PT906426E - Anticorpos para o domínio ed-b de fibronectina, sua construção e utilizações - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Anticorpos para ο domínio ED-B de fibronectina, sua construção e utilizações"

Antecedentes O presente invento refere-se a membros de ligação específica para uma isoforma fetal de fibronectina, ED-B, que também é expressa no desenvolvimento de neovasculatura de tumores, tal como demonstrado tanto por imunocitoquímica como por localização de alvos em tumores in vivo. Também se refere a materiais e métodos relativos a tais membros de ligação específica. O principal objectivo da maior parte das formas existentes de terapia tumoral é a morte do máximo possível de células constituintes do tumor. O sucesso limitado da quimioterapia e da radioterapia refere-se à relativa falta de especificidade do tratamento e à tendência para efeitos secundários tóxicos em tecidos normais. Uma forma de melhorar a selectividade da terapia tumoral é entregar o agente ao tumor através de uma proteína de ligação, usualmente incluindo um domínio de ligação de um anticorpo, com especificidade para um antigénio marcador expresso na superfície do tumor mas ausente nas células normais. Esta forma de terapia dirigida ao alvo, denominada numa linguagem informal por "bala mágica" (em inglês "magic bullets") tem sido principalmente exemplificada por anticorpos monoclonais (mAb) de roedores que são específicos para os denominados antigénios associados a tumores expressos na superfície celular. Estes mAb podem ser conjugados quimicamente a uma porção citotóxica (por exemplo, uma toxina ou um fármaco) ou podem ser produzidos na forma de uma proteína de fusão recombinante, em que os genes que codificam o mAb e a toxina são ligados um ao outro e expressos em tandem. A abordagem de "bala mágica" tem tido um efeito limitado, embora significativo, no tratamento de cancro humano, mais marcadamente tendo como alvo tumores de origem linfóide, em que as células malignas se encontram mais facilmente acessíveis à dose terapêutica na circulação. Contudo, o 2 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ tratamento de tumores sólidos permanece um problema clínico grave, porque somente uma proporção diminuta da massa celular total, predominantemente as células da periferia externa do tumor, é exposta aos imunoconjugados terapêuticos em circulação; estes alvos periféricos formam uma denominada "barreira de locais de ligação" ao interior do tumor (Juweid et al., 1992, Câncer Res. 52 5144-5153). No interior do tumor, a arquitectura do tecido é em geral demasiado densa, com estroma fibroso e células tumorais com empacotamento compacto, para permitir a penetração de moléculas na gama de tamanhos dos anticorpos. Além disso, sabe-se que os tumores apresentam uma pressão intersticial elevada devido à ausência de drenagem linfática, que também impede o influxo de moléculas exógenas. Para uma revisão recente dos factores que afectam a absorção de agentes terapêuticos por tumores, veja-se Jain, R (1994), Sei. Am. 271 58-65.

Embora existam limitações óbvias ao tratamento de tumores sólidos tomando como alvo antigénios associados ao tumor estes tumores apresentam uma característica em comum que proporciona um alvo antigénico alternativo para terapia com anticorpos. Uma vez que tenham ultrapassado um determinado tamanho, os tumores são universalmente dependentes de um fornecimento independente de sangue para fornecer oxigénio e nutrientes adequados para manter o crescimento. Se for possível interferir ou obstruir o fornecimento de sangue, existe um potencial realista para matar à fome milhares de células tumorais no processo. À medida que o tumor se desenvolve, sofre uma mudança para um fenótipo angiogénico, produzindo um conjunto variado de factores angiogénicos que actuam em células endoteliais capilares vizinhas, induzindo-as a proliferar e migrar. A estrutura destes vasos sanguíneos formados de novo é altamente desorganizada, com terminações e fenestrações levando a aumento das fugas, em contraste acentuado com a estrutura ordenada dos capilares em tecido normal. A indução de angiogénese é acompanhada pela supra-regulação da expressão de determinados antigénios de superfície celular, muitos dos quais são comuns à vasculatura dos tecidos normais. A identificação de antigénios que são únicos para a neovasculatura de tumores tem sido o principal factor limitante no desenvolvimento de um tratamento genérico para tumores sólidos através da utilização de alvos 3 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ vasculares. Ο antigénio que é objecto do presente invento aborda directamente este problema.

Durante a progressão do tumor, a matriz extracelular do tecido circundante é remodelada através de dois processos principais: (1) a degradação proteolítica dos componentes da matriz extracelular de tecido normal e (2) a síntese de novo de componentes da matriz extracelular por células tumorais e por células estromais activadas por citoquinas induzidas por tumor. Estes dois processos, em estado estacionário, geram uma "matriz extracelular tumoral", que proporciona um ambiente mais adequado para progressão de tumores e que é distinta qualitativa e quantitativamente da de tecidos normais. Entre os componentes desta matriz encontram-se as isoformas grandes de tenascina e fibronectina (FN); a descrição destas proteínas como isoformas reconhece a sua extensa heterogeneidade estrutural que é introduzida a nível da transcrição, pós-transcrição e pós-tradução (veja-se adiante). É uma das isoformas de fibronectina, a denominada isoforma B+ (B-FN) que constitui o objecto do presente invento.

As fibronectinas (FN) são glicoproteínas multifuncionais, de alto peso molecular, componentes tanto da matriz extracelular, como de fluidos corporais. Estão envolvidas em vários processos biológicos diferentes tais como o estabelecimento e manutenção da morfologia celular normal, migração celular, hemóstase e trombose, cicatrização de ferimentos e transformação oncogénica (para revisões veja-se Alitalo et al., 1982; Yamada, 1983; Hynes, 1985; Ruoslahti et ai., 1988; Hynes, 1990; Owens et al., 1986). A diversidade estrutural de FN é proporcionada por splicing alternativo de três regiões (ED-A, ED-B e IIICS) do produto de transcrição FN primário (Hynes, 1985; Zardi et al., 1987) para gerar pelo menos 20 isoformas diferentes, algumas das quais são expressas diferenciadamente em tecido de tumor e normal. Assim como é regulada de uma forma específica do tecido e de desenvolvimento, sabe-se que o padrão de splicing do pré-ARNm de FN é desregulado em células transformadas e em malignidades (Castellani et al., 1986; Borsi et al., 1987; Vartio et al., 1987, Zardi et al., 1987; Barone et al., 1989; Carnemolla et al., 1989; Oyama et al., 1989, 1990; Borsi et al., 1992b). De facto, as isoformas FN contendo as sequências ED-A, ED-B e 4 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ IIICS são expressas numa maior extensão em células tumorais transformadas e malignas do que em células normais. Em particular, a isoforma FN que contém a sequência ED-B (isoforma B+) é altamente expressa em tecidos fetais e de tumor, bem como durante a cicatrização de ferimentos, mas a expressão é restrita em tecidos adultos normais (Norton et al., 1987; Schwarzbauer et al.r 1987; Gutman e Kornblihtt, 1987; Carnemolla et al., 1989; ffrench-Constant et al., 1989; ffrench-Constant e Hynes, 1989; Laitinen et al., 1991.) As moléculas FN B+ são indetectáveis em vasos maduros, mas são reguladas positivamente em vasos sanguíneos angiogénicos em desenvolvimento normal (por exemplo, desenvolvimento do endométrio), patológico (por exemplo, em retinopatia diabética) e desenvolvimento de tumor (Castellani et al., 1994) . A sequência ED-B é uma repetição de homologia do tipo III completa codificada por um único exão e incluindo 91 aminoácidos. Contrariamente à isoforma IIICS de splicing alternativo, que contém um local de ligação específico do tipo celular, a função biológica das isoformas A+ e B+ é ainda objecto de especulação (Humphries et al., 1986). A presença da própria isoforma B+ constitui um neoantigénio induzido por tumor, mas além disso, a expressão de ED-B expõe um antigénio normalmente críptico dentro da repetição 7 do tipo III (que precede ed-b) ; dado que este epítopo não está exposto em moléculas de FN que não contêm ED-B, a expressão de ED-B induz a expressão de neoantigénios tanto directa como indirectamente. Este local antigénico críptico constitui o alvo de um anticorpo monoclonal (mAb) denominado BC-1 (Carnemolla et al., 1992). A especificidade e as propriedades biológicas deste mAb foram descritas em ΕΡ 0 344 134 Bl, que é obtenível a partir do hibridoma depositado em European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, RU com o número 88042101. O mAb foi utilizado com sucesso para localizar os vasos sanguíneos angiogénicos de tumores sem reactividade cruzada com endotélio vascular maduro, ilustrando o potencial de isoformas de FN para localizar alvos vasculares utilizando anticorpos. 5 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ

Contudo, existem determinadas reservas à especificidade do mAb BC-1. O facto de BC-1 não reconhecer directamente a isoforma B+ suscitou a questão de em determinados tecidos, o epitopo reconhecido por BC-1 poder ser desmascarado sem a presença de ED-B e consequentemente levar indirectamente a reactividade cruzada indesejável de BC-1. Além disso, BC-1 é estritamente especifico para a isoforma B+ humana, pelo que os estudos em animais sobre a biodistribuição e a localização no tumor de BC-1 não são possíveis. Embora tenham sido produzidos anticorpos policlonais de proteínas de fusão recombinantes contendo a isoforma B+ (Peters et al., 1995), estes só são reactivos com FN que foi tratada com N-glicanase para desmascarar o epitopo.

Constitui um problema geral adicional da utilização de anticorpos monoclonais de ratinho, a resposta humana anti-anticorpo ratinho (HAMA) (Schroff et al., 1985; Dejager et al., 1988). As respostas HAMA apresentam uma gama de efeitos, desde a neutralização do anticorpo administrado levando a uma dose terapêutica reduzida, até respostas alérgicas, doenças séricas e danos renais.

Embora tenham sido identificados anti-soros policlonais reactivos com ED-B recombinante (veja-se acima), o isolamento de mAb com a mesma especificidade de BC-1 após imunização de ratinhos tem sido em geral difícil porque as proteínas ED-B humana e de ratinho apresentam virtualmente 100% de homologia de sequência. A proteína humana pode assim parecer um auto-antigénio para o ratinho que então não desenvolve uma resposta imunitária contra ela. De facto, em mais de dez anos de investigação intensa neste campo, foi identificado apenas um único mAb com reactividade indirecta com a isoforma de B+ de FN (BC-1), e nenhum deles reconhece ED-B directamente. É quase de certeza significativo que a especificidade de BC-1 é para um epitopo críptico exposto como consequência de ED-B, e não como parte do próprio ED-B, que está provavelmente ausente do FN de ratinho e consequentemente não é reconhecida como "própria" pelo sistema imunitário do ratinho. A realização do presente invento foi conseguida utilizando uma estratégia alternativa às previamente utilizadas e em que não é necessária imunização anterior com fibronectina ou ED-B: 6 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ obtiveram-se anticorpos com especificidade para a isoforma ED-B como Fv em cadeia simples (scFv) a partir de bibliotecas de regiões variáveis de anticorpos humanos apresentadas na superfície de bacteriófagos filamentosos (Nissim et al., 1994; veja-se igualmente W092/01047, W092/20791, WO93/06213, W093/11236, W093/19172).

