ES2287976T3 - Recuperacion de proteinas mediante cromatografia seguida de filtracion sobre una capa cargada. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la recuperación de un polipéptido, que comprende: (a) exponer una composición que comprende un polipéptido a un reactivo que se une a, o que modifica, el polipéptido, en el que el reactivo se encuentra inmovilizado sobre una fase sólida; y después (b) pasar la composición por un filtro con una carga que es contraria a la carga del reactivo en la composición, de manera que se elimina el reactivo lixiviado de la composición.

Description

Recuperación de proteínas mediante cromatografía seguida de filtración sobre una capa cargada.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a la recuperación de proteínas. En particular, se refiere a la recuperación de un polipéptido, en la que el polipéptido se expone a un reactivo inmovilizado que se une o que modifica el polipéptido.

Descripción de la técnica relacionada

La purificación económica a gran escala de proteínas crecientemente es un problema importante para la industria de la biotecnología. Generalmente, las proteínas se producen mediante cultivo celular, utilizando líneas de células de mamífero o bacterianas manipuladas para producir la proteína de interés mediante la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Debido a que las líneas celulares utilizadas son organismos vivos, deben alimentarse con un medio de cultivo complejo que contiene azúcares, aminoácidos y factores de crecimiento, habitualmente suministrados a partir de preparaciones de suero animal. La separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos alimentada a las células y de los productos secundarios de las células mismas hasta una pureza suficiente para la utilización como terapéutico en el ser humano plantea un reto formidable (ver la patente WO nº 93/11162 y patente EP nº 127 737 A1).

Los procedimientos para la purificación de proteínas a partir de residuos celulares inicialmente dependen del sitio de expresión de la proteína. Algunas proteínas puede causarse que se segreguen directamente de la célula hacia el medio de crecimiento circundante; otras se sintetizan intracelularmente. Para estas últimas proteínas, la primera etapa de un procedimiento de purificación implica la lisis de la célula, que puede realizarse mediante una diversidad de procedimientos, incluyendo la rotura mecánica, el choque osmótico o tratamientos enzimáticos. Esta rotura libera el contenido completo de la célula hacia el homogenado, y además produce fragmentos subcelulares que resultan difíciles de separar debido a su reducido tamaño. Estos generalmente se separan mediante centrifugación diferencial o mediante filtración. El mismo problema surge, aunque a escala más pequeña, con proteínas segregadas directamente debido a la muerte natural de las células y la liberación de proteínas intracelulares de la célula huésped durante el curso de la operación de producción de proteínas.

Tras obtenerse una solución clarificada que contiene la proteína de interés, su separación de otras proteínas producidas por la célula habitualmente se intenta utilizando una combinación de diferentes técnicas de cromatografía. Estas técnicas separan mezclas de proteínas a partir de su carga, grado de hidrofobicidad o tamaño. Se encuentran disponibles varias resinas de cromatografía diferentes para cada una de estas técnicas, permitiendo la adaptación exacta del esquema de purificación a la proteína particular. La esencia de cada uno de estos procedimientos de separación es que puede causarse que las proteínas se desplacen a velocidades diferentes a lo largo de una columna larga, consiguiendo una separación física que se incrementa a medida que siguen bajando la columna o se adhieren selectivamente al medio de separación, eluyéndose diferencialmente en este caso por solventes diferentes. En algunos casos, la proteína deseada se separa de las impurezas cuando éstas se adhieren específicamente a la columna, mientras que la proteína de interés no, es decir, la proteína de interés se encuentra presente en el "eluido".

Como parte del procedimiento general de recuperación de la proteína, la proteína puede exponerse a un reactivo inmovilizado que se une o que modifica la proteína. Por ejemplo, la proteína puede someterse a cromatografía de afinidad, en la que un reactivo inmovilizado se une específicamente a la proteína, tal como un anticuerpo, captura el anticuerpo y las impurezas pasan por la columna de cromatografía de afinidad. La proteína puede eluirse posteriormente de la columna modificando las condiciones de manera que la proteína ya no se una al reactivo inmovilizado. El reactivo inmovilizado también puede ser un enzima que modifica la proteína. Sahni et al., Anal. Biochem. 193:178-185, 1991, y Voyksner et al., Anal. Biochem. 188:72-81, 1990, describe proteasas inmovilizadas.

