ES2254833T3 - Formula de vacuna polinucleotida, preferentemente para el tratamiento de enfermedades respiratoiras en bovinos. - Google Patents

Formula de vacuna polinucleotida, preferentemente para el tratamiento de enfermedades respiratoiras en bovinos.

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ES2254833T3
ES2254833T3 ES03016996T ES03016996T ES2254833T3 ES 2254833 T3 ES2254833 T3 ES 2254833T3 ES 03016996 T ES03016996 T ES 03016996T ES 03016996 T ES03016996 T ES 03016996T ES 2254833 T3 ES2254833 T3 ES 2254833T3
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Abstract

Vacuna bovina que comprende un plásmido que contiene un gen del virus de la parainfluenza de tipo 3 (PI-3) gen elegido del grupo consistente en HN y F, y un excipiente apropiado. La presente invención tiene como objeto una fórmula de vacuna principalmente contra la patología respiratoria de los bovinos, que comprende al menos tres valencias de vacuna polinucleótida, cada una de las cuales comprende un plásmido que integra, con el fin de expresarlo in vivo en las células huésped, un gen de una valencia de patógeno respiratorio bovino, estando elegidas esas valencias del grupo consistente en virus del herpes bovino, virus respiratorio sincitial bovino, virus de la enfermedad de las mucosas y virus de la parainfluenza de tipo 3, comprendiendo los plásmidos, para cada valencia, uno o varios de los genes elegidos de entre el grupo consistente en gB y gD para el virus del herpes bovino, F y G para el virus respiratorio sincitial bovino, E2, C + E1 + E2 y E1 + E2 para el virus de la enfermedad delas mucosas, HN y F para el virus de la parainfluenza de tipo 3.

Description

Fórmula de vacuna polinucleótida, preferiblemente para el tratamiento de enfermedades respiratorias en bovinos.
La presente invención se refiere a una fórmula de vacuna que permite la vacunación de los bovinos, principalmente contra la patología respiratoria. Se refiere asimismo a un procedimiento correspondiente de vacunación.
Todos los bovinos son portadores de virus y bacterias potencialmente patógenos en grados muy variables.
Los virus pueden multiplicarse cuando está debilitada la inmunidad específica y cuando hay lesiones de las vías respiratorias. Son excretados inmediatamente por el animal, y entonces pueden contaminar a otros animales.
De entre los virus que se encuentran se pueden citar principalmente el virus de la parainfluenza de tipo 3 (PI-3), de patogenicidad propia moderada, el virus respiratorio sincitial bovino (RSV) y el virus del herpes bovino (BHV), llamado también virus de la rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR), de elevadas patogenicidades propias.
Otro virus particularmente importante por su función inmunodepresora y sus efectos nefastos sobre la reproducción es el virus de la enfermedad de las mucosas o pestivirus bovino (BVDV).
Estos virus se manifiestan por lo general con una fase primaria de hipertermia, de síndrome gripal y de trastornos respiratorios, con trastornos digestivos (diarreas) en el caso de BDV. Esta fase puede estar acompañada por una fase secundaria con la aparición de bronconeumonías asociadas a infecciones bacterianas, en particular de Pasteurella, que pueden ocasionar la muerte. Agravan en particular este fenómeno la inmunodepresión que es consecuencia de la infección por BVD o la infección de los macrófagos por PI-3. Pueden presentarse también otros síntomas, como abortos con BVD y BVH.
Parece necesario, por consiguiente, intentar poner a punto una prevención eficaz contra los principales virus que intervienen en la patología respiratoria de los bovinos.
En el pasado se han propuesto ya asociaciones de vacunas contra ciertos virus responsables de la patología respiratoria de los bovinos.
Las asociaciones desarrolladas hasta el momento estaban hechas a partir de vacunas inactivadas o de vacunas vivas y, eventualmente, de mezclas de esas vacunas. Su puesta en práctica plantea problemas de compatibilidad entre valencias y de estabilidad. Es necesario, efectivamente, asegurar a la vez la compatibilidad entre las diferentes valencias de vacuna, tanto si es en el plano de los diferentes antígenos utilizados como si es en el plano de las formulaciones mismas, sobre todo en el caso de que se combinen al mismo tiempo vacunas inactivadas y vacunas vivas. Se plantea asimismo el problema de la conservación de las vacunas combinadas de ese tipo, y también el de su inocuidad, principalmente en presencia de adyuvante. Estas vacunas son por lo general bastante costosas.
