ES2283009T3

ES2283009T3 - Anticuerpo catalitico aldolasa.

Info

Publication number: ES2283009T3
Application number: ES96943772T
Authority: ES
Inventors: Carlos F. Barbas, Iii; Richard A. Lerner; Juergen Wagner
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 2007-10-16
Anticipated expiration: 2016-12-16
Also published as: DE69636923D1; DK0870014T3; EP0870014A1; CA2239167C; AU1292397A; EP0870014B9; US6368839B1; DE69636923T2; WO1997021803A1; US5733757A; CA2239167A1; ATE354644T1; JPH11510063A; EP0870014B1; EP0870014A4; JP3996642B2; AU729055B2; US5985626A; PT870014E; SI0870014T1

Abstract

SE GENERAN ANTICUERPOS QUE CATALIZAN LA REACCION DEL ALDOL MEDIANTE UNA INMUNIZACION CON UN COMPUESTO REACTIVO QUE ATRAPA DE FORMA COVALENTE UN RESTO LISINA (LYS) EN LA CAVIDAD DE UNION DEL ANTICUERPO, MEDIANTE LA FORMACION DE UNA AMIDA VINILOGA ESTABLE, ES DECIR, UN COMPLEJO COVALENTE DE ANTICUERPO/HAPTENO. LOS ANTICUERPOS CATALITICOS RESULTANTES EMPLEAN UN MECANISMO CATALITICO QUE IMITA EL MECANISMO CATALITICO EMPLEADO POR LAS ENZIMAS ALDOLASAS DE CLASE I NATURALES.

Description

Anticuerpo catalítico aldolasa.

Campo del invento

El invento se refiere a un anticuerpo catalítico que tiene actividad aldolasa. Más particularmente, el invento se refiere a anticuerpos catalíticos que tienen actividad aldolasa y que se generan mediante un producto inmunoconjugado que tiene un hapteno \beta-dicetónico que tiene actividad de sustrato suicida con respecto a dichos anticuerpos catalíti-
cos.

Antecedentes

La reacción de adición aldólica es una reacción reversible que comprende la combinación de dos moléculas reaccionantes y la formación de un producto que tiene un nuevo enlace carbono-carbono. Cada uno de los reaccionantes contiene un grupo carbonilo, es decir, es un aldehído o una cetona. Durante la reacción, uno de los reaccionantes pierde un protón del átomo de carbono próximo a su grupo carbonilo, volviéndose por ello nucleófilo. El carbono nucleófilo del primer reaccionante ataca entonces al grupo carbonilo del segundo reaccionante. También se puede producir la reacción inversa de esta reacción de condensación, la cual acarrea la escisión de un enlace carbono-carbono y la disociación de una molécula en dos componentes. La reacción de adición aldólica es importante en la vía glucolítica y es catalizada por enzimas aldolasa. La reacción de adición aldólica es también fundamental en química orgánica para la formación y disociación de enlaces carbono-carbono. En química orgánica, la reacción puede ser catalizada por una base.

Se han desarrollado dos clases de enzimas aldolasa en cuanto a su mecanismo, es decir, las aldolasas de Clase I y Clase II [W. J. Rutter, Fed. Proc. Amer. Soc. Exp. Biol. (1.964), volumen 23, página 1.248]. Las aldolasas de Clase I utilizan el grupo \varepsilon-amino de una Lys del sitio activo para formar una base de Schiff con uno de los sustratos, que activa el sustrato en forma de dador aldólico.

El mecanismo para las aldolasas de Clase I se ilustra en la Figura 1. La reacción es bimolecular y se desarrolla mediante una catálisis covalente a través de múltiples productos intermedios. Se forma un ion iminio o una base de Schiff que actúa como un sumidero de electrones, lo que reduce la energía de activación (E_{a}) para la extracción protónica de C\alpha y la subsiguiente formación de la enamina. La enamina actúa como el agente nucleófilo carbonado, o dador aldólico, que reacciona con un agente electrófilo aldehídico, el aceptor aldólico, para formar un nuevo enlace C-C. La base de Schiff es luego hidrolizada y el producto es liberado. La esencia del mecanismo es la formación de la enamina, que es el agente nucleófilo carbonado naciente.

Las aldolasas de Clase II son metaloenzimas que facilitan la formación de enolatos por coordinación con el oxígeno carbonílico del sustrato. También se han descrito modelos del estado de transición para las reacciones aldólicas en que están implicados metales [H. E. Zimmerman et al., J. Am. Chem. Soc. (1.957), volumen 79, página 1.920]. Sin embargo, aún queda por caracterizar totalmente el mecanismo para las aldolasas de Clase II.

Diversas enzimas catalizan la condensación aldólica. Los mecanismos de actuación de estas enzimas han sido bien caracterizados [C. Y, Lai et al., Science (1.974), volumen 183, página 1.204; y A. J. Morris et al., Biochemistry (1.994), volumen 33, página 12.291]. Sin embargo, las enzimas aldolasa aceptan una variedad relativamente limitada de sustratos [C.-H. Wong et al., Enzymes in Synthetic Organic Chemistry (Pergamon, Oxford, 1.994); M. D. Bednarski en Comprehensive Organic Synthesis, compilado por B. M. Trost (Pergamon, Oxford, 1.991), volumen 2, páginas 455-473; C. F. Barbas III et al., J. Am. Chem. Soc. (1.990), volumen 112, página 2.013; H. J. M. Gijsen et al., J. Am. Chem. Soc. (1.995), volumen 117, página 2.947; C.-H. Wong et al., J. Am. Chem. Soc. (1.995), volumen 117, página 3.333; L. Chen et al., J. Am. Chem. Soc. (1.992), volumen 114, página 741]. Aunque las enzimas aldolasa naturales presentan una gran especificidad con respecto al aceptor aldólico, el dador aldólico está normalmente limitado al sustrato natural. La técnica de la síntesis orgánica se beneficiaría significativamente si se pudieran producir catalizadores que tuvieran la especificidad de sustrato deseada con objeto de catalizar reacciones de adición aldólica deseadas.

Las reacciones de adición aldólica no enzimáticas, catalizadas por una base, se emplean mucho en química orgánica para formar nuevos enlaces carbono-carbono. Además, se ha desarrollado una diversidad de reactivos eficaces para controlar la estereoquímica del aldol. Sin embargo, estos reactivos son estequiométricos y requieren enolatos preformados y una amplia química de grupos protectores [C. H. Heathcock, Aldrichim. Acta (1.990), volumen 23, página 99; C. H. Heathcock, Science (1.981), volumen 214, página 395; D. A. Evans, Science (1.988), volumen 240, página 420; S. Masamune et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1.985), volumen 24, página 1; D. A. Evans et al., Top. Stereochem. (1.982), volumen 13, página 1; C. H. Heathcock et al. en Comprehensive Organic Synthesis, compilado por B. M. Trost (Pergamon, Oxford, 1.991), volumen 2, páginas 133-319 (1.991); e I. Paterson, Pure & Appl. Chem. (1.992), volumen 64, página 1.821]. Se han desarrollado recientemente reacciones aldólicas catalíticas en que se usan enolatos preformados, incluyendo el aldol de copulación cruzada de Mukaiyama [S. Kobayashi et al., Tetrahedron (1.993), volumen 49, página 1.761; K. Furuta et al., J. Am. Chem. Soc. (1.991), volumen 113, página 1.041; T. Bach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1.994), volumen 33, página 417, y las referencias allí citadas; y E. M. Carreira et al., J. Am. Chem. Soc. (1.995), volumen 117, página 3.649].