Otro tipo de procedimiento de purificación es la filtración. La filtración de contaminantes de tamaño de partícula pequeño separándolos de líquidos se han conseguido utilizando diversos medios de filtro poroso por los que se pasa una composición contaminada de manera que el filtro retiene el contaminante. La retención del contaminante puede producirse mediante filtración mecánica o captura electrocinética de partículas y adsorción. En la filtración mecánica, se retiene una partícula al quedar atrapada físicamente cuando intenta pasar por un poro de tamaño inferior a su propio tamaño. En el caso de los mecanismos electrocinéticos de captura, la partícula colisiona con una superficie dentro del filtro poroso y resulta retenida sobre la superficie por fuerzas atractivas de rango corto. Para conseguir la captura electrocinética, pueden utilizarse sistemas de modificación de carga para alterar las características de carga superficial de un filtro (ver, por ejemplo, la patente WO nº 90/11814). Por ejemplo, en el caso de que el contaminante que debe separarse es aniónico, puede utilizarse un modificador de carga catiónico para alterar las características de carga del filtro de manera que se retenga el contaminante por el filtro.

Existe una necesidad en la técnica de procedimientos mejorados para recuperar polipéptidos, especialmente aquellos polipéptidos producidos mediante técnicas recombinantes.

Descripción resumida de la invención

Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para recuperar un polipéptido, que comprende: (a) exponer una composición que comprende un polipéptido a un reactivo que se une o que modifica el polipéptido, en el que el reactivo se inmoviliza sobre una fase sólida, y después (b) pasar la composición por un filtro que porta una carga que es contraria a la carga del reactivo en la composición, de manera que se separa el reactivo lixiviado de la composición. Preferentemente, las características de carga del polipéptido en la composición en la etapa (b) permiten que el polipéptido pase por el filtro y preferentemente el filtro se sitúa en línea con la composición expuesta al reactivo tal como en la etapa (a). En una realización de la invención, el polipéptido que debe tratarse en la etapa (a) es un polipéptido precursor y el reactivo inmovilizado es una proteasa (por ejemplo pepsina) que elimina un dominio precursor (por ejemplo un dominio de dimerización de cremallera de leucinas) del polipéptido.

La invención también proporciona un procedimiento para recuperar un polipéptido que comprende separar un reactivo lixiviado de una composición que comprende el polipéptido y el reactivo lixiviado pasando la composición por un filtro que porta una carga opuesta a la del reactivo lixiviado, en el que el reactivo lixiviado se había inmovilizado previamente sobre una fase sólida.

En todavía una realización más, la invención proporciona un procedimiento para modificar un precursor de anticuerpo que comprende un dominio de dimerización de cremallera de leucina, que comprende exponer el precursor de anticuerpo a una proteasa inmovilizada sobre una fase sólida de manera que la proteasa separa la cremallera de leucina del precursor de anticuerpo. Este procedimiento opcionalmente comprende además pasar el anticuerpo libre de la cremallera de leucina por un filtro cargado positivamente situado en línea con anticuerpo que ha sido expuesto a la proteasa inmovilizada.