Las solicitudes de patente WO-A-9011092, WO-A-9319183, WO-A-9421797 Y WO-A-9520660 han empleado la técnica recientemente desarrollada de las vacunas polinucleótidas. Se sabe que estas vacunas utilizan un plásmido apto para expresar en las células del huésped el antígeno insertado en ese plásmido. Se han propuesto todas las vías de administración (intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, transcutánea, intradérmica, mucosa, etc.). Se pueden utilizar asimismo diferentes medios de vacunación, como por ejemplo recubrir con ADN la superficie de partículas de oro y proyectarlas de tal manera que penetren en la piel del animal (Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992), así como los inyectores por chorro de líquido, que permiten transfectar al mismo tiempo en la piel, el músculo, los tejidos grasos y los tejidos mamarios (Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992).
Las vacunas polinucleótidas pueden utilizar tanto ADNs desnudos como ADNs formulados, por ejemplo, en el seno de liposomas o de lípidos catiónicos.
G.J.M: COX ha propuesto ya la vacunación polinucleótida contra el herpes virus bovino de tipo 1 en J. of Virology, Volumen 67, núm. 9, septiembre 1993, 5664-5667. Los autores han descrito principalmente plásmidos que integran los genes gI (gB), gIII (gC) y gIV (gD).
En Vaccine, Volumen 13, núm. 4, 415-421, 1995, J.E. CROWE presenta una revisión general de los diferentes procedimientos de vacunación contra el virus respiratorio sincitial y contra el virus de la parainfluenza de tipo 3. Esta revisión recoge el conjunto de las posibilidades ofrecidas por las técnicas actuales de vacunación y sugiere simplemente que la tecnología de la inmunización polinucleótida podría ser útil en la estrategia de inmunización contra RSV y PI-3. En ese documento no se describe ninguna construcción de plásmido ni ningún resultado de vacunación de los bovinos contra esos virus.
La invención se propone, en consecuencia, proporcionar una fórmula de vacuna polivalente que permita garantizar una vacunación contra un cierto número de virus patógenos que intervengan principalmente en la patología respiratoria de los bovinos, y asegurar de esta manera una vacunación eficaz contra esa patología.
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Otro objetivo de la invención es el de proporcionar una fórmula de vacuna de ese tipo asociando diferentes valencias de manera que presente todos los criterios requeridos de compatibilidad y de estabilidad de las valencias entre
ellas.
Otro objetivo de la invención es el de proporcionar una fórmula de vacuna de ese tipo que permita asociar diferentes valencias en un mismo excipiente.
Otro objetivo de la invención es el de proporcionar una vacuna de ese tipo cuya puesta en práctica resulte sencilla y poco costosa.
Otro objetivo más de la invención es el de proporcionar una fórmula de vacuna de ese tipo y un procedimiento de vacunación de los bovinos que permitan obtener una protección multivalente con un elevado nivel de eficacia y de larga duración, así como una buena inocuidad y una ausencia de residuos.
La presente invención, por consiguiente, tiene como objeto una fórmula de vacuna principalmente contra la patología respiratoria de los bovinos, que comprende al menos tres valencias de vacuna polinucleótida, cada una de las cuales comprende un plásmido que integra, con el fin de expresarlo in vivo en las células huésped, un gen de una valencia de patógeno respiratorio bovino, estando elegidas esas valencias del grupo consistente en virus del herpes bovino, virus respiratorio sincitial bovino, virus de la enfermedad de las mucosas y virus de la parainfluenza de tipo 3, comprendiendo los plásmidos, para cada valencia, uno o varios de los genes elegidos de entre el grupo consistente en gB y gD para el virus del herpes bovino, F y G para el virus respiratorio sincitial bovino, E2, C + E1 + E2 y E1 + E2 para el virus de la enfermedad de las mucosas, HN y F para el virus de la parainfluenza de tipo 3.
En la presente invención se entiende por valencia al menos un antígeno que asegure una protección contra el virus del patógeno considerado, pudiendo contener la valencia, a título de subvalencia, uno o varios genes naturales o modificados de una o varias cepas del patógeno considerado.
Por gen de agente patógeno se entiende, no sólo en gen completo, sino también las secuencias nucleótidas diferentes, incluidos fragmentos, que conservan la capacidad de inducir una respuesta protectora. La noción de gen abarca las secuencias nucleótidas equivalentes a las descritas con precisión en los ejemplos, es decir, las secuencias diferentes pero que codifican la misma proteína. Abarca también las secuencias nucleótidas de otras cepas del patógeno considerado que aseguran una protección cruzada o una protección específica de cepa o de grupo de cepas. Abarca además las secuencias nucleótidas que han sido modificadas para facilitar la expresión in vivo por el animal huésped, pero codificando la misma proteína.
Preferentemente la fórmula de vacuna según la invención comprende las cuatro valencias.
