ES2283052T3 - Geles de alginato de liberacion sostenida. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a formulaciones que emplean como base geles de alginato de liberación prolongada y los procedimientos correspondientes.

Description

Geles de alginato de liberación sostenida.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones de liberación sostenida que usan perlas de gel de alginato y a los métodos de ellas.

Fundamento

Con los avances en tecnologías de ingeniería genética y celular, la disponibilidad de proteínas recombinantes ha engendrado avances en el uso de proteínas como medicamentos para aplicaciones terapéuticas. Muchas enfermedades o estados tratados con proteínas farmacéuticas requieren niveles de proteínas sostenidos para conseguir el resultado terapéutico más eficaz. Sin embargo, como muchos productos farmacéuticos proteínas, la vida media biológica generalmente corta requiere administración frecuente. Estas inyecciones repetidas se dan a intervalos diversos que producen niveles de medicación fluctuantes con una carga física y monetaria significativa sobre los pacientes. Puesto que muchos estados responden mejor a niveles controlados de un producto farmacéutico, existe necesidad de liberación controlada de un medicamento para proporcionar períodos más largos de liberación constante. Tales medicamentos de liberación sostenida proporcionarían al paciente no sólo efectos profilácticos, terapéuticos o diagnósticos aumentados, sino también una disminución de la frecuencia de inyecciones así como de los costes totales.

Los intentos actuales para sostener niveles de medicación en seres humanos o animales entre dosis han incluido el uso de polímeros biodegradables como matrices para controlar la liberación de medicamentos. Por ejemplo, la Patente de Gran Bretaña Nº 1.388.580 describe el uso de hidrogeles para liberación sostenida de insulina. La Patente de los EE.UU. Nº 4.789.550 describe el uso de microcápsulas de alginato revestidas de polilisina para entrega de proteína por células vivas encapsulantes. Los intentos de liberación sostenida han utilizado también composiciones de polímeros aniónicos o catiónicos rodeadas por polímeros iónicos de carga opuesta para encapsular células capaces de producir composiciones activas biológicamente. Patente de los EE.UU. Nº 4.744.933. De igual modo, también se han descrito capas múltiples de polímeros de reticulación aniónicos o catiónicos como medio para obtener liberación controlada. Patentes de los EE.UU. Nº 4.690.682 y 4.789.516. Además, intentos adicionales describen el uso de alginatos solos, o alginatos revestidos con otros polímeros biodegradables, para liberación controlada de composiciones de polipéptidos o precipitados catiónicos de ellas. Documentos PCT WO 96/00081, PCT WO 95/29664 y PCT WO 96/03116.

Estos intentos, no obstante, han proporcionado medios insuficientes para obtener entrega con liberación sostenida de productos farmacéuticos proteínas deseados. Se sabe generalmente que el uso de ciertos polímeros biodegradables, por ejemplo, co-glicólido de poliláctido, en condiciones in vivo, presentan altos estallidos iniciales de liberación de medicamento. Johnson, O. et al., Nature Med., 2/7: 795 (1996). Además, se sabe generalmente que proteínas usadas con formas actuales de preparaciones de liberación sostenida pueden experimentar desnaturalización y perder su bioactividad por exposición a los agentes encapsulantes. Tales preparaciones usan disolventes orgánicos que pueden tener efectos perjudiciales sobre la proteína de elección. Finalmente, como se discute después, el uso de alginato solo no ha proporcionado la liberación de proteína controlada deseada necesaria para resultados terapéuticos
eficaces.

En general, los alginatos son polisacáridos aniónicos de origen natural muy conocidos, constituidos por ácido 1,4-enlazado-\beta-D-manurónico y ácido \alpha-L-gulurónico. Smidsrod, O. et al., Trends in Biotechnology, 8: 71-78 (1990); Aslani, P. et al., J. Microencapsulation, 13/5: 601-614 (1996). Los alginatos varían típicamente del 70% de ácido manurónico y 30% de ácido gulurónico a 30% de ácido manurónico y 70% de ácido gulurónico. Smidsrod, supra. El ácido algínico es insoluble en agua, mientras que las sales formadas con iones monovalentes como sodio, potasio y amonio son solubles en agua. McDowell, R.H., "Properties of Alginates" (Londres, Alginate Industries Ltd., 4ª edición, 1977). Se conocen cationes polivalentes que reaccionan con alginatos y forman espontáneamente geles.

Los alginatos tienen una amplia variedad de aplicaciones tales como aditivos de alimentación, adhesivos, pastillas farmacéuticas y vendajes de heridas. También se han recomendado alginatos para técnicas de separación de proteínas. Por ejemplo, Gray, C.J. et al., en Biotechnology and Bioengineering, 31: 607-612 (1988) atrapaban insulina en geles de alginato de zinc/calcio para separación de insulina de otras proteínas del suero.

También se han documentado bien matrices de alginato para sistemas de entrega de fármacos, véase por ejemplo la Patente de los EE.UU. nº 4.695.463, que describe un sistema de entrega de goma de mascar basada en alginato y preparaciones farmacéuticas. Se han usado perlas de alginato para liberación controlada de diversas proteínas tales como: receptor de factor de necrosis de tumores en perlas de catión-alginato revestidas con policationes, Wee, S.F., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 21: 730-31 (1994); factor de crecimiento transformante encapsulado en perlas de alginato, Puolakkainen, P.A. et al., Gastroenterology, 107: 1319-1326 (1994); factores angiógenos atrapados en perlas de calcio-alginato, Downs, E.C. et al., J. of Cellular Physiology, 152: 422-429 (1992); albúmina atrapada en perlas de alginato de quitosan, Polk, A. et al., J. Pharmaceutical Sciences, 83/2: 178-185 (1994), o perlas de alginato de quitosan-calcio revestidas con polímeros, Okhamafe, A.O. et al., J. Microencapsulation, 13/5: 497-508 (1996); hemoglobulina encapsulada con perlas de alginato de quitosan-calcio, Huguet, M.L. et al., J. Applied Polymer Science, 51: 1427-1432 (1994), Huguet, M.L. et al., Process Biochemistry, 31: 745-751 (1996); e interleuquina-2 encapsulada en microesferas de alginato-quitosan, Liu, L.S. et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 22: 542-543 (1995).

Los sistemas que usan perlas de gel de alginato, o perlas de gel de alginato/calcio para atrapar proteínas carecen de la falta de cualquier efecto de liberación sostenida debido a la liberación rápida de la proteína de las perlas de alginato. Liu, L. et al., J. Control Rel., 43: 65-74 (1997). Para evitar tal liberación rápida, un cierto número de los sistemas anteriores intentan usar revestimientos de polímero de policatión (por ejemplo, polilisina, quitosan) para retardar la liberación de las perlas de alginato de proteína Véase, por ejemplo, Wheatley, M.A. et al., J. Applied Polymer Science, 43: 2123-2135 (1991); Wee, S.F. et al., supra; Liu, L.S. et al. supra; Wee, S.F. et al., Controlled Release Society, 22: 566-567 (1995) y Lim et al., supra.

