ES2284199T3 - Receptor 4 que contiene dominio de muerte (dr4:receptor 4 de muerte), miembro de la superfamilia de receptores tnf y union a trail (apo-2l). - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 de longitud completa que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, que incluye la secuencia líder predicha o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.

Description

Receptor 4 que contiene dominio de muerte (DR4: receptor 4 de muerte), miembro de la superfamilia de receptores TNF y unión a trail (APO-2L).

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo miembro de la familia de receptores de factor de necrosis tumoral. Más específicamente, se proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican el Receptor 4 humano que contiene el Dominio de Muerte, denominado algunas veces en la presente memoria "DR4". También se proporcionan polipéptidos de DR4, así como los vectores, células hospedantes y métodos recombinantes para producirlos. La invención también se refiere a métodos de monitorización para identificar

\hbox{agonistas y antagonistas
de la  actividad de DR4.}

Antecedentes de la invención

Muchas acciones biológicas, por ejemplo la respuesta a determinados estímulos y procesos naturales, están controladas por factores, tales como las citoquinas. Muchas citoquinas actúan a través de receptores acoplándose al receptor y produciendo una respuesta intracelular.

Por ejemplo, los factores de necrosis tumoral (TNF) alfa y beta son citoquinas que actúan a través de receptores de TNF para regular numerosos procesos biológicos, incluyendo la protección frente a la infección y la inducción de conmoción y la enfermedad inflamatoria. Las moléculas de TNF pertenecen a la superfamilia de "ligandos de TNF", y actúan junto con sus receptores o contra-ligandos, la superfamilia de "receptores de TNF". Hasta el momento se han identificado nueve miembros de la superfamilia de ligandos de TNF y se han caracterizado diez miembros de la superfamilia de receptores de TNF.

Entre los ligandos se incluyen el TNF-\alpha, la linfotoxina-\alpha (LT-\alpha, también conocida como TNF-\beta), la LT-\beta (descubierta en el heterotrímero complejo LT-\alpha2-\beta), el FasL, el CD40L, el CD27L, el CD30L, el 4-IBBL, el OX40L y el factor de crecimiento de nervio (NGF). La superfamilia de receptores de TNF incluye el receptor p55TNF, el receptor p75TNF, la proteína relacionada con receptor TNF, el antígeno FAS ó APO-1, el CD40, el CD27, el CD30, el 4-IBB, el OX40, el p75 de baja afinidad y el receptor de NGF (Meager, A., Biologicals, 22: 291-295 (1994)).

Muchos miembros de la superfamilia de ligandos de TNF se expresan mediante células T activadas, lo que implica que son necesarios para las interacciones de células T con otros tipos de células que subyacen ontogenia y funciones celulares. (Meager, A., ver anterior).

Se ha conseguido una visión considerable de las funciones esenciales de varios miembros de la familia de receptores de TNF a partir de la identificación y de la creación de mutantes que eliminan la expresión de dichas proteínas. Por ejemplo, las mutaciones naturales del antígeno de FAS y de su ligando provocan la enfermedad linfoproliferativa (Watanabe-Fukunaga, R., y col., Nature 356: 314 (1992)), lo que quizás refleja un fallo en la muerte celular programada. Las mutaciones del ligando CD40 provocan un estado de inmunodeficiencia ligado a X caracterizado por altos niveles de inmunoglobulina M y por bajos niveles de inmunoglobulina G en el plasma, lo que indica un fallo en la activación de células B dependientes de células T (Allen, R.C. y col., Science 259: 990 (1993)). Las mutaciones dirigidas del receptor de factor de crecimiento de nervio de baja afinidad provocan un trastorno que se caracteriza por un fallo en la innovación sensorial de las estructuras periféricas (Lee, K.F. y col., Cell 69: 737 (1992)).

El TNF y la LT-\alpha son capaces de unirse a dos receptores de TNF (los receptores de TNF de 55 y de 75 kd). Un gran número de efectos biológicos provocados por TNF y LT-\alpha, actuando a través de sus receptores, incluyen necrosis hemorrágica de tumores transplantados, citotoxicidad, un papel en el choque endotóxico, inflamación, inmunorregulación, proliferación y respuestas antivirales, así como protección frente a efectos negativos de la radiación ionizante. El TNF y la LT-\alpha están involucrados en la patogénesis de una amplia variedad de enfermedades, incluyendo el choque citotóxico, la malaria cerebral, tumores, la enfermedad autoinmune, el SIDA y el rechazo injerto-hospedante (Beutler, B. y Von Huffel, C., Science 264: 667-668 (1994)). Las mutaciones en el Receptor p55 provocan una susceptibilidad aumentada frente a la infección microbiana.

Además, se presentó un dominio de aproximadamente 80 aminoácidos cerca del extremo C del TNFR1 (p55) y del Fas como el "dominio de muerte", que es responsable de la transducción de señales para la muerte celular programada (Tartaglia y col., Cell 74: 845 (1993)).

La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso fisiológico esencial para el desarrollo normal y para la homeostasis en los organismos multicelulares (H. Steller, Science 267, 1445-1449 (1995)). Los trastornos en la apoptosis contribuyen a la patogénesis de varias enfermedades humanas que incluyen el cáncer, los trastornos neurodegenerativos y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (C.B. Thompson, Science 267, 1456-1462 (1995)). Recientemente, se ha centrado mucho la atención en la transducción de la señal y en la función biológica de dos receptores de muerte de la superficie celular, el Fas/APO-1 y el TNFR-1 (J.L. Cleveland, y col., Cell 81, 479-482 (1995); A. Fraser, y col., Cell 85, 781-784 (1996); S. Nagata, y col., Science 267, 1449-56 (1995)). Los dos son miembros de la familia de receptores de TNF que también incluye el TNFR-2, el NGFR de baja afinidad, el CD40 y el CD30, entre otros (C.A. Smith, y col., Science 248, 1019-23 (1990); M. Tewari, y col., en Modular Texts in Molecular and Cell Biology, M. Purton, Heldin, Carl, Ed. (Chapman & Hall, Londres, 1995). Aunque los miembros de la familia se definen por la presencia de repeticiones ricas en cisteína en sus dominios extracelulares, el Fas/APO-1 y el TNFR-1 también comparten una región de homología intracelular, designada apropiadamente como "dominio de muerte", que está ligeramente relacionado con el gen de suicidio de la Drosófila, segador (P. Golstein, y col., Cell 81, 185-6 (1995); K. White y col., Science 264, 677-83 (1994)). Este dominio de muerte compartido sugiere que ambos receptores interaccionan con un conjunto relacionado de moléculas de transducción de señal que, hasta recientemente, no había sido identificado. La activación de Fas/APO-1 recluta la molécula adaptador que contiene dominio de muerte FADD/MORT1 (A.M. Chinnaiyan, y col., Cell 81, 505-12 (1995); M.P. Boldin, y col., J. Biol Chem 270, 7795-8 (1995); F.C. Kischkel, y col., EMBO 14, 5579-5588 (1995)), que a su vez se une y presumiblemente activa FLICE/MACH1, un miembro de la familia ICE/CED-3 de proteasas pro-apoptóticas (M. Muzio y col., Cell 85, 817-827 (1996); M.P. Boldin, y col., Cell 85, 803-815 (1996)). Aunque el papel central del Fas/APO-1 es activar la muerte celular, el TNFR-1 puede señalizar cualquier conjunto de actividades biológicas diversas, muchas de las cuales parten de su capacidad para activar NF-kB (L.A. Tartaglia, y col., Immunol Today 13, 151-3 (1992)). Del mismo modo, el TNFR-1 recluta la molécula adaptadora multivalente TRADD, que como la FADD también contiene un dominio de muerte (H. Hsu, y col., Cell 81, 495-504 (1995); H. Hsu, y col., Cell 84, 299-308 (1996)). A través de sus asociaciones con una serie de moléculas de señalización que incluyen FADD, TRAF2 y RIP, el TRADD puede señalizar tanto la apoptosis como la activación de NF-kB (H. Hsu, y col., Cell 84, 299-308 (1996); H. Hsu, y col., Immunity 4, 387-396 (1996)).

Recientemente se ha descubierto un nuevo ligando de inducción de apoptosis. Wiley, S.R., y col., se refieren a la nueva molécula como ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF o "TRAIL" (Immunity 3: 673-682 (1995)). Pitti, R.M. y col., se refieren a la nueva molécula como ligando Apo-2 ó "Apo-2L". Esta molécula también fue descrita en la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. con Nº de Serie 60/013405. Para mayor comodidad, en la presente memoria se designa TRAIL.

Al contrario que el ligando FAS cuyos tránscritos parecen estar ampliamente restringidos a las células T estimuladas, en muchos tejidos se observan niveles significativos de TRAIL, y es transcrito constitutivamente por algunas líneas celulares. Se ha demostrado que el TRAIL actúa independientemente del ligando FAS (Wiley, S.R., y col. (1995), ver anteriormente). Los estudios de Marsters, S.A. y col., han indicado que el TRAIL activa rápidamente la apoptosis, en un margen de tiempo similar a la señalización de muerte de FAS/Apo-1L pero mucho más rápido que la apoptosis inducida por TNF (Current Biology, 6: 750-752 (1996)). Todo el trabajo realizado hasta la fecha sugiere que el receptor del TRAIL no es uno de los muchos receptores de TNF conocidos.

Los efectos de los ligandos de la familia de TNF y de los receptores de la familia de TNF son variados e influyen en numerosas funciones, tanto normales como anormales, de los procesos biológicos del sistema mamífero. Existe una clara necesidad, por tanto, por identificar y caracterizar los receptores y ligandos que influyen en la actividad biológica, tanto en estados normales como en estados de enfermedad. En concreto, existe una necesidad por aislar y caracterizar el receptor correspondiente al ligando TRAIL recientemente descubierto.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2), o la secuencia de aminoácidos que codifica el clon de cADN depositado como Depósito ATCC Nº 97853 el 21 de Enero de 1997.

La presente invención también proporciona vectores y células hospedantes para la expresión recombinante de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria, así como los métodos de fabricación de dichos vectores y células hospedantes y el uso de los mismos para la producción de polipéptidos o péptidos DR4 mediante técnicas recombinantes.

La invención proporciona además un polipéptido DR4 aislado que presenta una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido descrito en la presente memoria.

La presente invención también proporciona ensayos diagnósticos tales como ensayos cuantitativos y de diagnosis para la detección de niveles de proteína DR4. De este modo, por ejemplo, se puede usar un ensayo diagnóstico de acuerdo con la invención para la detección de sobre-expresión de DR4, o de una forma soluble de la misma, en comparación con muestras de tejido de control normales, para detectar la presencia de tumores.

Los ligandos de la familia de Factor de Necrosis Tumoral (TNF) son conocidos por encontrarse entre las citoquinas principalmente pleiotrópicas, que inducen un gran número de respuestas celulares, incluyendo citotoxicidad, actividad antiviral, actividades inmunorreguladoras y la regulación transcripcional de varios genes. La respuesta celular a los ligandos de la familia TNF incluye no sólo las respuestas fisiológicas normales, sino también las enfermedades asociadas a la apoptosis incrementada o a la inhibición de la apoptosis. La apoptosis (muerte celular programada) es un mecanismo fisiológico involucrado en la eliminación de linfocitos T periféricos del sistema inmune, y su desregulación puede conducir a una serie de diferentes procesos patogénicos. Las enfermedades asociadas a la supervivencia celular incrementada, o a la inhibición de la apoptosis, incluyen cánceres, trastornos autoinmunes, infecciones víricas, inflamación, enfermedad de injerto contra hospedante, rechazo agudo de injerto, y rechazo crónico de injerto. Las enfermedades asociadas a la apoptosis aumentada incluyen SIDA, trastornos neurodegenerativos, síndromes mielodisplásticos, heridas isquémicas, enfermedad del hígado inducida por toxinas, choque séptico, caquexia y anorexia.

Por tanto, la invención proporciona además un método para potenciar la apoptosis inducida por un ligando de familia de TNF, que implica la administración a una célula que expresa el polipéptido DR4 de una cantidad eficaz de un agonista capaz de aumentar la señalización mediada por DR4. Preferiblemente, la señalización mediada por DR4 se aumenta para tratar una enfermedad en la que se da una apoptosis disminuida.

En un aspecto adicional, la presente invención está dirigida a un método para la inhibición de la apoptosis inducida por un ligando de la familia de TNF, que implica la administración a un célula que expresa el polipéptido DR4 de una cantidad eficaz de un antagonista capaz de disminuir la señalización mediada por DR4. Preferiblemente, la señalización mediada por DR4 se reduce para tratar una enfermedad en la que se da una apoptosis aumentada.

El hecho de que cualquier candidato "agonista" o "antagonista" de la presente invención pueda potenciar o inhibir la apoptosis se puede determinar usando ensayos de respuesta celular ligando/receptor de familia de TNF conocidos en la técnica, incluyendo los descritos con más detalle más adelante. De este modo, en un aspecto adicional, se proporciona un método de escrutinio para determinar si un agonista o antagonista candidato es capaz de potenciar o de inhibir una respuesta celular a un ligando de la familia de TNF. El método incluye poner en contacto células que expresan el polipéptido DR4 con un compuesto candidato y con un ligando de la familia de TNF, ensayar una respuesta celular, y comparar la respuesta celular con una respuesta celular estándar, fijando el ensayo estándar cuando se realiza un contacto con el ligando en ausencia del compuesto candidato, de tal modo que una respuesta celular aumentada sobre el estándar indica que el compuesto candidato es un agonista de la ruta de señalización ligando/receptor, y una respuesta celular reducida en comparación con el estándar indica que el compuesto candidato es un antagonista de la ruta de señalización ligando/receptor. Mediante la invención, se puede poner en contacto una célula que expresa el polipéptido DR4 con un ligando de la familia de TNF administrado endógena o exógenamente.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el nucleótido y la secuencia de aminoácidos deducida de DR4. Se predice que los aminoácidos 1-23 constituyen el péptido señal, los aminoácidos 24-238 constituyen el dominio extracelular, los aminoácidos 239-264 constituyen el dominio transmembrana y los aminoácidos 265-468 constituyen el dominio intracelular, del cual los aminoácidos 379-422 constituyen el dominio de muerte.

La Figura 2 muestra las regiones de similitud entre las secuencias de aminoácido de DR4, el receptor I de factor de necrosis tumoral humano (SEQ ID NO: 3), proteína Fas humana (SEQ ID NO: 4), y el dominio de muerte que contiene el receptor 3 (DR3) (SEQ ID NO: 5).

La Figura 3 muestra un análisis de la secuencia de aminoácidos de DR4. Se muestran regiones alfa, beta, giro y bobina; hidrofilicidad e hidrofobicidad; regiones antipáticas; regiones flexibles; índice antigénico y probabilidad superficial. En el gráfico "Índice Antigénico - Jameson-Wolf", los residuos de aminoácido 35-92, 114-160, 169-240, 267-298, 330-364, 391-404 y 418-465 de la Figura 1 se corresponden con las regiones altamente antigénicas mostradas de la proteína DR4.

La Figura 4 muestra las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ácido nucleico relacionados HTOIY07R (SEQ ID NO: 6) y HTXEY80R (SEQ ID NO: 7).

La Figura 5A y 5B muestran la capacidad de DR4 para inducir apoptosis en las líneas celulares MCF7 y 293. La Figura 5C muestra la capacidad de los inhibidores de proteasa de muerte z-VAD-fmk y CrmA para inhibir la acción apoptótica de DR4.

