ES2284183T3

ES2284183T3 - Proteina inmunotropica asociada a lactancia bovina (cd14), gen codificador y aplicacion en la activacion de celulas b.

Info

Publication number: ES2284183T3
Application number: ES97913053T
Authority: ES
Inventors: Michael H. Julius; Dominik Filipp; Kamel Alizadeh-Khiavi
Original assignee: Arthritis and Autoimmunity Research Centre Foundation AARC
Current assignee: Arthritis and Autoimmunity Research Centre Foundation AARC
Priority date: 1996-11-18
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2017-11-18
Also published as: EP1801216A2; EP0941322B1; US6093693A; ATE356205T1; DE69737456T2; HUP0001057A2; AU5045198A; BR9713096A; AU732476B2; IL129855A; DE69737456D1; WO1998022580A2; US6676985B1; JP4447058B2; WO1998022580A3; HUP0001057A3; CN1238010A; DK0941322T3; CA2272051A1; JP2001504695A

Abstract

SE HA IDENTIFICADO UNA NUEVA PROTEINA, PURIFICADA A PARTIR DEL LACTOSUERO DE CALOSTRO, ASI COMO SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS AISLADAS, QUE CODIFICAN ESTA PROTEINA. SE HA LLAMADO A ESTA PROTEINA BOVINA AISLADA, PROTEINA INMUNOTROPA BOVINA ASOCIADA A LA LACTANCIA (BO LAIT). SE DESCRIBE TAMBIEN EL HOMOLOGO HUMANO DE ESTA PROTEINA BO LAIT, LA PROTEINA HU - LAIT. SE DESCRIBE TAMBIEN UN PROCEDIMIENTO DE ACTIVACION DE LINFOCITOS B Y ESPECIALMENTE DE ACTIVACION DE LINFOCITOS B EN UN MAMIFERO, COMO POR EJEMPLO UN HOMBRE QUE NECESITA ESTE TIPO DE ACTIVACION, CONSISTIENDO ESTE PROCEDIMIENTO EN ADMINISTRAR ESTA PROTEINA LAIT. SE PUEDE INCORPORAR ESTA PROTEINA LAIT EN UNA FORMULA PARA RECIEN NACIDOS Y ADMINISTRARLA A UN RECIEN NACIDO, MEDIANTE LA APORTACION DE DICHA FORMULA EN SU ALIMENTACION. SE PUEDE TAMBIEN INCORPORAR ESTA PROTEINA LAIT A UNA VACUNA Y ADMINISTRARLA A UN PACIENTE QUE TIENE UN DEFICIT INMUNITARIO EN LINFOCITOS T, POR EJEMPLO, UN DESAJUSTE PARTICULAR DE LOS LINFOCITOS T EN EL CUAL GR39 (CD40L) SE SUBEXPRESA EN LA SUPERFICIE CELULAR DE LOS LINFOCITOS T DE ESTE PACIENTE O ESTA TOTALMENTE AUSENTE DE ESTA SUPERFICIE. ESTA INVENCION SE REFIERE FINALMENTE A LA PREPARACION DE MEDICAMENTOS QUE CONTIENEN ESTA PROTEINA LAIT, Y DESTINADOS A LA ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS B EN UN MAMIFERO QUE REQUIERE DICHA ACTIVACION. SE PUEDE UTILIZAR UNA PROTEINA LAIT NATURAL O RECOMBINADA.

Description

Proteína inmunotrópica asociada a lactancia bovina (CD14), gen codificador y aplicación en la activación de células B.

Campo de la invención

Esta invención, en los campos de inmunología, bioquímica y biología celular y molecular, se refiere a proteínas o proteínas que son modificadas co- y/o post-traduccionalmente, denominadas proteínas LAIT, que activan células B. La presente invención se dirige también al uso de tal proteína en preparaciones farmacéuticas, y composiciones farmacéuticas que comprenden proteína LAIT o derivados funcionales de la misma. La presente invención se dirige también a moléculas de ácidos nucleicos que codifican la proteína LAIT bovina o derivados funcionales de la misma y a procedimientos para la purificación de formas nativas y recombinantes de dichas proteínas que activan células B.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos "B" derivados de médula ósea, denominados comúnmente células B, son un tipo de glóbulos blancos presentes en la linfa, la sangre y en órganos linfoides secundarios del sistema inmunitario. Las células B son los precursores de células secretoras de anticuerpos, células plasmáticas, y como tales son básicas en la inducción de respuestas inmunitarias humorales.

La inducción de la mayoría de las respuestas inmunitarias humorales en el adulto implica una serie de interacciones celulares entre linfocitos T derivados del timo, comúnmente denominados células T, células presentadoras de antígenos (CPA) y células B [J. Exp. Med. 147:1159, 1978; PNAS 77:1612, 1982; PNAS 79:1989, 1982; Immunol. Rev. 95:914, 1987].

Según se entiende en la actualidad, la activación de células B dependiente de células T implica la activación de células T en su reconocimiento de antígeno, según se presenta por CPA en conjunción con proteínas codificadas dentro del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), que se expresan en la superficie celular de las CPA. Esta interacción de CPA de células T específica de antígeno y restringida en CMH da como resultado la activación recíproca de los dos tipos celulares y la alteración de fisiología de células T de manera que se hace manifiesta la "función auxiliar".

Las células T auxiliares pueden activar células B específicas de antígeno. La especificidad de antígeno de la interacción célula T-célula B se mantiene como consecuencia de la capacidad última de la célula B de actuar como una CPA. Así, en reposo, las células B inactivas no son CPA eficientes (PNAS 79:1989, 1982), interaccionan específicamente con antígeno a través de inmunoglobulina asociada a membrana, cuya especificidad refleja la de la inmunoglobulina que secretarán sus células hijas (J. Exp. Med. 140:904, 1974).

La internalización mediada por inmunoglobulina de antígeno por la célula B específica, que puede implicar presentación por otra clase más de CPA, la célula dendrítica folicular, tiene como resultado el inicio del procesamiento de antígeno por la célula B, la regulación por incremento de CMH Clase II y expresión B7, y la presentación de péptidos derivados de antígeno en el contexto de CMH (J. Exp. Med. 178:2055, 1993). La célula B activada por esta vía es una diana para la célula T auxiliar activada.

La función auxiliar de células T incluye señales suministradas a través de contacto con célula T-célula B, y la interacción de los mediadores solubles derivados de células T, denominados citocinas, con sus ligandos análogos expresados en la membrana plasmática de células B. El contacto célula T-célula B está también restringido en CMH, de forma análoga a la interacción célula T-CPA (Eur. J. Immunol. 12:627, 1982; Eur. J. Immunol. 12:634. 1982). Sin embargo, la interacción específica de las moléculas que median la interacción restringida en CMH entre los dos linajes de linfocitos, específicamente, el receptor de células T para antígeno (RcT), y el complejo CMH/antígeno expresado por las células B, no propugnan la inducción de crecimiento y diferenciación de células B (Eur. J. Immunol. 18:375, 1988).

La interacción molecular esencial, reflejada por el requisito para contacto célula T-célula B, está mediada por CD40 expresado en la membrana plasmática de la célula B, y su ligando análogo, gp39 (o CD40L), expresado en la membrana plasmática de la célula T (PNAS 89:8550, 1992; Nature 357:80, 1992). En coherencia con este paradigma está la observación de que la expresión de membrana del último aumenta en la interacción célula T-CPA, así como con posterioridad a la interacción célula T-célula B (PNAS 89:6550, 1992). Además, la interacción con antígeno de células B mediada por inmunoglobulina de membrana tiene como resultado el aumento de la expresión de membrana de CD40 (Sem. in Immunol. 6:303, 1994). La interacción entre CD40 y CD40L propugna la inducción de crecimiento de células B, diferenciación de células B en células secretoras de inmunoglobulina y cambio de isotipo de inmunoglobulina (J. Exp. Med. 178:1567, 1993).

En coherencia con este modelo está la observación de que la CD40L soluble, o anticuerpo monoclonal (AcM) específico para CD40, puede inducir crecimiento y diferenciación de células B en secreción de inmunoglobulina (Sem. in Immunol. 6:267, 1994; PNAS 83:4494, 1986; J. Immunol. 140:1425, 1988).

Además del requisito obligado para contacto célula T-célula B, una serie de citocinas derivadas de células T, IL-2, IL-4 y IL-5 son básicas para el crecimiento y diferenciación de células B. La susceptibilidad de las células B a estas citocinas está limitada en su mayor parte por el contacto anterior con una célula T. Así, después de contacto con células T, las células B aumentan la expresión de receptores de membrana específicos de citocina (PNAS 80:6628, 1983; J. Immunol. 145:2025, 1990; J. Immunol. 146:1118, 1991). Se ha demostrado que las IL-2 y las IL-5 apoyan el crecimiento de células B activadas (PNAS 77:1612, 1980; Immunol. Rev. 52; 115, 1980). Además, se ha demostrado que la IL-4 y la antiinmunoglobulina apoyan de forma sinérgica el crecimiento de células B (J. Exp. Med. 155:914, 1982).

Excepciones notables en este contexto son las respuestas de las células B inactivas a IL-4 e IL-5. IL-4 induce la transcripción y traducción de novo de proteínas CMH Clase II (J. Exp. Med. 155:914, 1982; PNAS 81:6149, 1984; J. Exp. Med. 160:679. 1984), e IL-5 es capaz de apoyar la diferenciación de células B inactivas en células secretoras de inmunoglobulina a alta velocidad en ausencia de crecimiento celular (Eur. J. Immunol. 22:2323; 1992).

En cualquier caso, las señales derivadas de interacciones moleculares entre moléculas de membrana en células T y células B, y de aquellas citocinas derivadas de células T que interaccionan con sus receptores análogos en células B, forman parte de un complejo sistema de señalización. Cada señal impulsa a la célula B a otra fase de activación, haciéndola susceptible a posteriores señales en progresión. Estas señales se complementan mutuamente, en vez de tener la capacidad, individualmente, de impulsar el proceso completo de crecimiento y diferenciación de células B (Immunol. Rev. 95:177, 1987).

En 1988, se descubrió una actividad singular en el calostro ovino (J. Immunol. 140:1366, 1988). La Proteína Rica en Prolina (PRP) se había purificado parcialmente usando técnicas clásicas de purificación de proteínas. Se demostró que este material apoya la inducción de células B inactivas en el ciclo celular, y apoya su diferenciación en células secretoras de inmunoglobulina de alta velocidad. Este fue aparentemente el primer informe de una proteína de origen de mamífero que media estas funciones.

Posteriormente se preparó un anticuerpo monoclonal específico para PRP ovina. Cuando se pasaron los preparados de PRP por una columna de afinidad preparada usando el anticuerpo, todas las PRP quedaron retenidas en la columna, según se evaluó por análisis de transferencia Western del eluato y el efluente. Sin embargo, toda la actividad estimuladora de células B se encontró en el efluente. Así, la caracterización publicada de la célula B de la bioactividad trópica de las células B en el calostro ovino no era atribuible a PRP (información no publicada).

Son de relevancia además las siguientes publicaciones: Z. Yang y col., Inflammation 1996, Vol. 20(l) pág. 97-106; H.H. Jabara y D. Vercelli, J. Immunol. 1994, Vol. 153, páginas 972-978; G. Diamond y col., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 1996, Vol. 93, páginas 5156-5160; y Base de Datos EMBL-EBI; Bos taurus CD14 ARNm, CD parciales, 13 de septiembre de 1996, registro en la base de datos nº U48356. El artículo de Yang describe transcriptos de ARNm bovino que hibridan una sonda de ADNc de CD14 humana, y un producto de traducción de ADNc que se une a AcM anti-CD14. El artículo de Jabara describe la inhibición de expresión de IgE de células mononucleares humanas por AcM anti-CD14. El artículo de Diamond cita la entrada de la base de datos que incluye secuencias parciales de ácidos nucleicos y aminoácidos de CD14 bovina.

Resumen de la invención

La presente invención presenta usos según se define en las reivindicaciones de una nueva proteína bovina y secuencias de nucleótidos aisladas que codifican la proteína, siendo dicha proteína capaz de activar células B de origen de mamífero. Puede producirse una proteína LAIT sustancialmente pura o una forma modificada co- y/o post-traduccionalmente de la proteína por purificación bioquímica, o por medios recombinantes en un hospedador procariota o eucariota sustancialmente libre de otras proteínas con las que se asocie de forma nativa. También se incluye en la presente invención un procedimiento para purificar proteína LAIT o una forma modificada co- y/o post-traduccionalmente de proteína LAIT de la presente invención a partir de suero de calostro bovino que comprende:

(i) extracción salina de proteínas contenidas en dichas muestras,

(ii) enriquecimiento y última purificación de proteína LAIT a partir de proteínas tratadas por extracción salina en la etapa (i) usando técnicas clásicas de fraccionamiento de proteínas.

En todos los casos, dicha proteína posee la actividad biológica deseada. También se describe en la presente memoria descriptiva una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína LAIT. La molécula de ácido nucleico puede ser ADNc o ADN genómico.

La proteína bovina aislada tiene homología con CD14 humana y CD14 murina y, por ello, se refiere también como CD14 bovina. La invención incluye un procedimiento in vitro de activación de células B según se define en las reivindicaciones, y en particular de activación de células B en un mamífero que necesita dicha activación por administración de CD14, una forma recombinante de la proteína de la misma, o un derivado funcional de la misma.

En una forma de realización preferida, el mamífero es un paciente humano.