Para ciertas reacciones, el problema de los productos intermedios complejos puede ser resuelto utilizando compuestos relativamente reactivos, en lugar de los antígenos inertes más habituales, para inmunizar animales o seleccionar anticuerpos de bancos de modo que el proceso de la inducción de anticuerpos implique una reacción química real en el sitio de unión [C. F. Barbas III et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1.991), volumen 88, página 7.978; K. D. Janda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1.994), volumen 191, página 2.532]. Esta misma reacción llega entonces a ser parte del mecanismo catalítico cuando el anticuerpo interacciona con un sustrato que comparte reactividad química con el antígeno utilizado para inducirlo.

Uno de los principales objetivos de la química orgánica es utilizar la comprensión de los mecanismos de reacción para diseñar nuevos catalizadores. Esto no es a menudo sencillo porque hay que enfrentarse a productos intermedios que tienen una energía elevada y una estructura compleja. Los anticuerpos catalíticos ofrecen una posible solución a este problema ya que pueden ser programados por el experimentador para que interaccionen con el estado de transición que limita la velocidad de una reacción química, con objeto de reducir su energía y aumentar la velocidad de reacción [R. A. Lerner et al., Science (1.991), volumen 252, página 659]. Sin embargo, incluso aquí, la capacidad del experimentador para programar el catalizador está normalmente limitada a los aspectos más globales del estado de transición en vez de al mecanismo de reacción detallado. Por lo tanto, aunque uno puede tratar con cargas de alta energía y características estereoelectrónicas y geométricas que aparecen a lo largo de las coordenadas de reacción, aún resulta difícil la organización de los múltiples y complejos productos intermedios de reacción.

Reymond et al. (Tetrahedron Lett. 36 (15), 2.575, 1.995) describen anticuerpos catalíticos para reacción aldólica generados al utilizar haptenos de amonio cuaternario.

Lo que se necesita es un método para inducir anticuerpos en que se usen los mecanismos de reacción que proporcionan a las aldolasas su eficacia, pero que saquen partido de la variedad de sustratos y especificidades estereoquímicas de que se dispone con los anticuerpos. Lo que se necesita es una estrategia que amalgame las mejores características de las sencillas aproximaciones químicas y enzimáticas al problema de formar enlaces carbono-carbono a través de la condensación aldólica, la cual es, defendiblemente, la reacción de formación de enlaces C-C más básica en química y biología.

Sumario

El invento se dirige a la generación de anticuerpos que catalicen la reacción aldólica. Los anticuerpos catalíticos son generados mediante inmunización con un compuesto reactivo que retiene covalentemente un resto de lisina (Lys) en la cavidad ligante del anticuerpo mediante la formación de una amida viníloga estable, es decir, un complejo covalente de anticuerpo/hapteno. Se describe que el mecanismo catalítico para estos anticuerpos catalíticos mimetiza el mecanismo catalítico empleado por las enzimas aldolasa de Clase I naturales.

El mismo mecanismo de reacción empleado para formar el complejo covalente de anticuerpo/hapteno se emplea también para catalizar la reacción aldólica. Durante la catálisis, los anticuerpos utilizan el grupo \varepsilon-amino de Lys para formar una enamina con sustratos cetónicos y luego utilizan esta enamina como un agente nucleófilo carbonado naciente para atacar al segundo sustrato, un aldehído, para formar un nuevo enlace carbono-carbono. Los anticuerpos catalíticos aquí descritos se caracterizan por su amplia especificidad de sustrato y su capacidad para controlar la selectividad diastereofacial de la reacción tanto en la dirección Cram-Felkin como en la dirección anti-Cram-
Felkin.

El presente invento es como se expone en las reivindicaciones. Más particularmente, un aspecto del invento se dirige a moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo que catalizan una reacción de adición aldólica entre un dador cetónico alifático y un aceptor aldehídico. Estos anticuerpos se caracterizan por poder ser generados mediante la inmunización de un animal inmunosensible con un inmunógeno que incluye un hapteno 1,3-dicetónico de fórmula general:

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copulado a una proteína portadora, y también se caracterizan por tener una lisina con un grupo \varepsilon-amino. Se caracterizan además por estar sometidos a inhibición por el hapteno 1,3-dicetónico por formación de un complejo entre el hapteno 1,3-dicetónico y el grupo \varepsilon-amino de la lisina del anticuerpo catalítico. El complejo puede ser una amida viníloga covalente estable, una enamina conjugada o una base de Schiff. En una realización preferida, las moléculas de anticuerpo controlan la selectividad diastereofacial de la reacción de adición aldólica tanto en la dirección Cram-Felkin como en la dirección anti-Cram-Felkin. Los dadores cetónicos alifáticos preferidos incluyen compuestos representados por las estructuras siguientes:

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Los aceptores aldehídicos preferidos incluyen compuestos representados por las estructuras siguientes:

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Otro aspecto del invento se dirige a moléculas de la Reivindicación 1 que son secretadas por el hibridoma 38C2, que tiene el número de acceso HB 12005 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; del inglés, American Type Culture Collection), o por el hibridoma 33F12, que tiene el número de acceso HB 12004 de la ATCC.

Otro aspecto del invento se dirige a células que, cuando son cultivadas en un medio, producen las anteriormente indicadas moléculas de anticuerpo monoclonal o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo que catalizan reacciones de adición aldólica. En una realización preferida, las células son de un tipo que secreta las moléculas de anticuerpo monoclonal o las moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo al medio de cultivo. Las células de hibridoma son una realización preferida, es decir, las células del hibridoma 38C2, que tiene el número de acceso HB 12005 de la ATCC, y las células del hibridoma 33F12, que tiene el número de acceso HB 12004 de la ATCC.

Un aspecto más del invento se dirige a un método para catalizar una reacción de adición aldólica entre un dador cetónico alifático y un aceptor aldehídico. El método comienza con el mezclamiento de una cantidad catalíticamente eficaz de las moléculas de anticuerpo monoclonal o las moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo, de la Reivindicación 1, con el dador cetónico alifático y dicho aceptor aldehídico en un medio acuoso para formar una mezcla de reacción. Una vez que se ha formado la mezcla de reacción, es mantenida durante un periodo de tiempo suficiente para que las moléculas de anticuerpo o las moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo catalicen la reacción de adición aldólica entre el dador cetónico alifático y el aceptor aldehídico. En un modo preferido del anterior método sintético, las moléculas de anticuerpo o las moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo son secretadas por el hibridoma 38C2, que tiene el número de acceso HB 12005 de la ATCC, o por el hibridoma 33F12, que tiene el número de acceso HB 12004 de la ATCC.

Un modo alternativo del invento se dirige a un procedimiento para llevar a cabo una reacción de adición aldólica por formación de una mezcla de reacción al mezclar un dador cetónico alifático, un aceptor aldehídico y una cantidad catalíticamente eficaz de anticuerpos monoclonales o de porciones de los anticuerpos monoclonales que contienen parátopos en un medio acuoso con un valor de pH de entre aproximadamente 6 y 10. Los anticuerpos monoclonales o las porciones de los mismos que contienen parátopos pueden ser generados mediante la inmunización de un animal inmunosensible con un inmunógeno que incluye un hapteno 1,3-dicetónico de fórmula general:

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copulado a una proteína portadora, y son de un tipo que incluye una lisina con un grupo \varepsilon-amino que reacciona con el dador cetónico alifático para formar un producto intermedio enamínico. Una vez que se ha formado la mezcla de reacción, es mantenida bajo condiciones de reacción biológicas durante un periodo de tiempo suficiente para que el producto intermedio enamínico reaccione con el aceptor aldehídico para formar un producto de adición aldólica.

