ES2579277T3

ES2579277T3 - Utilización combinada de un agente de bloqueo CTLA-4 y una terapia linfotóxica en el tratamiento de tumores

Info

Publication number: ES2579277T3
Application number: ES10180032.4T
Authority: ES
Inventors: Patrick James Allison; Dana R. Leach; Matthew F. Krummel
Original assignee: University of California Berkeley; University of California, San Diego
Current assignee: University of California Berkeley; University of California, San Diego
Priority date: 1995-12-04
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 2016-08-09
Anticipated expiration: 2016-12-04
Also published as: PT2332561E; EP2106800A1; LU91927I2; CA2770851A1; CA2770851C; JP4477701B2; EP2332561B1; ES2318853T3; AU730500B2; DE69637762D1; DK2332561T3; EP0865293A1; DE122012000002I1; EP0865293B1; EP2332561A1; AU1147397A; WO1997020574A1; PT865293E; CA2239448A1; US5811097A

Abstract

Agente de bloqueo CTLA-4 que es un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento del mismo para utilizar en un método de tratamiento combinado de un tumor con una terapia linfotóxica que es quimioterapia o radioterapia, en el que en el método la terapia linfotóxica se administra antes o después de la terapia con anti-CTLA-4.

Description

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obtener la máxima eliminación de las células tumorales, ya que la respuesta inmune facilitada por CTLA-4 elimina la masa tumoral residual. Esto minimiza los frecuentemente terribles efectos secundarios, incluyendo la inmunosupresión asociada con la aplicación convencional de quimioterapia. Consideraciones similares son aplicables a la radioterapia. La dosis de agente quimioterapéutico o radiación si se utiliza conjuntamente con un

5 agente de bloqueo CTLA-4 se encuentra preferiblemente entre el 2 y 20%, más preferiblemente entre 5 y 10% de la dosis utilizada normalmente.

[0039] Los agentes de bloqueo de CTLA-4, especialmente aquellos que consisten en un anticuerpo para la parte extracelular de CTLA-4, se pueden utilizar en combinación con uno o más agentes estimulantes de la respuesta inmune. Los agentes de bloqueo de CTLA-4 también se pueden combinar conjuntamente con el tratamiento de radiación y/o el tratamiento quimioterapéutico que producen indirectamente agentes estimulantes de la respuesta inmune. Dicho uso combinado implica el uso simultáneo o secuencial del agente de bloqueo CTLA-4 y el agente estimulante de la respuesta inmune y puede tener lugar en diferentes puntos. Por ejemplo, el agente de bloqueo CTLA-4 se puede administrar en un punto lejos del tumor después de haber irradiado directamente el tumor.

15 Alternativamente, se puede utilizar un agente quimioterapéutico para tratar células tumorales de manera local o sistémica seguido del uso de un agente de bloqueo CTLA-4.

[0040] Entre las situaciones caracterizadas por una respuesta deficiente de células T huésped a antígeno se incluyen los tumores. La administración de los bloqueadores de CTLA-4 de la presente invención cambia específicamente el fenotipo de las células T activadas, dando lugar a una mayor respuesta a la activación mediada por antígeno. Es de interés el tratamiento de primates, más particularmente humanos, pero otros mamíferos también se pueden beneficiar del tratamiento, particularmente animales domésticos, tales como equinos, bovinos, ovinos, felinos, caninos, murinos, lagomorfa y similares.

25 [0041] La formulación debe administrarse en una dosis eficaz para aumentar la respuesta de las células T a la estimulación antigénica. La respuesta de las células T activadas se verán afectadas por el tratamiento de la presente invención en un mayor grado que las células T en reposo. La determinación de la respuesta de las células T variará con el estado patológico que se trata. Las mediciones útiles de la actividad de células T son la proliferación, la libración de citoquinas, por ejemplo IL-2, IFNg, TNFa; la expresión de células T de marcadores, tales como CD25 y CD69; y otras mediciones de la actividad de células T conocidas en la técnica.

[0042] El tratamiento se puede realizar en combinación con la administración de citoquinas que estimulan las células presentadoras de antígenos, por ejemplo factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF),

35 interleuquina 3 (IL-3), interleuquina 12 (IL-12), etc. Se pueden utilizar proteínas y/o citoquinas adicionales conocidas por potenciar la proliferación y la secreción de células T, tales como IL-1, IL-2, B7, anti-CD3 y anti-CD28, de manera simultánea o secuencial con los agentes de bloqueo para aumentar la respuesta inmune. La terapia se puede combinar con la transfección de células tumorales o linfocitos que se infiltran en los tumores con genes que codifican para diversas citoquinas o receptores de la superficie celular (véase Ogasawara et al. (1993) Cancer Res. 53: 35618; y Townsend et al. (1993) Science 259:368-370). Por ejemplo, se ha observado que la transfección de células tumorales con ADNc que codifica CD80 conduce al rechazo de células tumorales transfectadas, y puede inducir inmunidad a una estimulación posterior por las células tumorales parentales no transfectadas (Townsend et al. (1994) Cancer Res. 54:6477-6483). La terapia aumenta este efecto.

45 [0043] Las células T huésped específicas de tumores se pueden combinar ex vivo con los agentes de bloqueo de la presente invención, y antígenos o células tumorales y se reintroducen en el paciente. Cuando se administran a un huésped, las células estimuladas inducen una reacción tumoricida que da lugar a una regresión tumoral. Las células huésped se pueden aislar de una serie de fuentes, tales como nódulos linfáticos, por ejemplo, inguinales, mesentéricos, auxiliares distales superficiales, etc.; médula ósea; bazo, o sangre periférica, así como del tumor, por ejemplo, linfocitos que se infiltran en el tumor. Las células pueden ser alogénicas o, preferiblemente autólogas. Para la estimulación ex vivo, las células huésped se extraen de manera aséptica, y se suspenden en cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Las células se estimulan mediante alguno de una serie de protocolos, particularmente combinaciones de B7, anti-CD28, etc., en combinación con los agentes de bloqueo. Las células estimuladas se reintroducen al huésped mediante inyección, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, etc. en una

55 serie de formulaciones farmacéuticas, incluyendo aditivos, tales como aglutinantes, sustancias de carga, portadores, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes y tampones. Los diluyentes y excipientes adecuados son agua, solución salina, glucosa y similares.

[0044] Entre las células tumorales cuyo crecimiento puede disminuir mediante la administración de los agentes de bloqueo de la presente invención se incluyen carcinomas, por ejemplo adenocarcinomas, que pueden tener un sitio primario del tumor en la mama, ovario, endometrio, cérvix, colon, pulmón, páncreas, esófago, próstata, intestino delgado, recto, útero o estómago; y carcinomas de células escamosas, que pueden tener un sitio primario en los pulmones, cavidad oral, lengua, laringe, esófago, piel, vejiga, cérvix, párpado, conjuntiva, vagina, etc. Otras clases de tumores que se pueden tratar incluyen sarcomas, por ejemplo, sarcomas miogénicos; neuromas; melanomas,

65 leucemias; ciertos linfomas; tumores trofoblásticos y de células germinales; tumores neuroendocrinos y neuroectodérmicos.