El procedimiento de purificación de anti-CD18 es un ejemplo de un procedimiento en el que se requiere un reactivo inmovilizado para separar un dominio de dimerización de cremallera de leucina del precursor anticuerpo anti-CD18. El precursor de anticuerpo se purifica inicialmente utilizando cromatografía de intercambio de cationes ABX antes de separar el dominio de cremallera de leucina mediante digestión con pepsina. La cantidad de pepsina necesaria para separar por completo la cremallera de leucina del precursor de anticuerpo es considerable. Resulta necesario una proporción de 1 mg de pepsina por cada 20 mg de anticuerpo para llevar a cabo la digestión a lo largo de un periodo de tiempo razonable. Un tratamiento como éste dejará una gran cantidad de pepsina que deberá separarse en las etapas restantes del procedimiento de purificación de anti-CD18 (figura 7). Se descubrió que la separación rápida de la pepsina resultaba beneficiosa, debido a que la exposición excesiva a la pepsina resultaba en la digestión excesiva del anticuerpo anti-CD18, con pérdidas significativas de producto intacto. Con el fin de controlar con eficacia la cantidad de pepsina añadida al precursor de anticuerpo anti-CD18, y para eliminar eficazmente cualquiera traza de pepsina que pudiese persistir durante el procedimiento de purificación, se introdujeron dos procedimientos en el procedimiento de purificación de anticuerpo anti-CD18. En primera lugar, para reducir considerablemente la cantidad de pepsina añadida al pool de precursor de anticuerpo purificado en ABX, se inmovilizó la pepsina en una fase sólida (es decir, acoplado a perlas de vidrio de poro controlado (CPG) y empaquetadas en el interior de una columna). A continuación, se llevó a cabo la reacción de digestión haciendo fluir el pool de precursor de anticuerpo por la columna de pepsina-CPG este procedimiento limitó la cantidad de pepsina añadida al pool de precursor de anticuerpo. Sin embargo, se identificó el problema adicional de que la pepsina lixiviaba de la fase sólida. Se descubrió que resultaba suficiente que lixiviase de la fase sólida una cantidad reducida de pepsina para causar la digestión excesiva del anticuerpo anti-CD18, resultando en una reducción de los rendimientos de producto. Para superar este problema de lixiviado de pepsina de la fase sólida, se situó un filtro cargado positivamente en línea con el efluente procedente de la columna de pepsina-CPG. Se descubrió que el filtro separaba la totalidad de la pepsina que lixiviaba de la fase sólida, previniendo de esta manera la digestión excesiva del precursor de anticuerpo. La pepsina es una proteína ácida con pI reducido. Por lo tanto, a pH 4, el pH de la etapa de digestión, la pepsina siguió encontrándose cargada negativamente y unida fuertemente al filtro cargado positivamente. Se descubrió que resultaba ventajosa la utilización de un filtro cargado en lugar de una resina para separar los lixiviables, debido a que los filtros son compactos y capaces de caudales muy elevados con presión de retorno mínima. Puede introducirse un filtro en línea sin necesidad de llevar a cabo una etapa de recuperación separada, reduciendo por lo tanto la complejidad y la duración del
procedimiento.

Se contempla la utilización de filtros cargados negativa y positivamente para resolver problemas asociados con el lixiviado de reactivos previamente inmovilizados en otros procedimientos de recuperación.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B ilustran la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (figura 1A, SEC ID nº 1) y de la cadena ligera (figura 1B; SEC ID nº 2) de CD18 rhuMAb. La secuencia en cursiva en la figura 1A (SEC ID nº 3) es de la cremallera de leucina.

Las figuras 2A y 2B ilustran anticuerpo intacto (Ab) y una diversidad de fragmentos de anticuerpo (F(ab')_{2}, Fab', cadena ligera y Fd'). Se ilustran las cadenas pesadas en blanco y las cadenas ligeras con trama. Los dos enlaces disulfuro que se forman entre dos cadenas pesadas se muestran como -ss-. La figura 2B muestra el corte con pepsina del precursor de CD18 RhuMAb, rindiendo CD18 rhuMAb que se encuentra libre de cremallera de leucinas.

La figura 3 ilustra la estructura del plásmido pS1130 utilizado para producir CD18 rhuMAb del ejemplo proporcionado posteriormente.

Las figuras 4A y 4B ilustran la secuencia completa del casete de expresión de pS1130 (SEC ID nº 5).

La figura 5 muestra la derivación de la línea celular de producción de 49A5.

La figura 6 es un esquema del procedimiento de fermentación para CD18 RhuMAb.

