ES2298829T3

ES2298829T3 - Agente para el tratamiento de infecciones por leishmania.

Info

Publication number: ES2298829T3
Application number: ES04790046T
Authority: ES
Inventors: Burghardt Wittig; Laura Fuertes-Lopez; Marcos Timon-Jimenez
Original assignee: Mologen AG
Current assignee: Mologen AG
Priority date: 2003-10-24
Filing date: 2004-10-22
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2024-10-22
Also published as: MXPA06004025A; US8669100B2; DK1615663T3; US20060194753A1; BRPI0412913B1; US20110223189A1; WO2005039633A1; DE502004005784D1; CY1107286T1; EP1615663B1; BRPI0412913A; ATE381942T1; EP1615663A1; PT1615663E; US7795406B2

Abstract

Uso de un constructo de expresión de ADN para la preparación de un medicamento para la inmunización contra infecciones por leishmaniosis, en el que el citado constructo de expresión de ADN contiene una o varias secuencias de ácido nucleico de codificación que conducen a la expresión de los antígenos de Leishmania infantum gen de la proteína antioxidante específica de tiol (TSA), glicoproteína gp63 y proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11).

Description

Agente para el tratamiento de infecciones por Leishmania.

La invención se refiere al uso de una combinación de constructos de expresión de ADN para la preparación de un medicamento para la inmunización frente a infecciones por leishmaniosis, así como a una correspondiente vacuna. Los constructos de ADN mismos son igualmente objeto de la invención.

Las Leishmania son flagelados tripanosomátidos del orden de los cinetoplástidos que se transmiten mediante moscas de arena hembra chupadoras de sangre del género Phlebotomus y Lutzomyia a distintas especies de mamíferos y al hombre. Las leishmaniosis son enfermedades con distintos cuadros clínicos que representan un problema de salud significativo. La OMS estima que en todo el mundo están afectados por la enfermedad aproximadamente 12 millones de personas. Aproximadamente 2 a 9% de todos los pacientes de VIH padecen leishmaniosis visceral, por tanto ésta es la tercera enfermedad parasitaria más común que padecen las personas positivas de VIH. Aunque en las leishmaniosis mucocutánea y cutánea aparecen destrucciones de tejido considerables, la leishmaniosis visceral (kala-azar) no tratada termina la mayoría de las veces con la muerte.

Para el tratamiento de la enfermedad, están disponibles sólo unos pocos medicamentos probados clínicamente. Así, se utilizan desde hace aproximadamente 60 años para la terapia de leishmaniosis visceral productos quimioterapéuticos, principalmente compuestos del metal pesado antimonio. Sin embargo, la toxicidad masiva en cierta medida de la mayoría de estos preparados limita su uso. Además, las Leishmania han desarrollado resistencia en muchos campos frente a los preparados de antimonio (J. Postgrad. Med., ene-mar 2003, 49(1), 61-68).

No hay hasta ahora una vacunación rutinaria compatible y protectora.

Ya que las personas que han sufrido la infección desarrollan una fuerte inmunidad contra una infección posterior, debería ser posible el desarrollo de una protección por vacunación eficaz.

La vacunación o inmunoterapia de la leishmaniosis, cuya causa son parásitos intracelulares, debería ser posible mediante la generación de una reacción inmune Th1 típica. En el estado de la técnica, se indica en muchos casos la importancia de la generación de una respuesta Th1 en la terapia o prevención de leishmaniosis (Handman et al., J. Immunol. 160: 3949-3957, Gurunathan et al., Nature Med.: 4(12): 1409-1415). Para la potenciación de la activación de una respuesta inmune Th1 típica, se refiere la citocina IL-12 coestimulatoria como coadyuvante indispensable (Parker et al., J. Immunol. 104: 896-902).

Además, pueden utilizarse secuencias de ácido nucleico inmunoestimulantes (SAI) como coadyuvante. Los motivos CPG de las SAI efectúan una elevación de la actividad de las células NK y macrófagos así como una fuerte estimulación de la respuesta inmune TH1 celular. Preferiblemente, pueden utilizarse SAI cerradas covalentemente con una longitud de 30 pb como se describen, por ejemplo, en el documento EP 1.196.178 A1.

Se han ensayado distintos antígenos en protocolos de vacunación experimentales en ratones. La reacción inmunológica en ratones ante esta infección parece compararse con la del hombre y probablemente también con la del perro (Cox, Int. J. Parasitol., 263: 1147-1157). Los antígenos relacionados eran gp63 (Scott et al., J. Exp. Med. 168: 1675-1684), gp46 (McMahon-Pratt et al., Infection and Immunity 61: 3351-3359), p-4 y p-8 (Scott et al., Immunology 99: 615-624), así como p36 o también el antígeno designado como LACK (Gonzales-Aseguinolaza et al., Eur. J. Biochem. 259: 909-916). El régimen de vacunación más exitoso, primera inmunización con proteína p36, segunda inmunización con virus Vaccinia que codifica p36 e IL-12, conducía a una reducción media de las lesiones de un 52% en comparación con ratones no vacunados (Gonzalo et al., Microbes and Infection: 3 (9),
701-711).

Además de una protección de sólo un 52%, se utilizaban en el ensayo citado virus Vaccinia como vehículo génico. A este respecto, se trata de vectores víricos que a causa de su alta eficacia de transfección representan todavía el vehículo génico más frecuentemente utilizado. Sin embargo, es conocido que existe un alto riesgo de reacción citotóxica del organismo anfitrión ante las células transfectadas. Así, la aplicación de una alta de dosis de un adenovirus condujo en un ensayo clínico a la muerte del paciente; aparentemente la causa de ello fue una fuerte sobrerreación del sistema inmune (Lehrman, 1999, Nature 401: 517-518). Además, por la inestabilidad de la cepa de vacunación atenuada, no hay que excluir la retrotransformación en una cepa virulenta. Además, los componentes víricos mismos pueden actuar como inmunógenos, lo que conduce a un descenso de su actividad por el sistema inmune del
paciente.

En trabajos propios de la solicitante, se han inmunizado ratones BALB/c con vectores de expresión mínimos que codificaban el antígeno p36 LACK. A este respecto, se han empleado distintos esquemas de vacunación. En el marco de estos estudios, pudo conseguirse en un grupo un 57% de protección ante una infección por Leishmania major (L. López-Fuertes et al., 2002, Vaccine 21: 247-257).