Los policationes, tales como polilisina, son polielectrólitos cargados positivamente que interactúan con las moléculas de alginato cargadas negativamente para formar complejos de polielectrólito que actúan como barreras de difusión en la superficie de la perla. Pueden tener lugar problemas con el uso de policationes porque: (1) tales formulaciones pueden ser citotóxicas debido a los policationes (Huguet, M.L. et al., supra; Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, 13: 269 (1992); Bergmann, P. et al., Clinical Science, 67: 35 (1984)); (2) los policationes son propensos a oxidación; (3) las perlas con revestimientos de policationes tienden a no ser erosionables y concentrarse en el cuerpo; (4) tales formulaciones se fabrican mediante procedimientos de revestimiento laboriosos que incluyen revestimientos múltiples del policatión polilisina (Padol et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 2: 216 (1986); y (5) las interacciones iónicas entre la proteína y los policationes pueden producir pérdida de actividad de la proteína o causar inestabilidad de la proteína.

Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar formulaciones farmacéuticas que consigan un medio mejor de liberación sostenida para aplicaciones clínicas. Numerosas proteínas recombinantes o naturales podrían beneficiarse de la liberación constante a largo plazo, y proporcionar por ello resultados clínicos más eficaces.

La presente invención proporciona tales avances. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son capaces de proporcionar protección, degradación disminuida y liberación lenta de proteína con estabilidad y eficacia de la proteína aumentada. También, las composiciones farmacéuticas de la presente invención proporcionan un medio simple, rápido y económico de liberación de proteína recombinante controlada para resultados profilácticos, terapéuticos o diagnósticos eficaces. Los documentos WO-A-9008551 y WO-A-9011757 se refieren a dispositivos de entrega sostenida.

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones de liberación sostenida que usan perlas o partículas de gel de alginato, y a métodos de ellas según las reivindicaciones. En particular, la formación de los geles de liberación sostenida incluye la co-precipitación de perlas de gel de alginato con un agente activo biológicamente. Este método proporciona una ventaja para producir una carga eficaz y alta de agente activo biológicamente dentro del gel de alginato para entrega de liberación sostenida mientras se consigue protección de la proteína, degradación disminuida, estabilidad aumentada y eficacia del agente a entregar.

Por consiguiente, un aspecto de la presente descripción proporciona una composición de liberación sostenida, que comprende un polímero hidrófilo; un agente activo biológicamente; y al menos un agente de precipitación. Durante la formulación de la composición, el agente activo biológicamente se co-precipita con el polímero hidrófilo. Además, pueden añadirse también a la composición agentes de precipitación adicionales. Según se usa aquí, el término co-precipitación se refiere al uso de agente(s) para precipitación del agente activo biológicamente junto con el polímero hidrófilo para formar una matriz del polímero precipitado y el agente, por ejemplo, la formación de las perlas de gel de alginato sería mediante precipitación. Tal precipitación puede ser simultánea o dentro de una estrecha proximidad entre ellos. La precipitación de moléculas y cualesquiera agentes de precipitación relacionados es muy conocida por los expertos en la técnica.

Otro aspecto proporciona métodos para producir las composiciones de liberación sostenida de la presente invención. Comprenden las etapas de disolver un agente activo biológicamente y un polímero hidrófilo con un disolvente para formar una primera mezcla; disolver al menos un agente de precipitación en un disolvente para formar una segunda mezcla; añadir la solución del agente activo biológicamente y el polímero hidrófilo de la primera mezcla al agente de precipitación y disolvente de la segunda mezcla; y co-precipitar el agente activo biológicamente dentro del polímero hidrófilo. Los presentes métodos incluyen también el uso de agentes de precipitación adicionales. Además, también se considera una etapa para aislar la composición de liberación sostenida.

Según se usa aquí, el término disolvente se refiere a disolventes de base acuosa capaces de dispersar o disolver los agentes activos biológicamente, los polímeros hidrófilos o los agentes de precipitación de elección. Tales disolventes son muy conocidos por un experto en la técnica. La adición de la primera mezcla a la segunda mezcla para formar la composición de co-precipitación puede hacerse por métodos muy conocidos por un experto en la técnica, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, adición de gotitas, dispersión, pulverización o mezclado usando chorros de pulverización, chorros de aire, atomización y campos eléctricos. El término dispersión para los fines de esta invención puede significar dispersiones líquidas, sólidas o gaseosas. Según se usa aquí, el término aislamiento se refiere al procedimiento para aislar la composición de liberación sostenida de la presente invención. Tales procedimientos de aislamiento y purificación son muy conocidos en la técnica.

En otro aspecto aún, la presente invención proporciona una composición de liberación sostenida producida por los métodos anteriores según se reivindica. Los aspectos adicionales incluyen formulaciones farmacéuticas de las composiciones anteriores en un excipiente o coadyuvante aceptable farmacéuticamente.

En otros aspectos todavía, la presente descripción proporciona métodos para tratar indicaciones con composiciones de liberación sostenida que contienen agentes activos biológicamente deseados.

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Descripción detallada de la invención Composiciones

Pueden obtenerse alginatos y derivados de ellos de diversas fuentes comerciales, naturales o sintéticas muy conocidas en la técnica.

De igual modo, pueden obtenerse agentes de precipitación de diversas fuentes comerciales, naturales o sintéticas que son muy conocidas en la técnica. Los agentes de precipitación incluyen, aunque sin limitarse a ellos, iones de metales polivalentes, sales, acetatos, citratos, cloruros, carbonatos, hidróxidos, oxalatos, tartratos o hidróxidos de ellos, ácidos o polímeros solubles en agua. En particular, los iones de metales pueden incluir, aunque sin limitarse a ellos, aluminio, bario, calcio, hierro, manganeso, magnesio, estroncio y zinc. Preferiblemente, los iones de metales son calcio y zinc o las sales de ellos, como acetato de zinc, acetato cálcico o sales cloruro. Pueden usarse también pequeñas moléculas y sales solubles en agua tales como sulfato amónico, acetona, etanol y glicerol.

Pueden usarse otros tamaños y tipos de agentes de precipitación, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si hay alguno sobre la actividad biológica, la facilidad de manipulación, el grado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos de un agente de precipitación deseado para una proteína o análogo terapéutico). Un experto en la técnica apreciará otros agentes de precipitación que están dentro del alcance de la invención.

