el proceso de inactivación, las células se usaron tres días
después de que fueran divididas. Se sedimentaron a partir del medio
de cultivo a 400 g x 10 min, el material sobrenadante se descartó y
se volvió a poner en suspensión las células en un concentrado de
plaquetas humanas de 1-5 días (PC) (pH
7,5-7,6) a una concentración de 2 x 10^{6}
células/ml. Se hicieron partes alícuotas de la suspensión de
células infectadas con PC para controles oscuros libres de
psoraleno, para soluciones sólo con UVA sin psoraleno, para
controles oscuros con psoraleno y para la muestra experimental de
psoraleno más UVA. Se diluyeron con agua soluciones madre
concentradas esterilizadas por filtración de cada psoraleno en las
proporciones adecuadas para una concentración final de 150 \muM.
(Una Solución madre 10 mM del compuesto 18 se diluyó
aproximadamente 67 veces y una solución madre 2 mM del compuesto 2
se diluyó aproximadamente 13 veces). Después de un período de
equilibrado de aproximadamente 30 min a temperatura ambiente, 0,5 ml
de cada uno de los controles oscuros se puso en un criovial y se
almacenó en la oscuridad a -80ºC. Para iluminación con UVA, 8 ml de
la alícuota exenta de psoraleno y 8 ml de cada alícuota que
contenía psoraleno se introdujeron en una bolsa de Teflon^{TM}
Fl20 modificada (modificada para que tuviera una superficie total de
92 cm^{2}, The West Co., Phoenixvill, PA) con una jeringa de
plástico desechable de 10 ml conectada a uno de los puertos de
polipropileno de la bolsa. Esto dio una longitud media del paso de
0,17 cm. Las bolsas se iluminaron luego a una exposición total de 3
Julios/cm^{2} en el dispositivo descrito en el Ejemplo 1, unido a
un ensamblaje de refrigeración con baño de agua circulante fijado a
4ºC que mantenía la temperatura en la bolsa a aproximadamente
22-25ºC. Durante la exposición, el dispositivo se
sacudió sobre una mesa de sacudidas de plaquetas (Helmer Labs,
Noblesville, IN). Después de la exposición, los contenidos de las
bolsas se extrajeron con una jeringa fresca a través del otro
puerto, no usado, de la bolsa y se pusieron en crioviales para
almacenamiento a -80ºC hasta su análisis.
Las muestras almacenadas se descongelaron a
37ºC, luego se titularon en un ensayo de microplaca descrito por
Hanson, C.V., Crawford-Miksza, L. y Sheppard, H.W.,
J. Clin. Micro 28:2030 (1990), descrito en el Ejemplo 13 anterior,
con las modificaciones siguientes. La eliminación de coágulos de
cada muestra se realizó antes de cultivo. A causa de que se deseaba
el cultivo de un volumen diana de 4 ml después de eliminar el
coágulo, se pasó un exceso de la muestra (6 ml) a un tubo de
polipropileno y se diluyó a un volumen total de 60 ml con muestras
de ensayo y control del proceso de inactivación que se diluyeron en
50% de medio de ensayo y 50% de plasma humano normal combinado. Las
muestras se diluyeron serialmente en placas de 96 pocillos (Corning
Glass Works, Corning, NY). Las placas se mezclaron en una mesa de
sacudidas oscilante durante 30 segundos y se incubaron a 37ºC en
atmósfera con 5% de CO_{2} durante 1-18 horas. A
cada pocillo se añadieron células MT-2 (0,025 ml)
[clon alfa-4, obtenible (nº de catálogo 237) de los
National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent
Program, Rockville, Md.] para obtener una concentración de 80.000
células por pocillo. Después de 1 hora más de incubación a 37ºC en
atmósfera con 5% de CO_{2}, se añadieron a cada pocillo 0,075 ml
de medio de ensayo que contenía 1,6% de agarosa SeaPlaque (FMC
Bioproducts, Rockland, Maine) y precalentado a 38,5ºC. Las placas
se mantuvieron a 37ºC durante unos pocos minutos hasta que se habían
acumulado varias placas y luego se centrifugaron en soportes de
placas a 600 x g a 37ºC durante 20 minutos en una centrifugadora
preenfriada a 10ºC. En la centrifugadora se formaron monocapas antes
de que gelificara la capa de agarosa. Las placas se incubaron a
37ºC durante 5 días en atmósfera con 5% de CO_{2} y se tiñeron
añadiendo a cada pocillo 0,05 ml de yoduro de propidio (Sigma
Chemical Co.) 50 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato
(pH 7,4). Después de 24-48 horas, se examinaron
visualmente las microplacas teñidas en rojo por fluorescencia
poniendo las placas en una caja de luz UV de 304 nm de 8.000
\muW/cm^{2} (Fotodyne, Inc., New Berlin, Wis.). El recuento de
las placas se hizo a un aumento de 20x a 25x con un
estereomicroscopio.