En lo que respecta a la valencia BHV, es preferible emplear los dos genes que codifican gB y gD, en plásmidos diferentes o en un solo y mismo plásmido. Eventualmente, pero menos preferiblemente, se puede utilizar uno u otro de esos genes.
Para la valencia RSV se utilizan preferentemente los dos genes G y F integrados en dos plásmidos diferentes o en un solo y mismo plásmido. Eventualmente, pero menos preferentemente, se puede utilizar el gen F solo.
Para la valencia BVD se preferirá utilizar un plásmido que integre el gen E2. Eventualmente, pero menos preferiblemente, se puede utilizar un plásmido que codifique E1 y E2 juntos, o el conjunto constituido por C, E1 y E2.
Para la valencia PI-3 se prefiere utilizar el conjunto de los dos genes HN y F en dos plásmidos diferentes o en un solo y mismo plásmido. También es posible utilizar únicamente el gen HN.
Una fórmula de vacuna preferida según la invención comprende y garantiza la expresión de los genes gB y gD de BHV, G y F de RSV, E2 de BVD y HN y F de PI-3.
La fórmula de vacuna según la invención se podrá presentar con un volumen de dosis comprendido entre 0,1 y 10 ml y en particular entre 1 y 5 ml.
Por lo general la dosis estará comprendida entre 10 ng y 1 mg, preferentemente entre 100 ng y 500 \mug, y aún más preferiblemente entre 1 \mug y 250 \mug por tipo de plásmido.
Se utilizarán preferentemente plásmidos desnudos, colocados simplemente en el excipiente de vacunación, que por lo general será agua fisiológica (NaCl 0,9%), agua ultrapura, tampón TE, etc. Se pueden utilizar, por supuesto, todas las formas de vacuna polinucleótida descritas en la técnica anterior.
Cada plásmido comprende un promotor apto para garantizar la expresión del gen insertado bajo su dependencia en las células huésped. Se tratará por lo general de un promotor eucariota fuerte, y en particular de un promotor temprano del citomegalovirus CMV-IE, de origen humano o murino, o también eventualmente de otro origen, como por ejemplo la rata, el cerdo, la cobaya.
De manera más general, el promotor podrá ser, bien de origen viral, bien de origen celular. Como promotor viral distinto de CMV-IE se puede citar el promotor temprano o tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Puede tratarse también de un promotor del virus del que proviene el gen, por ejemplo el promotor propio del gen.
Como promotor celular se puede citar el promotor de un gen del citoesqueleto, como por ejemplo el promotor de la desmina (Bolmont et al., Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1990, 22, 117-122; y ZHENLIN et al., Gene, 1989, 78, 243-254), o también el promotor de la actina.
Cuando se encuentran presentes varios genes en el mismo plásmido, pueden presentarse en la misma unidad de transcripción o en dos unidades diferentes.
La combinación de las diferentes valencias de la vacuna según la invención se puede llevar a cabo preferentemente por mezcla de plásmidos polinucleótidos que expresan el o los antígenos de cada valencia, pero se puede prever asimismo el hecho de hacer expresar a un mismo plásmido antígenos de varias valencias.
La invención tiene además por objeto fórmulas de vacuna monovalente que comprenden uno o varios plásmidos que codifican uno o varios genes de uno de los virus elegidos de entre el grupo consistente en BRSV, BVD y PI-3, siendo los genes los que se han descrito antes. Aparte de su carácter monovalente, estas fórmulas pueden recoger las características antes enunciadas en lo que respecta a la elección de los genes, sus combinaciones, la composición de los plásmidos, los volúmenes de dosis, las dosis, etc.
Las fórmulas de vacuna monovalente se pueden utilizar (i) para la preparación de una fórmula de vacuna polivalente como la que se ha descrito antes, (ii) a título individual contra la patología propia, (iii) asociadas a una vacuna de otro tipo (completa, viva o inactivada, recombinante, subunidad) contra otra patología, o (iv) como refuerzo de una vacuna, tal como se describe a continuación.
En efecto, la presente invención tiene como objeto además la utilización de uno o de varios plásmidos según la invención para la fabricación de una vacuna destinada a vacunar los bovinos primo vacunados por medio de una primera vacuna clásica del tipo de las de la técnica anterior, elegida principalmente del grupo consistente en vacuna completa viva, vacuna completa inactivada, vacuna de subunidad, vacuna recombinante, presentando esta primera vacuna, es decir, conteniendo o pudiendo expresar, el o los antígenos codificado(s) por el o los plásmidos o antígeno(s)
que aseguran una protección cruzada.
De manera notable, la vacuna polinucleótida tiene un efecto de refuerzo que se puede traducir en una amplificación de la respuesta inmunitaria y la instauración de una inmunidad de larga duración.
