ES2294814T3 - Geles de liberacion retardada y sostenida. - Google Patents

Abstract

Una formulación farmacéutica de una composición de gel de liberación sostenida que comprende: a) alginato; b) un agente biológicamente activo; y c) al menos un ion metálico polivalente unido, en la que el gel se forma de una manera retardada en el tiempo, en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Description

Geles de liberación retardada y sostenida.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones de liberación sostenida que usan geles retardados de alginato y a sus métodos.

Antecedentes

Con los avances en las tecnologías de ingeniería genética y celular, la disponibilidad de proteínas recombinantes ha engendrado avances en el uso de proteínas como medicamentos para aplicaciones terapéuticas. Muchas enfermedades o estados tratados con proteínas farmacéuticas requieren niveles de proteína sostenidos para alcanzar el resultado terapéutico más eficaz. Sin embargo, como con la mayoría de los productos farmacéuticos proteínicos, la semivida biológica generalmente corta requiere una administración frecuente. Estas inyecciones repetidas se administran a diversos intervalos que dan como resultado niveles de medicación fluctuantes con una carga física y monetaria significativa sobre los pacientes. Puesto que muchos estados responden mejor a niveles controlados de un producto farmacéutico, existe una necesidad de una liberación controlada de un medicamento para proporcionar períodos de liberación constante más prolongados. Tales medicamentos de liberación sostenida deben proporcionar al paciente no solo efectos profiláticos, terapéuticos o diagnósticos mejorados, sino también una disminución en la frecuencia de las inyecciones así como en los costes globales.

Intentos actuales de sostener niveles de medicación en seres humanos o animales entre dosis han incluido el uso de polímeros biodegradables como matrices para controlar la liberación de medicamento. Por ejemplo, la Patente de Gran Bretaña Nº 1.388.580 describe el uso de hidrogeles para la liberación sostenida de insulina. La Patente de EE.UU. Nº 4.789.550 describe el uso de microcápsulas de alginato revestidas con polilisina para el aporte de proteína al encapsular células vivas. Intentos de liberación sostenida también han utilizado composiciones de polímero aniónico o catiónico rodeadas por polímeros iónicos de la carga opuesta para encapsular células capaces de producir composiciones biológicamente activas. Patente de EE.UU. Nº 4.744.933. Asimismo, también se han descrito múltiples capas de polímeros de reticulación aniónicos o catiónicos como medios para obtener liberación controlada. Patentes de EE.UU. Nº 4.690.682 y 4.789.516. Además, intentos adicionales describen el uso de alginatos solos o alginatos revestidos con otros polímeros biodegradables para la liberación controlada de composiciones polipeptídicas o sus precipitados catiónicos. Documentos PCT WO 96/00081, PCT WO 95/29664 y PCT WO 96/03116.

Sin embargo, estos intentos han proporcionado medios insuficientes para obtener aporte de liberación sostenida de productos farmacéuticos proteínicos deseados. Se sabe generalmente que el uso de ciertos polímeros biodegradables, por ejemplo, poli(láctido-co-glicólido), bajo condiciones in vivo, exhibe descargas instantáneas iniciales altas de liberación de medicamento. Johnson, O. y otros, Nature Med., 2/7: 795 (1996). Por otra parte, se sabe generalmente que las proteínas usadas con formas actuales de preparaciones de liberación sostenida pueden sufrir desnaturalización y perder su viabilidad durante la exposición a los agentes encapsulantes. Tales preparaciones usan disolventes orgánicos que pueden tener efectos perjudiciales sobre la proteína de elección. Finalmente, según se analiza posteriormente, el uso de alginato solo no ha proporcionado la liberación de proteína controlada deseada necesaria para unos resultados terapéuticos eficaces.

En general, los alginatos son polisacáridos aniónicos presentes en la naturaleza bien conocidos, comprendidos por ácido \beta-D-manurónico conectado en 1,4 y ácido \alpha-L-gulurónico. Smidsrod, O. y otros, Trends in Biotechnology, 8: 71-78 (1990); Aslani, P. y otros, J. Microencapsulation, 13/5: 601-614 (1996). Los alginatos varían físicamente de 70% de ácido manurónico y 30% de ácido gulurónico a 30% de ácido manurónico y 70% de ácido gulurónico. Smidsrod, anteriormente. El ácido algínico es insoluble en agua mientras que las sales formadas con iones monovalentes como sodio, potasio y amonio son solubles en agua. McDowell, R. H., "Properties of Alginates" (Londres, Alginate Industries Ltd., 4ª edición, 1977). Se sabe que los cationes polivalentes reaccionan con alginatos para formar espontáneamente geles.

Los alginatos tienen una amplia variedad de aplicaciones tales como aditivos alimenticios, adhesivos, comprimidos farmacéuticos, una plantilla para nuevo crecimiento celular y vendajes para heridas. Los alginatos también se han recomendado para técnicas de separación de proteínas. Por ejemplo, Gray, C. J. y otros, en Biotechnology and Bioengineering, 31: 607-612 (1988), atraparon insulina en geles de alginato de zinc/calcio para la separación de insulina y otras proteínas séricas.

Las matrices de alginato también se han documentado bien para sistemas de aporte de fármacos. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.695.463, que describe un sistema de aporte y preparaciones farmacéuticas de goma de mascar basada en alginato. Se han usado cuentas de alginato para la liberación controlada de diversas proteínas tales como: receptor de factor de necrosis tumoral en cuentas de alginato catiónico revestidas con policationes, Wee, S. F, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 21: 730-31 (1994); factor de crecimiento transformante encapsulado en cuentas de alginato, Puolakkainen, P. A. y otros, Gastroenterology, 107: 1319-1326 (1994); factores angiogénicos atrapados en cuentas de alginato cálcico, Downs, E. C. y otros, J. of Cellular Physiology, 152: 422-429 (1992); albúmina atrapada en microcápsulas de quitosano-alginato, Polk, A. y otros, J. Pharmaceutical Sciences, 83/2: 178-185 (1994), o cuentas de quitosano-alginato cálcico revestidas con polímero, Okhamafe, A. O. y otros, J. Microencapsulation, 13/5: 497-508 (1996); hemoglobulina encapsulada con cuentas de quitosano-alginato cálcico, Huguet, M. L. y otros, J. Applied Polymer Science, 51: 1427-1432 (1994), Huguet, M. L. y otros, Process Biochemistry, 31: 745-751 (1996); e interleuquina-2 encapsulada en microesferas de alginato-quitosano, Liu, L. S. y otros, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 22: 542-543 (1995).

Los sistemas que usan cuentas de gel de alginato o cuentas de gel de alginato/calcio para atrapar proteínas sufren de falta de efecto de liberación sostenida debido a liberación rápida de la proteína desde las cuentas de alginato. Liu, L. y otros, J. Control. Rel., 43: 65-74 (1997). Para evitar tal liberación rápida, un número de los sistemas anteriores intenta usar revestimientos de polímeros policatiónicos (por ejemplo, polilisina, quitosano) para retardar la liberación de las cuentas de proteína-alginato. Véanse, por ejemplo, Wheatley, M. A. y otros, J. Applied Polymer Science, 43: 2123-2135 (1991); Wee, S. F. y otros, anteriormente; Liu, L. S. y otros, anteriormente; Wee, S. F. y otros, Controlled Release Society, 22: 566-567 (1995) y Lim y otros, anteriormente.

Los policationes, tales como polilisina, son polielectrolitos cargados positivamente que interactúan con las moléculas de alginato cargadas negativamente para formar complejos polielectrolíticos que actúan como barreras de difusión sobre la superficie de la cuenta. Pueden producirse problemas con el uso de policationes ya que: (1) tales formulaciones pueden ser citotóxicas debido a los policationes (Huguet, M. L. y otros, anteriormente; Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, 13: 269 (1992); Bergmann, P. y otros, Clinical Science, 67: 35 (1984)); (2) los policationes son propensos a la oxidación; (3) las cuentas con revestimientos policatiónicos tienden a no ser erosionables y se acumulan en el cuerpo; (4) tales formulaciones se elaboran a través de procedimientos de revestimiento laboriosos que incluyen revestimientos múltiples del policatión polilisina (Padol, y otros, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 2: 216 (1986) y (5) las interacciones iónicas entre la proteína y los policationes pueden dar como resultado pérdida de actividad de la proteína o provocar inestabilidad de la proteína.