Según un aspecto, la invención incluye la incorporación de CD14 en leche de fórmula para lactantes. También se describe la administración de CD14 a un lactante que incluye un modo de administración con el que se alimenta al lactante con dicha leche de fórmula.

En otro aspecto, la invención incluye la incorporación de CD14 como parte de una vacuna. La invención incluye una vacuna que comprende CD14 y antígeno distinto de CD14. En un modo preferido, la vacuna es un único preparado que contiene tanto CD14 como el antígeno.

También se describe en la presente memoria descriptiva la administración de CD14 a un paciente que tiene inmunodeficiencia de células T. Esto incluye la administración de CD14 a un paciente que sufre una disfunción particular de células T en la que gp39 (CD40L) está subexpresada o totalmente ausente en la superficie celular de las células T del paciente.

Además, se describe la administración de anticuerpos activos contra CD14 a un paciente que sufre una disfunción en la que las células B del paciente están hiperactivas como consecuencia de niveles superiores a lo normal de CD14 sérica. Esto incluye la administración de anticuerpos contra CD14 a un paciente que sufre artritis reumatoide en la que las células B están secretando factor reumatoide como consecuencia de su activación por CD14 sérica.

La presente invención incluye un nuevo procedimiento in vitro de hibridomas que secretan AcM de especificidad deseada cultivando células B con concentraciones mitogénicas subóptimas de CD14 en concierto con el antígeno contra el que se desea que actúen los anticuerpos. Las poblaciones de células B activadas de esta manera están altamente enriquecidas en células B activadas específicas del antígeno, que se usarán a continuación para la producción de hibridomas que secretan el AcM de especificidad deseada.

La invención incluye el uso de CD14 en la preparación de medicamentos para activar células B en un mamífero necesitado de dicha activación.

En la invención puede usarse CD14 natural o recombinante.

En el contexto de la presente invención, el término "CD14" incluye CD14 murina, bovina o humana.

Definición de términos

Un "derivado funcional" conserva al menos una parte de la función de CD14, como unión a un anticuerpo específico o unión a su receptor análogo en células que poseen dicho receptor, lo que permite su utilidad de acuerdo con la presente invención. El término "derivado funcional" según se usa en la presente memoria descriptiva incluye un "fragmento", o "variante" de CD14, términos que se definen a continuación.

Un "fragmento" de CD14 se refiere a cualquier subconjunto del polipéptido, es decir, un péptido más corto. El término "fragmento" se usa para indicar un polipéptido que se obtiene de CD14 que tiene una secuencia de proteínas de ocurrencia natural que comprende una deleción de uno o más aminoácidos en uno o más sitios del terminal C, terminal N, y dentro de la secuencia. Dichos fragmentos deben conservar una o más actividades o funciones biológicas que son características del polipéptido de CD14 intacto o formas modificadas co- y/o post-traduccionalmente de CD14.

Una "variante" de CD14 se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia primaria similar a la de la CD14 nativa o un fragmento de la misma de manera que la actividad nativa se conserva al menos parcialmente. Los péptidos de variante pueden prepararse por medios sintéticos o por mutaciones en el ADNc que codifican dicho polipéptido que conserva la actividad biológica de dicho polipéptido incluyendo deleciones, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro del polipéptido.

El término "anticuerpo" según se usa en la presente memoria descriptiva es una proteína de inmunoglobulina que tiene la capacidad de unirse a distintos epítopo en una región no conservada de dicha proteína, permitiendo así al anticuerpo distinguir una proteína de otra. Se entiende que el término "epítopo" se refiere a esa parte de cualquier molécula capaz de unirse mediante un anticuerpo. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (AcM) o anticuerpos quiméricos.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo obtenidas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno.

Los anticuerpos monoclonales son una población homogénea de anticuerpos capaces de unirse a distintos epítopos en el antígeno. Los AcM pueden obtenerse por procedimientos conocidos para los expertos en la materia. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulinas incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA e IgD, y de cualquier subclase de las mismas. Se entiende también que el término "anticuerpo" incluye tanto moléculas intactas como fragmentos de las mismas, como, por ejemplo, Fab y F(ab')_{2}, que son capaces de unirse a antígeno. Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión inespecífica a tejido que un anticuerpo intacto (Wahl y col., J. Nucl. Med. 24:316-325, 1983).

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Los anticuerpos quiméricos son moléculas, partes diferentes de las cuales se obtienen de diferentes especies animales, como las que tienen una región variable obtenida de un AcM murino y una región constante obtenida de una inmunoglobulina humana.

Un "antígeno" es una molécula o una parte de una molécula capaz de unirse mediante un anticuerpo que es capaz además de inducir a un animal a producir un anticuerpo capaz de unión a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo. Cuando se dice que un anticuerpo "es específico de" un polipéptido, fragmento o variante del mismo o se dice que es "capaz de unirse" a un polipéptido, fragmento o variante del mismo, se quiere decir que el antígeno reaccionará de una manera altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden evocarse por otros antígenos.

Breve descripción de los dibujos

Las fig. 1A-1C muestran la purificación de proteína LAIT bovina nativa (nBo-LAIT). La fig. 1A muestra un perfil de elución a partir de una columna de intercambio aniónico (FPLC-Mono-Q, Pharmacia) en la que se cargaron 50 mg del precipitado de (NH4)2SO4 al 62% (v/v). Se eluyeron las proteínas ligadas con un gradiente de NaCl 50-400 mM en bis-tris propano 10 mM, y un gradiente de pH simultáneo de 7,5 a 9,5. La Tabla 1A indica la bioactividad de la fracción con actividad pico, fracción nº 57. Se aislaron células B esplénicas de ratón de alta densidad de flotación según se ha descrito anteriormente (J. Immunol. 131:581, 1983), y se cultivó a 5 x 104 células en 0,2 ml de medio libre de suero en una placa de cultivo tisular de fondo plano y grupos de 96 pocillos (Costar). Se añadió cada fracción a una concentración final del 10% (v/v) en presencia, o ausencia de 0,25 \mug/ml de LPS. A las 40 horas, se sometieron a impulsos los cultivos con 1 \muCi de 3H-TdR, se recogieron en discos de filtro 6 horas más tarde y se evaluó la captación de timidina por espectroscopia de centelleo. Los números representan cpm x 10^{-3}. La fig. 1B muestra un perfil de una columna de filtrado molecular (FPLC-Superdex 75, Pharmacia) en la que se cargaron 20 mg de Fracción nº 57 (fig. 1A). La columna se equilibró en tampón de pH 8,0 de tris-HCl 20 mM que contenía NaCl 0,45 M. La Tabla 1B indica la bioactividad de la fracción pico, fracción nº 38, valorada según se describe en conexión con la fig. 1A. La fig. 1C muestra el perfil de elución de una columna de hidroxiapatito [HPLC-hidroxiapatito, Pharmacia] en la que se cargó 1 mg de fracción nº 38 (fig. 1B). Se eluyeron las proteínas ligadas con un gradiente de 1 a 500 mM de tampón de K2HPO4, pH 6,8, que contenía NaCl 1 mM. La Tabla 1C indica la bioactividad de la fracción pico, fracción nº 25, valorada según se describe en conexión con la fig. 1A. El recuadro de la figura muestra un gel SDS-PAGE con tinción de plata de aproximadamente 5 \mug de proteína de la fracción nº 25. Carril izquierdo: fracción nº 25; carril derecho: marcadores de PM, desde arriba: 97, 66, 45, 31, 21 y 14 kD, respectivamente.

La fig. 2 muestra la secuencia conocida de CD14 humana (ID SEC Nº: 5) y fragmentos alineados de nBo-LAIT. Los fragmentos Bo-LAIT se generaron a partir de nBo-LAIT de calostro purificada de afinidad (ver fig. 3). Los fragmentos correspondientes a los restos 235-264 y 344-355 de CD14 humana fueron péptidos mayores y menores, respectivamente, cada uno de aproximadamente 18 kD de tamaño, generados por escisión CnBr, y separados por HPLC de fase inversa (columna C8, Pharmacia). El fragmento correspondiente a los restos 53-67 de CD14 humana es una secuencia parcial de un fragmento de 24 kD generado por escisión CnBr, y separado por SDS-PAGE y electrotransferido en membrana de PVDF. Los fragmentos correspondientes a los restos 19-36 y 151-165 de CD14 humana se generaron por escisión de tripsina, y se separaron por HPLC de fase inversa (columna C8, Pharmacia). La longitud de la secuencia bovina solapada con la secuencia predicha de CD14 humana se subraya para cada uno de los fragmentos. Las líneas de puntos indican los mismos aminoácidos mientras que los que difieren de la secuencia humana están indicados.

La fig. 3 muestra SDS-PAGE y tinción de plata de proteína LAIT de calostro purificada de afinidad de origen bovino y humano. Carril 1: marcadores de PM, como se ofrece para la fig. 1C; carril 2: precipitado de (NH4)2SO4 al 62,5% (v/v) de suero de calostro bovino; carril 3: eluato pH 2,5 de columna de afinidad de Sefarosa nº 842; carril 4: eluato pH 2,5 de columna de afinidad de AcM específico de CD14 63D3 (PNAS 77:6764, 1980)-Sefarosa, cargada con material representado en la carril 5; carril 5: suero de calostro humano fraccionado Sefacryl S100 HR. Cada uno de los carriles 1 a 5 contiene 5 \mug de proteína. La Tabla 2 muestra los resultados obtenidos cuando se cultivaron 5 x 104 de células B esplénicas de ratón de alta densidad de flotación en medio libre de suero en presencia de los estímulos indicados durante 40 horas, con impulsos de 1 \muCi de 3H-TdR, recogidos 6 horas más tarde en discos de filtro, y se evaluó la captación de timidina por espectroscopia líquida de centelleo. Los números representan cpm x 10^{-3}. Los detalles del bioensayo son según se describe para la fig. 1A. Control cpm x 10^{-3}; sin estímulo. 0,3; 50 \mug/ml LPS, 75,0; 0,25 \mug/ml LPS [LPS \downarrow] 0,8; y 1 \mug/ml AcM específico de mIgM b-7-6 (Eur. J. Immunol. 14:753, 1984), 0,7.

Las fig. 4A y 4B muestran labilidad térmica e inhibición mediada por anticuerpos de actividad de nBo-LAIT. La fig. 4A muestra captación de timidina por 5 x 104 células B esplénicas de ratón de alta densidad de flotación cultivadas según se describe para la fig. 1A en presencia de la concentración indicada de nBo-LAIT purificada de afinidad que se ha tratado por calor a 95°C durante 10 minutos (\bullet), y nBo-LAIT que se ha tratado por calor (O). Se sometieron a impulsos los cultivos con 3H-TdR a 40 horas, se recogieron 6 horas más tarde, y se evaluó la captación de timidina por espectroscopia líquida de centelleo. El recuadro ilustra las respuestas en cultivos que contienen las concentraciones indicadas de LPS, que se han tratado por calor (o no) como para nBo-LAIT. La fig. 4B muestra la captación de timidina en cultivos que se establecieron según se describe para la fig. 4A en presencia de 0,25 \mug/ml de nBo-LAIT purificada de afinidad, o 50 \mug/ml de LPS. Cada uno de estos estímulos se cultivó en presencia de la concentración indicada de anti-Bo-LAIT IgG de conejo policlonal, nº 842, o Ig de conejo normal. La inhibición porcentual de captación de timidina mediada por IgG nº 842 para estimulación mediada por nBo-LAIT y LPS se indica entre paréntesis. Los niveles de inhibición mediada por IgG de conejo normal oscilaron entre el 9 y el 20%, y el 12 y el 31% para estimulación por nBo-LAIT y LPS, respectivamente. La CPM inducida directamente por IgG nº 842 en aislamiento estuvo comprendida entre 454 \pm 53 y 764 \pm 69 a 0,4 y 50 \mug/ml, respectivamente; y para IgG de conejo normal, desde 297 \pm 34 hasta 420 \pm 31 a 0,4 y 50 \mug/ml, respectivamente. Los controles no estimulados dieron lugar a 195 \pm 29 cpm para ambos conjuntos de experimentos.

La fig. 5A muestra un mapa de restricción del fragmento EcoRI-XhoI de 7,1 kb que contiene gen de CD14 bovina. Las abreviaturas para sitios de restricción son: X, XhoI; P, PstI; O, NcoI; B, BamHI; N, NotI; D, BssHI; T, BstEII; M, SmaI; S, SacII; C, HpaI; R, EcoRV; A, SphI; G, BgIII; H, HindIII; E, EcoRI. La fig. 5B es un diagrama esquemático del locus de la CD14 bovina. La zona sombreada representa la región de codificación del gen, el cuadro abierto es una secuencia de intrones. La zona de sombreado discontinuo delante del codón de inicio ATG es región no traducida 5', y la zona de sombreado discontinuo detrás del codón de parada TAA es región sin traducir 3'. La fig. 5C es un diagrama esquemático que muestra la estrategia de secuenciación adoptada. Las flechas representan la dirección de secuenciación. El número de fragmento se indica en la derecha (ver texto para detalle).

La fig. 6 muestra una comparación de secuencias de ácidos nucleicos de regiones de codificación de CD14 bovina (ID SEC Nº: 1), humana (ID SEC Nº: 2) y de ratón (ID SEC Nº: 3). La primera posición de base corresponde al primer nucleótido del codón ATG, el último nucleótido corresponde al tercer nucleótido del codón de parada TAA. La alineación se realizó usando software ADN STAR-Megalign, aplicando el procedimiento Clustal con una tabla de restos ponderada. La secuencia de ADNc humano (número de registro PO8571) y la secuencia de ADNc de ratón (número de registro PO8571) usados en esta alineación se obtuvieron de la base de datos Swiss-Protein.