Según se usa aquí, la expresión tampón o solución tampón se refiere al uso de ácidos inorgánicos u orgánicos o una combinación de ellos para preparar una solución tampón como se conoce en la técnica. Los ácidos inorgánicos dentro del alcance de la presente invención incluyen haluro de hidrógeno (por ejemplo, ácido clorhídrico), fosfórico, nítrico o sulfúrico. Otros ácidos inorgánicos serían muy conocidos para un experto en la técnica y se consideran aquí. Los ácidos orgánicos dentro del alcance de la invención incluyen ácidos carboxílicos alifáticos y ácidos aromáticos tales como fórmico, carbónico, acético, propiónico, butírico, valérico, caproico, acrílico, malónico, succínico, glutárico, adípico, maleico, fumárico, glicina o fenol sulfónico. Otros ácidos orgánicos serían muy conocidos para un experto en la técnica. El tampón preferido de la presente invención incluye sistemas de tampón de glicina y glicina ácido fosfórico.

Según se usa aquí, agentes activos biológicamente se refiere a proteínas recombinantes o de origen natural, humanas o de animales, útiles para aplicación profiláctica, terapéutica o diagnóstica. El agente activo biológicamente puede ser natural, sintético, semisintético o derivados de ellos. Los agentes activos biológicamente de la presente invención deben ser precipitables. Se considera un amplio intervalo de agentes activos biológicamente. Éstos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, hormonas, citoquinas, factores hematopoyéticos, factores del crecimiento, factores antiobesidad, factores tróficos, factores anti-inflamatorios y enzimas (véase también Patente de los EE.UU. Nº 4.695.463 para tener ejemplos adicionales de agentes activos biológicamente útiles). Un experto en la técnica será capaz fácilmente de adaptar un agente activo biológicamente deseado a las composiciones de la presente invención.

Tales proteínas incluirían, aunque sin limitarse a ellas, interferones (véanse Patentes de los EE.UU. Nº 5.372.808, 5.541.293, 4.897.471 y 4.695.623), interleuquinas (véase Patente de los EE.UU. Nº 5.075.222), eritropoyetinas (véanse Patentes de los EE.UU. Nº 4.703.008, 5.441.868, 5.618.698, 5.547.933 y 5.621.080), factores estimulantes de colonias de granulocitos (véanse Patentes de los EE.UU. Nº 4.810.643, 4.999.291, 5.581.476, 5.582.823 y Publicación PCT Nº 94/17185), factor de células estaminales (Publicación PCT Nº 91/05795, 92/17505 y 95/17206) y la proteína OB (véanse Publicaciones PCT Nº 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816). Además, los agentes activos biológicamente pueden incluir también, aunque sin limitarse a ellos, productos relacionados anti-obesidad, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona estimulante de tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante de folículos (FSH), gonadotropina coriónica humana (HCG), motilina, interferones (alfa, beta, gamma), interleuquinas (IL-1 a IL-12), factor de necrosis de tumores (TNF), proteína de unión a factor de necrosis de tumores (TNF-bp), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de glial (GDNF), factor neurotrófico 3 (NT3), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento neurotrófico (NGF), factores de crecimiento de huesos tales como osteoprotegerina (OPG), factores de crecimiento de tipo insulina (IGFs), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento derivado de megaqueratinocitos (MGDF), trombopoyetina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF), factores de crecimiento estimulantes de colonias (CSFs), proteína morfogenética de huesos (BMP), dismutasa superóxido (SOD), activador de plasminógeno de tejidos (TPA), uroquinasa, estreptoquinasa y calicreína. El término proteínas, según se usa aquí, incluye péptidos, polipéptidos, moléculas de consenso, análogos, derivados o combinaciones de ellos.

Los derivados de agentes activos biológicamente pueden incluir la incorporación de uno o más restos químicos al resto de proteína. Se ha encontrado que la modificación química de agentes activos biológicamente proporciona ventajas adicionales en ciertas circunstancias, tales como aumento de la estabilidad y tiempo de circulación de la proteína terapéutica y disminución de la inmunogenicidad. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar la modificación química deseada en base a la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a proteólisis, los usos terapéuticos y otras consideraciones.

Complejos

Las proteínas, análogo o derivado pueden administrarse acomplejados a una composición de unión. Tal composición de unión puede tener el efecto de prolongar el tiempo de circulación de la proteína, análogo o derivado o aumentar la actividad del agente activo biológicamente. Tal composición puede ser una proteína (o, de manera sinónima, péptido), derivado, análogo o combinación. Por ejemplo, una proteína de unión para la proteína OB es receptor de proteína OB o porción del mismo, tal como una porción soluble del mismo. Otras proteínas de unión pueden determinarse examinando proteína OB o la proteína de elección, en suero, o examinarse empíricamente la presencia de unión. Tal unión no interferirá típicamente con la capacidad de la proteína OB o análogo o derivado para unirse al receptor de proteína OB endógeno y/o efectuar transducción de señal. Además de la proteína OB, también serán aplicables complejos de unión a otras proteínas terapéuticas de la presente invención. Los muy expertos en la técnica serán capaces de determinar proteínas de unión apropiadas para uso con la presente invención.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas de liberación sostenida de la presente invención pueden administrarse mediante preparaciones orales (por ejemplo, cápsulas tales como cápsulas duras y cápsulas blandas, preparaciones sólidas tales como gránulos, pastillas, píldoras, comprimidos o grageas, sellos, glóbulos, formas en polvo y liofilizadas, preparaciones líquidas tales como suspensiones) y no orales (por ejemplo, preparaciones intramuscular, subcutánea, transdérmica, visceral, IV (intravenosa), IP (intraperitoneal), intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, inyectable, pulmonar, nasal, rectal y uterina-transmucósica). En general, están comprendidas por la invención composiciones farmacéuticas de liberación sostenida que comprenden cantidades eficaces de proteína, o productos derivados, con las composiciones de liberación sostenida de la invención junto con diluyentes, agentes de conservación, solubilizantes, emulsionantes, coadyuvantes y/o excipientes aceptables farmacéuticamente necesarios para admnistración. Véase el documento PCT 97/01331. La formulación farmacéutica óptima para un agente activo biológicamente deseado se determinará por un experto en la técnica dependiendo de la vía de administración y de la dosificación deseada. Se describen ejemplos de composiciones farmacéuticas en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., 18ª Ed., Easton, PA, págs. 1435-1712 (1990)).

Los componentes que pueden necesitarse para administración incluyen diluyentes de diverso contenido de tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como tensioactivos y agentes de solubilización (por ejemplo, Tween 80, HCO-60, Polysorbate 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, glutationa, metabisulfito sódico), polisacáridos adicionales (por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginato sódico, hialuronato sódico, sulfato de protamina, polietilenglicol), agentes de conservación (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico, metilparabén, propilparabén) y sustancias de formación (por ejemplo, lactosa, manitol); incorporación del material a preparaciones en partículas de compuestos polímeros tales como polímeros o copolímeros de ácido poliláctico/poliglicólico, etc., o combinado con liposomas. El ácido hialurónico puede usarse también como componente de administración y éste puede tener el efecto de promover aún más la duración sostenida en la circulación. Adicionalmente, las composiciones de liberación sostenida de la presente invención pueden dispersarse también con aceites (por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de maíz, vegetal), o una mezcla de ellos con un fosfolípido (por ejemplo, lecitina) o triglicéridos de ácidos grasos de cadena media (por ejemplo, Miglyol 812) para proporcionar una suspensión aceitosa. Las composiciones de la presente invención también pueden dispersarse con agentes de dispersión tales como polisacáridos solubles en agua (por ejemplo, manitol, lactosa, glucosa, almidones), ácido hialurónico, glicina, fibrina, colágeno y sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro sódico).