Además de los sistemas anteriores, también existen sistemas de aporte que se gelifican después de la inyección o son de base orgánica y/o base tixotrópica. Los depósitos gelificados que se gelifican después de la inyección en el cuerpo pueden sostener la liberación de fármacos atrapados. Estos incluirán la gelificación inducida por temperatura de poloxámeros, (por ejemplo, Pluronics®, Patente de EE.UU. Nº 2.741.573). Estos son líquidos a temperaturas frías pero se gelifican a temperaturas elevadas tales como las temperaturas corporales. Estos sistemas son difíciles de controlar debido a variaciones en las condiciones de temperatura ambiente y variaciones en las temperaturas anatómicas, especialmente si se usan inyecciones subcutáneas.

Como para los sistemas de gelificación de base orgánica, tales sistemas no son adecuados para fármacos proteínicos frágiles que se desestabilizan en presencia de disolventes orgánicos o condiciones no fisiológicas. También se han usado geles tixotrópicos de estearato de aluminio en aceites para prolongar la actividad de la penicilina. Buckwalter y otros, J. Am. Pharm Assoc., 137: 472 (1948); Thompson, R. E., American Journal Clinical Nutrition, 7: 311 (1959); Thompson, Robert E., Sustained Release of Parenteral Drugs, Bulletin of Parenteral Drug Assoc., 14: 6-17, (1960); Chen, Y., Journal of Parenteral Science & Tech., 35: 106 (1981). El documento JP 01 005460A describe la gelificación de goma de gelano usando una sal de metal alcalino y una sustancia ácida. Las proteínas tienden a desestabilizarse en presencia de este tipo de sistemas que contienen aceite.

Generalmente no se conocen en la técnica sistemas de aporte de fármacos de liberación sostenida que impliquen un retardo de tiempo controlado para la gelificación en el cuerpo. Sin embargo, este tipo de sistemas de gelificación retardada se conoce en el contexto del cultivo tisular de plantas, la inmovilización de células, la formación de microesferas, la liberación de insecticidas y la industria alimentaria. Por ejemplo, los alginatos se han usado con complejos cálcicos insolubles y \delta-gluconolactona como un donante de protones para la liberación de iones calcio en la solución para la gelificación. Véase Draget y otros, Appl Microbiol. Biotechnol, 31:79-83 (1989). Asimismo, se han usado sistemas similares para la formación de cuentas de alginato mediante emulsificación/gelificación interna. Las microesferas de alginato se producen usando alginato dispersado dentro de aceite vegetal y la gelificación se inicia al reducir el pH para liberar calcio del complejo insoluble. Véase Poncelet, D. y otros, Appl. Microbiol. Biotechnol, 43: 644-650 (1995). También se han usado sistemas de alginato para inmovilizar células. Burke, C. describe, en Methods of Enzymology, 135: 175-189 (1987), que pueden usarse fosfato dicálcico y \delta-gluconolactona con alginatos para la gelificación retardada de células. La Patente de EE.UU. Nº 4.053.627 describe el uso de discos de gel de alginato para controlar la liberación de un insecticida en un ambiente acuoso. Estos usos mencionados anteriormente no están diseñados para depósitos gelificados dentro del cuerpo para la liberación sostenida de agentes biológicamente activos, especialmente proteínas.

De acuerdo con esto, existe una necesidad de desarrollar formulaciones farmacéuticas de gel retardado que alcancen un medio mejor de liberación sostenida para aplicaciones clínicas. Numerosas proteínas recombinantes o naturales podrían beneficiarse de la liberación constante a largo plazo a través de formulaciones de gel retardado y de ese modo proporcionar resultados clínicos más eficaces.

La presente invención proporciona tales avances. Las composiciones farmacéuticas de gel retardado de la presente invención son capaces de proporcionar protección, degradación disminuida y disolución lenta de proteínas con estabilidad y potencia incrementadas de las proteínas. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención proporcionan un medio simple, rápido y económico de liberación controlada de proteínas recombinantes para resultados profilácticos, terapéuticos o diagnósticos eficaces.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones de liberación sostenida que usan geles retardados de alginato y a sus métodos. En particular, la formación de los geles retardados de liberación sostenida incluye geles de alginato tixocotrópicos con un agente biológicamente activo. Este sistema proporciona la ventaja de producir una carga eficaz y alta de agente biológicamente activo dentro del gel retardado de alginato para el aporte de liberación sostenida mientras se alcanza protección y degradación disminuida de la proteína y estabilidad y potencia incrementadas del agente que ha de aportarse. Por otra parte, la gelificación temporizada proporciona más control sobre las propiedades de gelificación y su administración.

De acuerdo con esto, un aspecto de la presente invención proporciona una composición de gel retardado de liberación sostenida, que comprende un polímero hidrófilo; un agente biológicamente activo y al menos un ion metálico polivante unido. La velocidad de gelificación se controla mediante el nivel de calcio libre, es decir, ion metálico polivalente no unido. El agente biológicamente activo puede estar en una forma complejada. La formación de moléculas complejadas y cualesquiera agentes complejantes relacionados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Además, la composición anterior puede contener además ion metálico polivalente que es una mezcla de iones metálicos polivalentes unidos y uno unidos. Debido a la naturaleza controlada en el tiempo de estos geles, estas mezclas pueden situarse en el cuerpo donde pueden gelificarse después de la inyección. Además, debido a la naturaleza tixotrópica de la composición en estado de gel, estas mezclas pueden inyectarse mientras están en estado de gel, por ejemplo, mediante presión desde la jeringa, después de lo cual pueden regelificarse en el cuerpo.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición de gel retardado de liberación sostenida, que comprende un polímero hidrófilo; un agente biológicamente activo; al menos un ion metálico polivalente unido y que comprende además al menos un donante de protones capaz de liberar el ion metálico polivalente unido. La liberación del protón desde el donante de protones libera el catión del ion metálico polivalente unido.

Otro aspecto proporciona métodos para producir las composiciones de gel retardado de liberación sostenida de la presente invención. Un método comprende las etapas de mezclar un agente biológicamente activo y un polímero hidrófilo con un disolvente para formar una primera mezcla y mezclar la primera mezcla con al menos un ion metálico polivalente unido para formar una segunda mezcla. Un método alternativo comprende las etapas de mezclar un agente biológicamente activo y un polímero hidrófilo con un disolvente para formar una primera mezcla; mezclar la primera mezcla con al menos un ion metálico polivalente unido para formar una segunda mezcla; y mezclar con la segunda mezcla al menos un donante de protones capaz de liberar el ion metálico polivalente unido. El ion metálico polivalente unido y el donante de protones también pueden añadirse a la primera mezcla conjuntamente, o el donante de protones puede añadirse a la primera mezcla antes que el ion metálico polivalente unido. Además, también se contempla una etapa para aislar la composición de gel retardado de liberación sostenida.

Según se usa en la presente memoria, el término ion metálico polivalente unido se refiere a un ion metálico polivalente en una forma de sal o quelato o ion complejo. El ion metálico polivalente unido puede incluir una mezcla de ion metálico polivalente unido y no unido. Esto incluiría, según se apunta anteriormente, la liberación del ion metálico polivalente unido hasta no unido. Según se usa en la presente memoria, el término donante de protones capaz de liberar ion metálico polivalente unido se refiere a ácidos fuertes, ácidos débiles o un material capaz de generar un ácido, por ejemplo lactonas o ésteres (mediante hidrólisis acuosa), o un ácido escasamente soluble o un ácido que se disuelve lentamente, tal como ácido adípico.

Según se usa aquí, el término disolvente se refiere a disolventes de base acuosa o no acuosa capaces de dispersar o disolver los agentes biológicamente activos, polímeros hidrófilos, iones metálicos polivalentes, donantes de protones o agentes complejantes de elección. Tales disolventes son bien conocidos por el experto en la técnica. Pueden realizarse adiciones para formar la primera mezcla y la segunda mezcla mediante métodos bien conocidos para el experto en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, vertido y agitación, adición de gotículas, dispersión, pulverización o mezcladura al usar chorros de pulverización, chorros de aire, atomización y campos eléctricos. El término dispersión, para los propósitos de esta invención, pueden significar dispersiones líquidas, sólidas o gaseosas. Según se usa en la presente memoria, el término aislar se refiere al procedimiento para el aislamiento de la composición de gel retardado de liberación sostenida de la presente invención. Tales procedimientos de aislamiento y purificación son bien conocidos en la técnica.

En un aspecto más, la presente invención proporciona una composición de gel retardado de liberación sostenida producida mediante los métodos anteriores. Aspectos adicionales incluyen formulaciones farmacéuticas de gel retardado de las composiciones anteriores en un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Además, la composición de gel retardado puede estar contenida en una jeringa.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona métodos para tratar indicaciones con composiciones de gel retardado de liberación sostenida que contienen agentes biológicamente activos deseados.