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administración parenteral, el agente de bloqueo se puede formular como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. También se pueden utilizar liposomas o vehículos no acuosos, tales como aceites fijados. La formulación se esteriliza mediante técnicas conocidas en el sector.

5 [0053] El efecto funcional del bloqueo de CTLA-4 también se puede inducir mediante la administración de otros agentes que mimetizan el cambio en la señalización intracelular observada con la invención de la presente invención. Por ejemplo, se sabe que se pueden activar quinasas citoplásmicas específicas en respuesta a la unión de receptores extracelulares. Los agentes que bloquean la actividad quinasa tendrían un efecto fisiológico similar a la unión a un receptor de bloqueo. De manera similar, los agentes que aumentan las concentraciones de AMP cíclico, GTP y los niveles intracelulares de calcio pueden producir efectos fisiológicos que son análogos a los observados con la unión a receptores extracelulares.

[0054] los siguientes ejemplos se disponen a modo de ilustración y no a modo de limitación. La presente invención 15 es tal como se define en las reivindicaciones. La materia fuera de las reivindicaciones es de referencia.

Parte Experimental

EJEMPLO 1

Generación de Reactivo de Anticuerpos Monoclonales Con CTLA-4 de Ratón

a) Preparación de un Inmunógeno de CTLA-4 de Ratón

25 [0055] Se obtuvo una proteína de fusión que comprendía las partes extracelulares del gen del CTLA-4 de ratón y la región constante de IgGI humana, denominada mCTLA4-Hgl, por parte de los Drs. P. Lane y K. Karjalainen (Baser Institute for Immunology, Basilea, Suiza). Se construyó un vector de expresión capaz de expresar la proteína mCTLA4-Hgl tal y como se describe [Lane, et al. Immunol. 80:56 (1993)]. En resumen, se generaron secuencias que codifican las partes extracelulares de la molécula CTLA-4 de ratón utilizando PCR. Se utilizó la siguiente pareja de cebadores para amplificar estas secuencias de CTLA-4 a partir de un plásmido que contiene secuencias de CTLA-4 de ratón: 5’-TTACTCTACTCCCTGAGGAGCTCAGCACATTTGCC-3’ (SEC ID Nº:1) y 5’-TATACTTACCAGAATCCG GGCATGGTTCTGGATCA-3’ (SEC ID Nº:2). A continuación, se insertaron las secuencias de CTLA-4 amplificadas en un vector de expresión que permite la inserción de un gen de interés en dirección 5’ (“upstream”) de secuencias que codifican los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la proteína IgG1 humana [Traunecker, et al. Trends Biotech.

35 9:109 (1991)]. Cada cebador contenía sitios de restricción apropiados para la subclonación en del vector de expresión de IgG1 humana, junto con un sitio dador de empalme (“splice”) en 3' dentro del cebador de 3' para empalmarse a los exones de gI humana correctamente. El plásmido que contenía secuencias que codificaban la proteína de fusión mCTLA-4-HgI se denominó pH -APr-1-neo-mCTLA4-Hgl.

[0056] Para expresar la proteína mCTLA4-HgI, se transfirió el vector de expresión pH APr-1-neo-mCTLA4-Hgl en la línea de plasmacitoma de ratón, J558L (J558L es idéntica a la línea celular J558 que está disponible en ATCC [ATCC TIB 6]) utilizando la técnica estándar de fusión de protoplastos. Se cultivaron células J558L a 5 x 104 células/ml. A continuación, se seleccionaron células J558L transfectadas en presencia de medio que contenía xantina (Sigma) y ácido micofenólico (Calbiochem, LaJolla, CA) (medio selectivo). Se aplicó el medio selectivo 24h

45 después de la transfección y se cribaron dos semanas después los clones positivos (es decir, clones que crecieron en el medio selectivo). Se identificaron los clones que secretaban la proteína de fusión utilizando un ELISA para IgG1 humana. Se identificó un buen clon de secreción y se designó como clon nº 15. Se marcaron metabólicamente las células del clon nº 15 con metionina [35S] y se inmunoprecipitaron las proteínas secretadas con proteína A y se resolvieron las proteínas precipitadas en un gel de poliacrilamida SDS. Se observó que la proteína mCTLA4-Hgl migraba en geles de SDS-PAGE como un monómero de PM de aproximadamente 60.000 bajo condiciones reductoras y como un dímero bajo condiciones no reductoras.

[0057] Se obtuvieron preparaciones purificadas de proteína mCTLA4-Hg1 mediante cromatografía de afinidad de sobrenadantes de cultivo de células de clon nº 15 en una columna de proteína A-Sefarosa (Zymed, South San

55 Francisco, CA). En resumen, las células J558 que expresaban la proteína mCTLA4-Hgl crecieron en IMDM complementado con FCS al 5%, glutamina, 2ME y antibióticos. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo de las células y se centrifugaron a 1500 x g para eliminar cualquier célula restante y se filtró el sobrenadante depurado a través de un tamaño de poro de 0,4 micras. Se ajustó el sobrenadante filtrado hasta un pH 8,5 utilizando NaOH 1N; a continuación, se hizo pasar el sobrenadante por una columna de proteína A-Sefarosa de 2 ml (volumen empaquetado) a una velocidad de flujo de 2 ml/min. Se observa que la línea celular J558 produce una inmunoglobulina adicional (es decir, además de la proteína de fusión CTLAIg de ratón) que se une a la proteína G; por lo tanto, no se recomienda el uso de resinas de proteína G para la purificación de la proteína mCTLA4-Hgl a partir de células J558 transfectadas.

65 [0058] Se lavó la columna de proteína A con de 20 a 30 volúmenes de columna de PBS y se eluyó la proteína de

fusión con dietilamina 50 mM (pH 11,0). Se recogieron fracciones de dos mililitros en tubos que contenían 0,2 ml de Tris-HCl 1M para neutralizar el pH de la muestra. Se determinó la absorbancia a 280 nm y se utilizó para evaluar la concentración de proteína de cada fracción. Se combinaron las fracciones que contenían proteína y se dializaron durante toda la noche contra 2 a 3 cambios de PBS (1 litro por cambio). Se confirmó la presencia de proteína

5 mCTLA4-Hgl mediante SDS-PAGE, que mostró una banda de aproximadamente 40 kD (el peso molecular predicho de la proteína de fusión). Además, se ensayó la proteína mCTLA4-Hgl purificada en un ELISA utilizando un anticuerpo IgG1 antihumano (HP6058; se utilizó el hibridoma de HP6058 (ATCC CRL 1786) como la fuente de anticuerpos de HP6058).

b) Inmunización de Hámsters

[0059] Para inmunizar hámsters con la proteína de fusión de CTLA-4 de ratón, se utilizó proteína mCTLA4-Hgl purificada (de aquí en adelante referida como CTLA-4Ig) para cubrir células de bacterias Staphylococcus aureus (StaphA) matadas por calor (Calbiochem, LaJolla, CA). Se inyectó a hámsters Golden Syrian de seis semanas de

15 vida en la base de las patas 50 l (volumen empaquetado) de bacterias StaphA matadas por calor cubiertas con aproximadamente 100 g de CTLA-4Ig suspendida en 0,2 ml de PBS. Las células de StaphA se cubrieron tal como se indica a continuación.