Además, también se consideran para su uso en la administración de las composiciones de liberación sostenida de la presente invención dispositivos mecánicos diseñados para entrega pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, nebulizadores, inhaladores dosificados e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica.

Los componentes de administración pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la proporción de liberación in vivo y la proporción de eliminación in vivo de las presentes proteínas y derivados. Un experto en la técnica apreciará los componentes de administración apropiados y/o los dispositivos mecánicos apropiados a usar dependiendo del uso terapéutico, la vía de administración, la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a proteólisis, la estabilidad de la proteína y otras consideraciones.

Métodos de uso

Terapéuticos. Los usos terapéuticos dependen del agente activo biológicamente usado. Un experto en la técnica será capaz fácilmente de adaptar un agente activo biológicamente deseado a la presente invención para sus usos terapéuticos previstos. Los usos terapéuticos para tales agentes se indican con mayor detalle en las siguientes publicaciones que se incorporan aquí como referencia incluyendo dibujos. Los usos terapéuticos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, usos para proteínas de tipo interferones (véanse Patentes de los EE.UU. Nº 5.372.808, 5.541.293, 4.897.471 y 4.695.623), interleuquinas (véase Patente de los EE.UU. Nº 5.075.222), eritropoyetinas (véanse Patentes de los EE.UU. Nº 4.703.008, 5.441.868, 5.618.698, 5.547.933 y 5.621.080), factores estimulantes de colonias de granulocitos (véanse Patentes de los EE.UU. Nº 4.999.291, 5.581.476, 5.582.823, 4.810.643 y Publicación PCT Nº 94/17185), factor de células estaminales (Publicaciones PCT Nº 91/05795, 92/17505 y 95/17206) y la proteína OB (véanse Publicaciones PCT Nº 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816).

Además, los usos terapéuticos de la presente invención incluyen usos de agentes activos biológicamente incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, productos relacionados anti-obesidad, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona estimulante de tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante de folículos (FSH), gonadotropina coriónica humana (HCG), motilina, interferones (alfa, beta, gamma), interleuquinas (IL-1 a IL-12), factor de necrosis de tumores (TNF), proteína de unión a factor de necrosis de tumores (TNF-bp), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de glial (GDNF), factor neurotrófico 3 (NT3), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento neurotrófico (NGF), factores de crecimiento de huesos tales como osteoprotegerina (OPG), factores de crecimiento de tipo insulina (IGFs), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento derivado de megaqueratinocitos (MGDF), trombopoyetina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF), factores de crecimiento estimulantes de colonias (CSFs), proteína morfogenética de huesos (BMP), dismutasa superóxido (SOD), activador de plasminógeno de tejidos (TPA), uroquinasa, estreptoquinasa y calicreína. El término proteínas, según se usa aquí, incluye péptidos, polipéptidos, moléculas de consenso, análogos, derivados o combinaciones de ellos. Además, las presentes composiciones pueden usarse también para fabricación de uno o más medicamentos para el tratamiento o mejora de los estados que pretende tratar el agente activo biológicamente.

A modo de ejemplo, pueden conseguirse también usos terapéuticos (oxigenación de la sangre) y una disminución de la resorción u osteoporosis de huesos en ausencia de pérdida de peso.

Terapias de combinación. Las presentes composiciones y métodos pueden usarse conjuntamente con otras terapias, tales como dieta modificada y ejercicio. Otros medicamentos, tales como los útiles para el tratamiento de diabetes (por ejemplo, insulina y posiblemente amilina), medicamentos para disminuir el colesterol y la tensión sanguínea (tales como los que reducen los niveles de lípidos en sangre u otros medicamentos cardiovasculares), medicamentos para aumento de la actividad (por ejemplo, anfetaminas), diuréticos (para eliminación de líquidos) y supresores del apetito. Tal administración puede ser simultánea o puede ser in seriatim. Además, los presentes métodos pueden usarse conjuntamente con procedimientos quirúrgicos, tales como cirugías cosméticas diseñadas para cambiar la apariencia total de un cuerpo (por ejemplo, liposucción o cirugías láser diseñadas para reducir la masa corporal, o cirugías de implante diseñadas para aumentar la apariencia de la masa corporal). Pueden aumentarse con el uso concomitante de las presentes composiciones y métodos los beneficios para la salud de cirugías cardíacas, tales como cirugías de bypass u otras cirugías diseñadas para aliviar un estado perjudicial causado por el bloqueo de vasos sanguíneos por depósitos grasos, tales como placa arterial. Los métodos para eliminar cálculos biliarios, tales como métodos ultrasónicos o láser, pueden usarse también antes de, durante o después del transcurso de los presentes métodos terapéuticos. Además, los presentes métodos pueden usarse como un adjunto a cirugías o terapias para huesos rotos, músculo dañado u otras terapias que mejorarían por un aumento de la masa de tejido flaco.

Dosificaciones

Un experto en la técnica será capaz de determinar dosificaciones eficaces por administración y observación del efecto terapéutico deseado. La dosificación de la preparación de liberación sostenida es la cantidad necesaria para conseguir la concentración eficaz del agente activo biológicamente in vivo, durante un período dado de tiempo. La dosificación y la frecuencia de administración preferida de las preparaciones de liberación sostenida varían con el tipo del agente activo biológicamente, la duración deseada de liberación, la enfermedad objetivo, la frecuencia de administración deseada, la especie de animal sujeto y otros factores. Preferiblemente, la formulación de la molécula será tal que entre aproximadamente 0,10 mg/kg/día y 100 mg/kg/día produzcan el efecto terapéutico deseado.

Las dosificaciones eficaces pueden determinarse usando herramientas de diagnóstico a lo largo del tiempo. A modo de ejemplo, la presente invención proporciona las dosificaciones de proteína OB. Por ejemplo, puede usarse primero un diagnóstico para medir la cantidad de proteína OB en la sangre (o plasma o suero) para determinar niveles endógenos de proteína OB. Tal herramienta de diagnóstico puede estar en forma de un ensayo de anticuerpo, tal como un ensayo sandwich de anticuerpo. Se cuantifica inicialmente la cantidad de proteína OB endógena, y se determina una línea de base. Las dosificaciones terapéuticas se determinan a medida que se continúa la cuantificación de proteína OB endógena y exógena (es decir, proteína, análogo o derivado encontrados dentro del cuerpo, auto-producidos o administrados) durante el transcurso de la terapia. Por ejemplo, puede ser necesaria inicialmente una dosificación relativamente alta, hasta verse el beneficio terapéutico, y usarse después dosificaciones más bajas para mantener los beneficios terapéuticos.