Utilizando uma biblioteca de fagos de anticorpos verificamos que se podem isolar scFv específicos tanto por selecção directa em fragmentos FN recombinantes contendo o domínio ED-B, como no próprio ED-B recombinante quando estes antigénios revestem uma superfície sólida ("selecção"). Estas mesmas fontes de antigénios foram também utilizadas com sucesso para produzir scFv de "segunda geração" com propriedades melhoradas relativamente aos clones parentais num processo de "maturação de afinidade". Verificamos que os scFv isolados reagem forte e especificamente com a isoforma B+ de FN humana sem tratamento prévio com N-glicanase.

Em aplicações antitumorais, os domínios de ligação ao antigénio de anticorpos humanos proporcionados pelo presente invento apresentam a vantagem de não serem sujeitos à resposta HAMA. Além disso, tal como aqui exemplificado, são úteis em análise imuno-histoquímica de tecido tumoral, tanto in vitro como in vivo. Estas e outras utilizações são aqui discutidas adicionalmente e são evidentes para um perito na arte.

Zang et al. Matrix Biology 1994 Vol. 14 páginas 623-633 descrevem um anticorpo policlonal desenvolvido contra o domínio B extra de fibronectina canina JP02076598 e JP04169195 descrevem anticorpos monoclonais contra fibronectina.

TERMINOLOGIA

Membro de ligação específica

Tal descreve um membro de um par de moléculas que apresentam especificidade de ligação uma para com a outra. Os membros de um par de ligação específica podem ser derivados naturalmente ou produzidos sinteticamente na totalidade ou em parte. Um membro do par de moléculas apresenta uma área na sua superfície ou uma cavidade que se liga especificamente e é 7 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ portanto complementar a uma determinada organização espacial e polar do outro membro do par de moléculas. Assim, os membros do par apresentam a propriedade de se ligarem especificamente um ao outro. Constituem exemplos de tipos de pares de ligação especifica antigénio-anticorpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando, enzima-substrato.

Anticorpo

Tal descreve uma imunoglobulina, quer natural, quer produzida sinteticamente em parte ou na totalidade. A expressão também abrange qualquer polipéptido ou proteína com um domínio de ligação que é um domínio de ligação de anticorpo ou que lhe é homólogo. Estes podem ser derivados de fontes naturais ou podem ser produzidos sinteticamente em parte ou na totalidade. Constituem exemplos de anticorpos os isotipos de imunoglobulina e as suas subclasses isotípicas; fragmentos que incluem um domínio de ligação ao antigénio tal como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; e diacorpos. É possível utilizar anticorpos monoclonais e outros e utilizar técnicas de tecnologia de ADN recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que mantêm a especificidade do anticorpo original. Tais técnicas podem envolver a introdução de ADN que codifica a região variável de imunoglobulina ou as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de um anticorpo nas regiões constantes ou regiões constantes mais regiões de esqueleto de uma imunoglobulina diferente. Veja-se, por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400. Pode submeter-se um hibridoma ou outra célula que produza um anticorpo a uma mutação genética ou outras alterações que podem ou não alterar a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos.

Dado que os anticorpos podem ser modificados de várias formas, a expressão "anticorpo" deve ser entendida como abrangendo qualquer membro de ligação específica ou substância com um domínio de ligação com a especificidade desejada. Assim, esta expressão abrange fragmentos de anticorpo, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, incluindo qualquer polipéptido que contenha um domínio de ligação de imunoglobulina, quer natural, quer sintético na 8 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ totalidade ou em parte. Estão assim incluídas moléculas quiméricas contendo um domínio de ligação de imunoglobulina, ou equivalente, fundido a outro polipéptido. Descrevem-se a clonagem e a expressão de anticorpos quiméricos em EP-A0120694 e EP-A-0125023.

Foi demonstrado que fragmentos de um anticorpo completo podem realizar a função de ligar antigénios. Constituem exemplos de fragmentos de ligação (i) o fragmento Fab que consiste em domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHI; (iii) o fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb (Ward et al., 1989) que consiste num domínio VH; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente incluindo dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv em cadeia única (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL se encontram ligados por um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associem para formar um local de ligação ao antigénio (Bird et al., 1988; Huston et al., 1988) (viii) dímeros Fv biespecíficos de cadeia única (PCT/US92/09965) e (ix) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão génica (W094/13804; Holliger et al., 1993).

Os diacorpos são multímeros de polipéptidos, em que cada polipéptido inclui um primeiro domínio incluindo uma região de ligação de uma cadeia leve de imunoglobulina e um segundo domínio incluindo uma região de ligação de uma cadeia pesada de imunoglobulina, estando os dois domínios ligados (por exemplo, através de um ligante peptídico) mas incapazes de se associarem um com o outro para formar um local de ligação ao antigénio: os locais de ligação ao antigénio são formados por associação do primeiro domínio de um polipéptido dentro do multímero com o segundo domínio de outro polipéptido dentro do multímero (WO94/13804).

Quando se utilizam anticorpos biespecíficos, estes podem ser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser produzidos de várias formas (Holliger e Winter, 1993), por exemplo preparados quimicamente ou partir de hibridomas híbridos, ou podem ser quaisquer dos fragmentos de anticorpo biespecífico mencionados acima. Pode ser preferível utilizar 9 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ dímeros de scFv ou diacorpos em vez dos anticorpos completos. Os diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, utilizando apenas dominios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos de reacção anti-idiotípica. Outras formas de anticorpos biespecificos incluem as "Janusinas" de cadeia simples descritas em Traunecker et al.r (1991).

Os diacorpos biespecificos, contrariamente aos anticorpos biespecificos completos, podem também ser particularmente úteis porque podem ser facilmente construídos e expressos em E. coli. Os diacorpos (e muitos outros polipéptidos tais como fragmentos de anticorpo) com especificidades de ligação adequadas podem ser facilmente seleccionados utilizando bibliotecas de exibição em fagos (WO94/13804). Caso um dos braços do diacorpo seja para permanecer constante, por exemplo com uma especificidade dirigida contra antigénio X, então pode construir-se uma biblioteca em que o outro braço seja variado e selecciona-se um anticorpo com especificidade adequada.

Domínio de ligação ao antigénio

Tal descreve a parte de um anticorpo que inclui a área que liga especificamente e que é complementar a parte ou todo o antigénio. Quando o antigénio é grande, um anticorpo pode ligar-se apenas a uma determinada parte do antigénio, parte essa que é denominada um epitopo. Um domínio de ligação ao antigénio pode ser proporcionado por um ou mais domínios variáveis de anticorpo. De preferência, um domínio de ligação ao antigénio inclui uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).

Específico

Tal refere-se à situação em que um membro de um par de ligação específica não apresentará qualquer ligação significativa a moléculas diferentes do seu parceiro de ligação específica. A expressão também é aplicável no caso, por exemplo, em que um domínio de ligação ao antigénio é específico para um determinado epitopo que é apresentado por vários antigénios, caso em que o membro de ligação específica 10 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ com ο domínio de ligação ao antigénio será capaz de se ligar a vários antigénios que contêm o epítopo.

Forma variante funcionalmente equivalente

Tal refere-se a uma molécula (a variante) que embora apresente diferenças estruturais com outra molécula (parental) mantém homologia significativa e também pelo menos parte da função biológica da molécula parental, por exemplo, a capacidade de ligar um determinado antigénio ou epitopo. As variantes podem encontrar-se sob a forma de fragmentos, derivados ou mutantes. Pode ser obtida uma variante, um derivado ou um mutante, por modificação da molécula parental por adição, deleção, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos ou por ligação de uma outra molécula. Estas alterações podem ser efectuadas ao nível dos nucleótidos ou da proteína. Por exemplo, o polipéptido codificado pode ser um fragmento Fab que é então ligado a uma cauda Fc de outra fonte. Alternativamente, pode ligar-se um marcador, tal como uma enzima, fluoresceína, etc.

Sumário do presente invento

De acordo com o presente invento proporciona-se um membro de ligação específica que é específico para o domínio ED-B oncofetal de fibronectina (FN) e se liga directamente a este, tal como reivindicado na reivindicação 1.

Os membros de ligação específica de acordo com o invento ligam o domínio ED-B directamente. Numa concretização, um membro de ligação específica liga-se, após tratamento da FN com a protease termolisina, a uma qualquer, ou todas, as FN contendo ED-B. Numa concretização adicional, um membro de ligação específica liga-se a uma qualquer, ou todas, as FN que contêm repetições de homologia do tipo III que incluem o domínio ED-B. São identificadas FN conhecidas em dois artigos por Carnemolla et al., 1989; 1992). A referência a "todas as FN contendo ED-B" pode ser tomada como referência a todas a FN identificadas nesses artigos como contendo ED-B. O membro de ligação específica liga de preferência ED-B humana e de preferência B+FN de pelo menos uma outra espécie, 11 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ tal como ratinho, rato e/ou galinha. De preferência, o membro do par de ligação especifica é capaz de ligar tanto ED-B de fibronectina humana, como uma ED-B de fibronectina não humana, tal como a de ratinho, permitindo o ensaio e a análise do membro sbp num modelo animal.

Os membros do par de ligação especifica de acordo com o presente invento ligam ED-B de fibronectina sem competir com o anticorpo BC-1 depositado disponível ao público discutido aqui noutro local. O BC-1 é estritamente especifico para a isoforma B+ humana. Os membros do par de ligação especifica de acordo com o presente invento não se ligam ao mesmo epitopo que BC-1. A ligação de um membro de ligação especifica de acordo com o presente invento a B+FN pode ser inibida pelo domínio ED-B. O dominio de ligação, quando medido como um monómero purificado, apresenta uma constante de dissociação (Kd) de 6 x IO-8 M ou inferior para ED-B de FN.

Num aspecto do presente invento, o dominio de ligação é reactivo com, ou seja é capaz de se ligar a, ED-B de fibronectina sem tratamento prévio de ED-B de fibronectina com N-glicanase.