Otro aspecto del invento se dirige a un método para preparar células que, cuando son cultivadas en un medio, producen moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo que catalizan una reacción de adición aldólica entre un dador alifático y un aceptor aldehídico. El método comienza al inmunizar un animal con un inmunógeno que incluye un hapteno 1,3-dicetónico de fórmula general:

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El animal es luego mantenido durante un periodo de tiempo suficiente para que secrete anticuerpos que inmunoreaccionen con el ligando hapténico. Los genes que codifican las moléculas de anticuerpo o las moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo son luego transferidos desde células productoras de anticuerpos del animal inmunizado y mantenido hasta células huésped para formar células híbridas. Las células huésped híbridas contienen genes de al menos dos fuentes. Las células híbridas formadas tienen dos características, a saber: (i) producen, cuando son cultivadas, moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo procedentes de los genes transferidos, y (ii) pueden ser cultivadas de un modo sustancialmente indefinido. Las células híbridas son luego cultivadas en un medio de cultivo apropiado durante un periodo de tiempo suficiente para que produzcan moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo. A continuación, las moléculas de anticuerpo o las moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo son recuperadas de las células híbridas cultivadas. Las obtenidas moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo son luego exploradas en cuanto a su actividad catalítica dirigida a la reacción de adición aldólica. Y, finalmente, se cultivan los clones de la célula híbrida identificada que produce moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo que catalizan la reacción de adición aldólica entre el dador alifático y el aceptor aldehídico. Las células híbridas preferidas son las células de hibridoma.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el mecanismo general de una reacción de adición aldólica catalizada por aldolasa de Clase I [Lai et al., Science 183, 1.204 (1.974); Morris et al., Biochemistry 33, 12.291 (1.994); Rutter et al., Fed. Proc. Amer. Soc. Exp. Biol. 23, 1.248 (1.964)] ("Enz" significa enzima y "B" significa base).

La Figura 2 ilustra el mecanismo de retención del grupo \varepsilon-amino esencial de un resto de Lys en la cavidad ligante del anticuerpo (Ab; del inglés, antibody) al usarse el hapteno 1,3-dicetónico 5. La formación de la amida viníloga covalente estable (dibujo inferior derecho) puede ser detectada a \lambda = 316 nm (\varepsilon es el coeficiente de extinción = 15.000). R = \rho[HOOC(CH_{2})_{3}CONH]C_{6}H_{4}-.

La Figura 3 ilustra que la estructura del hapteno 1,3-dicetónico contiene los elementos de una trampa química y entrópica. La cavidad ligante inducida con el hapteno 5 no impide la consecución de un ángulo Heathcock razonable para el ataque del dador aldólico al aceptor. Se alcanza una apropiada geometría de ataque mediante una sencilla rotación tanto de la cara enamínica como de la aldehídica.

La Figura 4 ilustra la síntesis del hapteno 5. Las operaciones son las siguientes; (a) diisopropilamiduro de litio (LDA; del inglés, lithium diisopropylamide) [2 equivalentes (eq)], THF, 40ºC, 1 hora; (b) bromuro de 4-nitrobencilo, hexametilfosforamida, de -78ºC a -40ºC, 48% de rendimiento; (c) (i) Pd/C, H_{2}, etanol; (ii) anhídrido glutárico, CH_{2}Cl_{2}, 74% de rendimiento.

La Figura 5 ilustra la exploración de anticuerpos en cuanto a la formación del producto intermedio de amida viníloga (estructura inferior derecha; Figura 2). Se añadió hapteno 5 (5 eq) a disoluciones 20 mM de cada anticuerpo en tampón de disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered saline), pH = 7,5, según un modelo de placa de microtitulación. Los anticuerpos con actividad catalítica aldolasa presentaban el típico máximo de absorción de la amida viníloga a 316 nm (ejemplo mostrado en la línea superior), mientras que ninguno de los anticuerpos inactivos lo presentó (ejemplo mostrado en la línea inferior). Dos de 20 anticuerpos formaron el producto intermedio de amida viníloga (estructura inferior derecha; Figura 2), determinándose posteriormente que eran catalíticos. Este eficaz método proporciona la rápida exploración de un gran número de anticuerpos.

La Figura 6(A) ilustra la determinación del coeficiente de extinción del producto intermedio de amida viníloga (estructura inferior derecha; Figura 2). Se añadió hapteno 5 en una concentración fija (100 mM) al anticuerpo 33F12 en las concentraciones indicadas. El complejo de anticuerpo y enamina pudo ser fácilmente detectado con anticuerpo en una concentración tan pequeña como 2 mM. La Figura 6(B) ilustra que los sitios activos del anticuerpo 38C2 eran titulados con acetilacetona. La concentración del anticuerpo era fija (20 mM). Se añadió acetilacetona (de 0 a 4,5 eq) y se midió la absorción a 316 nm. La intersección de las dos líneas corresponde a una relación 1:9 de acetilacetona a anticuerpo 38C2, lo que indica que ambos sitios ligantes del anticuerpo forman el aducto enamínico (estructura inferior derecha; Figura 2).

La Figura 7 ilustra la distribución de productos de la reacción, catalizada por anticuerpo, de (6+7) con acetona después de un 30% de conversión con una columna de soporte quiral para cromatografía de alta eficacia en estado líquido (HPLC; del inglés, high performance liquid chromatography) y fase normal.

La Figura 8 ilustra la reacción de adición aldólica del aldehído (6+7) y acetona, según se controló a lo largo de un periodo de 36 horas en presencia de catalizador al 1,5%. El catalizador mostró múltiples recambios (\sim2 recambios/hora) y casi ninguna inhibición por producto. Se pudo obtener un 90% de conversión en presencia de acetona en exceso (5% en volumen/volumen), para minimizar la reacción retroaldólica. El perfecto balance másico (línea superior) indica que no se produjeron reacciones secundarias, tal como eliminación o polimerización, durante ese periodo. De esta manera, la reacción aldólica catalizada por anticuerpo es un método excepcionalmente suave para la formación de enlaces C-C.

La Figura 9 ilustra la especificidad del anticuerpo 38C2 en cuanto al sustrato. Los parámetros cinéticos k_{cat} y K_{m} de cada reacción fueron calculados con respecto al aldehído (12 ó 6+7). En cada experimento se fijó una concentración constante del 5% (en volumen/volumen) para los dadores aldólicos (acetona, 2-butanona, 3-pentanona, 2-pentanona y acetaldehído). Se formaron los productos 15/16 y 18/19 en relaciones de 94 a 4 y 73 a 27, respectivamente.

La Figura 10 ilustra la síntesis de los aldehídos (6+7) y 12 a partir de p-yodoanilina usando la reacción de Heck (Jeffrey et al., J. Chem. Comm. 1984, 1.287). Se obtuvieron mezclas de productos en la adición aldólica a partir de los compuestos (6+7) y 12 al usar NaOH, agua y acetona.

La Figura 11 ilustra la cinética de la reacción aldólica en que se usan los anticuerpos 38C2 y 33F12 derivados del hapteno 5, aldehído 12 y acetona para obtener el compuesto 13/14 en un pH = 7,02. K_{cat} = 4,0\cdot10^{-3} [min^{-1}]; K_{M} = 5,8 [\muM].

La Figura 12 ilustra la cinética aldólica y retroaldólica al usar los anticuerpos 38C2 y 33F12 derivados del hapteno 5, aldehído 12 y acetona para obtener el compuesto 13/14. Flecha directa: reacción aldólica en un pH = 7,44. K_{cat} = 6,7\cdot10^{-3} [min^{-1}]; K_{M} = 17 [\muM]; flecha inversa: reacción retroaldólica en un pH = 7,22. K_{cat} = 4,4\cdot10^{-3} [min^{-1}]; K_{M} = 54 [\muM].