De manera general, se podrán elegir las vacunas de primo vacunación de entre las vacunas comerciales disponibles en los diferentes productores de vacunas veterinarias.
La invención tiene como objeto también un kit de vacunación que reúne una vacuna de primo vacunación como la que se ha descrito antes y una fórmula de vacuna según la invención para el refuerzo. Se refiere también a una fórmula de vacuna según la invención acompañada de una nota que indica el uso de esa fórmula como refuerzo de una primo vacunación como la que se ha descrito antes.
La presente invención tiene asimismo como objeto un procedimiento de vacunación de los bovinos contra la patología respiratoria, que comprende la administración de la fórmula de vacuna eficaz tal como se ha descrito antes. Este procedimiento de vacunación comprende la administración de una o de varias dosis de fórmula de vacuna, pudiendo ser administradas esas dosis sucesivamente en un breve lapso de tiempo y/o sucesivamente en momentos alejados entre sí.
En el marco de este procedimiento de vacunación se podrán administrar las fórmulas de vacuna según la invención a través de las diferentes vías de administración propuestas en la técnica anterior para la vacunación polinucleótida y por medio de las técnicas de administración conocidas.
La invención tiene además como objeto el procedimiento de vacunación que consiste en efectuar una primo vacunación como la descrita antes y un refuerzo con una fórmula de vacuna según la invención.
En una forma de puesta en práctica preferida del procedimiento según la invención, se le administra al animal en un primer momento una dosis eficaz de la vacuna de tipo clásico, principalmente inactivada, viva, atenuada o recombinante, o también una vacuna de subunidad con el fin de garantizar una primo vacunación y, preferentemente en un plazo de 2 a 6 semanas, se garantiza la administración de la vacuna polivalente o monovalente según la invención.
La invención se refiere asimismo al procedimiento de preparación de las fórmulas de vacuna, a saber, la preparación de las valencias y de sus mezclas, tal como se deduce de esta descripción.
Se describirá ahora la invención de manera más detallada con ayuda de modos de realización de la invención con referencia a los dibujos anexos.
Lista de las figuras
Figura núm. 1:
Plásmido pVR1012
Figura núm. 2:
Secuencia del gen BHV-1 ST gB
Figura núm. 3:
Construcción del plásmido pPB156
Figura núm. 4:
Plásmido pAB087
Figura núm. 5:
Plásmido pAB011
Figura núm. 6:
Plásmido pAB012
Figura núm. 7:
Plásmido pAB058
Figura núm. 8:
Plásmido pAB059
Figura núm. 9:
Plásmido pAB060
Figura núm. 10:
Plásmido pAB071
Figura núm. 11:
Plásmido pAB072
Lista de las secuencias SEQ ID Nº
SEQ ID Nº 1:
Secuencia del gen BHV-1 gB (cepa ST)
SEQ ID Nº 2:
Oligonucleótido PB234
SEQ ID Nº 3:
Oligonucleótido PB235
SEQ ID Nº 4:
Oligonucleótido AB162
SEQ ID Nº 5:
Oligonucleótido AB163
SEQ ID Nº 6:
Oligonucleótido AB026
SEQ ID Nº 7:
Oligonucleótido AB027
SEQ ID Nº 8:
Oligonucleótido AB028
SEQ ID Nº 9:
Oligonucleótido AB029
SEQ ID Nº 10:
Oligonucleótido AB110
SEQ ID Nº 11:
Oligonucleótido AB111
SEQ ID Nº 12:
Oligonucleótido AB114
SEQ ID Nº 13:
Oligonucleótido AB115
SEQ ID Nº 14:
Oligonucleótido AB116
SEQ ID Nº 15:
Oligonucleótido AB117
SEQ ID Nº 16:
Oligonucleótido AB130
SEQ ID Nº 17:
Oligonucleótido AB131
SEQ ID Nº 18:
Oligonucleótido AB132
SEQ ID Nº 19:
Oligonucleótido AB133
\newpage
Ejemplos
Ejemplo 1
Cultivo de los virus
Los virus se cultivan en el sistema celular apropiado hasta obtener un efecto citopático. El especialista en la materia conoce bien los sistemas celulares a utilizar para cada virus. De manera breve, se inoculan con la cepa viral que se estudia, utilizando una multiplicidad de infección de 1, células sensibles al virus utilizado que han sido cultivadas en medio mínimo esencial de Eagle (medio MEM) u otro medio apropiado. Las células infectadas se incuban entonces a 37ºC durante el tiempo necesario para que aparezca un efecto citopático completo (por término medio 36 horas).