Os membros do par de ligação especifica de acordo com o presente invento podem ser proporcionados na forma de isolados ou numa forma purificada, ou seja numa preparação ou formulação isenta de outros membros do par de ligação especifica, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de anticorpo, ou isentos de outros membros do par de ligação específica capazes de ligar ED-B de fibronectina. De preferência, os membros de ligação específica de acordo com o presente invento são proporcionados numa forma substancialmente pura. Podem ser "monoclonais" no sentido de serem de um único clone, em vez de serem restringidos a anticorpos obtidos utilizando a tecnologia dos hibridomas tradicional. Tal como discutido, os membros do par de ligação específica de acordo com o presente invento podem ser obtidos utilizando tecnologia de exibição em bacteriófagos e/ou expressão em células hospedeiras recombinantes, por exemplo, bacterianas. 12 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ Ο membro de ligação específica inclui um anticorpo. O membro de ligação específica pode incluir uma sequência polipeptídica sob a forma de um fragmento de anticorpo tal como Fv de cadeia simples (scFv). Podem ser utilizados outros tipos de fragmentos de anticorpos tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb ou um diacorpo (Winter e Milstein, 1991; WO94/13804). O membro de ligação específica pode estar sob a forma de um anticorpo completo. O anticorpo completo pode encontrar-se sob qualquer das formas de isotipos de anticorpo, por exemplo IgG, IgA, IgD, IgE e IgM e qualquer das formas de subclasses de isotipo, por exemplo igGl ou IgG4. O anticorpo pode ser de qualquer origem, por exemplo, humana, murina, ovina ou de coelho. Outras derivações serão evidentes para os peritos na arte. De preferência, o anticorpo é de origem humana. "Humana" significa que um anticorpo que é parcial ou totalmente derivado de uma biblioteca de ADNc, proteínas ou péptidos humanos. Esta expressão inclui péptidos e proteínas humanizadas de origem não humana que foram modificadas de modo a conferir características humanas à molécula de anticorpo e permitem assim que a molécula ultrapasse as defesas do sistema imunitário humano. O membro de ligação específica pode também estar sob a forma de um anticorpo alterado por engenharia genética, por exemplo, uma molécula de anticorpo biespecífico (ou um fragmento tal como F(ab')2) que apresenta um braço de ligação ao antigénio (ou seja domínio específico) contra ED-B de fibronectina, tal como revelado, e outro braço contra uma especificidade diferente ou uma molécula bivalente ou multivalente.

Além das sequências de anticorpo, o membro de ligação específica podem incluir quaisquer outros aminoácidos, por exemplo, formando um péptido ou polipéptido, ou para conferir à molécula outra característica funcional além da capacidade para ligar antigénio. Por exemplo, o membro de ligação específica pode incluir um marcador, uma enzima ou um seu fragmento, etc. 13 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ Ο domínio de ligação pode incluir parte ou todo um domínio VH codificado por um segmento de linha germinal ou um segmento de gene rearranjado. O domínio de ligação pode incluir parte ou todo um domínio capa de VL ou um domínio lambda de VL. O domínio de ligação pode incluir uma sequência génica de linha germinal VHl, VH3 ou VH4 ou uma sua forma rearranjada.

Um membro de ligação específica de acordo com o presente invento pode incluir uma região variável de cadeia pesada (domínio "VH") derivada de linha germinal humana DP47, cuja

sequência é apresentada na figura l(a), resíduos 1 a 98. A nomenclatura "DP" é descrita em Tomlinson et al., (1992). A sequência de aminoácidos da CDR3 pode ser Ser Leu Pro Lys. A sequência de aminoácidos da CDR3 pode ser Gly Vai Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu. Assim, o domínio de ligação de um membro de ligação específica de acordo com o presente invento pode incluir um domínio VH que inclui as sequências de aminoácidos apresentadas na figura 1(a) para CGS1 e CGS2. O domínio de ligação pode incluir uma região variável de cadeia leve (domínio "VL") derivada de linha germinal humana DPL16, cuja sequência se apresenta na figura l(b) como codões 1-90. O domínio VL pode incluir uma sequência CDR3 Asn Ser Ser Pro Vai Vai Leu Asn Gly vai vai. O domínio VL pode incluir uma sequência CDR 3 Asn Ser Ser Pro Phe Glu His Asn Leu Vai Vai.

Os membros de ligação específica do invento podem incluir variantes funcionalmente equivalentes das sequências apresentadas na figura 1, por exemplo, um ou mais aminoácidos foram inseridos, eliminados, substituídos ou adicionados, desde que se mantenha uma propriedade tal como aqui especificada. Por exemplo, a sequência CDR3 pode ser alterada, ou podem ser efectuadas uma ou mais alterações às regiões de esqueleto, ou o esqueleto pode ser substituído por outra região de esqueleto ou por uma forma modificada, desde que o membro de ligação específica ligue ED-B.

Uma ou mais CDR de um domínio VL ou VH de um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo aqui revelado pode ser 14 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ utilizada no denominado "enxerto de CDR" no qual uma ou mais sequências CDR de um primeiro anticorpo é colocada no interior de sequências de esqueleto que não são desse anticorpo, por exemplo, de outro anticorpo, tal como revelado em EP-B-0239400. As sequências CDR para CGS1 e CGS2 são apresentadas na figura l(a) e l(b).

Um membro de ligação especifica de acordo com o invento pode ser aquele que compete com um anticorpo ou scFv aqui descrito para ligação a ED-B de fibronectina. A competição entre membros de ligação pode ser ensaiada facilmente in vitro, por exemplo por marcação com uma molécula repórter especifica de um membro de ligação que pode ser detectado na presença de outro(s) membro(s) de ligação não marcado(s), para permitir identificação de membros de ligação especifica que se ligam ao mesmo epitopo ou um epitopo sobreponivel.

Um membro de ligação especifica de acordo com o presente invento pode ser utilizado num método incluindo causar ou permitir a ligação do membro de ligação especifica ao seu epitopo. A ligação pode ser seguida por administração do membro de ligação especifica a um mamífero, por exemplo, humano ou roedor, tal como ratinho. O presente invento proporciona a utilização de um membro de ligação específica tal como acima para utilização como um reagente de diagnóstico para tumores. A evidência experimental de modelos animais descrita adiante demonstra que os membros de ligação de acordo com o presente invento são úteis para localização de tumor in vivo.

Os membros de ligação específica preferidos de acordo com o presente invento incluem os que se ligam a tumores humanos, por exemplo, numa secção criostática, que apresenta um fenótipo invasivo e angiogénico e os que se ligam a tecidos embrionários, por exemplo, numa secção criostática. A ligação pode ser demonstrada por coloração imunocitoquímica.

Numa concretização preferida, o membro de ligação específica não liga, ou não liga significativamente, tenascina, uma proteína de matriz extracelular. 15 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ

Noutra concretização preferida, ο membro de ligação especifica não liga, ou não liga significativamente, pele humana normal, por exemplo, numa secção criostática e/ou tal como demonstrado utilizando coloração imunocitoquimica.

Concretizações adicionais de membros de ligação especifica de acordo com o presente invento não ligam, ou não ligam significativamente, um ou mais tecidos normais (por exemplo, em secção criostática e/ou tal como demonstrado por coloração imunocitoquimica) seleccionados de figado, baço, rim, estômago, intestino delgado, intestino grosso, ovário, útero, bexiga, pâncreas, glândulas supra-renais, músculo esquelético, coração, pulmão, tiróide e cérebro.

Um membro de ligação especifica para ED-B pode ser utilizado como um agente de localização de alvo in vivo que pode ser utilizado para demonstrar especificamente a presença e localização de tumores que expressam ou estão associados com ED-B de fibronectina. Pode ser utilizado como um agente de imagem. O presente invento proporciona um método para determinar a presença de uma célula ou tumor que expressa ou que está associado com a expressão de ED-B de fibronectina, incluindo o método pôr em contacto células com um membro de ligação especifica tal como proporcionado e determinar a ligação do membro de ligação especifica às células. O método pode ser realizado in vivo ou in vitro numa amostra de ensaio de células removidas do corpo.

As reactividades de anticorpos numa amostra celular podem ser determinadas por quaisquer meios adequados. A marcação com moléculas repórter individuais é uma possibilidade. As moléculas repórter podem gerar directa ou indirectamente sinais detectáveis e, de preferência, mensuráveis. A ligação de moléculas repórter pode ser directa ou indirectamente, covalentemente, por exemplo através de uma ligação peptidica ou não covalentemente. A ligação através de uma ligação peptidica pode ser em resultado de expressão recombinante de uma fusão génica que codifica o anticorpo e a molécula repórter.

Um modo favorecido é por ligação covalente de cada anticorpo com um fluorócromo, fosforescente ou corante de 16 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ laser individual com características de absorção ou emissão isoladas espectralmente. Constituem fluorócromos adequados, entre outros, fluoresceina, rodamina, ficoeritrina e vermelho do Texas. Constitui um corante cromogénico adequado, entre outros, diaminobenzidina.

Outros repórteres incluem partículas coloidais macromoleculares ou material particulado tal como pérolas de látex que são coradas, magnéticas ou paramagnéticas, e agentes activos biológica ou quimicamente que possam causar directa ou indirectamente sinais detectáveis por observação visual, detectados electronicamente ou registados de outra forma. Estas moléculas podem ser enzimas que catalisam reacções que desenvolvem ou mudam cores ou causam alterações em propriedades eléctricas, por exemplo. Podem ser excitáveis molecularmente, tal como transições electrónicas entre estados energéticos que resultam em absorções ou emissões espectrais características. Podem incluir entidades químicas utilizadas conjuntamente com biossensores. Podem ser utilizados sistemas de detecção de biotina/avidina ou biotina/estreptavidina e fosfatase alcalina. O modo de determinação de ligação não é uma característica do presente invento e os peritos na arte são capazes de seleccionar um modo adequado de acordo com a sua preferência ou com o conhecimento geral.

Os sinais gerados por conjugados anticorpo-repórter individuais podem ser utilizados para derivar dados quantificáveis absoluta ou relativamente sobre a ligação do anticorpo relevante em amostras celulares (normal e de ensaio). Além disso, pode ser utilizada uma coloração nuclear geral tal como iodeto de propídio para enumerar a população celular total numa amostra, permitindo proporcionar razões quantitativas de populações celulares individuais relativamente às células totais. Quando se liga um radionucleótido, tal como 125i, inin ou 99mTc, a um anticorpo, se o anticorpo se localizar preferencialmente em tumores relativamente a tecido normal, a presença do marcador radioquímico em tumores pode ser detectada e quantificada utilizando um detector de visualização gama. A qualidade da 17 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ imagem do tumor obtida é directamente correlacionada com a razão sinal:ruído.

Os anticorpos podem ser utilizados como agentes de diagnóstico para rastrear tumores vascularizados recentemente e podem também ser utilizados, por exemplo, sob forma modificada, para entregar agentes citotóxicos ou para desencadear coagulação dentro dos novos vasos sanguíneos, privando assim o tumor em desenvolvimento de oxigénio e nutrientes e constituir uma forma indirecta de terapia de tumor. O presente invento proporciona também a utilização de um membro de ligação específica tal como acima para utilização como um reagente terapêutico, por exemplo quando acoplado, ligado ou modificado por engenharia genética como uma proteína de fusão para ter uma função de efector. Pode ser utilizado um membro de ligação específica de acordo com o presente invento para dirigir ao alvo uma toxina, radioactividade, células T, células assassinas ou outras moléculas para um tumor que expressa ou está associado com o antigénio de interesse.