La Figura 13 ilustra la cinética de una reacción aldólica retrógrada en que se usan los anticuerpos 38C2 y 33F12 derivados del hapteno 5, y el producto 13/14 para formar el aldehído 12 y acetona. El procedimiento fue el siguiente: se introdujo una disolución (100 \mul, pH = 7,22) que contenía EDTA 0,2 mM, Tris 100 mM, 4,5 mg de alcohol deshidrogenasa de levadura, 0,43 mg de NADH y \beta-hidroxicetona 4 (4 mM) en cuatro pocillos de una placa de microtitulación. Se añadieron los anticuerpos 38C2 y 33F12 (100 \mul, 34,6 mM, tampón de Tris, pH = 7,22) a dos pocillos diferentes; se añadieron 100 ml de tampón solo a los pocillos restantes, que fueron los blancos. Se midió la absorbancia ultravioleta a 340 nm cada 15 minutos durante 24 horas. La absorbancia de los blancos fue restada de la absorbancia de las reacciones catalizadas, y la velocidad fue determinada usando \varepsilon = 6.220 M^{-1}cm^{-1}. Reacción aldólica retrógrada en pH = 7,22: K_{cat} = 3,7\cdot10^{-3} [min^{-1}]; K_{M} = 4,6 [\muM].

Descripción detallada

Los haptenos son diseñados tanto para retener el resto de Lys requerido en el sitio activo del anticuerpo, para inducir que el anticuerpo forme el producto intermedio enamínico esencial, como para inducir los apropiados sitios ligantes para que los dos sustratos superen la barrera entrópica intrínseca a esta reacción bimolecular. El sencillo hapteno 1,3-dicetónico 5 proporciona elementos tanto de una trampa química como de una entrópica, como se ilustra en la Figura 2. En agua, la forma cetónica del hapteno mostrado predomina sobre la forma enólica en una relación de 3 a 1 [M. Moriyasu et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. II (1.986), página 515]. Las coordenadas de reacción de la adición aldólica y el mecanismo de reacción esperado cuando el hapteno interacciona con ciertos anticuerpos comparten varios productos intermedios comunes. En ambos casos, se forma un producto intermedio tetraédrico de carbinolamina que se deshidrata para proporcionar el iminio catiónico, que se tautomeriza hasta la enamina. Se esperaba que los anticuerpos inducidos de acuerdo con el mecanismo de reacción hapténico estabilizarían los productos intermedios catiónicos y los estados de transición análogos a lo largo de las coordenadas de reacción de la reacción aldólica. La fuerza impulsora para la reacción del hapteno 1,3-dicetónico con el anticuerpo es la formación de una enamina conjugada o una amida viníloga covalente estable entre el hapteno y el grupo \varepsilon-amino de la lisina. Cálculos basados en las reglas de Woodward para enonas indicaban que la amida viníloga tendría un máximo de absorción en una región espectral ultravioleta apropiada para permitir su identificación, \lambda_{max} = 318 nm [E. Pretsch et al., Tables of Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds (Springer-Verlag, Berlín, 2ª edición, 1.989), página U20]. La estabilidad y las características espectrales de este tipo de compuestos fueron previamente advertidas por Westheimer y sus colaboradores en los estudios sobre la acetoacetato descarboxilasa [W. Tagaki et al., Biochemistry (1.968), volumen 7, página 905]. Se esperaba ahora una ventaja entrópica mediante la incorporación del segundo sustrato (aceptor aldólico) a la trampa química dicetónica. Se ha sugerido que los efectos entrópicos pueden contribuir con tanto como de 10^{8} a 10^{11} al índice de aceleración de las enzimas naturales [M. I. Page et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A (1.971), volumen 68, página 1.678].

Un ejemplo preferido de la reacción descrita es la adición aldólica de acetona a derivados de 3-fenilpropionaldehído. El segundo sustrato está representado por la porción 3-fenilpropiononilo del hapteno. La fijación de los dos sustratos al hapteno dicetónico presentaría un complejo de sustratos en que el ángulo Heathcock para el ataque de la enamina al aldehído estaría retorcido hasta el extremo de 90º en el estado de transición, determinante de la velocidad, de la formación del enlace C-C [E. P. Lodge et al., J. Am. Chem. Soc. (1.987), volumen 109, 3.353]. Esto no se esperaba ni demostró ser un impedimento fundamental en la reacción catalítica puesto que la rotación tanto de la cara enamínica como de la aldehídica debe proporcionar un ángulo Heathcock razonable, como se ilustra en la Figura 3.

El concepto central del invento aquí descrito es que, mediante inmunización con compuestos reactivos, se pueden inducir catalizadores que empleen un mecanismo de reacción covalente. Los ejemplos de este principio aquí proporcionado incluyen, pero no se limitan a, mecanismos de bases de Schiff y de enaminas. Este planteamiento es particularmente útil siempre que la química que se va a llevar a cabo está más allá de la que se alcanza fácilmente incluso mediante un concierto de interacciones no covalentes.

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Ejemplos Síntesis del Compuesto 3 (Figura 4)

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Compuesto 3

Se disolvió diisopropilamina (1,43 ml, 2,1 eq), destilada sobre CaH_{2}, en THF seco (80 ml). Se enfrió la disolución a 0ºC y se añadió lentamente butil-litio 1,6 M en hexano (6,4 ml, 2,1 eq). Se mantuvo la disolución incolora de diisopropilamiduro de litio (LDA) a 0ºC durante 30 minutos y se añadió hexametilfosforamida (0,8 ml, 0,9 eq). Se añadió lentamente 2,4-pentanodiona recién destilada (0.5 ml, 1,0 eq; Aldrich), disuelta en THF seco (20 ml). Se calentó la mezcla a 40ºC durante 1 hora. Se enfrió la disolución amarillenta del dianión a -78ºC y se añadió lentamente bromuro de 4-nitrobencilo (1,052 g, 1,0 eq; Aldrich Chemical Company), disuelto en THF seco (20 ml). Se elevó lentamente la temperatura (\sim 20 min) hasta -40ºC [control por cromatografía en capa fina (TLC; del inglés, thin layer chromatography): AcOEt/éter de petróleo (1:3)]. Se vertió la mezcla de reacción en una mezcla de CH_{2}Cl_{2} y disolución saturada de NH_{4}Cl (100 ml), enfriada con hielo. Tras la separación de las fases, la fase acuosa fue sometida a una nueva extracción con CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas combinadas fueron secadas sobre MgSO_{4}, y el disolvente fue evaporado. El residuo fue purificado mediante cromatografía en columna [SiO_{2}, malla de 230-400, AcOEt/éter de petróleo (1:3)] para obtener 3 (544 mg, 48%) en forma de sólido amarillento, el cual puede ser recristalizado en AcOEt/éter de petróleo (1:3). Resonancia magnética nuclear (NMR; del inglés, nuclear magnetic resonance) de ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz): forma enólica, \delta: 8,12 - 8,19 (m, 2H), 7,33 - 7,41 (m, 2H), 5,47 (s, 1H), 3,05 (t, J = 7,5, 2H), 2,65 (t, J = 7,5, 2H), 2,08 (s, 3H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}, 125 MHz): forma enólica, \delta: 192,7, 190,3, 148,5, 129,2, 123,7, 100,1, 39,2, 30,9, 24,5; forma cetónica parcial, \delta: 146,5, 57,7, 44,2, 28,9; IR (neto): \eta_{max}, 3.078, 2.928, 2.853, 1.706, 1.600, 1.516, 1,343, 1.108, 854 cm^{-1}; espectrometría de masas (MS; del inglés, mass spectrometry), m/z (intensidad relativa): 236 (M + H^{+}, 100); C_{12}H_{13}NO_{4} (235,239).