Descripción detallada de la invención Composiciones

La composición usa alginatos y sus derivados, que pueden obtenerse de diversas fuentes comerciales, naturales o sintéticas bien conocidas en la técnica.

Asimismo, los iones metálicos polivalentes unidos pueden obtenerse de diversas fuentes comerciales, naturales o sintéticas que son todas bien conocidas en la técnica. Iones metálicos polivalentes unidos o secuestrados dentro del alcance de esta invención incluyen, pero no se limitan a, manganeso, estroncio, hierro, magnesio, calcio, bario, cobre, aluminio o zinc. Los iones metálicos pueden obtenerse de sales solubles de un agente complejante, sus fosfatos, tartratos, sulfatos, carbonatos, hidróxidos o aniones de ácido graso, tales como oleatos. Un experto en la técnica apreciará otros diversos iones metálicos polivalentes unidos/complejos que están dentro del alcance de la invención. Los iones metálicos polivalentes unidos pueden incluir una mezcla de iones metálicos polivalentes unidos y no unidos.

Donantes de protones, según se usa aquí, se refiere a un material que puede generar ácidos. Los donantes de protones son capaces de liberar un ion metálico polivalente unido secuestrado. Los donantes de protones son bien conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, lactonas tales como gluconolactona, ésteres, tampones y otros ácidos que se disuelven lentamente. Según se usa aquí, ácidos que se disuelven lentamente se refiere a ácidos tales como ácidos sólidos que son de baja solubilidad en disolvente. Además, ácidos que se disuelven lentamente incluyen dispositivos o materiales revestidos que liberan lentamente ácidos. Ácidos bien conocidos dentro del alcance de la técnica incluyen acético, adípico, cítrico, fumárico, glucónico, láctico, málico, fosfórico y tartárico. Un experto en la técnica apreciará otros diversos donantes de protones que están dentro del alcance de la invención.

Según se usa en la presente memoria, el término tampón o solución tamponadora se refiere al uso de ácidos o bases inorgánicos u orgánicos o una de sus combinaciones para preparar una solución tamponadora como se conoce en la técnica. Estos también incluyen materiales anfóteros o aminoácidos. Ácidos inorgánicos dentro del alcance de la presente invención incluyen haluros de hidrógeno (por ejemplo, ácido clorhídrico), fosfórico, nítrico o sulfúrico. Otros ácidos inorgánicos serán bien conocidos para el experto en la técnica y se contemplan en la presente memoria. Ácidos orgánicos dentro del alcance de la invención incluyen ácidos carboxílicos alifáticos y ácidos aromáticos tales como fórmico, carbónico, acético, propiónico, butírico, valérico, caproico, acrílico, malónico, succínico, glutárico, adípico, maleico, fumárico, glicina o fenolsulfónico. Otros ácidos orgánicos serán bien conocidos para el experto en la técnica. Bases orgánicas incluyen TRIS®, piridina, PIPES® y HEPES®. Tampones de aminoácido incluyen glicina y mezclas de glicina/ácido fosfórico.

Según se usa en la presente memoria, agentes biológicamente activos se refiere a proteínas recombinantes o presentes en la naturaleza, ya sean humanas o animales, útiles para aplicación profiláctica, terapéutica o diagnóstica, así como agentes no basados en proteínas, tales como moléculas pequeñas, oligonucleótidos y agentes inorgánicos y orgánicos. El agente biológicamente activo puede ser natural, sintético, semisintético o sus derivados. Además, los agentes biológicamente activos de la presente invención pueden ser precipitables. Se contempla una amplia gama de agentes biológicamente activos. Estos incluyen, pero no se limitan a, hormonas, citoquinas, factores hematopoyéticos, factores de crecimiento, factores antiobesidad, factores tróficos, factores antiinflamatorios y enzimas (véase, además, la Patente de EE.UU. Nº 4.695.463 para ejemplos adicionales de agentes biológicamente activos útiles). Un experto en la técnica podrá fácilmente adaptar un agente biológicamente activo a las composiciones de la presente invención.

Tales proteínas incluirán, pero no se limitan a, interferones (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 5.372.808, 5.541.293, 4.897.471 y 4.695.623 incorporadas en la presente memoria mediante referencia incluyendo los dibujos), interleuquinas (véase la Patente de EE.UU. Nº 5.075.222, incorporada en la presente memoria mediante referencia incluyendo los dibujos), eritropoyetinas (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 4.703.008, 5.441.868, 5.547.933 y 5.621.080, incorporadas en la presente memoria mediante referencia incluyendo los dibujos), factores estimulantes de colonias de granulocitos (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 4.810.643, 4.999.921, 5.581.476, 5.582.823 y la Publicación PCT Nº 94/17185, incorporadas en la presente memoria mediante referencia incluyendo los dibujos), factor de células pluripotenciales (Publicaciones PCT Nº 91/05795, 92/17505 y 95/17206, incorporadas en la presente memoria mediante referencia incluyendo los dibujos) y la proteína OB (véanse las Publicaciones PCT Nº 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816, incorporadas en la presente memoria mediante referencia incluyendo las figuras). Además, los agentes biológicamente activos también pueden incluir, pero no se limitan a, productos relacionados con la lucha contra la obesidad, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona estimulante del tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante de folículos (FSH), gonadotropina coriónica humana (HCG), motilina, interferones (alfa, beta, gamma), interleuquinas (IL-1 a IL-12), factor de necrosis tumoral (TNF), proteína de unión al factor de necrosis tumoral (TNF-bp), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), factor neurotrófico 3 (NT3), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento neurotrófico (NGF), factores de crecimiento óseos tales como osteoprotegerina (OPG), factores de crecimiento similares a insulina (IGFs), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento derivado de megacariocitos (MGDF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), trombopoyetina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF), factores de crecimiento estimulantes de colonias (CSFs), proteína morfogenética ósea (BMP), superóxido dismutasa (SOD), activador del plasminógeno tisular (TPA), uroquinasa, estreptoquinasa y calicreína. El término proteínas, según se usa en la
presente memoria, incluye péptidos, polipéptidos, moléculas de consenso, análogos, derivados o sus combinaciones.

Derivados de agentes biológicamente activos pueden incluir la ligazón de uno o más restos químicos al resto proteínico. Se ha encontrado que la modificación química de agentes biológicamente activos proporciona ventajas adicionales bajo ciertas circunstancias, tales como incrementar la estabilidad y el tiempo en circulación de la proteína terapéutica y disminuir la inmunogenicidad. Un experto en la técnica podrá seleccionar la modificación química deseada basándose en la dosificación deseada, el tiempo en circulación, la resistencia a la proteolisis, los usos terapéuticos y otras consideraciones. Son deseables derivados tales como proteínas de fusión de polietilenglicol y Fc.

Complejos

El agente biológicamente activo puede estar en formas complejadas. Esto incluirá formas precipitadas, formas estructuradas y asociación con otras moléculas. Estas formas complejadas del agente pueden disminuir la velocidad de difusión del agente fuera del gel y de ahí sostener la liberación del agente. Estas formas complejadas incluyen, pero no se limitan a, un agente biológicamente activo complejado con anticuerpos, sustratos, receptores, polímeros y precipitantes.

Por ejemplo, los agentes biológicamente activos, el análogo o el derivado pueden administrarse complejados a una composición de unión. Tal composición de unión además de los beneficios anteriores también puede tener el efecto de promover el tiempo en circulación del agente, el análogo o el derivado o potenciar la actividad del agente biológicamente activo. Tal composición puede ser una proteína (o sinónimamente un péptido), un derivado, un análogo o una combinación o un agente no proteínico.

A modo de ilustración, una proteína de unión para la proteína OB es el receptor de proteína OB o una de sus porciones, tal como una de sus porciones solubles. Otras proteínas de unión pueden determinarse al examinar la proteína OB, o la proteína de elección, en suero, o rastrearse típicamente con respecto a la presencia de unión. Tal unión típicamente no interferirá con la actividad de proteína OB o análogo o derivado para unirse a receptor de proteína OB endógeno y/o efectuar la transducción de señal. Además de la proteína OB, los complejos de unión también serán aplicables a otras proteínas terapéuticas de la presente invención. Los expertos en la técnica podrán determinar proteínas de unión apropiadas para el uso con la presente invención.