La Figura 6A muestra la capacidad de una fusión DR4-Fc extracelular soluble para bloquear la capacidad de inducción apoptótica de TRAIL. La Figura 6B muestra la incapacidad de la fusión DR4-Fc extracelular soluble para bloquear la capacidad de inducción apoptótica de TRF-alfa.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido DR4, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2), o un fragmento del polipéptido. El polipéptido DR4 de la presente invención comparte homología de secuencia con TNFR-1, DR3 y ligando Fas (Figura 2). La secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) se obtuvo por secuenciamiento de clones de cADN tales como HCUDS60, que se depositó el 21 de Enero de 1997 en la "American Type Culture Collection", 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, y se le asignó el Número de Acceso 97853. El clon depositado está contenido en plásmido pBK (Stratagene, La Jolla, CA).

Moléculas de ácido nucleico

A no ser que se indique lo contrario, todas las secuencias de nucleótidos determinadas mediante secuenciamiento de una molécula de ADN en la presente memoria fueron determinadas usando un secuenciador de ADN automático (tal como el Modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.), y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por moléculas de ADN determinadas en la presente memoria fueron predichas mediante traducción de una secuencia de ADN determinada como se ha indicado anteriormente. Por tanto, como es aplicable a cualquier secuencia de ADN determinada mediante esta estrategia automatizada, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en la presente memoria puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas automáticamente normalmente son idénticas en al menos un 90%, más típicamente idénticas en al menos entre aproximadamente un 95% y a aproximadamente un 99,9%, a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real se puede determinar con mayor precisión mediante otras técnicas que incluyen métodos de secuenciamiento de ADN manuales bien conocidos en la técnica. Como también es sabido en la técnica, una única inserción o eliminación en una secuencia de nucleótidos determinada en comparación con la secuencia real provocará un cambio estructural en la traducción de la secuencia de nucleótidos, de tal modo que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada realmente por la molécula de ADN secuenciada, comenzando en el punto de dicha inserción o eliminación.

Con proteína o polipéptido "aislado" se pretende indicar un polipéptido o proteína separados de su entorno nativo. Por ejemplo, los polipéptidos y proteínas producidos recombinantemente expresados en células hospedantes se consideran aislados para los propósitos de la invención, al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que han sido purificados sustancialmente empleando cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación de una sola etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67: 31-40 (1988).

Usando la información proporcionada en la presente memoria, tal como la secuencia de aminoácidos especificada en la Figura 1, se puede obtener una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido DR4 usando procedimientos estándar de clonación y de escrutinio, tales como los descritos para clonar cADNs usando mARN como material de partida. Como ejemplo de la invención, el gen de la presente invención también se ha identificado en bibliotecas de cADN de los siguientes tejidos: células amnióticas, corazón, hígado, cáncer, riñón, leucocito, célula T activada, K562 mas PMA, células W138, células Th2, amígdalas humanas y capa leucoplaquetar agotada en CD34 (sangre de cordón).

El gen DR4 contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína madura de aproximadamente 445 residuos de aminoácido cuyo codón de inicio se encuentra en la posición 19-21 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), con una secuencia líder de aproximadamente 23 residuos de aminoácido (es decir, una longitud total de proteína de 468 aminoácidos), y un peso molecular deducido de aproximadamente 50 kDa. De los miembros conocidos de la familia de receptores de TNF, el polipéptido DR4 de la invención comparte el mayor grado de homología con los polipéptidos humanos TNFR1 y DR3 mostrados en la Figura 2, incluyendo una significativa homología de secuencia en los múltiples dominios Ricos en Cisteína.

Además de la homología de secuencia exhibida entre el DR4 y otros receptores que contienen el dominio de muerte, se ha demostrado que el DR4 se une a TRAIL y que induce apoptosis cuando se expresa temporalmente. Se transfectaron células de carcinoma de pecho humano MCF7 y células 293 temporalmente con un constructo que expresaba DR4, tal como se describe en el Ejemplo 5. Como se muestra en las Figura 5A y 5B, una proporción sustancial de las células transfectadas sufrió cambios morfológicos característicos de la apoptosis. Tal como se había anticipado, la eliminación del dominio de muerte acabó con la capacidad del DR4 de iniciar la ruta de muerte. Como se puede observar en la Figura 5C, la apoptosis inducida por DR4 fue bloqueada eficazmente mediante inhibidores de proteasas de muerte que incluyen z-VAD-fmk, un inhibidor de caspasa de amplio espectro irreversible, y CrmA, una serpina codificada por un virus de viruela bovina que inhibe preferentemente caspasas apicales tales como FLICE/MACH-1 (caspasa-8). Puesto que la apoptosis inducida por TNFR-1, CD-95 y DR3 también se ve atenuada por estos mismos inhibidores, es probable que las moléculas efectoras de muerte por debajo sean de naturaleza similar.

Para determinar si el DR4 es capaz de inhibir TRAIL, se expresó el dominio de unión de ligando extracelular del DR4 como una fusión con la región Fc de IgG humano (DR4-Fc). El TRAIL se unió de forma selectiva a DR4-Fc pero no a los correspondientes dominios extracelulares del TNFR-1 o del CD-95, también expresados como fusiones Fc, datos no mostrados. Adicionalmente, el DR4-Fc no se unió a ligando TNF alfa o a ligando Fas en las condiciones en las que ambos ligandos se unen a receptores relacionados.

La capacidad del TRAIL para inducir apoptosis en células MCF7 fue bloqueada específicamente mediante DR4-Fc, pero no se vio influida por TNFR1-Fc, CD95-Fc o por Fc solo (Figura 6A). Además, tal como era de esperar, la apoptosis inducida por TNF alfa fue inhibida por TNFR-1-Fc pero no por DR4-Fc, CD95-Fc o Fc solo (Figura 6B).

Considerados en conjunto, los datos anteriores indican que el DR4 es un receptor que contiene el dominio de muerte con la capacidad de inducir apoptosis, y que es un receptor de TRAIL, un conocido ligando inductor de apoptosis.

Tal como se ha indicado, la presente invención proporciona la(s) forma(s) madura(s) de la proteína DR4 de la presente invención. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas segregadas por las células de mamífero presentan una secuencia señal o secretora líder que se separa de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína creciente a través del retículo endoplasmático. La mayoría de las células de mamífero e incluso las células de insectos separan proteínas segregadas con la misma especificidad. Sin embargo, en algunos casos, la separación de una proteína segregada no es completamente uniforme, lo que da como resultado dos o más especies maduras de la proteína. Además, se sabe desde hace mucho tiempo que la especificidad de separación de una proteína segregada está determinada en última instancia por la estructura primaria de la proteína completa, es decir, es inherente a la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por tanto, la presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por los clones de cADN contenidos en el hospedante identificado como Depósito ATCC Nº 97853, y tal como se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2). Con la expresión "proteína DR4 madura que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por los clones de cADN contenidos en el hospedante identificada como Depósito ATCC Nº 97853", se quiere decir la(s) forma(s) madura(s) de la proteína DR4 producida(s) por expresión en una célula de mamífero (por ejemplo, células COS, tal como se describe más adelante) del marco de lectura abierto completo codificado por la secuencia de ADN humano del clon contenido en el vector del hospedante depositado. Tal como se indica más adelante, la DR4 madura que presenta la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853, puede o no diferir de la proteína DR4 "madura" predicha mostrada en la Figura 1 (aminoácidos entre aproximadamente el 24 y aproximadamente el 468), dependiendo de la precisión de la posición de separación predicha en base a análisis con ordenador.

Se dispone de métodos para predecir si una proteína tiene un líder secretor así como un punto de separación para dicha secuencia líder. Por ejemplo, se pueden usar el método de McGeoch (Virus Res. 3: 271-286 (1985)) y el de von Heinje (Nucleic Acids Res. 14: 4683-4690 (1986)). La precisión de la predicción de los puntos de separación de proteínas secretoras de mamíferos conocidas para cada uno de estos métodos se encuentra en el intervalo de 75-80%. (von Heinje, ver anterior). Sin embargo, los dos métodos no siempre producen el(los) mismo(s) punto(s) de separación para una proteína dada.

En el presente caso, la secuencia de aminoácidos predicha del polipéptido DR4 completo de la presente invención se analizó mediante un programa de ordenador ("PSORT"), (véase K. Nakai y M. Kanehisa, Genomics 14: 897-911 (1992)), que es un sistema experto en la predicción de la localización celular de una proteína en base a la secuencia de aminoácidos. Como parte de esta predicción computacional de la localización, se incorporan los métodos de McGeoch y de von Heinje. El análisis mediante el programa PSORT predijo las posiciones de separación entre los aminoácidos 23 y 24 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2). A partir de ahí, se completó el análisis de las secuencias de aminoácidos mediante inspección visual, aplicando una forma sencilla de la regla (-1,-3) de von Heinje. (von Heinje, ver anterior). De este modo, se predice que la secuencia líder correspondiente a la proteína DR4 consiste en los residuos de aminoácido 1-23, subrayados en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2), mientras que la proteína DR4 madura predicha consiste en los residuos 24-468.

Tal como se ha indicado, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden encontrarse en la forma de ADN, incluyendo, por ejemplo cADN y ADN genómico obtenido mediante clonación o producido sintéticamente. El ADN puede ser de doble cadena o de cadena sencilla. El ADN de cadena sencilla puede ser la cadena codificadora, también conocida con cadena sentido, o puede ser la cadena no codificadora, también denominada cadena anti-sentido.

Con molécula(s) de ácido nucleico "aislada(s)" se pretende indicar una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido separada de su entorno nativo. Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de moléculas de ADN aisladas incluyen las moléculas de ADN recombinante mantenidas en células hospedantes heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en disolución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen tránscritos de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención incluyen moléculas de ADN de DR4 que comprenden un marco de lectura abierto (ORF, del inglés "open reading frame") mostrado en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), y además incluyen moléculas de ADN que comprenden una secuencia sustancialmente diferente a todo o a parte del ORF cuyo codón de inicio se encuentra en la posición 19-21 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), pero que, debido a la degeneración del código genético, aún codifica el polipéptido DR4 o un fragmento del mismo. Por supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. Por tanto, para un especialista en la técnica generar dichas variantes degeneradas sería una tarea rutinaria.

En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el polipéptido DR4 que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cADN contenido en el plásmido depositad como Depósito ATCC Nº 97853 el 21 de Enero de 1997. Preferiblemente, dichas moléculas de ácido nucleico codificarán el polipéptido maduro codificado por el clon de cADN depositado descrito antes. La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o la secuencia de nucleótidos del cADN de DR4 contenido en el clon depositado descrito antes, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a una de las anteriores secuencias. Dichas moléculas de ADN aisladas y fragmentos de las mismas son útiles como sondas de ADN para el mapeado génico mediante hibridación in situ del gen de DR4 en tejido humano mediante análisis Northern blot.

La presente invención está dirigida también a fragmentos de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente memoria. Por fragmentos de una moléculas de ADN aislada que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) se entiende fragmentos de ADN de al menos 20 pb, y más preferiblemente de al menos 30 pb de longitud, que son útiles como sondas de ADN tal como se ha discutido antes. Por supuesto, los fragmentos de ADN mayores, de 50-1500 pb de longitud, también son útiles como sondas de ADN de acuerdo con la presente invención, como también lo son los fragmentos de ADN correspondientes a la mayoría, sino a toda, la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1). Por un fragmento de al menos 20 pb de longitud, por ejemplo, se entiende fragmentos que incluyen 20 o más bases de la secuencia de nucleótidos de la Figura 1 (SEQ ID NO: 1).

Los fragmentos de ácido nucleico preferidos de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican: un polipéptido que comprende el dominio extracelular de DR4 (residuos de aminoácido desde aproximadamente el 24 hasta aproximadamente el 238 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2)); un polipéptido que comprende el dominio transmembrana de DR4 (residuos de aminoácido desde aproximadamente el 265 hasta aproximadamente el 468 en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2)); y un polipéptido que comprende el dominio de muerte de DR4 (residuos de aminoácido desde aproximadamente el 379 hasta aproximadamente el 422 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2)). Puesto que la localización de estos dominios ha sido predicha mediante gráficos de ordenador, un especialista en la técnica apreciaría que los residuos de aminoácido que constituyen estos dominios pueden variar ligeramente (por ejemplo, en aproximadamente de 1 a 15 residuos), dependiendo del criterio usado para definir el dominio.

Los fragmentos de ácido nucleico preferidos de la invención codifican un polipéptido de DR4 de longitud completa que carece de los nucleótidos que codifican la metionina amino-terminal (nucleótidos 19-21 de la SEQ ID NO: 1), ya que se sabe que la metionina se separa de forma natural y dichas secuencias pueden ser útiles en el diseño genético de vectores de expresión de DR4. Los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos también se contemplan en la invención.

Los fragmentos de ácido nucleico preferidos de la presente invención además incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican porciones que portan epítopos de la proteína DR4. En concreto, dichos fragmentos de ácido nucleico de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican: un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido entre aproximadamente el 35 y aproximadamente el 92 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido entre aproximadamente el 114 y aproximadamente el 160 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido entre aproximadamente el 169 y aproximadamente el 240 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido entre aproximadamente el 267 y aproximadamente el 298 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido entre aproximadamente el 330 y aproximadamente el 364 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido entre aproximadamente el 391 y aproximadamente el 404 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); y un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido entre aproximadamente el 418 y aproximadamente el 465 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2). Los inventores han determinado que los anteriores fragmentos de polipéptido son regiones antigénicas de la proteína DR4. Los métodos para determinar otras porciones portadoras de epítopo similares de la proteína DR4 se describen en detalle más adelante.

Adicionalmente, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que tienen las secuencias de nucleótido relacionadas con las porciones extensivas de la SEQ ID NO: 1 tal como sigue: HTOIY07R (SEQ ID NO: 6) y HTXEY80R (SEQ ID NO: 7), mostradas ambas en la Figura 4.

Además, la invención incluye un polinucleótido que comprende cualquier porción de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, de la SEQ ID NO: 1 desde el residuo 365 hasta el 1.424.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que se hibrida en condiciones de hibridación severas con una porción del polinucleótido en una molécula de ácido nucleico de la invención descrita anteriormente, por ejemplo, los clones de cADN contenidos en el Depósito ATCC Nº 97853. Por "condiciones de hibridación severas" se entiende una incubación durante toda la noche a 42ºC en una disolución que comprende: 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x disolución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 g/mL de ADN de esperma de salmón sheared desnatularizado, seguido de un lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC.

Con un polinucleótido que se hibrida a una "porción" de un polinucleótido se quiere decir un polinucleótido (ADN ó ARN) que se hibrida con al menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt), y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 nt, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 30 nt, e incluso más preferiblemente aproximadamente 30-70 nt del polinucleótido de referencia. Estos son útiles como sondas diagnósticas y cebadores, como se ha discutido anteriormente y con más detalle más adelante.

Con una porción de un polinucleótido de "al menos 20 nt de longitud", por ejemplo, se quiere decir 20 o más nucleótidos contiguos desde la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia (por ejemplo, el cADN depositado o la secuencia de nucleótido tal cual se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o en la Figura 2 (SEQ ID NO: 3)).