La figura 7 es un diagrama de flujo que ilustra las etapas de purificación de CD18 RhuMAb.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes Definiciones

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "polipéptido" se refiere de manera general a péptidos y proteínas que presentan más de aproximadamente diez aminoácidos. Preferentemente, el polipéptido es una proteína de mamífero, entre los ejemplos del cual se incluyen renina, una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovina; factor liberador de hormona del crecimiento, hormona paratiroidea, hormona estimulante del tiroides, lipoproteínas, antitripsina alfa 1, cadena A de la insulina, cadena B de la insulina, proinsulina, hormona folículo-estimulante, calcitonina, hormona luteinizante, glucagón, factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willebrands, factores anticoagulación, tales como proteína C, factor natriurético atrial, surfactante pulmonar, activador del plasminógeno, tales como uroquinasa u orina humana o activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA), bombesina, trombina, factor de crecimiento hematopoyético, factor alfa y beta de necrosis tumoral, encefalinasa, RANTES (células T reguladas y normales, expresadas y secretadas), proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa), una albúmina sérica, tal como albúmina sérica humana, sustancia inhibidora mulleriana, cadena A de la relaxina, cadena B de la relaxina, prorrelaxina, péptido asociado a gonadotropina de ratón, una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa, ADNasa, IgE, antígeno asociado a linfocito T citotóxico (CTLA), tal como CTLA-4, inhibina, activina, un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptores de hormonas o de factores de crecimiento, proteína A o D, factores reumatoides, factor neurotrófico, tal como factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5 ó 6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-\beta, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento fibroblástico, tal como aFGF y BFGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TGF-\beta4 o TGF-\beta5, factor I y II de crecimiento similar a la insulina (IGF-I e IGF-II), des(1,3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión a factor de crecimiento similar a insulina (IGFBPs), proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20, eritropoyetina, factores osteoinductores, inmunotoxinas, una proteína morfogenética ósea (BMP), un interferón, tal como interferón-alfa, beta y gamma, factores estimulantes de colonias (CSFs), por ejemplo M-CSF, GM-CSF y G-CSF, interleuquinas (ILs), por ejemplo IL-1 a IL-10, superóxido dismutasa, receptores de células T, proteínas membranales de superficie, factor acelerador de la degradación, antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una parte de la cubierta del virus del SIDA, proteínas de transporte, receptores de localización, adresinas, proteínas reguladoras, integrinas, tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM, antígeno asociado a tumores, tal como receptores HER2, HER3 o HER4 y fragmentos y/o variantes de cualquiera de los polipéptidos anteriormente indicados.

Una "variante" o "variante de secuencia de aminoácidos" de un polipéptido de partida es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos diferente de la del polipéptido de partida. Generalmente, una variante posee una identidad de secuencia de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%, y todavía más preferentemente de por lo menos 98%, con el polipéptido nativo. El porcentaje de identidad de secuencia lo determina, por ejemplo, Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1382-1386, 1983, versión del algoritmo descrito por Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970, tras alinear las secuencias para proporcionar la máxima homología. Se preparan variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido introduciendo cambios apropiados de nucleótidos en el ADN que codifica el polipéptido, o mediante síntesis de péptidos. Entre estas variantes se incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos en el interior de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de interés. Se lleva a cabo cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar al constructo final, con la condición de que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos post-traduccionales del polipéptido, tales como cambios del número o posición de los sitios de glucosilación. Los procedimientos para generar variantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos se describen en la patente US nº 5.534.615.

En realizaciones preferentes de la invención, el polipéptido es un polipéptido recombinante. Un "polipéptido recombinante" es uno que ha sido producido en una célula huésped que ha sido transformada o transfectada con ácido nucleico codificante del polipéptido, o produce el polipéptido como resultado de recombinación homóloga. Los términos "transformación" y "transfección" se utilizan intercambiablemente para referirse al procedimiento de introducción de ácido nucleico en una célula. Tras la transformación o transfección, el ácido nucleico puede integrarse en el genoma de la célula huésped, o puede existir en forma de elemento extracromosómico. La expresión "célula huésped" incluye una célula en cultivo celular in vitro, así como una célula en un animal huésped. Los procedimientos para la producción recombinante de polipéptidos se describe en la patente US nº 5.534.615.