Ejemplo 2
Extracción de los ADNs genómicos virales
Después del cultivo, se recoge el sobrenadante y las células lisadas, y se centrifuga la totalidad de la suspensión viral a 1000 g durante 10 minutos a +4ºC para eliminar los restos celulares. Se recogen entonces las partículas virales por ultracentrifugación a 400000 g durante 1 hora a +4ºC. Se recoge el sedimento en un volumen mínimo de tampón (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Se trata esta suspensión viral concentrada con la proteinasa K (100 \mug/ml final) en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS) (0,5% final) durante 2 horas a 37ºC. Se extrae a continuación el ADN viral con una mezcla de fenol/cloroformo, y después se precipita con 2 volúmenes de etanol absoluto. Después de una noche a -20ºC, se centrifuga el ADN a 10000 g durante 15 minutos a +4ºC. Se seca el sedimento de ADN, y después se recoge en un volumen mínimo de agua ultrapura estéril. Entonces puede ser digerido por enzimas de restricción.
Ejemplo 3
Aislamiento de los ARNs genómicos virales
Se purificaron los virus de ARN según las técnicas bien conocidas por el especialista en la materia. Se aisló a continuación el ARN viral genómico de cada virus utilizando la técnica de extracción "tiocianato de guanidina y fenol-cloroformo" descrita por P. Chomczynski y N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987. 162. 156-159).
Ejemplo 4
Técnicas de biología molecular
Todas las construcciones de plásmidos se han realizado utilizando las técnicas estándar de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Todos los fragmentos de restricción utilizados para la presente invención han sido aislados utilizando el kit "Geneclean" (BIO101 Inc. La Jolla, CA).
Ejemplo 5
Técnica de RT-PCR
Se han sintetizado oligonucleótidos específicos (que comprenden en sus extremos 5' sitios de restricción para facilitar la clonación de los fragmentos amplificados) de tal manera que cubran por entero las regiones codificantes de los genes que se han de amplificar (ver ejemplos específicos). La reacción de transcripción inversa (RT) y la amplificación en cadena por polimerasa (PCR) se llevaron a cabo según las técnicas estándar (J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Cada reacción de RT-PCR se hizo con un par de amplímeros específicos y tomando como matriz el ARN genómico viral extraído. Se extrajo al fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) el ADN complementario amplificado antes de ser digerido por las enzimas de restricción.
Ejemplo 6
Plásmido pVR1012
El plásmido pVR1012 (figura núm. 1) se obtuvo en Vical Inc. San Diego, CA, USA. Se encuentra descrita su construcción en J. Hartikka et al. (Human Gene Therapy. 1996. 7. 1205-1217).
Ejemplo 7
Construcción del plásmido pPB156 (gen BHV-1 gB)
El ADN genómico del herpes virus bovino BHV-1 (cepa ST) (Leung-Tack P. Et al. Virology. 1994. 199. 409-421) se preparó según la técnica descrita en el ejemplo 2 y fue digerido por BamHI. Tras la purificación, se clonó el fragmento BamHI-BamHI de 18 kpb en el vector pBR322, previamente digerido por BamHI, para dar el plásmido pIBR-4-BamHI (22 kpb).
A continuación se digirió el plásmido pIBR-4-BamHI por Sall para liberar un fragmento Sall-Sall de 6,6 kpb que contenía el gen que codifica la glicoproteína gB del BVH-1 (figura núm. 2 y SEQ ID Nº 1). Se clonó este fragmento en el vector pBR322, previamente digerido por Sall, para dar el plásmido pIBR-6,6-Sall (10,9 kpb).
El plásmido pIBR-6,6-Sall fue digerido por NheI y BgIII para liberar un fragmento NheI-BgIII de 2676 pb que contenía el gen que codifica la glicoproteína gB del herpes virus bovino (BHV-1) (fragmento A).
Se llevó a cabo una reacción de PCR con el ADN genómico del herpes virus bovino (BHV-1) (cepa ST) y con los siguientes oligonucleótidos:
PB234 (30 mer) (SEQ ID Nº 2)
5' TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG 3'
PB235 (21 mer) (SEQ ID Nº 3)
5' GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG 3'
para aislar la parte 5' del gen que codifica la glicoproteína gB del BHV-1.
Tras la purificación se digirió por Sall y NheI el producto de PCR de 153 pb para aislar un fragmento Sall-NheI de 145 pb (fragmento B).
Los fragmentos A y B fueron ligados juntos con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con Sall y BamHI, para dar el plásmido pPB158 (7691 pb) (figura núm. 3).