Los resultados fueron como sigue: El compuesto 2
(150 \muM) inactivó >6,7 logs de HIV después de irradiación de
3 julios/cm^{2} (en comparación con controles oscuro y con luz de
0 log de inactivación, a partir de título logarítmico de 6,1
unidades/ml que forman placa). A la misma concentración e igual
tiempo de irradiación, el compuesto 18 inactivó >7,2 logs de HIV
(en comparación con un control oscuro de 0 logs y un control de luz
de 0,1 logs, a partir del título 6,.6). Este ejemplo confirma que
los compuestos de la presente invención son eficaces para inactivar
virus asociados a células.
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Este ejemplo implica una estimación de
formulaciones de medios sintéticos mediante los siguientes ensayos
de la función de plaquetas in vitro: (1) mantenimiento del
pH; (2) agregación de plaquetas ("Agg") y (3) expresión de
GMP-40. Los ensayos para cada uno de estas
determinaciones han sido descritos antes.
Se prepararon cuatro formulaciones: S 2.19, S
2.22, S 3.0 y S 4.0. La composición de estas formulaciones se recoge
en la Tabla 21.
Una unidad de plasma humano rico en plaquetas
(PRP) se obtuvo del banco de sangre de Sacramento. La unidad se
centrífugo a temperatura ambiente durante 6 minutos a 4000 rpm y
luego se pasó a una unidad de prensado. Usando una línea de
transferencia conectada, se extrajo el plasma de la unidad dejando
aproximadamente 9,4 ml de plasma residual.
Se dejó la unidad en reposo durante 1 hora y
después se amasó suavemente para poner las plaquetas en suspensión.
A 0,6 ml de la suspensión se añadieron 2,4 ml de plasma y el
contenido total se pasó a una minibolsa de Teflon^{TM}. Se
determinó el pH de la unidad reconstituida y se hicieron otros
ensayos el día siguiente con los resultados siguientes:
Agg = agregación
El resto de la unidad se usó luego para evaluar
el medio sintético en cuanto al almacenamiento de plaquetas con y
sin fotodescontaminación. A cada formulación se añadieron partes
alícuotas (0,8 ml) de la unidad en tubos. 3 ml de cada mezcla se
pasaron a una minibolsa de Teflon^{TM} (concentración final de
plasma 20%).
Cinco días después se evaluó la función de las
plaquetas usando la batería de ensayos descrita antes. En la
siguiente Tabla 22 se presentan los resultados para cada una de las
formulaciones de medios sintéticos.
Como se ve, el medio sintético que contenía
glucosa 2 mM (esto es, S2.22) mantenía la función de las plaquetas,
medida por GMP140 y la agregación, mejor que el medio sintético que
no contenía glucosa (esto es, S2.19).
Para confirmar este hallazgo, se repitieron los
experimentos (siendo "n" el número de experimentos repetidos)
con estas formulaciones así como con formulaciones adicionales
exentas de glucosa (3.0 y 4.0). La función de las plaquetas se
evaluó antes y después de almacenamiento y junto con
descontaminación. En las siguientes Tablas 4, 5 y 6 se presenta un
resumen de los resultados.
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Claims (17)
1. Un procedimiento para sintetizar
4'-(\omega-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
que comprende las etapas de:
a) proporcionar
4'-(\omega-hidroxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
b) tratar
4'-(\omega-hidroxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con una base y cloruro de metanosulfonilo de forma que se produzca
4'-(\omega-metanosulfoniloxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
c) tratar
4'-(\omega-metanosulfoniloxi-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con azida sódica, de forma que se produzca
4'-(\omega-azido-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
y
d) reducir
4'-(\omega-azido-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
de forma que se produzca
4'-(\omega-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
2. El procedimiento de síntesis que se describe
en la reivindicación 1, en el que dicho
4'-(\omega-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
es
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
3. El procedimiento de síntesis que se describe
en la reivindicación 2, en el que, en la etapa (d)
4'-(4-azido-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
se reduce con trifenilfosfina.
4. Un compuesto de psoraleno que puede obtenerse
mediante el procedimiento de síntesis que se describe en la
reivindicación 1, que comprende
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
5. Un procedimiento de sintetizar un compuesto
de psoraleno que tiene un sustituyente R_{1} en el átomo de
carbono 4', que se selecciona a partir del grupo que comprende
-(CH_{2})-O-(CH_{2})_{x}-O-(CH_{2})_{z}-NH_{2},
donde x = z y x es un número entero de 2 a 5, y los sustituyentes
R_{5}, R_{6} y R_{7} de los átomos de carbono 4', 5' y 8
respectivamente, se seleccionan independientemente a partir del
grupo que comprende H y (CH_{2})_{v}CH_{3} donde v es
un número entero de 0 a 5, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un
4'-halometil-4-5'-8-trimetilpsoraleno
que se selecciona a partir del grupo que comprende
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
y
4'-yodometil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
(b) tratar dicho
4'-halometil-4-5'-8-trimetilpsoraleno
con
HO(CH_{2})_{x}O(CH_{2})_{z}OH de
forma que se produzca
4'-(\omega-hidroxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
en el que n = x+3;
(c) tratar dicho
4'-(\omega-hidroxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con una base y cloruro de metanosulfonilo de forma que se produzca
4'-(\omega-metanosulfoniloxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
(d) tratar el
4'-(\omega-metanosulfoniloxi-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con azida sódica, de forma que se produzca
4'-(\omega-azido-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
y
(e) reducir
4'-(\omega-azido-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno
de forma que se produzca
4'-(\omega-amino-2,n-dioxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
6. Un procedimiento de sintetizar
4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un
4'-halometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
que se selecciona a partir del grupo que comprende
4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
y
4'-yodometil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
(b) tratar dicho
4'-halometil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con dietilenglicol, de manera que se produzca
4'-(7-hidroxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
(c) tratar el
4'-(7-hidroxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con una base y cloruro de metanosulfonilo, de manera que se produzca
4'-(7-metanosulfoniloxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno;
(d) tratar
4'-(7-metano-sulfoniloxi-2,5-dioxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno
con 1,4-diaminobutano de manera que se produzca
4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetilpsoraleno.