Asimismo, agentes precipitantes usados para precipitar el agente biológicamente activo pueden obtenerse de diversas fuentes comerciales, naturales o sintéticas que son bien conocidas en la técnica. Agentes precipitantes incluyen, pero no se limitan a, iones metálicos polivalentes o sus sales, tales como acetatos, citratos, cloruros, carbonatos, hidróxidos, oxalatos, tartratos o sus hidróxidos, ácidos o polímeros solubles en agua. En particular, los iones metálicos pueden incluir, pero no se limitan a, aluminio, bario, calcio, hiero, manganeso, magnesio, estroncio y zinc. Preferiblemente, el ion metálico es zinc o sus sales, como sales de acetato-cloruro. También pueden usarse moléculas pequeñas y sales solubles en agua, tales como sulfato amónico, acetona, etanol y glicerol.

Como para los polímeros solubles en agua, estos incluyen, pero no se limitan, a polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, hidroxietilcelulosa, amilosa, carboxilmetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímeros de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos, dextrano, poli(N-vinilpirolidona), polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados, poli(succinato de alcohol vinílico), glicerina, óxidos de etileno, óxidos de propileno, poloxámeros, copolímeros alcoxilados, polianiones solubles en agua, sus derivados o combinaciones. El polímero soluble en agua puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. Por ejemplo, el peso molecular preferido del polietilenglicol está entre aproximadamente 700 Da y aproximadamente 100 kDa para la facilidad en el manejo y la eficacia de precipitación.

Pueden usarse otros tamaños y tipos de agentes precipitantes, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de liberación sostenida deseada, los efectos, si los hay, sobre la actividad biológica, la facilidad en el manejo, el grado o la falta de antigenicidad y otros efectos conocidos de un agente precipitante deseado para una proteína terapéutica o análogo). Un experto en la técnica apreciará otros agentes precipitantes que están dentro del alcance de la invención.

Además, las composiciones de la presente invención también pueden incluir excipientes suplementarios necesarios para estabilizar el agente biológicamente activo y/o el polímero hidrófilo. Estos pueden estar contenidos en el tampón y pueden incluir, pero no se limitan a, conservantes.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas de liberación sostenida de la presente invención pueden administrarse mediante preparaciones orales (por ejemplo, preparaciones líquidas que permiten la gelificación en el estómago o el intestino) y no orales (por ejemplo, preparaciones intramusculares, subcutáneas, transdérmicas, viscerales, IV (intravenosas), IP (intraperitoneales), intraarticulares, de colocación en el oído, ICV (intracerebroventriculares), IP (intraperitoneales), intraarteriales, intratecales, intracapsulares, intraorbitales, inyectables, pulmonares, nasales, rectales y uterinas-transmucosales. En general, son abarcadas por la invención composiciones farmacéuticas de gel retardado de liberación sostenida que comprenden cantidades eficaces de proteína, o productos derivados, con las composiciones de liberación sostenida de la invención junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables necesarios para la administración. (Véase el documento PCT 97/01331 incorporado en la presente memoria mediante referencia). La formulación farmacéutica óptima para un agente biológicamente deseado será determinada por un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración y la dosificación deseada. Composiciones farmacéuticas ejemplares se describen en Remington's Farmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., 18ª Ed., Easton, PA., pgs. 1435-1712 (1990)).

Debido a la naturaleza tixotrópica de la formulación de gel retardado, pueden usarse jeringas para administrar subcutáneamente. La composición puede gelificarse en una jeringa para la inyección posterior. Esta gelificación puede realizarse de una manera retardada en el tiempo. La temporización se controla mediante el ajuste juicioso de la cantidad del agente gelificante y el donante de protones, si se usa, así como el tamaño de partícula del ion metálico polivalente y la temperatura de la mezcla. Tal preparación se usará para la regelificación posterior en el cuerpo después de la inyección. El término tixotrópico, según se usa en la presente memoria, se refiere a que la viscosidad de la mezcla de gel disminuye bajo presión, por ejemplo, desde el émbolo de la jeringa, en cuyo punto la mezcla puede fluir, por ejemplo, a través de la aguja de la jeringa, y a continuación reformar un gel en la zona de inyección.

El concepto de gelificación retardada también puede aplicarse a la carga de una jeringa en la que una composición de gel de liberación sostenida se carga en una jeringa y en un momento prefijado gelifica en la jeringa, por ejemplo, de unos pocos minutos a muchas horas después de la carga. Esto evita el problema de cargar una jeringa con material que ya se ha gelificado. Estas jeringas precargadas pueden almacenarse para la inyección posterior a pacientes.

Componentes que pueden ser necesarios para la administración incluyen diluyentes o tampones de diversos pH y fuerza iónica (por ejemplo, Tris-HCl, acetato); aditivos tales como tensioactivos y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, HCO-60, Polysorbate 80), lípidos, liposomas, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, glutationa, metabisulfito sódico), polisacáridos adicionales (por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginato sódico, hialuronato sódico, sulfato de protamina, polietilenglicol), conservantes (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico, metilparabén, propilparabén) y sustancias estructurales (por ejemplo, lactosa, manitol); la incorporación del material con preparaciones en partículas de compuestos polímeros tales como polímeros o copolímeros de poli(ácido láctico)/poli(ácido glicólico), etc., o combinado con liposomas. El ácido hialurónico también puede usarse como un componente de administración y que puede tener el efecto de promover aún más la duración sostenida en la circulación. Adicionalmente, las composiciones de liberación sostenida de la presente invención también pueden dispersarse con aceites (por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de maíz, aceite vegetal), o una de sus combinaciones con un fosfolípido (por ejemplo, lecitina), o triglicéridos de ácidos grasos de cadena media (por ejemplo, Miglyol 812) para proporcionar una suspensión oleosa. Las composiciones de la presente invención también pueden dispersarse con agentes dispersantes tales como polisacáridos solubles en agua (por ejemplo, manitol, lactosa, glucosa, almidones), ácido hialurónico, glicina, fibrina, colágeno y sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro sódico).

Además, también se contemplan para el uso en la administración de composiciones de liberación sostenida de la presente invención dispositivos mecánicos diseñados para el aporte pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo, pero no limitados a, nebulizadores, inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica.

Los componentes de administración pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vitro y la velocidad de regulación in vivo de las proteínas y los derivados presentes. Un experto en la técnica apreciará los componentes de administración apropiados y/o los dispositivos apropiados que usar dependiendo del uso terapéutico, la ruta de administración, la dosificación deseada, el tiempo en circulación, la resistencia a la proteolisis, la estabilidad de la proteína y otras consideraciones.

Métodos de uso

Terapéutico. Los usos terapéuticos dependen del agente biológicamente activo usado. Un experto en la técnica podrá fácilmente adaptar un agente biológicamente activo deseado a la presente invención para sus usos terapéuticos pretendidos. Usos terapéuticos para tales agentes se indica con mayor detalle en las siguientes publicaciones incorporadas en la presente memoria mediante referencia incluyendo los dibujos. Los usos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, usos para proteínas como interferones (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 5.372.808, 5.541.293, 4.897.471 y 4.695.623, incorporadas en la presente memoria mediante referencia incluyendo los dibujos), interleuquinas (véase la Patente de EE.UU. Nº 5.075.222, incorporada en la presente memoria mediante referencia incluyendo los dibujos), eritropoyetinas (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 4.703.008, 5.441.868, 5.547.933 y 5.621.080, incorporadas en la presente memoria mediante referencia incluyendo los dibujos), factores estimulantes de colonias de granulocitos (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 4.999.921, 5.581.476, 5.582.823, 4.810.643 y la Publicación PCT Nº 94/17185, incorporadas en la presente memoria mediante referencia incluyendo los dibujos), factor de células pluripotenciales (Publicaciones PCT Nº 91/05795, 92/17505 y 95/17206, incorporadas en la presente memoria mediante referencia incluyendo los dibujos) y la proteína OB (véanse las Publicaciones PCT Nº 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816, incorporadas en la presente memoria mediante referencia incluyendo las figuras).