La fig. 7 muestra una comparación de secuencias de aminoácidos de proteínas de CD14 bovina (ID SEC Nº: 4), humana (ID SEC Nº: 5) y de ratón (ID SEC Nº: 6). Las secuencias de aminoácidos se dedujeron de las secuencias de ADNc correspondientes mostradas en la fig. 6. Se usó el software ADN Star-Megalign para generar esta alineación usando el procedimiento descrito por J. Hein (Methods in Enzymology 183:626, 1990) en conjunción con la tabla de pesos de restos PAM 250.

Las fig. 8 muestra cebadores usados para amplificación de región de codificación de ADNc de CD14 bovina ADNc. La fig. 8A muestra cebadores directo (ID SEC Nº: 7) e inverso (ID SEC Nº: 8) usados para el sistema de expresión de baculovirus. La fig. 8B muestra cebadores directo (ID SEC Nº: 9) e inverso (ID SEC Nº: 10) usados para el sistema de expresión de mamíferos.

La fig. 9 muestra la inmunotransferencia de CD14 bovina nativa y recombinante. Se usó análisis de transferencia Western para evaluar y comparar los tamaños de proteína nBo-LAIT con proteínas CD14 recombinantes. Se sometieron a electroforesis 250 ng de proteínas CD14 en gel de SDS-poliacrilamida al 12,5% y se transfirieron electroforéticamente una membrana de PVDF (Millipore) a 180 mA durante 30 minutos. La membrana se bloqueó durante 1 hora en leche descremada al 5% en TBST (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,025%), seguido por incubación durante 1 hora con Ac nº 842 anti-Bo-LAIT de conejo a concentración de 2,5 \mug/ml en TBST suplementado con leche descremada al 5%. La transferencia se enjuagó tres veces durante 10 minutos/enjuagado en TBST. Se usó IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (BioRad) para detectar anticuerpo de conejo. A continuación se enjuagó la membrana tres veces (10 minutos/enjuagado) con TBST. Se usó el kit ECL (Amersham) para visualizar las proteínas. Carril 1: marcadores de PM; carril 2: proteína nBo-LAIT purificada de afinidad de nBo-LAIT-842-Sefarosa; carril 3: CD14 bovina recombinante obtenida de célula de insecto Sf9 purificada de afinidad rBo-Sf9-12CA5; carril 4: CD14 bovina recombinante obtenida de línea de células tumorales mamarias de ratón C127, purificadas de afinidad rBo-C127- 842-Sefarosa.

La fig. 10 muestra actividad de promoción de comparativa de nBo-LAIT y LPS. Se prepararon células B esplénicas murinas en reposo de alta densidad de flotación, se cultivaron y se recogieron según se describe para la fig. 1A. Las concentraciones indicadas de nBo-LAIT purificada de afinidad (purificada de afinidad según se describe para la fig. 1) o LPS, obtenida de S. typhosa (Difco), se añadieron al inicio del cultivo.

La fig. 11 muestra actividad de promoción de diferenciación comparativa de nBo-LAIT y LPS. Se prepararon células B esplénicas murinas en reposo de alta densidad de flotación y se cultivó según se describe para la fig. 1A. Se iniciaron cultivos replicados usando 10 \mug/ml de LPS [S. typhosa (Difco)], o 500 ng/ml de nBo-LAIT purificada de afinidad, y se recogieron las veces indicadas. Se evaluó la producción de IgM acumulativa cuantificando la IgM presente en sobrenadantes usando un kit ELISA disponible comercialmente.

La fig. 12 muestra actividad de promoción de crecimiento comparativa de proteínas nBo- y rBo-LAIT con la de LPS. Se prepararon células B esplénicas murinas en reposo de alta densidad de flotación, se cultivaron y se recogieron según se describe para la fig. 1A. Las concentraciones indicadas de nBo-LAIT (purificada según se describe para la fig. 1A), rBo-LAIT generadas en células e insecto, o células de mamífero, y LPS [S. typhosa (Difco)] se añadieron al inicio del cultivo. La Bo-LAIT recombinante obtenida de células de insecto estaba purificada de afinidad de los sobrenadantes del cultivo de células Sf9 transfectadas con ADNc de Bo-LAIT. El vector de expresión incluía un 3' 27 mer que codifica un nonapéptido obtenido de hemaglutinina de influenza (HA tag). La purificación de afinidad se logró haciendo pasar sobrenadantes S9f sobre Sefarosa conjugada con el AcM 12CA5 (Cell 57:787, 1984), que reconoce la HA tag. La purificación de afinidad de nBo-LAIT recombinante obtenida del sistema de expresión de mamífero, C127, se consiguió como para nBo-LAIT, usando Sefarosa conjugada con IgG aislada del antisuero policlonal obtenido de conejo 842.

La fig. 13 muestra un análisis comparativo de la actividad de promoción de crecimiento de nBo-LAIT en poblaciones primarias purificadas de células B y T. Las células B esplénicas murinas en reposo de alta densidad de flotación se prepararon según se describe para la fig. 1A. Las células T primarias se aislaron a partir de los nódulos linfáticos de los mismos animales a partir de los cuales se aislaron las células B esplénicas. Específicamente, se hicieron pasar suspensiones de nódulos linfáticos sobre columnas anti-Ig (Biotex Labora) según instrucciones de los fabricantes, y según se ha descrito anteriormente (Eur. J. Immunol. 24:967, 1994). Las poblaciones de células T fueron > 95% CD3+, y < 0,5% mlg+, según se evalúa por tinción inmunofluorescente y análisis FACS. El panel izquierdo muestra la respuesta proliferativa de cultivos que contienen 1,5 x 105 de células T o B purificadas en respuesta a las concentraciones indicadas de nBo-LAIT purificada de afinidad. El panel derecho muestra la respuesta proliferativa del mismo número de células B o T para bien 50 \mug/ml de LPS (S. typhosa (Difco)] o 1 \mug/ml de Concanavalina A (Sigma). Se emplearon condiciones libres de suero, y todos los estímulos se añadieron al inicio del cultivo. A las 40 horas, se sometieron a impulsos los cultivos 1 \muCi de 3H-TdR, se recogieron en discos de filtro 8 horas más tarde y se evaluó la captación de timidina por espectroscopia de centelleo. Los números indicados representan el cpm medio de cultivos
duplicados.

La fig. 14 muestra la independencia del suero de ternera fetal del crecimiento de células B murinas mediadas por nBo-LAIT. Se prepararon células B esplénicas murinas en reposo de alta densidad de flotación, se cultivaron y se recogieron según se describe para la fig. 1A. El medio de cultivo libre de suero se suplementó con la concentración indicada de suero de ternera fetal inactivado por calor (56°C durante 1 hora) (Gibco SRL) y sin estímulo (\sqbullet), 0,5 \mug/ml nBo-LAIT de afinidad (O) o 50 \mug/ml LPS [S. typhosa (Difco)] (\bullet). A las 40 horas, se sometieron a impulsos los cultivos con 1 \muCi de 3H-TdR, se recogieron en discos de filtro 6 horas más tarde y se evaluó la captación de timidina por espectroscopia de centelleo. Los números indicados representan el cpm medio de cultivos duplicados.

La fig. 15 muestra un análisis de transferencia Northern para CD14 contenida en: (1) esplenocitos sin fraccionar, (2) células B esplénicas murinas en reposo de alta densidad de flotación preparadas según se describe para la fig. 1A, y (3) células B mlg+ ordenadas por FACS obtenidas de la última población en reposo de alta densidad de flotación. Para ordenación FACS, se incubaron células de alta densidad de flotación con AcM conjugado con FITC 187.1, específico para IgK de ratón (Hybridoma 1:5, 1981). Se indica la proporción de células mlg+ en cada una de las tres poblaciones. Se aisló el ARN total a partir de 107 células de cada una de las tres poblaciones usando el procedimiento Trizol (Gibco BRL Life Technologies) según las instrucciones del fabricante y se resolvió en un gel de formaldehído al 1,2%. Se transfirió el ARN a una membrana de nailon (GeneScreen) usando el sistema de transferencia al vacío (Pharmacia). Se realizaron reticulación, prehibridación e hibridación según recomienda el fabricante de membranas. La sonda específica de CD14 murina se obtuvo de un fragmento de CD14 de ratón genómico generado PCR usando el cebador directo 5'-CTA GAA TTC TCT CCC GCC CCA CCA GAG CCC TGC G-3' (ID SEC Nº: 11) y el cebador inverso 5'-CTA GAA TTC TTA AAC AAA GAG GCG ATC TCC TAG G-3' (ID SEC Nº: 12). El fragmento amplificado se resolvió por electroforesis de gel de agarosa, se escindió y se purificó. Se usa una sonda de ADNc L32 (Nucl. Acid Res. 16:10751, 1988), específica para un ARNm expresado constitutivamente de la gran proteína de subunidad ribosómica usada para normalizar la carga de ARN. Las sondas (100 ng cada una) se marcaron usando kit de oligomarcado (Pharmacia) para una actividad específica de 0,2 a 1 x 109 cpm/\mug de ADN. A continuación se lavó la membrana en 0,2 x SSC, SDS al 1% a 65°C durante 2 horas y se expuso a la película de rayos X (Kodak, Biomax MS) durante 1 a 5 días.

La fig. 16 muestra la respuesta de células B esplénicas murinas en reposo de alta densidad de flotación que se purificaron más para células mlg+ según se describe en la fig. 15, o no, a 50 \mug/ml LPS [S. typhosa (Difco)] y 0,5 \mug/ml de nBo-LAIT purificada de afinidad. Se estabilizaron los cultivos, se sometieron a impulsos con timidina tritiada, se recogieron y se evaluó la captación de timidina según se describe para la fig. 1A. Los números indicados representan el cpm medio de cultivos duplicados.

La fig. 17 muestra la independencia de CD40 de activación de células B mediadas por Bo-LAIT recombinantes. Las células B esplénicas murinas en reposo de alta densidad de flotación se aislaron a partir de ratones convencionales C57BL/6, o a partir de animales con deficiencias en CD40 creados por disrupción objeto del locus de CD40 (Immunity 1:167, 1994). Se cultivaron células (1,5 x 105) en presencia de 10 \mug/ml LPS, o las concentraciones indicadas de rBo-LAIT obtenidas en el sistema de expresión de células de insecto. Se sometieron a impulsos los cultivos y se recogieron según se describe en conexión con la fig. 1A. Los números indicados representan el cpm medio de cultivos
duplicados.

La fig. 18 muestra un análisis comparativo de tinción de plata (panel izquierdo) e inmunotransferencia (panel derecho) de CD14 nativa de origen humano (nHu), de vaca (nBo) y de ratón (nMo). La nHu se aisló a partir de la orina de pacientes nefróticos, según se ha descrito anteriormente (Eur. J. Immunol. 24:1779, 1994). La nBo era purificada de afinidad a partir de calostro bovino según se describe en la fig. 3. La nMo se aisló a partir de sobrenadante del hibridoma de ratón OKT3 (PNAS USA 77:4914, 1980) por cromatografía de afinidad usando AcM específico de CD14 inmovilizado con Sefarosa 4B 3C10 (J. Exp. Med. 15:126, 1983). Para tinción de plata, se resolvió 1 \mug de cada una de las muestras en SDS-PAGE al 10% a 200 V durante 45 minutos. La proteína se visualizó por tinción de plata (BioRad) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Para inmunotransferencia, se resolvieron 250 ng de cada una de las muestras por SDS-PAGE al 10% a 180 mA durante 45 minutos, se transfirieron electroforéticamente a membrana de PVDF (Millipore) a 180 mA durante 30 minutos. Se bloqueó la membrana durante 1 hora en leche descremada al 5% en TBST (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,025%), seguido por incubación durante 1 hora con AcM 3C10 (J. Exp. Med. 15:126, 1983) a concentración 10 \mug/ml en TBST suplementado con leche descremada al 5%. Se enjuagó la transferencia tres veces durante 10 minutos/enjuagado en TBST. Se usó IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (BioRad) para detectar anticuerpo de ratón. A continuación se enjuagó la membrana tres veces (10 minutos/enjuagado) con TBST. Se usó el kit ECL (Amersham) para visualizar las proteínas.

La fig. 19 muestra un análisis comparativo de CD14 nativa de origen humano (nHu), de vaca (nBo) y de ratón (nMo) para estimular el crecimiento de células B murinas. Estas tres proteínas se purificaron según se describe en la fig. 18. Se evaluó la respuesta de las células B esplénicas murinas en reposo de alta densidad de flotación aisladas según se describe en la fig. 1A, a las concentraciones indicadas de las tres proteínas. Se sometieron a impulsos los cultivos con 1 \muCi de 3H-TdR a las 40 h y se recogieron a las 46 h. Los números indicados representan el índice de estimulación obtenido dividiendo el cpm medio de cultivos duplicados estimulados con la concentración indicada de nHu, nBo y nMo, por el cpm medio de los cultivos duplicados que no contienen estímulo.