[0060] Se prepararon células de StaphA de acuerdo con el protocolo del fabricante hasta una concentración de 10% p/v en solución salina (NaCl al 0,9%). Se centrifugó un ml de emulsión de células bacterianas a 1.400 x g para precipitar las bacterias y se extrajo el sobrenadante. Se añadió una solución de 1 ml que contenía aproximadamente 100 g de CTLA-4Ig purificada en PBS al residuo y se incubó la mezcla a 37ºC durante 2 horas con agitación. A continuación, se precipitaron las bacterias mediante centrifugación tal y como se describe anteriormente; se lavó el residuo dos veces con 1 ml de PBS/lavado. A continuación, se resuspendieron las células bacterianas cubiertas con

25 CTLA-4Ig en aproximadamente 200 l de PBS; se inyectaron 50 l de esta preparación por base de las patas.

[0061] Se administraron un total de cinco inyecciones por hámster. El día del refuerzo final y antes de la inyección, se obtuvieron aproximadamente 100 l de suero mediante sangrado intraocular realizado por la Office of Laboratory Animal Care staff (Univ. of Calif, Berkeley). Se analizó este suero en comparación con el suero obtenido mediante la metodología idéntica antes de la primera inyección.

[0062] Se utilizó un ELISA de unión a CTLA-4Ig para demostrar la presencia del anticuerpo que reconocía la proteína de fusión CTLA-4Ig en el sangrado post-inmunización. El ELISA de unión a CTLA-4Ig se llevó a cabo tal y como se indica a continuación. Se utilizó la proteína de fusión CTLA-4Ig o la proteína de fusión CD4Ig para cubrir los

35 pocillos de placas de ELISA de base plana modificada de 96 pocillos (Corning, Coming, NY).

[0063] CD4Ig es una proteína de fusión que consiste en el dominio extracelular de CD4 de ratón y los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 humana [Traunecker et al., supra.]; se utilizó la proteína CD4Ig como control negativo en los ensayos ELISA. Se preparó la proteína de fusión CD4Ig a partir de células J558 transfectadas y se purificó mediante cromatografía de afinidad en Sefarosa de proteína A tal y como se describe anteriormente para la proteína de fusión mCTLA4-Hl (es decir, la CTLA-4Ig) en la sección (a).

[0064] Se colocaron cincuenta microlitros de las proteínas de fusión, a una concentración de 1 g/ml en gelatina al 0,4% en PBS en los pocillos. Se incubaron las placas a 37ºC durante 2-3 horas para permitir que las proteínas se

45 absorbieran; a continuación, se lavaron las placas tres veces utilizando 150 l de NaCl al 0,9% que contenía Tween20 al 0,05%. A continuación, se bloquearon los restantes sitios de unión a proteína en los pocillos utilizando gelatina al 0,4% en PBS (tampón de bloqueo) durante 30 min a 37ºC; tras la etapa de bloqueo, se lavaron las placas dos veces con NaCl al 0,9% que contenía Tween-20 al 0,05%. Se añadieron cincuenta microlitros de solución que contenía anticuerpos antiCTLA-4 (es decir, suero de hámsters inmunizados, anticuerpos purificados o sobrenadantes de cultivo) en pocillos por triplicado y se incubaron las placas durante 2-3 horas a 37ºC. Para evaluar la cantidad de anticuerpos anti-CTLA-4 presentes en el suero de hámsters inmunizados, se ensayaron los sangrados post-inmunización utilizando diluciones que iban de 1:1000 a 1:100 (diluidas en gelatina al 0,4% que contenía PBS).

55 [0065] A continuación, se lavaron los pocillos tres veces utilizando 150 l de NaCl al 0,9% que contenía Tween-20 al 0,05%. Se añadieron a los pocillos cincuenta microlitros de una solución que contenía sueros policlonales de IgG anti-hámster de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante (CalTag, South San Francisco, CA) a una concentración de 1 g/ml en tampón de bloqueo y se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC. A continuación, se lavaron las placas cuatro veces con NaCl al 0,9% que contenía Tween-20 al 0,05%. Se añadió una solución que contenía 0,55 mg/ml de ABTS 2,2’-Azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) en tampón de citrato [ácido cítrico 0,1 M (pH 4,35)] y se incubaron las placas durante aproximadamente 20 min a 37ºC. A continuación, se leyeron las placas a 405 nm utilizando un lector de placas BioTech (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) para evaluar la absorbancia del producto verde de la reacción.

65 [0066] Los resultados del ELISA de unión a CTLA-4Ig demostraron la presencia de anticuerpo que reconocía la

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una proteína que no es CTLA-4, tal como la CD4 humana utilizando un ensayo ELISA.

[0114] Se clonan repetitivamente hibridomas de pocillos positivos mediante dilución limitante tal y como se describe en el Ejemplo 1c. Se seleccionan líneas de hibridoma que secretan anticuerpos monoclonales que son reactivos

5 contra proteínas CTLA-4 humanas pero no contra proteínas humanas irrelevantes (por ejemplo, CD4 humana), y que tienen la capacidad de teñir células transfectantes de CTLA-4 humana pero no transfectantes de control para la producción de anticuerpos monoclonales CTLA-4 anti-humanos.

EJEMPLO 5

Estimulación ex vivo de linfocitos infiltradores de tumores (TILs)

[0115] Se estimulan células huésped ex vivo, permitiéndolas diferenciarse en células efectoras inmunes específicas de tumores. A continuación, se reintroducen las células en el mismo huésped para mediar los efectos terapéuticos

15 anticáncer.

a) Aislamiento de linfocitos infiltradores de tumores (TILs)

[0116] Se obtienen linfocitos infiltradores de tumores utilizando técnicas estándar. Se dispersan tumores sólidos (recién diseccionados o crioconservados) en suspensiones celulares individuales mediante digestión enzimática durante toda una noche [por ejemplo, agitando durante toda la noche a temperatura ambiente en medio RPMI 1640 que contiene hialuronidasa de tipo V al 0,01%, ADNasa de tipo I al 0,002%, colagenasa de tipo IV al 0,1% (Sigma, St. Louis), y antibióticos]. A continuación, se pasan las suspensiones de tumor a través de gradientes Ficoll-Hypaque (Lymphocyte Separation Medium, Organon Teknika Corp., Durham, NC). Las interfases de los gradientes contienen

25 células tumorales viables y se lavan células mononucleares, se ajustan a una concentración celular total desde 2,5 hasta 5,0 x 105 células/ml y se cultivan en medio completo. El medio completo comprende RPMI 1640 con suero humano de compatible con el tipo inactivado con calor al 10%, penicilina 50 IU/ml y estreptomicina 50 µg/ml (Biofluids, Rockville, MD), gentamicina 50 µg/ml (GIBCO Laboratories, Chagrin Falls, OH), anfotericina 250 ng/ml (Funglzone, Squibb, Flow Laboratories, McLean, VA), tampón HEPES 10 mM (Biofluids), y L-glutamina 2 mM (MA Bioproducts, Walkersville, MD). Se añade medio condicionado de cultivos de células asesinas activadas por linfoquinas (LAK) autólogas o alogénicas de 3 a 4 días (ver a continuación) a una concentración final de 20% (v/v). Se añade IL-22 recombinante a una concentración final de 1000 U/ml.