Gurunathan et al. utilizan el antígeno p36 LACK, codificado por vectores de expresión eucarióticos, en ensayos de vacunación en ratones (J. Exp. Med., vol. 186, nº 7 (1997): 1137-1147).

En otras preparaciones, se han utilizado distintas combinaciones de antígeno. Con una mezcla de ADN de plásmido que codifica TSA y LmST11, pudo reducirse así el tamaño de las lesiones durante un intervalo de tiempo determinado después de la infección (A. Campos-Neto et al., 2002, Infection and Immunity: 2828-2836).

La combinación terciaria de antígeno LACK, LmST11 y TSA pudo reducir en gran medida la aparición de lesiones dérmicas después de la infección y condujo a una protección mantenida durante varias semanas (S. Méndez et al., 2001, J. of Immunology 166: 5122-5128).

En todos los ensayos citados es común que sea alcanzable sólo una protección parcial y por tanto insuficiente ante una infección por leishmaniosis. Igualmente, se probaron las combinaciones de vacuna desventajosamente no en perros, el vehículo principal, sino en ratones. Es una desventaja adicional que los vehículos génicos sean plásmidos. Los plásmidos se obtienen mediante fermentación bacteriana. Por tanto, contienen además del gen deseado también el ADN necesario para su propagación y selección, habitualmente genes de resistencia frente a los antibióticos usados en la fermentación. En el uso de constructos de expresión génica basados en ADN de plásmido, existe por tanto el riesgo inherente de proliferación de los genes de resistencia a antibióticos lo que, particularmente en campañas de vacunación de protección, no es justificable. En la práctica médica, las desventajas descritas de los vectores de expresión basados en plásmido se oponen a su amplia aplicación masiva.

A partir de este estado de la técnica, es por tanto objetivo de la presente invención poner a disposición un constructo de expresión de ADN o también varios constructos de expresión de ADN que puedan usarse para la preparación de un medicamento para inmunización eficaz contra la leishmaniosis.

El objetivo se consigue mediante las características de las reivindicaciones independientes.

Como constructos de expresión de ADN, se usan preferiblemente constructos de expresión génica definidos inmunológicamente mínimos según la invención, que se designan a continuación como vectores MIDGE (MIDGE®: vectores de Expresión Génica Inmunológicamente Definidos Mínimos, véanse los documentos EP 0.941.318 B1, US 6.451.593 B1). Los vectores MIDGE tienen la ventaja de que con ellos puede renunciarse a estructuras que no son esenciales para el efecto terapéutico.

Según la invención, se prevé particularmente que se use el antígeno inmunogénico p36 LACK en combinación con el antígeno proteína antioxidante específica de tiol de Leishmania infantum (TSA), el antígeno proteína 11 de membrana de cinetoplástidos de Leishmania infantum (Kmp-11) y el antígeno glicoproteína 63 (gp63) de Leishmania infantum para la obtención de una respuesta inmune.

En consecuencia, se prevé el uso de un constructo de expresión de ADN para la preparación de un medicamento para la inmunización contra infecciones por leishmaniosis, en el que el citado constructo de expresión de ADN contiene una o varias secuencias de ácido nucleico de codificación que conducen a la expresión de los antígenos de Leishmania infantum gen de proteína antioxidante específica de tiol (TSA), glicoproteína gp63 y proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11).

Pero se prefiere también el uso de dos o tres constructos de expresión de ADN para la preparación de un medicamento para la inmunización contra infecciones por leishmaniosis, en el que los citados constructos de expresión de ADN contienen respectivamente una o varias secuencias de ácido nucleico de codificación que conducen conjuntamente a la expresión de los antígenos de Leishmania infantum gen de proteína antioxidante específica de tiol (TSA), glicoproteína gp63 y proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11).

Según la invención, se prevé que al menos dos de los antígenos de Leishmania infantum se expresen como proteína de fusión. A este respecto, puede tratarse por un lado de la proteína de fusión, como producto de expresión, de gen de proteína antioxidante específica de tiol (TSA) y gen de proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11). Consiguientemente, se prefiere también con respecto a los tres antígenos de Leishmania infantum distintos una proteína de fusión, como producto de expresión, de gen de proteína antioxidante específica de tiol (TSA), glicoproteína gp63 y gen de proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11).

A este respecto, es posible cualquier serie/disposición de genes o de la dirección de lectura, a saber por ejemplo [TSA-Kmp-11], pero también [Kmp-11-TSA] o [TSA-gp63-Kmp-11] o [TSA-Kmp-11-gp63] o [Kmp-11-TSA-gp63] y demás.

Por tanto, se prevé así igualmente un constructo de expresión génica que codifica proteínas de fusión eventualmente distintas. La proteína de fusión está compuesta como se ha descrito por una combinación de al menos dos de los antígenos citados (TSA, Kmp-11). La proteína de fusión doble se utiliza en combinación con el antígeno
gp63.

Sin embargo, la proteína de fusión puede estar compuesta también como se ha descrito por tres antígenos. Se trata entonces de una combinación de antígenos TSA, Kmp-11 y gp63.

Además, se prefiere un uso en el que adicionalmente a los productos de expresión de ADN descritos, independientemente de si las proteínas de fusión se expresan o no, está contenido un constructo de expresión de ADN para la expresión del antígeno p36 LACK de Leishmania. El antígeno p36 LACK puede añadirse por tanto opcionalmente a este cóctel.

Como vehículo génico, se usa un módulo de expresión MIDGE cerrado covalentemente bicatenario lineal. Las secuencias polinucleotídicas inmunizantes se presentan como constructos de expresión que están compuestos por moléculas de ácido desoxirribonucleico lineales cerradas covalentemente que presentan una zona bicatenaria lineal, en la que las cadenas individuales que forman la doble cadena están ligadas por cortos bucles monocatenarios de desoxirribonucleótidos, y en la que las cadenas individuales que forman la doble cadena están compuestas sólo por la secuencia de codificación bajo el control de un promotor operativo en el animal a vacunar y una secuencia terminadora. El módulo de expresión está compuesto así por la secuencia de codificación, el promotor y eventualmente una secuencia de terminación, de modo que el constructo sólo contiene la información necesaria para la expresión del gen deseado, lo que en última instancia evita la desventaja del origen vírico del vehículo génico. Además, se prevé según la invención que el (o los) constructo(s) de expresión de ADN esté(n) conjugado(s) para aumentar la eficacia de transfección respectivamente con un oligopéptido de 3 a 30 aminoácidos, estando el oligopéptido compuesto a la mitad por aminoácidos básicos del grupo de arginina y lisina. Se prefieren especial-
mente:

\bullet: la secuencia peptídica representativa de una señal de localización nuclear (señal de localización nuclear= NLS) PKKKRKV (prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina) del virus de simio SV-40. Se ha mostrado, especialmente para la SV-40-NLS, que dirige las proteínas de hasta 465 kDa al núcleo celular (Lanford et al., 1986, Cell 15; 46(4): 575-582). Esta capacidad del péptido se ha aprovechado aquí mediante el acoplamiento a ADN para la mejora de la transferencia génica.