Las fig. 20A y B muestran la actividad de promoción de crecimiento de nBo-LAIT en células B humanas aisladas de sangre del cordón umbilical y de las amígdalas, respectivamente. La fig. 20A muestra la captación de timidina por células B de sangre del cordón umbilical aisladas por selección positiva. Las suspensiones de leucocitos de sangre del cordón umbilical se tiñeron con AcM específicos marcados con fluoresceína para el marcador de células B de bandeja CD72. A continuación se aislaron los leucocitos de cordón umbilical positivos CD72 en un clasificador celular activado por fluorescencia (FACStar Plus, Becton Dickenson), de lo que se obtuvieron purezas de > 98%. Se cultivaron células B (1,5 x 105) según se describe para la fig. 1A, en presencia de no estímulo o 2 \mug/ml de nBo-LAIT. También se cultivaron células B en pocillos que se habían precubierto durante 9 horas con una combinación de dos AcM, uno específico para Ig\kappa humana [LO-HK3, (en "Rat Hybridomas and Rat Monoclonal Antibodies" ed. H. Bazin, CRC Press, Boca Raton, FL, EE.UU.)] y uno específico para Ig\lambda humana (LO-HL2, (en "Rat Hybridomas and Rat Monoclonal Antibodies" ed. H. Bazin, CRC Press, Boca Raton, FL, EE.UU.)], cada uno a una concentración de recubrimiento de 1,5 \mug/ml, sin estímulo adicional, o en presencia de 2 \mug/ml de nBo-LAIT. Se sometieron a impulsos los cultivos a 60 horas con 1 \muCi de 3H-TdR, se recogieron en discos de filtro 12 horas más tarde y se evaluó la captación de timidina por espectroscopia de centelleo. La fig. 20B muestra los resultados obtenidos usando células B de amígdala preparadas por selección negativa. Específicamente, se marcaron suspensiones de leucocitos con AcM específico biotinilado para CD3\varepsilon (Becton Dickenson), seguido por avidina conjugada con hierro que contenía "micro-perlas" (Becton Dickenson). La población marcada se pasó a través del MACS (Becton Dickenson), y el efluente recogido. Esta población contenía < 1% de células T y > 97% de células B según se evalúa por tinción de inmunofluorescencia con AcM específicos de linaje. Las células B (1,5 x 105) se cultivaron según se describe en conexión con la fig. 1A. Al igual que para las células B de sangre de cordón umbilical, las células B de amígdala se cultivaron en presencia y ausencia de AcM específicos unidos a la placa para Ig\kappa y \lambda humana, pero en este caso, los pocillos se precubrieron usando una concentración de 0,5 \mug/ml de cada uno de los AcM. Se sometieron a impulsos los cultivos, se recogieron y se evaluó la captación de timidina según se describe para la fig. 20A.

La fig. 21 muestra la concentración de CD14 en leche materna durante el tiempo del posparto. La leche materna se recogió de dos donantes (A.D. y S.B.) en los momentos indicados después del parto. Se preparó suero aclarado y se evaluó la concentración de CD14 contenida usando un kit de ELISA específico de CD14 (IBL, Hamburgo) según instrucciones de los fabricantes.

Descripción de las formas de realización preferidas

Los experimentos descritos a continuación demuestran la purificación de proteína LAIT bovina nativa (nBo-LAIT), también denominada en la presente memoria descriptiva como CD14 bovina, a partir de suero de calostro. Se muestra el análisis de secuencia de aminoácidos de nBo-LAIT purificada, y se demuestra la homología con CD14 humana. Se muestra un procedimiento para la purificación de CD14 humana. Se muestra un procedimiento para la purificación de CD14 de ratón a partir de sobrenadante de hibridoma.

Se describen ensayos de estimulación de células B in vitro para Bo-LAIT de calostro purificada de afinidad, CD14 de calostro humana, CD14 humana obtenidas de orina y CD14 de ratón obtenida de un sobrenadante de hibridoma. Se muestra que las células B esplénicas en reposo de alta densidad de flotación obtenidas de ratón entran y avanzan a través del ciclo celular, en respuesta a la proteína LAIT de las tres especies, y se diferencian en células secretoras de inmunoglobina de alta velocidad en respuesta a la exposición a proteína LAIT de origen bovino. Estos sucesos de activación se producen en un medio libre de suero definido, y se muestra también que la presencia de suero de ternera fetal en medio de cultivo no afecta a la activación de células B mediada por proteína LAIT. Ese muestran experimentos que demuestran que la nBo-LAIT activa específicamente las células B murinas, y células T no murinas, y que la proteína LAIT activa las poblaciones de células B en las que el ARNm de CD14 es indetectable. También se ofrecen experimentos que demuestran que la CD14 bovina induce el crecimiento de células B en el que la CD40 no se expresa.

Se describe el aislamiento, clonación y secuenciación de ADN genómico y ADNc que codifican CD14 bovina. Las comparaciones de secuencias con CD14 de ratón y humanas, conocidas en la bibliografía, muestran las relaciones de secuencias entre Bo-LAIT y estas CD14 conocidas anteriormente. Se muestran el crecimiento y diferenciación de actividades de células B asociadas con CD14 bovina recombinante.

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Se describen procedimientos para la expresión de CD14 bovina recombinante en sistemas de insectos y mamíferos. Específicamente, se empleó un vector de expresión de baculovirus en ayuda de la expresión de proteínas recombinantes en células de insecto. La comparación de las propiedades de crecimiento y diferenciación de células B de Bo-LAIT nativa (nBo-LAIT) y Bo-CD14 recombinante (rBo-LAIT) obtenidas del sistema de expresión de baculovirus reveló que la segunda era funcional, y tenía una actividad específica de aproximadamente el 50% de la de nBo-LAIT.

La línea celular de carcinoma de mama de ratón, C127, se usó como receptor de ADNc que codifica CD14 de origen bovino. Se clonó el ADNc en un vector de expresión de virus de papiloma bovino. Se estabilizaron transfectantes C127 estables, y se aisló proteína CD14 recombinante de los sobrenadantes de cultivos C127 confluentes por cromatografía de afinidad. Los análisis de transferencia Western de proteínas LAIT obtenidas de células de insecto y C127 revelaron que se generaron diferentes modificaciones co- y/o postraduccionales en los dos sistemas de expresión. La actividad específica de CD14 bovina recombinante obtenida de células de mamíferos fue la misma que el material recombinante obtenido de células de insecto.

Se ofrece una comparación de la actividad de promoción del crecimiento de células B apoyada por la BoLAIT nativa y la CD14 bovina recombinante obtenidas de células de insecto y células de mamífero. Además, se ofrece la actividad de promoción de crecimiento de actividades de Bo-LAIT nativa en células B humanas, aisladas de las amígdalas o de la sangre del cordón umbilical. Los resultados demuestran que las células B murinas, células B humanas, aisladas de un neonato o de un adulto, son susceptibles al crecimiento mediado por Bo-LAIT.

Se muestra que la concentración de CD14 presente en el calostro humano, y en la leche materna hasta 78 días después del parto, es entre 3 y 20 veces más alta que la observada en los sueros de donantes sanos.

Procedimientos Purificación de Proteína LAIT bovina

Se obtuvieron más de cinco litros de calostro de las primeras secreciones mamarias de vacas que acababan de parir.

(i) Se preparó suero de calostro aclarado por centrifugado de calostro primero a 4.420 g durante 30 minutos para eliminar células y desecho celular. A continuación se centrifugó el sobrenadante de este giro a 250.000 g durante dos horas. Se desecharon los lípidos flotantes y la caseína en sedimento, y se sometió el suero de calostro aclarado a más fraccionamiento.

Se evaluó la actividad de promoción de crecimiento de células B en cada fracción obtenida de cada técnica de fraccionamiento in vitro. Así, se sometió a ensayo cada fracción durante un amplio intervalo de concentraciones para conocer su capacidad de estimular el crecimiento de células B en reposo de alta densidad de flotación obtenidas de bazo de ratón, según se ha descrito anteriormente (J. Immunol. 131:581, 1983). El medio libre de suero definido se usó a lo largo de todos estos análisis [IMDM (Gibco), suplementado con 5 x 10^{-5} de 2-\beta-mercaptoetanol, 5 \mug/ml de transferina saturada en hierro (Boehringer, Lewes, GB), 0,5 mg/ml de BSA deslipidada (Boehringer), 100 U/ml de penicilina (Gibco), 100 \mug/ml de estreptomicina (Gibco) y aminoácidos esenciales]. Las fracciones obtenidas del esquema de aislamiento descrito a continuación se probaron directamente, así como en combinación con una concentración submitogénica de LIPS (0,25 pg/ml). Según se describirá, cuando la proteína LAIT se aproximaba a la pureza, se revelaron sus propiedades mitogénicas directas.

(ii) Se realizó una extracción salina de proteínas contenidas dentro de las preparaciones de suero de calostro usando precipitación secuencial en (NH_{4})_{2}SO_{4}. La secuencia de concentraciones salinas crecientes empleada fue 42%:50%:62%:65% (v/v) de sulfato de amonio (SA). Así, la concentración de SA en el sobrenadante del material precipitado al 42% se aumentó al 50%; el material precipitado al 50% se rescató, y la concentración de SA en el sobrenadante restante aumentó al 62%, y así sucesivamente. Cada sedimento de precipitado de SA se solubilizó en Tris-HCl 10 mM pH 8,0, que contenía NaCl 0,15 M y AEBSF (TNAEBSF) 1 mM. Estas fracciones se desalaron y se cambió el tampón por TNAEBSF usando columnas 10DG, y se sometió a ensayo la bioactividad. La mayoría de la actividad de promoción del crecimiento de células B se aisló en el precipitado de SA del 62% siguiendo el esquema anterior (no mostrado).

(iii) Posteriormente se enriqueció la actividad, y en última instancia se purificó usando tres técnicas secuenciales de fraccionamiento de proteínas. Se aplicaron 50 mg de la fracción enriquecida de SA al 62% a una columna de intercambio aniónico, y se separó el material usando un gradiente de sal de NaCl de 50 mM a 400 mM en bis-tris propano 10 mM, con un gradiente de pH simultáneo de 7,5 a 9,5. La fig. 1A muestra el perfil de elución de esta columna, y la Tabla 1A indica la fracción que contiene la actividad pico, fracción nº 57. A continuación se aplicaron 20 mg de fracción nº 57 a una columna de filtrado molecular equilibrada en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, que contenía NaCl 0,45 M. El perfil de elución de este fraccionamiento se muestra en la fig. 18 y la actividad de la fracción pico nº 38 se muestra en la Tabla 1B.

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A continuación se aplicó 1 mg de fracción nº 38 a una columna de hidroxiapatito en NaCl 1 mM, y se eluyó usando un gradiente de 1 a 500 mM de tampón de fosfato de potasio pH 6,8. El perfil de elución se muestra en la fig. 1C con la actividad asociada mostrada en la Tabla 1C.

El recuadro de la fig. 1C representa un análisis SDS-PAGE de la fracción con actividad pico seguido por tinción de plata, e ilustra una banda mayor única con una masa molecular relativa de 46 a 50 kD.

Análisis de secuencia de proteína LAIT bovina

La nBo-LAIT purificada se sometió a análisis de secuencias. Se encontró que el término N estaba bloqueado. El material se sometió a hidrólisis con bromuro de cianógeno o con tripsina. Se generaron cinco fragmentos y se purificaron usando HPLC de fase inversa o SDS-PAGE seguido por electrotransferencia en una membrana de PVDF, antes de secuenciación.

Según se ilustra en la fig. 2, los cinco fragmentos se alinean, con homología significativa, con CD14 humana.

Purificación de afinidad de proteína LAIT de calostro bovino y humano

Se usó nBo-LAIT aislada usando técnicas clásicas de fraccionamiento de proteínas para preparar un anticuerpo policlonal de conejo (nº 842). La fracción IgG de este antisuero se purificó en Proteína A-Sefarosa, y posteriormente se conjugó a Sefarosa 48.

La homología de secuencia de nBo-LAIT y CD14 humana (HuCD14) indicó que Bo-LAIT podría ser el homólogo bovino de CD14. Esto se exploró más en profundidad generando una columna de afinidad usando anticuerpo monoclonal (AcM) disponible específico para HuCD14. Este anticuerpo, 63D3 (PNAS 77:6764, 1980), se purificó a partir del correspondiente sobrenadante de hibridoma en una columna de afinidad formada por AcM 187.1 [kappa anti-ratón de rata (Hybridoma 1:5, 1981)], conjugado con Sefarosa 413, y a continuación se conjugó el AcM purificado con Sefarosa 4B.

El suero de calostro aclarado bovino se trató secuencialmente por extracción salina usando sulfato de amonio, según se describe anteriormente. Se fraccionó suero de calostro humano en una columna Sefacryl S100 HR. A continuación se purificaron de afinidad las fracciones que contenían actividad pico de promoción de crecimiento de células B usando la columna de 842-Sefarosa para el material bovino o la columna 63D3-Sefarosa para el material humano.

El análisis SDS-PAGE de Bo-LAIT de calostro purificada de afinidad LAIT, y de CD14 de calostro humano purificada de afinidad se muestra en la fig. 3 y en la Tabla 2 se muestra la actividad de promoción del crecimiento de células B asociada. Según se ilustra, se aisló una banda predominante a partir de preparaciones de calostro, del material bovino p46-50 (fig. 3, carril 3) y de un molécula humana p50-52 (fig. 3, carril 4).

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La bioactividad mostrada en la Tabla 2 demuestra que la Bo-LAIT purificada de afinidad, a una concentración de 100 ng/ml, estimuló el crecimiento de células B de ratón en reposo. Cuando se añadió a 10 ng/ml, este material dejó de ser mitogénico, pero se logró la coestimulación con la adición de una concentración submitogénica de LPS, o un AcM específico para IgM de ratón, b-7-6 (Eur. J. Immunol. 14:753, 1984). No se encontró, en sí mismo, que el material humano purificado de afinidad fuera mitogénico para las concentraciones ensayadas, pero para 10 ng/ml, el crecimiento de células B se estimuló con los mismos coestímulos con la misma eficacia que con el material bovino.