Además, usos terapéuticos de la presente invención incluyen usos de agentes biológicamente activos, incluyendo, pero no limitados a, productos relacionados con la lucha contra la obesidad, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona estimulante del tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante de folículos (FSH), gonadotropina coriónica humana (HCG), motilina, interferones (alfa, beta, gamma), interleuquinas (IL-1 a IL-12), factor de necrosis tumoral (TNF), proteína de unión al factor de necrosis tumoral (TNF-bp), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), factor neurotrófico 3 (NT3), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento neurotrófico (NGF), factores de crecimiento óseos tales como osteoprotegerina (OPG), factores de crecimiento similares a insulina (IGFs), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento derivado de megacariocitos (MGDF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), trombopoyetina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF), factores de crecimiento estimulantes de colonias (CSFs), proteína morfogenética ósea (BMP), superóxido dismutasa (SOD), activador del plasminógeno tisular (TPA), uroquinasa, estreptoquinasa y calicreína. El término proteínas, según se usa aquí, incluye péptidos, polipéptidos, moléculas de consenso, sus análogos, derivados o sus combinaciones. Además, las presentes combinaciones también pueden usarse para la fabricación de uno o más medicamentos para el tratamiento o el alivio de los estados que el agente biológicamente activo está destinado a tratar.

Terapias de combinación. Las composiciones y los métodos presentes pueden usarse junto con otras terapias, tales como dieta alterada y ejercicio. Otros medicamentos, tales como aquellos útiles para el tratamiento de la diabetes (por ejemplo, insulina y posiblemente amilina), medicamentos que disminuyen el colesterol y la presión sanguínea (tales como aquellos que reducen los niveles de lípidos en sangre u otros medicamentos cardiovasculares), medicamentos que incrementan la actividad (por ejemplo, anfetaminas), diuréticos (para la eliminación de líquidos) y supresores del apetito. Tal administración puede ser simultánea o puede ser en serie. Además, los presentes métodos pueden usarse junto con procedimientos quirúrgicos, tales como cirugías cosméticas diseñadas a alterar la apariencia global del cuerpo (por ejemplo, liposucción o cirugías laséricas diseñadas para reducir la masa corporal, o cirugías de implante diseñadas para incrementar la apariencia de la masa corporal). Los beneficios sanitarios de cirugías cardíacas, tales como cirugías de baipás u otras cirugías diseñadas para aliviar un estado perjudicial provocado por el bloqueo de vasos sanguíneos por depósitos grasos, tales como placa arterial, pueden incrementarse con el uso concomitante de las composiciones y los métodos presentes. Métodos para eliminar piedras vesiculares, tales como métodos ultrasónicos o laséricos, también pueden usarse bien antes de, bien durante o bien después del transcurso de los presentes métodos terapéuticos. Por otra parte, los presentes métodos pueden usarse como un adyuvante para cirugías o terapias para huesos rotos, músculo dañado u otras terapias que se mejorarían mediante un incremento en la masa de tejido magro.

Dosificaciones

Un experto en la técnica podrá determinar dosificaciones eficaces mediante administración y observando el efecto terapéutico deseado. La dosificación de la preparación de liberación sostenida es la cantidad necesaria para alcanzar la concentración eficaz del agente biológicamente activo in vivo, para un período de tiempo dado. La dosificación y la frecuencia de administración preferida de las preparaciones de liberación sostenida varían con el tipo del agente biológicamente activo, la duración deseada de la liberación, la enfermedad elegida como objetivo, la frecuencia de administración deseada, la especie del animal en cuestión y otros factores. Preferiblemente, la formulación de la molécula será tal que entre aproximadamente 0,10 \mug/kg/día y 100 mg/kg/día darán el efecto terapéutico deseado.

Las dosificaciones eficaces pueden determinarse usando herramientas diagnósticas a lo largo del tiempo. A modo de ejemplo, la presente invención proporciona las dosificaciones de proteína OB. Por ejemplo, puede usarse en primer lugar un diagnóstico para medir la cantidad de proteína OB en la sangre (o el plasma o el suero) para determinar niveles endógenos de proteína OB. Tal herramienta diagnóstica puede estar en la forma de un ensayo de anticuerpos, tal como un ensayo de anticuerpos de tipos sándwich. La cantidad de proteína OB endógena se cuantifica inicialmente y se determina una línea de base. Las dosificaciones terapéuticas se determinan a medida que la cuantificación de proteína OB endógena y exógena (esto es, proteína, análogo o derivado encontrado dentro del cuerpo, bien sea autoproducido o administrado) se continúa a lo largo del transcurso de la terapia. Por ejemplo, puede necesitarse inicialmente una dosificación relativamente alta, hasta que se observa beneficio terapéutico, y a continuación usarse dosificaciones interiores para mantener los beneficios terapéuticos.

Materiales y Métodos

Materiales. Alginato en forma de sal de alginato puede encontrarse de fuentes o puede prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica. La leptina, el GCSF y el interferón de consenso son de Amgen Inc. Otros productos químicos son de fuentes bien conocidas en la técnica.

Preparación-introducción de gel retardado. El gel retardado se prepara al combinar una mezcla de agente biológicamente activo y polímero aniónico (por ejemplo, alginato) con una sal catiónica polivalente (por ejemplo, CaCO_{3}) y un donante de protones (por ejemplo, tampón acidificado o fuente de ácido de liberación o disolución lenta tal como \delta-gluconolactona), si se usa. Para todos los casos, el polímero aniónico, la proteína y cualesquiera precipitantes/excipientes pueden prepararse como una mezcla. La gelificación se inicia mediante la adición de la sal catiónica polivalente y la fuente de protones, si se usa, a la mezcla. La adición de protón-ion metálico polivalente a la mezcla de polímero-agente biológicamente activo puede ser simultánea, o separadamente con el donante de protones en primer lugar o el ion metálico polivalente en primer lugar. Para la gelificación inducida por tampón, la sal catiónica polivalente y la fuente de protones pueden mezclarse como una suspensión acuosa mucho antes del momento de la gelificación. Después de que se inicie la gelificación, las jeringas se cargan antes de que se produzca la gelificación (típicamente de 5 a 10 minutos). Las inyecciones pueden realizarse antes de que el material se gelifique para la gelificación in situ o después de que el material se gelifique.

Mezcla de proteína-alginato. Se prepara una mezcla de disolvente y precipitantes/excipientes (por ejemplo, sales de zinc, tampones, etc.). En sucesión rápida, se mezclan rápidamente una solución de la proteína (por ejemplo, leptina en Tris HCl 10 mM, pH 8) y alginato estéril (por ejemplo, solución al 10% tratada en autoclave). Cuando el agente biológicamente activo se prepara como una suspensión fina (por ejemplo, zinc-leptina se forma típicamente en 10-15 mg/ml), puede ser deseable concentrar la suspensión.

Sal cálcica. La sal cálcica puede prepararse como una suspensión tratada en autoclave de polvo fino en agua (por ejemplo, CaCO_{3} al 9,1% en agua).

Fuente de protones. Para geles inducidos por tampón, la suspensión de sal cálcica puede combinarse con tampón, tal como Tris HCl 1 M, pH 7,0, o PIPES 0,5 M, pH 6,7.

Para fuentes de ácido que se disuelven lentamente o que se liberan lentamente (\delta-gluconolactona), un peso dado de polvo se disuelve en agua a un tiempo seleccionado poco antes del uso (por ejemplo, un minuto antes de la mezcladura). También pueden usarse una mezcla procesada de polvos estériles secos de la fuente de ácido y la sal cálcica para simplificar el procedimiento.

Disolvente. El disolvente puede ser acuoso, no acuoso o sus mezclas. Ejemplos de disolventes no acuosos son dimetilsulfóxido, dimetilformamida, glicerol, polietilenglicoles, Pluronics®, etc.

Gelificación. La gelificación de la mezcla polímero-fármaco puede iniciarse añadiendo sal cálcica. La temperatura de la mezcla y la cantidad y el tamaño de partícula de la sal pueden usarse para controlar la rapidez de la gelificación. Si se usa adicionalmente un donante de protones, la gelificación de la mezcla puede iniciarse al añadir bien 1) sal cálcica y suspensión tamponadora acidificada (separadamente o conjuntamente), bien 2) suspensión de sal cálcica seguido por una solución/suspensión reciente de una fuente de protones que se libera lentamente, o viceversa, o bien 3) polvos de sal cálcica y fuente de protón conjuntamente o separadamente. Después de la adición de la sal cálcica, pueden añadirse a la mezcla otros precipitantes/excipientes (por ejemplo, sales de zinc, o tampones, etc.). Después de la mezcladura a fondo y rápida, la mezcla de gel puede aspirarse a una jeringa antes de que se gelifique.

Carga de gel. En general, la carga de la proteína es conocida. Cargas de gel desconocidas pueden determinarse como sigue.