Un "polipéptido precursor" en la presente invención es un polipéptido que se encuentra fusionado con uno o más dominios precursores, por ejemplo en el caso en que el dominio precursor es parte de una cadena polipeptídica del polipéptido o se encuentra unido covalentemente al polipéptido mediante una molécula de enlace químico. El "dominio percusor" puede ser un residuo aminoácido o un polipéptido. Por ejemplo, el dominio percusor puede ser un dominio de dimerización, tal como una cremallera de leucina, una secuencia de aminoácidos, tal como ácido poliglutámico, que porta una carga negativa, y otra secuencia de aminoácidos, tal como polilisina, que porta una carga positiva, o un empaquetamiento de hélices peptídicas que comprende una hélice, un giro y otra hélice; un epítopo de reconocimiento útil, por ejemplo, en la purificación del polipéptido de interés, un residuo aminoácido o péptido en el extremo amino o carboxi-terminal del polipéptido que se desea eliminar para generar una preparación homogénea de polipéptido, una metionina N-terminal, un artefacto de producción del polipéptido en cultivo celular recombinante, un dominio pre, pro o prepro de un polipéptido maduro (por ejemplo el dominio pro de la protrombina, en el que el dominio pro genera la molécula de trombina madura biológicamente activa), un polipéptido polilisina, un enzima, tal como glutatión transferasa, o la región Fc de un anticuerpo intacto que se elimina para generar un F(ab')_{2}.

Un polipéptido "epítopo de reconocimiento" presenta suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que puede prepararse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto para que no interfiera con la actividad del polipéptido al que se encuentra fusionado. El epítopo de reconocimiento preferentemente es suficientemente única para que el anticuerpo de la misma no presenta reacción cruzada sustancial con otros epítopos. Los polipéptidos epítopo de reconocimiento adecuados generalmente presentan por lo menos 6 residuos aminoácido y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos aminoácidos (preferentemente entre aproximadamente 9 y 30 residuos). Entre los ejemplos se incluyen el polipéptido de reconocimiento HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell Biol. 8:2159-2165, 1988), la etiqueta c-myc y los anticuerpos contra la misma 8F8, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan et al., Mol. Cell Biol. 5(12):3610-3616, 1985) y la etiqueta de glucoproteína D (gD) del virus herpes simplex y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553, 1990).

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específicamente cubre los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada.

El anticuerpo de la presente invención se dirige contra un "antígeno" de interés. Preferentemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece una enfermedad o trastorno puede resultar en un beneficio terapéutico en dicho mamífero. Sin embargo, los anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipéptidos (tales como antígenos glucolípidos asociados a tumor, ver la patente US nº 5.091.178) también se encuentran contemplados. En el caso de que el antígeno sea un polipéptido, puede ser una molécula transmembranal (por ejemplo receptor) o ligando, tal como un factor de crecimiento. Entre los antígenos ejemplares se incluyen aquellos polipéptidos comentados anteriormente. Entre las dianas moleculares preferentes para los anticuerpos abarcados por la presente invención se incluyen los polipéptidos CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 y CD34, elementos de la familia de receptores ErbB, tales como los receptores EGF, HER2, HER3 o HER4, moléculas de adhesión celulares, tales como LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina \alphav/\beta3, incluyendo las subunidades \alpha o \beta de la misma (por ejemplo los anticuerpos anti-GD11a, anti-CD18 o anti-CD11b), factores de crecimiento, tales como VEGF, IgE, antígenos de grupo sanguíneo, receptor flk2/flt3, receptor de obesidad (OB), receptor mpI, CTLA-4, polipéptido C, etc. Pueden utilizarse antígenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados otras moléculas, como inmunógenos para generar anticuerpos. Para moléculas transmembranales, tales como receptores, pueden utilizarse fragmentos de estos como inmunógenos (por ejemplo el dominio extracelular de un receptor). Alternativamente, pueden utilizarse células que expresan la molécula transmembranal como el inmunógeno. Estas células pueden derivarse de una fuente natural (por ejemplo líneas de células cancerosas) o pueden ser células que han sido transformadas mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembranal.