Por supuesto, un polinucleótido que se hibrida sólo a una secuencia poli a (tal como el tracto poli(A) 3 terminal del cADN de DR4 mostrado en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1)), o a una tira complementaria de residuos T (ó U), no se incluiría en un polinucleótido de la invención usado para hibridarse a una porción de un ácido nucleico de la invención, ya que dicho polinucleótido se hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contenga una tira poli (A) o a su complemento (por ejemplo, en la práctica cualquier clon de cADN de cadena doble).

Tal como se ha indicado, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican el polipéptido DR4 pueden incluir, aunque sin que suponga una limitación, la secuencia de codificación correspondiente al polipéptido maduro, por sí mismo; la secuencia de codificación correspondiente al polipéptido maduro y secuencias adicionales, tales como las que codifican una secuencia líder o secretora, tal como una secuencia de pre-, ó pro- ó prepro-proteína; la secuencia de codificación del polipéptido maduro, con o sin las secuencias codificadoras adicionales mencionadas anteriormente, junto con secuencias adicionales no codificadoras, que por ejemplo incluyen, aunque sin que suponga una limitación, intrones y secuencias 3' y 5' no codificadoras, tales como las secuencias transcritas, no traducidas, que desempeñan un papel en la transcripción, el procesado de mARN (incluyendo las señales de división y de poliadenilación, por ejemplo), la unión de ribosomas y la estabilidad del mARN; una secuencia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales, tal como las que proporcionan funcionalidades adicionales. Por tanto, por ejemplo, se puede fusionar el polipéptido con una secuencia marcadora, tal como un péptido, que facilite la purificación del polipéptido fusionado. En determinadas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como el proporcionado en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales se encuentran disponibles comercialmente. Tal como se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe, que ha sido descrito por Wilson y col., Cell 37: 767 (1984), por ejemplo.

La presente invención se refiere además a variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, que codifican fragmentos, análogos o derivados del polipéptido DR4. Las variantes pueden existir de forma natural, tal como una variante alélica. Por "variante alélica" se entiende una de las diversas formas alternativas de un gen que ocupa una posición dada en un cromosoma de un organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1985). Las variantes no naturales se pueden producir usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica.

Dichas variantes incluyen las producidas mediante sustituciones, eliminaciones o adiciones de nucleótidos que pueden incluir a uno o más nucleótidos. Las variantes se pueden alterar en las regiones codificadoras o no codificadoras, o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificadoras pueden producir sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas.

Otras realizaciones de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que son al menos idénticas en un 90%, y más preferiblemente idénticas en al menos un 95%, un 96%, un 98% o un 99%, a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 de longitud completa que presenta la secuencia de aminoácidos completa de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2), incluyendo la secuencia líder predicha; (b) secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 de longitud completa que presenta la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2), incluyendo la secuencia líder predicha pero que carece de la metionina aminoterminal; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 maduro (polipéptido de longitud completa sin el líder) que presenta la secuencia de aminoácidos en las posiciones aproximadamente 24 a aproximadamente 468 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); (d) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos completa que incluye el líder codificado por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 de longitud completa que presenta la secuencia de aminoácidos que incluye el líder pero que carece de la metionina aminoterminal codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853; (f) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853; (g) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular de DR4, (h) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio transmembrana de DR4, (i) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio intracelular de DR4, (j) una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de muerte DR4; o (k) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de los apartados anteriores (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) ó (j).

Por un nucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos "idéntica" en al menos, por ejemplo, un 95% a una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido de DR4 se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido DR4. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos un 95% a la secuencia de nucleótidos de referencia, se pueden eliminar o sustituir con otro nucleótido hasta un 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia, o se puede insertar en la secuencia de referencia un número de nucleótidos de hasta el 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Dichas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones terminales 5 ó 3 de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier posición entre dichas posiciones terminales, distribuidas individualmente entre los nucleótidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

En la práctica, el hecho de que cualquier molécula de ácido nucleico en concreto presente una identidad de al menos el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99%, con, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 o con las secuencias de nucleótidos del clon de cADN depositado, se puede determinar convencionalmente usando programas de ordenador conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711. Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), para obtener el mejor segmento de homología entre las dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento para determinar si una secuencia concreta es, por ejemplo, idéntica en un 95% a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, se fijan los parámetros de tal modo que, por supuesto, el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud total de la secuencia de nucleótidos de referencia, y permitiendo los huecos de homología de hasta el 5% del número total de nucleótidos de la secuencia de referencia.

La presente solicitud está dirigida a moléculas de ácido nucleico idénticas en al menos el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o a la secuencia de ácido nucleico de los cADNs depositados, independientemente de si codifican un polipéptido que presente actividad de DR4. Esto es debido a que incluso cuando una molécula de ácido nucleico concreta no codifica un polipéptido que tenga actividad de DR4, un especialista de la técnica sabría cómo usar la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, como sonda de hibridación o como cebador de reacción de cadena de polimerasa (PCR). Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que presenta actividad de DR4 incluyen, entre otros, (1) aislar el gen de DR4 o sus variantes alélicas en una biblioteca de cADN; (2) hibridación in situ (por ejemplo, "FISH") con extensiones cromosomales de metafase para proporcionar una localización cromosomal precisa del gen de DR4, tal como se describe en Verma y col., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988); y (3) análisis Northern blot para detectar la expresión de mARN de DR4 en tejidos
específicos.

Sin embargo, se prefieren las moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias que son idénticas en al menos el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o a la secuencia de ácido nucleico de los cADNs depositados que, de hecho, codifican un polipéptido que presenta actividad de proteína DR4. Por "un polipéptido que tiene actividad de DR4" se entiende polipéptidos que exhiben una actividad similar, aunque no necesariamente idéntica, a la actividad de la proteína DR4 de la invención (tanto de la proteína de longitud completa como, preferiblemente, de la proteína madura), medida en un ensayo biológico concreto. Por ejemplo, la actividad de proteína DR4 se puede medir usando ensayos de muerte celular realizados esencialmente como se ha descrito previamente (A.M. Chinnaiyan, y col., Cell 81, 505-12 (1995); M.P. Boldin, y col., J. Biol. Chem. 270, 7795-8 (1995); F.C. Kischkel, y col., EMBO 14, 5579-5588 (1995); A.M. Chinnaiyan, y col., J. Biol. Chem. 271, 4961-4965 (1996)) o tal como se establece en el Ejemplo 5, mostrado más adelante. En las células MCF7, se co-transfectan los plásmidos que codifican el DR4 de longitud completa o un dominio de muerte candidato que contiene receptores con el constructo informador pLantern que codifica proteína fluorescente verde. Los núcleos de las células transfectadas con DR4 exhibirán morfología apóptica, determinada mediante tinción DAPI. Como ocurre con el TNFR-1 y con el Fas/APO-1 (M. Muzio, y col., Cell 85, 817-827 (1996); M. P. Boldin y col., Cell 85, 803-815 (1996); M. Tewari, y col., J. Biol. Chem. 270, 3255-60 (1995)), la apoptosis inducida por DR4 es bloqueada por los inhibidores de proteasas similares a ICE, CrmA y z-VAD-fmk.

Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, un especialista en la técnica reconocerá inmediatamente que un gran número de moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia idéntica en al menos un 90%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% a la secuencia de ácido nucleico del cADN depositado o a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), codificarán un polipéptido "que tiene actividad de proteína DR4". De hecho, puesto que todas las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican el mismo polipéptido, este hecho será evidente para el especialista de la técnica incluso sin realizar el ensayo de comparación descrito antes. También se reconocerá en la técnica que, para las moléculas de ácido nucleico que no sean variantes degeneradas, un número razonable también codificarán un polipéptido que tenga actividad de proteína DR4. Esto se debe a que el especialista en la técnica es consciente de las sustituciones de aminoácidos que afectan a la función proteica significativamente de forma o bien menos probables o bien no probable (por ejemplo, reemplazar un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático).

Por ejemplo, una guía en relación a cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas se proporciona en Bowie, J.U. y col., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247: 1306-1310 (1990), en el que los autores indican que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a sustituciones de aminoácidos.

Ensayos de polinucleótidos

Esta invención también se refiere al uso de los polinucleótidos DR4 para detectar polinucleótidos complementarios tales como, por ejemplo, un reactivo de diagnóstico. La detección de una forma mutada de DR4 asociada a la disfunción proporcionará una herramienta diagnóstica que puede añadir o definir una diagnosis de una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad que da se debe a la infra-expresión o a la sobre-expresión, o a la expresión alterada, de DR4 o de una forma soluble del mismo, tal como, por ejemplo, tumores o enfermedades autoinmunes.

Los individuos que portan mutaciones en el gen DR4 pueden detectarse a nivel de ADN empleando una serie de técnicas. Los ácidos nucleicos para la diagnosis se pueden obtener a partir de células de un paciente, tal como de la sangre, la orina, la saliva, de material de biopsias o autopsias de tejidos. El ADN genómico se puede usar directamente para la detección o puede amplificarse enzimáticamente usando PCR antes del análisis. (Saiki y col., Nature 324: 163-166 (1986)). También se puede usar ARN o cADN del mismo modo. A modo de ejemplo, se pueden usar los cebadores PCR complementarios al ácido nucleico que codifica DR4 para identificar y analizar la expresión y las mutaciones de DR4. Por ejemplo, las eliminaciones y las inserciones se pueden detectar a través de un cambio de tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Se pueden identificar mutaciones puntuales hibridando ADN amplificado con ARN de DR4 radiomarcado o, de forma alternativa, con secuencias de ADN antisentido de DR4 radiomarcado. Las secuencias perfectamente coincidentes se pueden distinguir de los pares no coincidentes mediante una digestión de ARNasa o por las diferencias en las temperaturas de
fusión.

Las diferencias de secuencia entre el gen de referencia y los genes que presentan mutaciones también se pueden revelar mediante un secuenciamiento directo de ADN. Además, los segmentos de ADN clonado se pueden emplear como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de dichos métodos se puede mejorar enormemente mediante un uso apropiado de PCR o de otro método de amplificación. Por ejemplo, se usa un cebador de secuenciamiento con producto de PCR de doble cadena o con una molécula molde de cadena sencilla generada por un PCR modificado. La determinación de la secuencia se realizar mediante procedimientos convencionales con nucleótidos radiomarcados o mediante procedimientos de secuenciamiento automáticos con etiquetas
fluorescentes.

Se pueden realizar ensayos genéticos basados en las diferencias en las secuencias de ADN mediante la detección de la alteración de movilidad electroforética de los fragmentos de ADN en geles, con o sin agentes desnaturalizantes. Se pueden visualizar pequeñas eliminaciones e inserciones de secuencia mediante electroforesis de gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de las diferentes secuencias se pueden distinguir de los geles de gradiente de formamida desnaturalizante en los que las movilidades de los diferentes fragmentos de ADN se ven retardadas en el gel en diferentes posiciones de acuerdo con sus temperaturas de fusión o de fusión parcial específicas (véase, por ejemplo, Myers y col., Science 230: 1242 (1985)).

Los cambios de secuencia en posiciones específicas también se pueden revelar mediante ensayos de protección de nucleasa, tales como la protección de SI y de ARNasa o el método de ruptura química (por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397-4401 (1985)).

Por tanto, la detección de una secuencia específica de ADN se puede lograr a través de métodos tales como la hibridación, la protección de ARNasa, la ruptura química, el secuenciamiento directo de ADN o el uso de enzimas de restricción (por ejemplo, polimorfismos de longitud de fragmento de restricción ("RFLP") y análisis de Southern blot de ADN genómico).

Además de la electroforesis de gel convencional y del secuenciamiento de ADN, también se pueden detectar mutaciones mediante análisis in situ.

Ensayos de cromosomas

Las secuencias de la presente invención también son valiosas en la identificación de cromosomas. La secuencia está dirigida específicamente y se puede hibridar con una posición concreta de un cromosoma humano individual. El mapeado de ADNs a cromosomas de acuerdo con la presente invención es una primera etapa importante para correlacionar dichas secuencias con genes asociados a enfermedades.

En determinadas realizaciones preferidas a este respecto, el cADN descrito en la presente memoria se usa para clonar ADN genómico de un gen de DR4. Esto se puede realizar usando una serie de técnicas y de bibliotecas bien conocidas, que generalmente están disponibles comercialmente. El ADN genómico se usa para el mapeado in situ de cromosomas usando técnicas conocidas aplicables a este propósito.

Además, se pueden mapear las secuencias a cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb) a partir del cADN. El análisis por ordenador de la región sin traducir 3' del gen se usa para seleccionar rápidamente cebadores que no se separen más de un exón en el ADN genómico, complicando de este modo el proceso de amplificación. Estos cebadores se usan a continuación para escrutinio PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales.

La hibridación in situ por fluorescencia ("FISH") de un clon de cADN a una extensión de metafase cromosomal se puede usar para proporcionar una localización cromosomal precisa en una etapa. Esta técnica se puede usar con cADN de hasta 50 ó 60. Para una revisión de esta técnica, véase Verma y col., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988).

Una vez que se ha mapeado una secuencia a una localización cromosomal precisa, se puede correlacionar la posición física de la secuencia en el cromosoma con datos del mapa genético. Dichos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en línea a través de la Johns Hopkins University, Welch Medical Library. Entonces se identifica la relación entre genes y enfermedades que han sido mapeados en la misma región cromosomal a través de análisis de enlaces (co-herencia de genes físicamente adyacentes).

A continuación, es necesario determinar las diferencias en el cADN o en la secuencia genómica entre los individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o en todos los individuos afectados pero no en ningún individuo normal, entonces probablemente la mutación es el agente causante de la enfermedad.

Vectores y células hospedantes

La presente invención también se refiere a vectores que incluyen moléculas de ADN de la presente invención, a células hospedantes que generalmente se diseñan con vectores de la invención, y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Las células hospedantes se pueden diseñar genéticamente para incorporar moléculas de ácido nucleico y para expresar polipéptidos de la presente invención. Los polinucleótidos se pueden introducir solos o con otros polinucleótidos. Dichos otros polinucleótidos se pueden introducir de forma independiente, se pueden co-introducir o se pueden introducir unidos a los polinucleótidos de la invención.

De acuerdo con este aspecto de la invención el vector puede ser, por ejemplo, un vector de plásmido, un vector fago de cadena sencilla o de cadena doble, un vector viral de ARN o de ADN de cadena sencilla o de cadena doble. Dichos vectores se pueden introducir en las células como polinucleótidos, preferiblemente como ADN, mediante técnicas bien conocidas para la introducción de ADN y de ARN en células. Los vectores virales pueden ser de replicación competente o de replicación defectuosa. En el último caso, generalmente la propagación viral se producirá únicamente en células hospedantes complementarias.

Entre los vectores, en determinados aspectos, se prefieren aquellos para la expresión de polinucleótidos y de polipéptidos de la presente invención. Generalmente, dichos vectores comprenden regiones de control de actuación cis efectivas en la expresión en un hospedante ligado operativamente al polinucleótido que se va a expresar. Los factores de actuación trans apropiados son suministrados por el hospedante, por un vector complementario o por el vector mismo tras la introducción en el hospedante.

Se puede usar una gran variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido de la invención. Dichos vectores incluyen vectores cromosomales, episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de episomas de levadura, de elementos cromosomales de levadura, de virus tales como baculovirus, virus de papova, tal como el SV40, virus de vaccinia, adenovirus, virus de viruela de ave de corral, virus de pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos bacteriófagos y del plásmido, tales como cósmicos y fagémidos, pueden usarse todos para la expresión de acuerdo con este aspecto de la presente invención. De forma general, para la expresión a este respecto se puede usar cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos para expresar un polipéptido en un hospedante.