[0117] Se mantienen los cultivos a 37ºC en atmósfera humidificada con CO2 al 5%. Se alimentan los cultivos

35 semanalmente mediante la recolección, la agrupación y la resuspensión de células a 2,5 x 106 células/ml en medio nuevo. Durante un periodo inicial (por ejemplo, de 2 a 3 semanas) de cultivo, los linfocitos proliferan selectivamente, mientras que las células tumorales restantes habitualmente desaparecieron por completo.

[0118] Para producir cultivos de células LAK, se obtienen linfocitos de sangre periférica (PBL) de pacientes o donantes normales. Después de pasar a través de gradientes Ficoll-Hypaque, se cultivan las células a una concentración de 1 x 106/ml en medio RPMI 1640 con suero humano al 2%, antibióticos, glutamme, y tampón HEPES. Se añade IL-2 recombinante a 1000 U/ml. Se mantienen los cultivos durante 3 a 7 días en una atmósfera humidificada con CO2 al 2% a 37º.

45 b) Estimulación ex vivo de TILs

[0119] Se incuban 4 x 106 células, en 2 ml de medio de cultivo que contiene mAbs anti-CTLA-4, en un pocillo de placas de 24 pocillos a 37ºC en una atmósfera con CO2 al 5% durante 2 días. El medio de cultivo comprende medio RPMI 1640 complementado con suero de ternero fetal inactivado por calor al 10%, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato sódico 1 µM, L-glutamina recién preparada 2 mM, estreptomicina 100 µg/ml, penicilina 100 U/ml, gentamicina 50 1lg/ml, fungizona 0,5 µg/ml (todos de GIBCO, Grand Island, NY) y 2-ME 5 x 10-5 M (Sigma). Se recogen las células y se lavan.

[0120] Se cultivaron adicionalmente las células estimuladas inicialmente a 3 x 105/pocillo en 2 ml de medio de cultivo

55 con IL-2 humana recombinante (disponible en Chiron Corp., Emeryville, CA; actividad específica desde 6 hasta 8 x 106 U/mg de proteína; unidades equivalentes a 2-3 Unidades Internacionales). Tras 3 días de incubación en IL-22, se recogen las células, se lavan, se cuentan para determinar el grado de proliferación, y se resuspenden en medios apropiados para la administración intravenosa (i.v.) (por ejemplo soluciones salinas fisiológicas tamponadas). Se realizan cultivos bacterianos para determinar la existencia de contaminación bacteriana anterior a la reinfusión de las células activadas.

[0121] Después de resuspenderse los TILs activados en medios adecuados para la inyección, se obtiene acceso IV en el huésped y se infusiona la suspensión celular. Opcionalmente, se trata el huésped con agentes para inducir la función in vivo y la supervivencia de las células estimuladas (por ejemplo IL-2).

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EJEMPLO 6

[0122] En este estudio investigamos el efecto de señales de CD28 y CTLA-4 en las respuestas de poblaciones de células T en respuesta al superantígeno enterotoxina B de Staphylococcus (SEB) in vitro e in vivo. Los resultados indican que CD28 proporciona un coestímulo importante para la respuesta de SEB in vitro y estas señales a través

5 de CTLA-4 inhiben la respuesta. In vivo, el bloqueo de CD28 mediante fragmentos FAb o anticuerpos intactos tiene los efectos opuestos sobre la expansión de Vβ8+ hacia un bloqueo similar con fragmentos FAb anti-CTLA-4 o anticuerpos intactos. El análisis de la cinética de la expansión supone que señales a través de CD28 inducen la expansión de células T, mientras que una señal contraria a través de CTLA-4 actúa durante la expansión de células T para atenuar la magnitud de la respuesta a SEB.

Procedimientos

[0123] Ratones. Se adquirieron ratones BALB/c de cuatro o cinco semanas de edad de Charles River y se utilizaron en menos de tres semanas.

15 [0124] Anticuerpos y Reactivos. Se purificaron CD28 anti-ratón de hámster del clon 37.N.51.1 (Gross et al. (1992) J. Immunol. 149:380), CTLA-4 anti-ratón de hámster del clon 9H10.11D3 (Krummel y Allison (1995) J. Exp. Med. 182:459), B7-1 anti-ratón de hámster del clon 1610.A (Razi-Wolf et al. (1992) J. Exp. Med. 89:4210), B7-2 anti-ratón de rata (del clon GL-1 (Hathcock et al. (1993) Science 262:905) e IgG de hámster irrelevante del clon F560.31 de fluido ascítico en nuestras instalaciones. Se obtuvieron fragmentos FAb mediante la digestión con papaína inmovilizada (Pierce, Rockford IL) mediante metodología estándar y se extrajo el anticuerpo no digerido mediante adsorción de Proteína A. Se analizaron todos los fragmentos FAb mediante SDS-PAGE antes de su uso. Se evaluó adicionalmente la pureza de FAbs anti-CD28 en ensayos funcionales por la capacidad de bloquear la proliferación de células T en un allo-MLR. Se obtuvo anti-Vβ8.1,8.2 FITC (clon MR5-2) de Pharmingen (San Diego, CA).

25 [0125] Ensayos in vitro. Se trocearon bazos obtenidos de animales no tratados previamente para obtener suspensiones y se lisaron RBCs mediante tratamiento hipotónico con solución Geys seguido de dos lavados con PBS. Se pusieron en placas 2x105 esplenocitos en 200 µl de RPMI (que contenía FCS al 10%, -mercaptoetanol 50 µM, glutamina 2 mM, y gentamicina 50 µg/ml) en placas de base redonda de 96 pocillos. Se añadió SEB en las concentraciones indicadas. Cuando se indica, se añadió anti-CD28 a una dilución 1:1000 de ascitis, se añadió antiB7-1 a 5 µg/ml y se añadió anti-B7-2 a 20 µg/ml, y se añadieron cantidades iguales de anticuerpo de control no específico 560.31. Para experimentos con FAb, se añadieron anti-CD28, anti-CTLA-4 o fragmentos de FAb de control a 100 µg/ml. Se incubaron cultivos durante 60 horas a 37 ºC, se pulsaron con 1 µCi de 3H timidina y se dejó que se incubara durante unas 12 horas adicionales antes de la recogida.