\bullet: o el fragmento de péptido T largo de 11 aminoácidos YGRKKRRQRRR del producto génico TAT de VIH-1.

Se prefieren por tanto como componente de los constructos de expresión oligopéptidos que refuercen la eficacia de transfección de vacunas de ADN, por ejemplo, péptidos y proteínas catiónicos.

Las secuencias polinucleotídicas de codificación se pueden presentar también en un vector de expresión bicatenario circular.

Es conocido que mediante la optimización del uso de codón en el constructo de expresión a los codones usados preferiblemente en mamíferos, puede aumentar considerablemente la expresión de proteínas (Grantham et al., Nucleic Acids Res. 1980, 9: 1893-1912). Para expresar más antígeno in vivo y por tanto activar una respuesta inmune más fuerte que muestre una protección eficaz y duradera ante la infección por leishmaniosis, se optimizó la secuencia de tipo silvestre de gp63. Por optimización debe entenderse la adaptación de codón, también designada como "optimización del uso de codón". Para ello, se desarrolló una estrategia de clonación que posibilitó la síntesis de esta secuencia de ADN optimizada de gp63 a partir de oligonucleótidos.

Según la invención, se optimizaron por tanto los codones de la secuencia del antígeno gp63 de Leishmania infantum (SEC Nº ID 5). Por lo tanto, se prefiere igualmente un constructo de expresión de ADN que presente esta secuen-
cia.

Los constructos de expresión de ADN según la invención sirven para la preparación de una vacuna para el tratamiento de enfermedades de infección por leishmaniosis y son parte componente de la correspondiente vacuna.

La vacuna puede comprender secuencias de ácido nucleico inmunoestimulantes (SAI). Las secuencias de ácido nucleico inmunoestimulantes, que contienen motivos CpG, comprenden una cadena circular de ácido desoxirribonucleico con una secuencia de bases antiparalela complementaria parcialmente. Las secuencias de ácido nucleico inmunoestimulantes pueden tener forma lobular.

Es concebible igualmente la combinación de la vacuna según la invención con compuestos mejoradores de la transfección como, por ejemplo, PEI (polietilenimina).

Para la transfección, pueden utilizarse procedimientos biológicos, químicos y/o físicos que pertenecen al estado de la técnica, por ejemplo, transfección mediante transferencia balística o electroporación. La transfección puede realizarse mediante inyección intradérmica con jeringuilla o dispositivos de inyección sin aguja.

El protocolo de secuencias adjunto, que es parte componente de la solicitud y la presente descripción, reproduce las siguientes secuencias.

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Están contenidas otras medidas ventajosas en las demás reivindicaciones subordinadas. La invención se describe detalladamente y se discute a continuación mediante las figuras y ejemplos de realización.

El sorprendente efecto de la combinación según la invención de constructos de expresión de ADN y un medicamento que contiene una de dichas combinaciones se observa claramente mediante las representaciones según las Figuras. A este respecto, significan:

MIDGE-NLS p36: MIDGE acoplado con NLS que codifica el antígeno p36 LACK

MIDGE-NLS TSA: MIDGE acoplado con NLS que codifica el antígeno TSA

MIDGE-NLS gp63: MIDGE acoplado con NLS que codifica el antígeno gp63

MIDGE-NLS Kmp-11: MIDGE acoplado con NLS que codifica el antígeno Kmp-11

pMCVp36: plásmido que codifica el antígeno p36 LACK

pMCV TSA: plásmido que codifica el antígeno TSA

pMCV gp63: plásmido que codifica el antígeno gp63

pMCV Kmp-11: plásmido que codifica el antígeno Kmp-11.

Se muestra:

Fig. 1: Desarrollo de las lesiones en la semana 8 después de la exposición a la infección en ratones. Significan en ésta:

L+K: LACK en combinación con Kmp-11

L+T: LACK en combinación con TSA

L+G: LACK en combinación con gp 63

K+T: Kmp-11 en combinación con TSA

K+G: Kmp-11 en combinación con gp63

T+G: TSA en combinación con gp63

T+G+L: TSA en combinación con gp63 y LACK

T+G+K: TSA en combinación con gp63 y Kmp-11

L+K+G: LACK en combinación con Kmp-11 y gp63

L+K+T: LACK en combinación con Kmp-11 y TSA

T+G+L+K: TSA en combinación con gp63, LACK y Kmp-11

PBS: grupo de control con PBS.

La Fig. 1 muestra las distintas combinaciones de los antígenos utilizados en ratones. Los puntos representan allí los datos de animales individuales, mientras que los brazos horizontales caracterizan el valor medio del correspondiente grupo. Los antígenos referidos se utilizaron respectivamente individualmente, en seis combinaciones de dos distintas, en cuatro combinaciones de tres distintas y en una combinación de cuatro. Como parámetro relevante para el éxito clínico de la vacunación, se midió el crecimiento de las lesiones causadas por la infección en las patas traseras infectadas de los animales. Se aplica el aumento de tamaño de las lesiones a las ordenadas en milímetros. Se representa en las abcisas las distintas combinaciones de antígeno. A este respecto, se muestra que, en el grupo de combinaciones de dos, la combinación de TSA con gp63 ofrece la mejor protección de vacuna. La siguiente protección mejor la ofrece la combinación de LACK con TSA. En el grupo de combinaciones de tres, el grupo LACK, Kmp-11 y TSA ofrece la mejor protección. El efecto de vacunación alcanzado se muestra en el tamaño claramente reducido de las lesiones formadas. La segunda mejor protección de vacunación la ofrece la combinación de antígenos TSA, gp63 y Kmp-11. En este grupo, se consigue un tamaño de lesión de 0,4 mm de media. Sin embargo, el valor de 0,5 mm representa el valor de hinchamiento a partir del cual las lesiones son perceptibles y evaluables claramente al ojo humano. Esto significa que los animales que se trataron con la combinación de TSA, gp63 y Kmp-11 no mostraron por definición lesiones o se encuentran evaluadas por debajo del límite de detección. En comparación con ello, los ratones no tratados del grupo de control mostraron un tamaño de lesión de 1,7 mm de media. Igualmente, apareció en estos animales un fuerte hinchamiento y enrojecimiento de las patas, síntomas que no se observaron igualmente en los grupos protegidos, y que representan claramente señales de inflamación como consecuencia de la infección.