La secuencia de ADN del vector de expresión está ligada operativamente a una(s) secuencia(s) de control de expresión apropiada(s), incluyendo, por ejemplo, un promotor para dirigir la transcripción de mARN. Los representantes de dichos promotores incluyen el promotor de PL de fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los promotores SV40 temprano y tardío y los promotores de LTRs retrovirales, por nombrar sólo unos pocos de los promotores conocidos. En general, la expresión de constructos contendrá posiciones para la transcripción, el inicio y la terminación, y, en la región transcrita, una posición de unión de ribosoma para la traducción. La porción codificadora de los tránscritos maduros expresada por los constructos incluirá un AUG de inicio de la traducción al principio y un codón de terminación (UAA, UGA ó UAG) posicionado apropiadamente en el extremo del polipéptido que va a ser
traducido.

Además, los constructos pueden contener regiones de control que regulan y que generan expresión. Generalmente, dichas regiones operarán controlando la transcripción, tal como las posiciones de unión de represor y los potenciadores, entre otros.

Los vectores para la propagación y la expresión generalmente incluirán marcadores seleccionables. Dichos marcadores también pueden ser adecuados para la amplificación o los vectores pueden contener marcadores adicionales para dicho propósito. A este respecto, los vectores de expresión preferiblemente contienen uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedantes transformadas. Los marcadores preferidos incluyen resistencia a reductasa de dihidrofolato o a neomicina para el cultivo de células eucarióticas, y genes de resistencia a tetraciclina o a ampicilina para el cultivo de E. coli o de otras
bacterias.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada tal como se describe en la presente memoria, así como un promotor apropiado, y otras secuencias de control apropiadas, se puede introducir en un hospedante apropiado usando una serie de técnicas adecuadas conocidas para la expresión del polipéptido deseado. Los ejemplos representativos de hospedantes apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura; células de insectos tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como células CHO, COS y de melanoma de Bowes; y células vegetales. Se conocen hospedantes para una gran variedad de constructos de expresión, y los especialistas en la técnica serán capaces, a partir de la presente descripción, de seleccionar fácilmente un hospedante para la expresión de un polipéptido de acuerdo con este aspecto de la presente invención.

Entre los vectores preferidos para su uso en bacterias se encuentran el pQE70, el pQE60 y el pQE-9, disponibles en Qiagen, los vectores pBS, los vectores Phagescript, los vectores Bluescript, el pNH8A, el pNH16a, el pNH18A, el pNH46A, disponibles en Stratagene; y el ptrc99a, el pKK223-3, el pKK-233-3, el pDR540, el pRIT5, disponibles en Pharmacia. Entre los vectores eucarióticos preferidos se encuentran el pWLNEO, el pSV2CAT, el pOG44, el pXT1 y el pSG, disponibles en Stratagene; y el pSVK3, el pBPV, el pMSG y el pSVL, disponibles en Pharmacia. Dichos vectores se enumeran únicamente a modo de ilustración de los muchos vectores conocidos que hay disponibles comercialmente, al alcance de los especialistas de la técnica.

La selección de los vectores y promotores apropiados para la expresión en una célula hospedante es un procedimiento bien conocido y las técnicas requeridas para la construcción del vector de expresión, para la introducción del vector en el hospedante y para la expresión en el hospedante, son rutinarias en la técnica.

La presente invención también se refiere a células hospedantes que contienen los constructos anteriormente mencionados que se discuten más adelante. La célula hospedante puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedante puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana.

La introducción del constructo en la célula hospedante se puede efectuar mediante transfección con fosfato de calcio, mediante transfección mediada por DEAE-dextrano, mediante transfección mediada por lípido catiónico, mediante electroporación, transducción, infección u otros métodos. Dichos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology (1986).

El polipéptido se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas. De este modo, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente de aminoácidos cargados, se puede añadir al extremo N del polipéptido para mejorar la estabilidad y la persistencia en la célula hospedante, durante la purificación o durante el posterior manejo y almacenamiento. Asimismo, la región también se puede añadir al polipéptido para facilitar la purificación. Dichas regiones pueden eliminarse antes de la preparación final del polipéptido. La adición de funciones peptídicas a los polipéptidos para generar secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación, entre otros, son técnicas familiares y rutinarias en la técnica. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que es útil para solubilizar proteínas. Por ejemplo, el documento EP-A-O 464 533 (contrapartida canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc de una proteína de fusión es completamente ventajosa para su uso en terapia y diagnosis, y por tanto da como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (EP-A 0232 262). Por otro lado, para determinados usos sería deseable poder eliminar la parte Fc una vez que la proteína de fusión ha sido expresada, detectada y purificada en el modo ventajoso descrito. Este es el caso cuando la porción Fc resulta ser un obstáculo para su uso en terapia y diagnosis, por ejemplo cuando la proteína de fusión se va a usar como antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanas tales como la hIL-5 con porciones Fc con el propósito de ensayos de escrutinio de alta capacidad para identificar antagonistas de hIL-5. Véase D. Bennett y col., Journal of Molecular Recognition, Vol. 8: 52-58 (1995) y K. Johanson y col., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, Nº 16: 9459-9471 (1995).

Los polipéptidos DR4 se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes empleando métodos conocidos que incluyen precipitación con etanol o con sulfato amónico, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Más preferiblemente, se emplea cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") para la purificación. Se pueden emplear técnicas conocidas para el replegado de proteína para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante el aislamiento y/o la purificación.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados de forma natural, productos de procedimientos químicos sintéticos, y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedante procariótico o eucariótico, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de vegetales superiores, de insectos y de mamíferos. Dependiendo del hospedante empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo de metionina inicial modificado, en algunos casos como resultado de procesos mediados por hospedante.

Los polinucleótidos y polipéptidos DR4 se pueden usar de acuerdo con la presente invención para una variedad de aplicaciones, en concreto para aquellas que hagan uso de las propiedades químicas y biológicas de DR4. Entre dichas aplicaciones se encuentran el tratamiento de tumores, la resistencia a parásitos, bacterias y virus, para inducir la proliferación de células T, células endoteliales y determinadas células hematopoyéticas, para tratar la restenosis, la enfermedad de injerto contra hospedante, para regular las respuestas antivirales y para prevenir determinadas enfermedades autoinmunes tras la estimulación del DR4 mediante un agonista. Otras aplicaciones adicionales se refieren a la diagnosis y al tratamiento de trastornos de células, tejidos y organismos. Estos aspectos de la invención se discuten con más detalle más adelante.

Polipéptidos DR4 y fragmentos

La invención proporciona además un polipéptido DR4 aislado que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o un péptido o polipéptido que comprende una porción de los polipéptidos
anteriores.

Para mejorar o alterar las características de polipéptidos DR4, se puede emplear ingeniería de proteínas. Se puede usar tecnología de ADN recombinante al alcance de los especialistas en la técnica para crear nuevas proteínas mutantes o "muteínas", que incluyen sustituciones, eliminaciones y adiciones de aminoácidos o proteínas de fusión. Dichos polipéptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, un aumento de actividad o un aumento de estabilidad. Además, se pueden purificar con mayores rendimientos y muestran una mejor solubilidad que el correspondiente polipéptido natural, al menos bajo determinadas condiciones de almacenamiento y purificación.

Por ejemplo, para muchas proteínas, que incluyen el dominio extracelular de una proteína asociada a membrana o
la(s) forma(s) madura(s) de una proteína segregada, en la técnica se sabe que se pueden eliminar uno o más aminoácidos del extremo N o del extremo C sin que se produzca una pérdida sustancial de la función biológica. Por ejemplo, Ron y col., J. Biol. Chem., 268: 2984-2988 (1933) publicaron proteínas KGF modificadas que presentaban actividad de unión de heparina incluso si faltaban 3, 8 o 27 residuos de aminoácido amino-terminales. En el presente caso, puesto que la proteína de la invención es un miembro de la familia de polipéptidos de receptores que contienen el dominio de muerte (DDCR), las eliminaciones de aminoácidos N-terminales hasta el residuo de cisteína de la posición 132 de la SEQ ID NO: 2 pueden conservar alguna actividad biológica tal como la capacidad de inducir apoptosis. No es de esperar que los polipéptidos que presentan eliminaciones N-terminales adicionales que incluyen el residuo de cisteína de la posición 132 (C-132) de la SEQ ID NO: 2 conserven dichas actividades biológicas debido a que este residuo se conserva entre los miembros de la familia, véase la Figura 2, puede requerirse para la formación de un puente de disulfuro para proporcionar estabilidad estructural necesaria para la unión de
receptor.

Sin embargo, incluso si la eliminación de uno o más aminoácidos del extremo N de una proteína da lugar a una modificación de la pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, todavía puede que se mantengan otras actividades biológicas. Por tanto, de forma general se mantendrá la capacidad de la proteína acortada para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen la proteína de dominio completo o extracelular de la proteína cuando se eliminen menos de la mayoría de los residuos de la proteína de dominio completo o extracelular del extremo N. El hecho de que un polipéptido concreto que carece de residuos N-terminales de una proteína completa conserve dichas actividades inmunológicas puede determinarse fácilmente empleando métodos rutinarios descritos en la presente invención, y en cualquier caso otros conocidos en la técnica.

Por consiguiente, la presente invención además proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos eliminados en el extremo amino de la secuencia de aminoácidos de DR4 mostrada en SEQ ID NO: 2, hasta el residuo C-132, y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En concreto, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los residuos n-468 de la SEQ ID NO: 2, en los que n es un número entero en el intervalo de 1 a 132, en el que C-132 es el primer residuo del extremo N del dominio extracelular del polipéptido DR4 (mostrado en la SEQ ID NO: 2), que se cree es necesario para la actividad de unión receptor-ligando de la proteína DR4 (por ejemplo, unión de TRAIL). También se proporcionan los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos.

De forma similar, se conocen muchos ejemplos de muteínas de eliminación C-terminal biológicamente funcionales. Por ejemplo, el interferón gamma muestra actividades hasta diez veces superiores mediante la eliminación de 8-10 residuos de aminoácido del término carboxi de la proteína (Döbeli y col., J. Biotechnology 7: 199-216 (1988). En el presente caso, puesto que la proteína de la invención es un miembro de la familia de polipéptidos DDCR, las eliminaciones de aminoácidos C-terminales hasta la cisteína de la posición 221 (C-221) de la SEQ ID NO: 2 pueden conservar algo de actividad biológica, tal como la unión de receptor. No es de esperar que los polipéptidos que presentan eliminaciones C-terminales adicionales, incluyendo la C-221 de la SEQ ID NO: 2, conserven dichas actividades biológicas debido a que este residuo se conserva entre los miembros de la familia DDCR, y es necesario para la formación de un puente de disulfuro que proporcione la estabilidad estructural requerida para la unión ligando-receptor.

Sin embargo, incluso si la eliminación de uno o más aminoácidos del extremo C de una proteína da como resultado en la modificación de la pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, todavía se pueden conservar otras actividades biológicas. Por tanto, la capacidad de la proteína acortada para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen el dominio completo o extracelular de la proteína generalmente se conservará cuando se elimine menos de la mayoría de los residuos del dominio completo o extracelular del extremo C. El hecho de si un polipéptido concreto que carece de residuos C-terminales de una proteína completa conserve dichas actividades inmunológicas se puede determinar fácilmente empleando métodos rutinarios descritos en la presente memoria, u otros disponibles en la técnica.

Por consiguiente, la presente invención además proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos eliminados en el extremo carboxi de la secuencia de aminoácidos de DR4 mostrada en SEQ ID NO: 2, hasta la C-221, y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En concreto, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-m de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, en la que m es cualquier número entero en el intervalo de 221 a 468 y el residuo C-221 es la posición del primer residuo del extremo C del polipéptido DR4 completo (mostrado en la SEQ ID NO: 2), que se cree es necesario para la actividad de unión de receptor de la proteína DR4. También se proporcionan los polinucleótidos que codifican dichos
polipéptidos.

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La invención también proporciona polipéptidos que presentan uno o más aminoácidos eliminados del extremo amino y del extremo carboxilo, que pueden describirse generalmente como que presentan los residuos n-m de la SEQ ID NO: 2, siendo n y m números enteros tal como se ha descrito antes.

También se incluye la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que consiste en una porción de una secuencia de aminoácidos de DR4 completa codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853, en el que dicha porción excluye los aminoácidos del 1 al 108 del extremo amino de la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853, o de 1 a aproximadamente 247 aminoácidos del extremo carboxi, o cualquier combinación de las anteriores eliminaciones amino o carboxiterminales, de la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853. También se proporcionan los polinucleótidos que codifican todas las formas de polipéptidos mutantes de
eliminación.

Entre los mutantes de eliminación N- y C-terminales se prefieren los que comprenden sólo una porción del dominio extracelular, es decir, en los residuos 24-238, ya que se espera que cualquier porción en ese intervalo sea
soluble.

Se reconocerá en la técnica que alguna secuencia de aminoácidos de DR4 se puede variar sin afectar de forma significativa a la estructura o a la función de la proteína. Si se contemplan tales diferencias en la secuencia, debería recordarse que en la proteína habrá áreas críticas que determinan la actividad. Dichas áreas habitualmente comprenderán los residuos que constituyen la posición de unión de ligando o el dominio de muerte, o que forman estructuras terciarias que afectan a estos dominios.

Por tanto, la invención incluye también las variaciones de la proteína DR4 que muestran una actividad sustancial de proteína DR4, o que incluyen regiones de DR4 tal como los fragmentos de proteína discutidos más adelante. Dichos mutantes incluyen eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones de tipo. Tal como se ha indicado antes, en Bowie, J.U. y col., Science 247: 1306-1310 (1990) se puede encontrar una guía sobre qué cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silenciosos.

De especial interés son las sustituciones de aminoácidos cargados por otro aminoácido cargado, y por aminoácidos neutros o cargados negativamente. Estas últimas dan como resultado proteínas con carga positiva reducida para mejorar las características de la proteína DR4. Es altamente deseable evitar la agregación. La agregación de proteínas no solo produce una pérdida de actividad, sino que también puede ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas, debido a que pueden ser inmunogénicas. (Pinckard y col., Clin Exp Immunol. 2: 331-340 (1967); Robbins y col., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland y col., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377 (1993)).

La sustitución de aminoácidos también puede cambiar la selectividad de la unión a receptores celulares superficiales. Ostade y col., Nature 361: 266-268 (1993) describe determinadas mutaciones que dan como resultado la unión selectiva de TNF-alfa sólo a uno de los dos tipos conocidos de receptores de TNF. Por tanto, el receptor de DR4 de la presente invención puede incluir una o más sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos, tanto procedentes de mutaciones naturales como de manipulación humana.

Tal como se ha indicado, preferiblemente los cambios son de naturaleza menor, tal como sustituciones de aminoácidos conservativas, que no afectan de forma significativa al plegamiento o a la actividad de la proteína (véase la Tabla 1).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Sustituciones de aminoácidos conservativas

1

Los aminoácidos de la proteína DR4 de la presente invención que son esenciales para la función se pueden identificar empleando métodos conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida a posición específica o la mutagénesis de barrido de alanita (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). El último procedimiento introduce mutaciones de alanina sencillas en cada residuo de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se prueban a continuación para determinar su actividad biológica, tal como la unión de receptor in vitro, o la actividad proliferativa in vitro. Las posiciones críticas para la unión receptor-ligando también se pueden determinar mediante análisis estructural, tal como mediante cristalización, resonancia magnética nuclear o etiquetado de fotoafinidad (Smith y col., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) y de Vos y col., Science 255: 306-312 (1992)).