Síntesis del hapteno dicetónico 5 (Figura 4)

8

Compuesto 5

Se disolvió la dicetona 3 (100 mg, 0,43 milimoles) en EtOH (10 ml). Se añadió Pd al 10%/C (45 mg, 0,1 eq) y se hidrogenó la mezcla durante 45 minutos bajo una agitación enérgica [TLC: CH_{2}Cl_{2}/Et_{2}O (1:3)]. La suspensión fue filtrada a través de Celite, lavada con CH_{2}Cl_{2} (\sim50 ml) y secada sobre MgSO_{4}. La evaporación del disolvente proporcionó la amina 4 cruda, que fue redisuelta en CH_{2}Cl_{2} (15 ml). Se enfrió la disolución a 0ºC y se añadió anhídrido glutárico (53 mg, 1,1 eq). La mezcla fue agitada a temperatura ambiental durante 1,5 horas [TLC: CH_{2}Cl_{2}/Et_{2}O (1:3)]. La disolución fue sometida a extracción con NaOH 0,2 N. La fase acuosa fue acidificada hasta un pH = 1,0 con HCl 2 N y fue sometida 3 veces a extracción con AcOEt (15 ml). Las fases orgánicas combinadas fueron secadas sobre MgSO_{4}, y el disolvente fue evaporado para obtener 5 (100 mg, 74%) en forma de sólido blanco. ^{1}H-NMR (CDCl_{3}, 500 MHz): forma enólica, \delta: 8,08 (s, 1H), 7,39 - 7,42 (m, 2H), 7,06 - 7,10 (m, 2H), 5,47 (s, 1H), 2,86 (t, J = 8,1, 2H), 2,54 (t, J = 8,1, 2H), 2,39 - 2,44 (m, 4H), 2,03 (s, 3H), 1,98 - 2,04 (m, 2H); forma cetónica, \delta: 8,13 (s, 1H), 7,39 - 7,42 (m, 2H), 7,06 - 7,10 (m, 2H), 3,56 (s, 2H), 2,78 - 2,85 (m, 4H), 2,39 - 2,44 (m, 4H), 2,19 (s, 3H), 1,94 - 1,98 (m, 2H); ^{13}C-NMR (CDCl_{3}, 125 MHz): forma enólica, \delta: 193,3, 191,3, 178,0, 171,3, 136,7, 135,9, 128,7, 120,3, 100,1, 36,9, 36,0, 33,0, 30,8, 24,8, 20,6; forma cetónica parcial, \delta: 57,8, 45,1, 32,9, 28,7, 19,6; IR (KBr), \eta_{max}: 3.325, 3.113, 3.044, 2.935, 1.696, 1.658, 1.602, 1.531, 1.413, 1.311, 918, 830, 683 cm^{-1}; MS, m/z (intensidad relativa): 320 (M + H^{+}, 92); C_{17}H_{21}NO_{5} (319,357). Nota: Cerca del 83% de la dicetona 5 está en forma cetónica en CHCl_{3}.

Copulación del hapteno a la proteína portadora

El hapteno 5 fue copulado a hemocianina de lapa del género Fissurella, una proteína portadora habitualmente utilizada, de acuerdo con las condiciones especificadas por Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1.988, 79.

Producción de anticuerpos a partir de líneas celulares de hibridoma

Después de la inmunización de 129 ratones G^{1X+} (Scripps Research Institute), se obtuvieron 20 hibridomas que producían anticuerpos hacia 5 mediante métodos estándares como los descritos por G. Kohler et al., Nature 256, 495 (1.975). Los anticuerpos de cada línea celular fueron luego purificados mediante precipitación con sulfato amónico, intercambio aniónico, y cromatografía de afinidad con proteína G del modo descrito por V. E. Gouverneur et al., Science 262, 204 (1.993). Se aislaron 20 anticuerpos.

Exploración de los anticuerpos (Figura 5)

Mediante un ensayo en placa de microtitulación, los 20 anticuerpos fueron explorados en cuanto a su capacidad para formar la propuesta amida viníloga estable, como se muestra en la Figura 2, por incubación de anticuerpo 20 mM con 100 mM del hapteno dicetónico 5 (Figura 5). Dos anticuerpos, 38C2 y 33F12, mostraron un intenso máximo de absorción a 316 nm, característico de la propuesta amida viníloga, como se muestra en la Figura 2, que se aproxima al máximo de absorción calculado de 318 nm en ausencia de proteína (Figura 5). La incubación de 5 con lisina bajo unas condiciones idénticas no dio lugar a un aumento de absorbancia.

Determinación del coeficiente de extinción (Figura 6A)

Se determinó que el coeficiente de extinción del complejo anticuerpo-enamina era 15.000 cm^{-1}M^{-1} después de la sustracción de la absorbancia del anticuerpo (Figura 6A), que se aproxima al observado en la reacción del acetopiruvato con la enzima acetoacetato descarboxilasa: 19.000 cm^{-1}M^{-1} [W. Tagaki et al., Biochemistry (1.968), volumen 7, página 905].

Determinación de la estequiometría del complejo anticuerpo/enamina por medio de la titulación con acetilacetona (Figura 6B)

Puesto que se espera que los anticuerpos formen una enamina con acetona en la reacción sintética, la observación del grupo cromóforo de la amida viníloga no debería depender de la porción de aceptor aldólico (bencilo) del hapteno. Se ensayó la acetilacetona como la dicetona mínima de la que se esperaba que generase el grupo cromóforo. Ambos anticuerpos reaccionaron con este compuesto y produjeron el esperado espectro de absorbancia. Para determinar la estequiometría del complejo anticuerpo/enamina, se llevó a cabo una titulación del anticuerpo con acetilacetona de acuerdo con las condiciones de Tagaki et al., Biochemistry 7, 905, 1.968. Suponiendo que la reacción que forma la enamina es irreversible, la estequiometría de la titulación debería corresponder a la concentración de sitios activos del anticuerpo. La titulación proporciona una relación de acetilacetona a anticuerpo de 1,9, lo que indica que cada uno de los dos sitios ligantes de antígeno idénticos del anticuerpo forma el aducto de amida viníloga (Figura 6B). La catálisis de la formación de la amida viníloga resultó esencialmente completa tras el mezclamiento del anticuerpo con el hapteno y lo suficientemente rápida para que la determinación de la velocidad de esta reacción requiriera estudios cinéticos de flujo detenido.

Adición de un dador aldólico a aldehídos en presencia de anticuerpo para producir una \beta-hidroxicetona (Figura 9)

Se ensayaron los anticuerpos 38C2 y 33F12 en cuanto a su capacidad para catalizar la adición de dadores aldólicos (acetona, 2-butanona, 3-pentanona y 2-pentanona) a los aldehídos 6, 7 y 12 (Figura 9). Un procedimiento típico es el siguiente: Se introdujeron 100 \mul de disolución tampón de pH = 7,5 con EDTA 0,2 mM, Tris 100 mM y dador aldólico en una concentración de aproximadamente 5% (volumen de dador/volumen de disolvente), en n pocillos de una placa de microtitulación. Se añadieron los anticuerpos 38C2 y 33F12 (100 \mul, 34 \muM, tampón Tris, pH = 7,5) a diferentes pocillos. Se añadieron 100 \mul de tampón solo a los pocillos restantes, que fueron los blancos. Se midió la absorbancia ultravioleta a 340 nm cada 15 minutos durante 24 horas. La absorbancia de los blancos fue restada de la absorbancia de las reacciones catalizadas, y la velocidad fue determinada usando \varepsilon = 6.220 M^{-1}cm^{-1}. Los anticuerpos 38C2 y 33F12 tenían la misma k_{cat}, 4,53\cdot10^{-3} min^{-1}, que se correlaciona bien con las mediciones por HPLC. Se determinaron el consumo y la producción de la \beta-hidroxicetona por cromatografía de alta eficacia en estado líquido (HPLC) y fase inversa, del modo siguiente: se usó una columna RP-C18 (MICROSORB-MV, 0,45 cm por 22 cm) con un programa isocrático de 75/25 de H_{2}O (ácido trifluoroacético al 0,1%)/H_{2}O:acetonitrilo (1:1) y un caudal de 1,5 ml/min, realizándose la determinación a 254 nm. Los tiempos de retención del aldehído 12 y del producto aldólico (13,14) son 6,35 y 8,78 min, respectivamente. Para los estudios cinéticos, la concentración de cetona fue fijada en 5% (volumen/volumen) y la concentración de 12 ó 6+7 fue variada de 30 a 200 \muM en el estudio de la reacción de adición aldólica. Los anticuerpos fueron también ensayados después de una operación de purificación adicional sobre una columna de intercambio aniónico, con idénticos resultados.

