ES2286831T3 - Anticuerpos para el dominio ed-b de fibronectina, la construccion de estos y sus usos. - Google Patents

Abstract

SEGUN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTA UN ELEMENTO DE ENLACE ESPECIFICO QUE ES ESPECIFICO PARA Y SE ENLAZA DIRECTAMENTE AL DOMINIO ONCOFETAL DE FIBRONECTINA (FN). EN LA INVENCION TAMBIEN SE PRESENTAN MATERIALES Y METODOS PARA LA PRODUCCION DE TALES ELEMENTOS DE ENLACE.

Description

Anticuerpos para el dominio ED-B de fibronectina, la construcción de estos y sus usos.

Antecedentes

Esta invención se refiere a miembros de unión específica para una isoforma fetal de fibronectina, ED-B, que también se expresa en la neovasculatura en desarrollo de tumores, como se demuestra tanto por inmunocitoquímica como por dirección a tumores in vivo. También se refiere a materiales y métodos relacionados con estos miembros de unión específica.

El objetivo primario de la mayoría de las formas existentes de terapia tumoral es destruir tantas células constituyentes del tumor como sea posible. El éxito limitado que se ha experimentado con la quimioterapia y radioterapia está relacionado con la falta de especificidad relativa del tratamiento y la tendencia a efectos secundarios tóxicos en tejidos normales. Una forma en la que se puede mejorar la selectividad de la terapia por el tumor es administrar el agente al tumor a través de una proteína de unión, que normalmente comprende un dominio de unión de un anticuerpo con especificidad por un antígeno marcador expresado en la superficie del tumor pero ausente en las células normales. Esta forma de terapia dirigida, denominada en términos generales "balas mágicas" se ha ejemplificado principalmente por anticuerpos monoclonales (mAb) de roedores que son específicos para los denominados antígenos asociados con tumores expresados en la superficie celular. Estos mAb pueden conjugarse químicamente con la unidad citotóxica (por ejemplo, una toxina o un fármaco) o pueden producirse como una proteína de fusión recombinante, donde los genes que codifican el mAb y la toxina están unidos entre sí y se expresan en tándem.

La estrategia de "bala mágica" ha estado limitada aunque ha tenido un efecto significativo en el tratamiento de cánceres humanos, más notablemente en la dirección a tumores de origen linfoide, donde las células malignas son las más accesibles a la dosis terapéutica presente en la circulación. Sin embargo, el tratamiento de tumores sólidos sigue siendo un problema clínico importante, ya que sólo una pequeña proporción de la masa celular total, predominantemente las células en la periferia más externa del tumor, se exponen a los inmunoconjugados terapéuticos presentes en la circulación; estas dianas periféricas forman la denominada "barrera para el sitio de unión" para el interior del tumor (Juweid et al, 1992, Cancer Res. 52 5144-5153). Dentro del tumor, la arquitectura del tejido generalmente es demasiado densa, con el estroma fibroso y las células tumorales estrechamente empaquetadas, para permitir la penetración de las moléculas con un tamaño en el intervalo del de los anticuerpos. Además, se sabe que los tumores tienen una presión intersticial elevada debido a la falta de drenaje linfático, lo cual también impide la entrada de moléculas exógenas. Como revisión reciente de los factores que afectan a la captación de agentes terapéuticos en los tumores, véase Jain, R (1994), Sci. Am. 271 58-65.

Aunque hay limitaciones evidentes en el tratamiento de tumores sólidos por medio de la dirección de antígenos asociados a tumores, estos tumores tienen una característica en común que proporciona una diana antigénica alternativa para la terapia con anticuerpos. Una vez que han crecido por encima de un cierto tamaño, los tumores son universalmente dependientes de un suministro de sangre independiente que proporciona el oxígeno y los nutrientes adecuados para mantener el crecimiento. Si se puede modificar u ocluir este suministro de sangre, miles de células tumorales en el proceso podrían verse realmente privadas de nutrientes. Según se desarrolla un tumor, experimenta un cambio a un fenotipo angiogénico produciendo una serie diversa de factores angiogénicos que actúan sobre las células del endotelio capilar vecinas, induciendo su proliferación y migración. La estructura de estos vasos sanguíneos recién formados está muy desorganizada, con extremos ciegos y fenestraciones que llevan a la existencia de más fugas, lo cual es muy diferente de la estructura ordenada de los capilares de un tejido normal. La inducción de la angiogénesis va acompañada por la regulación positiva de la expresión de ciertos antígenos de la superficie celular, de los que muchos son comunes en la vasculatura de los tejidos normales. La identificación de antígenos que son únicos para la neovasculatura de tumores ha sido el factor limitante principal en el desarrollo de un tratamiento genérico para tumores sólidos mediante la dirección vascular. El antígeno que es el objeto de la presente invención aborda este problema directamente.

Durante la progresión tumoral, la matriz extracelular del tejido circundante se remodela por medio de dos procesos principales: (1) la degradación proteolítica de los componentes de la matriz extracelular del tejido normal y (2) la síntesis de novo de componentes de la matriz extracelular tanto por células tumorales como por células estromáticas activadas por citoquinas inducidas por el tumor. Estos dos procesos, en estado estacionario, generan una "matriz extracelular tumoral" que proporciona un medio más adecuado para la progresión del tumor y es cualitativa y cuantitativamente distinta de la de los tejidos normales. Entre los componentes de esta matriz se encuentran las isoformas mayores de tenascina y fibronectina (FN); la descripción de estas proteínas como isoformas reconoce su amplia heterogeneidad estructural la cual es causada a nivel transcripcional, postranscripcional y postraduccional (véase más adelante). Es una de las isoformas de la fibronectina, la denominada isoforma B+ (B-FN), la que es el objeto de la presente invención.

Las fibronectinas (FN) son glicoproteínas multifuncionales de alto peso molecular, que constituyen tanto de la matriz extracelular como de los fluidos corporales. Están implicadas en muchos procesos biológicos diferentes tales como el establecimiento y mantenimiento de la morfología celular normal, la migración celular, la hemostasis y la trombosis, la curación de heridas y la transformación oncogénica (como revisiones, véanse Alitalo et al., 1982; Yamada, 1983, Hynes, 1985; Ruoslahti et al., 1988; Hynes, 1990; Owens et al., 1986). La diversidad estructural en las FN es provocada por el empalme alternativo de tres regiones (ED-A, ED-B y IIICS) del transcrito primario de FN (Hynes, 1985; Zardi et al., 1987) para generar al menos 20 isoformas diferentes, que algunas de las cuales se expresan de forma diferencial en tejidos tumorales y normales. Además de existir una regulación con especificidad de tejido y de desarrollo, se sabe que el patrón de empalme del pre-ARNm de FN está desregulado en las células transformadas y en malignidades (Castellani et al., 1986; Borsi et al, 1987; Vartio et al., 1987, Zardi et al, 1987; Barone et al., 1989; Carnemolla et al, 1989; Oyama et al, 1989, 1990; Borsi et al, 1992b). De hecho, las isoformas de FN que contienen las secuencias ED-A, ED-B y IIICS se expresan en una mayor medida en células transformadas y en células tumorales malignas en comparación con las células normales. En particular, la isoforma de FN que contiene la secuencia de ED-B (isoforma B+) tiene una expresión muy alta en tejidos fetales y tumorales, así como durante la curación de heridas, pero tiene una expresión restringida en tejidos adultos normales (Norton et al, 1987; Schwarzbauer et al, 1987; Gutman y Kornblihtt, 1987; Carnemolla et al, 1989; ffrench-Constant et al, 1989; ffrench-Constant y Hynes, 1989; Laitinen et al, 1991). Las moléculas B+ FN son indetectables en vasos maduros, pero están reguladas positivamente en vasos sanguíneos angiogénicos en situaciones normales (por ejemplo, en el desarrollo del endometrio), patológicas (por ejemplo, en la retinopatía diabética) y en el desarrollo tumoral (Castellani et al, 1994).

La secuencia de ED-B es una repetición de homología de tipo III completa codificada por un solo exón y que comprende 91 aminoácidos. A diferencia de la isoforma IIICS con un empalme alternativo, que contiene un sitio de unión con especificidad de tipo celular, la función biológica de las isoformas A+ y B+ sigue siendo motivo de especulación (Humphries et al., 1986).

La presencia de la propia isoforma B+ constituye un neoantígeno inducido por tumores, pero además, la expresión de ED-B expone un antígeno normalmente críptico dentro de la repetición 7 de tipo III (que precede a ED-B); como este epítopo no está expuesto en moléculas de FN que carecen de ED-B, se deduce que la expresión de ED-B induce la expresión de neoantígenos tanto directa como indirectamente. El sitio antigénico críptico forma la diana de un anticuerpo monoclonal (mAb) denominado BC-1 (Carnemolla et al, 1992). La especificidad y propiedades biológicas de este mAb se han descrito en el documento EP 0 344 134 B1 y se puede obtener a partir del hibridoma depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, UK con el número 88042101. El mAb se ha usado satisfactoriamente para localizar los vasos sanguíneos angiogénicos de tumores sin reactividad cruzada con el endotelio vascular maduro, ilustrando el potencial de las isoformas de FN para la dirección vascular usando anticuerpos.

Sin embargo, sigue habiendo ciertas incertidumbres en cuanto a la especificidad del mAb BC-1. El hecho de que BC-1 no reconozca directamente la isoforma B+ ha suscitado la cuestión de si en algunos tejidos, el epítopo reconocido por BC-1 podría estar desenmascarado sin la presencia de ED-B y por lo tanto conducir indirectamente a una reactividad cruzada indeseada de BC-1. Además, BC-1 es estrictamente específico de la isoforma B+ humana, lo que significa que no son posibles los estudios en animales sobre la biodistribución y localización en tumores de BC-1. Aunque se han producido anticuerpos policlonales contra proteínas de fusión recombinantes que contienen la isoforma B+ (Peters et al, 1995), sólo son reactivos con FN los que han sido tratados con N-glicanasa para desenmascarar el epítopo.

Otro problema general con el uso de anticuerpos monoclonales de ratón es la respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) (Schroff et al, 1985; Dejager et al, 1988). Las respuestas de HAMA tienen una serie de efectos, desde la neutralización del anticuerpo administrado que lleva a una reducción de la dosis terapéutica, hasta respuestas alérgicas, enfermedad del suero e insuficiencia renal.