Métodos de preparación

Preparación de perlas de proteína/alginato. Un procedimiento típico se ilustra mediante el siguiente ejemplo usando la proteína OB o leptina como proteína de elección. Un experto en la técnica entenderá y será capaz de aplicar estos procedimientos a otros agentes activos biológicamente.

Preparación de la mezcla de gotas. La expresión "mezcla de gotas" según se usa aquí se refiere a la mezcla que contiene el polímero hidrófilo y el agente activo biológicamente. Una mezcla de un ml de alginato del 5% (TRIS 10 mM; pH 8) se añade con agitación magnética a 4 ml de leptina (100 mg/ml; TRIS 10 mM; pH 8) en un vaso de boca ancha de 10 ml (en un baño de hielo). La mezcla se vuelve turbia. Se añaden después a la mezcla 40 \mul de NaOH 4 mM y se continúa la agitación durante 15 minutos (en hielo). Se clarifica la mezcla y su pH final está entre aproximadamente 8,6 y 8,8. La concentración de alginato debe ser debe ser al menos 0,05% en peso. Además, el alginato debe ser al menos preferiblemente 30% de ácido gulurónico.

Además de lo anterior, puede añadirse polietilenglicol a la mezcla de gotas como se discute después. De igual modo, tampones o excipientes ayudan a la estabilidad de la proteína de elección. Un experto en la técnica estará bien enterado de los ingredientes apropiados que deben añadirse con fines de estabilidad dependiendo de la proteína escogida para entregar.

Preparación de la mezcla del baño. La expresión "mezcla del baño" según se usa aquí se refiere a la mezcla que contiene el(los) agente(s) de precipitación usado(s) para co-precipitar el agente activo biológicamente y el polímero hidrófilo. El baño contiene típicamente 10 ml de mezcla en un vaso de boca ancha de 50 ml consistente en CaCl_{2} 100 mM más otros ingredientes (véase después). El pH es preferiblemente ácido para ayudar a disminuir el efecto estallido. El pH debe ser preferiblemente menor que pH 4. El tampón del baño dependerá también de la proteína usada. Un experto en la técnica será capaz de ajustar la capacidad o fuerza del tampón en base a la proteína usada. Así, dependiendo de la estabilidad de la proteína, si la concentración del tampón es demasiado alta, por ejemplo con G-CSF, la proteína puede parecer ser menos estable y disminuirá la liberación sostenida.

El baño puede estar constituido por CaCl_{2}, ZnCl_{2}, polietilengicoles ("PEG") y tampones ácidos. El zinc interactúa con la proteína precipitándola, ayudando por ello a aumentar la carga de la perla, a disminuir el efecto estallido y a la liberación lenta de la proteína de la perla. El calcio ayuda a formar el precipitado de alginato y a la formación de la perla. El calcio ayuda también a conformar la perla, especialmente si el baño es viscoso por la adición de otros aditivos como PEG. Puede aumentarse el calcio cuando hay aumento de viscosidad para ayudar a mantener la forma de la perla. Las concentraciones de zinc deben ser al menos 0,1 mM y la concentración de calcio debe ser al menos 10 mM.

La adición de PEG ayuda a aumentar la carga. Se sabe que ciertos PEGs precipitan proteínas. También puede añadirse PEG a la mezcla proteína/alginato que se gotea en el baño para ayudar a maximizar la carga y la liberación sostenida. El peso molecular del PEG puede variar de 700 Da a 1.000 kDa, pero preferiblemente 700 Da-100 kDa. Un experto en la técnica sabrá de la cantidad de PEG a añadir a la mezcla del baño, pero puede ser tan alta como el 99%, preferiblemente menor del 75% en peso. Un experto en la técnica sabrá también que puede limitarse la concentración de PEG por la viscosidad del baño.

Preparación de perlas. En general, se pulverizan, gotean o dispersan gotitas de una mezcla de gotas de leptina/alginato en una mezcla del baño (como se ha descrito antes) que precipita o gelifica la mezcla leptina/alginato. Además, pueden usarse medios electrostáticos para formación de perlas.

Para hacer perlas pequeñas, es decir, de menos de unos pocos cientos de micrómetros de diámetro, se usa una cámara de flujo (portainyector) consistente en una aguja con flujo de aire coaxial. Una de dos aberturas está conectada a una tubería de gas y la otra abertura a una jeringa (3 ml) usada para bombear (a aproximadamente 1 ml/min) la mezcla proteína/alginato al baño. Típicamente, se inyectan 2 ml de la mezcla en 10 ml de mezcla del baño. El inyector está situado aproximadamente a 0,8 cm de la parte superior del vaso de boca ancha del baño. El tamaño de perla se determina principalmente por el caudal de gas, por ejemplo, con un caudal de 8 l/min, el tamaño de perla varía de 50 a 150 micrómetros de diámetro. El caudal de leptina/alginato tiene un efecto mucho menor sobre el tamaño de perla.

Para hacer perlas grandes (es decir, 1-3 mm de diámetro), se usa una jeringa de tuberculina de 1 cm^{3}, equipada con una aguja 24G para gotear la mezcla leptina/alginato en la mezcla del baño. El baño contiene típicamente 1,5% de CaCl_{2} y ZnCl_{2} de 5 a 50 mM. Se recogen las perlas vertiéndolas a través de un filtro de células de nylon de 40 micrómetros. Las perlas se enjuagan el el filtro con 5 ml de agua estéril y se secan suavemente de la cara inferior del filtro
con un paño de limpieza (paño gamma 67). Las perlas se guardan en un microtubo de tapón de rosca de plástico estéril.

Carga de perlas

Método de estallido: Se determina la carga de fármaco de un grupo de perlas seleccionado pesando con precisión 100 mg de las perlas cargadas hidratadas en 1 ml de citrato sódico 0,5 M pH 8,5. La suspensión de perlas se incuba a temperatura ambiente hasta que se desintegran las perlas formando habitualmente un precipitado. Se centrifuga la suspensión a 14k rpm durante 2 min (Eppendorf, 5415 C). Se recoge el sobrenadante y se registra la absorbancia a 280 nm. El precipitado se disuelve suspendiéndolo en 1 ml de urea 7 M. Se registra la absorbancia de esta mezcla. La carga de proteína de las perlas cargadas hidratadas se expresa como mg de proteína por mg de perla o mg de proteína por ml de perla y se determina de la suma de las dos absorbancias.

Método acumulativo: Este método se usa conjuntamente con los estudios de liberación in vitro. Se totaliza la cantidad de proteína liberada de las perlas incluyendo el estallido al final del estudio. Para tener detalles, véase después.