Fig. 2: Determinación del título total de IgG en el animal diana perro antes de la exposición a la infección con promastigotos de Leishmania infantum. Significan en ésta:

Grupo 1: MIDGE-NLSp36 LACK

Grupo 2: MIDGE-NLS combinación de 4 antígenos

Grupo 3: plásmido combinación de 4 antígenos

Grupo 4: grupo de control: PBS

Los puntos representan los datos de los perros individuales, mientras que los brazos horizontales caracterizan el valor medio de los correspondientes grupos. La densidad óptica (DO) aumenta con la concentración de anticuerpo sérico. En la Figura 2, es visible una clara diferencia entre las concentraciones de anticuerpos anti-Leishmania de los grupos 1 y 2 por un lado y los grupos 3 y 4 por otro lado. Los perros del grupo 1, que se vacunaron con MIDGE-NLS-LACK, y los perros del grupo 2, que habían recibido la combinación de las cuatro secuencias antigénicas en MIDGE-NLS, exhibieron más anticuerpos contra Leishmania infantum que los grupos 3 y 4. Resulta notable que en el grupo 3 no fuera detectable ningún anticuerpo, aunque se usaron las mismas secuencias antigénicas que en el grupo 2. Esto muestra que la combinación de las cuatro secuencias antigénicas especialmente en asociación con vectores MIDGE-NLS es adecuada para la inducción de una respuesta inmune humoral. También en comparación con el grupo 1, los perros del grupo 2 exhibieron de media más anticuerpos. A partir de ello puede llegarse a la conclusión de que la combinación de los cuatro antígenos representa una ventaja frente a la administración individual de LACK.

A continuación se detallan los resultados de ensayo, en particular:

Se ensayó la actividad en un ensayo de vacunación en ratones a distintas combinaciones de los antígenos utilizados para alcanzar la protección más alta posible contra infecciones por leishmaniosis. Como parámetro para el efecto protector alcanzado, se empleó la supresión del crecimiento de lesión por las combinaciones de vacuna utilizadas. Para la estimación del efecto protector, se llevó a cabo una exposición a la infección con promastigotos de Leishmania infantum. La estimación del crecimiento de la lesión se realizó semanalmente. Los resultados de la Figura 2 proceden de la semana 8 después de la exposición a la infección. Básicamente, todos los animales que se vacunaron con un antígeno o una combinación de dos antígenos desarrollaron lesiones más tempranas que los animales que se vacunaron con una combinación de tres o cuatro antígenos. Se consiguió un buen éxito de vacunación con la combinación de tres antígenos Kmp-11, TSA y p63 LACK. Se consiguió un efecto protector comparable con la combinación de antígenos TSA, gp63 y Kmp-11. El sorprendente éxito de vacunación fue visible en que, en ambas combinaciones de tres exitosas (TSA, gp63, Kmp-11 y p36 LACK, Kmp-11, gp63), el tamaño de las lesiones se encuentra por debajo del límite de detección de 0,5 mm y por tanto no desarrollaron lesiones visibles. Por ello, el tamaño de lesión en los animales vacunados es un 100% menor que en el grupo de control no vacunado.

TABLA 1 Composición de las combinaciones de antígenos en un ensayo de inmunización en ratones

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Cada grupo utilizó nueve ratones Balb/c hembra. Se vacunaron los animales con 50 \mug de ADN. En las combinaciones de antígeno, la cantidad de ADN utilizado ascendió a 50 \mug por antígeno. Después de 2 semanas, se realizó la segunda inmunización (recuerdo). Tres semanas después del recuerdo, se realizó la exposición a la infección con 5 x 10^{4} promastigotos de Leishmania infantum que se encontraban en fase estacionaria metacíclica. Se inyectaron estos en los animales por vía subcutánea en la pata trasera derecha. Se siguió el estado de la infección semanalmente. Se determinó el tamaño de las lesiones con un calibre móvil electrónico mediante comparación con la pata trasera izquierda no tratada. En un experimento de seguimiento en perros Beagle hembra de 4-12 meses de edad, se formularon igualmente distintas composiciones de vacuna que se diferencian en la combinación de antígeno usada. Los controles negativos, grupo 4, recibieron sólo tampón PBS y sirvieron como grupo de control de la infección. El grupo 1 estaba compuesto por sólo un antígeno, el antígeno p36 LACK. Este antígeno ha conducido en ensayos anteriores a una buena protección y debería ensayarse en el animal diana perro (L. López-Fuertes et al., 2002, Vaccine 21: 247-257). El grupo 3 estaba compuesto por distintos plásmidos que codificaban los antígenos de Leishmania infantum: TSA, Kmp-11, gp63 y p36 LACK. Este grupo sirve como comparación de vector y de efecto con el grupo 2, que está compuesto por la misma combinación de antígenos, pero contiene MIDGE acoplados a péptido como vectores.

Se han agrupado 4 grupos de vacunación respectivamente de 6 animales que se han inmunizado cuatro veces por vía intradérmica con un intervalo de 15 días respectivamente con 200 \mug de ADN por constructo (véase la Tabla 3). Antes del inicio del experimento, y después de cada inmunización, se extrajo sangre a los animales, además de los análisis de medicina veterinaria rutinarios, para análisis serológicos.

Para establecer qué tipo de respuesta inmune se produce mediante la vacunación o una infección, son utilizables distintos procedimientos. A los procedimientos que permiten la conclusión de una respuesta inmune celular pertenece el ensayo de "hipersensibilidad retardada", que también se designa como ensayo de "hipersensibilidad de tipo retardado" (ensayo DTH). Mediante la medida del grosor de la piel en el sitio de inyección 72 horas después de la administración de antígeno, puede determinarse con relativa exactitud si se ha realizado una reacción de hipersensibilidad retardada y por tanto una reacción específica de células T por el antígeno. Los resultados se representan a continuación en la Tabla 2.