Aunque se han identificado antisueros policlonales reactivos con ED-B recombinante (véase anteriormente), el aislamiento de los mAb con la misma especificidad que BC-1 después de la inmunización de ratones generalmente ha resultado difícil debido a que las proteínas ED-B humanas y de ratón muestran una homología de secuencia prácticamente del 100%. Por lo tanto, la proteína humana le puede parecer un autoantígeno al ratón, el cual por lo tanto no provoca una respuesta inmune en su contra. De hecho, en más de diez años de intensa investigación en este campo, sólo se ha identificado un mAb con reactividad indirecta para la isoforma B+ FN (BC-1), sin que ninguno reconozca ED-B directamente. Casi con toda seguridad, es significativo que la especificidad de BC-1 sea por un epítopo críptico expuesto como consecuencia de ED-B, más que por parte del propio ED-B, el cual probablemente estará ausente de las FN de ratón y por lo tanto no se considerará "propio" por el sistema inmune del ratón.

La realización de la presente invención se ha conseguido usando una estrategia alternativa a las usadas previamente y en la que no se requiere una inmunización previa con fibronectina o ED-B: se han obtenido anticuerpos con especificidad por la isoforma ED-B como Fv monocatenarios (scFv) a partir de bibliotecas de regiones variables de anticuerpos humanos presentadas en la superficie de bacteriófagos filamentosos (Nissim et al., 1994; véanse también los documentos WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172).

Usando una biblioteca de anticuerpos en fagos se ha descubierto que pueden aislarse scFv específicos por selección directa tanto en fragmentos de FN recombinantes que contienen el dominio ED-B como en el propio ED-B recombinante, cuando estos antígenos recubren una superficie sólida ("panning"). Estas mismas fuentes de antígeno también se han usado satisfactoriamente para producir scFv de "segunda generación" con mejores propiedades que los clones parentales en un proceso de "maduración de afinidad". Se ha descubierto que los scFv aislados reaccionan de manera intensa y específica con la isoforma B+ de la FN humana sin tratamiento previo con N-glicanasa.

En aplicaciones anti-tumorales, los dominios de unión a antígenos de anticuerpos humanos proporcionados por la presente invención tienen la ventaja de no estar sometidos a la respuesta de HAMA. Además, como se ejemplifica en este documento, son útiles en el análisis inmunohistoquímico del tejido tumoral, tanto in vitro como in vivo. Estos y otros usos se describen adicionalmente en este documento y serán evidentes para una persona con una experiencia normal en la técnica.

Zang et al. Matrix Biology 1994 Vo. 14, páginas 623-633, describen anticuerpos policlonales inducidos contra el Dominio B Extra de la Fibronectina canina. Los documentos JP02076598 y JP04169195 describen anticuerpos monoclonales contra la fibronectina.

Terminología Miembro de unión específica

Esta expresión describe un miembro de un par de moléculas que tienen especificidad de unión entre sí. Los miembros de un par de unión específica pueden ser de origen natural o pueden ser parcial o totalmente sintéticos. Un miembro del par de moléculas tiene un área en su superficie, o una cavidad, que se une específicamente y, por lo tanto, es complementaria a una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de moléculas. De esta manera, los miembros del par tienen la propiedad de unirse específicamente entre sí. Son ejemplos de tipos de pares de unión específica antígeno-anticuerpo, biotina-

\hbox{avidina, hormona-receptor  de
hormona, receptor-ligando y
enzima-sustrato.}

Anticuerpo

Este término describe una inmunoglobulina tanto de origen natural como parcial o totalmente sintética. El término también incluye cualquier polipéptido o proteína con un dominio de unión que es, o es homólogo a, un dominio de unión de un anticuerpo. Pueden obtenerse a partir de fuentes naturales o pueden ser parcial o totalmente sintéticos. Son ejemplos de anticuerpos los isotipos de inmunoglobulinas y sus subclases isotípicas; fragmentos que comprenden un dominio de unión a antígeno tal como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos.

Es posible coger anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usar técnicas de la tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que conserven la especificidad del anticuerpo original. Estas técnicas pueden implicar la introducción de ADN que codifica la región variable de una inmunoglobulina, o las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo, en las regiones constantes, o en las regiones constantes más regiones de entramado ("framework regions"), de una inmunoglobulina diferente. Véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400. Un hibridoma u otra célula productora de un anticuerpo puede someterse a mutación genética o a otros cambios, que pueden alterar o no la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.

Como los anticuerpos pueden modificarse de varias maneras, puede considerarse que el término "anticuerpo" incluye cualquier sustancia o miembro de unión específica que tenga un dominio de unión con la especificidad requerida. De esta manera, este término incluye fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión de inmunoglobulina, ya sea de origen natural como parcial o totalmente sintético. Por lo tanto, se incluyen moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión de inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a otro polipéptido. En los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023 se describe la clonación y expresión de anticuerpos quiméricos.

Se ha demostrado que ciertos fragmentos de un anticuerpo entero pueden realizar la función de unión a antígenos. Son ejemplos de fragmentos de unión (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward et al., 1989) que consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab') 2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos, (vii) moléculas Fv monocatenarias (scFv), donde un dominio VH y un dominio VL están unidos por un engarce peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno (Bird et al, 1998; Huston et al, 1988), (viii) dímeros de Fv monocatenarios biespecíficos (documento PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión génica (documento WO94/13804; Holliger et al, 1993).

Los diacuerpos son multímeros de polipéptidos, comprendiendo cada polipéptido un primer dominio que comprende una región de unión de una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo dominio que comprende una región de unión de una cadena pesada de inmunoglobulina, estando unidos los dos dominios (por ejemplo, por un engarce peptídico) pero sin poderse asociar entre sí para formar un sitio de unión a antígeno; los sitios de unión a antígenos se forman por la asociación del primer dominio de un polipéptido dentro del multímero con el segundo dominio de otro polipéptido dentro del multímero (documento WO94/13804).

Cuando se van a usar anticuerpos biespecíficos, pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales que pueden fabricarse de una diversidad de maneras (Holliger y Winter, 1993), por ejemplo, pueden prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mencionados anteriormente. Puede ser preferible usar dímeros de scFv o diacuerpos en lugar de anticuerpos enteros. Los diacuerpos y scFv pueden construirse sin una región Fc, usando sólo dominios variables, con lo cual se reducen potencialmente los efectos de la reacción anti-idiotípica. Otras formas de anticuerpos biespecíficos incluyen las "Janusinas" monocatenarias descritas en Traunecker et al, (1991).

Los diacuerpos biespecíficos, al contrario que los anticuerpos biespecíficos enteros, también pueden ser particularmente útiles porque pueden construirse y expresarse fácilmente en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tales como fragmentos de anticuerpo) con especificidades de unión apropiadas pueden seleccionarse fácilmente usando la presentación en fagos (documento WO94/13804) de bibliotecas. Si un brazo del diacuerpo se va a mantener constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antígeno X, entonces puede prepararse una biblioteca en la que se varíe el otro brazo y puede seleccionarse un anticuerpo de la especificidad apropiada.

Dominio de unión a antígenos

Esta expresión describe la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente y es complementaria a parte o a la totalidad de un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse sólo a una parte particular del antígeno, denominándose dicha parte epítopo. Un dominio de unión a antígeno puede proporcionarse por uno o más dominios variables de anticuerpo. Preferiblemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).

Específico

Este término se refiere a la situación en la que un miembro de un par de unión específica no mostrará ninguna unión significativa a moléculas distintas de su molécula de unión específica. El término también se puede aplicar cuando, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno es específico para un epítopo particular que es llevado por varios antígenos, en cuyo caso el miembro de unión específica que lleva el dominio de unión al antígeno podrá unirse a los diversos antígenos que llevan el epítopo.

Forma variante funcionalmente equivalente

Esta expresión se refiere a una molécula (la variante) que, aunque tiene diferencias estructurales con otra molécula (la molécula parental), conserva alguna homología significativa y también al menos parte de la función biológica de la molécula parental, por ejemplo, la capacidad de unirse a un antígeno o epítopo particular. Las variantes pueden estar en forma de fragmentos, derivados o mutantes. Una variante, derivado o mutante puede obtenerse por modificación de la molécula parental mediante de la adición, deleción, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos, o por la unión de otra molécula. Estos cambios pueden realizarse a nivel de nucleótidos o de proteína. Por ejemplo, el polipéptido codificado puede ser un fragmento Fab que después se une a una cola Fc de otra fuente. Como alternativa, puede unirse un marcador tal como una enzima, fluoresceína, etc.

Sumario de la presente invención

De acuerdo con la presente invención se proporciona un miembro de unión específica que es específico y que se une directamente al dominio oncofetal ED-B de la fibronectina (FN), de acuerdo con la reivindicación 1.

Los miembros de unión específica de acuerdo con la invención se unen al dominio ED-B directamente. En una realización, un miembro de unión específica se une, después del tratamiento de la FN con la proteasa termolisina, a una, cualquiera o todas las FN que contienen ED-B. En otra realización, un miembro de unión específica se une a una, cualquiera o todas las FN que contienen repeticiones de homología de tipo III que incluyen el dominio ED-B. Las FN conocidas se identifican en dos documentos por Carnemolla et al., 1989; (1992). La referencia a "todas las FN que contienen ED-B" puede considerarse la referencia a todas las FN identificadas en esos documentos como FN que contienen ED-B.

El miembro de unión específica preferiblemente se une a la región ED-B humana, y preferiblemente a B+ FN de al menos otra especie, tal como ratón, rata y/o pollo. Preferiblemente, el miembro del par de unión específica puede unirse tanto a ED-B de fibronectina humana como a ED-B de fibronectina no humana, tal como de ratón, por lo que se puede realizar el ensayo y análisis del miembro del sbp en un modelo animal.

Los miembros del par de unión específica de acuerdo con la presente invención se unen a ED-B de fibronectina sin competir con el anticuerpo BC-1 depositado con disponibilidad pública descrito en otras partes de este documento. BC-1 es estrictamente específico para la isoforma B+ humana. Los miembros del par de unión específica de acuerdo con la presente invención no se unen al mismo epítopo que BC-1.

La unión de un miembro de unión específica de acuerdo con la presente invención a B+ FN puede inhibirse por el dominio ED-B.

Cuando se mide como un monómero purificado, el dominio de unión tiene una constante de disociación (Kd) de 6 x 10^{-8} M o menor para ED-B FN.