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de aparición natural que pueden encontrarse presentes en cantidades reducidas. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones convencionales (policlonales) de anticuerpos, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica que el anticuerpo se ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.816.567). En una realización adicional, pueden aislarse "anticuerpos monoclonales" a partir de bibliotecas fágicas de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990. Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991, y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fágicas. Algunos artículos posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango de nM) mediante el intercambio de cadenas (Marks et al., Biol. Technology 10:779-783, 1992), así como mediante la infección combinatorial y la recombinación in vivo como estrategia para la construcción de bibliotecas fágicas de gran tamaño (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21:2265-2266, 1993). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. Alternativamente, ahora resulta posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras inmunizarlos, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica de la región de unión (J_{H}) de la cadena pesada de anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal resulta en la inhibición total de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la matriz génica humana de inmunoglobulina de línea germinal en estos ratones mutantes de línea germinal resulta en la producción de anticuerpos humanos tras el reto antigénico. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551, 1993; Jakobovits et al., Nature 362:255-258, 1993; Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33, 1993, y Duchosal et al., Nature 355:258, 1992.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en las que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada (patente US nº 4.816.567, y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).

La expresión "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende residuos aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, los residuos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) y 89 a 97 (L3)) en el dominio variable de la cadena ligera y 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) y 95 a 102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, los residuos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) y 91 a 96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) y 96 a 101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Los residuos "de marco" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se definen en la presente invención. Los residuos CDR y FR del anticuerpo H52 del ejemplo posterior se identifican en Eigenbrot et al., Polypeptides: Structure, Function and Genetics 18:49-62, 1994.

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Mayoritariamente los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que se sustituyen residuos de una región hipervariable del receptor por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que presenta la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se sustituyen residuos de la región marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan con el fin de afinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos un, y típicamente dos, dominios variables, en los que la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las regiones FR son aquéllas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprende por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmuoglobulina humana.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que deben utilizarse en la preparación de los anticuerpos humanizados resulta muy importante para reducir la antigenicidad. Según el procedimiento denominado "de ajuste óptimo", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba contra la biblioteca completa de las secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana más cerca a la del roedor seguidamente se acepta como la secuencia marco (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296, 1993; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901, 1987). Otro procedimientos hace uso de un marco particular derivado de una secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede utilizarse el mismo marco para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151:2623, 1993).

Además, resulta importante que los anticuerpos se humanicen conservando una afinidad elevada para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para alcanzar este objetivo, según un procedimiento preferente, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y de diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de la secuencias parentales y humanizadas. Se encuentran disponibles modelos tridimensionales de inmunoglobulinas y resultan familiares para los expertos en la materia. Se encuentran disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias candidatas seleccionadas de inmunoglobulina. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de inmunoglobulina, es decir, el análisis de los residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse con las secuencias del receptor e importadas, de manera que se consiga la característica deseada del anticuerpo, tal como la afinidad incrementada para el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de la CDR influyen más directa y sustancialmente sobre la unión de antígeno.

En una realización preferente de la invención, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que preferentemente es humano o humanizado (ver el comentario anterior sobre anticuerpos humanizados).

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una parte de una anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión a antígeno o región variable del mismo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de una cadena, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-11, 1992, y Brennan et al., Science 229:81, 1985). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden ser producidos directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, pueden aislarse fragmentos de anticuerpo de las bibliotecas fágicas de anticuerpos comentadas anteriormente. Alternativamente, pueden recuperarse directamente fragmentos Fab'-SH de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167, 1992). En otra realización, tal como se describe en el Ejemplo posteriormente, el F(ab')_{2} se forma utilizando la cremallera de leucinas GCN4 para inducir el ensamblaje de la molécula F(ab')_{2}. De acuerdo con otro enfoque, pueden aislarse directamente fragmentos F(ab')_{2} a partir de un cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo resultarán evidentes para el experto en la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de una sola cadena (scFv). Ver la patente WO nº 93/16185.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una sola cadena" o "sFv" comprende los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, en los que estos dominios se encuentran presentes en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un polipéptido de enlace entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que sFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de sFv ver Pluckthun, en. The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, editores, Springer-Verlag, New York, páginas 269-315, 1994.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprende un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H} - V_{L}). Mediante la utilización de una molécula de enlace excesivamente corta para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza que los dominios se apareen con los dominios complementarios de otra cadena, creando dos sitios de unión a antígeno. Se describen los diacuerpos más en detalle en, por ejemplo, la patente EP nº 404.097, la patente WO nº 93/11161, y en Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993.