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La Tabla 2 muestra los resultados del ensayo de "hipersensibilidad retardada", que se designa también como ensayo de "hipersensibilidad de tipo retardado" (ensayo DTH). Se evalúa un hinchamiento dérmico local como positivo del ensayo DTH (en la figura caracterizado por "+" o "++") y se muestra que el animal afectado crea células T de memoria específicas de antígenos como consecuencia de la vacunación, y por tanto ha tenido lugar una respuesta inmune celular. Como se ha descrito, la respuesta inmune celular es decisiva en la profilaxis y terapia de enfermedades por leishmaniosis. Antes del inicio del experimento, se llevó a cabo el DTH para asegurar que ninguno de los animales de ensayo hubiera creado ya una respuesta inmune celular contra L. infantum como consecuencia de una infección/vacunación anterior. Todos los animales excepto uno reaccionaron en el ensayo DTH negativamente, y cumplieron por tanto el prerrequisito para el ensayo. Una reacción positiva después de la terminación de la inmunización significa que la inmunización ha conseguido una respuesta inmune celular específica contra Leishmania infantum. Esto ha de valorarse como un éxito de vacunación y deja esperar una mejor protección contra infecciones.

Después de la última vacunación, se vuelve a llevar a cabo un ensayo DTH. Aquí se esperaba que posiblemente todos los animales vacunados reaccionaran positivamente. Ya que el animal anteriormente positivo reaccionó ahora negativamente, ha de suponerse que también era negativo en el primer ensayo DTH y que se trataba de un error en la interpretación del resultado.

Se caracterizó adicionalmente la respuesta inmune generada por las vacunaciones mediante ensayos serológicos. En la Figura 2, se representan los resultados del análisis ELISA de anticuerpos específicos contra Leishmania infantum en suero de perros inmunizados. En general, las concentraciones de anticuerpo en los sueros de los perros vacunados no eran muy altas. Este resultado corresponde con las expectativas, ya que la inmunización se dirige más a una respuesta inmune celular que a una humoral.

TABLA 3 Composición de los grupos de vacunación en el ensayo de inmunización contra Leishmania infantum en perros

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El éxito de la inmunización es describible mediante una reacción de exposición de los animales al patógeno. Cuatro semanas después de la última inmunización, tuvo lugar por tanto una exposición a la infección por vía intravenosa con 5 x 10^{7} promastigotos de Leishmania infantum. El grado de infección, y por tanto la protección alcanzada por la vacunación, se comprobó mediante análisis de patología clínica. Entre estos, se cuentan el análisis del hinchamiento de los ganglios linfáticos de la fosa poplítea, la pérdida de peso, la degeneración con cambio asociado del color de los músculos, el crecimiento de uñas excesivo, lesiones de la piel así como cambios en el hemograma. La existencia y la cantidad de patógeno se determinan mediante una reacción de PCR cuantitativa. En la comparación de los grupos 11 meses después de la exposición a la infección con respecto a la aparición de síntomas clínicos, resulta el siguiente cuadro: es observable una diferencia clara entre el grupo 2 y el grupo de control. En el grupo 2, enfermó sólo 1 perro de leishmaniosis, mientras que en el grupo de control enfermaron 4 de 6 perros de leishmaniosis. También en el grupo 1, se redujo claramente el número de perros enfermos frente al grupo de control, mientras que el grupo 3 presentaba sólo una pequeña diferencia con el grupo de control. La comparación directa del efecto de MIDGE-NLS con plásmido que codifica exactamente los mismos antígenos (grupo 2 y grupo 3) muestra que con MIDGE-NLS se conseguía una mejor protección contra leishmaniosis que la posible con plásmido. Los resultados de ensayo permiten la conclusión de que la inmunización de perros contra leishmaniosis con una combinación de los cuatro antígenos codificados por MIDGE-NLS puede reducir el desarrollo de los síntomas clínicos de la leishmaniosis en perros. Según el estado del conocimiento del solicitante, se ha descrito hasta ahora un buen resultado por Ramiro et al. (Vaccine 3696, 2003: 1-11) comparable al conseguido con la vacuna según la invención MIDGE-NLS que codifica 4 antígenos. Sin embargo, a diferencia de la MIDGE-NLS, en el estudio de Ramiro et al. se usa un virus Vaccinia recombinante (rVV) como vacuna de recuerdo. En el virus Vaccinia recombinante, se trata de virus modificados genéticamente que representan conocidamente un alto riesgo para la seguridad (Lehrman, 1999, Nature 401: 517-518).

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Ejemplos de realización

Ejemplo 1

Clonación del plásmido pMCVp36

Se amplificaron dos fragmentos mediante PCR a partir del plásmido de partida pSCp36:

1ª PCR de aproximadamente 800 pb:

Cebador izquierdo:: 5'-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT

Cebador derecho:: 5'-TTATATGAGCTCAGAAGACACGGACAGGGACCTCTTCCGTCG

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2ª PCR de aproximadamente 950 pb:

Cebador izquierdo:: 5'-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT,

Cebador derecho:: 5'-TTATATGAGCTCTTACTCGGCCGTCGGAGATGG

El producto de PCR de la 2ª PCR se cortó con Eco311 y se aisló el fragmento menor (aprox. 200 pb).

El producto de PCR de la 1ª PCR se cortó con Bpil.

Se ligaron conjuntamente el fragmento de 200 pb y el fragmento cortado de la 1ª PCR y a continuación se cortaron con KpnI y SacI y se ligaron con el vector pMOK cortado con KpnI y Sacl. El plásmido obtenido recibió el nombre de pMCVp36.

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Ejemplo 2

Clonación del plásmido pMCVKmp-11

Se amplificó el gen mediante PCR a partir de ADNc de Leishmania infantum. Se clonó el producto de PCR después de digestión con KpnI y XhoI en el vector pMCV1.4 igualmente cortado y se secuenció. Se denominó al plásmido formado pMCVKpm11.