En un aspecto de la presente invención, el dominio de unión es reactivo con, es decir puede unirse a ED-B de fibronectina sin tratamiento previo del dominio ED-B de fibronectina con N-glicanasa.

Los miembros del par de unión específica de acuerdo con la presente invención pueden proporcionarse como aislados o en una forma purificada, es decir, en una preparación o formulación sin otros miembros del par de unión específica, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, o sin otros miembros del par de unión específica que pueden unirse a ED-B de fibronectina. Preferiblemente, los miembros de unión específica de acuerdo con la presente invención se proporcionan en una forma sustancialmente pura. Pueden ser "monoclonales" en el sentido de proceder de un solo clon, en lugar de restringirse a anticuerpos obtenidos usando la tecnología de hibridoma tradicional. Como se ha descrito, los miembros del par de unión específica de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse usando la tecnología de presentación en bacteriófagos y/o expresión en células hospedadoras recombinantes, por ejemplo, bacterianas.

El miembro de unión específica comprende un anticuerpo. El miembro de unión específica puede comprender una secuencia polipeptídica en forma de un fragmento de anticuerpo tal como Fv monocatenario (scFv). También pueden utilizarse otros tipos de fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb o un diacuerpo (Winter y Milstein, 1991; WO94/13804). El miembro de unión específica puede estar en forma de un anticuerpo entero. El anticuerpo entero puede estar en cualquiera de las formas de los isotipos de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgD, IgE e IgM y cualquiera de las formas de las subclases de isotipo, por ejemplo IgG1 o IgG4.

El anticuerpo puede ser de cualquier origen, por ejemplo, humano, murino, ovino o de conejo. A los expertos en la materia se les ocurrirán otras variaciones. Preferiblemente, el anticuerpo es de origen humano. Por "humano" se entiende un anticuerpo que procede parcial o totalmente de un ADNc, proteína o biblioteca peptídica humana. Este término incluye péptidos humanizados y proteínas de origen no humano que se han modificado para impartir características humanas a la molécula de anticuerpo y de esta manera permitir que la molécula evite las defensas del sistema inmune humano.

El miembro de unión específica también puede estar en forma de un anticuerpo modificado por ingeniería genética, por ejemplo, una molécula de anticuerpo biespecífica (o un fragmento tal como F(ab')2) que tiene un brazo de unión a antígeno (es decir, un dominio específico) contra ED-B de fibronectina como se describe y otro brazo contra una especificidad diferente, o una molécula bivalente o multivalente.

Además de las secuencias de anticuerpo, el miembro de unión específica puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, que forman un péptido o polipéptido, o que imparten a la molécula otras características funcionales además de la capacidad de unirse a un antígeno. Por ejemplo, el miembro de unión específica puede comprender un marcador, una enzima o un fragmento de los mismos y similares.

El dominio de unión puede comprender parte o la totalidad de un dominio VH codificado por un segmento de línea germinal o un segmento génico reordenado. El dominio de unión puede comprender parte o la totalidad de un dominio VL kappa o un dominio VL lambda.

El dominio de unión puede comprender una secuencia de un gen de línea germinal VH1, VH3 o VH4, o una forma reordenada de los mismos.

Un miembro de unión específica de acuerdo con la presente invención puede comprender una región variable de cadena pesada (dominio "VH") procedente de la línea germinal humana DP47, cuya secuencia se muestra en la Fig. 1(a), restos 1 a 98. La nomenclatura "DP" se describe en Tomlinson et al, (1992). La secuencia de aminoácidos de la CDR3 puede ser Ser Leu Pro Lys. La secuencia de aminoácidos de la CDR3 puede ser Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu. De esta manera, el dominio de unión de un miembro de unión específica de acuerdo con la presente invención puede incluir un dominio VH que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 1(a) para CGS1 y CGS2.

El dominio de unión puede comprender una región variable de cadena ligera (dominio "VL") procedente de la línea germinal humana DPL16, cuya secuencia se muestra en la Figura 1(b) como codones 1-90.

El dominio VL puede comprender una secuencia de CDR3 Asn Ser Ser Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val. El dominio VL puede comprender una secuencia de CDR3 Asn Ser Ser Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val.

Los miembros de unión específica de la invención pueden comprender variantes funcionalmente equivalentes de las secuencias mostradas en la Figura 1, por ejemplo, cuando se ha insertado, delecionado, sustituido o añadido uno o más aminoácidos, siempre que se conserve una propiedad como se indica en este documento. Por ejemplo, la secuencia de la CDR3 puede alterarse, o pueden realizarse uno o más cambios en las regiones de entramado, o la región de entramado puede reemplazarse por otra región estructural o una forma modificada, siempre que el miembro de unión específica se una a ED-B.

Una o más CDR de un dominio VL o VH de un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo descrito en este documento puede usarse en el denominado "injerto de CDR" en el que una o más secuencias de CDR de un primer anticuerpo se ponen dentro de una región de entramado de secuencias que no son de ese anticuerpo, por ejemplo, de otro anticuerpo, como se describe en el documento EP-B-0239400. En la Figura 1(a) y 1(b) se muestran las secuencias de CDR para CGS1 y CGS2.

Un miembro de unión específica de acuerdo con la invención puede ser uno que compite con un anticuerpo o scFv como se describe en este documento por la unión de ED-B de fibronectina. La competición entre miembros de unión puede ensayarse fácilmente in vitro, por ejemplo, marcando con una molécula reportera específica un miembro de unión que puede detectarse en presencia de otros miembros de unión no marcados, para permitir la identificación de miembros de unión específica que se unen al mismo epítopo o a un epítopo parcialmente coincidente.

Un miembro de unión específica de acuerdo con la presente invención puede usarse en un procedimiento que comprende provocar o permitir la unión del miembro de unión específica a su epítopo. La unión puede seguir a la administración del miembro de unión específica a un mamífero, por ejemplo, un ser humano o un roedor tal como un ratón.

La presente invención proporciona el uso de un miembro de unión específica como se ha indicado anteriormente como reactivo de diagnóstico para tumores. Las pruebas experimentales en modelos animales descritas más adelante demuestran que los miembros de unión de acuerdo con la presente invención son útiles en la localización de tumores in vivo.

Los miembros de unión específica preferidos de acuerdo con la presente invención incluyen los que se unen a tumores humanos, por ejemplo, en una sección de criostato, que muestran un fenotipo invasivo y angiogénico y los que se unen a tejidos embrionarios, por ejemplo, en una sección de criostato. La unión puede demostrarse por tinción inmunocitoquímica.

En una realización preferida, el miembro de unión específica no se une o no se une significativamente a tenascina, una proteína de la matriz extracelular.

En otra realización preferida, el miembro de unión específica no se une, o no se une significativamente, a la piel humana normal, por ejemplo, en una sección de criostato y/o como se demuestra usando tinción inmunocitoquímica.

Otras realizaciones de miembros de unión específica de acuerdo con la presente invención no se unen, o no se unen significativamente, a uno o más tejidos normales (por ejemplo, en una sección de criostato y/o como se demuestra usando tinción inmunocitoquímica) seleccionados entre hígado, bazo, riñón, estómago, intestino delgado, intestino grueso, ovario, útero, vejiga, páncreas, glándulas suprarrenales, músculo esquelético, corazón, pulmón, tiroides y cerebro.

Un miembro de unión específica para ED-B puede usarse como agente de dirección in vivo que puede usarse para demostrar específicamente la presencia y localización de tumores que expresan o están asociados con el dominio ED-B de fibronectina. Puede usarse como agente para formar imágenes. La presente invención proporciona un procedimiento para determinar la presencia de una célula o tumor que expresa o está asociado con la expresión de ED-B de fibronectina, comprendiendo el procedimiento poner en contacto células con un miembro de unión específica como el proporcionado y determinar la unión del miembro de unión específica a las células. El procedimiento puede realizarse in vivo o in vitro en una muestra de ensayo de células extraídas del cuerpo.

Las reactividades de los anticuerpos en una muestra de células pueden determinarse por cualquier medio apropiado. Una posibilidad es la señalización con moléculas reporteras individuales. Las moléculas reporteras pueden generar directa o indirectamente señales detectables y preferiblemente medibles. La unión de moléculas reporteras puede ser directa o indirectamente covalente, por ejemplo, a través de un enlace peptídico, o no covalente. La unión a través de un enlace peptídico puede ser como resultado de la expresión recombinante de una fusión génica que codifica el anticuerpo y la molécula reportera.

Un modo preferido es por unión covalente de cada anticuerpo con un fluorocromo individual, fósforo o un colorante láser con características de emisión o absorción aisladas espectralmente. Los fluorocromos adecuados incluyen fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y Rojo Texas. Los colorantes cromogénicos adecuados incluyen diaminobenzidina.

Otros reporteros incluyen partículas coloidales macromoleculares o un material particulado tal como perlas de látex que están coloreadas, son magnéticas o paramagnéticas, y agentes biológica o químicamente activos que pueden producir directa o indirectamente señales detectables que pueden observarse visualmente, detectarse electrónicamente o registrarse de otra manera. Estas moléculas pueden ser enzimas que catalizan reacciones que desarrollan o cambian colores o producen cambios en las propiedades eléctricas, por ejemplo. Pueden ser excitables molecularmente, de tal forma que las transiciones electrónicas entre los estados de energía produzcan absorciones o emisiones espectrales características. Pueden incluir entidades químicas usadas junto con biosensores. Pueden emplearse sistemas de detección de biotina/avidina o biotina/estreptavidina y sistemas de detección de fosfatasa alcalina.

El modo para determinar la unión no es una característica de la presente invención y los expertos en la materia pueden elegir un modo adecuado de acuerdo con su preferencia y conocimiento general.

Pueden usarse las señales generadas por conjugados individuales de anticuerpo-reportero para obtener datos absolutos o relativos cuantificables de la unión del anticuerpo pertinente en muestras de células (normales y de ensayo). Además, puede usarse una tinción nuclear general tal como yoduro de propidio para enumerar la población celular total en una muestra, permitiendo la provisión de relaciones cuantitativas de poblaciones celulares individuales con respecto a las células totales. Cuando un radionucleótido tal como ^{125}I, ^{111}In o ^{99m}Tc se une a un anticuerpo, si ese anticuerpo se localiza preferentemente en un tumor en lugar de en tejidos normales, puede detectarse la presencia del radiomarcador en el tejido tumoral y cuantificarse usando una cámara gamma. La calidad de la imagen del tumor obtenida se correlaciona directamente con la relación señal:ruido.