Análisis de la reacción retroaldólica (Figura 13)

Ambos anticuerpos demostraron una catálisis de la adición aldólica que seguía una cinética de Michaelis-Menten. La capacidad de estos dos anticuerpos para generar acetona y el aldehído 3 a partir de la \beta-hidroxicetona 4 en la reacción retroaldólica fue determinada siguiendo la disminución de la absorbancia UV a 340 nm en un ensayo enzimático acoplado con alcohol deshidrogenasa y \beta-nicotinamida adenina dinucleótido en su forma reducida (NADH). Un procedimiento típico es el siguiente: se introdujo una disolución (100 \mul, pH = 7,5) que contenía EDTA 0,2 mM, Tris 100 mM, 4,5 mg de alcohol deshidrogenasa de levadura, 0,43 mg de NADH y \beta-hidroxicetona (13,14) 4 mM en cuatro pocillos de una placa de microtitulación. Se añadieron los anticuerpos 38C2 y 33F12 (100 \mul, 34,6 mM, tampón de Tris, pH = 7,5) a dos pocillos diferentes; se añadieron 100 ml de tampón solo a los pocillos restantes, que fueron los blancos. Se midió la absorbancia ultravioleta a 340 nm cada 15 minutos durante 24 horas. La absorbancia de los blancos fue restada de la absorbancia de las reacciones catalizadas, y la velocidad fue determinada usando \varepsilon = 6.220 M^{-1}cm^{-1}. Los anticuerpos 38C2 y 33F12 tenían la misma k_{cat}, 4,53\cdot10^{-3} min^{-1}, que se correlaciona bien con las mediciones por HPLC. Se determinó la producción del aldehído 12 mediante su subsiguiente reducción por alcohol deshidrogenasa y el consumo de NADH. También se estudió la reacción retroaldólica por HPLC, y se obtuvieron los mismos resultados. Los valores de la constante de Michaelis, K_{M}, y de la constante de velocidad catalítica, k_{cat}, fueron 54 \muM y 4,4 x 10^{-3} min^{-1}, respectivamente, para el anticuerpo 38C2. Los 18 anticuerpos restantes fueron incapaces de catalizar las reacciones aldólicas sintética y retrosintética, lo que indica que sólo eran activos aquellos que formaban el producto intermedio crítico (Figura 13).

Inhibición de la reacción aldólica por el sustrato

Se caracterizó la capacidad del hapteno 5 y la acetilacetona para inhibir la reacción aldólica, para implicar a un producto intermedio enamínico. Cuando se proporcionaron 3 equivalentes de hapteno 5 o de acetilacetona antes de los ensayos retroaldólico o de adición aldólica, la actividad catalítica resultó completamente inhibida, lo que muestra que la retención del producto intermedio enamínico con las 1,3-dicetonas impide la catálisis en que está implicado el grupo \varepsilon-amino de Lys. Para establecer que la formación de la enamina con el hapteno en el ensayo de retención y con la acetona en el ensayo catalítico eran dependientes del mismo resto de Lys, anticuerpos incubados con acetona fueron tratados con NaBH_{4}. La reducción, con NaBH_{4}, del producto intermedio imínico formado en la reacción de la acetona con el grupo \varepsilon-amino de Lys de los anticuerpos daría lugar a la isopropilación irreversible de la amina esencial [Chang et al., Science 183, 1.204 (1.974); A. J. Morris et al., Biochemistry 33, 12.291 (1.994)]. Después del tratamiento, los anticuerpos quedaron completamente inactivados en cuanto a su capacidad para formar la amida viníloga con las dicetonas. Estos experimentos proporcionan evidencia de que el mecanismo de reacción y los restos inducidos con el hapteno 1,3-dicetónico son iguales que los reunidos en las reacciones catalíticas. Los anticuerpos aldolasa mostraban un amplio intervalo óptimo de pH, de entre 6 y 10, que se aproxima al observado con las aldolasas de Clase I naturales.

Eficacia de los dadores aldólicos

Los anticuerpos aceptan acetona, fluoroacetona, cloroacetona, 2-butanona, 3-pentanona, 2-pentanona y dihidroxiacetona como sustratos dadores aldólicos. En las reacciones con 2-butanona y 2-pentanona, los anticuerpos presentan cierto control de la regioselectividad de la adición aldólica mediante la formación preferente de la enamina más sustituida. La eficacia relativa de la catálisis con estos sustratos disminuye en un factor de 42, como viene reflejado por k_{cat}/K_{M} en la serie de acetona a pentanona (Figura 9, líneas 1, 3 a 5). Los anticuerpos fallaron a la hora de aceptar el acetaldehído como dador, lo que demuestra que la adición aldólica se dirige con una cetona como dador aldólico. Los dos catalizadores que se han aislado están limitados ya que dirigen la adición aldólica con acetona o cetonas alifáticas como dadores y derivados de 3-fenilpropionaldehído como aceptores.

Reacción aldólica con el aceptor 3-fenilpropionaldehído (6+7) para formar productos \beta-hidroxicetónicos (9,10)

La reacción del aceptor ramificado 3-fenilpropionaldehído (6+7) (Figura 9, línea 1) con acetona fue la más eficaz y mostró poca inhibición por producto (Figura 8). De hecho, basta menos de 1 por ciento en moles de catalizador para conseguir una elevada conversión de sustrato en un tiempo relativamente corto. La reacción sólo produce el deseado producto aldólico puesto que cada mol de aldehído consumido se convierte en el producto \beta-hidroxicetónico (9,10) (Figuras 8 y 9). Para esta reacción, se ha determinado la velocidad de la reacción de fondo no catalizada en un pH = 7,5, bajo unas condiciones idénticas a las utilizadas en los ensayos de anticuerpos, k_{no cat} = 2,28 x 10^{-7} M^{-1}min^{-1} [Reymond et al., Tetrahedron Lett. 36, 2.575 (1.995)]. Esto permite que sea determinada la eficacia de la catálisis mediada por anticuerpo. Para ambos anticuerpos, 38C2 y 33F12, (k_{cat}/K_{M})/kno cat es \sim109. La eficacia de la catálisis es debida, en gran parte, a una ventaja entrópica en la reacción catalizada por anticuerpo que se ve reflejada como una elevada molaridad eficaz, k_{cat}/k_{no cat} > 105 M. La eficacia catalítica ((k_{cat}/K_{M}) de los anticuerpos aldolasa es sólo \sim4.000 veces menor que la eficacia de la enzima más estudiada, la fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa [Chang et al., Science 183, 1.204 (1.974); Tolan et al., Biochemistry 33, 12.291 (1.994)]. La eficacia catalítica del anticuerpo 38C2 para la reacción indicada en la línea 1 de la Figura 9 es 64 veces mayor que la obtenida con la catálisis realizada por la enzima 2-desoxirribosa-5-fosfato aldolasa.