Pode utilizar-se um membro de ligação específica em métodos de tratamento incluindo administração de um membro de ligação especifica tal como proporcionado, composições farmacêuticas incluindo tal membro de ligação específica e utilização de tal membro de ligação específica no fabrico de um medicamento para administração, por exemplo num método para preparar um medicamento ou composição farmacêutica incluindo formular o membro de ligação específica com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

As composições proporcionadas podem ser administradas a indivíduos. A administração é de preferência numa "quantidade terapeuticamente eficaz", sendo esta suficiente para mostrar benefício para um doente. Tal benefício pode ser pelo menos melhoria de pelo menos um sintoma. A quantidade efectivamente administrada e a velocidade e decurso da administração dependerão da natureza e gravidade do que está a ser tratado. A prescrição de tratamento, por exemplo decisões sobre a dosagem etc., encontra-se no âmbito de responsabilidade de clínicos gerais e outros médicos. As doses adequadas de 18 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ anticorpo são bem conhecidas na arte; veja-se Ledermann et ai., (1991); Bagshawe K.D. et ai. (1991).

Pode administrar-se uma composição sozinha ou em combinação com outros tratamentos, quer simultânea, quer sequencialmente, dependendo da condição a ser tratada.

As composições farmacêuticas de acordo com o presente invento e para utilização de acordo com o presente invento podem incluir, além do ingrediente activo, um excipiente, transportador, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos dos peritos na arte. Tais materiais não devem ser tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente activo. A natureza exacta do transportador ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser oral ou por injecção, por exemplo, intravenosa.

As composições farmacêuticas para administração oral podem ter a forma de comprimido, cápsula, pó ou líquido. Um comprimido pode incluir um transportador sólido tal como gelatina ou um adjuvante. As composições farmacêuticas líquidas incluirão em geral um transportador líquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Podem ser incluídas solução salina fisiológica, solução de dextrose ou outro sacárido ou glicóis tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol.

Para injecção intravenosa ou injecção no local de aflição, o ingrediente activo estará sob a forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é isenta pirogénios e tem um pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os peritos na arte relevante são bem capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotónicos tal como injecção de cloreto de sódio, injecção de Ringer, injecção de Ringer lactato. Podem ser incluídos, caso necessário, conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos.

Um membro de ligação específica de acordo com o presente invento pode ser preparado por expressão de ácido nucleico codificante. O ácido nucleico que codifica qualquer membro de ligação específica tal como proporcionado forma por si só um 19 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ aspecto do presente invento, tal como um método de produção do membro de ligação especifica, cujo método inclui expressão a partir do ácido nucleico que o codifica. A expressão pode ser conseguida convenientemente por cultura sob condições adequadas de células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucleico. O ácido nucleico pode codificar quaisquer das sequências de aminoácidos do dominio de ligação ao antigénios do anticorpo aqui descritos ou qualquer forma funcionalmente equivalente. Podem efectuar-se alterações a nivel de nucleótidos por adição, substituição, deleção ou inserção de um ou mais nucleótidos, alterações que podem ou não ser reflectidas ao nivel dos aminoácidos, dependendo da degenerescência do código genético. São bem conhecidos sistemas para clonagem e expressão de um polipéptido em várias células hospedeiras diferentes. Constituem células hospedeiras adequadas, entre outras, bactérias, células de mamífero, levedura e sistemas de baculovírus. Constituem linhas de células de mamífero disponíveis na arte para expressão de um polipéptido heterólogo, entre outras, células de ovário de hamster chinês, células HeLa, células de rim hamster bebé e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano comum preferido é E. coli. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos em células procarióticas tais como E. coli está bem estabelecida na arte. Para uma revisão, veja-se por exemplo Pluckthun, (1991) . Encontra-se também disponível aos peritos na arte a expressão em células eucarióticas em cultura como uma opção para a produção de um membro de ligação específica, veja-se para revisões recentes, por exemplo Reff, (1993); Trill et al. (1995) .

Podem ser seleccionados ou construídos vectores adequados contendo sequências de regulação adequadas, incluindo sequências de promotor, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, sequências de facilitador, genes de marcação e outras sequências tal como adequado. Os vectores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, fago ou fagemídeo, tal como adequado. Para mais detalhes veja-se, por exemplo, 20 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ

Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Descrevem-se detalhadamente muitas técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácido nucleico, por exemplo na preparação de construções de ácido nucleico, mutagénese, sequenciação, introdução de ADN em células e expressão génica e análise de proteínas em Short Protocols in Molecular Biology, segunda edição, Ausubel et al. ed., John Wiley & Sons, 1992. As revelações de Sambrook et al. e Ausubel et al. são aqui incorporadas por referência.

Assim, um aspecto adicional do presente invento proporciona uma célula hospedeira contendo ácido nucleico tal como aqui revelado. Ainda outro aspecto adicional proporciona um método incluindo introdução de tal ácido nucleico numa célula hospedeira. A introdução pode utilizar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, as técnicas adequadas podem incluir transfecção com fosfato de cálcio, DEAE-Dextrano, electroporação, transfecção mediada por lipossoma e transdução utilizando retrovírus ou outros vírus, por exemplo, vaccinia ou, para células de insectos, baculovírus. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir transformação com cloreto de cálcio, electroporação e transfecção utilizando bacteriófago. A introdução pode ser seguida por causar ou permitir expressão do ácido nucleico, por exemplo, por cultura das células hospedeiras em condições para expressão do gene.

Numa concretização, o ácido nucleico do invento é integrado no genoma (por exemplo, cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão.

Após produção de um membro de ligação específica, este pode ser utilizado por exemplo em qualquer das maneiras aqui reveladas, tal como na formulação de um produto farmacêutico ou de diagnóstico, tal como um kit incluindo, além do membro de ligação específica, um ou mais reagentes para determinar a ligação do membro a células, tal como discutido. 21 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ

Serão aparentes aos peritos na arte aspectos adicionais do invento e concretizações. De modo a entender completamente o presente invento, proporcionam-se os seguintes exemplos apenas a titulo exemplificativo e de modo algum limitativo. Faz-se referência às seguintes figuras:

Figura 1: A figura 1 apresenta sequências de aminoácidos alinhadas das VH e VL de scFv de CGS-1 e CGS-2. A figura l(a) apresenta sequências VH; a figura 1 (b) apresenta sequências VL. As CDR (1, 2 e 3) são indicadas. A VH de linha germinal humana mais homóloga de ambos os scFv é o segmento DP47 da família VH3; o segmento VL de ambos os clones é DPL16, a cadeia leve utilizada para construir a biblioteca scFv original (Nissim et al., 1994). Os resíduos que distinguem os dois clones um do outro estão sublinhados.

Figura 2: A figura 2A apresenta um modelo da estrutura do domínio de uma subunidade FN humana. As regiões de variabilidade IIICS, ED-A e ed-b, devidas a splicing alternativo do pré-ARNm de FN são indicadas. A figura também indica as homologias internas bem como os produtos de digestão de termolisina principais contendo ED-B (Zardi et al., 1987). A figura 2B apresenta SDS-PAGE a 4-18% de plasma e WI38VA FN e das suas digestões com termolisina coradas com azul de Coomassie e imunotransferências sondadas com BC-1, IST-6, CGS-1 e CGS-2. Plasma de FN não digerido (pista 1) e digerido utilizando termolisina a 1 μg/mg de FN (pista 3) e 10 μρ/πιρ de FN (pista 4). WI38VA FN não digerido (pista 2) e digerido utilizando termolisina a 1 μg/mg (pista 5), 5 \iq/m.q (pista 6) e 10 μρ/ιηρ (pista 7) de FN. Os números do lado direito indicam os principais produtos de digestão com termolisina apresentados na figura 2A. Os valores à esquerda indicam os padrões de peso molecular em quiloDalton (kD).

Figura 3: A figura 3A apresenta as sequências de repetição de FN tipo III contidas nas proteínas de fusão e recombinantes expressas em E. coli e a reactividade destas proteínas com CGS-1 e CGS-2 e com os mAb BC-1 e IST-6. A figura 3B apresenta um gel corado com azul de Coomassie e ao lado as imunotransferências sondadas com CGS-1, CGS-2, BC-1, IST-6. A numeração das pistas corresponde à das construções de péptidos 22 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ na parte superior da figura. Os valores à esquerda indicam os padrões de peso molecular em kD.

Figura 4: Aparelho de obtenção de imagem de ratinho por infravermelho; o aparelho de obtenção de imagem de ratinho utilizado para as experiências de localização de alvo consiste numa caixa negra não fluorescente equipada com uma lâmpada de tungsténio halogéneo, filtros de excitação e emissão específicos para o fluoróforo de infravermelho CY7 e uma câmara CCD monocromática de 8 bits controlada por computador.

Figura 5: Direccionamento de fragmentos de anticorpo marcados por fluorescência para o teratocarcinoma murino F9 utilizando scFv monomérico (CGS-1) e scFv dimérico (CGS-1)2 dirigido contra B-FN. O scFv dimérico (Dl.3)2 com especificidade de ligação para lisozima foi utilizado como controlo negativo.

Figura 6: Direccionamento de fragmentos de anticorpo marcados por fluorescência para o teratocarcinoma murino F9 utilizando scFv(CGS-2) maturado por afinidade e o scFv(28SI) de baixa afinidade dirigido contra o mesmo epítopo de B-FN. O direccionamento é detectado tanto em tumores grandes (aprox. 0,6 gramas), cobertos às 48 h por uma crosta negra que obscurece parcialmente a imagem e em tumores pequenos (aprox. 0,2 gramas).

Lista de exemplos

Exemplo 1 - Isolamento de scFv humanos específicos para o domínio ED-B de FN humana.

Exemplo 2 - Maturação por afinidade de scFv humanos específicos para o domínio ED-B de FN humana.

Exemplo 3 - Especificidade de scFv maturados por afinidade para fibronectinas contendo ed-b.

Exemplo 4 - Utilização de scFv anti-ED-B maturados por afinidade em coloração imunocitoquímica de secções de tumor humano e de ratinho. 23 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ

Exemplo 5 - Utilização de scFv anti-ED-B maturados por afinidade em localização de alvos de tumores humanos in vivo.

Exemplo 6 - Direccionamento para teratocarcinomas F9 murinos xenoenxertados em ratinhos nus.

Exemplo 1 - Isolamento de scFv humanos específicos para o domínio ED-B de FN humana

Utilizou-se uma biblioteca de scFv humanos em fagos (Nissim et al.f 1994) para a selecção de anticorpos recombinantes. Utilizaram-se duas formas diferentes da isoforma ED-B como uma fonte de antigénio para selecção e em ambos os casos a isoforma foi proteína recombinante humana.

Expressaram-se péptidos FN recombinantes contendo as repetições do tipo III 2-11 (B-) e 2-11 (B+) em Esherichia coli.