Método de la descarga instantánea. Aproximadamente 0,1-0,2 ml (tomado el peso exacto) de gel se cuelan en un tubo de Eppendorf y a continuación se disuelven en 1 ml de citrato sódico 0,1 M. La mezcla se incuba a temperatura ambiente con agitación suave hasta que el gel se desintegra (generalmente de 2 horas hasta durante la noche). Después de que la suspensión resultante se centrifugue a 8 K rpm durante 2 min (Eppendorf, 5415 C), se toma la absorbancia a 280 nm del sobrenadante. Cualesquiera sólidos residuales se disuelven en 1 ml de urea 7 M; la absorbancia de esta solución se registra. A partir de estas absorbancias, pueden calcularse los miligramos de proteína por gamo de gel.

Método acumulativo. Este método se usa junto con los estudios de liberación in vitro. La cantidad de proteína liberada del gel, incluyendo la descarga instantánea al final del estudio, se totaliza. Para los detalles, véase la sección en Estudios de Liberación In Vitro.

Estudios de liberación in vitro. El gel bien se forma en un tubo de Eppendorf (muestras "coladas") o bien en la jeringa y a continuación se diluye en el tubo de Eppendorf (muestras "extruidas"). En general, aproximadamente 0,1-0,2- ml de gel se cuelan o extruyen (cantidad exacta pesada). La liberación se comienza al añadir tampón (Tris HCl 10 mM, pH 8 para leptina, pH 7,4 para GCSF) a cada tubo y colocarlo en un agitador incubador (New Brunswick Scientific) a 37ºC y 100-200 rpm. A intervalos de tiempo seleccionados, la muestra se retira de la incubadora. Si el gel está intacto, el sobrenadante se retira y se centrifuga (Eppendorf, 8000 rpm, 2 min) y el sobrenadante se recoge. Cualesquiera sólidos se suspenden en 1 ml de Tris reciente y se devuelven al tubo de liberación original para la reanudación de la liberación. Si el gel está en gran parte roto, el contenido del tubo se centrifuga, el sobrenadante se recoge y los sólidos se resuspenden en 1 ml de tampón para la reanudación de la liberación. Los "puntos temporales" del sobrenadante pueden requerir centrifugación adicional (8000-13.000 rpm, 8 minutos) para clarificarlos para la exploración UV. La cantidad de proteína liberada se determina a partir de la absorbancia del sobrenadante. Después de que se tome la muestra de liberación final, la cantidad que queda en la cuenta se determina mediante el Método de la Descarga Instantánea (anteriormente). El porcentaje liberado en un tiempo dado se determina a partir de la proteína acumulativa liberada expresada como una fracción bien de la carga de proteína original en el gel (conocida a partir del peso de gel y cómo esté formulado) o bien la proteína total final liberada (incluyendo la descarga instantánea de citrato-urea final).

Estudios in vivo

Pérdida de peso en ratones. Ratones hembra de seis a ocho semanas de edad, tipo C57/BLC, se obtienen de Charles River y Taconic Inc. Típicamente pesan 20 gramos. Cada grupo de dosis consiste en cinco ratones. Las inyecciones son subcutáneas.

Estudio de PK en ratas. Se usan ratas macho en este estudio y típicamente pesan 250-300 gramos. Las inyecciones se realizan de una manera similar a la descrita en los experimentos de pérdida de peso en ratones. Se muestrea sangre mediante recolección con catéter a diversos intervalos temporales después de la inyección y las muestras se analizan con respecto a la leptina mediante un ensayo ELISA.

Ejemplos

Los siguientes Ejemplos se ofrecen para ilustrar más a fondo la invención, pero no debe considerarse que limiten su alcance. Además, con respecto a la descripción anterior o los ejemplos posteriores, un experto en la técnica podrá realizar los cambios necesarios en las descripciones para la producción a gran escala.

Ejemplo 1

Este Ejemplo in vivo muestra que la leptina en un gel retardado inducido con tampón es activa y exhibe liberación sostenida en comparación con una solución de leptina. Este ejemplo también ilustra un sistema que se gelifica después de la inyección en el animal. Se preparó una suspensión de carbonato cálcico estéril a partir de sólidos tamizados de un tamaño de partícula de menos de 75 micras. Una premezcla de esto con Tris, pH 7, se añadió a leptina en alginato (en Tris 10 mM, pH 8) tal que las concentraciones finales de los ingredientes eran: 2% de alginato (filtrado estérilmente), 10 mg/ml de leptina, Tris 7 mM, pH 8, Tris 150 mM, pH 7, CaCO_{3} 24 mM (suponiendo disolución completa). Tal mezcla se gelificaba en de ocho a nueve minutos. Cuando se omitía la leptina, el tiempo de gelificación era ligeramente más prolongado (10-12 minutos). Esto dejaba tiempo para cargar las jeringas.

La formulación de gel retardado se inyectó (mientras todavía estaba sin gelificar) en un grupo de ratones en días alternos a 100 mg/kg/día (equivalente a 2 días a 50 mg/kg). Un segundo grupo fue inyectado con solución de leptina (en tampón de Tris a 10 mg/ml) diariamente a 50 mg/kg y un tercer grupo recibía la solución de leptina en días alternos a 100 mg/kg. Los ratones se pesaron diariamente y el cambio de peso se expresó como un porcentaje de los pesos iniciales de los ratones.

El esquema de dosificación de días alternos con el gel retardado daba casi la misma pérdida de peso que la solución de leptina inyectada diariamente (8-9%). En contraste, la solución de leptina administrada en días alternos mostraba una pérdida de peso menor (6%) de menor duración. Este último grupo volvía a su peso de la línea de base en 8 días, mientras que los otros grupos recuperaban sus pesos originales en 10-11 días.

Ejemplo 2

Este Ejemplo muestra que la producción de un gel retardado de alginato cálcico inducido por tampón puede prolongar la liberación sostenida in vitro en comparación con las formulaciones no gelificadas. Se preparó suspensión de carbonato cálcico como una suspensión de 100 mg/ml de un polvo muy fino. Una premezcla de esta con tampón de PIPES de pH 6,7 se añadió a una suspensión de zinc-leptina en alginato (tamponada con Tris a pH 8) que se generó a partir de una solución de leptina concentrada (83 mg/ml en Tris pH 8 en el momento en el que se añadía el zinc). Un ml de tal mezcla se coló en un vaso de precipitados de 10 ml. Las concentraciones finales de todos los ingredientes eran: 2% de alginato (a partir de solución al 10% tratada en autoclave de Keltone LVCR), Tris 15 mM, pH 8, 50 mg/ml de leptina, ZnCl_{2} 1 mM, CaCO_{3} 10 mM (suponiendo la disolución completa) y PIPES 93 mM, pH 6,7. En ausencia de leptina, tal mezcla gelificaba en 7 minutos. Después de la gelificación nocturna, trozos de 0,2 g del gel se pesaron y se pusieron en viales de centelleo para la liberación, sobre el agitador a 37ºC. Esta liberación se comparó con la liberación de la misma formulación sin calcio y PIPES (sin gel de alginato cálcico). Cuando la formulación espesada de zinc-leptina-alginato (no gelificada) se liberaba, el punto temporal de 5 horas era 75% y había una liberación gradual hasta 90% durante los \sim3 días siguientes. Sin embargo, zinc-leptina en el gel retardado de alginato cálcico exhibía una liberación mucho más sostenida - 35% a las 5 horas, 60% al día, y a continuación liberación más gradual hasta 70% a los 5 días.

Ejemplo 3

Este Ejemplo muestra que un gel inducido por \delta-gluconolactona que contiene leptina como un precipitado de zinc fino sostiene la liberación de leptina. Se añadió leptina (\sim14 mg/ml en Tris pH 8) a una solución de PIPES de pH 6,7 y una solución de ZnCl_{2} se mezcló inmediatamente, seguido rápidamente por solución de alginato (a 10% tratada en autoclave) tal que las concentraciones finales de los ingredientes eran ZnCl_{2} 1,1 mM, 2,2% de alginato, Tris 10 mM (pH 8) y PIPES 22 mM (pH 6,7). Esta mezcla se concentró mediante centrifugación hasta que el nivel de leptina era 46 mg/ml. La mezcla de gel se elabora a continuación removiendo en suspensión de CaCO_{3} (polvo fino) rápidamente seguido por solución de \delta-gluconolactona. Las concentraciones finales de los componentes eran 2% de alginato, PIPES 20 mM, Tris 9 mM, ZnCl_{2} 1 mM, CaCO_{3} 16 mM (suponiendo disolución completa) y \delta-gluconolactona 79 mM. La mezcla se aspiró en jeringas antes de la gelificación y la gelificación se produjo en las jeringas después de 10 minutos. Después del almacenamiento durante la noche (3 horas a temperatura ambiente y a continuación a 4ºC), los geles se inyectaron en ratones. La pérdida de peso se verificó en comparación con el control de
tampón.