La bioactividad de nBo-LAIT es lábil al calor. Según se ilustra en la fig. 4A, el tratamiento de Bo-LAIT purificada de afinidad a 95°C durante 10 minutos elimina la actividad de promoción de crecimiento de células B asociada. Un tratamiento similar de LPS no tuvo efecto en su actividad (recuadro de la fig. 4A). Además, el anti-Bo-LAIT policlonal, nº 842, bloqueó eficazmente la actividad de promoción de crecimiento de células B de nBo-LAIT, sin afectar a la actividad de LPS. Ver fig. 4B y recuadro.

Clonación molecular de CD14 genómica bovina

Se sometió a detección selectiva una biblioteca lambda EMBL3 SP6/T7 genómica bovina (Clontech) con un fragmento de 1,5 kb de ADNc de CD14 humana (obtenido de R. Ulevitch, Scripps Institute). Se obtuvieron 15 señales positivas, y la señal más intensa, clon "B2", se eligió para un posterior análisis y clonación de CD14 bovina.

El ADN de fago aislado y purificado del clon B2 tenía un tamaño de inserto de aproximadamente 15 kb. Se digirió el ADN purificado, y se subclonó un fragmento resultante EcoRI-XhoI de 7,1 kb, que contenía una secuencia homóloga a la CD14 humana, en pBluescriptSK^{+} (Stratagene). La cartografía de restricción, usando una amplia variedad de enzimas, seguido por hibridación con la sonda de CD14 humana, permitió la localización del gen de CD14 bovina dentro del fragmento clonado (fig. 5A). Se usó una cartografía de restricción adicional para la subclonación de cuatro fragmentos más cortos (I-IV) en pBluescriptSK^{+}, y la secuenciación ulterior de aproximadamente 5 kb que comprendía el gen completo de CD14 bovina (fig. 5C). Se usaron los fragmentos I (EcoRI-BamHI, 3,2 kb): II (PstI-PstI, 1,35 kb): III (PstI-PstI, 0,3 kb); y IV (PstI-XhoI, 0,95 kb) para construir deleciones unidireccionales solapadas anidadas. Estos fragmentos proporcionaron la secuencia contigua del locus de la CD14 bovina. La fig. 5B ilustra la organización del fragmento genómico de la CD14 bovina.

Clonación molecular de ADNc de CD14 bovina

Se aisló ARN poli(A^{+}) a partir de monocitos de sangre periférica bovina, y se usó Extracto de Empaquetamiento Gigapack II (Stratagene) para empaquetar los ADN de fagos lambda recombinantes. Se preparó una biblioteca de ADNc usando el vector Excell EcoRI/CIP con el "Time Saver ADNc Synthesis Kit" (Pharmacia).

Se sometió la biblioteca a detección selectiva con la sonda obtenida de la región traducida de codificación del fragmento de CD14 genómica bovina por PCR (los detalles se proporcionan más adelante en la sección que describe la preparación de vector de expresión recombinante de baculovirus con fragmento de CD14 bovina). Se marcó la sonda con ^{32}P por síntesis de segunda cadena cebada con hexanucleótido aleatoria (Oligolabelling Kit, Pharmacia Biotech). Se realizaron procedimientos de detección selectiva en condiciones de alta restrictividad (0,1 x SSC, SDS al 1%; 65°C durante 3 horas). Uno de los clones obtenidos (Excell/BoCD14-1) contenía un inserto de 1,4 kb, que se subclonó en pBluescriptSK^{+}, y se secuenció usando subclones pBS/BoCD14 que contenían deleciones unidireccionales solapadas progresivas (Nested Deletion Kit, Pharmacia).

Este clon de ADNc de CD14 bovina consiste en 1.327 pb. Un codón de inicio ATG está seguido por un marco de lectura abierta de 1.116 nt, y un codón de parada TAA en el nucleótido 1.202. El marco de lectura abierta está flanqueado por 82 pb de secuencia 5' sin traducir y 122 pb de secuencia 3' sin traducir. Una señal de poliadenilación, 5'-ATTAAAA-3', se sitúa 105 pb 3' del codón de terminación.

La alineación de las secuencias de CD14 bovina genómica y ADNc revela que son colineales desde el inicio del ADNc 5' hasta el primer y único intrón (88 pb) que se encuentra inmediatamente después del codón de inicio ATG. El resto de la secuencia de codificación es ininterrumpido. Así, la organización intrón-exón descrita anteriormente para CD14 humana y de ratón se conserva precisamente en la CD14 bovina. La comparación de la secuencia de nucleótidos traducida de ADNc de CD14 bovina con la de ADNc de CD14 humana y de ratón reveló el 74,2% y el 62,6% de identidad de nucleótidos en las regiones de codificación, respectivamente (fig. 6).

La estructura primaria de la proteína CD14 bovina se dedujo de la secuencia de ADNc, y consiste en 374 aminoácidos. La primera metionina está seguido por un tramo de 15 restos hidrófobos y/o neutros, típicos de péptidos de señal eucariota. La alineación de las secuencias de aminoácidos de CD14 bovina con CD14 humana y de ratón revela una identidad del 73,1% y el 62,3%, respectivamente (fig. 7). Existen tres sitios de glucosilación potenciales ligados a N (Asn-X-Thr/Ser), todos los cuales se conservan en la CD14 humana y de ratón. Por otra parte, la CD14 bovina contiene 10 motivos de repetición ricos en leucina (LXXLXL), comunes para CD14 humana y de ratón (J. Immunol. 145:331, 1990).

Expresión de CD14 bovina recombinante en células de insecto

En la preparación de fragmentos de ADN para producir proteínas CD14 recombinantes, se generaron fragmentos de longitud completa de regiones traducidas de CD14 por PCR. Se diseñaron conjuntos específicos de cebadores de PCR basándose en la información de las secuencias obtenidas de ADNc de CD14 bovina. El cebador de PCR para el extremo 5' contenía: dos secuencias de reconocimiento para NHeI; una secuencia de Kozak; un codón de inicio ATG; y los primeros 17-21 nucleótidos de región de codificación traducida. El cebador de PCR para el extremo 3' contenía: dos secuencias de reconocimiento para NheI; y los últimos 21-24 nucleótidos de región de codificación traducida hasta y excluyendo el codón de parada TAA (fig. 8A).

La región traducida de CD14 bovina se amplificó usando el fragmento de CD14 genómica EcoRI-XhoI de 7,1 kb (ver anteriormente) como plantilla. La PCR se efectuó usando Pwo ADN polimerasa (Boehringer). La amplificación se realizó añadiendo 5 ng de ADN plantilla, Tris-HCl 10 mM pH 8,85, KCl 25 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5 mM, MgSO_{4} 2 mM, 250 mM de cada dNTP, 250 nM de cada cebador, y 5 unidades de Pwo ADN polimerasa, en un volumen final de 100 \mul. Las muestras se amplificaron para 30 ciclos a temperatura de apareamiento de 70°C usando un ciclador térmico de ADN (Perkin Elmer).

Los fragmentos amplificados se digirieron con NheI, y se subclonaron individualmente en sentido descendente desde el promotor de polihedrina en el vector de transferencia de baculovirus pETL-HA (C. Richardson, OCI/Amgen). Este vector se obtiene de pETL (Methods in Molecular Biology 39:161, 1995), y contiene un fragmento de ADN NheI-BamHI 3' de 30 pb que codifica un nonapéptido obtenido de hemaglutinina de influenza (HA), seguido por el codón de parada TAG (5'-TAC CAA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT TAG-3') (ID SEC Nº: 13). Los vectores de transferencia recombinantes se cotransfectaron individualmente con el virus de polihedrosis nuclear Autographa californica baculovirus de tipo silvestre (AcMNPV, Linear Transfection Module, Invitrogen) en células Sf9 (Methods in Molecular Biology 39:161, 1995). Los clones de baculovirus recombinante se seleccionaron y purificaron según protocolos establecidos (Methods in Molecular Biology 39:161, 1995). Las células Sf9 se infectaron con baculovirus recombinante en una multiplicidad de 5-10:1.

Se realizó un análisis de curso temporal para determinar el periodo de tiempo óptimo requerido para que las células Sf9 infectadas secretaran proteínas CD14 recombinantes. Los análisis de inmunotransferencia del medio celular tomados en diferentes puntos de tiempo usando el anticuerpo monoclonal anti-HA 12CA5 (Cell 57:787, 1984) revelaron que la expresión de proteínas CD14 recombinantes alcanzó el nivel máximo en 96 horas. Este periodo se eligió en experimentos posteriores para la producción de proteínas recombinantes para bioensayo (ver más adelante). En la fig. 9 se ilustra el análisis de transferencia Western de CD14 bovina recombinante obtenida de Sf9.

Expresión de CD14 bovina recombinante en células de mamíferos

Los autores de la invención han usado una versión modificada del Vector de Expresión de Mamífero Episómico pBPV (Pharmacia) para expresión estable de CD14 bovina recombinante en células de mamífero. Para permitir la selección directa de células transformadas, se modificó el pBPV incluyendo un gen de resistencia a neomicina, que se insertó 3,4 kb en dirección ascendente de la casete de expresión. Hacia este extremo, se subclonó un fragmento HindIII-XBaI de 1,95 kb de pBCMGSneo (Eur. J. Immunol. 18:98, 1988) en pCRII (Invitrogen). El constructo recombinante, pCRII-neo, se purificó, y se amplificó el fragmento clonado por PCR. Se designaron cebadores de PCR de manera que la secuencia de reconocimiento para SalI se incluyó en los extremos 5' y 3'. Las secuencias de cebador fueron complementarias a la región de poliligador del vector pCRII, flanqueando a los sitios de clonación de HindIII (Cebador A) y a XBaI (Cebador B).

Cebador A:	5'-GCA GTC GAC ACT ATA GAA TAC TCA AGC-3'	(ID SEC Nº: 14)

Cebador B:	5'-TTC GTC GAC ATT GGG CCC TCT AGA-3'	(ID SEC Nº:15)

El producto final se digirió con SalI, se purificó con gel y se subclonó en el sitio de clonación SalI de pBPV en la misma orientación de transcripción que la de la casete de expresión contenida. Se generaron preparados de plásmido del vector de expresión modificado, pBPVneo-13, (Plasmid Maxi Kit, Quiagen).

Se preparó un fragmento de ADN que codifica la región traducida de CD14 bovina por amplificación de PCR del gen en el vector pETL-HA. El cebador de PCR del extremo 5' usado en la reacción de amplificación incluía: una secuencia de reconocimiento XhoI; seguido por una secuencia de reconocimiento NheI (presente en el vector pETI-HA); una secuencia de Kozak; un codón de inicio ATG; y los primeros 11 a 13 nucleótidos de la región traducida. El cebador de PCR principal para el extremo 3’ contenía la secuencia de codificación HA que se extendió, como para las secuencias 5', con la inclusión de una secuencia de reconocimiento XhoI. Los cebadores se muestran
en la fig. 8B.

Se efectuó PCR usando Pwo ADN polimerasa (Boehringer Mannheim). Las amplificaciones se realizaron añadiendo 5 ng de plantilla de ADN, Tris-HCl 10 mM pH 8,85, KCl 25 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5 mM, MgSO_{4} 2 mM, 250 mM de cada dNTP, 250 nM de cada cebador y 5 unidades de Pwo ADN polimerasa en un volumen final de 100 \muL. Las muestras se amplificaron para 30 ciclos a temperatura de apareamiento de 70°C usando un ciclador térmico de ADN (Perkin Elmer).

Los fragmentos amplificados se digirieron con XhoI y se purificaron con gel. A continuación, estos fragmentos se subclonaron en pBPVneo-13 en sentido descendente del promotor I de metalotioneína de ratón. Antes de la subclonación, pBPVneo-13 se pretrató con la enzima de restricción apropiada, y se desfosforiló usando fosfatasa intestinal de ternera. Se prepararon plásmidos recombinantes usando un Plasmid Maxi Kit (Quiagen).

El plásmido recombinante (pBPVneo13-BoCD14) se transfectó en la línea celular de tumor mamario del ratón, C127 (PNAS 78:2727, 1981), usando 20 \mug de ADN/10^{7} células. La transferencia de ADN se logró por electroporación a 960 \muF/280 V usando un pulsador de genes (Bio-Rad Laboratories). Los transformantes estables se seleccionaron en presencia de 1,5 mg/ml de G418 (Life Technologies).

Los transfectantes que expresan altos niveles de CD14 de membrana (las C127 no transfectadas son negativas para CD14) se enriquecieron por tinción de inmunofluorescencia seguido por clasificación de células activadas por fluorescencia usando un Becton Dickinson FACStar Plus. El nivel de expresión de membrana de la proteína exógena se correlacionaba bien con la cantidad de CD14 secretada rescatada en sobrenadantes de 58 horas de cultivos confluentes de células C127 transfectadas. A diferencia de la purificación de material recombinante generado en células de insecto, no se encontró posible purificar de afinidad el material obtenido de C127 usando columnas de afinidad 12CA5-Sefarosa. Esto podría deberse a la pérdida de la marca HA del terminal C en las proteínas recombinantes obtenidas de células C127. Como consecuencia, la CD14 bovina recombinante obtenida de C127 se purificó de afinidad en 842-Sefarosa. En la fig. 9 se ilustra el análisis de inmunotransferencia de CD14 bovina recombinante obtenida de células C127.