Los polipéptidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en forma aislada, y preferiblemente son purificados sustancialmente. Una versión del polipéptido DR4 producida recombinantemente se purifica sustancialmente mediante un método de una sola etapa descrito en Smith y Jonson, Gene 67: 31-40 (1988).

Los polipéptidos de la presente invención también incluyen el polipéptido codificado por el cADN codificado que incluye el líder, el polipéptido maduro codificado por el cADN depositado menos el líder (es decir, la proteína madura), el polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) incluyendo el líder, el polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) menos el líder, el dominio extracelular, los polipéptidos solubles que comprenden todos o parte de los dominios extracelulares e intracelulares pero que carecen del dominio de transmembrana así como los polipéptidos que son idénticos en al menos un 80%, más preferiblemente idénticos en al menos del 90% al 95%, aún más preferiblemente, idénticos en al menos un 96%, un 97%, un 98% o un 99% al polipéptido codificado por los clones de cADN depositados, al polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) y también incluye porciones de dichos polipéptidos con al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente con al menos 50 aminoácidos.

Por un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos "idéntica" al, por ejemplo, 95%, a la secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido DR4, se entiende una secuencia de aminoácidos del polipéptido que es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia de polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido DR4. En otras palabras, para obtener un polipéptido que presente una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 95% a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los residuos de aminoácido de la secuencia de referencia se pueden eliminar o sustituir con otro aminoácido, o un número de aminoácidos de hasta el 5% del total de residuos de aminoácido de la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Dichas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre dichas posiciones terminales, distribuidas individualmente entre los residuos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

En la práctica, el hecho de que cualquier polipéptido concreto sea idéntico en al menos un 90%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o a la secuencia de aminoácidos codificada por clones de cADN depositados, se puede determinar convencionalmente usando programas de ordenador conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia concreta es idéntica, por ejemplo, al 95% a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, se fijan los parámetros, por supuesto, de tal modo que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia y que se permita que los huecos en la homología sean de hasta el 5% del número total de residuos de aminoácido de la secuencia de referencia.

Los presentes inventores han descubierto que el polipéptido DR4 es una proteína de 468 residuos que presenta tres dominios estructurales principales. En primer lugar, el dominio de unión de ligando se identificó aproximadamente entre los residuos 24 y 238 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2). En segundo lugar, se identificó el dominio transmembrana aproximadamente entre los residuos 239 y 264 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2). Cabe destacar que el dominio intracelular incluye un dominio de muerte aproximadamente entre los residuos 379 y 422. Otros fragmentos preferidos del polipéptido mostrado en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) incluyen la proteína madura aproximadamente entre los residuos 24 y 468, y los polipéptidos solubles que comprenden todos o parte de los dominios extracelulares e intracelulares pero que carecen del dominio transmembrana.

La invención también proporciona polipéptidos DR4 codificados por el clon de cADN depositado que incluyen el líder y fragmentos de polipéptido DR4 seleccionados de la proteína madura, el dominio extracelular, el dominio transmembrana, el dominio intracelular y el dominio de muerte.

En otro aspecto, la invención proporciona un péptido o polipéptido que comprende una porción portadora de epítopo de un polipéptido descrito en la presente memora. El epítopo de esta porción de polipéptido es un epítopo inmunogénico o antigénico de un polipéptido de la invención. Un "epítopo inmunogénico" se define como una parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpo cuando la proteína completa es el inmunógeno. Por otro lado, una región de una molécula proteica a la que se puede unir un anticuerpo se define como "epítopo antigénico". El número de epítopos antigénicos de una proteína generalmente es inferior al número de epítopos antigénicos. Véase, por ejemplo, Geysen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983).

En relación a la selección de péptidos y polipéptidos que portan un epítopo antigénico (es decir, que contienen una región de una molécula proteica a la que se puede unir un anticuerpo), es sabido en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que imitan parte de una secuencia de proteínas son capaces de provocar de forma rutinaria un antisuero que reacciona con la proteína imitada parcialmente. Véase, por ejemplo, Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N. y Learner, R.A. (1983), Antibodies that react with predetermined sites on proteins. Science 219: 660-666. Los péptidos capaces de provocar sueros reactivos con proteínas se presentan frecuentemente en la secuencia primaria de una proteína, se pueden caracterizar empleando una serie de reglas químicas sencillas, y no se confinan en regiones inmunodominantes de las proteínas intactas (es decir, epítopos inmunogénicos) ni en los extremos amino o carboxi.

Péptidos y polipéptidos que portan epítopos antigénicos de la invención son útiles, por tanto, para activar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente a un polipéptido de la invención. Véase, por ejemplo, Wilson y col., Cell 37: 767-778 (1984) en la 777.

Los péptidos y polipéptidos que portan epítopos antigénicos de la invención preferiblemente contienen una secuencia de al menos siete, más preferiblemente de al menos nueve y aún más preferiblemente de entre al menos aproximadamente 15 y a aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención.

Los ejemplos no limitantes de polipéptidos o péptidos antigénicos que pueden usarse para generar anticuerpos específicos de DR4 incluyen: un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde aproximadamente el 35 hasta aproximadamente el 92 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde aproximadamente el 114 hasta aproximadamente el 160 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde aproximadamente el 169 hasta aproximadamente el 240 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde aproximadamente el 267 hasta aproximadamente el 298 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde aproximadamente el 330 hasta aproximadamente el 364 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde aproximadamente el 391 hasta aproximadamente el 404 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); y un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde aproximadamente el 418 hasta aproximadamente el 465 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2). Tal como se ha indicado antes, los inventores han determinado que los fragmentos de polipéptido anteriores son regiones antigénicas de la proteína DR4.

Los péptidos y polipéptidos portadores de epítopo de la invención se pueden producir empleando cualquier medio convencional. Houghten, R.A., "General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985). Este proceso de "Síntesis Múltiple Simultánea de Péptidos (SMPS)" se describe con más detalle en la Patente de EE.UU. Nº 4.631.211, a nombre de Houghten y col. (1986).

Como apreciará el especialista en la técnica, los polipéptidos DR4 de la presente invención y sus fragmentos portadores de epítopos descritos anteriormente se pueden combinar con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), dando como resultado polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y presentan una vida media in vivo incrementada. Esto ha sido demostrado, por ejemplo, para las proteínas quiméricas que consisten en los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y en diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de mamífero (EPA 394.827; Traunecker y col., Nature 331: 84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que presentan una estructura dimérica ligada a disulfuro debido a la parte IgG también pueden ser más eficaces en la unión y neutralización de otras moléculas que la proteína, o fragmento de proteína, DR4 monomérica por sí sola (Fountoulakis y col., J Biochem 270: 3958-3964 (1995)).

Ensayos de polipéptidos

La presente invención también se refiere a ensayos diagnósticos tales como los ensayos cuantitativos y diagnósticos para la detección de niveles de proteína DR4, o de su forma soluble, en células y tejidos, incluyendo la determinación de niveles normales y anormales. Por tanto, por ejemplo, un ensayo diagnóstico de acuerdo con la invención para la detección de la sobre-expresión de DR4, o de su forma soluble, en comparación con muestras de tejido de control normales, se puede usar para detectar la presencia de tumores, por ejemplo. Las técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar en una muestra de un hospedante niveles de una proteína, tal como la proteína DR4 de la presente invención, o de una forma soluble de la misma, son bien conocidas por los especialistas de la técnica. Dichos métodos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de Western Blot y ensayos ELISA.

El ensayo de niveles de proteína DR4 en una muestra biológica se puede realizar usando cualquier método conocido en la técnica. Las técnicas basadas en anticuerpos son las preferidas para ensayar niveles de proteína DR4 en una muestra biológica. Por ejemplo, la expresión de proteína DR4 en tejidos se puede estudiar con métodos inmunohistológicos clásicos. (Jalkanen, M., y col., J Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen, M., y col., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)).

Otros métodos basados en anticuerpos que son útiles para la detección de expresión génica de proteína DR4 incluyen los inmunoensayos, tales como el ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA).

En la técnica se conocen las marcas adecuadas e incluyen marcas enzimáticas, tales como glucosa oxidasa, radioisótopos, tales como los de yodo (^{125}I, ^{121}I), de carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In) y tecnecio (^{99m}Tc), y marcas fluorescentes, tales como la fluoresceína y la rodamina, y la biotina.

Terapia

Los ligandos de la familia de Factor de Necrosis Tumoral (TNF) son conocidos por encontrarse entre las citoquinas más pleyotrópicas, que inducen un gran número de respuestas celulares, incluyendo citotoxicidad, actividad anti-viral, actividades inmunorreguladoras, y la regulación transcripcional de varios genes (Goeddel, D.V. y col., "Tumor Necrosis Factors: Gene Structure and Biological Activities", Symp. Quant. Biol. 51: 597-609 (1986), Cold Spring Harbor; Beutler, B., y Cerami, A., Annu. Rev. Biochem. 57: 505-518 (1988); Old, L.J., Sci. Am. 258: 59-75 (1988); Fiers, W., FEBS Lett. 285: 199-224 (1991)). Los ligandos de la familia TNF inducen varias respuestas celulares mediante la unión de receptores de familia TNF, incluyendo el DR4 de la presente invención. Las células de la presente invención que expresan el polipéptido DR4 y que se cree tienen una respuesta celular potente frente a los ligandos de DR4 incluyen las células amnióticas, del corazón, hígado, cancerosas, de riñón, leucocitos de sangre periférica, células T activadas, tejido correspondiente a células Th2, de amígdala humana, y capa leucoplaquetar agotada en CD34 (sangre de cordón). Por "una respuesta celular a un ligando de familia TNF" se entiende cualquier cambio genotípico, fenotípico y/o morfológico, en una célula, línea celular, tejido, cultivo de tejido o paciente que es inducido por un ligando de familia TNF. Como se ha indicado, dichas respuestas celulares no solo incluyen respuestas fisiológicas normales a los ligandos de familia TNF, sino también a enfermedades asociadas con un aumento de la apoptosis o a la inhibición de la apoptosis. La muerte celular programada por apoptosis es un mecanismo fisiológico implicado en la eliminación de linfocitos T periféricos del sistema inmune, y su desregulación puede conducir a una serie de diferentes procesos patogénicos (Ameisen, J.C., AXDS 8: 1197-1213 (1994); Krammer, P.H. y col., Curr. Opin. Immunol. 6: 279-289 (1994)).

Las enfermedades asociadas a un aumento de la supervivencia celular, o a la inhibición de la apoptosis, incluyen cánceres (tales como los linfomas foliculares, los carcinomas con mutaciones p53, y los tumores dependientes de hormonas, tales como el cáncer de pecho, el cáncer de próstata, el sarcoma de Kaposi y el cáncer de ovario); trastornos autoinmunes (tales como el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide de relacionada con glomerulonefritis inmune) e infecciones víricas (tales como los virus del herpes, los virus de aves de corral y los adenovirus), enfermedad de injerto contra hospedante, rechazo agudo de injerto, y rechazo crónico de injerto. Las enfermedades asociadas a un aumento de la apoptosis incluyen SIDA; trastornos neurodegenerativos (tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la retinitis pigmentosa, la degeneración cerebelar); síndromes mielodisplásticos (tales como la anemia aplástica), heridas isquémicas (tales como las provocadas por infarto de miocardio, ataque y heridas de repercusión), enfermedad del hígado inducida por toxinas (tal como la provocada por el alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia.

Por tanto, en un aspecto, la presente invención está dirigida a un método para potenciar la apoptosis inducida por un ligando de familia TNF, que implica la administración a una célula que expresa el polipéptido DR4 de una cantidad efectiva del ligando DR4, de un análogo o de un agonista capaz de aumentar la señalización mediada por DR4. Preferiblemente, la señalización mediada por DR4 se aumenta para tratar una enfermedad en la que se produce un descenso de apoptosis, un descenso de citoquinas y un descenso de expresión molecular de adhesión. Un agonista puede incluir formas solubles del DR4 y anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido DR4.

En un aspecto adicional, la presente invención está dirigida a un método para inhibir la apoptosis inducida por un ligando de familia TNF, que incluye la administración a una célula que expresa el polipéptido DR4 de una cantidad efectiva de un antagonista capaz de disminuir la señalización mediada por DR4. Preferiblemente, la señalización mediada por DR4 se disminuye para tratar una enfermedad en la que se produce un aumento de apoptosis o de la expresión de NFkB. Un antagonista puede incluir formas solubles de DR4 y anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido DR4.

Por "agonista" se entiende compuestos naturales y sintéticos capaces de potenciar o aumentar la apoptosis. Por "antagonista" se entiende compuestos naturales o sintéticos capaces de inhibir la apoptosis. El hecho de que cualquier "agonista" o "antagonista" candidato de la presente invención pueda potenciar o inhibir la apoptosis se puede determinar usando ensayos de respuesta celular ligando/receptor de la familia TNF conocidos en la técnica, que incluyen los descritos más detalladamente a continuación.

Dicho procedimiento de escrutinio incluye el uso de melanóforos que se transfectan para expresar el receptor de la presente invención. Dicha técnica de escrutinio se describe en el documento PCT WO 92/01810, publicado el 6 de Febrero de 1992. Dicho ensayo se puede emplear, por ejemplo, para realizar el escrutinio de un compuesto que inhibe (o potencia) la activación del polipéptido receptor de la presente invención poniendo en contacto las células de melanóforo que codifican el receptor con un ligando de la familia TNF y con el antagonista (o agonista) candidato. La inhibición o el potenciamiento de la señal generada por el ligando indica que el compuesto es un antagonista o un agonista del mecanismo de señalización ligando/receptor.

Otras técnicas de escrutinio incluyen el uso de células que expresan el receptor (por ejemplo, células CHO transfectadas) en un sistema que mide cambios del pH extracelular provocados por activación del receptor, por ejemplo, tal como se describe en Science 246: 181-296 (Octubre, 1989). Por ejemplo, los compuestos se pueden poner en contacto con una célula que expresa el polipéptido receptor de la presente invención y se puede medir una segunda respuesta mensajera, por ejemplo una transducción de señal o un cambio de pH, para determinar si el compuesto potencial activa o inhibe al receptor.

Otra técnica de escrutinio implica la introducción de ARN que codifica al receptor en Xenopus oocytes para expresar temporalmente el receptor. El oocytes receptor se puede poner en contacto a continuación con el ligando receptor y con un compuesto que vaya a ser escrutado, seguido de la detección de la inhibición o de la activación de una señal de calcio en el caso del escrutinio de compuestos sospechosos de inhibir la activación del receptor.

Otra técnica de escrutinio consiste en la expresión de un constructo en células en las que se liga el receptor a una fosfolipasa C ó D. Dichas células incluyen células endoteliales, células de músculo liso, células de riñón embriónico, etc. El escrutinio se puede realizar como se acaba de indicar mediante la detección de la activación del receptor o de la inhibición de la activación del receptor a partir de la señal de fosfolipasa.