Cebador izquierdo:: 5'-ATTATAGGTACCATGGCCACCACGTACGAG

Cebador derecho:: 5'-TTAATTCTCGAGTTACTTGGATGGGTACTGCG

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Ejemplo 3

Clonación del plásmido pMCVTSA

Se amplificó el gen mediante PCR a partir de ADNc de Leishmania infantum y se separó una secuencia de reconocimiento Eco311 mediante la inserción de un intercambio de bases, sin cambiar la secuencia de aminoácidos. Se clonó el producto de PCR terminal después de digestión con KpnI y XhoI en el vector pMCV1.4 igualmente cortado y se secuenció. Se denominó al plásmido formado pMCVTSA.

Cebador izquierdo:: 5'-AATTATGGTACCATGTCCTGCGGTAACGCCAAGATC

Cebador derecho:: 5'-AATATACTCGAGTTACTGCTTGCTGAAGTATCCTTCGAC

Cebador de mutación izquierdo:: 5'-TACCGCGGTCTCTTCATCATCG

Cebador de mutación derecho:: 5'-ATTGGGGGTCTCGATGAATAGACCGCGGTAGG

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Ejemplo 4

Estrategia de clonación para la optimización del uso de codón de gp63

Se encargaron los oligonucleótidos con una longitud de 18 y 28 bases (MWG Biotech). Se unieron dos veces entre sí 90 oligonucleótidos que reproducen respectivamente la cadena con sentido y la cadena antisentido mediante apareamiento y ligación. Los oligonucleótidos apareados generaron respectivamente dos protuberancias de 4 bases. Se tuvo cuidado de que las protuberancias sólo aparecieran una vez y no fueran palindrómicas. Se aparearon los oligonucleótidos mezclando ambos oligonucleótidos individuales (cadena y anticadena) con tampón cinasa calentado aproximadamente a 80ºC, y después se enfriaron lentamente hasta temperatura ambiente. Después, se añadieron ATP y polinucleótido cinasa (PNK) y se fosforilaron los oligonucleótidos durante 1 hora. A continuación, se mezclaron conjuntamente en una primera etapa los oligonucleótidos respectivamente adyacentes y se ligaron (oligonucleótido 1+2, oligonucleótido 3+4). Después de 1 h de ligación, se mezclaron conjuntamente una alícuota de la preparación de ligación del oligonucleótido 1+2 y una alícuota de la preparación de ligación 3+4. Esto se llevó a cabo con las distintas preparaciones de ligación hasta una longitud del producto de ligación de aproximadamente 300 pb. Se utilizó una alícuota de la última etapa de ligación respectiva como molde en una PCR con cebadores flanqueantes. Se sometió a clonación intermedia el producto de PCR en el vector de clonación TOPO-TA (Invitrogen) y se secuenció. Esto se realizó con 6 fragmentos en total del gen completo. Los 6 fragmentos individuales se cortaron con Eco311 a partir del plásmido clonado intermedio y se ligaron entre sí. Se amplificó el producto de ligación total de longitud correcta en una PCR terminal, se digirió con KpnI y SacI y se clonó en el vector pMCV1.4 igualmente cortado después de extracción de gel. A continuación, se controló la secuencia mediante secuenciación. El plásmido formado se denominó pMCVgp63.

Cebadores para los 6 fragmentos mezclados conjuntamente:

Fragmento 1:

Cebador izquierdo:: ATTATTGGTACCATGTCTGTGGACT

Cebador derecho:: TTATATGGTCTCTCTCAGGGCTCCCCAGTTG

\vskip1.000000\baselineskip

Fragmento 2:

Cebador izquierdo:: ATTATAGGTCTCCTGAGAATTGCTGTGTCCACAGAG

Cebador derecho:: TTATATGGTCTCACAGAGGCCACATACATCACAA

\vskip1.000000\baselineskip

Fragmento 3:

Cebador izquierdo:: TATTATGGTCTCCTCTGTGCCCTCTGAGGAGGGAGTGCTGGCC

Cebador derecho:: AATTATGGTCTCCTCAATCTCCAGGTACTCCAGG

\vskip1.000000\baselineskip

Fragmento 4:

Cebador izquierdo:: ATTATAGGTCTCATTGAGGACCAGGGAGGAG

Cebador derecho:: TAATATGGTCTCGTGTCTGGTCACTCCACACTTG

\vskip1.000000\baselineskip

Fragmento 5:

Cebador izquierdo:: ATTATAGGTCTCGACACCCAGACCTGCCCC

Cebador derecho:: TTATATGGTCTCGGGGTGCAGTTGGCATAGCC

\vskip1.000000\baselineskip

Fragmento 6:

Cebador izquierdo:: ATATATGGTCTCCACCCCAGGCCTGAGAGTGG

Cebador derecho:: TAATATGAGCTCCTACAGGGCCACAGCCAGCAGG

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia total

Cebador izquierdo:: ATTATTGGTACCATGTCTGTGGACT

Cebador derecho:: TAATATGAGCTCCTACAGGGCCACAGCCAGCAGG

Ejemplo 5

Acoplamiento de la secuencia de NLS a los oligonucleótidos

Se realiza el acoplamiento de NLS como sigue: se acopló el péptido NLS con la secuencia PKKKRKV en dos etapas a los ODN. En primer lugar, se activó el oligonucleótido modificado 5'-PH-dGGG AGT CCA GT xT TTC TGG AC (en el que xT representa bases de timina aminomodificadas con un aminoengarce C_{2}= ODN1) (0,1 mM) con sulfo-KMUS (5 mM) en PBS a temperatura ambiente (TA). Después de 120 minutos, se detuvo la reacción con tris(hidroximetil)aminometano 50 mM y se obtuvo el ODN activado después de precipitación con etanol (NaOAc 300 mM, pH 5,2, MgCl_{2} 5,5 mM, 70% de etanol), centrifugación y lavado una vez con etanol al 70%. Se disolvió el ODN así obtenido (0,1 mM) en PBS y se hizo reaccionar con el péptido (0,2 mM) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se ensayó la reacción mediante electroforesis en gel (al 3%) y coloración con bromuro de etidio. Se purificó el ODN acoplado a NLS formado por HPLC y se usó para la síntesis de los constructos de antígeno MIDGE-NLS.