Preparou-se uma construção utilizando ADNc de FN a partir dos clones pFHl54 (Kornblihtt et al. 1985), XF10 e ÀF2 (Carnemolla et al., 1989). Inseriram-se as construções de ADNc, abrangendo as bases 2229-4787, (Kornblihtt et al., 1985) no vector pQE-3/5 utilizando o kit QIAexpress de Qiagen (Chatsworth, Califórnia). Purificaram-se FN-III 2-11 (B-) e (B+) recombinantes por cromatografia de imunoafinidade utilizando o mAb 3E3 (Pierschbacher et al. 1981) conjugado a Sepharose 4B (Pharmacia). Produziram-se fragmentos de ADN para a preparação dos fragmentos FN recombinantes contendo as repetições de homologia de tipo III 7B89, 789, ED-B e FN-6 por amplificação por reacção de polimerização em cadeia (PCR) utilizando ADN polimerase UltMa (PerkinElmer), utilizando ADNc de clones FN 2-11 (B+) e FN 2-11 (B-) como moldes.

Conceberam-se os iniciadores para permitir clonagem dos produtos de PCR para pQE-12 utilizando o kit QIAexpress (Qiagen). Foram subsequentemente transformados para E. coli e expressos. Todos os clones de ADNc foram sequenciados utilizando um kit de sequenciação de ADN Sequenase 2.0 (USB).

As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de Ni-NTA (IMAC), de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen), utilizando a cauda de hexa-histidina no terminal carboxilo dos fragmentos FN. A proteína de fusão 24 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ ED-H-pGal foi preparada por clonagem do ADNc de ED-B para o vector de bacteriófago Agtll, para obter clone ÀED-B. O clone ÀchFN60 (contendo parte da sequência ED-B) foi derivado como uma proteína de fusão de pchFN60 de fn de galinha clonado (Norton et al., 1987).

Para a selecção da biblioteca de fagos de scFv humanos, efectuaram-se três ciclos de selecção para cada um dos dois diferentes antigénios recombinantes (7B89 e ED-B). Os antigénios foram ambos utilizados para revestir imunotubos (Nunc; Maxisorp, Roskilde, Dinamarca) durante a noite a 50 μρ/πιΐ em PBS (tampão fosfato 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,2). O primeiro antigénio foi o fragmento FN recombinante 7B89, no qual o domínio ED-B está flanqueado pelas repetições de homologia FN de tipo III adjacentes; este foi utilizado para revestir durante a noite a 4°C. O segundo antigénio utilizado foi ED-B recombinante (Zardi et al., 1987) com uma cauda de hexa-histidina no terminal carboxilo; esta proteína não contém resíduos lisina, de modo que o grupo do terminal amino do primeiro aminoácido está disponível para imobilização covalente específica de local de ED-B para placas de ELISA reactivas (Nunc; Covalink). O revestimento foi efectuado durante a noite à temperatura ambiente.

Após três ciclos de selecção, os fagos eluídos foram infectados para células de E. coli HB2151 e plaqueados tal como descrito (Nissim et al., 1994). Após cada ciclo de selecção, rastrearam-se 95 colónias isoladas resistentes a ampicilina para identificar scFv específicos de antigénio por ELISA. Os clones que apresentaram os sinais de ELISA maiores nos antigénios utilizados para selecção foram seleccionados para análise adicional e para maturação por afinidade. Também se demonstrou que estes clones apresentaram coloração específica de secções de glioblastoma multiforme e tumores de mama por coloração imunocitoquímica, descrita mais detalhadamente no exemplo 4.

Exemplo 2 - Maturação por afinidade de scFv humanos específicos para o domínio ED-B de FN humana.

Seleccionaram-se clones 35GE (de selecção com 7B89) e 28SI (de selecção com o domínio ED-B sozinho) com anticorpos candidatos para maturação por afinidade. De modo a 25 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ diversificar as cadeias leves como meio para melhorar a afinidade, exploramos então uma estratégia de afinidade simples com base em randomização dos seis residuos centrais (DSSGNH) da CDR3 da cadeia leve utilizando oligonucleótidos degenerados e PCR (figura 1), proporcionando uma diversidade de sequência potencial de 20' = 6,4 x 107. Esta região (conjuntamente com a CDR3 de cadeia pesada) localiza-se no centro do local de ligação ao antigénio (Padlan, 1994) . Também mutamos o resíduo de arginina imediatamente precedente à porção de seis resíduos para serina, de modo a evitar a possibilidade dos efeitos electrostáticos dominarem a selecção. O plasmídeo de uma única colónia bacteriana que expressa o fragmento scFv "parental" foi amplificado por PCR com os iniciadores LMB3 (5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3') e CDR3-6-VL-

FOR (5' CTT GGT CCC TCC GCC GAA TAC CAC MNN MNN MNN MNN MNN

MNN AGA GGA GTT ACA GTA ATA GTC AGC CTC 3') (94°C [l']-55°C

[l']-72°C [1*30"], 25 ciclos; veja-se Marks et al., 1991, para tampões e condições) O produto resultante foi purificado em gel (de modo a remover resíduos do plasmídeo contendo o gene de scFv original) e utilizado como molde para uma segunda etapa de amplificação com os iniciadores LMB3 e Jl-Not-FOR (5' ATT GCT TTT CCT TTT TGC GGC CGC GCC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC TCC GCC 3') (94°C [ 1’]-55 °C [l']-72°C [l'30n], 25 ciclos). O produto de PCR impuro, que correu como uma única banda com o peso molecular correcto em gel de agarose, foi purificado directamente da mistura de PCR utilizando Spin-Bind (FMC, Rockland, Mayne, EUA), digerido duplamente com Ncol/Notl e ligado em fagemídeo pHENl (Hoogenboom et al., 1991) digerido com Ncol/Notl e purificado em gel contendo uma inserção Ncol/Notl falsa para facilitar a separação de vector digerido duplamente de vector digerido uma vez. O vector foi preparado com um kit maxiprep de plasmídeo Qiagen (Chatsworth, Califórnia, EUA). Utilizaram-se aproximadamente 5 μρ de plasmídeo digerido e de inserção na mistura de ligação, que foi extraída uma vez com fenol, uma vez com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:25:1), seguidamente precipitado com etanol utilizando glicogénio (Boehringer, Mannheim, Alemanha) como um transportador e liofilizado em Speed-Vac. Ressuspendeu-se o sedimento em 20 μΐ de água e electroporou-se para células de E. coli TGl electrocompetentes 26 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ (Gibson, 1984) . Utilizamos tipicamente células electrocompetentes com um titulo de 109 transformantes/^g para soluções-mãe em glicerol ou IO10 transformantes^g para células electrocompetentes preparadas recentemente. Tal originou tipicamente >107 clones com o procedimento aqui descrito. A biblioteca de maturação foi então processada tal como para a biblioteca Nissim (Nissim et al., 1994) para produzir partículas de fago, que foram utilizadas para um ciclo de selecção em imunotubos utilizando 7B89 (10 μρ/πιΐ) como antigénio, seguido por um ciclo de selecção cinética (Hawkins et al., 1992). Esta etapa de selecção foi efectuada por incubação de 7B89 biotinilado (10 nM) com a suspensão de fago (aproximadamente 1012 t.u.) em leite-PBS a 2% (MPBS a 2%) do primeiro ciclo de selecção durante 5 minutos, seguido por adição de 7B89 não biotinilado (1 μΜ) e deixando a competição prosseguir durante 30 minutos. Adicionou-se então 100 μΐ de Dynabeads revestidas de estreptavidina (Dynal: M480) pré-bloqueadas em MPBS a 2% à mistura reaccional, misturou-se durante 2 minutos e seguidamente capturaram-se num magnete e lavaram-se 10 vezes com lavagens alternadas de (PBS + Tween-20 a 0,1%) e PBS. Eluíram-se os fagos das pérolas com 0,5 ml de trietilamina 100 mM. Esta solução foi então neutralizada com 0,25 ml de Tris 1 M, pH 7,4 e utilizada para infectar células HB2151 em crescimento exponencial (Nissim et al., 1994). Utilizaram-se 95 colónias simples resistentes a ampicilina para produzir sobrenadantes contendo scFv (Nissim et al., 1994) que foram rastreados por ELISA, imuno-histoquímica e BIAcore para identificar os melhores ligantes. Foram então subclonados entre locais Sfil/Notl do vector de expressão pDN268 (Neri et al., 1996), que tem um marcador fosforilável como apêndice, o epítopo FLAG e uma cauda de hexa-histidina na extremidade do terminal C do scFv.

Cultivaram-se colónias simples dos anticorpos relevantes subclonados em pDN268 a 37°C em 2xTY contendo ampicilina a 100 mg/1 e glucose a 0,1%. Quando a cultura celular atingiu D.O.600 = 0,8, adicionou-se IPTG para uma concentração final de 1 mM e continuou-se a cultura durante 16-20 h a 30°C. Após centrifugação (rotor GS-3 Sorvall, 7000 rpm, 30 minutos), filtrou-se o sobrenadante, concentrou-se e permutou-se com 27 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ tampão de carga (fosfato 50 mM, pH 7,4 NaCl 500 mM, imidazole 20 mM) utilizando um aparelho de fluxo tangencial Minisette (Filtron). A solução resultante foi carregada para 1 ml de resina Ni-NTA (Qiagen), lavada com 50 ml de tampão de carga e eluida com tampão de eluição (fosfato 50 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazole 100 mM) . O anticorpo purificado foi analisado por SDS-PAGE (Laemmli, 1970) e dialisado contra PBS a 4°C. Processaram-se adicionalmente as preparações de scFv purificado por filtração em gel utilizando um aparelho de fplc equipado com uma coluna S-75 (Pharmacia), dado que se sabe que os fragmentos scFv multivalentes podem exibir artificialmente boa ligação em BlAcore (Jonsson et al., 1991) devido a efeitos de avidez (Nissim et al., 1994; Crothers e Metzger, 1972). A concentração de anticorpo de fracções monoméricas purificadas por FPLC foi determinada espectrofotometricamente assumindo uma absorvância a 280 nm de 1,4 unidades para uma solução de scFv 1 mg/ml. A ligação de scFv monovalente a várias concentrações na gama de 0,1-1 μΜ em PBS foi medida num instrumento BlAcore (Pharmacia Biosensor), utilizando os seguintes antigénios: (i) 1000 Unidades de Ressonância (RU) de fragmento de FN 7B89 recombinante biotinilado imobilizado num chip revestido com estreptavidina, que se liga especificamente a 250 RU de scFv; (ii) 200 RU de ED-B recombinante, imobilizado quimicamente no grupo amino do terminal N, que foi ligado especificamente por 600 RU de scFv; (iii) 3500 RU de fibronectina WI38VA rica em ED-B (veja-se exemplo 3), que se ligou especificamente a 150 RU de scFv. Efectuou-se análise cinética dos dados de acordo com as instruções do fabricante. Com base em análise qualitativa de BlAcore de sobrenadantes contendo anticorpo, seleccionou-se uma versão maturada por afinidade de cada clone de scFv: clone CGS-1 da selecção com o fragmento 78B9 e CGS-2 de selecção com fragmento ED-B de FN recombinante. As constantes de velocidade de associação (kM) e constantes de velocidade de dissociação (kQff) apresentam-se na tabela 1, conjuntamente com as constantes de dissociação de equilíbrio calculadas (Kd) de ambos os scFv e do clone original 28SI. Embora ambos os clones CGS-1 e CGS-2 apresentem Kd na gama de nanomolar, o clone CGS-2 apresentou a maior melhoria relativamente ao seu clone parental, apresentando um Kd de 1 nM (melhorado de 110 nM) relativamente a todas as três 28 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ proteínas ensaiadas no chip sensor (tabela 1). A melhoria foi principalmente devida a uma constante de dissociação cinética mais lenta (~10-4 s”1), tal como medida com preparações de anticorpo monomérico (não apresentado). A estratégia de maturação parece ser geral e proporcionou anticorpos com afinidade melhorada contra proteína de ligação de maltose, citocromo C, o domínio extracelular de endoglina murina (D.N., L. Wyder, R. Klemenz), citomegalovírus (A.P., G. Neri, R. Botti, P.N.), a proteína HMGI-C marcadora de tumor nuclear (A.P., P. Soldani, V. Giancotti, P.N.) e fosfatase alcalina de placenta marcadora de tumor de ovário (M. Deonarain e A.A. Epenetos). A estratégia parece assim ser pelo menos tão eficaz como outras estratégias de maturação (Marks et al., 1992; Low et al., 1996) e proporciona anticorpos com afinidades semelhantes aos derivados de bibliotecas de anticorpos de fagos muito grandes (Griffiths et al., 1994; Vaughan et al., 1996).