35 [0126] Respuestas SEB In Vivo. Se inyectaron intreperitonealmente ratones con 200 µl de PBS que contenía, cuando se indica, 200 µg de anticuerpo. Después de 1-2 horas, se inyectaron intravenosamente ratones con 50 µg por animal de SEB (Toxin Technologies, Sarasota F1) en PBS o PBS solo en un volumen total de 100 µl.

[0127] Citometría de flujo. Para evaluar la población de células que expresan Vβ8, se trocearon bazos para obtener suspensiones y se lisaron RBCs utilizando una solución Geys hipotónica. A continuación, se resuspendieron las células resultantes en 5 ml de RPMI-FCS al 10% y se recontaron alícuotas por triplicado utilizando un hemocitómetro. El error estándar para esto fue rutinariamente menos del 10% de la media. Para la tinción, se lavaron una vez los alícuotas en PBS/FCS al 1% con NaN al 0,01%, y se resuspendieron en PBS/FCS a una

45 concentración de 106 células/50 µl. Se añadieron anticuerpos y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Se lavaron las células y se analizaron posteriormente usando un citómetro FACScan utilizando el software LysisII (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). Se analizaron 10.000 casos restringidos por el porcentaje que expresa Vβ8+ y se utilizó para obtener el número total de células Vβ8 mediante la aplicación de la fórmula: #Vβ8 = Rendimiento Celular Total x %Vβ8 en muestra.

Resultados

[0128] Papel de coestimulación en la proliferación in vitro mediada por SEB. Se investigó la respuesta proliferativa de esplenocitos de ratones BALB/c a SEB para determinar el papel de las interacciones B7/CD28. A medida que se

55 añadía SEB a los esplenocitos, se observó una proliferación dependiente de dosis en los cultivos. Las moléculas B7 en células de estos cultivos parecen suministrar la coestimulación, ya que la adición de anticuerpos anti-B7-1B7-2 inhibió significativamente la respuesta. Además, la mayor señalización de CD28 mediante anticuerpos anti-CD28 aumentó la respuesta proliferativa. Este incremento puede estar mediado por la inmovilización del anticuerpo en células FcR+ B o mediante la formación de microagregados de anticuerpo. De modo interesante, la adición de anti-CD28 y anti-B7-1/B7-2 indujo un ligero incremento pero reproducible en la proliferación en comparación con anti-CD28 por sí solo, sugiriendo que otro ligando B7 aparte de CD28 (es decir CTLA-4) podría ser importante en la subregulación de la respuesta de células T a SEB.

[0129] Para tratar las contribuciones relativas de CD28 y CTLA-4 en la respuesta de células T, se añadieron a 65 cultivos estimulados por SEB fragmentos Fab de anticuerpo específicos para estas moléculas. La adición de FAbs

imagen13

[0135] En contraste con CD28, las interacciones de CTLA-4 con moléculas B7 reduce la respuesta de células T a SEB. La observación de que los fragmentos FAb de anti-CTLA-4 aumentan la proliferación indica que las interacciones CTLA-4B7 inhiben la respuesta proliferativa de células T a SEB. Además, los anticuerpos anti-B7-1/2 aumentan la proliferación en presencia de la estimulación óptima con anticuerpos CD28, proporcionando una base

5 adicional a la idea de que las señales inhibidoras están mediadas a través de interacciones CTLA-4-B7.

[0136] CD28 y CTLA-4 tienen efectos opuestos en la expansión inducida por SEB de células T in vivo. La manipulación de la coestimulación en ratones tratados con SEB mediante al interferencia directa con señales transducidas a través de CD28 o CTLA-4 presenta efectos opuestos en la expansión de las células T Vβ8+. Este resultado apoya los datos in vitro previos que sugieren que estas moléculas podrían competir para determinar el resultado proliferativo en presencia de un nivel fijado de señal TCR. Parece ser un requerimiento para las señales de CD28 para respuestas óptimas a SEB; el bloqueo con fragmentos FAb anti-CD28 o anticuerpos anti-CD28 intactos disminuye eficazmente la expansión proliferativa. La observación de que el bloqueo de CTLA-4 permite de forma similar la mayor expansión de células sensibles respalda además la similitud en los requisitos de coestimulación

15 para respuestas in vivo a superantígeno o antígeno peptídico. Además, el análisis cinético implica que la competición entre CD28 y CTLA-4 por moléculas B7 determina un parámetro muy inicial de la respuesta a célula T; en este experimento tuvo lugar un cambio dependiente de CTLA-4 en la expansión dentro de los dos primeros días. Aunque es claro que el bloqueo de CTLA-4 incrementa la respuesta a SEB cuando se permite el la unión de CD28, éste no tiene efecto sobre la proliferación residual cuando se bloquea CD28.

[0137] Los datos demuestran que CTLA-4 juega un papel en la reducción la respuesta a SEB mediante la oposición de los efectos de CD28. Aunque esto puede representar un mecanismo para la tolerancia de las células T, también puede implicarse la inhibición en la alteración del fenotipo. Por ejemplo, las señales generadas por señales B7/CTLA-4 podrían inducir células de memoria o la expresión de linfoquinas y función efectora alternativas.

25 EJEMPLO 7

[0138] El análisis cinético de los efectos de la unión a CTLA-4 en la proliferación, producción de IL-2, muerte celular, progresión del ciclo celular y la aparición de marcadores de la activación de células T.

Materiales y métodos

[0139] Anticuerpos y reactivos: Los anticuerpos utilizados para la activación fueron: hibridoma 500A2 anti-CD3 (Allison et al. (1987) en T cell Receptor, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series. Alan R Liss,

35 Inc., Nueva York, 33-45), hibridoma 37.N.51.1 anti-CD28 (Gross et al., supra), hibridoma 9H10.11G3 anti-CTLA-4 (Krummel et al., supra) e hibridoma 536 anti-Va3 (Havran et al. (1989) P.N.A.S. 86: 4185-4189). Ig CTLA-4 se describe en Lane et al. (1994) Immunol. 80: 58-61). La depleción de APC y CD8 se consiguió utilizando hibridomas 28-16-8A de MHC Clase II (Ozato y Sachs (1981) J. Immunol. 126: 317-323) y BP107 (Symington y Sprent (1981) Immunogenetics 14:53-61), e hibridoma 3.155 de anticuerpos anti-Cd8 (Sarmiento et al. (1980) J. Immunol. 125: 2665-2672). Se obtuvieron microesferas de látex de poliestireno con sulfato de 5 μm ± 0,1 μm de diámetro promedio de Interfacial Dynamics Corp. (Portland, Or.)

[0140] Preparación de linfocitos T CD4+: se aislaron células de nódulos linfáticos de ratones BALB/c de 6-8 semanas de vida obtenidas de NCI (Bethesda, MD). Los linfocitos aislados se obtuvieron mediante troceado del

45 tejido y la filtración de la suspensión resultante a través nytex. Los preparados ricos en células T CD4+ se obtuvieron mediante el tratamiento con anticuerpos de complemento anti-Clase II y anticuerpos anti-CD8. Los preparados típicos fueron CD4+ al 95% con menos de un 0,75% de células positivas B220.