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Ejemplo 6

Preparación de MIDGE-NLSp36

Los MIDGE son módulos de expresión lineales cerrados covalentemente que están compuestos únicamente por el promotor CMV, un intrón, la correspondiente secuencia génica y una secuencia de poliadenilación (véase el documento EP 0.941.318 B1). Se obtuvieron los constructos como sigue: se digirió totalmente el plásmido pMCVp36 descrito en el ejemplo 1.1 con Eco311. Se detuvo la ligación con oligodesoxinucleótidos (ODN) de forma lobular 5'-fosforilados 5'-PH-GGG AGT CCA GT XT TTC TGG AC (=ODN1) y 5'-AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC-3' (=ODN2) mediante ADN ligasa T4 en presencia de Eco311 mediante calentamiento a 70ºC. Se concentró la mezcla resultante y se trató con Eco311 y ADN ligasa T7 en presencia de trifosfatos de desoxirribonucleótido. Se realizó la purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico.

Se realizó la preparación de MIDGE-NLS-TSA, -Kmp-11 y -p63 análogamente.

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Ejemplo 7

Ensayo DHT

Ensayo de "hipersensibilidad retardada" que se designa también como ensayo de "hipersensibilidad de tipo retardado" (ensayo DTH). Se administra en este ensayo al animal vacunado una cantidad muy pequeña de antígeno en las capas superiores de la piel. Antes, se mide exactamente el grosor de la piel en el lugar de administración. A continuación, se observa si la piel en el sitio de inyección sufre cambios inflamatorios. Es característica de una reacción inmune causada por células T sensibilizadas ante el antígeno una reacción de inflamación que es detectable sólo después de 48 a 72 horas. Los síntomas clínicos como hinchamiento dérmico local, enrojecimiento y eventual dolor pueden atribuirse al efecto de las citocinas. Se evalúa un hinchamiento dérmico local como positivo del ensayo DTH (en la tabla 1, caracterizado con "+" o "++") y se muestra que el animal afectado ha generado células T de memoria específicas de antígeno a consecuencia de la vacunación.

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Ejemplo 8

Determinación de los anticuerpos totales después de la inmunización

En la Fig. 2, se representan los resultados de la detección por ELISA de anticuerpos específicos contra Leishmania infantum en suero de perros inmunizados. Antes de la exposición a la infección, se obtuvieron los sueros de todos los perros. La determinación del título total de anticuerpos IgG se realizó mediante ELISA, en la que se determinó la absorción en DO (densidad óptica) a una longitud de onda de \lambda= 406 nm.

<110> Mologen AG

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<120> AGENTE PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES POR LEISHMANIOSIS

\vskip0.400000\baselineskip

<130> XI 1827-03

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 03090368.6

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 22-10-2004

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 03090368.6

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 22-10-2003

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leishmania infantum

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN del gen de la proteína 11 de membrana de cinetoplástidos de Leishmania infantum (kmp-11)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leishmania infantum

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de proteína de la proteína 11 de membrana de cinetoplástidos de Leishmania infantum (kmp-11)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 600

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leishmania infantum

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN del antígeno de Leishmania infantum gen de la proteína antioxidante específica de tiol (TSA)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leishmania infantum

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de proteína de la proteína antioxidante específica de tiol (TSA) de Leishmania infantum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1800

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN del antígeno gp63 de Leishmania infantum optimizada a nivel de codón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 599

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de proteína del antígeno gp63 de Leishmania infantum optimizada a nivel de codón

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 939

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leishmania infantum

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN del antígeno p36 (LACK) de Leishmania

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leishmania infantum

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de proteína del antígeno p36 (LACK) de Leishmania

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> virus de simio 40

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de localización nuclear

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fragmento de péptido T largo del producto génico TAT de VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador izquierdo de la 1ª PCR; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatatggta ccatgaacat acgagggtca cct

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador derecho de la 1ª PCR; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatatgagc tcagaagaca cggacaggga cctcttccgt cg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador izquierdo de la 2ª PCR; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatatggta ccatgaacat acgagggtca cct

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador derecho de la 2ª PCR; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatatgagc tcttactcgg ccgtcggaga tgg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador izquierdo de la PCR de Kmp-11; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attataggta ccatggccac cacgtacgag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador derecho de la PCR de Kmp-11; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttaattctcg agttacttgg atgggtactg cg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador izquierdo de PCR de TSA; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattatggta ccatgtcctg cggtaacgcc aagatc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador derecho de la PCR de TSA; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatatactcg agttactgct tgctgaagta tccttcgac

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de mutación izquierdo de TSA; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taccgcggtc tcttcatcat cg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de mutación derecho de TSA; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attgggggtc tcgatgaata gaccgcggta gg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador izquierdo del fragmento 1 de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attattggta ccatgtctgt ggact

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador derecho del fragmento 1 de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatatggtc tctctcaggg ctccccagtt g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador izquierdo del fragmento 2 de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attataggtc tcctgagaat tgctgtgtcc acagag

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador derecho del fragmento 2 de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatatggtc tcacagaggc cacatacatc acaa

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador izquierdo del fragmento 3 de gp63; oligo sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tattatggtc tcctctgtgc cctctgagga gggagtgctg gcc

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador derecho del fragmento 3 de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattatggtc tcctcaatct ccaggtactc cagg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador izquierdo del fragmento 4 de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attataggtc tcattgagga ccagggagga g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador derecho del fragmento 4 de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatatggtc tcgtgtctgg tcactccaca cttg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador izquierdo del fragmento 5 de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attataggtc tcagacaccc agacctgccc c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador derecho del fragmento 5 de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatatggtc tcggggtgca gttggcatag cc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador izquierdo del fragmento 6 de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatatggtc tccaccccag gcctgagagt gg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador derecho del fragmento 6 de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatatgagc tcctacaggg ccacagccag cagg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador izquierdo de la secuencia total de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attattggta ccatgtctgt ggact

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador derecho de la secuencia total de gp63; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatatgagc tcctacaggg ccacagccag cagg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ODN1; oligo sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)...(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T= timina modificada químicamente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggagtccag ttttctggac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ODN2; oligo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggggtccag ttttctggac

\hfill

20

Claims

1. Uso de un constructo de expresión de ADN para la preparación de un medicamento para la inmunización contra infecciones por leishmaniosis, en el que el citado constructo de expresión de ADN contiene una o varias secuencias de ácido nucleico de codificación que conducen a la expresión de los antígenos de Leishmania infantum gen de la proteína antioxidante específica de tiol (TSA), glicoproteína gp63 y proteína 11 de membrana de cinetoplástidos
(Kmp-11).