Otro método implica el escrutinio en busca de compuestos que inhiben la activación del polipéptido receptor de la presente invención, antagonistas, mediante la determinación de la inhibición de la unión del ligando marcado a células que presentan el receptor en su superficie. Dicho método implica transfectar una célula eucariótica con ADN que codifica el receptor de tal modo que la célula expresa al receptor sobre su superficie, y poner en contacto la célula con un compuesto en presencia de una forma marcada de un ligando conocido. El ligando se puede marcar, por ejemplo, mediante radioactividad. Se mide la cantidad de ligando marcado unido a los receptores, por ejemplo, midiendo la radioactividad de los receptores. Si el compuesto se une al receptor, determinado por una reducción del ligando marcado que se une a los receptores, se inhibe la unión del ligando marcado con el receptor.

Otros ensayos de escrutinio en busca de agonistas y antagonistas de la presente invención se pueden encontrar en Tartaglia, L.A., y Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267 (7): 4304-4307 (1992).

Por tanto, en un aspecto adicional, se proporciona un método de escrutinio para determinar si un agonista o antagonista candidato es capaz de potenciar o de inhibir una respuesta celular a un ligando de familia TNF. El método implica poner en contacto células que expresan el polipéptido DR4 con un compuesto candidato y un ligando de familia TNF, ensayar una respuesta celular, y comparar la respuesta celular con una respuesta celular estándar, ensayándose el estándar cuando se realizar el contacto con el ligando en ausencia del compuesto candidato, con lo que una respuesta celular por encima del estándar indica que el compuesto candidato es un agonista del mecanismo de señalización ligando/receptor, y una reducción de la respuesta celular en comparación con el estándar indicar que el compuesto candidato es un antagonista del mecanismo de señalización ligando/receptor. Por "ensayar una respuesta celular" se entiende medir cualitativa o cuantitativamente una respuesta celular a un compuesto candidato y/o a un ligando de familia TNF (por ejemplo, determinar o estimar un aumento o una disminución de la proliferación de células T o del marcado de timidita tritiada). Mediante la invención, se puede poner en contacto una célula que expresa polipéptido DR4 con un ligando de familia TNF administrado tanto endógena como
exógenamente.

Los agonistas de acuerdo con la presente invención incluyen compuestos naturales y sintéticos tales como, por ejemplo, los fragmentos de péptido ligando de la familia TNF, que transforman el factor de crecimiento, los neurotransmisores (tales como glutamato, dopamina, N-metil-D-aspartato), supresores de tumor (p53), células T citolíticas y antimetabolitos. Los agonistas preferidos incluyen fármacos quimioterapéuticos tales como, por ejemplo, cisplatina, doxorubicina, bleomicina, citosina arabinósido, mostaza de nitrógeno, metotrexato y vincristina. Otros incluyen etanol y péptido amiloide. (Science 267: 1457-1458 (1995)). Otros agonistas preferidos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales cultivados contra el polipéptido DR4, o contra un fragmento del mismo. Dichos anticuerpos agonistas cultivados contra receptor de familia TNF se describen en Tartaglia, L.A., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9292-9296 (1991); y en Tartaglia, L.A., y Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267 (7): 4304-4307 (1992). Véase también la Solicitud PCT WO 94/09137.

Los antagonistas de acuerdo con la presente invención incluyen compuestos naturales y sintéticos tales como, por ejemplo, el ligando CD40, aminoácidos neutros, zinc, estrógeno, andrógenos, genes víricos (tales como Adenovirus ElB, Baculovirus p35 y IAP, virus cowpox crmA, virus de Epstein-Barr BHRF1, LMP-1, virus africano de la peste porcina LMW5-HL, y virus del herpes yl 34.5), inhibidores de calpaína, inhibidores de cisteína proteasa, y promotores de tumores (tales como PMA, Fenobarbital y Hexaclorociclohexano).

Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido. La tecnología antisentido se puede usar para controlar la expresión génica mediante ADN ó ARN antisentido o a través de formación de hélice triple. Las técnicas antisentido se discuten, por ejemplo, en Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxinucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1998). La formación de hélice triple se discute, por ejemplo, en Lee y col., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney y col., Science 241: 456 (1988); y Dervan y col., Science 251: 1360 (1991). Los métodos se basan en la unión de un polinucleótido a un ADN ó ARN complementario.

Por ejemplo, la porción codificadora 5' de un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro de la presente invención se puede usar para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 pares base de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para ser complementario a una región del gen involucrada en la transcripción, evitando con ello la transcripción y la producción del receptor. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida al mARN in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mARN en el polipéptido receptor. Los oligonucleótidos descritos anteriormente también se pueden administrar a células de tal modo que el ARN o el ADN antisentido puede expresarse in vivo para inhibir la producción del receptor.

Otros antagonistas adicionales de acuerdo con la presente invención incluyen las formas solubles del DR4, es decir, los fragmentos de DR4 que incluyen el dominio de unión a ligando de la región extracelular del receptor de longitud completa. Dichas formas solubles del receptor, que pueden ser naturales o sintéticas, antagonizan la señalización mediada por DR4 compitiendo con el DR4 de la superficie celular por la unión a ligandos de familia TNF. Por tanto, las formas solubles del receptor que incluyen el dominio de unión de ligando son citoquinas nuevas capaces de inhibir la apoptosis inducida por ligandos de familia TNF. Éstos se expresan preferiblemente como dímeros o trímeros, ya que estas formas han demostrado ser superiores a las formas monoméricas del receptor soluble como antagonistas, por ejemplo, las fusiones familia de receptores TNF-IgGFc. En la técnica se conocen otras citoquinas como las descritas, e incluyen Fas B (una forma soluble del receptor Fas de ratón) que actúa fisiológicamente para limitar la apoptosis inducida por ligando Fas (Hughes, D.P. y Crispe, I.N. J. Exp. Med. 182: 1395-1401 (1995)).

Los experimentos establecidos en el Ejemplo 5 demuestran que el DR4 es una molécula que contiene dominio de muerte capaz de activar apoptosis, que es importante en la regulación del sistema inmune. Adicionalmente, los experimentos establecidos a continuación demuestran que la apoptosis inducida por DR4 fue bloqueada por los inhibidores de proteasas de tipo ICE, CrmA y z-VAD-fmk. Por tanto, también se podrían utilizar como antagonistas de la actividad de DR4 las proteasa de tipo ICE, FADD-DN y FLICE-DN/MACHa1C360S.

Los términos "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (mAb), tal como se usan en la presente memoria, pretenden incluir moléculas intactas y fragmentos de las mismas (tal como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')_{2}), que son capaces de unirse a antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden presentar una menor unión no específica a tejido de un anticuerpo intacto (Wahl y col., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante cualquiera de una serie de métodos usando inmunógenos DR4 de la presente invención. Como se ha indicado, dichos inmunógenos DR4 incluyen el polipéptido DR4 de cadena completa (que puede incluir o no la secuencia líder) y fragmentos de polipéptido DR4 tales como el dominio de unión de ligando, el dominio transmembrana, el dominio intracelular y el dominio de
muerte.

Las proteínas y otros compuestos que se unen a dominios DR4 también son agonistas y antagonistas candidatos de acuerdo con la presente invención. Dichos compuestos de unión se pueden "capturar" usando el sistema de dos híbridos de levadura (Fields y Song, Nature 340: 245-246 (1989)). Una versión del sistema de dos híbridos de levadura ha sido descrita por Roger Brent y sus colegas (Gyuris, J., y col., Cell 75: 791-803 (1993); Zervos, A.S. y col., Cell 72: 223-232 (1993)). Preferiblemente, el sistema de dos híbridos de levadura se usa de acuerdo con la presente invención para capturar compuestos que se unen al dominio de unión del ligando DR4 o al dominio intracelular de DR4. Dichos compuestos son buenos candidatos para agonistas y antagonistas de la presente invención.

Por un "ligando de familia TNF" se entiende ligandos naturales, recombinantes y sintéticos que son capaces de unirse a un miembro de la familia de receptores de TNF, y que induce el mecanismo de señalización ligando/receptor. Los miembros de la familia de ligandos TNF incluyen, aunque sin limitación, los ligandos DR4 que incluyen TRAIL, TNF-\alpha, linfotoxina-\alpha (LT-\alpha, también conocida como TNF-\beta), LT-\beta (presente en heterotrímero complejo LT-\alpha2-\beta), FasL, CD40, CD27, CD30, 4-IBB, OX40 y factor de crecimiento nervioso (NFG).

Las aplicaciones terapéuticas representativas de la presente invención se discuten a continuación con más detalle. El estado de inmunodeficiencia que define al SIDA es secundario para una disminución del número y de la función de linfocitos T CD4^{+}. Publicaciones recientes estiman que la pérdida diaria de células T CD4^{+} se encuentra entre 3,5 x 10^{7} y 2 x 10^{9} células (Wei X., y col., Nature 373: 117-122 (1995)). Se cree que una causa del agotamiento de células T CD4^{+} al producirse la infección del VIH es la apoptosis inducida por VIH. De hecho, la muerte celular apoptótica inducida por VIH se ha demostrado no sólo in vitro, sino también, y más importante, en individuos infectados (Ameisen, J.C., AIDS 8: 1197-1213 (1994); Finkel, T.H., y Banda, N.K., Curr. Opin. Immunol. 6: 605-615 (1995); Muro-Cacho, C.A. y col., J. Immunol. 154: 5555-5566 (1995)). Además, la apoptosis y el agotamiento de linfocitos T CD4^{+} están estrechamente relacionados diferentes modelos animales de SIDA (Brunner, T., y col., Nature 373: 441-444 (1995); Gougeon, M.L., y col., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 553-563 (1993)), y no se observa apoptosis en los modelos animales en los que la replicación vírica no conduce a SIDA (Gougeon, M.L., y col., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 553-563 (1993)). Otros datos indican que los linfocitos T no infectados pero imprimados o activados procedentes de individuos infectados por el VIH sufren apoptosis tras encontrarse con el ligando FasL de la familia TNF. Usando líneas de células monocíticas que dan como resultado la muerte tras infectarse con VIH, se ha demostrado que la infección de células U937 con VIH da como resultado la expresión de novo de FasL, y que el FasL media en la apoptosis inducida por VIH (Badley, A.D. y col., J. Virol. 70: 199-206 (1996)). Además, el ligando de familia TNF se detectó en macrófagos no infectados, y su expresión se reguló al alza tras la infección con VIH dando como resultado un exterminio selectivo de linfocitos T CD4 no infectados (Badley, A.D. y col., J. Virol. 70: 199-206 (1996)). Por tanto, mediante la invención, se proporciona un método para tratar a individuos infectados por VIH que implica la administración de un antagonista de la presente invención para reducir el exterminio selectivo de linfocitos T CD4. Los modos de administración y la dosificación se discuten con más detalle más adelante.

Como rechazo a un aloinjerto, el sistema inmune del animal receptor no ha sido imprimado previamente para responder debido a que el sistema inmune en su mayor parte sólo está imprimado por antígenos medioambientales. Los tejidos de otros miembros de la misma especie no se han presentado del mismo modo en que se han presentado, por ejemplo, virus y bacterias. En el caos del rechazo de aloinjerto, se designan regímenes inmunosupresivos para evitar que el sistema inmune alcance la etapa efectora. Sin embargo, el perfil inmune del rechazo de xenoinjerto recuerda a la recurrencia de enfermedad más que al rechazo de aloinjerto. En el caso de la recurrencia de enfermedad, el sistema inmune ya ha sido activado, como se evidencia por la destrucción de las células isleta nativas. Por tanto, en la recurrencia de enfermedad el sistema inmune ya se encuentra en la etapa efectora. Los agonistas de la presente invención son capaces de suprimir la respuesta inmune tanto a aloinjertos como a xenoinjertos debido a que los linfocitos activados y diferenciados en las células efectoras expresarán el polipéptido DR4, y por tanto son susceptibles a compuestos que potencian la apoptosis. De este modo, la presente invención proporciona además un método para crear tejidos privilegiados inmunes. Los antagonistas de la invención también se pueden usar en el tratamiento de la Enfermedad Inflamatoria del Intestino.

Los antagonistas de DR4 pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como la artritis reumatoide, la osteoartritis, la soriasis, la septicemia y la enfermedad inflamatoria del intestino.

Adicionalmente, debido a la expresión de linfoblasto del DR4, el DR4 soluble, se pueden usar mABs agonistas o antagonistas para tratar esta forma de cáncer. Además, el DR4 soluble o mABs neutralizantes se pueden usar para tratar diversas formas crónicas y agudas de inflamación tales como la artritis reumatoide, la osteoartritis, la soriasis, la septicemia y la enfermedad inflamatoria del intestino.

Modos de administración

Los agonistas o antagonistas descritos en la presente memoria se pueden administrar in vitro, ex vivo o in vivo a células que expresan el receptor de la presente invención. Por administración de una "cantidad efectiva" de un agonista o de un antagonista se entiende una cantidad del compuesto que es suficiente para potenciar o para inhibir una respuesta celular al ligando de familia TNF y que incluye polipéptidos. En concreto, por administración de una "cantidad efectiva" de un agonista o antagonista se entiende una cantidad efectiva para potenciar o inhibir la apoptosis mediada por DR4. Por supuesto, cuando se necesite potenciar la apoptosis, se puede co-administrar un agonista de acuerdo con la presente invención junto con un ligando de familia TNF. Un especialista en la técnica apreciará que las cantidades efectivas de una agonista o de un antagonista pueden determinarse empíricamente y se pueden emplear en forma pura o en forma de sal, éster o profármaco farmacéuticamente aceptables. El agonista o el antagonista se pueden administrar en composiciones en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Se comprenderá que, cuando se administra a un paciente humano, el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invención lo decidirá el médico encargado, dentro del alcance de la práctica médica sensata. El nivel específico de dosis terapéuticamente efectiva para cualquier paciente concreto dependerá de factores establecidos en el campo de la medicina.

Como proposición general, la cantidad farmacéuticamente total de polipéptido DR4 administrado parenteralmente por dosis se encontrará en el intervalo de aproximadamente 1 \mug/Kg\cdotdía a aproximadamente 10 mg/Kg\cdotdía referido a peso corporal del paciente, aunque, como se ha indicado anteriormente, esto quedará sometido a la discreción terapéutica. Más preferiblemente, dicha dosis es de al menos 0,01 mg/Kg\cdotdía, y aún más preferiblemente para humanos se encuentra aproximadamente entre 0,01 mg/Kg\cdotdía y 1 mg/Kg\cdotdía correspondientes a la hormona. Si se administran de forma continua, los agonistas o antagonistas de DR4 se administran típicamente en una dosis de aproximadamente 1 \mug/Kg\cdothora a aproximadamente 50 \mug/Kg\cdothora, bien a través de 1-4 inyecciones diarias o bien mediante infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, usando una mini-bomba. También se puede emplear una disolución de bolsa intravenosa.

También se puede establecer una dosificación a un paciente de un modo específico que proporcione una concentración predeterminada de un agonista o de un antagonista en la sangre, determinada por la técnica RIA. De este modo, la dosis del paciente se puede ajustar para alcanzar niveles en sangre regulares, medidos por RIA, en el orden de 50 a 1000 ng/mL, preferiblemente de 150 a 500 ng/mL.