[0141] Activación de células T Cd4+ utilizando anti-Cd3 inmovilizados: Se recubrieron placas de base redonda de 96 pocillos con anti-CD3 a 0,1 μg/ml en volúmenes de 50 μl durante 2 horas a 37oC, a continuación se lavaron ampliamente y se bloquearon durante 30 minutos a 37oC con RPMI-1640 completo (que contenía FCS al 10%, βmercaptoetanol 50 μM, glutamina 2 mM y gentamicina 50 μg/ml). Se añadieron células T a 1x105 por pocillo en 200 μl de RPMI-1640 completo y todos los cultivos celulares se incubaron a 37oC en CO2 al 5%. Cuando se indicó se añadió anti-CD28 a 10 μg/ml, se añadió Ig CTLA-4 a 5 μg/ml y se añadieron fragmentos FAb de control o anti-CTLA

55 4 a 50 μg/ml. Doce horas antes de la recogida, se pulsaron los pocillos con 20 μl de RPMI completo que contenía 1 μCi de 3H timidina. Las placas se recogieron en almohadillas de filtro de vidrio y se midió la incorporación de 3H utilizando un contador de fase gas (Packard, Meriden, Ct.).

[0142] Activación de células T utilizando microesferas de látex: Se recubrieron microesferas de látex (partículas) tal como se describe en Krummel et al. (1995). Brevemente, se suspendieron 1x107 partículas/ml en PBS con los anticuerpos indicados y se incubaron durante 1,5 horas a 37oC, seguido de lavado con PBS y bloqueo con FCS al 10%. Se añadió anti-CD3 a 0,5 μg/ml, se añadió anti-CD28 a 1 μg/ml, se añadió anti-CTLA-4 a 4 μg/ml, y se normalizaron las soluciones de unión con anticuerpo 536 de control para mantener una concentración de anticuerpo total constante de 6 μg/ml durante la unión. Se cultivaron células T (1x105 células/200 μl) con 1 x10 partículas en un 65 volumen total de 200 μl/pocillo. Para todos los ensayos se utilizaron placas de 96 pocillos de base redonda. Los cultivos se incubaron a 37oC en 5% de CO2 y se pulsaron con 1 μCi de 3H-timidina para las 12 horas finales antes de

la recogida. La acción inhibidora de CTLA-4 parece específica a los anticuerpos anti-CTLA-4, ya que otros anticuerpos de unión a células T, incluyendo anti-L selectina (Mel-14), anti-Thy 1.2 y anticuerpos no relacionados, no muestran efectos o ni un aumento de los efectos cuando se co-inmovilizan con anti-CD3 y anti-CD28.

5 [0143] Análisis de la viabilidad celular: Se cultivaron células T de forma idéntica que en los ensayos de proliferación. La viabilidad celular se evaluó mediante la adición de una décima parte de un volumen de azul de tripano al 0,4% (Sigma, St. Louis, Mo.) y se determinó el número de células utilizando un hemocitómetro. Se contaron 10-4 ml de cada cultivo a partir de pocillos duplicados y el valor de este volumen se multiplicó por dos para obtener un valor para el porcentaje de entrada (se introdujeron 50x104 células/ml). Las desviaciones estándar siempre fueron inferiores a un diez por ciento.

[0144] Análisis del ciclo celular: El análisis de yoduro de propidio del estado del ciclo celular se realizó tal como se ha descrito previamente (Telford et al. (1992) Cytometry 13: 137-143). Brevemente, las células se activaron tal como se ha descrito utilizando microesferas en placas de 96 pocillos. En los tiempos indicados, se recogieron tres pocillos

15 idénticos (introducción de 3x105 en el inicio del cultivo por muestra), se lavaron con PBS y se fijaron con 1,0 ml de etanol al 80%. Las células se incubaron en hielo durante 30 minutos, se agruparon mediante centrifugación y se resuspendieron en 0,4 ml de una solución acuosa que contenía Triton X-100 al 0,1%, EDTA 0,1 mM, ARNasa A 0,05 mg/ml (50 U/mg) y yoduro de propidio 50 μg/ml. Las muestras se almacenaron en hielo en la oscuridad hasta el análisis y cada muestra se analizó a una velocidad de flujo constante durante 2 minutos. Los datos se analizaron utilizando un sistema Coulter EPICS.

[0145] Determinación de IL-2. Se utilizó un ELISA para detectar IL-2 en sobrenadantes celulares. Brevemente, se recubrieron anticuerpos capturados a 1 μg/ml sobre placas de ELISA Corning (Corning, NY) en tampón borato (borato sódico 0,2 M, pH 8,0) durante 2 horas a 37oC. A continuación, se lavaron estas placas de manera amplia, se

25 bloquearon con Gelatin/POBS al 0,4% durante 30 minutos y se añadieron sobrenadantes de cultivos de células T (50 μl) y se incubaron durante 2 horas a 37oC. Las placas se lavaron de nuevo y se añadieron anticuerpos de detección biotinilados en PBS/Tween al 0,5% y se incubaron durante 1 hora a 37oC. Las placas se lavaron de nuevo y se añadió una solución de 1 μg/ml de Estreptavidina-HRPO en PBS/Tween y se incubaron durante 30 minutos a 37pC. Se añadieron 50 μl de reactivo revelador (0,55 mg/ml ABTS (ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6sulfónico) en tampón citrato (ácido cítrico 0,1 M, pH 4,35), se incubaron a 25oC durante 15 minutos y se determinó la absorbancia a 405 nm. Se obtuvo IL-2 recombinante de Boehringer Mannheim y se diluyó en serie para desarrollar una curva estándar. Los valores de absorbancia por triplicado de las muestras de prueba se convirtieron de este modo en cantidades de linfoquina medidas en nanogramos por mililitro. Los anticuerpos (captura: JE6-1A12 y detección: JES6-5H4 biotinilado) se obtuvieron de PharMingen (San Diego, CA).

35 [0146] Análisis de la expresión de CD25 y CD69. Se suspendieron 2x105 células en 50 μl de PBS/suero de ternera al 1%/azida sódica al 0,05% enfriado en hielo. Se añadieron anticuerpos anti-CD25.FITC, anti-CD69 o RatlgG FITC de control, se incubaron en hielo durante 30 minutos seguido de dos lavados de 4 ml de PBS/suero de ternera/azida sódica. Se adquirieron 5.000 casos seleccionados vivos en un Becton-Dickinson FACScan y se utilizó el programa LYSIS II para analizar las poblaciones relevantes.