Actividades comparativas de promoción de crecimiento y diferenciación de nBo-LAIT y LPS

Los resultados mostrados en la fig. 10 ilustran que la Bo-LAIT nativa apoya el crecimiento de células B esplénicas murinas en reposo de alta densidad de flotación con eficacias de aproximadamente 200 veces más que la de LPS. Así, nBo-LAIT a 50 ng/ml da como resultado la inducción de síntesis de ADN comparable a la observada en presencia de 10 \mug/ml de LPS.

La capacidad de nBo-LAIT para inducir crecimiento de células B corre en paralelo con su capacidad de inducir la diferenciación de células B murinas en reposo de alta densidad de flotación para secreción de inmunoglobulina. Según se ilustra en la fig. 11, la cantidad de IgM acumulativa inducida por 500 ng/ml de nBo-LAIT es comparable a la inducida por 10 \mug/ml de LPS. Se evaluó la cantidad de secreción de IgM dentro de un periodo de cultivo de 24 horas. 500 ng/ml de nBo-LAIT indujeron 956 \pm 10 ng/ml; 754 \pm 8,7 ng/ml; y 25 \pm 1,4 ng/ml de IgM dentro de los periodos de cultivo de 24 horas de 48 a 72 horas; 72 a 98 horas; y 96 a 120 horas, respectivamente. Los valores correspondientes obtenidos de cultivos estimulados con 10 \mug/ml de LPS fueron: 1.442 \pm 71 ng/ml; 874 \pm 32 ng/ml; y 183 \pm 3 ng/ml, respectivamente. Así, nBo-LAIT tiene la capacidad de inducir células B murinas en reposo de alta densidad de flotación para secreción de inmunoglobulina a velocidades comparable a las observadas cuando las células B se estimulan con el estímulo más potente conocido en la actualidad. Además, tiene la capacidad de hacerlo a concentraciones del 1 al 10% de las de LPS.

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También se evaluó la capacidad de nBo-LAIT para inducir cambio de isotipo de células B en reposo murinas. También se valoraron los sobrenadantes obtenidos de los cultivos descritos anteriormente para ver presencia de isotipos de IgG. Se observó que 500 ng/ml de nBo-LAIT y 10 \mug/ml de LPS indujeron niveles acumulativos (ng/ml en el día 5) de IgG 1: 7,0 \pm 0,1 y 5,6 \pm 0,6; IgG2a: 358 \pm 3 y 406 \pm 8; IgG2b: 8 \pm 1 y 11 \pm 2; IgG3: 75 \pm 5 y 75 \pm 0,5; e IgA: 6,5 \pm 1,5 y 5,0 \pm 0,3, respectivamente. Así, nBo-LAIT tiene la capacidad de inducir algún cambio de isotipo mediante células B murinas en reposo en ausencia de células T.

Actividades comparativas de promoción de crecimiento de proteínas nBo- y rBo-LAIT

Las formas recombinantes de CD14 bovina, tanto las obtenidas de células de insecto como de células de mamífero, tiene la capacidad de inducir el crecimiento de células B murinas en reposo de alta densidad de flotación. Según se ilustra en la fig. 12, rBoCD14 obtenida de células de insecto, y purificada de afinidad en 12CA5-Sefarosa, induce una robusta síntesis de ADN a concentraciones de 0,2 a 3 \mug/ml. La actividad comparable recibió el apoyo del material recombinante obtenido del sistema de expresión de mamífero, y ambas formas recombinantes apoyan el crecimiento de células B en concentraciones de ng/ml, comparables a la actividad observada para nBo-LAIT obtenida de calostro.

La seguridad de que la bioactividad mediada por nBo-LAIT aislada de calostro bovino ya sea por técnicas clásicas de fraccionamiento de proteínas o por purificación de afinidad está mediada por la proteína observada procede de la valoración de la bioactividad mediada por CD14 bovina recombinante. Según se ilustra en la fig. 9, ningunos de los pesos moleculares aparentes de las formas recombinantes de CD14 bovina son idénticos a los de nBo-LAIT. La razón de las diferencias observadas en peso molecular aparente no está clara, pero podría deberse a distintas modificaciones co- y/o post-traduccionales, distintos tamaños de las proteínas principales o ambas cosas. La CD14 soluble obtenida de monocitos ha sido documentada y puede generarse en uno de tres mecanismos conocidos en la actualidad, cada uno de los cuales daría como resultado proteínas de distinto peso molecular. Puede secretarse como una molécula de longitud completa (Eur. J. Immunol. 23:2144, 1993; Eur. J. Immunol. 25:604. 1995), la forma unida por GPI expresada por membrana puede escindirse por fosfolipasas (J. Immunol. 141:547, 1988; EMBO J. 13:1741, 1994), y la forma unida por GPI expresada por membrana puede escindirse por serina/treonina proteasas, expresadas en su caso en la membrana exterior de plasma del monocito en sí, y activarse en modos todavía no caracterizados (J. Immunol. 147:1567, 1991). Aún queda por determinar si los distintos pesos moleculares aparentes de las rBo-LAIT y la nBo-LAIT obtenida de calostro se deben a distintas modificaciones co- y/o post-traduccionales de los materiales recombinantes apoyados por sus respectivos sistemas de expresión, o distintos tamaños de las proteínas principales, o ambas cosas.

La actividad de promoción de crecimiento de nBo-LAIT es específica de células B

Habiendo observado las bioactividades de nBo-LAIT en células B murinas, se examinaron los efectos en la fisiología de las células T murinas. El hecho de que las células B purificadas aisladas respondan a nBo-LAIT no excluye la posibilidad de que la Bo-LAIT pueda activar también las células T.

Las células T de nódulos linfáticos se aislaron por selección negativa en columnas anti-Ig (Biotex Labora) según se ha descrito anteriormente (Eur. J. Immunol. 24:967, 1994). La población efluente resultante contenía > 95% de células CD3^{+} y > 0,5% mlg^{+} de células evaluado por tinción de inmunofluorescencia y análisis FACS. Se aislaron células B esplénicas de alta densidad de flotación de los mismos ratones, y se valoraron las células T de nódulos linfáticos y las células B esplénicas para ver su capacidad de respuesta a nBo-LAIT. La pureza de estas poblaciones evaluada funcionalmente por análisis de sus respuestas a LPS mitógenos específicos de células B, y la concavalina A mitógena específica de células T (ConA). Según se ilustra en el panel derecho de la fig. 13, las células B, pero no las células T, respondieron con síntesis de ADN robusta a LPS, mientras las células T, pero no las células B, respondieron a ConA. Según se ilustra en el panel izquierdo, las células T no respondieron a nBo-LAIT en el intervalo de dosis ensayado, mientras las células B respondieron a nBo-LAIT a concentraciones de 10 ng/ml y superiores.

Crecimiento de células B inducido por proteína LAIT y suero bovino fetal

Se ha demostrado recientemente que los monocitos responden a CD14 soluble (CD14s) aislada de la orina de pacientes nefróticos con la producción de citocinas proinflamatorias (Eur. J. Immunol. 24:17790, 1994), en ausencia de suero obtenido de proteína de unión a lipopolisacáridos (LBP). En cambio, la capacidad de bajas concentraciones de LPS de estimular la producción de estas mismas citocinas por CD14 que expresa monocitos es dependiente del suero (J. Exp. Med. 176:719, 1992). Esta dependencia del suero se supera a altas concentraciones de LPS. Así, la producción de citocina por monocitos inducida por 10 ng/ml de LPS depende estrictamente del suero/LBP, pero la inducida por 50 \mug/ml de LPS no.

Para determinar si la presencia de suero bovino fetal LPB afectaría a la capacidad de bajas concentraciones de nBo-LAIT de inducir el crecimiento de células B murinas de alta densidad de flotación, la respuesta provocada por 500 ng/ml de nBo-LAIT evaluada en un amplio intervalo de concentraciones de SBF, en comparación con la inducida por 50 \mug/ml de LPS. Según se ilustra en la fig. 14, las respuestas de célula B a estos dos estímulos no se vieron afectados por la presencia de hasta el 9% de SBF presente en el medio de cultivo.

Crecimiento de células B inducido por proteína LAIT y CD14m

La sensibilidad diferencial de las células B y los monocitos a activación mediada por LPS podría estar relacionada con la expresión de CD14 de membrana (CD14m) por los últimos. Se ha demostrado directamente que la sensibilidad de activación mediada por LPS puede potenciarse espectacularmente por la presencia de CD14m en las células de respuesta. Específicamente, se ha demostrado que la sensibilidad de una línea de células pre-B negativas CD14m a LPS se incrementa aproximadamente en mil veces con respecto a la expresión forzada de CD14m unida a GPI exógena (J. Exp. Med. 175:1697, 1992). Sigue siendo objeto de debate si las células B primarias expresan CD14m. La alta actividad específica de Bo-LAIT con respecto a la de LPS en la activación de células B es coherente con el hecho de que su modo de activación sea independiente de la expresión de CD14m.

Para valorar directamente la implicación de la expresión de CD14m en la activación de células B mediada por Bo-LAIT, se evaluó la presencia de ARNm específico de CD14 en las poblaciones de células B murinas de alta densidad de flotación usadas como respondedores. El ARN total de 10^{7} células de cada una de las tres poblaciones obtenidas del bazo: esplenocitos no fraccionados; células de alta densidad de flotación, fraccionadas Percoll, agotadas en T, las usadas rutinariamente en ensayos de crecimiento mediados por proteínas LAIT; y células de expresión de Ig de membrana aisladas de la población agotada en T de alta densidad de flotación por marcado de inmunofluorescencia con AmC de rata conjugado por FITC específico para Igk de ratón [187.1 Hybridoma 1:5, 1981)] y posterior purificación usando un clasificador celular Becton Dickinson FACStar Plus. Según se ilustra en la fig. 15, estas tres poblaciones contenían el 59,2%; el 83,5%; y el 99,8% de células mlg^{+}. El ARN aislado de estas poblaciones se resolvió en un gel de formaldehído al 1,2%, y se transfirió a una membrana de nailon (GeneScreen), se reticuló, se prehibridó y se hibridó con dos sondas, secuencialmente.

La sonda de CD14 de ratón se obtuvo por PCR de ADN genómico. Específicamente, la amplificación se realizó añadiendo Pwo ADN polimerasa (Boehringer Mannheim) a 0,4 \mug de ADN genómico Balb/c con el cebador directo: 5'-CTA GAA TTC TCT CCC GCC CCA CCA GAG CCC TGC G-3' (ID SEC Nº: 11); y cebador inverso: 5'-CTA GAA TTC TfA AAC AAA GAG GCG ATC TCC TAG G-3' (ID SEC Nº: 12). La muestra se amplificó para 30 ciclos en un ciclador térmico de ADN (Perkin Elmer) usando una temperatura de apareamiento de 55°C. El fragmento amplificado se resolvió por electroforesis de gel de agarosa, se escindió del gel y se purificó. Se usó una sonda L32 (Nucl. Acid. Res. 16: 10751, 1988) para normalizar la carga de ARN. Cada sonda (100 ng) se marcó usando un kit de oligomarcado (Pharmacia) para una actividad específica de 0,2 a 1 x 10^{9} cpm/\mug de ADN. Se sondearon las membranas y se lavaron en 0,2 x SSC, SDS al 1% a 65°C durante 2 horas, y se expusieron.

Según se ilustra en la fig. 15, el ARN obtenido de los esplenocitos no fraccionados y de los esplenocitos de alta densidad de flotación agotados en T contenía ARNm específico de CD14, mientras que las células B purificadas por FACS no. La señal de CD14 en los esplenocitos de alta densidad de flotación agotados en T, en lo sucesivo denominados células B en reposo, se debe probablemente a monocitos contaminantes, ya que estas poblaciones son del 85 al 90% mlg^{+}, pero > 98% CMH Clase II+ según se evalúa por tinción de inmunofluorescencia y análisis FACS. Por tanto, es posible que el crecimiento mediado por Bo-LAIT de células B en esta población sea indirecto, y está mediado a través de la activación de monocitos contenidos.

Se comparó la respuesta de esplenocitos fraccionados Percoll agotados en T y células mlg^{+} purificadas por FACS obtenidos en esta población para nBo-LAIT, y el crecimiento inducido por LPS. Según se ilustra en la fig. 16, ambas poblaciones respondieron robustamente a los dos estímulos. Los índices de estimulación 10 veces superiores obtenidos con poblaciones de células B puras al 99,8% se debieron al sustrato no estimulado reducido observado en estos cultivos (fig. 16).

Crecimiento de células B inducido por proteína LAIT y CD40

Según se describe anteriormente, se ha observado que los AcM específicos para CD40, que se expresan en la membrana de células B, inducen crecimiento de células B murinas (Sem. in Immunol. 6:267, 1994; PNAS 83:4494, 1986; J. Immunol. 140:1425, 1988).

Para determinar si existe alguna relación entre activación de células B inducida por anti-CD40 y proteína LAIT, se examinó la capacidad de rBo-LAIT para estimular el crecimiento de células B esplénicas de alta densidad de flotación aisladas de ratones convencionales C57BL/6 o de ratones C578L/6 en los que se extirpó la expresión de CD40 a través de una disrupción de gen diana (inmunidad 1:167, 1994). Según se ilustra en la fig. 17, no se observaron diferencias en las respuestas de estas células B durante el intervalo de concentración de rBo-LAIT ensayado.

Estos resultados indican que la CD40 en sí no está implicada necesariamente en la señalización de proteínas LAIT, pero no puede excluirse la posibilidad de que se compartan segundos sistemas generadores mensajeros usados por CD40 y el posible receptor de membrana para proteína LAIT.