Se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un agonista o antagonista y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, que se pueden administrar oralmente, rectalmente, parenteralmente, intracistemalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, tópicamente (mediante polvos, ungüentos, gotas o parches transdermales), bucalmente, o por medio de un spray oral o nasal. Cabe destacar que se pueden reducir los efectos clínicos secundarios por la co-administración de un agonista y un ligando de familia TNF usando menores dosis del ligando y del agonista. Se entenderá que el agonista se puede "coadministrar" tanto antes, como después, o simultáneamente al ligando de familia TNF, dependiendo de las exigencias de una aplicación terapéutica concreta. Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende un relleno sólido, semisólido o líquido, un diluyente, un material de encapsulación o una formulación auxiliar de cualquier tipo, no tóxicos. El término "parenteral" tal como se usa en la presente memoria se refiere a los modos de administración que incluyen la inyección o la infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención para la inyección parenteral pueden comprender disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones, acuosas o no acuosas estériles farmacéuticamente aceptables, así como polvos estériles para su reconstitución en disoluciones o dispersiones estériles inyectables justo antes de su
uso.

Además de los polipéptidos DR4 solubles, también se puede usar el polipéptido DR4 que contiene la región transmembrana cuando se solubiliza apropiadamente mediante la inclusión de detergentes, tales como CHAPS o NP-40, con un tampón.

Ejemplo 1

Expresión y purificación en E. coli

La secuencia de ADN que codifica la proteína DR4 madura en el clon de cADN depositado (ATCC Nº 97853) se amplifica usando cebadores de oligonucleótido PCR específicos de las secuencias aminoterminales de la proteína DR4 y de las secuencias de vector 3' respecto del gen. Se añaden nucleótidos adicionales que contienen posiciones de restricción para facilitar la clonación a las secuencias 5' y 3', respectivamente.

Los siguientes cebadores se usan para la expresión de dominio extracelular de DR4 de E. coli: cebador 5' 5'-GCGGCATGCATGATCAATCAATTGGCAC-3' (SEQ ID NO: 8), que contiene la posición SphI subrayada. El cebador 3' 5'-GCGAAGCTTTCAATTATGTCCATTGCCTG-3' (SEQ ID NO: 9) contiene la posición HindIII subrayada. El vector es pQE60.

Las posiciones de restricción son convenientes como posiciones de restricción enzimática en el vector de expresión pQE60, que se usan para la expresión bacteriana en estos ejemplos. (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). El pQE60 codifica resistencia antibiótica a ampicilina ("Amp") y contiene un origen bacteriano de replicación ("ori"), un promotor IPTG inducible, una posición de unión de ribosoma ("RBS").

El ADN de DR4 amplificado y el vector pQE60 se digieren ambos con SphI y con HindIII, y los ADNs digeridos se ligan juntos a continuación. La inserción de ADN de la proteína DDCR en el vector pQE60 restringido coloca la región codificadora de la proteína DR4 por debajo del promotor IPTG inducible del vector, ligada operativamente a él, y en la misma estructura con un AUG de inicio posicionado apropiadamente para la traducción de proteína DR4.

La mezcla de ligadura se transforma en células de E. coli competentes usando procedimientos estándar. Dichos procedimientos se describen en Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª Edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). La cepa M15/rep4 de E. coli, que contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lac y confiere resistencia a canamicina ("Kan"), se usa para llevar a cabo el ejemplo descrito en la presente memoria. Dicha cepa, que simplemente es una de las muchas que son adecuadas para expresar proteína DR4, se encuentra disponible comercialmente en Quiagen.

Los transformantes son identificados por su capacidad para crecer en placas LB en presencia de ampicilina y de canamicina. El ADN de plásmido se aisla a partir de colonias resistentes y la identidad del ADN clonado se confirmó mediante análisis de restricción.

Los clones que contienen los constructos deseados se cultivan por la noche ("O/N") en un cultivo líquido en medio LB complementado con ampicilina (100 \mug/mL) y con canamicina (25 \mug/mL).

El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo grande, con una dilución de aproximadamente 1:100 a 1:250. Las células se cultivan hasta una densidad óptica a 600 nm ("OD600") de entre 0,4 y 0,6. A continuación se añade isopropil-B-D-tiogalactopiranósido ("IPTG") hasta una concentración final 1 mM para inducir la transcripción desde los promotores sensibles a represor lac, mediante la desactivación del represor lacI. Posteriormente, las células son incubadas otras 3-4 horas. A continuación las células son cosechadas mediante centrifugación y se rompen mediante métodos estándar. Los cuerpos de inclusión son purificados a partir de las células rotas usando técnicas de recolección de rutina, y la proteína se solubiliza a partir de los cuerpos de inclusión en urea 8 M. La disolución de urea 8 M que contiene la proteína solubilizada se pasa a través de una columna PD-10 en 2X disolución salina tamponada con fosfato ("PBS"), consiguiendo con ello eliminar la urea, intercambiar el tampón y replegar la proteína. La proteína se purifica en una etapa adicional de cromatografía para eliminar endotoxinas. A continuación, se filtra en condiciones esterilizadas. La preparación proteica filtrada en condiciones de esterilidad se almacena en 2X PBS con una concentración de 95 \mug/mL.

Ejemplo 2

Expresión en células de mamífero

La mayoría de los vectores usados para la expresión temporal de una secuencia génica dada en células de mamífero portan el origen SV40 de replicación. Esto permite la replicación del vector hasta números de copia elevados en las células (por ejemplo, células COS) que expresan el antígeno T requerido para el inicio de la síntesis de ADN viral. También se puede utilizar cualquier otra línea celular de mamífero con este propósito.

Un vector de expresión de mamífero típico contiene el elemento promotor, que media en la iniciación de la transcripción del mARN, la proteína que codifica la secuencia y las señales requeridas para la terminación de la transcripción y la poliadenilación del tránscrito. Otros elementos incluyen potenciadores, secuencias Kozak y secuencias de intervención flanqueadas por posiciones dador y aceptor de la división del ARN. Se puede lograr una transcripción altamente eficaz con los promotores temprano y tardío de SV40, las repeticiones terminales largas (LTRs) de Retrovirus, por ejemplo RSV, HTVLI, VIHI y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también se pueden usar señales celulares (por ejemplo, actina humana, promotor). Los vectores de expresión adecuados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como el pSVL y el pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109). Las células hospedantes de mamífero que podrían usarse incluyen células humanas Hela, 283, H9 y Jurkat, células de ratón NIH3T3 y C127, células de mono verde africano Cos 1, Cos 7 y CV1, células QC1-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario de hámster chino.

De forma alternativa, se puede expresar un gen de interés en líneas celulares estables que contienen el gen integrado en un cromosoma. La co-transfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina, permite la identificación y el aislamiento de las células transfectadas.

El gen transfectado también puede ser amplificado para expresar grandes cantidades de la proteína codificada. La DHFR (dihidrofolato reductasa) es un marcador útil para desarrollar líneas celulares que portan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés. Usando este marcador se cultivan células de mamífero en cantidades crecientes de metotrexato para su selección, y se seleccionan las células con mayor resistencia. Estas líneas celulares contienen el(los) gen(es) amplificado(s) en un cromosoma. A menudo se usan células de ovario de hámster chino (CHO) para la producción de proteínas.

Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el promotor fuerte (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Cullen y col., Molecular and Cellular Biology 438: 44701 (Marzo de 1985)), además de un fragmento del potenciador CMV (Boshart y col., Cell 41: 521-530 (1985)). Las posiciones de clonación múltiples, por ejemplo, con las posiciones de ruptura enzimática de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores contienen además del intrón 3', la señal de poliadenilación y de terminación del gen de preproinsuluina de rata.

Clonación y expresión en células CHO

El vector pC4 se usa para la expresión de polipéptido DR4. El plásmido pC4 es un derivado del plásmido pSV2-dhfr (Nº de Acceso ATCC 37146). El plásmido contiene el gen de ratón DHFR bajo control del promotor temprano SV40. Se pueden seleccionar células de ovario de hámster chino, u otras células que carecen de actividad de dihidrofolato que son transfectadas con dichos plásmidos mediante el cultivo de las células en un medio selectivo (MEM alfa menos, Life Technologies) complementado con el agente quimioterapéutico metotraxato. La amplificación de los genes DHR en células resistentes a metotraxato (MTX) está bien documentada (véase, por ejemplo, Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R. y Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253: 1357-1370, Hamlin, J.L. y Ma, C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097: 107-143, Page, M.J. y Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology 9: 64-68). Las células cultivadas en concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencia al fármaco a través de la sobreproducción de la enzima objetivo, DHFR, como resultado de la amplificación del gen DHFR. Si se une un segundo gen al gen DHFR, normalmente es co-amplificado y sobre-expresado. Se sabe en la técnica que dicha estrategia puede usarse para desarrollar líneas celulares que portan más de 1000 copias del gen(es) amplificado(s). Posteriormente, cuando se retira el metotrexato, se obtienen líneas celulares que contienen el gen amplificado integrado en uno o más cromosomas de la célula hospedante.

El plásmido pC4, para expresar el gen de interés, contiene el promotor fuerte de la repetición terminal larga (LTR) del Virus de Sarcoma de Rouse (Cullen, y col., Molecular and Celular Biology, Marzo de 1985: 438-447) además de un fragmento aislado procedente del potenciador del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) (Boshart y col., Cell 41: 521-530 (1985)). Por debajo del promotor se encuentran las siguientes posiciones de ruptura enzimática de restricción sencilla que permiten la integración de los genes: BamHI, XbaI y Asp718. Detrás de estas posiciones de clonación el plásmido contiene el intrón 3' y la posición de poliadenilación del gen de preproinsulina de rata. También se pueden usar otros promotores de alta eficacia para la expresión, por ejemplo, el promotor de actina \beta humana, los promotores temprano y tardío de SV40 o las repeticiones terminales largas procedentes de otros retrovirus, por ejemplo, de VIH y HTLVI. Se pueden usar los sistemas de expresión génica Tet-Off y Tet-On de Clontech y sistemas similares para expresar el polipéptido DR4 de un modo regulado en células de mamífero (Gossen, M. y Bujard, H. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551). Para la poliadenilación del mARN también se pueden usar otras señales, por ejemplo, de la hormona de crecimiento humana o de genes duende. También se pueden seleccionar líneas celulares estables que porten un gen de interés integrado en los cromosomas tras co-transfección para usar más de un marcador seleccionable al principio, por ejemplo, G418 más metotrexato.

El plásmido pC4 se digiere con la enzima de restricción BamHI y a continuación se desfosforila usando fosfastos intestinales de ternero mediante procedimientos descritos en la técnica. A continuación se aisla el vector de gel de agarosa al 1%.

La secuencia de ADN que codifica el polipéptido completo se amplifica usando cebadores de oligonucleótido PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' de la porción deseada del gen. El cebador 5' que contiene la posición BamHI subrayada, una secuencia Kozak, y un codón de inicio AUG, presenta la siguiente secuencia: 5' GCGGGATCCGCCATCATGGCGCCACCACCAGCTAGA 3' (SEQ ID NO: 10). El cebador 3', que contiene la posición BamHI subrayada, presenta la siguiente secuencia: 5' GCGGGATCCTCACTCCAAGGACACGGCAGAGCC 3' (SEQ ID NO: 11).

El fragmento amplificado se digiere con endonucleasa BamHI y a continuación se purifica de nuevo sobre gel de agarosa al 1%. El fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan entonces al T4 ADN ligasa. A continuación se transforman células de E. coli HB101 ó XL-1 Azul y se identifican bacterias que contienen el fragmento insertado en el plásmido pC4 usando, por ejemplo, análisis de enzima de restricción.

Las células de ovario de hámster chino que carecen de un gen DHFR activo se usan para la transfección. Se cotransfectan cinco \mug del plásmido de expresión pC4 con 0,5 \mug del plásmido pSVneo usando lipofectina (Felgner y col., ver anteriormente). El plásmido pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos que incluye G418. Las células se siembran en MEM alfa menos complementado con 1 mg/mL de G418. Tras 2 días, las células son tripsinizadas y sembradas en placas de clonación de hibridoma (Greiner, Alemania) en MEM alfa menos complementado con 10, 25 ó 50 ng/mL de metotrexato más 1 mg/mL de G418. Después de aproximadamente 10-14 días se tripsinizan clones sencillos y a continuación se siembran en placas petri de 6 pocillos o en matraces de 10 mL usando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Los clones que crecen a las mayores concentraciones de metotrexato son transferidos a continuación a nuevas placas de 6 pocillos que contienen concentraciones de metotrexato incluso superiores (1 \muM, 2 \muM, 5 \muM, 10 mM, 20 mM). Se repite el mismo procedimiento hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración de 100-200 \muM. Se analiza la expresión del producto génico deseado mediante, por ejemplo, SDS-PAGE y análisis Western Blot, o mediante análisis de HPLC de fase inversa.

Ejemplo 3

Clonación y expresión del domino extracelular soluble de DR4 en un sistema de expresión de baculovirus

La secuencia de cADN que codifica el dominio extracelular soluble de la proteína DR4 en el clon depositado (ATCC Nº 97853) se amplifica usando cebadores de oligonucleótido PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen.

El cebador 5' correspondiente a DR4 presenta la secuencia: 5' GCGGGATCCGCCATCATGGCGCCACCACCAG
CTAGA 3' (SEQ ID NO: 10), que contiene la posición enzimática de restricción BamHI subrayada. Insertado en un vector de expresión, tal como se describe más adelante, el extremo 5' del fragmento amplificado que codifica DR4 proporciona un péptido señal de ruptura eficaz. En la porción de vector del constructo se localiza de forma apropiada una señal eficaz para la iniciación de la traducción en células eucarióticas, tal como describe Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987).

El cebador 3' correspondiente a DR4 presenta la secuencia:

5' GCGGGATCCTCAATTATGTCCATTGCCTG 3' (SEQ ID NO: 12), que contiene la restricción BamHI subrayada seguida de los nucleótidos complementarios a la secuencia de nucleótido de DR4 establecida en la Figura 1, seguido de un codón de parada.

El fragmento amplificado se aisla en gel de agarosa al 1% usando un kit disponible comercialmente ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca). A continuación el fragmento se digiere con BamHI y Asp718 y se purifica de nuevo sobre gel de agarosa al 1%.

Se usa el vector pA2 para expresar la proteína DR4 en el sistema de expresión de baculovirus, usando métodos estándar, tales como los descritos en Summers y col., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Boletín de la Estación Experimental Agrícola de Texas Nº 1555 (1987). Este vector de expresión contiene el promotor poliédrico fuerte del virus Autograph californica nuclear polyhedrosis (ACMNPV) seguido de convenientes posiciones de restricción. Para una selección fácil de virus recombinante se inserta el gen de beta-galactosidasa de E. coli con la misma orientación que el promotor poliédrico, y se continúa con la señal de poliadenilación del gen poliédrico. Las secuencias poliédricas están flanqueadas a ambos lados por secuencias víricas para la recombinación homóloga mediada por células con ADN vírico natural para generar virus viables que expresan el polinucleótido clonado.

Se podrían usar otros muchos vectores de baculovirus en lugar del pA2, tal como el pAc373, el pVL941 y el pAcIM1, siempre que, como apreciarán rápidamente los especialistas en la técnica, la construcción proporcione señales localizadas apropiadamente para la transcripción, la traducción, el tráfico y otros similares, tal como el AUG en estructura y un péptido señal, según se requiera. Dichos vectores se describen en Luckow y col., Virology 170: 31-39, entre otros.

El plásmido se digiere con la enzima de restricción Bam HI y a continuación se desfosforila usando fosfatasa de intestino de ternero, usando procedimientos rutinarios conocidos en la técnica. A continuación el ADN se aisla en gel de agarosa al 1% usando un kit disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca).