Ejemplo 8
Construcción del plásmido pAB087 (gen BHV-1 gD)
Se llevó a cabo una reacción de PCR con el ADN genómico del herpes virus bovino (BHV-1) (cepa ST) (P. Leung-Tack et al. Virology, 1994. 199. 409-421), preparado según la técnica descrita en el ejemplo 2 y con los siguientes oligonucleótidos:
AB162 (31 mer) (SEQ ID Nº 4)
5' AAACTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCG 3'
AB163 (27 mer) (SEQ ID Nº 5)
5' ATCTTGTACCATATGACCGTGGCGTTG 3'
para amplificar la parte 5' del gen que codifica la glicoproteína gD del herpes virus bovino (BHV-1) (núm. de acceso de la secuencia en GenBank = L26360) bajo la forma de un fragmento PCR de 338 pb. Tras la purificación, este fragmento fue digerido por PstI y NdeI para aislar un fragmento PstI-NdeI de 317 pb (fragmento A).
El plásmido pBHV001 (P. Leung-Tack et al. Virology. 1994. 199. 409-421) fue digerido por NdeI y StyI para liberar un fragmento de 942 pb que contenía la parte 3' del gen que codifica la glicoproteína gD del BHV-1 (fragmento B).
Los fragmentos A y B fueron ligados juntos con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con PstI y XbaI, para dar el plásmido pAB087 (6134 pb) (figura núm. 4).
Ejemplo 9
Construcción del plásmido pAB011 (gen BRSV F)
Se llevó a cabo una reacción RT-PCR, según la técnica descrita en el ejemplo 5, con el ARN genómico del virus respiratorio sincitial bovino (BRSV) (cepa 391-2) (R. Lerch et al. Virology. 1991. 181. 118-131), preparado tal como se indica en el ejemplo 3, y con los siguientes oligonucleótidos:
AB026 (33 mer) (SEQ ID Nº 6)
5' AAAACTGCAGGGATGGCGGCAACAGCCATGAGG 3'
AB027 (31 mer) (SEQ ID Nº 7)
5' CGCGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTG 3'
para aislar el gen que codifica la glicoproteína de fusión F (BRSV F) bajo la forma de un fragmento PCR de 1734 pb. Tras la purificación, este fragmento fue digerido por PstI y BamHI para aislar un fragmento PstI-BamHI de 1717 pb. Se ligó este fragmento con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con PstI y BamHI, para dar el plásmido pAB011 (6587 pb) (figura núm. 5).
Ejemplo 10
Construcción del plásmido pAB012 (gen BRSV G)
Se llevó a cabo una reacción RT-PCR, según la técnica descrita en el ejemplo 5, con el ARN genómico del virus respiratorio sincitial bovino (BRSV) (cepa 391-2) (R. Lerch et al. Virology. 1990. 64. 5559-5569), con los siguientes oligonucleótidos:
AB028 (32 mer) (SEQ ID Nº 8)
5' AAAACTGCAGATGTCCAACCATACCCATCATC 3'
AB029 (35 mer) (SEQ ID Nº 9)
5' CGCGGATCCCTAGATCTGTGTAGTTGATTGATTTG 3'
para aislar el gen que codifica la proteína G (BRSV G) bajo la forma de un fragmento PCR de 780 pb. Tras la purificación, este fragmento fue digerido por PstI y BamHI para aislar un fragmento PstI-BamHI de 763 pb. Se ligó este fragmento con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con PstI y BamHI, para dar el plásmido pAB012 (5634 pb) (figura núm. 6).
Ejemplo 11
Construcción del plásmido pAB058 (gen BVDV C)
Se llevó a cabo una reacción RT-PCR, según la técnica descrita en el ejemplo 5, con el ARN genómico del virus de la diarrea viral bovina (BVDV) (cepa Osloss) (L. De Moerlooze et al. J. Gen. Virol. 1993. 74. 1433-1438), preparado según la técnica descrita en el ejemplo 3 y con los siguientes oligonucleótidos:
AB110 (35 mer) (SEQ ID Nº 10)
5' AAAACTGCAGATGTCCGACACAAAAAGCAGAAGGGG 3'
AB111 (47 mer) (SEQ ID Nº 11)
5' CGCGGATCCTCAATAAAAATCATTCCCACTGCGACTTGAAACAAAAC 3'
para amplificar un fragmento de 342 pb que contenía el gen que codifica la proteína de cápside C del virus BVDV. Tras la purificación, el producto de RT-PCR fue digerido por PstI y BamHI para dar un fragmento PstI-BamHI de 324 pb. Se ligó este fragmento con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con PstI y BamHI, para dar el plásmido pAB058 (5183 pb) (figura núm. 7).