2. Uso de dos o tres constructos de expresión de ADN para la preparación de un medicamento para la inmunización contra infecciones por leishmaniosis, en el que los citados constructos de expresión de ADN contienen una o varias secuencias de ácido nucleico de codificación que conducen conjuntamente a la expresión de los antígenos de Leishmania infantum gen de la proteína antioxidante específica de tiol (TSA), glicoproteína gp63 y proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11).

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que al menos dos de los antígenos de Leishmania infantum se expresan como proteína de fusión.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que la proteína de fusión es el producto de expresión del gen de la proteína antioxidante específica de tiol (TSA) y el gen de la proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11).

5. Uso según la reivindicación 3 y 1, en el que la proteína de fusión es el producto de expresión del gen de la proteína antioxidante específica de tiol (TSA), el gen de la glicoproteína gp63 y el gen de la proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11).

6. Uso según al menos una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que está contenido adicionalmente un constructo de expresión de ADN para la expresión del antígeno de Leishmania p36 LACK.

7. Uso según al menos una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las secuencias polinucleotídicas de codificación se presentan como constructos de expresión que están compuestos por moléculas de ácido desoxirribonucleico lineales cerradas covalentemente que presentan una zona bicatenaria lineal, en la que las cadenas individuales que forman la doble cadena están ligadas por cortos bucles monocatenarios de desoxirribonucleótidos, y en la que las cadenas individuales que forman la doble cadena están compuestas sólo por la secuencia de codificación bajo el control de un promotor operativo en el animal a vacunar y una secuencia terminadora.

8. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las secuencias polinucleotídicas de codificación se presentan en un vector de expresión bicatenario circular.

9. Uso según al menos una de las reivindicaciones precedentes, en el que el constructo de expresión de ADN está unido covalentemente a uno o varios oligopéptidos para aumentar la eficacia de transfección.

10. Uso según al menos una de las reivindicaciones precedentes, en el que los constructos de expresión de ADN están conjugados respectivamente con un oligopéptido de 3 a 30 aminoácidos, estando el oligopéptido compuesto a la mitad por aminoácidos básicos del grupo de arginina y lisina.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que los oligopéptidos conjugados presentan la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRR.

12. Uso según al menos una de las reivindicaciones precedentes, en el que los constructos de expresión de ADN lineales cerrados covalentemente están modificados con un péptido que contiene la secuencia de localización nuclear (NLS) del antígeno T grande de SV40 con la secuencia de aminoácidos PKKKRKV.

13. Uso de un constructo de expresión de ADN para la preparación de una vacuna para el tratamiento de enfermedades infecciosas por leishmaniosis, en el que dicho constructo de expresión de ADN contiene una o varias secuencias de ácidos nucleicos de codificación que conducen a la expresión de los antígenos de Leishmania infantum gen de proteína antioxidante específica de tiol (TSA), glicoproteína gp63 y proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11).

14. Uso de dos o tres constructos de expresión de ADN para la preparación de una vacuna para el tratamiento de enfermedades infecciosas por leishmaniosis, en el que dichos constructos de expresión de ADN contienen respectivamente una o varias secuencias de ácidos nucleicos de codificación que conducen conjuntamente a la expresión de los antígenos de Leishmania infantum gen de proteína antioxidante específica de tiol (TSA), glicoproteína gp63 y proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11).

15. Constructo de expresión de ADN que contiene una o varias secuencias de ácido nucleico de codificación que conducen a la expresión de los antígenos de Leishmania infantum gen de proteína antioxidante específica de tiol (TSA), glicoproteína gp63 y proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11).

16. Constructo de expresión de ADN según la reivindicación 15, en el que los productos génicos se expresan como una proteína de fusión única.

17. Constructo de expresión de ADN que contiene una o varias secuencias de ácido nucleico de codificación que conducen a la expresión de los antígenos de Leishmania infantum gen de proteína antioxidante específica de tiol (TSA) y proteína 11 de membrana de cinetoplástidos (Kmp-11).

18. Constructo de expresión de ADN según la reivindicación 17, en el que los productos génicos se expresan como una proteína de fusión única.

19. Constructo de expresión de ADN según al menos una de las reivindicaciones 15-18, presentándose el constructo de expresión como una molécula de ácido desoxirribonucleico lineal cerrada covalentemente que presenta una zona bicatenaria, en la que las cadenas individuales que forman la doble cadena están ligadas por cortos bucles monocatenarios de desoxirribonucleótidos, y en la que las cadenas individuales que forman la doble cadena están compuestas sólo por la secuencia de codificación bajo el control de un promotor operativo en el animal a vacunar y una secuencia terminadora.

20. Constructo de expresión de ADN según al menos una de las reivindicaciones 15-18, en el que las secuencias polinucleotídicas de codificación se presentan en un vector de expresión bicatenario circular.

21. Constructo de expresión de ADN según al menos una de las reivindicaciones 15-20, en el que el constructo de expresión de ADN está ligado covalentemente con uno o varios oligopéptidos para aumentar la eficacia de transfección.

22. Constructo de expresión de ADN según la reivindicación 21, estando el constructo de expresión de ADN conjugado con un oligopéptido de 3 a 30 aminoácidos, y el oligopéptido está compuesto a la mitad por aminoácidos básicos del grupo de arginina y lisina.

23. Constructo de expresión de ADN según la reivindicación 22, en el que el oligopéptido conjugado presenta la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRR.

24. Constructo de expresión de ADN según la reivindicación 21, estando el constructo de expresión de ADN lineal cerrado covalentemente modificado con un péptido que contiene la secuencia de localización nuclear (NLS) del antígeno T grande de SV40 con la secuencia de aminoácidos PKKKRKV.

25. Constructo de expresión de ADN según la reivindicación 15 ó 16, en el que la secuencia para gp63 está optimizada a nivel de codón.

26. Constructo de expresión de ADN según la reivindicación 25, que contiene la secuencia SEC Nº ID 5.

27. Vacuna para el tratamiento de enfermedades infecciosas por leishmaniosis que contiene un constructo de expresión de ADN según una o varias de las reivindicaciones 15 a 26.

28. Vacuna según la reivindicación 27, que contiene adicionalmente coadyuvantes y/o secuencias de ácido nucleico inmunoestimulantes con uno o varios motivos CpG.

29. Vacuna según la reivindicación 28, en la que las secuencias de ácido nucleico inmunoestimulantes se presentan como ácidos desoxirribonucleicos de cadena circular con una secuencia de bases antiparalela complementaria parcialmente.