Los anticuerpos pueden utilizarse como agentes de diagnóstico para localizar tumores vascularizados recientemente, y también pueden emplearse, por ejemplo, en forma modificada, para administrar agentes citotóxicos o para inducir la coagulación dentro de nuevos vasos sanguíneos, privando de esta manera al tumor en desarrollo de oxígeno y nutrientes y constituyendo una forma indirecta de terapia tumoral.

La presente invención también proporciona el uso de un miembro de unión específica como se ha indicado anteriormente para uso como un reactivo terapéutico, por ejemplo, cuando se acopla, se une o se modifica por ingeniería genética como una proteína de fusión para que posea una función efectora. Un miembro de unión específica de acuerdo con la presente invención puede usarse para dirigir una toxina, radiactividad, células T, células asesinas u otras moléculas a un tumor que expresa o está asociado con el antígeno de interés.

Un miembro de unión específica puede usarse en métodos de tratamiento que comprenden la administración de un miembro de unión específica proporcionado tal cual o en composiciones farmacéuticas que comprenden dicho miembro de unión específica, y puede usarse en la fabricación de un medicamento para administración, por ejemplo, en un método para preparar un medicamento o composición farmacéutica, que comprende formular el miembro de unión específica con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones proporcionadas pueden administrarse a individuos. La administración preferiblemente se realiza en una "cantidad terapéuticamente eficaz", siendo ésta suficiente para mostrar un efecto beneficioso para un paciente. Este efecto beneficioso puede ser al menos la mejoría de al menos un síntoma. La cantidad real administrada, y la proporción y transcurso a lo largo del tiempo de la administración dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se está tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación etc., está dentro de la responsabilidad de los especialistas generales y otros médicos. Las dosis apropiadas de anticuerpos son bien conocidas en la técnica; véase Ledermann et al., (1991); Bagshawe K.D. et al. (1991).

Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, simultánea o secuencialmente dependiendo de la afección a tratar.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención y para uso de acuerdo con la presente invención pueden comprender, además de un ingrediente activo, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizante u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos para los expertos en la materia. Estos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral, o por inyección, por ejemplo intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de comprimidos, cápsulas, polvos o líquidos. Un comprimido puede comprender un vehículo sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceites minerales o aceites sintéticos. Pueden incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para la administración intravenosa, inyección o inyección en el sitio de la afección, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa aceptable para vía parenteral que está libre de pirógenos y que tiene valores adecuados de pH, isotonicidad y estabilidad. Los expertos en la materia pueden preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como Inyección de Cloruro Sódico, Inyección de Ringer o Inyección de Ringer Lactada. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, cuando se requiera.

Un miembro de unión específica de acuerdo con la presente invención puede obtenerse por expresión a partir de un ácido nucleico codificante. El ácido nucleico que codifica cualquier miembro de unión específica constituye por sí mismo un aspecto de la presente invención, así como también lo constituye un procedimiento de producción del miembro de unión específica, comprendiendo dicho procedimiento la expresión a partir del ácido nucleico codificante. La expresión puede conseguirse convenientemente cultivando en condiciones apropiadas células hospedadoras recombinantes que contienen el ácido nucleico.

El ácido nucleico puede codificar cualquiera de las secuencias de aminoácidos de los dominios de unión a antígeno del anticuerpo descrito en este documento o cualquier forma funcionalmente equivalente. Pueden realizarse cambios a nivel de los nucleótidos por adición, sustitución, deleción o inserción de uno o más nucleótidos, pudiendo reflejarse o no estos cambios a nivel de los aminoácidos, dependiendo de la degeneración del código genético.

Son bien conocidos los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una diversidad de células hospedadoras diferentes. Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, levaduras y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de cría de hámster y muchas otras. Un hospedador bacteriano común preferido es E. coli.

La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en células procariotas tales como E. coli está bien establecida en la técnica. Como revisión, véase por ejemplo Plückthun, (1991). Los expertos en la materia también disponen de la expresión en células eucariotas en cultivo como opción para la producción de un miembro de unión específica, como revisiones recientes véase, por ejemplo, Reff, (1993); Trill et al. (1995).

Pueden elegirse o construirse vectores adecuados que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias apropiadas. Los vectores pueden ser plásmidos, virales por ejemplo fagos o fagémidos, según sea apropiado. Si se desean detalles adicionales véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. En Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992 se describen con detalle muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en las células y expresión génica, y análisis de proteínas. Las descripciones de Sambrook et al. y Ausubel et al. se incorporan en este documento como referencia.

De esta manera, otro aspecto de la presente invención proporciona una célula hospedadora que contiene un ácido nucleico como se describe en este documento. Otro aspecto adicional proporciona un procedimiento que comprende introducir dicho ácido nucleico en una célula hospedadora. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. En el caso de las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato cálcico, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. En el caso de las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro cálcico, electroporación y transfección usando bacteriófagos.

Después de la introducción puede provocarse o permitirse la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo, por medio del cultivo de células hospedadoras en condiciones para la expresión del gen.

En una realización, el ácido nucleico de la invención se integra en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula hospedadora. La integración puede promoverse por inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas convencionales.

Después de la producción de un miembro de unión específica, éste puede usarse, por ejemplo, de cualquiera de las formas descritas en este documento, tal como en la formulación de un producto farmacéutico o de diagnóstico, tal como un kit que comprende, además del miembro de unión específica, uno o más reactivos para determinar la unión del miembro a las células, como se ha descrito.

Para los expertos en la materia serán evidentes otros aspectos y realizaciones de la invención. Para que la presente invención se entienda completamente, los siguientes ejemplos se proporcionan sólo a modo de ejemplo y de ninguna manera deben considerarse limitantes. Se hace referencia a las siguientes figuras:

La figura 1 muestra secuencias de aminoácidos alineadas de la VH y VL de scFv CGS-1 y CGS-2. La Figura 1(a) muestra secuencias de VH; la Figura 1(b) muestra secuencias de VL. Se indican las CDR (1, 2 y 3). La VH de línea germinal humana más homóloga a los dos scFv es el segmento DP47 de la familia VH3; el segmento VL de los dos clones es DPL16, la cadena ligera usada para construir la biblioteca de scFv original (Nissim et al, 1994). Los restos que distinguen los dos clones entre sí están subrayados.

Figura 2: la figura 2A muestra un modelo de la estructura del dominio de una subunidad de FN humana. Se indican las regiones de variabilidad IIICS, ED-A y ED-B, debido al empalme alternativo del pre-ARNm de FN. La figura también indica las homologías internas así como los principales productos de digestión con termolisina que contienen ED-B (Zardi et al, 1987). La figura 2B muestra SDS-PAGE al 4-18% de FN de plasma y WI38VA y sus productos de digestión con termolisina marcados con Azul de Coomassie e inmunotransferencias tratadas con sondas de BC-1, IST-6, CGS-1 y CGS-2. FN de plasma no digerida (carril 1) y digerida usando termolisina a 1 \mug/mg de FN (carril 3) y 10 \mug/mg de FN (carril 4). FN WI38VA no digerida (carril 2) y digerida usando termolisina a 1 \mug/ml (carril 5), 5 \mug/mg (carril 6) y 10 \mug/mg (carril 7) de FN. Los números del lado derecho indican los productos principales de la digestión con termolisina mostrados en la figura 2A. Los valores de la izquierda indican los patrones de peso molecular en kiloDalton (kD).

Figura 3: la figura 3A muestra las secuencias repetidas de tipo III de FN contenidas en las proteínas de fusión y recombinantes expresadas en E. coli y la reactividad de estas proteínas con CGS-1 y CGS-2 y con los mAb BC-1 e IST-6. La figura 3B muestra un gel teñido con Azul de Coomassie y a lo largo de la zona lateral las inmunotransferencias sometidas a las sondas CGS-1, CGS-2, BC-1 e IST-6. La numeración de los carriles corresponde a la de las construcciones peptídicas en la parte superior de la figura. Los valores de la izquierda indican los patrones de peso molecular en kD.

Figura 4: Formador de Imágenes Infrarrojas de Ratón; el formador de imágenes de ratón usado para los experimentos de dirección consiste en una caja no fluorescente, negra, equipada con una lámpara halógena de tungsteno, filtros de excitación y emisión específicos para el fluoróforo infrarrojo CY7 y una cámara CCD monocromo de 8-bit controlada por un ordenador.

Figura 5: Dirección de fragmentos de anticuerpo marcados con fluorescencia al teratocarcinoma murino F9 usando el scFv(CGS-1) monomérico y el scFv(CGS-1)2 dimérico dirigido a B-FN. Como control negativo se usó el scFv(D1.3)2 dimérico con una especificidad de unión por lisozima.

Figura 6: Dirección de fragmentos de anticuerpo marcados con fluorescencia al teratocarcinoma murino F9 usando el scFv(CGS-2) con afinidad madurada y el scFv(28SI) de menor afinidad dirigido al mismo epítopo de B-FN. La dirección se detecta tanto en tumores grandes (de aproximadamente 0,6 gramos), cubiertos a las 48 h por una costra negra que oscurece parcialmente la imagen, como en tumores pequeños (de aproximadamente 0,2 g).

Lista de Ejemplos

Ejemplo 1 - Aislamiento de los scFv humanos específicos para el dominio ED-B de FN humana.

Ejemplo 2 - Maduración de afinidad de los scFv humanos específicos por el dominio ED-B de FN humana.

Ejemplo 3 - Especificidad de los scFv de afinidad madurada para fibronectinas que contienen ED-B.

Ejemplo 4 - El uso de los scFv anti-ED-B de afinidad madurada en la tinción inmunocitoquímica de secciones de tumores humanos y de ratón.

Ejemplo 5 - El uso de los scFv anti-ED-B de afinidad madurada en la dirección in vivo a tumores humanos.

Ejemplo 6 - Dirección de teratocarcinoma F9 murino xenoinjertado en ratones desnudos.

Ejemplo 1

Aislamiento de los scFv humanos específicos para el dominio ED-B de FN humana

Para la selección de anticuerpos recombinantes se usó una biblioteca humana de scFv en fagos (Nissim et al, 1994). Como fuente de antígeno para la selección se usaron dos formas diferentes de la isoforma ED-B y en ambos casos, la isoforma era proteína humana recombinante.