Estudios de liberación in vitro

Se pesan perlas cargadas hidratadas (100 mg) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (Eppendorf) y se añade 1 ml de tampón (histidina 10 mM pH 7,4). La muestra se pone en un sacudidor incubador a 37ºC y 100-200 rpm. A intervalos seleccionados de tiempo, se retira la muestra del incubador, se centrifuga (Eppendorf, 1.000 rpm, 2 min) y se separa el sobrenadante y sustituye por 1 ml de tampón nuevo. La cantidad de proteína liberada se determina a partir de la absorbancia del sobrenadante. Después de tomar la muestra liberada final, se determina la cantidad dejada en la perla por el Método de Carga/Estallido de perla. El porcentaje liberado en un tiempo dado se determina a partir de la suma de la proteína total liberada y la restante en la perla al completarse el experimento.

Estudios in vivo

Pérdida de peso de ratón: En general, se inyectan ratones una vez con una suspensión de las perlas cargadas o perlas sin cargar. Se usan ratones hembras de seis a ocho semanas (tipo C57/BLC), que pesan típicamente 20 gramos. En el caso de muestras de perlas, se añaden 350 \mul de tampón (MES 50 mM pH 6,7) a 100 mg de perlas hidratadas y se somete a vórtice. Se extrae la suspensión en una jeringa de 1 cm^{3} y se inyectan subcutáneamente todas las perlas y 300 \mul del tampón (aguja 23G) en el pescuezo del ratón. Se pesa diariamente a los ratones.

Estudio farmacocinético de ratas: Se usan ratas hembras de seis a ocho semanas (tipo Sprague Dawley), que pesan típicamente 250 gramos. Las inyecciones se realizan de manera similar a la descrita en los experimentos de pérdida de peso de ratón. Se toman muestras de sangre por recogida con catéter a diversos intervalos de tiempo post-inyección y se analiza leptina en las muestras por un ensayo ELISA.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más totalmente la invención, pero no han de considerarse limitativos del alcance de la misma. Además, con respecto a la descripción anterior o los ejemplos que siguen, un experto en la técnica será capaz de hacer los cambios necesarios a las descripciones para producción a gran escala.

Ejemplo 1

Este ejemplo examina el efecto de la concentración de leptina en la perla sobre la liberación de leptina de perlas de alginato coprecipitadas con zinc/leptina. Las perlas pequeñas se preparan como se ha descrito antes usando ZnCl_{2} 25 mM en el baño. La perla de mayor concentración, es decir, 66 mg/ml de leptina, se prepara usando 84 mg/ml de leptina en alginato al 1%, mientras que la perla de menor concentración, es decir, 21 mg/ml de leptina, se prepara a partir de 28 mg/ml de leptina en alginato del 1%. A medida que aumenta la concentración de la leptina en la perla, disminuye la liberación fraccionada de leptina de la perla. Para la mayor concentración, se libera 25% de leptina en 80 h, mientras que con la concentración más baja se libera el 80% en 80 h.

Ejemplo 2

Este ejemplo examina el efecto del nivel de ZnCl_{2} del baño sobre la liberación de leptina de perlas de alginato coprecipitadas con zinc/leptina. Las perlas pequeñas se preparan como se ha descrito antes, pero el nivel de ZnCl_{2} en el baño es 0,5 y 25 mM y la concentración de leptina en las perlas es 37 mg/ml (por el método acumulativo). Este ejemplo muestra que a medida que aumenta el nivel de ZnCl_{2} en el baño, las perlas resultantes tienen un estallido disminuido y una proporción de liberación disminuida de leptina. Con ZnCl_{2} 0,5 mM, las perlas tienen un estallido del 20% y una liberación del 50% a las 40 h; mientras que con ZnCl_{2} 25 mM, las perlas tienen un estallido de menos del 5% y una liberación del 25% a las 40 h.

Ejemplo 3

Este ejemplo compara una perla de alginato coprecipitada con zinc/leptina con una formulación de tampón de acetato testigo (20 mg/ml) en un experimento farmacocinético/de bioactividad combinado. Las perlas pequeñas contienen 64 mg/ml de leptina (es decir, por ml de perlas) y se fabrican como se ha descrito antes con ZnCl_{2} 17 mM en el baño. Se da a ratas hembras (220 g de peso corporal) una inyección SC (subcutánea) simple con una dosis de 50 mg/kg. Las concentraciones en plasma de la muestra de perlas están sostenidas con relación a la del testigo. Las ratas inyectadas con muestras de perlas mantienen una concentración en plasma de leptina por encima de 50 ng/ml durante más de 112 h , en contraste con las 12-18 h para los animales testigo. Los niveles en sangre de leptina más sostenidos superiores en el grupo de perlas se correlacionan con su pérdida de peso más pronunciada y sostenida en comparación con el grupo testigo. Las ratas inyectadas con muestras de perlas pierden continuamente peso durante 120 h; a las 120 h, la pérdida de peso total es el 9% del peso inicial. Como contraste, las ratas testigo pierden el 7% de su peso inicial en 50 h, pero recuperan el peso en 120 h.

Ejemplo 4

Este ejemplo muestra el efecto de diversos PEGs en el baño, además de ZnCl_{2} 10 mM, sobre la eficacia de carga y la liberación in vitro de IL-1ra. Las perlas pequeñas se preparan como se ha descrito antes con IL-1ra en PIPES 10 mM pH 6,85. Un baño de perlas (A) contiene CaCl_{2} 100 mM, ZnCl_{2} 10 mM, 20% de PEG 1K y 20% de PEG 2K. Un segundo baño de perlas (B) contiene lo mismo que A pero sin 20% de PEG 1K. La concentración de IL-1ra en las perlas A y B es 58 mg/ml, es decir, una eficacia de carga del 74% determinada a partir del estallido de citrato sódico. La formulación B tiene un estallido del 55% y liberó el 75% después de 18 h. La formulación A tiene un estallido del 20% y liberó el 50% después de 18 h. Así, la adición de PEGs en el baño condujo a perlas altamente cargadas que sostienen la liberación en la proteína. También, la adición de PEG 1K condujo a un estallido aún más bajo y liberación de proteína más lenta.

Ejemplo 5

(No según la invención)

Este ejemplo muestra el efecto de tener PEGs, pero no zinc, en el baño sobre la carga y el estallido inicial de IL-1ra de perlas de alginato. Las perlas pequeñas se preparan como se ha descrito antes excepto que el baño contiene 20% de PEG 1K y 20% de PEG 2K además de CaCl_{2} 100 mM. La eficacia de carga es del 93% con 63 mg/ml de IL-1ra en la perla. El estallido inicial es el 35%. Así, la adición de PEGs al baño puede conducir a una carga elevada de proteína sin la presencia de iones zinc.