Os clones maturados por afinidade CGS-1 e CGS-2 foram sequenciados e alinhados com uma base de dados de genes de anticorpo V de linha germinal humana (V-BASE) seguidamente traduzida utilizando o utilitário de computador MacVector. O gene VH de ambos os clones foi mais homólogo a DP47 de linha germinal humana (VH3) e além disso cada clone apresentava uma sequência CDR3 de VH diferente (figura 1). O gene VL de ambos os clones foi a linha germinal DPL16 utilizada na construção do repertório de scFv sintético humano descrito em Nissim et al., 1994. As sequências CDR3 de VL diferiram uma da outra em quatro de seis dos resíduos randomizados (figura lb). 29 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ TABELA 1

Constantes cinéticas e de dissociação de fragmentos scFv monoméricos CGS-1 e CGS-2 relativamente a proteínas contendo o domínio ED-B

Antigénio: ED-B 7B89 FN

W138VA

ScFv: CGS-1 S128 CGS-2 CGS-1 S128 CGS-2 CGS-1 S128 CGS-2 Wís'1)* 7, OxlO"3 2, 7xl0"2 l,5xl0“4 3,9xl0'3 3,0xl0'2 2,3xl0“4 5,0xl0'3 7,lxl(T2 6,5xl0“4 kon (M_1s_1) * 1,3xl05 2, 5xl05 l,3xl05’ 1, lxlO5 2,9xl05 Ι,ΙχΙΟ5 4,lxl05 l,2xl06 2,9xl05 Κι (M) * 5, 4xl0~8 1, lxlCT7 1, lxlO-9 3, 5xlCT8 1, OxlO-7 2, lxlCT9 1,2xl0-8 5,9xl0-8 2,4xl0“9

Legenda da tabela 1

As experiências foram efectuadas tal como descrito na secção de Materiais e Métodos. * Os valores de koff e kon têm uma precisão de +/- 30%, com base na precisão de determinações de concentração e em relação aos resultados ligeiramente diferentes obtidos quando se utilizam regiões diferentes dos sensogramas no procedimento de ajuste. Kd = koff/kon.

Exemplo 3 - Especificidade de scFv maturados por afinidade para fibronectinas contendo ED-B A imunorreactividade dos dois scFv maturados por afinidade, CGS-1 e CGS-2, foi avaliada inicialmente por ELISA e comparada directamente à de mAb BC-1 (que reconhece a isoforma B-FN) e mAb IST-β, que apenas reconhece isoformas de FN que não apresentam ED-B (Carnemolla et al., 1989; 1992). A caracterização destes mAb foi previamente relatada (Carnemolla et al., 1989; 1992). Posteriormente efectuou-se uma análise de especificidade fina utilizando um painel extenso de fragmentos FN derivados por tratamento com termolisina e de proteínas de fusão recombinantes.

Os antigénios utilizados para ELISA e imunotransferência foram preparados da seguinte forma. FN foi purificada de plasma humano e de meio condicionado da linha celular WI38VA13 tal como relatado previamente (Zardi et al., 1987). Digeriram-se FN purificadas com termolisina (protease tipo X; Sigma Chemical Co.) tal como relatado por Carnemolla et al. (1989). Purificaram-se os fragmentos de FN de 110kD (B-) nativo e de FN de 120 kD (B+) nativo (veja-se figura 2) a partir de um produto de digestão de FN tal como previamente relatado (Borsi et al., 1991). A isoforma grande de tenascina-C foi purificada tal como relatado por Saginati et 30 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ al. (1992). As proteínas recombinantes foram expressas e purificadas tal como descrito no exemplo 1. Efectuou-se SDS-PAGE e hibridação de Western tal como descrito por Carnemolla et al. (1989) .

Todos os antigénios utilizados em ELISA foram diluídos em PBS para a gama 50-100 μg/ml e utilizados para revestir poços de Immuno-Plate (Nunc, Roskilde, Dinamarca) a 4°C durante a noite. Removeu-se o antigénio não ligado com PBS e bloquearam-se depois as placas com PBS contendo albumina de soro bovino (BSA) a 3% (p/v) durante 2 h a 37°C. Tal foi seguido por quatro lavagens com PBS contendo Tween 20 a 0,05% (PBST). Deixaram-se então os anticorpos ligar a 37°C durante 1,5 h; pré-incubaram-se os scFv com um anti-soro dirigido contra a sequência de marcação: mAb M2 [Kodak, New Haven, Connecticut] para o marcador FLAG ou 9E10 [ATCC, Rockville, Maryland] para o marcador myc. Os anticorpos de controlo ensaiados foram mAb BC-1 e IST-6. Após quatro lavagens com PBST, incubaram-se as placas durante lha 37°C com igG de cabra anti-ratinho biotinilado (Bio-SPA Division, Milão, Itália) diluído a 1:2000 (em PBST+BSA a 3%). Repetiram-se as lavagens e adicionou-se complexo estreptavidina-fosfatase alcalina biotinilada (Bio-SPA Division, Milão, Itália) (diluída a 1: 800 em PBST contende i MgC12 2 mM) durante lha 37°C. Desenvolveu-se a reacção utilizando comprimidos de substrato de fosfatase (Sigma) em dietanolamina a 10%, pH 9,8 e leu-se a densidade óptica a 405 nm. Os resultados apresentam-se adiante na tabela 2. Tabela 2 CGS-1 CGS-2 BC-1 IST-6 FN Plasmática 0, 07 0, 04 0, 09 1, 73 FN WI38VA 1, 16 0, 72 1,20 1, 12 nllO kD (B-) 0, 03 0, 01 0, 05 1, 20 nl20 kD (B+) 0, 82 0, 81 1,20 0, 02 FN7B89 rec 1, 11 1, 02 1, 02 0, 01 FN789 rec 0, 01 0, 01 0, 05 1, 25 ED-B rec 1,21 1, 32 0, 15 0, 04 FN-6 rec 0, 01 0, 01 0, 08 0, 03 Tenascina 0, 01 0, 02 0, 06 0, 02 31 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ

Imunorreactividade de scFv e anticorpos monoclonais com antigénios derivados de fibronectina medida por elisa. Os valores representam a D.O. medida a 405 nm após subtracção do sinal de base. Os dados são a média de quatro experiências apresentando um máximo de 10% de desvio padrão. A identidade das diferentes formas de fibronectina utilizadas na experiência é a seguinte: FN plasmática = fibronectina plasmática humana; FN WI38-VA = fibronectina de sobrenadantes de fibroblastos transformados com SV40 (Zardi et al., 1987); nllOkD = domínio 4 de FN tratada com termolisina, sem ED-B; nl20kD = domínio 4 de FN tratada com termolisina contendo ED-B; FN7B89 rec = domínio ED-B flanqueado por repetições de homologia FN de tipo III adjacentes; FN789 rec = repetições de homologia FN de tipo III com um domínio ED-B; ED-B rec = ED-B recombinante sozinho; FN6 rec = domínio 6 de FN recombinante.

Tanto CGS-1, como CGS-2 reconheceram o péptido ED-B recombinante, bem como todos os fragmentos FN nativos ou recombinantes contendo a sequência ED-B, ao passo que não ligaram quaisquer fragmentos FN sem ED-B. Além disso, CGS-1 e CGS-2 não reagiram com tenascina (que inclui quinze repetições de homologia do tipo III: Siri et al., 1991) e FN plasmática, que não contém níveis detectáveis da sequência ED-B em produtos de digestão com termolisina (Zardi et al., 1987). Contrariamente, CGS-1 e CGS-2 reagiram fortemente com FN purificada da linha celular WI38VA transformada com SV40. Cerca de 70-90% das moléculas FN desta linha celular contêm ED-B, tal como demonstrado pelas experiências de digestão com termolisina e SI nuclease utilizando FN purificada e ARN total preparado a partir da linha celular (Zardi et al., 1987; Borsi et al., 1992). A especificidade dos scFv para a componente ED-B de FN foi demonstrada ainda adicionalmente por utilização de ED-B solúvel recombinante para inibir ligação de CGS-1 e/ou CGS-2 a FN em células WI38VA (dados não apresentados).

Os dados confirmam que CGS-1 e CGS-2 apenas reagem especificamente com derivados de FN que contêm o domínio ED-B. Ambos apresentam a mesma reactividade que o mAb BC-1, excepto 32 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ no caso de ED-B recombinante, que não era reconhecido por BC-1. A intensidade dos sinais de ELISA obtidos relativamente aos mAb de controlo reflecte a elevada especificidade dos dois scFv para antigénios contendo ED-B. A especificidade de CGS-1 e CGS-2 foi investigada adicionalmente em imunotransferências utilizando FN plasmática e células WI38VA e seus produtos de digestão com termolisina. Por digestão com termolisina, FN de células WI38VA (a maioria das quais contém ED-B) gera um fragmento de 120 kD (contendo ED-B) e um fragmento menor de 110 kD sem ED-B (figura 2A; Zardi et al., 1987). A digestão adicional do domínio de 120 kD gera dois fragmentos: um fragmento de 85 kD que contém praticamente a sequência ED-B completa no seu terminal carboxilo e uma sequência de 35 kD (figura 2A; Zardi et al., 1987) .