Se expresaron en Escherichia coli péptidos FN recombinantes que contenían las repeticiones 2-11 (B-) y 2-11 (B+) de tipo III.

Se preparó una construcción usando ADNc de FN de los clones pFH154 (Kornblihtt et al 1985), \lambdaF10 y \lambdaF2 (Carnemolla et al, 1989). Las construcciones de ADNc, que incluían las bases 2229-4787 (Kornblihtt et al, 1985), se insertaron en el vector pQE-3/5 usando el kit QIAexpress de Qiagen (Chatsworth, CA). Los recombinantes FN-III 2-11 (B-) y (B+) se purificaron por cromatografía de inmunoafinidad usando el mAb 3E3 (Pierschbacher et al 1981) conjugado con Sepharose 4B (Pharmacia). Se produjeron fragmentos de ADN para la preparación de los fragmentos de FN recombinantes que contenían las repeticiones de homología de tipo III 7B89, 789, ED-B y FN-6 por amplificación mediante la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) usando ADN polimerasa UltMa (Perkin Elmer), usando ADNc de los clones FN 2-11 (B+) y FN 2-11 (B-) como plantilla. Se diseñaron cebadores para permitir la clonación de los productos de PCR en pQE-12 usando el kit QIAexpress (Qiagen). Posteriormente se utilizaron para transformar E. coli y se expresaron. Todos los clones de ADNc se secuenciaron usando el kit de secuenciación de ADN Sequenase 2.0 (USB).

Las proteínas recombinantes se purificaron por cromatografía Ni-NTA (IMAC), de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen), usando la señal de hexahistidina en el extremo carboxi de los fragmentos de FN. La proteína de fusión ED-H-\betaGal se preparó por clonación del ADNc de ED-B en el vector bacteriófago \lambdagt11, para dar el clon \lambdaED-B. El clon \lambdachFN60 (que contenía parte de la secuencia de ED-B) se obtuvo como una proteína de fusión a partir de la FN de pollo clonada pchFN60 (Norton et al, 1987).

Para la selección de la biblioteca de scFv humanos en fagos, se realizaron tres vueltas de cribado en fase sólida (panning) para cada uno de los dos antígenos recombinantes diferentes (7B89 y ED-B). Los dos antígenos se aplicaron como recubrimientos en inmunotubos (Nunc; Maxisorp, Roskilde, Dinamarca) durante una noche a 50 \mug/ml en PBS (tampón fosfato 20 mM, NaCl 0,15 M pH 7,2). El primer antígeno era el fragmento de FN recombinante 7B89, en el que el dominio ED-B está flanqueado por las repeticiones de homología de FN de tipo III adyacentes; y se aplicó como un recubrimiento a 4ºC durante una noche. El segundo antígeno usado fue ED-B recombinante (Zardi et al, 1987) con una señal de hexahistidina carboxi terminal; esta proteína no contiene residuos de lisina, de forma que el grupo amino terminal del primer aminoácido está disponible para la inmovilización covalente con especificidad de sitio de ED-B en placas ELISA reactivas (Nunc; Covalink). El recubrimiento se realizó durante una noche a temperatura ambiente.

Después de tres vueltas de cribado en fase sólida, el fago eluido se utilizó para infectar células E. coli HB2151 y éstas se cultivaron en placas como se describe (Nissim et al., 1994). Después de cada vuelta de selección, se seleccionaron 95 colonias individuales resistentes a ampicilina para identificar los scFv con especificidad de antígeno por ELISA. Se seleccionaron los clones que dieron las mayores señales ELISA con los antígenos usados para el cribado en fase sólida para un análisis adicional y maduración de afinidad. También se demostró que estos clones proporcionaban una tinción específica de secciones de glioblastoma multiforme y tumores de mama por tinción inmunocitoquímica, como se describe con más detalle en el Ejemplo 4.

Ejemplo 2

Maduración de afinidad de scFv humanos específicos del dominio ED-B de FN humana

Se seleccionaron los clones 35GE (a partir de la selección con 7B89) y 28SI (a partir de la selección con el dominio ED-B solo) como anticuerpos candidatos por maduración de afinidad. Para diversificar las cadenas ligeras como una forma para mejorar la afinidad, se exploró una estrategia de maduración de afinidad sencilla basada en la aleatorización de los seis residuos centrales (DSSGNH) de la CDR3 de cadena ligera usando oligonucleótidos degenerados y PCR (Fig. 1), proporcionando una diversidad potencial de secuencia de 20' = 6,4 x 10^{7}. Esta región (junto con la CDR3 de cadena pesada) está localizada en el centro del sitio de unión al antígeno (Padlan, 1994). También se mutó el residuo de arginina que precedía directamente al tramo de seis residuos por serina, para evitar la posibilidad de que los efectos electrostáticos dominaran la selección.

El plásmido de una sola colonia bacteriana que expresaba el fragmento scFv "parental" se amplificó por PCR con cebadores LMB3 (5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3') y CDR3-6-VL-FOR (5' CTT GGT CCC TCC GCC GAA TAC CAC MNN MNN MNN MNN MNN MNN AGA GGA GTT ACA GTA ATA GTC AGC CTC 3') (94C [1'] - 55C [1'] - 72C [1'3''], 25 ciclos; véase en Marks et al., 1991 para los tampones y las condiciones). El producto resultante se purificó en gel (para retirar las pequeñas cantidades del plásmido que contenían el gen de scFv original) y se usó como plantilla para una segunda etapa de amplificación con los cebadores LMB3 y J1-Not-FOR (5' ATT GCT TTT CCT TTT TGC GGC CGC GCC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC TCC GCC 3') (94C [1'] - 55C [1'] - 72C [1'30''], 25 ciclos). El producto de PCR bruto, que se procesó como una sola banda del peso molecular correcto en gel de agarosa, se purificó directamente a partir de la mezcla de PCR usando Spin-Bind (FMC, Rockland, ME, USA), se digirió dos veces con Nco1/Not1 y se unió al fagémido pHEN1 (Hoogenboom et al., 1991) digerido con Nco1/Not1 purificado en gel que contenía un inserto Nco1/Not1 vacío para facilitar la separación del vector digerido dos veces del vector digerido una sola vez. El vector se preparó con un kit maxi-prep de plásmido Qiagen (Chatsworth, CA, U.S.A.). En la mezcla de ligamiento se usaron aproximadamente 5 \mug de plásmido digerido y de inserto, y dicha mezcla se extrajo una vez con fenol, una vez con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:25:1) y después se precipitó con etanol usando glucógeno (Boehringer, Mannheim, Germany) como vehículo y se secó en un speed-vac. El sedimento se resuspendió en 20 \mul de agua y se introdujo por electroporación en células E. coli TG1 electrocompetentes (Gibson, 1984). Típicamente se usaron células electrocompetentes con una titulación de 10^{9} transformantes/\mug si se usaban soluciones madre de glicerol, o 10^{10} transformantes/\mug con células electrocompetentes preparadas recientemente. Esto produjo típicamente > 10^{7} clones con el procedimiento indicado en este documento.

La biblioteca de maduración después se procesó como la biblioteca de Nissim (Nissim et al., 1994) para producir partículas de fago, que se usaron para una vuelta de selección en inmunotubos usando 7B89 (10 \mug/ml) como antígeno, seguido de una vuelta de selección cinética (Hawkins et al., 1992). Esta etapa de selección se realizó incubando 7B89 biotinilado (10 nM) con la suspensión de fago (aproximadamente 10^{12} t.u.) en leche-PBS al 2% (MPBS al 2%) a partir de la primera vuelta de selección durante 5 minutos, y después añadiendo 7B89 no biotinilado (1 \muM) y dejando que la competición continuara durante 30 minutos. Después se añadieron 100 \mul de Dynabeads recubiertas con estreptavidina (Dynal: M480) bloqueadas previamente en MPBS al 2% a la mezcla de reacción, se mezclaron durante 2 minutos y después se capturaron en un imán y se lavaron 10 veces con lavados alternativos de (PBS + Tween 20 al 0,1%) y PBS. El fago se eluyó de las perlas con 0,5 ml de trietilamina 100 mM. Después, esta solución se neutralizó con 0,25 ml de Tris 1 M, pH 7,4 y se usó para infectar células HB2151 que crecían exponencialmente (Nissim et al., 1994). Se usaron 95 colonias individuales resistentes a ampicilina para producir sobrenadantes que contenían scFv (Nissim et al., 1994) que se seleccionaron por ELISA, inmunohistoquímica y BIAcore para identificar los que mejor se unían. Después se subclonaron entre sitios Sfi1/Not1 del vector de expresión pDN268 (Neri et al., 1996), que lleva una señal fosforilable anexionada en su extremo, el epítopo FLAG y una señal de hexahistidina en el extremo C-terminal del scFv.

Se cultivaron colonias individuales de los anticuerpos relevantes subclonados en pDN268 a 37ºC en 2xTY que contenía 100 mg/l de ampicilina y glucosa al 0,1%. Cuando el cultivo celular alcanzó DO^{600} = 0,8, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y el crecimiento se continuó durante 16-20 horas a 30ºC. Después de la centrifugación (rotor GS-3 Sorvall, 7000 rpm, 30 minutos), el sobrenadante se filtró, se concentró y se cambió en tampón de carga (fosfato 50 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM) usando un aparato de flujo tangencial Minisette (Filtron). La solución resultante se cargó en 1 ml de resina Ni-NTA (Qiagen), se lavó con 50 ml de tampón de carga y se eluyó con tampón de elución (fosfato 50 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 100 mM). El anticuerpo purificado se analizó por SDS-PAGE (Laemmli, 1970) y se dializó frente a PBS a 4ºC. Las preparaciones de scFv purificado se procesaron adicionalmente por filtración en gel usando un aparato de FPLC equipado con una columna S-75 (Pharmacia), ya que se sabe que los fragmentos scFv multivalentes pueden presentar una unión artificialmente buena en BIAcore (Jonsson et al., 1991) gracias a sus efectos de avidez (Nissim et al., 1994; Crothers y Metzger, 1972). Se determinó espectrofotométricamente la concentración de anticuerpo de las fracciones monoméricas purificadas mediante FPLC asumiendo una absorbancia a 280 nm de 1,4 unidades para una solución de scFv de 1 mg/ml.