El equivalente a cinco días de leptina se inyectó a 50 mg/kg/día, es decir, un bolo de 250 mg/kg en el gel y se comparó con el mismo bolo de leptina libre en solución. El bolo de leptina libre mostraba solo un moderado máximo de pérdida de peso de 4,4-4,8% a los 2 a 3 días y empezaba la ganancia de peso el día 5. En contraste, a los 2 a 4 días, zinc-leptina en el gel producía una pérdida de peso de 9%. A los cinco días, la pérdida de peso para el gel todavía estaba en 5% y permanecía por encima de la línea de base (pérdida de peso mantenida) cuando el experimento terminaba a los 7 días.

Ejemplo 4

Este Ejemplo muestra que si la concentración de proteína de la mezcla de alginato-leptina-zinc es suficientemente alta, la mezcla forma un gel en ausencia de calcio que exhibe liberación sostenida. Se añadió leptina (\sim14 mg/ml en Tris pH 8) a una solución tamponadora y una solución de ZnCl_{2} se mezcló inmediatamente, seguido rápidamente por solución de alginato (a 10% tratada en autoclave) tal que las concentraciones finales de los ingredientes eran ZnCl_{2} 1,1 mM, bien 1,1 ó 2,2% de alginato, Tris 10 mM (pH 8) y PIPES 22 mM (pH 6,7) si está presente). Esta mezcla se concentró mediante centrifugación hasta que se alcanzaba la concentración deseada de sólidos de leptina. La formulación de \sim50 mg/ml tenía PIPES y 2,2% de alginato. La formulación de \sim100 mg/ml no tenía PIPES y tenía 1,1% de alginato.

Las concentraciones finales de los componentes para el gel cálcico de 50 mg/ml del Ejemplo 3 eran 2% de alginato, PIPES 20 mM, Tris 9 mM, ZnCl_{2} 1 mM, CaCO_{3} 16 mM (suponiendo la disolución completa) y \delta-gluconolactona 79 mM. Para el gel cálcico de 100 mg/ml, la formulación era similar, excepto que las concentraciones finales de los componentes eran 1% de alginato, se omitía PIPES, CaCO_{3} 13 mM y \delta-gluconolactona 67 mM.

Para los geles con calcio, las mezclas se aspiraron a jeringas antes de la gelificación y la gelificación se produjo en las jeringas después de 10 minutos. Cuando no se incluía calcio en el gel, la mezcla de Zn-leptina-alginato se aspiró a jeringas y se dejó gelificar. Se observaba que la formulación de 50 mg/ml sin calcio no se gelificaba. Después del almacenamiento durante la noche (3 horas a temperatura ambiente y a continuación a 4ºC), los geles se inyectaron en ratones. La pérdida de peso se verificó en comparación con el control de tampón.

El equivalente de cinco días de leptina se inyectó a 50 mg/kg/día, es decir, un bolo de 250 mg/kg en el gel. Los geles de calcio del Ejemplo 3 producían una pérdida de peso de 9% en 2-4 días; a los 5 días, la pérdida de peso para el gel todavía era 5% y permanecía por encima de la línea de base (pérdida de peso mantenida) cuando el experimento terminaba a los 7 días. En comparación, la formulación de 50 mg/ml sin calcio producía una pérdida de peso de 3% durante los días 2 a 4, sin embargo, la pérdida de peso caía hasta cero el día 5. En contrate, la formulación de 100 mg/ml de leptina sin calcio era al menos tan activa como la formulación de 100 mg/ml de leptina con calcio. La pérdida de peso máxima para el gel de 100 mg/ml sin calcio era 9% el día 4, la pérdida de peso máxima para el gel de 100 mg/ml con calcio era 6%, también el día 4. Ambas formulaciones empezaban la ganancia de peso el día 9.

Ejemplo 5

Este Ejemplo muestra que la liberación sostenida in vitro de leptina desde un gel retardado de alginato puede prepararse sin formar en primer lugar un precipitado fino de leptina-zinc. Leptina (100 mg/ml; Tris HCl 10 mM, pH 8,8; pH ajustado de 8,0 a 8,8 con NaOH 1 M) y alginato al 6% (Tris HCl 10 mM, pH 8,6) se enfriaron sobre un baño de hielo. Se añadió leptina (0,5 ml) al alginato al 6% (0,18 ml) y la mezcla se agitó sobre un baño de hielo durante 10-15 minutos; el pH final era 8,6-8,8. A esta mezcla se añadió una suspensión de CaCO_{3} 1 M (16 mcl) y la suspensión resultante se agitó bien. A esta suspensión se añadió gota a gota, con agitación, una solución de ZnCl_{2} 0,1 M (100 mcl); a continuación se añadió agua para llevar el volumen hasta 1 ml. La mezcla en suspensión se mezcló completamente y se mantuvo sobre un baño de hielo durante 10-20 minutos. A continuación, una solución de \delta-gluconolactona 1,68 M (56 mcl) se removió a fondo en esta mezcla. Una cantidad de 0,1 ml de la mezcla final (50 mg/ml de leptina, alginato al 1%) se coló sobre el interior de un tubo de Eppendorf y se dejó durante la noche a 4ºC.

Después del almacenamiento nocturno, se efectuó liberación in vitro en histidina 10 mM, pH 7,4. El gel colado exhibía pocas descargas instantáneas y una liberación de leptina bastante constante con 50% liberado en 6 días.

Ejemplo 6

Este Ejemplo muestra que un gel inducido por \delta-gluconolactona que contiene leptina como un precipitado de zinc fino produce más liberación sostenida de leptina que la misma suspensión de zinc en alginato que no está gelificada. El gel con zinc-leptina se preparó como en el Ejemplo 3. Una suspensión de zinc-leptina no gelificada en alginato se preparó del mismo modo, excepto que se omitieron el CaCO_{3} y la \delta-gluconolactona. Los ratones fueron dosificados con inyecciones en bolo de 250 mg/kg y el experimento de pérdida de peso se realizó como se describe en el Ejemplo 3. La suspensión no gelificada producía solo una pérdida de peso de 3% los días 2-4, mientras que la suspensión gelificada provocaba aproximadamente una pérdida de peso de 9% durante el mismo período. La pérdida de peso para la suspensión no gelificada volvía a la línea de base el día 5, mientras que la pérdida de peso para la suspensión gelificada quedaba por encima de la línea de base a los siete días, cuando el experimento finalizaba.

Ejemplo 7

Este Ejemplo muestra la cinética de liberación de orden cero en un estudio farmacocinético/farmacodinámico en ratas macho, que demuestra tanto la liberación sostenida como un efecto sostenido simultáneo de leptina (es decir, pérdida de peso) aportados por la composición de gel descrita en el Ejemplo 3. La concentración de leptina era 47 mg/ml y se pregelificó en la jeringa como se describe en el Ejemplo 3. Se les administró a las ratas una dosis en bolo de 0 mg/kg (control), 50 mg/kg y 250 mg/kg, a continuación los niveles en sangre y la pérdida de peso se verificaron durante seis días. El precipitado de leptina-zinc sin el gel también se inyectó en ratas a una dosis de 100 mg/kg.

El grupo del gel de leptina de alta dosis exhibía un nivel en sangre estable de \sim2000 ng/ml a lo largo del período, mientras que el grupo del gel de leptina de dosis inferior tenía un nivel de \sim1/5 el nivel para cuatro días. En contraste, el grupo de leptina sin el gel exhibía un nivel en sangre de 2300 ng/ml que alcanzaba el máximo a las 12 horas y a continuación disminuía en un factor de 100 durante el mismo período de tiempo. El peso de las ratas (frente al control de vehículo) disminuía establemente durante este período para el grupo de gel de leptina de alta dosis. El peso del grupo de gel de leptina de dosis inferior seguía el mismo curso durante cerca de 5 días; en ese punto, el nivel en sangre de leptina del grupo de dosis inferior disminuía.

La biodisponibilidad del fármaco leptina se determinó al comparar áreas normalizadas para la dosis bajo la curva de la formulación de gel de leptina, la formulación de leptina sin gel y leptina administrada intravenosamente. La biodisponibilidad de la formulación de gel de leptina era 80% en comparación con 63% de la formulación de leptina sin gel.