Análisis comparativo de CD14 nativa humana, bovina y murina

Habiendo observado las actividades de nBo-LAIT y rBoCD14 en las células B murinas, se examinaron las actividades de CD14 de ratón (Mo) y CD14 humana (Hu) aisladas de fluidos distintos de calostro. Se ha demostrado que la Hu-CD14 está presente en la orina de pacientes nefróticos (Eur. J. Immunol. 24:1779, 1994). La Hu-CD14 se aisló usando un protocolo modificado. Se hizo precipitar orina añadiendo (NH_{4})_{2}SO_{4} saturado para una concentración final del 45% (v/v), y se aclaró el precipitado por centrifugado a 14.000 g durante 30 minutos. A continuación se aumentó la concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} en el sobrenadante de este giro al 75% (v/v). Se sedimentó el precipitado a 14.000 g durante 30 minutos, y se solubilizó en tampón TN de pH 8,0 que contenía Tris 10 mM, NaCl 150 mM y cóctel inhibidor de proteasa "completo" (Boehringer Mannheim). El material insoluble se aclaró por centrifugado a 13.000 g durante 15 minutos. Se desaló el sobrenadante de este giro en columnas G-10 (BioRad) equilibradas en tampón de TN de pH 8,0. A continuación se hizo pasar este material sobre Sefarosa 4B a la que se había conjugado AcM específico de CD14 humana, 3C10 (J. Exp. Med. 15:126, 1983). Se eluyó el material ligado en acetato 100 mM, NaCl 150 mM, pH 2,8, y se neutralizó inmediatamente añadiendo un décimo volumen de Tris 1 M, pH 8,0. Se concentró el eluato en un concentrador por vacío y centrifugado, y se determinó la concentración de proteína colorimétricamente.

Se aisló CD14 murina del sobrenadante del OKT3 de hibridoma de ratón (PNAS EE.UU. 77:4914, 1980). Durante un análisis de detección selectiva de poblaciones celulares para la expresión de ARNm específico de CD14, se observó que todos los hibridomas sometidos a ensayo contenían mensajes. Se deduce que si el donante y el compañero de fusión eran ambos de origen murino, la CD14 producida también sería de origen murino. El OKT3 de hibridoma satisface estos criterios. Para valorar si la proteína CD14 se estaba produciendo por OKT3, y en cantidades suficientes para permitir el aislamiento, se purificó de afinidad el material contenido en 1 litro de sobrenadante de cultivo de OKT3 en 3C10-Sefarosa según se describe anteriormente para CD14 obtenida de orina humana. Se ha cartografiado la especificidad de 3C10 a los restos 7-10 de CD14 humana (J. Biol. Chem. 270:361, 1995). Estos restos se conservan altamente en CD14 bovina y murina.

El panel izquierdo de la fig. 18 ilustra un análisis comparativo de tinción de plata de 1 \mug cada CD14 de orina humana purificada de afinidad (nHu), CD14 bovina de calostro (nBo) y CD14 de ratón obtenida de OKT3 (nMo). El panel derecho de la fig. 18 ilustra un análisis comparativo de inmunotransferencia de 250 ng de cada una de las mismas tres especies de CD14, sondeadas con AcM 3C10. Según se ilustra, la pureza de los tres preparados era comparable, así como su reactividad con AcM 3C10.

Las discrepancias aparentes en los pesos moleculares de CD14 de las tres especies con las diferencias en el número de aminoácidos codificados por sus ADNc respectivos podría deberse a modificación co- y/o post-traduccional. En este contexto, parece que las CD14 de ratón, humana y bovina contienen cinco, cuatro y tres sitios potenciales de N-glucosilación, respectivamente.

Se evaluó la capacidad de estos tres preparados de CD14 para estimular el crecimiento de células B murinas. Según se ilustra en la fig. 19, la CD14 aislada de las tres especies tenía una actividad específica comparable, y estaba activa en el intervalo de concentración de ng/ml. Los resultados demuestran también que el material isogénico es funcional, específicamente, la CD14 murina puede estimular células B murinas. Los resultados también demuestran que la CD14 de calostro no es peculiar en su capacidad de estimular células B, y así no es probable que exista una forma especial de la molécula que se genere en las circunstancias especializadas de la lactancia.

Actividad de promoción de crecimiento de nBo-LAIT en células B de sangre de cordón umbilical humano

Habiendo observado una variedad de bioactividades de nBo-LAIT en células B murinas, se examinaron los efectos en la fisiología de células B humanas. Se usaron dos fuentes de células B. Como un posible papel de la proteína LAIT es la implicación en la potenciación del desarrollo del sistema inmunitario neonatal, se evaluó su capacidad de estimular el crecimiento de células B obtenidas del neonato, específicamente, las aisladas a partir de sangre del cordón umbilical.

La sangre del cordón umbilical se diluyó al 1:1 en solución salina de tampón de fosfato (PBS), y se superpuso en Percoll (Pharmacia), \rho = 1,077. Se centrifugó el gradiente según se describe en conexión con la fig. 1A. Se recogió la interfaz de \rho = 1,077/1,000 y se lavó dos veces en PBS suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 5%. A continuación se tiñó el preparado resultante de leucocitos con AcM conjugado con fluoresceína específico para el marcador de membrana de células B CD72. A continuación se seleccionaron positivamente leucocitos de cordón umbilical positivos CD72 por FACS, de lo que se obtuvieron purezas de > 98%. Estas células B seleccionadas positivamente se cultivaron a continuación en medio definido libre de suero, como para las células B murinas. La única diferencia en los ensayos de crecimiento para células B murinas y humanas fue que las últimas se sometieron a impulsos con timidina a las 60 horas, durante 12 horas, en vez de a las 40 horas, durante 6 horas.

Según se ilustra en la fig. 20A, la nBo-LAIT actúa con AcM específico para Ig\kappa e Ig\lambda en su capacidad para inducir el crecimiento de células B neonatales. Mientras ambos AcM de anti-cadena ligera (ligados a placa) inmovilizados y 2 \mug/ml de nBo-LAIT inducen un aumento en la captación de timidina sobre el sustrato, individualmente, la combinación de los dos apoyó un aumento adicional de 5 veces. Estos resultados indican que puede ser posible que la proteína LAIT consumida por las funciones neonatales de lactancia materna actúe como un sustitutivo de células T en ayuda de las células B estimulantes que han encontrado antígeno para crecer y diferenciarse en células secretoras de Ig, en ausencia de un compartimiento de células T plenamente desarrolladas (J. Exp. Med. 169:2149, 1989; Science 245:749, 1989; Intl. Immunol. 2:859, 1890; Intl. Immunol. 2:869, 1990).

CD14 en suero normal y de calostro humano

Para determinar la concentración de CD14 presente en suero normal y de calostro, se sometieron a ensayo muestras de calostro de dos donantes y muestras de suero de cinco donantes sanos, para ver la presencia de CD14 usando un ELISA específico (IBL-Hamburgo). Según se muestra en la Tabla 3, el suero de esta cohorte de individuos sanos contenía concentraciones de CD14 comprendidas entre 1,7 y 3,2 \mug/ml, y era independiente del género. Estos valores se corresponden bien con los comunicados por Grunwald y col. (J. Immunol. Method 155:225, 1992).

5

Según se ilustra en la fig. 21, el contenido en CD14 en calostro tomado a las 22 horas después del parto (A.D.), y la primera leche materna tomada a los cuatro días después del parto (S.B.), contenían aproximadamente concentraciones de CD14 multiplicadas por 20 con respecto a suero normal. Se obtuvieron muestras múltiples que se extendían a 78 días después del parto de una donante (S.B.), y mientras las concentraciones de CD14 descendieron considerablemente en comparación con las observadas en el día 4, siguieron siendo aproximadamente de 3 a 5 veces más altas que las observadas en suero normal, a lo largo de todo el periodo de detección selectiva ensayado (fig. 21).

Todavía no hay información disponible relativa a la concentración de CD14 en suero en mujeres lactantes. Así, aún queda por determinar si las altas concentraciones de CD14 observadas en calostro y leche materna están restringidas a estos fluidos, o reflejan un aumento generalizado en la concentración de CD14 en todos los fluidos corporales de las mujeres lactantes.

Puede suceder que la exposición temporal del sistema inmunitario neonatal a la actividad de crecimiento y diferenciación trópica de células B de CD14 de calostro desempeñe un papel en el desarrollo de la maquinaria de la respuesta inmunitaria neonatal. La relevancia fisiológica de la presencia de esta actividad en el calostro es coherente con la observación de que, según se describe anteriormente, la función de las células T en el neonato está comprometida, posiblemente debido a la presencia de altas concentraciones de TGF\beta1 y TGF\beta2 en el calostro y la primera leche materna (J. Cell. Biol. 105:1039, 1987; Cell 49:437, 1987; EMBO J. 6:1633, 1987). Según se muestra en la Tabla 2, las concentraciones submitogénicas de CD14 en combinación con concentraciones submitogénicas de AcM específico para inmunoglobulina de membrana, apoyan la activación de células B. La CD14 podría funcionar como un sustitutivo de células T dentro del sistema inmunitario neonatal en desarrollo. De esta forma, un neonato puede beneficiarse del uso de CD14 como un aditivo de leche de fórmula para lactantes por exposición a sus efectos inmunoestimulantes ausentes de la leche de fórmula sintética.

Actividad de promoción de crecimiento de nBo-LAIT en células B de amígdalas humanas

Se evaluó la bioactividad de nBo-LAIT en células B aisladas de adultos, en aislamiento, y en combinación con AcM de anti-cadena ligera (unidos a placa) inmovilizados, para estimular células B aisladas de las amígdalas humanas.

Se prepararon células B de amígdalas por selección negativa. Se prepararon leucocitos de amígdalas del mismo modo que para leucocitos de sangre del cordón umbilical. La población resultante se marcó con AcM biotinilado específico para CD3e (Becton Dickenson), seguido por marcado con hierro que contenía "microperlas" (Becton Dickenson). Después de un lavado, se hizo pasar la población marcada a través de un MACS (Becton Dickenson), y se recogió el efluente. Esta población contenía < 1% de células T y > 97% de células B según se evaluó por tinción de inmunofluorescencia con AcM específicos de linaje. Estas células B se sometieron a continuación a más fraccionamiento en gradientes de densidad discontinuos Percoll, idénticos a los usados para el aislamiento de células B murinas de alta densidad de flotación. Los ensayos descritos usaron esas bandas de células B en la interfaz de \rho = 1,085/1,079. Estas células B en reposo fraccionadas por densidad seleccionadas negativamente se cultivaron según se describe a continuación, se sometieron a impulsos y se recogieron del mismo modo que para células B de sangre del cordón umbilical.

Según se ilustra en la fig. 20B, y en contraste con los resultados obtenidos con células B aisladas de neonatos, nBo-LAIT, en aislamiento, presente a concentraciones tan bajas como 300 ng/ml estimularon el crecimiento robusto de estas células B de amígdalas en reposo. Además, la respuesta a algunas concentraciones de nBo-LAIT se potenció sustancialmente cuando se valoró en combinación con AcM de anti-cadena ligera inmovilizados (fig. 20B).

Las células B humanas maduras son susceptibles a las actividades de promoción de crecimiento de nBo-LAIT, que se amplifican en combinación con la ligadura simultánea del receptor de antígenos de células B. Estos resultados caracterizan el uso potencial de la proteína LAIT en vehículos de vacuna, en ayuda para aumentar su adyuvancia, o reduciendo posiblemente la necesidad de adyuvantes.

Una limitación de la tecnología de vacunación es la inmunogenicidad de un preparado de antígenos particular. Se piensa que ciertos adyuvantes actúan reclutando y activando células T específicas de antígenos. La CD14, como un sustitutivo de células T para respuestas de células B específicas de antígeno, puede proporcionar un medio mejorado de activar células B específicas de antígeno de manera que no sólo se expandan y diferencien en células secretoras de anticuerpos, sino que, una vez activadas, actuarían como CPA eficaz para el reclutamiento de células T. Esto potenciaría tanto la propagación de la respuesta inmunitaria específica como el cambio de isotipo mediado por células T.

Las inmunodeficiencias de células T son conocidas. Se han caracterizado estados de inmunodeficiencia asociados con disfunción de células T debido a la falta de expresión de gp39 (CD40L) (que cartografía el cromosoma X): (i) síndrome de hiper IgM ligado al cromosoma X (HIM); (ii) inmunodeficiencia variable común (IVC); y (iii) agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA). En algunos de estos estados de enfermedad (HIM), las células T aisladas de pacientes han demostrado ser incapaces de activar células B (Science 259:990, 19931, y este fenotipo se correlaciona con ausencia de gp39 funcional (CD40L). En estas circunstancias, CD14, ya sea como diana para la inducción de respuestas humorales específicas, o administrado como un activador de células B policlonal funcionaría para inducir/mantener los niveles de Ig isogénica en coherencia con la protección contra la barrera diaria de patógenos ambientales potenciales.

La presencia de CD14 en calostro es coherente con su papel en la estimulación de células B dentro del neonato lactante. La eficacia de CD14 para ayudar al desarrollo de los sistemas inmunitarios de los neonatos puede evaluarse en un modelo animal.

Las hembras con deficiencia en CD14, creadas a través de disrupción diana del locus de CD14, se acoplarán con sus heterocigotos, o machos con deficiencia en CD14. Así se permitirá la evaluación de los efectos de ausencia de CD14 de calostro en el desarrollo de células B en pupas que expresan o no expresan CD14. Específicamente, se comparará la ontogenia de las células B y el desarrollo acumulado de niveles de IgM y IgG en suero, así como la capacidad de estas pupas para montar respuestas inmunitarias específicas.