Distribución de los productos aldólicos

Se caracterizó la distribución de productos en la reacción de (6+7) con acetona, catalizada por anticuerpos. La distribución de productos fue determinada después de una conversión del 30% con una columna para HPLC en fase normal, de soporte quiral (Figura 7). Ambos anticuerpos catalizan la adición diastereoselectiva de acetona a la doble cara de (6+7) independientemente de la estereoquímica en el C-2 de este sustrato. Los cuatro diastereoisómeros fueron separados en una columna DAICEL Chiralpak OJ con un programa isocrático de hexano/etanol (7/1), 1 ml/min, 254 nm. Los tiempos de retención de los cuatro isómeros fueron: 19,74 (4R,5R), 23,32 (4R,5S), 25,15 (4S,5R) y 27,91 (4S,5S) minutos. La configuración relativa había sido determinada previamente [se utilizó una columna RP-C18 (MICROSORB-MV, 0,45 cm por 22 cm) con un programa isocrático de 77/23 de H_{2}O (ácido trifluoroacético al 0,1%)/H_{2}O:acetonitrilo (1:1), a 1,5 ml/min, realizándose la determinación a 254 nm]. Los tiempos de retención del aldehído (6+7) y de la \beta-hidroxicetona (13,14) son 19,20 y 21,92 minutos, respectivamente. La configuración absoluta fue deducida de un experimento en que el catalizador era 2-desoxirribosa-5-fosfato aldolasa (DERA). La DERA forma exclusivamente el producto aldólico que posee la configuración (S) en C-4 [C.-H. Wong y G. M. Whitesides, Enzymes in Synthetic Organic Chemistry (Pergamon, Oxford, 1.994)]. El producto aldólico generado por DERA consiste en una mezcla 1:4,5 de (4S,5R)-(compuesto 9) [exceso diastereomérico (ed) de 92%] y (4S,5S)-(compuesto 10) (ed > 95%). Los parámetros cinéticos de esta transformación concreta fueron: k_{cat} = 4,5 x 10^{-2} min^{-1} y K_{m} = 3.400 mM. Las reacciones aldólicas siguen el modo de ataque Cram-Felkin sobre (S) - (6) para generar el producto (4S,5S) - 9 y el modo de ataque anti-Cram-Felkin sobre (R) - (7) para generar el producto (4S,5R) - 10. Los anticuerpos formaban estos productos con rendimientos químicos similares, lo que demuestra la falta de resolución cinética del aldehído racémico en la adición aldólica. Los dos anticuerpos se distinguen entre sí por su capacidad para controlar la selectividad diastereofacial de la reacción, que refleja la capacidad de los catalizadores para orientar (6+7) en la cavidad ligante del anticuerpo con respecto al complejo nucleófilo de anticuerpo-enamina de acetona. Esta unión diferencial se refleja también en diferencias en los anticuerpos en cuanto a la K_{M} para (6+7) (Figura 9).

Síntesis del Compuesto 20 (Figura 10)

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Compuesto 20

Se suspendieron 1,0 equivalentes de 4-yodoanilina (Aldrich) en cloruro de metileno 0,10 molar y se enfrió la suspensión a 0ºC. A continuación, se añadieron 1,1 equivalentes de anhídrido acético y 1,1 equivalentes de trietilamina y se agitó la mezcla durante 2 horas a 0ºC. Una vez que se hubo completado la reacción, según se determinó mediante TLC, la mezcla fue sofocada mediante sucesivos lavados con disolución saturada de cloruro amónico y con agua y fue secada sobre sulfato magnésico. El compuesto fue obtenido por evaporación y fue purificado mediante cromatografía de resolución rápida en columna para obtener el Compuesto 20 con un rendimiento global del 81%.

Síntesis de los Compuestos (6+7) (Figura 10)

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Compuestos 6+7

Procedimiento en que se utiliza la reacción de Heck adaptada por Jeffrey et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1.287 (1.984): Se suspendieron 1,0 equivalentes de Compuesto 20 en dimetilformamida 0,10 molar a 25-30ºC bajo nitrógeno. A continuación, se añadieron 1,1 equivalentes de bicarbonato sódico, 1,1 equivalentes de 2-metil-2-propen-1-ol (Aldrich) y 2% en moles de PdCl_{2}, y se agitó la mezcla durante 12 horas. Una vez que se hubo completado la reacción, según se determinó mediante TLC, la mezcla fue diluida con acetato de etilo y fue sofocada mediante sucesivos lavados con disolución saturada de cloruro amónico y con agua y fue secada sobre sulfato magnésico. El compuesto fue obtenido por evaporación y fue purificado mediante cromatografía de resolución rápida en columna para obtener los Compuestos 6+7 con un rendimiento global del 81%.

Síntesis del Compuesto 12 (Figura 10)

11

Compuesto 12

Procedimiento en que se utiliza la reacción de Heck adaptada por Jeffrey et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1.287 (1.984): Se suspendieron 1,0 equivalentes de Compuesto 20 en dimetilformamida 0,10 molar a 25-30ºC bajo nitrógeno. A continuación, se añadieron 1,1 equivalentes de bicarbonato sódico, 1,1 equivalentes de alcohol alílico (Aldrich) y 2% en moles de PdCl_{2}, y se agitó la mezcla durante 12 horas. Una vez que se hubo completado la reacción, según se determinó mediante TLC, la mezcla fue diluida con acetato de etilo y fue sofocada mediante sucesivos lavados con disolución saturada de cloruro amónico y con agua y fue secada sobre sulfato magnésico. El compuesto fue obtenido por evaporación y fue purificado mediante cromatografía de resolución rápida en columna para obtener el Compuesto 12 con un rendimiento global del 81%.

Síntesis de los Compuestos (8-11; 13,14 - Figura 10)

Típicamente, se sacudieron de 50 a 100 mg de aldehído, 1 ml de cetona, 4 ml de H_{2}O y 10 ml de disolución saturada de NaOH durante 1 hora. Los productos fueron separados y purificados mediante HPLC preparativa en fase inversa.

Caracterización de la especificidad catalítica

Aunque las enzimas naturales presentan una amplia especificidad con respecto al aceptor aldólico, el dador aldólico está normalmente limitado al sustrato natural. El aspecto más limitante de la aplicación de enzimas naturales a la síntesis es su bastante escasa aceptación de una diversidad de sustratos. Por contraste, la especificidad de los anticuerpos aldolasa aquí descritos con respecto al sustrato dador está muy potenciada en comparación con la especificidad de las enzimas naturales. Por ejemplo, entre las cetonas estudiadas para la catálisis por anticuerpos (Figura 9), sólo la acetona es un sustrato de una enzima natural. Por contraste, los anticuerpos aldolasa pueden utilizar diversos aceptores y dadores aldólicos. Los anticuerpos aceptan acetona, fluoroacetona, cloroacetona, 2-butanona, 3-pentanona, 2-pentanona y dihidroxiacetona como sustratos dadores aldólicos. En las reacciones con 2-butanona y 2-pentanona, los anticuerpos presentan cierto control de la regioselectividad de la adición aldólica mediante la formación preferente de la enamina más sustituida. La eficacia relativa de la catálisis con estos sustratos disminuye en un factor de 42, como viene reflejado por k_{cat}/K_{M} en la serie de acetona a pentanona (Figura 9). El fallo de los anticuerpos en cuanto a aceptar el acetaldehído como dador demuestra que la adición aldólica se dirige con una cetona como dador aldólico. En principio, el hapteno dicetónico debería inducir anticuerpos que reaccionaran con cualquiera de las dos posiciones cetónicas del hapteno 5, generándose por ello catalizadores que dirigieran la adición aldólica en cualquier dirección (Figura 9). Los dos catalizadores que se han aislado están limitados ya que dirigen la adición aldólica con acetona o cetonas alifáticas como dadores y derivados de 3-fenilpropionaldehído como aceptores. La exploración de anticuerpos adicionales debería proporcionar catalizadores para la reacción en que se aceptaran derivados de 3-fenilpropanona como dadores aldólicos y los aldehídos alifáticos sirvieran como aceptores, como se indica en la Figura 9.