Ejemplo 12
Construcción del plásmido pAB059 ("gen" BVDV E1)
Se llevó a cabo una reacción RT-PCR, según la técnica descrita en el ejemplo 5, con el ARN genómico del virus de la diarrea viral bovina (BVDV) (cepa Osloss) (L. De Moerlooze et al. J. Gen. Virol. 1993. 74. 1433-1438), con los siguientes oligonucleótidos:
AB114 (32 mer) (SEQ ID Nº 12)
5' ACGCGTCGACATGAAGAAACTAGAGAAAGCCC 3'
AB115 (33 mer) (SEQ ID Nº 13)
5' CGCGGATCCTCAGCCGGGTTTGCAAACTGGGAG 3'
\newpage
para aislar la secuencia que codifica la proteína E1 del virus BVDV bajo la forma de un fragmento PCR de 1381 pb. Tras la purificación, este fragmento fue digerido por Sall y BamHI para dar un fragmento Sall-BamHI de 1367 pb.
Se ligó este fragmento con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con Sall y BamHI, para dar el plásmido pAB059 (6236 pb) (figura núm. 8).
Ejemplo 13
Construcción del plásmido pAB0660 ("gen" BVDV E2)
Se llevó a cabo una reacción RT-PCR, según la técnica descrita en el ejemplo 5, con el ARN genómico del virus de la diarrea viral bovina (BVDV) (cepa Osloss) (L. De Moerlooze et al. J. Gen. Virol. 1993. 74. 1433-1438), con los siguientes oligonucleótidos:
AB116 (36 mer) (SEQ ID Nº 14)
5' ACGCGTCGACATGACGACTACTGCATTCCTGGTATG 3'
AB117 (33 mer) (SEQ ID Nº 15)
5' CGCGGATCCTCATTGACGTCCCGAGGTCATTTG 3'
para aislar la secuencia que codifica la proteína E2 del virus BVDV bajo la forma de un fragmento PCR de 1252 pb. Tras la purificación, este fragmento fue digerido por Sall y BamHI para dar un fragmento Sall-BamHI de 1238 pb.
Se ligó este fragmento con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con Sall y BamHI, para dar el plásmido pAB060 (6107 pb) (figura núm. 9).
Ejemplo 14
Construcción del plásmido pAB071 (gen BPIV HN)
Se llevó a cabo una reacción RT-PCR, según la técnica descrita en el ejemplo 5, con el ARN genómico del virus de la parainfluenza bovina de tipo 3 (P13 = BPIV), con los siguientes oligonucleótidos:
AB130 (33 mer) (SEQ ID Nº 16)
5' TTTGTCGACATGGAATATTGGAAACACACAAAC 3'
AB131 (33 mer) (SEQ ID Nº 17)
5' TTTGGATCCTTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTC 3'
para aislar el gen que codifica la glicoproteína HN del BPIV (secuencia del gen HN depositada por H. Shibuta en 1987. Núm. de acceso de la secuencia en GenBank = Y00115) bajo la forma de un fragmento PCR de 1737 pb. Tras la purificación, este fragmento fue digerido por Sall y BamHI para aislar un fragmento Sall-BamHI de 1725 pb. Se ligó este fragmento con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con Sall y BamHI, para dar el plásmido pAB071 (6593 pb) (figura núm. 10).
Ejemplo 15
Construcción del plásmido pAB072 (gen BPIV F)
Se llevó a cabo una reacción RT-PCR, según la técnica descrita en el ejemplo 5, con el ARN genómico del virus de la parainfluenza bovina de tipo 3 (P13 = BPIV), con los siguientes oligonucleótidos:
AB132 (30 mer) (SEQ ID Nº 18)
5' TTTGTCGACATGATCATCACAAACACAATC 3'
AB133 (30 mer) (SEQ ID Nº 19)
5' TTTGGATCCTCATTGTCTACTTGTTAGTAC 3'
para aislar el gen que codifica la proteína F del BPIV (secuencia del gen F depositada por H. Shibuta en 1987. Núm. de acceso de la secuencia en GenBank = Y00115) bajo la forma de un fragmento PCR de 1641 pb. Tras la purificación, este fragmento fue digerido por Sall y BamHI para aislar un fragmento Sall-BamHI de 1629 pb. Se ligó este fragmento con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con Sall y BamHI, para dar el plásmido pAB072 (6497 pb) (figura núm. 11).
Ejemplo 16
Preparación y purificación de los plásmidos
Para la preparación de los plásmidos destinados a la vacunación de los animales se puede utilizar cualquier técnica que permita obtener una suspensión de plásmidos purificados mayoritariamente en forma superenrollada. Estas técnicas son bien conocidas por el especialista en la materia. Se puede citar en particular la técnica de lisis alcalina seguida de dos ultracentrifugaciones sucesivas en gradiente de cloruro de cesio en presencia de bromuro de etidio, tal como se encuentra descrita en J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Se puede hacer referencia asimismo a las solicitudes de patente PCT WO 95/21250 y PCT WO 96/02658, que describen procedimientos para producir a escala industrial plásmidos utilizables para la vacunación. Para las necesidades de la fabricación de las vacunas (ver ejemplo 17), se resuspenden los plásmidos purificados con el fin de obtener soluciones de elevada concentración ( > 2 mg/ml) compatibles con el almacenamiento. Para hacerlo se resuspenden los plásmidos, bien en agua ultrapura, bien en tampón TE (Tris-HCL 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0).