Además, puede valorarse el papel que desempeña la CD14 del suero (CD14s) en el mantenimiento de niveles circulantes de IgM "natural". Los niveles de IgG e IgM circulantes están bajo un control distinto. La IgG del suero está virtualmente ausente en los ratones criados en un entorno libre de antígenos, mientras que los niveles de IgM no están alterados. Con el fin de abordar el papel potencial de CD14s en la regulación de los niveles de IgM en suero, se criaron gnotobióticamente ratones suficientes y deficientes en CD14 obtenidos de los anteriores apareamientos.

La expresión desregulada de CD14s se asocia con la patología de estados de enfermedad específicos. El nivel de CD14s en el suero de pacientes con artritis reumatoide (AR) es elevado (Clin. Exp. Immunol. 91(2):207, 1993). También se ha comunicado que existe un aumento en el número de monocitos de CD14^{*} activados en el sinovio de pacientes de AR (Br. J. Rheumatol. 29(2):84, 1990; J. Rheumatol. 22(4):600, 1995). Aunque queda por determinar si el nivel de CD14s en el líquido sinovial de pacientes de AR es elevado, los monocitos de CD14^{*}, tras la activación, expresan proteasas asociadas a membrana que pueden escindir la CD14 de membrana, con el resultado de la producción de CD14s (Eur. J. Immunol. 25:604, 1995). En coherencia con la capacidad de CD14s para activar células B humanas, descrita en la presente memoria descriptiva, el líquido sinovial de pacientes de AR contiene altas frecuencias de células B activadas, al menos algunas de las cuales pueden producir factor reumatoide (Clin. Immuno. Immunopathol. 31(2):272, 1984; Clin. Exp. Immunol. 55(1):91, 1984). Así, surge un paradigma, que implica la producción aumentada de CD14s en pacientes de AR, y su posible implicación en la activación de células B resultante en la producción de factor reumatoide. La depuración mediada por anticuerpos de CD14s puede dar, por tanto, como resultado en la mejora de síntomas mediados por desregulación de la activación de células B y la producción de factor reumatoide en pacientes de AR. Además, la depuración mediada por anticuerpos de CD14s mejoraría la inflamación apoyada por la inducción por CD14s de citocinas proinflamatorias por monocitos (Eur. J. Immunol. 24:1779, 1994).

La producción rutinaria de anticuerpos monoclonales humanos (AcM) ha sido difícil por una serie de razones, de las que no es la menor la incapacidad de enriquecer células B humanas activadas de especificidad de antígeno deseada. La capacidad de CD14s para inducir crecimiento y diferenciación de células B humanas in vitro lleva a su posible uso en la producción de AcM específicos de antígenos. Los autores de la invención muestran en la presente memoria descriptiva que CD14s a altas concentraciones (0,5 a 1 \mug/ml) activa células B humanas en una forma policlonal. Sin embargo, se muestra que las concentraciones mitogénicas subóptimas de CD14s cooperan en sinergia con AcM específico para el receptor de células B para antígeno (BcR). Así, las concentraciones subóptimas de CD14s activan preferentemente aquellas células B que reciben una señal complementaria a través del BcR. El AcM específico de BcR actúa como un antígeno sustitutivo en estas circunstancias. Si se impone especificidad en el suministro de la señal BcR, la respuesta consiguiente de células B también sería específica. Así, cuando se sustituye anti-BcR por un antígeno específico, el estímulo sinérgico proporcionado por la presencia simultánea de CD14s se enfocaría en las células B específicas de antígeno, exclusivamente. Así, la producción consiguiente de anticuerpo sería específica del antígeno. Las poblaciones de células B activadas de esta forma se enriquecerían enormemente en células B activadas específicas de antígeno y, por tanto, se facilitaría la producción de AcM secretores de hibridomas humanos de especificidad deseada.

La eficacia de CD14 como un adyuvante en la tecnología de vacunación puede evaluarse usando un modelo animal. Bo- y Hu-CD14 se modificarán con TNP de hapteno. El material haptenado se valorará para ver su capacidad para inducir activación de células B policlonal in vitro, para garantizar que la haptenación no ha alterado la bioactividad de CD14. Los conjugados se inyectarán subcutáneamente, o intramuscularmente, y con el tiempo, se valorará el suero para ver su contenido de anticuerpo específico. Usando otra series de ratones, se recogerá el drenaje de nódulos linfáticos, y las células secretoras de anticuerpo contenidas enumeradas. Además, algunos receptores se inmunizarán con mezclas de cantidades variables de CD14 y proteína o antígeno celular. Se enumerarán las valoraciones de anticuerpos, así como el antígeno específico, y las células secretoras de Ig totales.

La toxicidad de CD14 puede evaluarse en estudios intravenosos agudos en ratones, ratas y monos. Pueden realizarse estudios de irritación subcutánea aguda en ratas, así como estudios a largo plazo que implican múltiples inyecciones subcutáneas e intravenosas en las tres especies. Se realizará una valoración patológica e histopatológica general, así como análisis químicos y hematológicos del suero. Puede valorarse el potencial genotóxico en células de mamífero in vitro, y en un ensayo de micronúcleo de ratón. Puede valorarse el potencial teratogénico en ratones, ratas y monas preñados.

Al administrar CD14 a un sujeto humano, puede emplearse la práctica farmacéutica convencional. Como aditivo a la leche de fórmula para lactantes, puede añadirse a la leche de fórmula en el momento de la fabricación. Puede prepararse como un comprimido o cápsula, o un polvo para mezclar justo antes de la administración. En el caso de preparación de vacunas, puede incluirse como parte de una vacuna preparada según procedimientos por lo demás normalizados. La administración podría ser por cualquier medio conveniente, por ejemplo, administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraventricular, intracraneal, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal u oral.

Las formulaciones parenterales pueden estar en la forma de soluciones o suspensiones líquidas.

Los procedimientos conocidos en la técnica para preparar formulaciones pueden encontrarse, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences". Las formulaciones para administración parenteral pueden contener, por ejemplo, como excipientes agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles como polietilenglicol, aceites vegetales, naftalenos hidrogenados, etc.

La concentración de CD14 para administración variará dependiendo, por ejemplo, de la dosificación que se suministrará y de la vía de administración.

En términos de variación a partir de una secuencia nativa de aminoácidos de CD14, como mínimo, pueden hacerse sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras se describen en la bibliografía de patentes, como por ejemplo, en la patente de Estados Unidos nº 5.2264.558. Se espera así, por ejemplo, que el intercambio entre aminoácidos neutros alifáticos no polares, glicina, alanina, prolina, valina e isoleucina, sean posibles. Análogamente, las sustituciones entre los aminoácidos neutros alifáticos polares, serina, treonina, metionina, asparagina y glutamina podrían prepararse posiblemente. Probablemente podrían hacerse sustituciones entre aminoácidos ácidos cargados, ácido aspártico y ácido glutámico, así como sustituciones entre los aminoácidos básicos cargados, lisina y arginina. También serían probablemente posibles las sustituciones entre los aminoácidos aromáticos, incluyendo fenilalanina, histidina, triptófano y tirosina. Estas clases de sustituciones e intercambios son bien conocidos por los expertos en la materia. Podrían ser muy bien posibles otras sustituciones. Naturalmente, se esperaría también que cuanto mayor fuera el porcentaje de homología de una proteína de variante con una proteína de ocurrencia natural, mayor será la conservación de actividad metabólica.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: The Wellesley Hospital Foundation

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(B): CALLE: 160 Wellesley Street East

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(C): CIUDAD: Toronto

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(D): ESTADO: Ontario

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(E): PAÍS: Canadá

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): M4Y 1J3

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\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: JULIUS, Michael H.

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(B): CALLE: 38 Earl Street, Townhouse nº9

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(C): CIUDAD: Toronto

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(D): ESTADO: Ontario

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(E): PAÍS: Canadá

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): M4Y 1M3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: FILLIPP, Dominik

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(B): CALLE: 704-15 Dundonald Street

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(C): CIUDAD: Toronto

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(D): ESTADO: Ontario

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(E): PAÍS: Canadá

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): M5Y 1K4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: ALIZADEH-KHIAVI, Kamel

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(B): CALLE: 618-1201 Richmond Street

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(C): CIUDAD: London

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(D): ESTADO: Ontario

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Canadá

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): N6A 3L6

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ACTIVACIÓN DE CÉLULAS B

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 15

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(iv): FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE SOPORTE: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versiónnº 1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/CA97/00880

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(vi): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: EE.UU. 08/746.883

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-NOV-1996

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(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.122 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 1:

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6

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(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1.128 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 2:

7

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(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.101 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 3:

8

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(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 373 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 4:

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9

10

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(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 375 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 5:

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11

12

\newpage

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(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 366 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 6:

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14

15

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(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 7:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

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(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"

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(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 7:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTAGCGCTA GCCACCATGG TGTGCGTGCC CTACCTGCT

\hfill

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(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTAGCGCTA GCCGCGAAGC CTCGGGCTCC TTGAAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCGAGCTCG AGGCTAGCCA CCATGGTGTG CGTGCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCGAGCTGA GGGATCCCTA AGCGTAATCT GGACC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAATTCT CTCCCGCCCC ACCAGAGCCC TGCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAATTCT TAAACAAAGA GGCGATCTCC TAGG

\hfill

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACCAATACG ATGTTCCAGA TTACGCTTAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGTCGACA CTATAGAATA CTCAAGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC. Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCGTCGACA TTGGGCCCTC TAGA

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Claims

1. Uso de un polipéptido, variante del mismo, o fragmento de dicho polipéptido o variante del mismo, o un conjugado de dicho polipéptido, variante o fragmento en la fabricación de un medicamento para activar células B a través de contacto directo entre ellas, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia designada como "CD14 bovina" en la fig. 7, la variante es una variante sustituida de forma conservativa de dicho polipéptido en la que la variante activa células B, y dicho fragmento activa células B.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento es una vacuna.

3. Un procedimiento para preparar CD14 bovina que tiene la secuencia de aminoácidos identificada como "CD14 bovina" en la fig. 7 de suero de calostro bovino que comprende el aislamiento del polipéptido a partir del suero.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el procedimiento incluye el aislamiento de dicha CD14 que es una forma modificada co- y/o post-traduccionalmente de dicha proteína.

5. El procedimiento de la reivindicación 3 ó 4, en el que el aislamiento de la CD14 incluye la extracción salina de proteínas a partir de suero de calostro bovino aclarado.

6. El procedimiento de la reivindicación 3, 4 ó 5, en el que el aislamiento de la CD14 incluye el uso de cromatografía de intercambio aniónico.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que aislamiento de la CD14 incluye el uso de cromatografía de columna de filtrado.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que aislamiento de la CD14 incluye el uso de cromatografía de columna de hidroxiapatito.

9. Un procedimiento de activación directa de células B in vitro usando un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos identificada como "CD14 bovina" en la fig. 7, una variante sustituida de forma conservativa del polipéptido en la que la variante activa células B, un fragmento del polipéptido o variante en el que el fragmento activa células B o un conjugado de dicho polipéptido, variante o fragmento.

10. Un procedimiento in vitro para inducir directamente crecimiento y diferenciación de células B en células secretoras de inmunoglobina de alta tasa usando un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos identificada como "CD14 bovina" en la fig. 7, una variante sustituida de forma conservativa del polipéptido en la que la variante induce crecimiento y diferenciación de células B, un fragmento de polipéptido del polipéptido o variante en el que el fragmento induce crecimiento y diferenciación de células B o un conjugado de dicho polipéptido, variante o fragmento.

11. Un procedimiento in vitro de enriquecimiento para células B de mamífero que secretan un anticuerpo monoclonal de una especificidad de antígeno deseado que comprende la activación directa de dichas células B usando un polipéptido, variante, fragmento o conjugado según se define en la reivindicación 9 a niveles subóptimos en concierto con dicho antígeno frente al cual han de actuar los anticuerpos.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que las células B de mamífero son de origen humano.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que las células B de mamífero son de origen murino.

14. Una vacuna que comprende un polipéptido, fragmento, variante o conjugado según se define en la reivindicación 9 y un antígeno distinto de CD14.

15. Uso de un polipéptido, fragmento, variante o conjugado según se define en la reivindicación 9 y de un antígeno distinto de CD14 para la preparación de una vacuna.

16. Un procedimiento de fabricación de una fórmula infantil que comprende la incorporación de un polipéptido, fragmento, variante o conjugado según se define en la reivindicación 9 dentro de la fórmula.

17. Fórmula infantil que comprende un polipéptido, fragmento, variante o conjugado según se define en la reivindicación 9.

18. Un procedimiento de fabricación de una vacuna que contiene un antígeno distinto de CD14 que comprende la incorporación de un polipéptido, fragmento, variante o conjugado según se define en la reivindicación 9 dentro de la fórmula de vacuna.

19. Un procedimiento según la reivindicación 18, que comprende además la etapa de conjugar dicho antígeno y dicho polipéptido, fragmento, variante o conjugado dentro de la fórmula de vacuna.

20. El procedimiento según la reivindicación 18, que comprende además la etapa de mezclado del antígeno y dicho polipéptido, fragmento, variante o conjugado dentro de la fórmula de vacuna.

21. Un kit para la preparación de una vacunación que comprende una cantidad predeterminada de un antígeno distinto de CD14 y una cantidad predeterminada de un polipéptido, fragmento, variante o conjugado según se define en la reivindicación 9.