Ejemplo 8

Este Ejemplo muestra la liberación sostenida in vitro de G-CSF desde vehículos de gel retardado. Se ejemplificaron tanto materiales "colados" como "extruidos". G-CSF en agua a pH 3,4 se mezcló con alginato concentrado (10%) para formar una suspensión viscosa turbia. Esta mezcla se gelificó con CaCO_{3} y \delta-gluconolactona, a 16 mM y 79 mM, respectivamente. Antes de la gelificación, partes alícuotas del material bien se colaron en tubos o bien se aspiraron a jeringas. Después de 1 hora a temperatura ambiente, los geles se almacenaron a 4ºC (durante la noche). Antes de realizar el estudio de liberación, el gel de las jeringas se extruyó en tubos y se dejó endurecer durante 20 minutos. Se añadió a continuación tampón de liberación. El gel extruido exhibía liberación de GCSF durante un período de 3 días, es decir, 11% a la hora, 35% en un día, 75% a los dos días y \sim90% a los tres días. El gel colado liberaba 22% a la hora, 80% en 1 día y 94% a los dos días.

Ejemplo 9

Este Ejemplo demuestra la liberación sostenida in vitro de leptina desde un gel retardado de alginato preparado a partir de sal cálcica (CaSO_{4}) sin la adición de un donante de protones. Leptina no tamponada a pH 8 se usó para formar una suspensión de zinc-leptina en alginato al 2%. Las concentraciones finales de ZnCl_{2} y leptina eran 1 mM y 55 mg/ml, respectivamente. Un polvo fino de CaSO_{4} se mezcló con la suspensión de zinc-leptina-alginato de modo que la mezcla final fuera 10 mM en CaSO_{4}. Partes alícuotas del material se colaron sobre las paredes de tubos de Eppendorf. La mezcla se gelificó en 4-5 minutos.

Después del almacenamiento durante la noche a temperatura ambiente, se efectuó un estudio de liberación. La liberación de proteína del gel exhibía una descarga instantánea baja (\leq 5%) en 1 hora. En un día se liberaba 11% de la leptina. La liberación de leptina era gradual, 1,1% al día, durante los siete días siguientes.

Ejemplo 10

Este Ejemplo demuestra la liberación sostenida in vitro de leptina desde un gel retardado de alginato preparado a partir de una sal cálcica en un disolvente no acuoso sin la adición de un donante de protones. Un polvo liofilizado de leptina se suspende en alginato al 2% en dimetilsulfóxido seco. Un polvo fino de oleato cálcico se mezcla con la suspensión de alginato-leptina de modo que la mezcla final sea 10 mM en calcio. Partes alícuotas del material se cuelan sobre las paredes de tubos de ensayo. La mezcla se gelifica a lo largo del tiempo.

Después del almacenamiento nocturno a temperatura, se efectúa un estudio de liberación. La liberación de proteína del gel es gradual y sostenida, durante los 7 días siguientes.

Ejemplo 11

Este Ejemplo demuestra la liberación sostenida in vivo de leptina de un gel de alginato preparado a partir de una sal cálcica como se describe en el Ejemplo 10. Se realiza un estudio de pérdida de peso en ratones después de una sola inyección de este gel que contiene leptina a 250 mg/kg. La pérdida de peso se mide durante varios días.

Ejemplo 12

Este Ejemplo demuestra la liberación sostenida in vitro de G-CSF de un gel retardado de alginato preparado a partir de una sal cálcica en un disolvente no acuoso sin la adición de un donante de protones. Un polvo liofilizado de G-CSF se suspende en alginato al 2% en dimetilsulfóxido seco. Un polvo fino de oleato cálcico se mezcla con la suspensión de alginato-G-CSF de modo que la mezcla final sea 10 mM en calcio. Partes alícuotas del material se cuelan sobre las paredes de tubos de ensayo. La mezcla gelifica a lo largo del tiempo.

Después del almacenamiento nocturno a temperatura ambiente, se efectúa un estudio de liberación. La liberación de proteína es gradual y sostenida.

Ejemplo 13

Este Ejemplo muestra la liberación sostenida in vitro de interferón de consenso, según se describe en la Patente de EE.UU. Nº 4.695.623, anteriormente, desde geles retardados de alginato. Agua, ZnCl_{2}, tampón de Tris e interferón de consenso (en Tris 10 mM, pH 7,5) se mezclaron con solución de alginato, a continuación se mezclaron con CaCO_{3} y \delta-gluconolactona, de modo que las concentraciones finales de los componentes fueran 1 mg/ml de interferón de consenso, ZnCl_{2} 10 mM, 1% de alginato, Tris 20 mM, CaCO_{3} 10 mM y \delta-gluconolactona 40 mM. La mezcla se coló sobre un tubo de Eppendorf (0,4 ml por tubo), se gelificó a temperatura ambiente y se almacenó durante la noche a 4ºC. Después del almacenamiento nocturno se efectuó una liberación in vitro en tampón de histidina 10 mM, pH 7,4. El gel colado exhibía poca descarga instantánea inicial - el porcentaje de liberación era 3% en 1 hora, 14% en un día. En 4 días se había liberado 70%. A los 5-6 días, la velocidad de liberación se frenaba hasta <5% al día.

Ejemplo 14

Este Ejemplo muestra que pueden usarse geles retardados de alginato para la liberación sostenida de interferón de consenso. Se preparó un gel retardado de alginato-interferón de consenso de acuerdo con el Ejemplo 13, excepto que las concentraciones finales eran como sigue: 0,2 mg/ml de interferón de consenso, ZnCl_{2} 10 mM, 2% de alginato, Tris 20 mM, CaCO_{3} 10 mM y \delta-gluconolactona 40 mM. Se preparó otra formulación con la misma composición, excepto que la concentración final de interferón de consenso era 1 mg/ml. Las mezclas se aspiraron a jeringas y se gelificaron durante 2 horas. La formulación de 0,2 mg/ml se inyectó subcutáneamente a 1 mg/kg y la formulación de 1 mg/ml en dosis de 1 mg/kg y 5 mg/kg en hámsteres sirios macho. Se recogió sangre mediante punción cardíaca y se ensayó con respecto al interferón de consenso para observar la liberación sostenida del fármaco.

Claims (21)

1. Una formulación farmacéutica de una composición de gel de liberación sostenida que comprende:

a) alginato;

b) un agente biológicamente activo; y

c) al menos un ion metálico polivalente unido, en la que el gel se forma de una manera retardada en el tiempo, en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

2. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición de liberación sostenida comprende además:

d) al menos un donante de protones capaz de generar un ácido a través de hidrólisis, escasa solubilidad o disolución lenta, con lo que se libera el ion metálico polivalente unido.

3. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el donante de protones se selecciona de tampones, ésteres, ácidos escasamente solubles, ácidos que se disuelven lentamente o lactonas.

4. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el donante de protones es gluconolactona.

5. Una formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el ion metálico polivalente unido es una mezcla de ion metálico polivalente unido y no unido.

6. Una formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además un excipiente o excipientes para estabilizar el agente biológicamente activo o el alginato.

7. Una formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el ion metálico polivalente unido es una sal seleccionada de fosfatos, tartratos, sulfatos, carbonatos, hidróxidos o sus aniones de ácido graso.

8. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el ion metálico se selecciona de manganeso, estroncio, hierro, magnesio, calcio, bario, cobre, aluminio o zinc.

9. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el ion metálico es calcio.

10. Una formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el alginato contiene al menos 30% de ácido gulurónico.

11. Una formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el agente biológicamente activo comprende una proteína.

12. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la proteína se selecciona de factores hematopoyéticos, factores estimulantes de colonias, factores antiobesidad, factores de crecimiento y factores antiinflamatorios.

13. Una formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 11 ó 12, en la que la proteína se selecciona de leptina, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-Ira, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferones, eritropoyetina, KGF, insulina y sus análogos o derivados.

14. Una formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el agente biológicamente activo es un agente biológicamente activo complejado.

15. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el agente biológicamente activo complejado es una proteína precipitada.

16. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la proteína precipitada es un precipitado de zinc-leptina.

17. Una formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la formulación está en una jeringa.

18. El uso de una composición de liberación sostenida de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 16, en un portador, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable para la fabricación de un medicamento para tratar una indicación.

19. Un uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la indicación es un trastorno seleccionado de exceso de peso, diabetes, alto nivel de lípidos en sangre, esclerosis arterial, placa arterial, la reducción o prevención de la formación de piedras vesiculares, masa de tejido magro insuficiente, sensibilidad insuficiente a insulina, y apoplejía.

20. Un uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la indicación es un trastorno seleccionado de deficiencias de células hematopoyéticas, infección y neutropenia.

21. Un uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la indicación es inflamación.