7. Un procedimiento de sintetizar
4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5',8-trimetilpsoraleno,
que comprende:
a) proporcionar
4,5',8-trimetilpsoralen-4'-carboxaldehído;
b) tratar
4,5',8-trimetilpsoralen-4'-carboxaldehído
con espermina y un agente reductor para producir
4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecano-4,5',8-trimetilpsoraleno.
8. Un compuesto de fórmula:
o una sal del
mismo.
9. Un compuesto de psoraleno, que comprende:
a) un sustituyente R_{1} en el átomo de
carbono 4', que se selecciona a partir del grupo que comprende:
- \quad
- -(CH_{2})_{w}-O-(CH_{2})_{z}-NH_{2},
- \quad
- -(CH_{2})_{w}-O-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{z}-NH_{2}, y
- \quad
- -(CH_{2})_{w}-O-(CH_{2})_{x}-R_{3}-(CH_{2})_{y}-R_{4}-(CH_{2})_{z}-NH_{2}.
en las que R_{3} y R_{4} se seleccionan
independientemente a partir del grupo que comprende O y NH, w es un
número entero de 1 a 5, x es un número entero de 2 a 5, y es un
número entero de 2 a 5, y z es un número entero de 2 a 6; y b) los
sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} en los átomos de carbono 4,
5' y 8 respectivamente, se seleccionan independientemente a partir
del grupo que comprende H y (CH_{2})_{v}CH_{3}, en el
que v es un número entero de 0 a 5; o una sal del mismo.
10. Un compuesto de la reivindicación 9, en el
que R_{3} y R_{4} son O.
11. Un compuesto de la reivindicación 9, en el
que dicho sustituyente R_{1} es
-CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2},
y en el que dichos sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son
todos CH_{3}.
12. Un compuesto de la reivindicación 9, en el
que dicho sustituyente R_{1} es
-CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}
y en el que dichos sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son
todos CH_{3}.
13. Un compuesto de la reivindicación 9, en el
que dicho sustituyente R_{1} es
-CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH-(CH_{2})_{4}-
NH_{2} y en el que dichos sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son todos CH_{3}.
NH_{2} y en el que dichos sustituyentes R_{5}, R_{6} y R_{7} son todos CH_{3}.
14. Un medio sintético para el almacenamiento de
plaquetas, que comprende una solución acuosa de
aproxima-
damente:
damente:
- \quad
- cloruro sódico 45-100 mM;
- \quad
- citrato sódico 8-15 mM;
- \quad
- acetato sódico 20-35 mM;
- \quad
- fosfato sódico monobásico 5-7 mM; y
- \quad
- fosfato sódico dibásico 14-22 mM;
y que además comprende
4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno
a una concentración de entre 0,1 y
250 mM.
250 mM.
15. El medio sintético para el almacenamiento de
plaquetas de la reivindicación 14, que comprende
aproximadamente:
- \quad
- cloruro sódico 84 mM;
- \quad
- citrato sódico 10 mM;
- \quad
- acetato sódico 30 mM;
- \quad
- fosfato sódico monobásico 6,2 mM; y
- \quad
- fosfato sódico dibásico 19,8 mM.
16. El medio sintético para el almacenamiento de
plaquetas de la reivindicación 14, que comprende
aproxima-
damente:
damente:
- \quad
- cloruro sódico 77 mM;
- \quad
- citrato sódico 11 mM;
- \quad
- acetato sódico 32 mM;
- \quad
- fosfato sódico monobásico 6,7 mM; y
- \quad
- fosfato sódico dibásico 19,8 mM.
17. El medio de la reivindicación 14, que además
comprende aproximadamente:
- \quad
- cloruro potásico 4-5 mM;
- \quad
- glucosa 0-2 mM;
- \quad
- mannitol 0-30 mM;
- \quad
- cloruro magnésico 2-3 mM.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83459 | 1993-06-28 | ||
| US08/083,459 US5399719A (en) | 1993-06-28 | 1993-06-28 | Compounds for the photodecontamination of pathogens in blood |
Publications (1)
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