Resultados

[0147] La unión a CTLA-4 inhibe la proliferación y la producción de IL-2. Se observó previamente que los

45 anticuerpos a CTLA-4 o B7 solubles aumentaban la incorporación de timidina y la producción de IL-2 por células T activadas por anti-CD3 y anti-CD28 inmovilizados en ensayos de tres días estándar. Estos resultados indicaron que el bloqueo de las interacciones CTLA-4B7 entre las propias células T aumentaba las respuestas mediante la eliminación de señales inhibidoras. Dado que los cultivos se analizaron en un punto de tiempo determinado, no fue posible determinar cuando tubo lugar el efecto en la evolución de los cultivos. En la figura 8A se presenta un análisis cinético de los resultados del bloqueo de CTLA-4B7 en la proliferación de células T CD4+. La inclusión de fragmentos CTLA-4Ig o Fab de anti-CTLA-4 en cultivos estimulados con anti-CD3 y anti-CD28 dio lugar a un aumento en la proliferación. El efecto fue ligero a las 26 horas, en cuyo instante sólo había una proliferación marginal en cualquiera de los cultivos. A tiempos posteriores, el bloqueo de CTLA-4/B7 dio lugar a un incremento de 1 ½ a 2 veces en la proliferación. El efecto potenciador de este bloqueo fue incluso más claro a niveles de la

55 producción de IL-2. Tal como se muestra en la figura 8B, IL-2 era detectable, aunque a niveles bajos, en cultivos estimulados con anti-CD3/CD28 antes de las 26 horas. La adición de Fab anti-CTLA4 o CTLA-4Ig dio lugar a un incremento de aproximadamente seis veces en la cantidad de IL-2 acumulada antes de 26 horas, y casi diez veces antes de 40 horas.

[0148] La cinética de la inhibición de la proliferación y la producción de IL-2 se examinaron mediante la reticulación de CTLA-4 junto con CD3 y CD28 utilizando microesferas recubiertas de anticuerpo. La cinética de la incorporación de timidina se muestra en la figura 1C. Una incorporación significativa era detectable antes de 26 horas en cultivos estimulados por anti-CD3 y anti-CD28. Esencialmente no hubo incorporación detectable a las 26 horas cuando el CTLA-4 también estaba unido, y la proliferación fue 3-4 veces inferior en estos cultivos a lo largo del periodo de 65 ensayo. Tal como se muestra en la figura 8D, se observó una inhibición incluso más pronunciada de la producción de IL-2. La IL-2 era fácilmente detectable en cultivos estimulados con anti-CD3/CD-28 antes de 16 horas y aumentó

hasta 40 horas. Cuando también se unió CTLA-4, la IL-2 sólo era apenas detectable incluso después de 30 horas y alcanzó un nivel de sólo aproximadamente 1/5 del mismo en los cultivos de control en su máximo a 42 horas.

[0149] Estos resultados indican que los efectos inhibidores de CTLA-4, mediados por su ligando natural o por la 5 reticulación de anticuerpos, se pueden detectar en el inicio del transcurso de la activación y no son debidos a la terminación abrupta de las respuestas en etapas posteriores en el proceso.

[0150] La unión a CTLA-4 no induce la muerte celular, pero evita la progresión del ciclo celular. Un mecanismo que podría explicar la inhibición de proliferación por CTLA-4 sería la inducción o aumento de la muerte celular. Dado que la inhibición fue detectable a lo largo del periodo de cultivo, se evaluó la cinética de la muerte celular que aparece en cultivos de células T. El recuento hematocitométrico de células teñidas con el colorante vital azul de tripano demostró que la recuperación total de células de los cultivos fue esencialmente el 100% de la entrada, incluso en aquellos en los que no tenía lugar la proliferación. En cultivos no estimulados, el número de células no viables aumenta durante el periodo de cultivo, alcanzando el 50% después de 54 horas. Hubo un ligero incremento en el

15 número de células muertas recuperadas de cultivos estimulados con anti-CD3 solo, especialmente en tiempo más iniciales. En concordancia con los datos de proliferación, los cultivos coestimulados con anti-CD28 produjeron un aumento de células viables después de 42 horas, con un rendimiento total de aproximadamente el 300% a las 78 horas. La estimulación con anti-CD3 más anti-CTLA-4 no dio lugar a un incremento de las células muertas sobre el observado en cultivos no estimulados o en cultivos estimulados con anti-CD3 solo. Tampoco hubo un incremento en la recuperación de células muertes de cultivos estimulados con anti-CTLA-4 en presencia de anti-CD3 y anti-CD28 sobre el de cultivos estimulados por anti-CD3 y anti-CD28. A lo largo del periodo de cultivo la recuperación de células viables fue de hecho superior al de cultivos no estimulados o cultivos estimulados con anti-CD3 solo. Estos datos indican que la reticulación de CTLA-4 no induce la muerte celular tal como se detecta a nivel de permeabilidad de membrana.

25 [0151] Como medición más directa y sensible de la muerte celular y el estado del ciclo celular, se utilizó tinción con yoduro de propidio de células permeabilizadas para medir el contenido de ADN en varias etapas en los cultivos. Cada cultivo se inició con cantidades idénticas de células, y se analizaron fracciones iguales de los cultivos con el fin de realizar una comparación de la cantidad absoluta de células recuperadas en poblaciones G0/G1, S/G2 y subdiploides. Los resultados se presentan en la figura 9. La recuperación total de las células fue esencialmente del 100% de la entrada o superior bajo todas las condiciones de estimulación. Más de un 99% de las células de entrada fueron G0/Gr. En cultivos no estimulados, el número de células con cantidades subdiploides de ADN indicativo de apoptosis aumentó hasta ligeramente más de un 50% del total durante la evolución del periodo de cultivo. Se observó un patrón similar en cultivos estimulados con anti-CD3 solo, aunque se obtuvieron cantidades ligeramente

35 más elevadas de células en S/G2. En cultivos coestimulados con anti-CD28, hubo un incremento significativo en el número de células en S/G2 ya a partir de 20 horas, y este número aumentó progresivamente durante el periodo de ensayo. Los perfiles de ADN de células estimuladas con anti-CD3 junto con anti-CTLA-4 fueron esencialmente los mismos quede cultivos no estimulados o estimulados con anti-CD3 a lo largo del periodo de ensayo sin diferencias significativas en el número de células apoptóticas. Sin embargo, hubo significativamente menos células en S/G2 en cultivos estimulados con anti-CD3 solo. Los cultivos se estimularon con anti-CTLA-4 y anti-CD3 más anti-CD28 y presentaban cantidades similares o incluso menores de células en la población subdiploide que cualquiera de las otras condiciones a lo largo del periodo de cultivo. Por tanto, no existe evidencia de la inducción de muerte celular apoptótica por reticulación de anti-CTLA-4 en ningún momento durante el transcurso de la activación. El principal efecto de la reticulación de CTLA-4 sobre células estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28 es una inhibición del

45 incremento en células viables totales, especialmente en aquellas en S/G2. Conjuntamente, estos resultados indican que la unión de CTLA-4 inhibe la progresión del ciclo celular, y una detención de células en G0/G1.