Se midió en una máquina BIAcore (Pharmacia Biosensor) la unión de scFv monovalente a diversas concentraciones en el intervalo de 0,1-1 \muM en PBS, usando los siguientes antígenos: (i) 1000 Unidades de Resonancia (RU) de fragmento de FN recombinante biotinilado 7B89 inmovilizado en un chip recubierto con estreptavidina, que se unió específicamente por 250 RU de scFv; (ii) 200 RU de ED-B recombinante, inmovilizado químicamente en el grupo amino N-terminal, que se unió específicamente por 600 RU de scFv; (iii) 3500 RU de fibronectina rica en ED-B WI38VA (véase el Ejemplo 3) que se unió específicamente por 150 RU de scFv. El análisis cinético de los datos se realizó de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Basándose en un análisis BIAcore cualitativo de sobrenadantes que contenían anticuerpo, se seleccionó una versión sometida a maduración de afinidad de cada clon de scFv: el clon CGS-1 de la selección con el fragmento 78B9 y CGS-2 de la selección con el fragmento de FN ED-B recombinante. Las constantes de velocidad de asociación (K_{on}) y las constantes de velocidad de disociación (K_{off}) se muestran en la Tabla 1, junto con las constantes de disociación en equilibrio (Kd) calculadas de los dos scFv y el clon original 28SI. Aunque tanto los clones CGS-1 como los clones CGS-2 tienen valores de Kd en el intervalo nanomolar, el clon CGS-2 mostró la mayor mejora con respecto a su clon parental, dando una Kd de 1 nM (mejorada a partir de 110 nM) con respecto a las tres proteínas ensayadas en el chip sensor (Tabla 1). La mejora se debía principalmente a la constante de disociación cinética más lenta (\sim10^{-4} s^{-1}), medida con preparaciones de anticuerpo monomérico (no mostrado).

La estrategia de maduración parece ser general y ha producido anticuerpos de mejor afinidad contra la proteína de unión a maltosa, citocromo C, el dominio extracelular de la endoglina murina (D.N., L. Wyder, R. Klemenz), citomegalovirus (A.P., G. Neri, R. Botti, P.N.), la proteína HMGI-C marcadora de tumor nuclear (A.P., P. Soldani, V. Giancotti, P.N.) y la fosfatasa alcalina placentaria marcadora de tumor ovárico (M. Deonarain y A.A. Epenetos). Por lo tanto, la estrategia parece ser al menos tan eficaz como otras estrategias de maduración (Marks et al., 1992; Low et al., 1996) y produce anticuerpos con afinidades similares a los obtenidos a partir de bibliotecas de anticuerpos presentadas en fagos de gran tamaño (Griffiths et al., 1994; Vaughan et al., 1996).

Los clones CGS-2 y CGS-2 de afinidad madurada se secuenciaron y alinearon con una base de datos de genes V de anticuerpos de línea germinal humana (V-BASE) y después se tradujeron usando el software MacVector. El gen VH de los dos clones fue el que tenía la mayor homología con DP47 de la línea germinal humana (VH3), y además cada clon tenía una secuencia de CDR3 de VH diferente (Figura 1). El gen VL de los dos clones era la línea germinal DPL16 usada en la construcción del repertorio de scFv sintéticos humanos descritos en Nissim et al, 1994. Las secuencias de CDR3 de VL diferían entre sí en cuatro de seis de los residuos aleatorizados (Figura 1b).

TABLA 1 Cinética y constantes de disociación de fragmentos scFv monoméricos CGS-1 y CGS-2 hacia proteínas que contienen el dominio ED-B

1

Ejemplo 3

Especificidad de scFv con afinidad madurada para fibronectinas que contienen ED-B

La inmunorreactividad de dos scFv sometidos de afinidad madurados, CGS-1 y CGS-2, se evaluó inicialmente por ELISA y se comparó directamente con el mAb BC-1 (que reconoce la isoforma B-FN) y el mAb IST-6, que sólo reconoce isoformas de FN que carecen de ED-B (Carnemolla et al., 1989; 1992). Previamente se ha indicado la caracterización de estos mAb (Carnemolla et al, 1989; 1992). Posteriormente se realizó un análisis de especificidad fino usando un panel extenso de fragmentos de FN obtenidos por tratamiento con termolisina y de proteínas de fusión recombinantes.

Los antígenos usados para el ELISA y la inmunotransferencia se prepararon como se indica a continuación. Se purificó FN a partir de plasma humano y a partir del medio acondicionado de la línea celular WI38VA13 como se ha indicado previamente (Zardi et al, 1987). Las FN purificadas se digirieron con termolisina (proteasa tipo X; Sigma Chemical Co.) como se indica por Carnemolla et al (1989). Se purificaron fragmentos de FN nativa de 110 kD (B-) y fragmentos de FN nativa de 120 kD (B+) (véase la Figura 2) a partir de un producto de digestión de FN como se ha indicado previamente (Borsi et al, 1991). La isoforma mayor de tenascina-C se purificó como se indica por Saginati et al (1992). Las proteínas recombinantes se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1. La SDS-PAGE y la transferencia de Western se realizaron como se describe por Carnemolla et al (1989).

Todos los antígenos usados en el ELISA se diluyeron en PBS a una concentración comprendida entre 50 y 100 \mug/ml y se aplicaron como un recubrimiento a 4ºC durante una noche en pocillos Immuno-Plate (Nunc, Roskilde, Dinamarca). El antígeno no unido se retiró con PBS y las placas se bloquearon después con PBS que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 3% (p/v) durante 2 h a 37ºC. Esto después se continuó mediante cuatro lavados con PBS que contenía Tween 20 (PBST) al 0,05%. Después se dejó que los anticuerpos se unieran a 37ºC durante 1,5 h; los scFv se preincubaron con un antisuero dirigido contra la secuencia señal: mAb M2 [Kodak, New Haven CT] para la señal FLAG o 9E10 [ATCC, Rockville, MD] para la señal myc. Los anticuerpos de control ensayados fueron los mAb BC-1 e IST-6. Después de cuatro lavados con PBST, las placas se incubaron durante 1 h a 37ºC con IgG de cabra anti-ratón biotinilada diluida 1:2000 (en PBST + BSA al 3%) (Bio-SPA Division, Milan, Italia). Los lavados se repitieron y se añadió complejo de fosfatasa alcalina biotinilada con Estreptavidina (Bio-SPA Division, Milan, Italia) (diluido 1:800 en PBST que contenía MgCl_{2} 2 mM) durante 1 h a 37ºC. La reacción se reveló usando comprimidos de sustrato de fosfatasa (Sigma) en dietanolamina al 10%, pH 9,8 y la densidad óptica se leyó a 405 nm. Los resultados se presentan más adelante en la Tabla 2.

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TABLA 2

2

La inmunorreactividad de los scFv y anticuerpos monoclonales con antígenos derivados de fibronectina medida por ELISA. Los valores representan la DO medida a 405 nm después de restar la señal de fondo. Los datos son la media de cuatro experimentos que muestran una desviación estándar máxima del 10%.

La identidad de las diferentes formas de fibronectina usadas en el experimento es la siguiente: FN de Plasma = fibronectina plasmática humana; FN WI38-VA = fibronectina de sobrenadantes de fibroblastos transformados con SV40 (Zardi et al, 1987); n110kD = dominio 4 de FN tratada con termolisina, sin ED-B; n120kD = dominio 4 de FN tratada con termolisina, que contiene ED-B; rec FN7B89 = dominio ED-B flanqueado por repeticiones de homología de FN de tipo III adyacentes; rec FN789 = repeticiones de homología de FN de tipo III con un dominio ED-B; rec ED-B = ED-B recombinante solo; rec FN6 = dominio 6 de FN recombinante.

Tanto CGS-1 como CGS-2 reconocían el péptido ED-B recombinante, así como todos los fragmentos de FN nativa o recombinante que contenían la secuencia de ED-B, aunque no se unían a ningún fragmento de FN que carecía de ED-B. Además, CGS-1 y CGS-2 no reaccionaban con tenascina (que comprende quince repeticiones de homología de tipo III: Siri et al, 1991) ni con FN plasmática, que no contiene niveles detectables de la secuencia de ED-B en los productos de digestión con termolisina (Zardi et al, 1987). Por el contrario, CGS-1 y CGS-2 reaccionaron fuertemente con FN purificada a partir de la línea celular transformada con SV40 WI38VA. Aproximadamente un 70-90% de las moléculas de FN de esta línea celular contienen ED-B, como se muestra por digestión con termolisina y experimentos con nucleasa S1 usando FN purificada y ARN total preparado a partir de la línea celular (Zardi et al, 1987; Borsi et al, 1992). La especificidad de los scFv por el componente ED-B de FN se demostró adicionalmente usando ED-B recombinante soluble para inhibir la unión de CGS-1 y/o CGS-2 a FN en células WI38VA (datos no mostrados).

Los datos confirman que CGS-1 y CGS-2 sólo reaccionan específicamente con derivados de FN que contienen el dominio ED-B. Demuestran la misma reactividad que el mAb BC-1, excepto en el caso de ED-B recombinante, que no se reconocía por BC-1. La intensidad de las señales ELISA obtenidas con respecto a los controles de mAb refleja la alta especificidad de los dos scFv por antígenos que contienen ED-B.

La especificidad de CGS-1 y CGS-2 se investigó adicionalmente en inmunotransferencias usando FN procedente de plasma y de células WI38VA, y productos de digestión con termolisina de los mismos. Tras la digestión con termolisina, la FN procedente de células WI38VA (conteniendo la mayoría ED-B) genera un fragmento de 120 kD (que contiene ED-B) y un fragmento menor de 110 kD que carece de ED-B (Figura 2A; Zardi et al, 1987). La digestión adicional del dominio de 120 kD genera dos fragmentos: un fragmento de 85 kD que contiene la secuencia de ED-B casi entera en su extremo carboxi y una secuencia 35 kD (Figura 2A; Zardi et al, 1987).