No lado esquerdo da figura 2B apresenta-se um gel corado com Coomassie de fracções de proteína analisadas por imunotransferência. FN plasmática (pista 1) e produtos de digestão da proteína com termolisina (pista 3, contendo a proteína de 110 kD, e pista 4, contendo o produto de digestão da proteína de 110 kD) não foram reconhecidos por CGS-1 e CGS-2. Contrariamente, a FN rica em ED-B de células WI38VA, tanto intacta (pista 2), como após aumentar a digestão com termolisina (pistas 5, 6 e 7) foi reconhecida por ambos os fragmentos scFv. O fragmento derivado de FN mais pequeno que pode ser reconhecido especificamente por CGS-1 foi a proteína de 120 kD (abrangendo as repetições do tipo III 2-11 inclusive), enquanto que CGS-2 foi capaz de reconhecer o fragmento de 85 kD abrangendo as repetições 2-7 além do terminal N de ED-B (figura 2B; Zardi et al., 1987). Estes resultados indicam que os dois scFv são reactivos com epítopos diferentes dentro da sequência ED-B. A ligação de CGS-2 ao domínio de 85 kD indica que o epítopo para este clone se localiza no terminal amino de ED-B. Contrariamente, a perda de ligação de CGS-1 quando o domínio de 120 kD é digerido para 85 kD demonstra que reconhece um epítopo localizado mais perto do terminal carboxilo da molécula ED-B. A especificidade fina de CGS-1 e CGS-2 foi investigada adicionalmente por imunotransferência utilizando fragmentos de 33 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ FN recombinantes e proteínas de fusão com e sem a sequência ED-B. As proteínas de fusão FN foram preparadas tal como descrito por Carnemolla et al. (1989). Os resultados destas experiências apresentam-se na figura 3; Para a associação do diagrama esquemático à estrutura dos domínios de FN humana, veja-se Carnemolla et al., 1992. Os perfis de ligação obtidos confirmaram essencialmente o que se tinha verificado previamente por ELISA e imunotransferências em FN purificada e produtos de clivagem proteolítica: CGS-1 e CGS-2 foram fortemente reactivos com fragmentos de FN contendo ED-B (pistas 2 e 4) mas não apresentaram qualquer reactividade com sequências de FN sem ED-B (pistas 1 e 3). CGS-1 não reagiu com proteína de fusão ED-B humana (pista 5) ou de galinha (pista 6), enquanto que CGS-2 reagiu fortemente com ambos os fragmentos (figura 3) . Este resultado pode reflectir determinadas restrições conformacionais do epítopo em FN contendo ED-B reconhecidas por CGS-1; é possível, por exemplo, que o epítopo seja sensível a desnaturação que não se apresente correctamente quando fraccionada por SDS-page e transferida para um suporte sólido, tal como nitrocelulose.

Considerados conjuntamente, estes resultados demonstram que CGS-1 e CGS-2 se ligam forte e especif icamente a FN contendo ED-B, em regiões distintas uma da outra e distintas da estrutura ED-B que é reconhecida pelo mAb BC-1.

Exemplo 4 - A utilização de scFv anti-ED-B maturados por afinidade em coloração imunocitoquímica de tumores humanos e de ratinho CGS-1 e CGS-2 foram ambos utilizados para imunolocalizar moléculas de FN contendo ED-B em vários tecidos humanos normais e neoplásicos. Para tecido normal, seleccionou-se pele, dado que se sabe que a isoforma B de FN é expressa em macrófagos e fibroblastos durante a cicatrização de ferimentos cutâneos (Carnemolla et al., 1989; Brown et al., 1993). Os dois tumores humanos seleccionados foram previamente analisados para especificidade de coloração com mAB anti-fibronectina: glioblastoma multiforme foi estudado detalhadamente porque as células endoteliais nos vasos deste tumor estão num estado altamente proliferativo com processos angiogenéticos aumentados incluindo a expressão de isoformas 34 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ B-FN (Castellani et al., 1994). Além disso, estudos utilizando um painel diverso de tecidos de mama humanos normais, hiperplásicos e neoplásicos proporcionaram evidência adicional de uma correlação entre angiogénese e expressão de B-FN (Kaczmarek et al., 1994).

Para as experiências aqui descritas, a coloração imuno-histoquímica de CGS-1 e CGS-2 foi comparada com a de mAb BC-1 (que reconhece a isoforma B-FN) e outros mAb que se sabe que reagem com todas as variantes de isoformas de FN (IST-4) ou apenas as isoformas de FN sem ED-B (IST-6). A caracterização de todos estes anticorpos de controlo foi previamente relatada (Carnemolla et al., 1989; 1992).

Os tecidos normais e neoplásicos foram obtidos de amostras retiradas durante cirurgia. Foi já estabelecido que a preparação e fixação de tecidos é critica para detecção exacta e sensivel de moléculas contendo FN (Castellani et al., 1994). Para imuno-histoquimica, secaram-se ao ar secções criostáticas de 5 μιη de espessura e fixaram-se em acetona fria durante dez minutos. Efectuou-se imunocoloração utilizando um kit de coloração de complexo estreptavidina-biotina fosfatase alcalina (Bio-SPA Division, Milão, Itália) e naftol-AS-MX-fosfato e Fast Red tr (Sigma). Utilizou-se hematoxilina de Gill como contra-coloração, seguido por montagem em Glicergel (Dako, Carpenteria, Califórnia) tal como relatado previamente por Castellani et al., 1994. De modo a analisar a especificidade adicionalmente em experiências em que se obteve coloração de tecidos positiva, demonstrou-se especificidade para ED-B por pré-incubação de anticorpos com o domínio ED-B recombinante, seguido por detecção tal como descrito previamente.

Os resultados globais destas experiências mostram que tanto CGS-1 como CGS-2 reagiram com as mesmas estruturas histológicas que mAb BC-1. O padrão de coloração obtido com pele utilizando CGS-1, CGS-2 e BC-1 reflecte a ausência de ED-B da FN expressa na derme. Na coloração de secções de carcinoma ductal invasivo, CGS-1, CGS-2 e BC-1 apresentaram uma distribuição restrita de coloração, confinada à fronteira entre as células neoplásicas e o estroma. Tal é consistente com o facto de, embora a FN total esteja distribuída 35 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ homogeneamente ao longo do estroma do tumor, a expressão de B-FN está confinada a determinadas regiões e são estas áreas que foram previamente localizadas com sucesso (em 95% dos casos) em carcinoma ductal invasivo utilizando mAb BC-1 (Kaczmarek et al., 1994).

As revelações prévias na coloração de BC-1 de tumor de glioblastoma multiforme foram confirmadas. Castellani et al. (1994) verificaram um padrão tipico de coloração de estruturas vasculares do tipo glomerular e, nas nossas experiências, CGS-1 e CGS-2 demonstraram que dão resultados qualitativamente idênticos.

Existe porém uma diferença importante entre CGS-1 e CGS-2 e o mAb BC-1: demonstrou-se que os dois scFv humanos se ligam tanto a B-FN de galinha como de ratinho, enquanto que BC-1 é estritamente especifico para a forma humana. CGS-2 reagiu com embriões de galinha (dados não apresentados) e tanto CGS-1 como CGS-2 reagiram com tumores de ratinho.

Também se demonstrou a coloração de CGS-1 de estruturas vasculares em secções do teratocarcinoma F9 murino. Contrariamente, todos os tecidos normais de ratinho ensaiados (fígado, baço, rim, estômago, intestino delgado, intestino grosso, ovário, útero, bexiga, pâncreas, glândulas supra-renais, músculo-esquelético, coração, pulmão, tiróide e cérebro) apresentaram uma reacção de coloração negativa com CGS-1 e CGS-2 (dados não apresentados) Demonstrou-se que as estruturas coradas nas secções de teratocarcinoma F9 são específicas para ED-B por utilização do domínio ED-B recombinante para inibir completamente a coloração obtida (dados não apresentados).

Exemplo 5 - A utilização de scFv anti-ED-B maturados por afinidade em localização de alvos de tumores humanos in vivo A linha celular de melanoma humano SKMEL-28 foi utilizada para desenvolver tumores xenoenxertados em ratinhos nus de 6-10 semanas de idade (Balb-c ou MF-1; Harlan, RU), por injecção de 1 x 107 células/ratinho subcutaneamente num flanco. Os ratinhos com tumores foram injectados na veia da cauda com 36 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ 100 μΐ de solução de scFvi-Cy7i a 1 mg/ml em pbs quando os tumores atingiram um diâmetro de aproximadamente 1 cm.

Conseguiu-se marcação de anticorpos recombinantes com CY7 por adição de 100 μΐ de bicarbonato de sódio 1 M, pH=9,3 e 200 μΐ de CY7-bis-OSu (Amersham; n.° de catálogo PA17000; 2 mg/ml em DMSO) a 1 ml de solução de anticorpo em PBS (1 mg/ml). Após 30 minutos à temperatura ambiente, adicionou-se 100 μΐ de Tris 1 M, pH=7,4, à mistura e separou-se o anticorpo marcado do corante que não reagiu utilizando colunas PD10 descartáveis (Pharmacia Biotech, Piscataway, Nova Jérsia, EUA) equilibradas com PBS. As fracções de anticorpo verde eluídas foram concentradas a aproximadamente 1 mg/ml utilizando tubos Centricon-10 (Amicon, Beverly, Massachusets, EUA). A razão de marcação conseguida foi em geral cerca de uma molécula de CY7: uma molécula de anticorpo. Tal foi estimada espectroscopicamente com cuvetes de 1 cm, assumindo que uma solução de anticorpo a 1 mg/ml proporciona uma absorção de 1,4 unidades a 280 nm, que o coeficiente de extinção molar de CY7 a 747 nm é 200 000 (M_1cm_1) e desprezando a absorção de CY7 a 280 nm. A imunorreactividade de amostras de anticorpo após marcação foi confirmada por desvio de banda (Neri et al., 1996b), por cromatografia de afinidade numa coluna de antigénio ou por análise de BIAcore. Obtiveram-se imagens dos ratinhos com um aparelho de obtenção de imagem de ratinhos construído localmente a intervalos de tempo regulares, sob anestesia por inalação de uma mistura de oxigénio/fluorotano. Foram estudados dois a oito animais para cada amostra, de modo a avaliar a reprodutibilidade dos resultados. Os procedimentos foram efectuados de acordo com a licença do Projecto RU "Tumour Targeting" emitida a D. Neri (UK PPL 80/1056). O aparelho de obtenção de imagem de infravermelhos de ratinhos foi construído como uma modificação do sistema de fotodetecção de Folli et al. (1994), que permite a utilização do fluoróforo de infravermelho CY7. A iluminação de infravermelho foi seleccionada de modo a obter melhor penetração de tecidos. A fluorescência de CY7 ( >760 nm) é invisível a humanos e necessita da utilização de uma câmara de CCD controlada por computador. O aparelho de obtenção de imagem de ratinhos consistiu de uma caixa pintada de preto e 37 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ estanque à luz, equipada com uma lâmpada de tungsténio halogéneo de 100 W, com um filtro de excitação com um diâmetro de 50 mm especificamente concebido para CY7 (Chroma

Corporation, Brattleboro, Vermont, EUA; 6 73-748 nm) . O feixe de iluminação resultante é, a uma boa aproximação, homogéneo numa área de 5 x 10 cm de tamanho, na qual o rato é colocado para obtenção de imagem. A fluorescência foi detectada numa câmara CCD Pulnix monocromática de 8 bit, equipada com uma lente montada em C e um filtro de emissão de 50 mm (Chroma Corporation, Brattleboro, Vermont, EUA; 765-855 nm) e com uma interface para o sistema ImageDOK (Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, RU). Este sistema consiste num computador, equipado com um sensor de imagens e utilitário para a captura e integração de imagens sequenciais. Utilizaram-se tipicamente três imagens sequenciais adquiridas em 50 ms cada no processo de obtenção de média; este número manteve-se constante para a série de imagens de um animal, para permitir uma comparação directa de localização do alvo de tumor em diferentes pontos no tempo. Converteram-se então as imagens em formato TIFF para ficheiros PICT utilizando o utilitário Graphics Converter e elaboraram-se utilizando o programa MacDraw Pro com um computador Power Macintosh 7100/66.