Ejemplo 6

En este ejemplo se hace una comparación de la eficacia de liberación de una inyección de bolus de IL-1ra en tampón (PIPES 10 mM, pH 6,85) e IL-1ra en perlas de alginato del Ejemplo 1. Se inyectaron SC (subcutáneamente) ratones Balb/C hembras (peso corporal 20 g) en el tiempo cero con las diversas formulaciones, conteniendo cada una 10 mg de IL-1ra. A las 18 h, se inyectó IV (intravenosamente) a los ratones con rhIL-1B (0,1 \mug por ratón) y se sacrificaron 2 h más tarde para tomar muestras de sangre. Se analiza en la sangre la concentración de glucosa y el número de linfocitos. La IL-1beta causa normalmente una caída de la concentración de glucosa y el número de linfocitos, pero la presencia de un cierto nivel de IL-1ra protege contra tal pérdida. El resultado del experimento muestra que sólo los ratones que reciben la IL-1ra contenida en las perlas están protegidos contra la pérdida de valor de los parámetros de la sangre. Este resultado demuestra que las perlas de alginato sostienen la liberación de la IL-1ra en un nivel eficaz durante al menos 18 h.

Ejemplo 7 Testigo

Este ejemplo es un experimento testigo que ilustra la preparación y liberación de perlas que contienen proteína usando GCSF, en el que el baño de precipitación sólo contiene CaCl_{2} (100 mM). Las perlas grandes se preparan como se ha descrito antes. La mezcla de la jeringa contiene 46 mg/ml de GCSF (Tris 10 mM pH 7) en alginato del 1%. Las perlas preparadas contienen 16 mg/ml de GCSF (de estallido de citrato). Así, con sólo CaCl_{2} en el baño, la eficacia de carga es del 35%. La liberación fraccionada de la proteína muestra un estallido del 60% y liberación del 75% en un día. Así, usando un procedimiento conocido descrito en la bibliografía se obtiene una carga de proteína baja y una liberación rápida.

Ejemplo 8

Este ejemplo muestra el efecto de ZnCl_{2} en el baño sobre la carga y liberación de GCSF en perlas de alginato. Las perlas grandes se preparan como se ha descrito antes excepto que se añade al baño ZnCl_{2} 10 mM. La mezcla de la jeringa contiene 46 mg/ml de GCSF en alginato del 1%. Las perlas preparadas contienen 28 mg/ml de GCSF (de estallido de citrato). Así, con la adición de ZnCl_{2} 10 mM al baño (además de CaCl_{2} 100 mM) la eficacia de carga aumenta del 35% (Ejemplo 6) al 61%. La liberación fraccionada de la proteína muestra un estallido reducido del 40% y una liberación de un día del 55%. Así, la adición de ZnCl_{2} al baño de CaCl_{2} conduce a una eficacia de carga mayor, estallido más bajo y liberación más lenta de la proteína.

Ejemplo 9

Este ejemplo muestra el efecto de tener PEG en el baño siendo el pH del baño ácido sobre la carga y liberación de GCSF con perlas de alginato. Las perlas grandes se preparan como se ha descrito en el Ejemplo 7 excepto que se añade al baño 20% de PEG (Aldrich) y el pH del baño es 1,7. El baño contiene también CaCl_{2} 100 mM y ZnCl_{2} 10 mM. La eficacia de carga para GCSF es del 54% y la liberación fraccionada (25 mg/ml en las perlas) muestra un estallido muy reducido de menos del 5% y liberación del 40% después de 100 horas. Así, una mezcla del baño ácida que puede contener PEG (además de CaCl_{2} y ZnCl_{2}) conduce a bajo estallido y liberación lenta de proteína.

Ejemplo 10

Este ejemplo muestra el efecto de tener PEGs y zinc en el baño y el pH del baño rebajado con agente(s) acidifican-
te(s) sobre la carga de, y el estallido inicial de GCSF de perlas de alginato. Las perlas grandes se preparan como se ha descrito antes excepto que el baño contiene ZnCl_{2} 25 mM, CaCl_{2} 100 mM y 5% de PEG 1K y 5% de PEG 10K. El pH del baño se rebaja con tampón de glicina y ácido fosfórico a pH 1,65. Las perlas resultantes (20 mg/ml de carga) presentan menos del 5% de estallido y una liberación fraccionada del 40% en 90 h. Así, una combinación de PEGs y zinc y bajo pH en el baño conduce a un estallido bajo y una liberación lenta.

Ejemplo 11

(No según la invención)

Este ejemplo muestra la preparación de GCSF en perlas de alginato con PEGs en un baño de pH bajo sin adición de iones zinc. Las perlas pequeñas se preparan como se ha descrito antes excepto que el baño contiene 5% de PEG 1K y 5% de PEG 10K. El pH del baño se rebaja a 1,43 usando tampón de glicina y ácido fosfórico. La eficacia de carga es del 42% con 14 mg/ml en las perlas (de estallido de citrato). La liberación fraccionada muestra un estallido del 32% y una liberación del 35% después de 70 h.

Ejemplo 12

(No según la invención)

Las perlas grandes de GCSF/alginato del Ejemplo 12 y de los siguientes Ejemplos 13-15 se preparan de manera similar a la descrita antes, pero con un control más riguroso del tiempo de las diversas operaciones y un método alternativo para determinar la carga. Más específicamente, se gotea 1 ml de una mezcla GCSF/alginato en 10 ml del baño agitado magnéticamente en aproximadamente 2 minutos. Las perlas se filtran y se lavan con 5 ml de agua. El procedimiento de fabricación de perlas total consume aproximadamente 5 minutos. La carga se determina (por A280) a partir de la diferencia de la cantidad de proteína en la mezcla de alginato goteada en el baño y la proteína que no queda incorporada en las perlas formadas, es decir, la proteína restante en la mezcla del baño y los lavados. Esta cantidad de proteína incorporada a las perlas se divide por el volumen de 1 ml de mezcla añadida al baño para obtener la carga expresada en mg/ml de perlas.

El Ejemplo 12 compara la presencia de PEG en el baño sobre la carga de GCSF en las perlas. Las perlas grandes se preparan como se ha descrito antes excepto que el baño contiene CaCl_{2} 200 mM y 15% de PEG 8K (pH 5-6); el baño de las perlas testigo tiene CaCl_{2} 200 mM. La adición de PEG al baño aumenta la carga de 21,8 mg/ml (eficacia del 70%) a 26,5 mg/ml (eficacia del 85%).

Ejemplo 13

(No según la invención)

Este ejemplo muestra el efecto del pH del baño bajo sobre la carga y liberación de GCSF con perlas de alginato. La formación de perlas y la carga se determinan como en el Ejemplo 12 con PEG excepto que uno de los baños contiene tampón de glicina 0,5 M pH 2,1. La carga a pH 2,1, 24,9 mg/ml (eficacia del 80%), es similar a la del testigo. Sin embargo, la liberación inicial a una hora (29%) es menor y la liberación a las 24 h más sostenida (32%) que la del testigo (92% y 99% respectivamente).

Ejemplo 14

Este ejemplo muestra el efecto de la adición de zinc a un baño que contiene PEG sobre la carga de GCSF en perlas de alginato. La formación de perlas y la carga se determinan como en el Ejemplo 12 con PEG. La adición de ZnCl_{2} 10 mM al baño aumentó la carga de 26,5 mg/ml (eficacia del 85%) a 30,3 mg/ml (eficacia del 97%).