Depósito de hibridomas

Los depósitos del hibridoma 38C2 (JW 3862), que tiene el número de acceso HB12005 de la ATCC, y del hibridoma 33F12 (JW 33F12), que tiene el número de acceso HB12004 de la ATCC, se realizaron de conformidad con los requisitos del Tratado de Budapest relativos a que la duración de los depósitos debe ser por 30 años a partir de la fecha de depósito en la depositaría o por la vida aplicable de una patente de EE.UU. que madure a partir de esta solicitud, lo que dure más. La línea celular será repuesta conforme se vuelva inviable en la depositaría.

Claims

1. Moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo que catalizan una reacción de adición aldólica entre un dador cetónico alifático y un aceptor aldehídico y que se caracterizan por poder ser generadas mediante la inmunización de un animal inmunosensible con un inmunógeno que incluye un hapteno 1,3-dicetónico de fórmula general:

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copulado a una proteína portadora, y también se caracterizan por tener una lisina con un grupo \varepsilon-amino y por estar sometidas a inhibición por el hapteno 1,3-dicetónico por formación de un complejo entre el hapteno 1,3-dicetónico y el grupo \varepsilon-amino de la lisina de dicho anticuerpo catalítico, complejo que es seleccionado del grupo que consiste en una amida viníloga covalente estable, una enamina conjugada y una base de Schiff.

2. Las moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo, de la Reivindicación 1, en que:

dichas moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo controlan la selectividad diastereofacial de la reacción de adición aldólica tanto en la dirección Cram-Felkin como en la dirección anti-Cram-Felkin.

3. Las moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo, de la Reivindicación 1, en que:

dicho dador cetónico alifático es seleccionado de un grupo representado por las estructuras siguientes:

13

4. Las moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo, de la Reivindicación 1, en que:

dicho aceptor aldehídico es seleccionado de un grupo representado por las estructuras siguientes:

14

15

5. Las moléculas de la Reivindicación 1 que son secretadas por el hibridoma 38C2, que tiene el número de acceso HB 12005 de la ATCC.

6. Las moléculas de la Reivindicación 1 que son secretadas por el hibridoma 33F12, que tiene el número de acceso HB 12004 de la ATCC.

7. Células que, cuando son cultivadas en un medio, producen moléculas de anticuerpo monoclonal o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo que catalizan una reacción de adición aldólica entre un dador cetónico alifático y un aceptor aldehídico y que se caracterizan por tener una lisina con un grupo \varepsilon-amino y por estar sometidas a inhibición por el hapteno 1,3-dicetónico de fórmula general:

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por formación de un complejo entre el hapteno 1,3-dicetónico y el grupo \varepsilon-amino de la lisina de dicho anticuerpo catalítico, complejo que es seleccionado del grupo que consiste en una amida viníloga covalente estable y una enamina conjugada.

8. Las células de la Reivindicación 7, que además secretan al medio de cultivo dichas moléculas de anticuerpo monoclonal o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo.

9. Las células de la Reivindicación 8, que son células de hibridoma.

10. Células de hibridoma de la Reivindicación 9, que son las del hibridoma 38C2, que tiene el número de acceso HB 12005 de la ATCC.

11. Células de hibridoma de la Reivindicación 9, que son las del hibridoma 33F12, que tiene el número de acceso HB 12004 de la ATCC.

12. Un método para catalizar una reacción de adición aldólica entre un dador cetónico alifático y un aceptor aldehídico, método que comprende las operaciones:

Operación A: mezclar una cantidad catalíticamente eficaz de las moléculas de anticuerpo monoclonal o las moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo, de la Reivindicación 1, con dicho dador cetónico alifático y dicho aceptor aldehídico en un medio acuoso para formar una mezcla de reacción; y luego

Operación B: mantener dicha mezcla de reacción de dicha Operación A durante un periodo de tiempo suficiente para que dichas moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo catalicen dicha reacción de adición aldólica entre dicho dador cetónico alifático y dicho aceptor aldehí-
dico.

13. El método de la Reivindicación 12, en que dichas moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación de dichos anticuerpos son secretadas por el hibridoma 38C2, que tiene el número de acceso HB 12005 de la ATCC.

14. El método de la Reivindicación 12, en que dichas moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación de dichos anticuerpos son secretadas por el hibridoma 33F12, que tiene el número de acceso HB 12004 de la ATCC.

15. Un procedimiento para llevar a cabo una reacción de adición aldólica, que comprende las operaciones siguientes:

Operación A: En un medio acuoso con un valor de pH de entre aproximadamente 6 y 10, formar una mezcla de reacción al mezclar un dador cetónico alifático, un aceptor aldehídico y una cantidad catalíticamente eficaz de anticuerpos monoclonales o de porciones de dichos anticuerpos monoclonales que contienen parátopos, en que dichos anticuerpos monoclonales o dichas porciones de los mismos que contienen parátopos pueden ser generados mediante la inmunización de un animal inmunosensible con un inmunógeno que incluye un hapteno 1,3-dicetónico de fórmula general:

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copulado a una proteína portadora, e incluyen una lisina con un grupo \varepsilon-amino que reacciona con el dador cetónico alifático para formar un producto intermedio enamínico; y luego

Operación B: mantener dicha mezcla de reacción bajo condiciones de reacción biológicas durante un periodo de tiempo suficiente para que el producto intermedio enamínico de dicha Operación A reaccione con el aceptor aldehídico para formar un producto de adición aldólica.

16. Un método para preparar células que, cuando son cultivadas en un medio, producen moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo que catalizan una reacción de adición aldólica entre un dador cetónico alifático y un aceptor aldehídico, método que comprende las operaciones:

Operación A: inmunizar un animal con un inmunógeno que incluye un hapteno 1,3-dicetónico de fórmula general:

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copulado a una proteína portadora; luego

Operación B: mantener dicho animal durante un periodo de tiempo suficiente para que dicho animal secrete anticuerpos que inmunoreaccionen con un ligando hapténico; luego

Operación C: transferir genes que codifican moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo, desde células productoras de anticuerpos de dicho animal inmunizado y mantenido de dicha Operación B hasta células huésped para formar células híbridas que contienen genes de al menos dos fuentes, células híbridas formadas que (i) producen moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo procedentes de dichos genes transferidos, cuando son cultivadas y (ii) pueden ser cultivadas de un modo sustancialmente indefinido; luego

Operación D: cultivar las células híbridas en un medio de cultivo apropiado durante un periodo de tiempo suficiente para que esas células híbridas produzcan moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo; luego

Operación E: recuperar, de las células híbridas cultivadas, las moléculas de anticuerpo o las moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo; luego

Operación F: explorar las obtenidas moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo que catalizan la reacción de adición aldólica; y luego

Operación G: cultivar clones de dicha célula híbrida identificada que produce moléculas de anticuerpo o moléculas que contienen porciones de los sitios de combinación del anticuerpo que catalizan la reacción de adición aldólica entre el dador alifático y el aceptor aldehídico.

17. El método de la Reivindicación 16, en que las células formadas en dicha Operación C son células de hibridoma.