Na figura 4 apresenta-se uma representação esquemática do desenho deste aparelho.

Estas experiências demonstraram que ambos os scFv localizaram o tumor quando visualizado a um nível macroscópico. A demonstração microscópica da localização do alvo de neovasculatura de tumores em desenvolvimento com os dois scFv anti-EDB foi detalhada da seguinte forma.

Injectaram-se ratinhos nus e/ou ratinhos SCID com um melanoma humano SKMEL-28 xenoenxertado ou um teratocarcinoma F9 de ratinho num flanco, com fragmentos scFv não marcados com o marcador FLAG ou com fragmentos scFv biotinilados.

Sacrificaram-se os ratinhos em diferentes pontos de tempo após injecção, obtiveram-se secções de tumor e não tumor, que 38 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ foram então coradas com protocolos de imunocitoquímica convencional, utilizando o anticorpo M2 anti-FLAG (Kodak, 181) ou reagentes de detecção baseados em estreptavidina. Obteve-se localização de alvo óptima às 12 horas após a injecção. Demonstrou-se que CGS1 e CGS2 se ligam à neovasculatura de tumor humano xenoenxertado e a teratocarcinoma murino.

Exemplo 6 - Localização de alvos de teratocarcinomas F9 murinos xenoenxertados em ratinhos nus.

Desenvolvemos tumores sólidos no flanco de ratinhos nus por injecção subcutânea de 4 x 106 células de teratocarcinoma F9 murino. Este tumor cresce muito rapidamente em ratinhos, atingindo 1 cm de diâmetro em aproximadamente uma semana após a injecção e é altamente vascularizado. Para obter imagens da localização com anticorpos, utilizamos uma modificação da metodologia de fotodetecção de Folli et al. (1994), que permite uma avaliação cinética da detecção de alvos de tumor e de depuração de anticorpo em imagens do mesmo animal em vários pontos temporais, tal como descrito detalhadamente acima (veja-se figura 4).

Para localizar alvos de tumor e para facilitar a detecção dos anticorpos, ligaram-se scFv(CGS-l), scFv(CGS-2) e o scFv(Dl.3) anti-lisozima (McCafferty et al., 1990) a um marcador de homodimerização (Pack et al., 1993) por subclonagem dos anticorpos nos locais Sfil/Notl do vector de expressão pGIN50. Este vector é um derivado de pDN268 (Neri et al., 1996b), no qual a sequência His6 do marcador é substituída pela sequência: GGC LTD TLQ AFT DQL EDE KSA LQT EIA HLL KEK EKL EFI LAA H, que contém um resíduo de cisteína e uma hélice anfipática da proteína Fos para a homodimerização covalente dos fragmentos de anticorpo (Abate et al. 1990). Não se conseguiu dimerização covalente completa: aproximadamente 30-50% dos fragmentos de anticorpo consistiram de dímeros ligados covalentemente.

Nova

Os fragmentos de anticorpo foram purificados por cromatografia de afinidade em colunas obtidas por acoplamento de lisozima de ovo de galinha (Dl.3) ou 7B89 (anticorpos anti-ED-B; Carnemolla et al., 1996) a Sepharose activada com CNBr (Pharmacia Biotech, Piscataway, Nova Jérsia, EUA) . 39 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ

Carregaram-se os sobrenadantes em suportes de afinidade, que foram então lavados com PBS, com PBS + NaCl 0,5 M e eluidos com Et3N 100 mM. Dialisaram-se então os anticorpos contra PBS.

Marcaram-se os anticorpos tal como descrito acima e foram injectados na veia da cauda de ratinhos com tumores com 100 μΐ de solução de scFvi-Cy7i a 1 mg/ml em PBS, quando os tumores atingiram um diâmetro de aproximadamente 1 cm.

Tal como apresentado na figura 5, scFv(CGS-l) localizou-se no tumor até três dias, embora ocorresse também depuração rápida do tumor durante este periodo. Contudo ocorreu também alguma coloração do fémur. O desempenho de localização de alvo de CGS-1 para o tumor melhorou drasticamente por introdução de uma hélice anfipática contendo um resíduo de cisteina no terminal C para promover dimerização do anticorpo (Pack et ai., 1993). De facto, a localização do scFv(CGS-2)2 dimérico não pareceu diminuir significativamente das 24 para as 72 horas. Contrariamente, um controlo negativo (o anticorpo dimérico scFv(D1.3)2, anticorpo anti-lisozima) apresentou uma depuração rápida e não foi detectável localização no tumor ou no fémur. e

ScFv(28Sl) apresentou localização De alvo de tumor fraca às 6 horas (não apresentado) mas não foi detectável nenhuma às 24 horas ou mais tarde (figura 6) . A maturação por afinidade levou a uma localização de alvo muito melhorada; assim scFv(CGS-2) localizou eficazmente como alvos tumores F9 pequenos e grandes, quer como monómero (figura 6) ou dímero (não apresentado). Após dois dias, verificou-se que a percentagem de dose injectada de anticorpo por grama de tumor era de cerca de 2 para o monómero scFv(CGS-2) e 3-4 para o dimero scFv(CGS-2). A dose entregue ao tumor por scFv(CGS-2) foi também superior do que para scFv(CGS-1) (figuras 5 e 6) e correlaciona-se com as suas respectivas afinidades (tabela 1). Contudo, tanto scFv(28SI), como scFv(CGS2) parecem ter tendência para clivagem proteolitica e demonstram uma alta absorção pelo figado (figura 6), enquanto que os anticorpos scFv(CGS-1) foram significativamente mais estáveis apresentam menor absorção pelo figado (figura 5). 40 ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ

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Lisboa

Claims (26)

1. ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados que são específicos de, e se liga directamente a, o dominio oncofetal ED-B de fibronectina (FN), possuindo uma constante de dissociação (Kd) para ED-B de FN inferior a 6xlCT1 2 M, quando medida como monómero purificado.
2. 2. Anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados de acordo com a reivindicação 1, que incluem um dominio de ligação ao antigénio de um anticorpo, de origem humana.
3. 3. Anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados de acordo com a reivindicação 1, que se ligam a todas as FN contendo ED-B após tratamento da FN com a protease termolisina.
4. 4. Anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados de acordo com a reivindicação 1, que se ligam a B-FN sem tratamento de B-FN com N-glicanase.
5. 5. Anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados de acordo com a reivindicação 1, possuindo uma região de cadeia pesada variável (VH) da sequência derivada da linha germinal humana DP47, codão 1 Glu - codão 98 Arg, inclusive, na figura 1 e a sequência CDR3 Ser Leu Pro Lys.
6. 6. Anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados de acordo com a reivindicação 1, possuindo uma região de cadeia pesada variável (VH) da sequência derivada da linha germinal humana DP47, codão 1 Glu - codão 98 Arg, inclusive, na figura 1 e a sequência CDR3 Gly Vai Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu. 1 Anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados de acordo com a reivindicação 1, possuindo uma região de cadeia 2 leve variável (V2) da sequência derivada da linha germinal humana DPL16, codão 1 Ser - codão 90 Ser, inclusive, na figura 1 e o restante da sequência CDR3 como Pro Vai Vai Leu Asn Gly Vai Vai.
7. ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ 2/4
8. 8. Anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados de acordo com a reivindicação 1, possuindo uma região de cadeia leve variável (VL) da sequência derivada da linha germinal humana DPL16, codão 1 Ser - codão 90 Ser, inclusive, na figura 1 e o restante da sequência CDR3 como Pro Phe Glu His Asn Leu Vai Vai.
9. 9. Anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que os referidos anticorpo ou fragmento de anticorpo incluem uma molécula de scFv.
10. 10. Anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que os referidos anticorpo ou fragmento de anticorpo incluem uma molécula de scFv dimérica.
11. 11. Fragmento de anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-8.
12. 12. Composição farmacêutica incluindo um anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 numa quantidade eficaz, conjuntamente com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
13. 13. Ácido nucleico que codifica um anticorpo ou um fragmento de anticorpo isolados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
14. 14. Fago que codifica um anticorpo ou um fragmento de anticorpo isolados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
15. 15. Célula hospedeira transformada ou transfectada in vitro com um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13.
16. 16. Anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 para utilização em terapia. ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ 3/4
17. 17. Utilização de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo isolados, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, no fabrico de um medicamento para localizar alvos em tumores.
18. 18. Utilização de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo isolados, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, no fabrico de um agente para obtenção de imagem de tumores.
19. 19. Processo para a produção de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo isolados, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, processo esse que inclui expressão de um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13 numa célula hospedeira in vitro para produzir o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo.
20. 20. Processo para a produção de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo isolados, de acordo com a reivindicação 1, processo esse que inclui: a) rastreio de uma biblioteca de fragmentos de anticorpo expressa em fagos com um fragmento de fibronectina recombinante contendo o domínio ED-B derivado da proteína fibronectina, em que os fragmentos de anticorpo são moléculas de scFv; b) infecção de células hospedeiras bacterianas com clones positivos; c) submeter os clones de fagos positivos a um processo de maturação por afinidade; d) repetição das etapas a) e b) para seleccionar clones de fagos positivos com afinidade melhorada para com o antigénio; e) infecção de células hospedeiras com clones positivos e purificação das moléculas de anticorpo a partir das referidas células hospedeiras.
21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que as referidas moléculas de scFv incluem um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo, de origem humana. ΕΡ Ο 906 426/ΡΤ 4/4
22. 22. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que a etapa a) inclui rastreio com antigénios recombinantes 7B89 ou ED-B.
23. 23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, em que o ácido nucleico de um clone positivo é utilizado na produção, por expressão numa células hospedeira in vitro, de um produto anticorpo ou fragmento de anticorpo codificado pelo ácido nucleico, produto anticorpo ou fragmento de anticorpo esse que inclui um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo que é específico para, e que se liga directamente a, o domínio oncofetal ED-B de fibronectina (FN) .
24. 24. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que o produto anticorpo está sob a forma de um anticorpo completo.
25. 25. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que o produto fragmento de anticorpo está sob a forma de uma molécula de scFv.
26. 26. Kit de diagnóstico incluindo um anticorpo ou fragmento de anticorpo isolados, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e um ou mais reagentes que permitem a determinação da ligação do referido membro a células. Lisboa,