[0152] La unión a CTLA-4 inhibe parcialmente la inducción de la expresión de cadena alfa del receptor de IL-2. Otra marcad distintiva de la activación de células T es la sobrerregulación de la expresión de CD25, la cadena alfa del receptor de IL-2. Se utilizó citometría de flujo para evaluar la expresión de CD25 en células T bajo condiciones de coestimulación de CD28 con y sin la unión a concomitante a CTLA-4.La estimulación de células T con anti-CD3 solo dio lugar a la inducción de la expresión de CD25 en aproximadamente el 60% de las células T en 24 horas. La coestimulación con anti-CD28 aumentó esta expresión con respecto a tanto el número de células positivas como el nivel de expresión a las 24 horas, y la expresión se aumentó adicionalmente a las 60 horas de cultivo. Cuando se

55 unió también el CTLA-4, la expresión de CD25 fue expresada por una fracción menor de las células (47% frente a 80%) y el nivel promedio de expresión fue mucho menor a las 24 horas (índice de fluorescencia promedio 162 frente a 194) y a las 60 horas (MFI 332 frente a 669) en relación con cultivos coestimulados con anti-CD28. Estos datos demuestran que la unión a CTLA-4 inhibe la sobrerregulación de CD25 a lo largo de la activación.

[0153] La unión a CTLA-4 inhibe parcialmente la expresión del marcador CD69 de activación temprana. Cd69 es un marcador temprano y transitorio de la activación de células T. Se realizó un análisis cinético de los efectos de la unión de CD28 y CTLA-4 en la inducción de la expresión de CD69. A las 12 horas, CD69 fue expresado por más de un 50% de células T activadas con CD3 solo o coestimuladas con anti-CD28, aunque menos de un 15% de células coestimuladas también sometidas a unión a CTLA-4 fueron positivas. A las 24 horas, la expresión de CD69 fue 65 detectable, aunque en un patrón heterogéneo, en más de un 75% de células estimuladas con CD28. En este punto,

menos de un 45% de las células en las que también se había unido CTLA-4, se redujeron la CD69 expresada y el nivel de expresión. Antes de 36 horas, la expresión de CD69 había vuelto a esencialmente los niveles de reposo en todos los cultivos. La coestimulación de CD28 aumenta y prolonga la expresión de CD69, mientras que la unión a CTLA-4 inhibe la sobrerregulación inicial de CD69. Este resultado concuerda con la observación de que los niveles

5 de CD69 resultaron ser constitutivamente elevados en células T aisladas de ratones deficientes en CTLA-4 y proporciona una evidencia adicional que sugiere un papel de CTLA-4 en la prevención de la inducción temprana de la activación de células T.

[0154] Estos datos demuestran que CTLA-4 media en la inhibición de la proliferación y la producción de IL-2 por células T en reposo en ausencia de muerte celular mediada por CTLA-4. La recuperación de células viables y no viables de cultivos inhibidos por anti-CTLA-4 es similar a la observada en cultivos de anticuerpo de control o estimulados con anti-CD3. No hay acumulación de células con cantidades subdiploides de ADN asociado con la muerte celular apoptótica incluso 1-2 días después de observar primero los efectos inhibidores de la reticulación de CTLA-4 a nivel de proliferación y producción de IL-2. Finalmente, la reticulación de CTLA-4 detiene a las células T en

15 una fase G0/G1 del ciclo celular. Conjuntamente, estos datos muestran claramente que la inhibición de la proliferación de células T y la secreción de IL-2 por CTLA-4 pueden tener lugar en ausencia de muerte celular. Una implicación importante de los datos presentados aquí es que CTLA-4 puede tener un papel en la regulación de las respuestas de células T en etapas tempranas en este proceso. Nuestros datos no revelan una terminación abrupta de las respuestas en acción, sino más bien una inhibición y retrasos de los sucesos asociados con la progresión de la activación de células T.

[0155] Los resultados anteriores demuestran que el tratamiento de la presente invención con agentes de bloqueo de CTLA-4 aumenta la respuesta de las células T a la estimulación antigénica. El crecimiento de las células tumorales in vivo disminuye ampliamente en presencia de los agentes de bloqueo de la presente invención. Los efectos se

25 observan contra tumores de tipo natural no manipulados. Los agentes de bloqueo de CTLA-4 no sólo representan una nueva estrategia a la terapia tumoral, sino que, eliminando señales inhibidoras potencialmente competidoras, puede ser una complementación particularmente útil a otras estrategias terapéuticas que implican el mecanismo coestimulador. El cambio de clase por células productoras de inmunoglobulinas, una medición de la ayuda de células T, aumenta ampliamente. La respuesta de las células T a la inmunización con antígenos peptídicos también se incrementa ampliamente mediante el tratamiento con los agentes de la presente invención.

EJEMPLO 8

Efectividad contra un tumor establecido

35 [0156] SA1 es un fibrosarcoma. Tal como se muestra en la figura 10, el bloqueo de de CTLA-4 utilizando 100 g de anticuerpo anti-CTLA-4 por dosis es eficaz incluso cuando se retrasaba 7 ó 14 días después de la implantación del tumor. Esto indica que el bloqueo de CTLA-4 puede ser eficaz en el tratamiento de tumores establecidos.

EJEMPLO 9

Sinergia con agente estimulante de la respuesta inmune

[0157] SM 1 es un carcinoma mamario que es escasamente inmunogénico. Es resistente al rechazo por transfección

45 con B7. Sin embargo, se ha obtenido cierta inhibición del crecimiento utilizando B7 e IFNg. En el experimento mostrado en la figura 11, los ratones recibieron s.c. implantes de células tumorales SM 1 no modificadas y los tratamientos indicados en los días 0, 3 y 6. Tal como se muestra, el tratamiento con anti-CTLA-4 (100 g/dosis) por sí mismos no tenía efecto en el crecimiento del tumor. La inmunización en un punto contralateral con células transducidas GM-CSF irradiadas tampoco tenía efecto. Sin embargo, la combinación de los dos dio lugar a un rechazo completo en 4 de 5 ratones. Esto demuestra claramente que el bloqueo de CTLA-4 puede ser sinérgico con GM-CSF, y probablemente otras linfoquinas, para obtenerle rechazo del tumor.

EJEMPLO 10

55 Bloqueo de CTLA-4 retrasado

[0158] RENCA es un tumor escasamente inmunogénico de crecimiento lento. Tal como se muestra en la figura 12, el bloqueo de CTLA-4 (100 g de anticuerpo anti-CTLA-4 por dosis) es sólo escasamente eficaz cuando se inicia en el momento de implantación del tumor. Sin embargo, es bastante eficaz si se inicia 9 días después de la implantación del tumor. Esto sugiere que la generación de residuos tumorales de una masa tumoral relativamente grande es importante como agente para estimular una respuesta inmune para obtener un rechazo eficaz. Esto sugiere que el bloqueo de CTLA-4 se podría utilizar en el momento, o poco después, de la radiación o quimioterapia.

EJEMPLO 11

65

Claims

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