Ejemplo 15

(No según la invención)

Este ejemplo muestra un estallido inicial bajo y una liberación sostenida de GCSF desde perlas de alginato. La formación de perlas, la carga y la liberación se realizan de manera similar a la del Ejemplo 13 excepto que el baño contiene CaCl_{2} 100 mM, 5% de PEG 1K y 5% de PEG 2K, y tampón de glicina 0,5 M (pH 2,1). Las perlas cargadas contienen 24 mg/ml de GCSF. En ½ hora la liberación inicial es casi cero, a las 19 h la liberación es del 13,6% y a las 44 h la liberación es del 24%.

Claims (35)

1. Una composición de perlas de gel de liberación sostenida, que comprende:

a)

un polímero hidrófilo;

b)

un agente activo biológicamente; y

c)

al menos dos agentes de precipitación;

en la que al menos uno de los agentes de precipitación comprende zinc y co-precipita el agente activo biológicamente con el polímero hidrófilo, en la que el polímero hidrófilo es alginato.

2. La composición de la reivindicación 1ª, en la que al menos uno de los agentes de precipitación se selecciona del grupo constituido por iones de metales polivalentes o sales, acetatos, citratos, cloruros, carbonatos o hidróxidos de ellos.

3. La composición de la reivindicación 2ª, en la que los iones de metales se seleccionan del grupo constituido por manganeso, estroncio, hierro, magnesio, calcio, bario o aluminio y mezclas de ellos.

4. La composición de la reivindicación 3ª, en la que los agentes de precipitación comprenden zinc y calcio.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, en la que el alginato contiene al menos 30% de ácido gulurónico.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, en la que el alginato consiste en al menos 0,05% en peso.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 6ª, en la que el agente activo biológicamente comprende una proteína.

8. La composición de la reivindicación 7ª, en la que la proteína consiste en al menos 0,01 mg/ml.

9. La composición de la reivindicación 7ª, en la que la proteína se selecciona del grupo constituido por factores hematopoyéticos, factores estimulantes de colonias, factores anti-obesidad, factores de crecimiento, factores tróficos y factores anti-inflamatorios.

10. La composición de la reivindicación 7ª, en la que la proteína se selecciona del grupo constituido por leptina, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1ra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferones, eritropoyetina, KGF y análogos o derivados de ellos.

11. La composición de alguna de las reivindicaciones 1ª a 10ª, en la que al menos uno de los agentes de precipitación se selecciona del grupo constituido por polímeros solubles en agua.

12. La composición de la reivindicación 11ª, en la que el polímero soluble en agua es polietilenglicol.

13. Un método para producir una composición de perlas de gel de liberación sostenida, que comprende las etapas de:

a)

disolver un agente activo biológicamente y un polímero hidrófilo en un disolvente para formar una primera mezcla;

b)

disolver al menos dos agentes de precipitación en un disolvente para formar una segunda mezcla;

c)

añadir la primera mezcla a la segunda mezcla; y

d)

co-precipitar el agente activo biológicamente con el polímero hidrófilo para formar una partícula co-precipitada,

en el que al menos uno de los agentes de precipitación es zinc y co-precipita el agente activo biológicamente, en el que el polímero hidrófilo es alginato.

14. El método de la reivindicación 13ª, en el que al menos un agente de precipitación se selecciona del grupo constituido por iones de metales polivalentes o sales, acetatos, citratos, cloruros, carbonatos o hidróxidos de ellos.

15. El método de la reivindicación 14ª, en el que el ion de metal se selecciona del grupo constituido por manganeso, estroncio, hierro, magnesio, calcio, bario, aluminio o mezclas de ellos.

16. El método de la reivindicación 15ª, en el que los agentes de precipitación comprenden zinc y calcio.

17. El método de la reivindicación 16ª, en el que el agente de precipitación de la segunda mezcla consiste en al menos 1 mM de calcio y 0,1 mM de zinc.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 17ª, en el que la segunda mezcla tiene un pH inferior a 4.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 18ª, en el que el alginato contiene al menos 30% de ácido gulurónico.

20. El método de la reivindicación 19ª, en el que la primera mezcla consiste en al menos 0,05% de alginato en peso.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 20ª, en el que el agente activo biológicamente comprende una proteína.

22. El método de la reivindicación 21ª, en el que la primera mezcla consiste en al menos 0,01 mg/ml de proteína.

23. El método de la reivindicación 21ª, en el que la proteína se selecciona del grupo constituido por factores hematopoyéticos, factores estimulantes de colonias, factores anti-obesidad, factores de crecimiento, factores tróficos y factores anti-inflamatorios.

24. El método de la reivindicación 21ª, en el que la proteína se selecciona del grupo constituido por leptina, G-CSF, SCF, BDNF, OPG, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1ra, IL2, TNF-bp, MGDF, interferones, eritropoyetina, KGF y análogos o derivados de ellos.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 24ª, en el que al menos uno de los agentes de precipitación se selecciona del grupo constituido por polímeros solubles en agua.

26. El método de la reivindicación 25ª, en el que el polímero soluble en agua es polietilenglicol.

27. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 26ª, en el que la adición de la primera mezcla a la segunda mezcla tiene lugar por pulverización, campos electrostáticos, adición de gotitas, dispersión o mezclado, para formar las partículas co-precipitadas.

28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 27ª, que comprende además la etapa de aislar la partícula co-precipitada.

29. El producto de liberación sostenida producido por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 28ª.

30. Una formulación farmacéutica que comprende una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 12ª o 29ª en un excipiente, diluyente o coadyuvante aceptable farmacéuticamente.

31. Una composición de liberación sostenida según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 12ª o 29ª en un excipiente, diluyente o coadyuvante aceptable farmacéuticamente, de uso en un método de tratamiento

32. El uso de una composición de liberación sostenida según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 12ª o 29ª o una formulación farmacéutica según la reivindicación 30ª, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo constituido por exceso de peso, diabetes, alto nivel de lípidos en sangre, esclerosis arterial, placa arterial, reducción o prevención de la formación de cálculos biliarios, insuficiente masa de tejidos flacos, sensibilidad insuficiente a insulina, y apoplejía, en la que el agente activo biológicamente es leptina, un análogo o un derivado de ella.

33. El uso de una composición de liberación sostenida según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 12ª o 29ª o una formulación farmacéutica según la reivindicación 30ª, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo constituido por deficiencias de células hematopoyéticas, infección y neutropenia, en la que el agente activo biológicamente es G-CSF, un análogo o un derivado de él.

34. El uso de una composición de liberación sostenida según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 12ª o 29ª o una formulación farmacéutica según la reivindicación 30ª, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de inflamación, en la que el agente activo biológicamente es una IL-1ra, un análogo o un derivado de ella.

35. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 32ª a 34ª, en el que el medicamento es para entrega por inyección.