En el lado izquierdo de la Figura 2B se muestra un gel teñido con Coomassie de las fracciones proteicas analizadas por inmunotransferencia. La FN plasmática (carril 1) y los productos de digestión de termolisina de la proteína (carril 3, que contenía la proteína de 110 kD, y carril 4, que contenía la proteína de 110 kD digerida) no se reconocieron por CGS-1 y CGS-2. Por el contrario, la FN rica en ED-B procedente de células WI38VA, tanto intacta (carril 2) como después de aumentar la digestión con termolisina (carriles 5, 6 y 7) fue reconocida por los dos fragmentos scFv. El fragmento más pequeño derivado de FN que pudo ser reconocido específicamente por CGS-1 fue la proteína de 120 kD (que incluía las repeticiones de tipo III 2-11 inclusive), mientras que CGS-2 podía reconocer el fragmento de 85 kD que incluía las repeticiones 2-7 además del extremo N de ED-B (Figura 2B; Zardi et al, 1987). Estos resultados indican que los dos scFv son reactivos con distintos epítopos dentro de la secuencia de ED-B. La unión de CGS-2 al dominio de 85 kD indica que el epítopo para este clon está en el extremo amino de ED-B. Por el contrario, la pérdida de unión a CGS-1 cuando el dominio de 120 kD se digiere a 85 kD demuestra que reconoce un epítopo localizado más adelante hacia el extremo carboxi de la molécula de ED-B.

La fina especificidad de CGS-1 y CGS-2 se investigó adicionalmente por inmunotransferencia usando fragmentos de FN recombinante y proteínas de fusión con o sin la secuencia de ED-B. Las proteínas de fusión de FN se prepararon como se ha descrito por Carnemolla et al (1989). Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 3; en relación con la asociación del diagrama esquemático a la estructura de los dominios de FN humana, véase Carnemolla et al, 1992. Los perfiles de unión obtenidos esencialmente confirmaron lo que se había descubierto previamente por ELISA e inmunotransferencias en FN purificadas y productos de escisión proteolítica: CGS-1 y CGS-2 reaccionaban fuertemente con fragmentos de FN que contenían ED-B (carriles 2 y 4), pero no mostraron ninguna reactividad con secuencias de FN que carecían de ED-B (carriles 1 y 3). CGS-1 no reaccionaba ni con la proteína de fusión de ED-B humana (carril 5) ni con la de pollo (carril 6), mientras que CGS-2 reaccionaba fuertemente con los dos fragmentos (Figura 3). Este resultado puede reflejar ciertas limitaciones conformacionales del epítopo de FN que contenía ED-B reconocido por CGS-1; es posible, por ejemplo, que el epítopo sea sensible a la desnaturalización o no se presente correctamente cuando se fracciona por SDS-PAGE y se transfiere a un soporte sólido tal como nitrocelulosa.

Considerados conjuntamente, estos resultados demuestran que CGS-1 y CGS-2 se unen fuerte y específicamente a FN que contienen ED-B, en regiones distintas entre sí y distintas de la estructura de ED-B que se reconoce por el mAb BC-1.

Ejemplo 4

El uso de scFv anti-ED-B con afinidad madurada en la tinción inmunohistoquímica de tumores humanos y de ratón

Se han usado tanto CGS-1 como CGS-2 para inmunolocalizar moléculas de FN que contienen ED-B en diversos tejidos humanos normales y neoplásicos. Para el tejido normal, se eligió piel, ya que se sabe que la isoforma B-FN se expresa en macrófagos y fibroblastos durante la curación de heridas cutáneas (Carnemolla et al, 1989; Brown et al, 1993). Los dos tumores humanos seleccionados se han analizado previamente por la especificidad de tinción con mAb anti-fibronectina: se ha estudiado glioblastoma multiforme en detalle porque las células endoteliales de los vasos de este tumor están en un estado muy proliferativo con mayores procesos angiogénicos incluyendo la expresión de isoformas de B-FN (Castellani et al, 1994). Además, los estudios que usan un panel diverso de tejidos de mama humanos normales, hiperplásicos y neoplásicos han proporcionado pruebas adicionales de una correlación entre la angiogénesis y la expresión de B-FN (Kaczmarek et al, 1994).

Para los experimentos descritos en este documento, la tinción inmunohistoquímica de CGS-1 y CGS-2 se ha comparado con la del mAb BC-1 (que reconoce la isoforma B-FN) y otros mAb que se sabe que reaccionan con todas las variantes de isoformas de FN conocidas (IST-4) o sólo con isoformas de FN que carecen de ED-B (IST-6). La caracterización de todos estos anticuerpos control se ha indicado previamente (Carnemolla et al, 1989; 1992).

Se obtuvieron tejidos normales y neoplásicos a partir de muestras tomadas durante la cirugía. Ya se ha establecido que la preparación y fijación de tejidos es crítica para una detección precisa y sensible de moléculas que contienen FN (Castellani et al, 1994). Para la inmunohistoquímica, se secaron al aire secciones de criostato de 5 \mum de espesor y se fijaron en acetona fría durante diez minutos. La inmunotinción se realizó usando un kit de tinción de complejo de fosfatasa alcalina-estreptavidina-biotina (Bio-SPA Division, Milan, Italia) y naftol-AS-MX-fosfato y Fast Red TR (Sigma). Como tinte de contraste se usó hematoxilina de Gill, seguido del montaje en glicergel (Dako, Carpenteria, CA) como se ha indicado previamente por Castellani et al, 1994. Para analizar la especificidad adicionalmente en experimentos en los que se obtuvo una tinción positiva de tejidos, se demostró la especificidad por ED-B por preincubación de anticuerpos con el dominio de ED-B recombinante, seguido de detección como se ha descrito previamente.

Los resultados de estos experimentos demostraron en general que tanto CGS-1 como CGS-2 reaccionaban con las mismas estructuras histológicas que el mAb BC-1. El patrón de tinción obtenido con piel usando CGS-1, CGS-2 y BC-1 refleja la ausencia de ED-B de la FN expresada en la dermis. En la tinción de secciones de carcinoma ductal invasivo, CGS-1, CGS-2 y BC-1 mostraron una distribución restringida de la tinción, limitada al borde entre las células neoplásicas y el estroma. Esto es coherente con el hecho de que aunque la FN total está distribuida homogéneamente a lo largo del estroma del tumor, la expresión de B-FN se limita a ciertas regiones, y son estas áreas las que previamente se habían localizado satisfactoriamente (en el 95% de los casos) en el carcinoma ductal invasivo usando el mAb BC-1 (Kaczmarek et al, 1994).

Se han confirmado descubrimientos previos en la tinción con BC-1 del tumor glioblastoma multiforme. Castellani et al (1994) habían observado un patrón típico de tinción de estructuras vasculares de tipo glomerular, y en los experimentos de los presentes solicitantes, se ha demostrado que CGS-1 y CGS-2 proporcionan resultados cualitativamente idénticos.

Sin embargo, hay una diferencia importante entre CGS-1 y CGS-2 y el mAb BC-1: se ha demostrado que los dos scFv humanos se unen a B-FN de pollo y ratón, mientras que BC-1 presenta una especificidad estricta por el ser humano. CGS-2 reaccionaba con embriones de pollo (datos no mostrados) y tanto CGS-1 como CGS-2 reaccionaban con tumores de ratón.

También se ha demostrado la tinción con CGS-1 de estructuras vasculares en secciones de teratocarcinoma F9 murino. Por el contrario, todos los tejidos de ratón normales ensayados (hígado, bazo, riñón, estómago, intestino delgado, intestino grueso, ovarios, útero, vejiga, páncreas, glándulas suprarrenales, músculo esquelético, corazón, pulmón, tiroides y cerebro) mostraron una reacción de tinción negativa con CGS-1 y CGS-2 (datos no mostrados). Las estructuras teñidas en las secciones de teratocarcinoma F9, según se demostró, eran específicas por ED-B usando el dominio ED-B recombinante para inhibir completamente la tinción obtenida (datos no mostrados).

Ejemplo 5

El uso de scFv anti-ED-B con afinidad madurada en la dirección in vivo de tumores humanos

Se usó la línea celular de melanoma humano SKMEL-28 para crear tumores xenoinjertados en ratones desnudos de 6-10 semanas de edad (Balb-c o MF-1; Harlan UK), inyectando 1 x 10^{7} células/ratón por vía subcutánea en un flanco. En los ratones que llevaban tumores se inyectaron en la vena de la cola 100 \mul de solución de scFv_{1}-Cy7_{1} de 1 mg/ml en PBS cuando los tumores habían alcanzado un diámetro de aproximadamente 1 cm.

El marcaje de los anticuerpos recombinantes con CY7 se consiguió añadiendo 100 \mul de bicarbonato sódico 1 M, pH 9,3, y 200 \mul de CY7-bis-OSu (Amersham; Nº de Catálogo PA17000; 2 mg/ml en DMSO) a 1 ml de solución de anticuerpo en PBS (1 mg/ml). Después de 30 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 100 \mul de Tris 1 M, pH 7,4 a la mezcla y el anticuerpo marcado se separó del colorante sin reaccionar usando columnas PD10 desechables (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) equilibradas con PBS. Las fracciones de anticuerpo verde eluidas se concentraron hasta aproximadamente 1 mg/ml usando tubos Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA, USA). La proporción de marcaje conseguida generalmente era próxima a una molécula CY7: una molécula de anticuerpo. Esto se estimó espectroscópicamente con cubetas de 1 cm, suponiendo que una solución de anticuerpo de 1 mg/ml proporciona una absorción de 1,4 unidades a 280 nm, que el coeficiente de extinción molar de CY7 a 747 nm es 200.000 (M^{-1} cm^{-1}) y despreciando la absorción de CY7 a 280 nm. La inmunorreactividad de las muestras de anticuerpo después del marcaje se confirmó por desplazamiento de bandas (Neri et al., 1996b), por cromatografía de afinidad en una columna de antígenos o por análisis BIAcore. Se obtuvieron imágenes de los ratones con un aparato de formación de imágenes de ratón de construcción interna a intervalos de tiempo regulares, con anestesia por inhalación de una mezcla de oxígeno/fluorotano. Para cada muestra se estudiaron de dos a ocho animales, para averiguar la reproducibilidad de los resultados. Los procedimientos se realizaron de acuerdo con el UK Project Licence "Tumor Targeting" expedido a D. Neri (UK PPL 80/1056).