El fragmento y el plásmido desfosforilado se ligan junto con ligasa de ADN T4. Se transforman células HB101 de E. coli con mezcla de ligación y se extienden sobre placas de cultivo. Se identifican las bacterias que contienen el plásmido con el gen DDCR humano mediante digestión de ADN procedente de colonias individuales usando BamHI y analizando entonces el producto de digestión mediante electroforesis de gel. La secuencia del fragmento clonado se confirma mediante secuenciamiento de ADN. Este plásmido se designa en la presente memoria pBac DR4.

Se co-transfectan 5 \mug del plásmido pBac DR4 con 1,0 \mug de un ADN de baculovirus linealizado disponible comercialmente ("ADN de baculovirus BaculoGold^{TM}", Pharmingen, San Diego, CA), usando el método de lipofección descrito por Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 (1987). Se mezcla 1 \mug de ADN de virus BaculoGold^{TM} y 5 \mug del plásmido pBac DR4 en un pocillo esterilizado de una placa de microtitulación que contiene 50 \muL de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Después se añaden 10 \muL de Lipofectina más 90 \muL de medio de Grace, se mezcla y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación se añade gota a gota la mezcla de transfección a células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711), sembradas en una placa de cultivo de tejido de 35 mm con 1 mL de medio de Grace sin suero. Se agita la placa hacia delante y hacia atrás para mezclar la nueva disolución añadida. A continuación se incuba la placa durante 5 horas a 27ºC. Tras 5 horas, se retira la disolución de transfección de la placa y se añade 1 mL de medio de insecto de Grace complementado con un 10% de suero de ternero fetal. Se devuelve la placa a un incubador y se continúa con el cultivo a 27ºC durante cuatro días.

Después de cuatro días se recoge el sobrenadante y se realiza un ensayo de placa, tal como describen Summers y Smith, citados anteriormente. Se usa un gel de agarosa con "Gal Azul" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) para permitir una fácil identificación y un fácil aislamiento de los clones que expresan gal, que producen plaquetas teñidas de azul. (También se puede encontrar una descripción detallada de un "ensayo de placa" de este tipo en la guía del usuario correspondiente al cultivo de células de insecto y a baculovirología, distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10).

Cuatro días después de la dilución en serie, se añadió el virus a las células. Tras una incubación apropiada, se recogieron plaquetas teñidas de azul con la punta de una pipeta Eppendorf. A continuación se resuspende el agar que contiene los virus recombinantes en un tubo Eppendorf que contiene 200 \muL de medio de Grace. Se retira el agar mediante una breve centrifugación y se usa el sobrenadante que contiene el baculovirus recombinante para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días después se cosechan los sobrenadantes de dichas placas de cultivo y a continuación se almacenan a 4ºC. Se identifica un clon que contiene DR4 insertado apropiadamente mediante análisis de ADN que incluye mapeado de restricción y secuenciamiento. En la presente memoria se designa como V-DR4.

Se cultivan células Sf9 en medio de Grace complementado con FBS al 10% desactivado térmicamente. Las células se infectan con el baculovirus recombinante V-DR4 con una multiplicidad de infección ("MOI") de aproximadamente 2 (entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3). Seis horas después se retira el medio y se recoloca con medio SF900 II menos metionina y cisteína (disponible en Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 horas después, se añaden 5 gCi de ^{35}S-metionina y 5 \muCi de ^{35}S-cisteína (disponible en Amersham). Las células se incuban otras 16 horas y a continuación se cosechan mediante centrifugación, se someten a lisis y se visualizan las proteínas marcadas mediante SDS-PAGE y autorradiografía.

Ejemplo 4

Distribución en tejido de la expresión génica de DR4

Se lleva a cabo el análisis Northern blot para examinar la expresión del gen DR4 (ATCC Nº 97853) en tejidos humanos, usando métodos descritos por, entre otros, Sambrook y col., citado anteriormente. Se marca una sonda de cADN que contiene la secuencia de nucleótidos completa de la proteína DR4 (SEQ ID NO: 1) con ^{32}P usando el sistema de marcado de ADN rediprime^{TM} (Amersham Life Science), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras el marcado, se purifica la sonda usando una columna CHROMA SPIN-100^{TM} (Clontech Laboratorios, Inc.), de acuerdo con el número de protocolo del fabricante PT1200-1. La sonda marcada purificada se usa a continuación para examinar diversos tejidos humanos en busca de mARN de DR4.

Las manchas correspondientes a análisis Northern blot en Múltiples Tejidos (MTN) que contienen diversos tejidos humanos (H) o diversos tejidos de sistema inmune humano (IM) se obtienen de Clontech y se examinan con la sonda marcada usando una disolución de hibridación ExpressHyb^{TM} (Clontech) de acuerdo con el protocolo del fabricante número PT1190-1. Después de la hibridación y del lavado, las manchas se montan y se exponen a filmación a
-70ºC toda la noche, y las películas se desarrollan de acuerdo a procedimientos estándar. La expresión de DR4 se detectó en tejidos enriquecidos en linfocitos que incluyen células amnióticas, de corazón, de cáncer de hígado, de riñón, leucocitos sanguíneos periféricos, células T activadas, K562 más PMA, células W138, células Th2, amígdalas humanas y capa leucoplaquetar agotada en CD34 (sangre de cordón). Se puede prever que el DR4 desempeña un papel en la homeostasis de linfocitos.

Ejemplo 5

Apoptosis inducida por DR4

La sobreexpresión de Fas/APO-1 y TNFR-1 en células de mamífero imita la activación de receptor (M. Muzio, y col., Cell 85, 817-827 (1996); M.P. Boldin, y col., Cell 85, 803-815 (1996)). Por tanto, este sistema se utilizó para estudiar el papel funcional de DR4. La expresión temporal de DR4 en células MCF7 de carcinoma de pecho humano y en células embriónicas 293 de riñón humano indujo una apoptosis rápida.

Se realizan ensayos de muerte celular esencialmente como se ha descrito anteriormente (A.M. Chinnaiyan, y col., Cell 81, 505-12 (1995); M.P. Boldin, y col., J. Biol. Chem. 270, 7795-8 (1995); F.C. Kischkel, y col., EMBO 14, 5579-5588 (1995); A.M. Chinnaiyan, y col., J. Biol. Chem. 271, 4961-4965 (1996)). En pocas palabras, líneas celulares clonales de carcinoma de pecho transfectadas de forma estable con el vector solo o con un constructo de expresión CrmA (M. Tewari, y col., J. Biol. Chem. 270, 3255-60 (1995)), se transfectan temporalmente con pCMV-DR4-galactosidasa (o con pCMV-DR4-galactosidasa (que carece de dominio de muerte) en presencia de un exceso 10 a 1 de constructos de expresión pcDNA3 que codifican las proteínas indicadas usando lipofectamina (GIBCO-BRL). Del mismo modo, se transfectan células 293 usando el método de CaPO_{4}. El inhibidor z-VAD-fmk de la familia ICE (Enzyme Systems Products, Dublín, CA) se añade a las células en una concentración 10 \muM, 5 horas después de la transfección. 32 horas después de la transfección, se fijan células y se tiñen con X-Gal tal como se ha descrito previamente (A.M. Chinnaiyan, y col., Cell 81,505-12 (1995); M.P. Boldin, y col., J. Biol. Chem. 270, 7795-8 (1995); F.C. Kischkel, y col., EMBO 14, 5579-5588 (1995)).

Las células mostraron las alteraciones morfológicas típicas de las células que sufren apoptosis, se vuelven redondeadas, se condensan y se separan de la placa. Similar al TNFR-1 y al Fas/APO-1 (M. Muzio, y col., Cell 85, 817-827 (1996); M.P. Boldin, y col., Cell 85, 803-815 (1996); M. Tewari, y col., J. Biol. Chem. 270, 3255-60 (1995)), la apoptosis inducida por DR4 se bloqueó por los inhibidores de proteasas de tipo ICE, CrmA y z-VAD-fmk.

Debe ser evidente que la invención puede llevarse a la práctica en cualquier otro modo diferente al descrito particularmente en la anterior descripción y Ejemplos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: NI, JIAN

\hskip3,9cm

ROSEN, CRAIG A.

\hskip3,9cm

PAN, JAMES G.

\hskip3,9cm

GENTZ, REINER L.

\hskip3,9cm

DIXIT, VISHVA M.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Receptor-4 que contiene el Dominio de Muerte

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: HUMAN GENOME SCIENCES, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 9410 KEY WEST AVENUE

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: ROCKVILLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: MD

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 20850

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-ENE-1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: BROOKES, ANDERS A

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.373

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: PF355

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (301) 309-8504

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (301) 309-8512

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2152 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 19..1422

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 468 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 669 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 909 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 833 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 426 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 339 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGCATGCA TGATCAATCA ATTGGCAC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGGATCCG CCATCATGGC GCCACCACCA GCTAGA

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGGATCCT CACTCCAAGG ACACGGCAGA GCC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGGATCCT CAATTATGTC CATTGCCTG

\hfill

29

Claims (17)

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 de longitud completa que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, que incluye la secuencia líder predicha;

(b)

una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 de longitud completa que presenta la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 2, que incluye la secuencia líder predicha pero que carece de la metionina aminoterminal;

(c)

una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 maduro (polipéptido de longitud completa sin el líder) que presenta la secuencia de aminoácidos de las posiciones aproximadas 24 a 468 de la SEQ ID NO: 2;

(d)

una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 de longitud completa que presenta la secuencia de aminoácidos completa que incluye el líder codificado por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853;

(e)

una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 de longitud completa que presenta la secuencia de aminoácidos completa que incluye el líder pero que carece de la metionina aminoterminal, codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853;

(f)

una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido DR4 maduro que presenta la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853;

(g)

una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular de DR4 que presenta la secuencia de aminoácidos aproximada de 24 a 238 de la SEQ ID NO: 2, o codificada por el Depósito ATCC Nº 97853;

(h)

una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio transmembrana de DR4 que presenta la secuencia de aminoácidos de las posiciones aproximadas 239 a 264 de la SEQ ID NO: 2, o codificada por el Depósito ATCC Nº 97853;

(i)

una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio intracelular de DR4 que presenta la secuencia de aminoácidos de las posiciones aproximadas 265 a 468 de la SEQ ID NO: 2, o codificada por el Depósito ATCC Nº 97853;

(j)

una secuencia de ácido nucleico que presenta la secuencia de nucleótidos completa de la SEQ ID NO: 1 o del clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853;

(k)

una secuencia de ácido nucleico que presenta la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 que codifica el polipéptido DR4, que presenta la secuencia de aminoácidos de las posiciones 2 a 468 de la SEQ ID NO: 2;

(l)

una secuencia de ácido nucleico que presenta la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 que codifica el dominio extracelular del polipéptido DR4 que presenta la secuencia de aminoácidos aproximada de 24 a 238 de la SEQ ID NO: 2;

(m)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos n a 468 de la SEQ ID NO: 2, en la que n es un número entero en el intervalo entre 1 y 132;

(n)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a m de la SEQ ID NO: 2, en la que m es un número entero en el intervalo entre 221 y 468;

(o)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que presenta la secuencia de nucleótidos que consiste en los residuos n a m de la SEQ ID NO: 2, en la que n y m son números enteros como los definidos en los apartados (m) y (n) anteriores, respectivamente;

(p)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que consiste en una porción de la secuencia de aminoácidos de DR4 completa codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853, en la que dicha porción excluye los aminoácidos del 1 a aproximadamente el 131 del término amino de dicha secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853;

(q)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que consiste en una porción de la secuencia de aminoácidos de DR4 completa codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853, en la que dicha porción excluye los aminoácidos desde el 1 a aproximadamente el 249 del extremo carboxi de dicha secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853;

(r)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que consiste en una porción de la secuencia de aminoácidos de DR4 completa codificada por el clon de cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 97853, en la que dicha porción incluye una combinación de cualesquier eliminaciones de los extremos amino y carboxi en los apartados (p) y (q) anteriores;

(s)

una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos el 95% a una secuencia de nucleótidos tal como se ha definido en los apartados (a) a (r), y que codifica un polipéptido que presenta actividad de proteína DR4;

(t)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos de uno cualquiera de los apartados (a) a (r), y que codifica un polipéptido que presenta actividad de proteína DR4;

(u)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido DR4 que, salvo por al menos una sustitución de aminoácido conservativa, es un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de uno cualquiera de los apartados (a) a (r); y

(v)

una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas de hibridación con una secuencia de nucleótidos como las definidas en los apartados (a) a (r), en la que dicha secuencia de nucleótidos que se hibrida no se hibrida en condiciones severas de hibridación con un polinucleótido que presente una secuencia de nucleótidos que consista únicamente en residuos de A o únicamente en residuos de T; y en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que es capaz de unirse al ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL).

o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.

2. Una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una porción portadora de epítopo de un polipéptido DR4 que presenta la secuencia de aminoácidos definida en uno cualquiera de los apartados (a) a (i) y (k) a (r) de la reivindicación 1, con la condición de que dicha porción portadora de epítopo no esté contenida en la siguiente secuencia de aminoácidos:

22

23

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, que codifica una porción que porta epítopo de un polipéptido DR4, en la que la secuencia de aminoácidos de dicha porción se selecciona del grupo que consiste en: un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde aproximadamente el 35 a aproximadamente el 92 de la SEQ ID NO: 2, un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde aproximadamente el 169 hasta aproximadamente el 240 de la SEQ ID NO: 2, un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde aproximadamente el 267 hasta aproximadamente el 298 de la SEQ ID NO: 2, y un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido desde aproximadamente el 330 hasta aproximadamente el 364 de la SEQ ID NO: 2.

4. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es ADN o ARN.

5. Un método para la fabricación de un vector que comprende la inserción de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un vector.

6. Un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o producido mediante el método de la reivindicación 5.

7. Un método para la fabricación de una célula hospedante que comprende la introducción del vector de la reivindicación 6 en una célula hospedante.

8. Una célula hospedante que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el vector de la reivindicación 6, o que es producida mediante el método de la reivindicación 7.

9. Un método para la producción de un polipéptido DR4 que comprende cultivar la célula hospedante de la reivindicación 8 en condiciones tales que dicho polipéptido se exprese, y recuperar dicho polipéptido.

10. Un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, o que puede obtenerse mediante el método de la reivindicación 9.

11. Un polipéptido que comprende una porción portadora de epítopo de la proteína DR4, en el que dicha porción es codificada por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 ó 3.

12. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 10 u 11.

13. Una molécula antisentido capaz de controlar la expresión del polipéptido de la reivindicación 10 u 11, hibridándose dicha molécula antisentido de forma específica con la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Un agonista del polipéptido de las reivindicaciones 10 u 11 que es un anticuerpo de la reivindicación 12 capaz de potenciar la actividad apoptótica de dicho polipéptido.

15. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 10 u 11, el anticuerpo de la reivindicación 12, el agonista de la reivindicación 14 o el antagonista de la reivindicación 13 y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Una composición de diagnóstico que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un anticuerpo de la reivindicación 12.

17. Un método de escrutinio para detectar un antagonista o un antagonista del polipéptido de la reivindicación 10 u 11 que comprende cultivar la célula hospedante de la reivindicación 8 en las condiciones en la que dicho polipéptido se expresa, poner en contacto dicha célula hospedante con un compuesto candidato y con un ligando de dicho polipéptido, evaluar la respuesta celular, y comparar la respuesta evaluada con una respuesta celular producida cuando dicha célula hospedante se pone en contacto únicamente con dicho ligando.