Ejemplo 17
Fabricación de las vacunas asociadas
Los diversos plásmidos necesarios para la fabricación de una vacuna asociada se mezclan partiendo de sus soluciones concentradas (ejemplo 16). Las mezclas se llevan a cabo de tal manera que la concentración final de cada plásmido corresponda a la dosis eficaz de cada plásmido. Las soluciones que se pueden utilizar para ajustar la concentración final de la vacuna pueden ser, bien una solución de NaCl al 0,9%, bien tampón PBS.
Para la fabricación de las vacunas se pueden emplear asimismo formulaciones particulares como, por ejemplo, los liposomas y los lípidos catiónicos.
Ejemplo 18
Vacunación de los bovinos
Los bovinos se vacunan con dosis de 100 \mug, 250 \mug o 500 \mug por plásmido. Las inyecciones se llevan a cabo con la aguja por vía intramuscular, bien a la altura del músculo gluteus, bien a la altura de los músculos del cuello. Las dosis vacunales se administran en volúmenes comprendidos entre 1 y 5 ml.

Claims (13)

1. Vacuna bovina que comprende un plásmido que contiene un gen del virus de la parainfluenza de tipo 3 (PI-3), gen elegido del grupo consistente en HN y F, y un excipiente apropiado.
2. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el plásmido comprende los dos genes HN y F.
3. Vacuna según la reivindicación 1, que comprende un plásmido que contiene HN y un plásmido que contiene F.
4. Vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el plásmido comprende un promotor elegido del grupo consistente en promotor CMV-IE, promotor temprano SV40, promotor tardío SV40, promotor LTR del virus del sarcoma de Rous y promotor de un gen de citoesqueleto.
5. Vacuna según la reivindicación 4, en la que el promotor es un promotor CMV-IE.
6. Vacuna según la reivindicación 4, en la que el promotor de un gen de citoesqueleto es el promotor de la desmina o el promotor de la actina.
7. Vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por el hecho de que comprende además un plásmido que contiene y expresa un gen de otro patógeno respiratorio bovino.
8. Vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por el hecho de que comprende además dos plásmidos elegidos del grupo consistente en un plásmido que contenga el gen gB o gD del virus del herpes bovino, un plásmido que contenga el gen E2, C + E1 + E2 y E1 + E2 de la enfermedad de las mucosas y un plásmido que contenga el gen F o G del virus respiratorio sincitial bovino.
9. Vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada por el hecho de que comprende entre 10 ng y 1 mg, preferentemente entre 100 ng y 500 \mug, y aún más preferentemente entre 1 \mug y 250 \mug de cada plásmido.
10. Utilización de uno o de varios plásmidos como los descritos en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la fabricación de una vacuna contra el virus de la parainfluenza de tipo 3 (PI-3) destinada a vacunar bovinos primo vacunados por medio de una primera vacuna elegida del grupo consistente en vacuna completa viva, vacuna completa inactivada, vacuna de subunidad, vacuna recombinante, presentando esa primera vacuna el o los antígeno(s) codificado(s) por el o los plásmido(s) o antígeno(s) que garantiza(n) una protección cruzada.
11. Kit de vacunación que agrupa una vacuna polinucleótida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y una primera vacuna elegida del grupo consistente en vacuna completa viva, vacuna completa inactivada, vacuna de subunidad, vacuna recombinante, presentando esa primera vacuna el antígeno codificado por la vacuna polinucleótida o un antígeno que garantiza una protección cruzada, para una administración de esa primera vacuna en primo vacunación y para un refuerzo con la vacuna polinucleótida.
12. Vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, acompañada de una nota que indique que esa vacuna polinucleótida se puede utilizar como refuerzo de una primera vacuna elegida del grupo consistente en vacuna completa viva, vacuna completa inactivada, vacuna de subunidad, vacuna recombinante, presentando esa primera vacuna el antígeno codificado por la vacuna polinucleótida o un antígeno que garantiza una protección cruzada.
13. Utilización de un plásmido como el descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de una vacuna destinada a la vacunación de bovinos contra el virus PI-3, en asociación con una vacuna completa viva o inactivada, recombinante o de subunidad dirigida contra otra patología bovina.
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