El aparato de formación de imágenes de ratón por infrarrojos se construyó como una modificación del sistema de fotodetección de Folli et al. (1994), que permite el uso del fluoróforo infrarrojo CY7. Se eligió iluminación infrarroja para obtener mejor penetración en los tejidos. La fluorescencia de CY7 (>760 nm) es invisible a los seres humanos y requiere el uso de una cámara CCD controlada por un ordenador. El aparato de formación de imágenes de ratón consistía en una caja pintada de negro, hermética a la luz, equipada con una lámpara halógena de tungsteno de 100W, que tenía instalado un filtro de excitación de 50 mm de diámetro diseñado específicamente para CY7 (Chroma Corporation, Brattleboro, VT, USA; 673-748 nm). El haz de iluminación resultante, en una buena aproximación, es homogéneo en un área de tamaño de 5 x 10 cm, en la que se puso el ratón para formar imágenes. La fluorescencia se detectó por una cámara CCD Pulnix monocromo de 8-bit, equipada con una lente C-mount y un filtro de emisión de 50 mm (Chroma Corporation, Brattleboro, VT, USA; 765-855 nm), y conectada con el sistema ImageDOK (Kinetic imaging Ltd., Liverpool, UK). Este sistema consiste en un ordenador, equipado con una placa de captura (frame-grabber) y un software para la captura e integración de imágenes secuenciales. Típicamente se usaron tres imágenes secuenciales adquiridas en 50 ms cada una en el proceso de promediado; este número se mantuvo constante para la serie de imágenes de un animal, para permitir una comparación directa de la dirección a tumores en diferentes puntos de tiempo. Las imágenes en formato TIFF se convirtieron después en archivos PICT usando el programa Graphics Converter y se elaboraron usando el programa MacDraw Pro con un ordenador Power Macintosh 7100/66.

En la Figura 4 se representa un diagrama esquemático del diseño de este aparato.

Estos experimentos demostraron que los dos scFv se localizaban en el tumor cuando se visualizaba a un nivel macroscópico.

La demostración microscópica de la dirección a la neovasculatura de tumores en desarrollo con los dos scFv anti-EDB se detalló como se indica a continuación.

En ratones desnudos y/o ratones SCID que llevaban un melanoma humano SKMEL-28 xenoinjertado o un teratocarcinoma F9 de ratón en un flanco, se inyectaron fragmentos scFv no marcados con la señal FLAG o fragmentos scFv biotinilados.

Los ratones se sacrificaron en diferentes puntos de tiempo después de la inyección, se obtuvieron secciones tumorales y no tumorales, las cuales fueron teñidas con protocolos de inmunohistoquímica convencionales usando el anticuerpo anti-FLAG M2 (Kodak, 181) o reactivos de detección basados en estreptavidina. La dirección óptima generalmente se obtuvo 12 horas después de la inyección. Se demostró que tanto CGS-1 como CGS-2 se unían a la neovasculatura tanto del tumor humano xenoinjertado como del teratocarcinoma murino.

Ejemplo 6

Dirección de teratocarcinoma F9 murino xenoinjertado en ratones desnudos

Los presentes solicitantes desarrollaron tumores sólidos en el flanco de ratones desnudos por inyección subcutánea de 4 x 10^{6} células de teratocarcinoma F9 murino. Este tumor crece muy rápidamente en ratones, alcanzando un diámetro de 1 cm aproximadamente una semana después de la inyección, y está muy vascularizado. Para obtener imágenes de la dirección de los anticuerpos, se usó una modificación de la metodología de fotodetección de Folli et al (1994), que permite una evaluación cinética de la dirección al tumor y de la eliminación de anticuerpos en el mismo animal del que se obtuvieron imágenes en distintos puntos de tiempo, como se ha descrito con detalle anteriormente (véase la Figura 4).

Para la dirección al tumor y facilitar la detección de los anticuerpos, a los scFv(CGS-1), scFv(CGS-2) y al anti-lisozima scFv(D1.3) (McCafferty et al., 1990) se les añadió una señal de homodimerización (Pack et al., 1993) por subclonación de los anticuerpos en los sitios Sfi1/Not1 del vector de expresión pGIN50. Este vector es un derivado de pDN268 (Neri et al., 1996b), en el que la secuencia His6 de la señal se reemplaza por la secuencia: GGC LTD TLQ AFT DQL EDE KSA LQT EIA HLL KEK EKL EFI LAA H, que contiene un residuo de cisteína y la hélice anfipática de la proteína Fos para la homodimerización covalente de fragmentos de anticuerpos (Abate et al. 1990). No se consiguió la dimerización covalente completa: aproximadamente un 30-50% de los fragmentos de anticuerpo consistía en dímeros unidos covalentemente.

Los fragmentos de anticuerpo se purificaron por cromatografía de afinidad en columnas obtenidas por acoplamiento de lisozima de huevo de gallina (D1.3) o 7B89 (anticuerpos anti-ED-B; Carnemolla et al., 1996) a Sepharose activada con CNBr (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Se cargaron los sobrenadantes en los soportes de afinidad, que después se lavaron con PBS, con PBS + NaCl 0,5 M y se eluyeron con Et3N 100 mM. Después, los anticuerpos se dializaron frente a PBS.

Los anticuerpos se marcaron como se ha descrito anteriormente y después se inyectaron en la vena de la cola de ratones portadores de tumores con 100 \mul de solución de scFv_{1}-Cy7_{1} de 1 mg/ml en PBS, cuando los tumores habían alcanzado un diámetro de aproximadamente 1 cm.

Como se muestra en la Figura 5, scFv(CGS-1) se localizó en el tumor durante hasta tres días, aunque también hubo una eliminación rápida del tumor durante este período. Sin embargo, también hubo alguna tinción del fémur. El rendimiento de dirección de CGS-1 al tumor se mejoró espectacularmente introduciendo una hélice anfipática que contenía un residuo de cisteína en el extremo C para promover la dimerización del anticuerpo (Pack et al., 1993). De hecho, la localización del scFv(CGS-2)_{2} dimérico no parecía reducirse significativamente de 24 a 72 horas. Por el contrario, un control negativo (el anticuerpo dimérico scFv(D1.3)2, anticuerpo anti-lisozima) mostró una eliminación rápida y una localización no detectable en el tumor o el fémur.

ScFv(28SI) mostró una dirección débil hacia el tumor a las 6 horas (no mostrado), pero no fue detectable a las 24 horas o posteriormente (Figura 6). La maduración de afinidad condujo a una dirección mucho mejor; de esta manera, scFv(CGS-2) se dirigía a tumores F9 pequeños y grandes eficazmente, tanto en forma del monómero (Figura 6) como en forma del dímero (no mostrado). Después de dos días, se descubrió que el porcentaje de dosis inyectada de anticuerpo por gramo de tumor era de aproximadamente 2 para el monómero de scFv(CGS-2) y de 3-4 para el dímero de scFv(CGS-2). La dosis administrada al tumor por scFv(CGS-2) también fue mayor que la administrada por scFv(CGS-1) (Figuras 5 y 6) y se correlaciona con sus afinidades respectivas (Tabla 1). Sin embargo, tanto scFv(28SI) como scFv(CGS-2) parecen ser propensos a la escisión proteolítica y muestran una captación hepática elevada (Figura 6), mientras que los anticuerpos scFv(CGS-1) eran significativamente más estables y muestran una captación hepática menor (Figura 5).

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Claims (26)

1. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que es específico por y se une directamente al dominio oncofetal ED-B de fibronectina (FN), que tiene una constante de disociación (Kd) para FN ED-B de menos de 6 x 10^{-8} M, cuando se mide como un monómero purificado.

2. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un dominio de unión a antígeno de anticuerpo de origen humano.

3. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que se une a todas las FN que contienen ED-B después del tratamiento de la FN con la proteasa termolisina.

4. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que se une a B-FN sin tratamiento de la B-FN con N-glicanasa.

5. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una región de cadena pesada variable (VH) de la secuencia derivada de la línea germinal humana DP47, codón 1 Glu - codón 98 Arg inclusive en la Figura 1, y la secuencia de la CDR3 Ser Leu Pro Lys.

6. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una región de cadena pesada variable (VH) de la secuencia derivada de la línea germinal humana DP47, codón 1 Glu - codón 98 Arg inclusive de la Figura 1, y la secuencia de la CDR3 Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu.

7. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una región de cadena ligera variable (V2) de la secuencia derivada de la línea germinal humana DPL16, codón 1 Ser - codón 90 Ser inclusive de la Figura 1, y el resto de la secuencia de la CDR3 es Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val.

8. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una región de cadena ligera variable (VL) de la secuencia derivada de la línea germinal humana DPL16, codón 1 Ser - codón 90 Ser inclusive de la Figura 1, y el resto de la secuencia de la CDR3 es Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val.

9. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una molécula scFv.

10. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una molécula de scFv dimérica.

11. Fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-8.

12. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en una cantidad eficaz, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. Ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Fago que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

15. Célula hospedadora transformada o transfectada in vitro con un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13.

16. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso en terapia.

17. Uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de un medicamento para dirección a tumores.

18. Uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de un agente para formar imágenes de tumores.

19. Procedimiento para la producción de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo dicho proceso la expresión in vitro de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13 en una célula hospedadora para producir dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

20. Procedimiento para la producción de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho proceso:

a) cribar una biblioteca de fragmentos de anticuerpo expresada en un fago con un fragmento de fibronectina recombinante que contiene el dominio ED-B procedente de la proteína fibronectina, donde los fragmentos de anticuerpo son moléculas scFv;

b) infectar células bacterianas hospedadoras con clones positivos;

c) someter clones de fagos positivos a un proceso de maduración por afinidad;

d) repetir las etapas a) y b) para seleccionar clones de fagos positivos con afinidad mejorada por el antígeno;

e) infectar células hospedadoras con clones positivos y purificar moléculas de anticuerpo a partir de dichas células hospedadoras.

21. Procedimiento de la reivindicación 20, donde dichas moléculas scFv comprenden un dominio de unión a antígeno de anticuerpo de origen humano.

22. Procedimiento de la reivindicación 20, donde la etapa a) comprende cribar con antígenos recombinantes 7B89 o ED-B.

23. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, donde se usa un ácido nucleico de un clon positivo en la producción por expresión in vitro en una célula hospedadora de un producto de anticuerpo o fragmento de anticuerpo codificado por el ácido nucleico, comprendiendo dicho producto de anticuerpo o fragmento de anticuerpo un dominio de unión a antígeno de anticuerpo que es especificó y se une directamente al dominio oncofetal ED-B de la fibronectina (FN).

24. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, donde el producto de anticuerpo está en forma de un anticuerpo entero.

25. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, donde el producto de fragmento de anticuerpo está en forma de una molécula scFv.

26. Kit de diagnóstico que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y uno o más reactivos que permiten la determinación de la unión de dicho miembro a las células.