La expresión "anticuerpos lineales" tal como se utiliza en toda la presente solicitud se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Polipeptide Eng. 8(10):1057-1062, 1995. En breve, estos anticuerpos comprende un par de segmentos Fd en tándem (V_{H}-CH1-V_{H}-CH1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Los "anticuerpos multiespecíficos" presentan especificidades de unión para por lo menos dos epítopos diferentes, en los que los epítopos habitualmente proceden de antígenos diferentes. Aunque estas moléculas normalmente sólo se unirán a dos antígenos (es decir, son anticuerpos biespecíficos, BsAbs), los anticuerpos con especificidades adicionales, tales como los anticuerpos triespecíficos, se encuentran comprendidos en esta expresión tal como se utiliza en la presente invención. Entre los ejemplos de BsAbs se incluyen aquellos con un brazo dirigido contra un antígeno de célula tumoral y el otro brazo dirigido contra una molécula desencadenante citotóxica, tal como anti-Fc\gammaRI/anti-CD15, anti-p185^{HER2}/Fc\gammaRIII (CD16), anti-CD3/anti-células B malignas (1D10), anti-CD3/anti-p185^{HER2}, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de células renales, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-carcinoma de colon), anti-CD3/anti-análogo de hormona estimulante de melanocitos, receptor anti-EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-molécula de adhesión a células neurales (NCAM)/anti-CD3, anti-proteína de unión a folato (FBP)/anti-CD3, anti-antígeno asociado a pancarcinoma (AMOC-31)/anti-CD3:BsAbs con un brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral, y un brazo que se une a una toxina, tal como anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadena A de ricina, anti-interferón-\alpha(IFN-\alpha)/anti-idiotipo de hibridoma, anti-CEA/anti-alcaloide vinca, BsAbs para convertir profármacos activados por enzima, tales como anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina (que cataliza la conversión del profármaco fosfato de mitomicina en alcohol de mitomicina); BsAbs que pueden utilizarse como agentes fibrinolíticos, tales como anti-fibrina/anti-activador del plasminógeno tisular (tPA), anti-fibrina/anti-activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA); BsAbs que dirigen complejos inmunológicos a receptores de superficie celular, tales como anti-lipoproteína de baja densidad (LDL)/anti-receptor Fc (por ejemplo Fc\gammaRI, Fc\gammaRII o Fc\gammaRIII); BsAbs para la utilización en la terapia de enfermedades infecciosas, tales como anti-CD3/anti-virus del herpes simplex (HSV), anti-complejo receptor de células T:CD3/anti-influenza, anti-FcyR/anti-HIV; BsAbs para la detección de tumores in vitro o in vivo, tales como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-p185^{HER2}/anti-hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacunas, y BsAbs como herramientas diagnósticas, tales como IgG anti-conejo/anti-ferritina, anti-peroxidasa de rábano picante (HRP)/anti-hormona, anti-somatostina/anti-sustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-\beta-galactosidasa. Entre los ejemplos de anticuerpos triespecíficos se incluyen anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-C08/anti-CD37. Pueden prepararse anticuerpos biespeíficos en forma de anticuerpos de longitud completa o de fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos F(ab')_{2}
biespecíficos).

Son conocidos de la técnica procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas presentan diferentes especificidades (Milstein et al., Nature 305:537-539, 1983). Debido a la combinación aleatoria de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de los que únicamente una presenta la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que habitualmente se lleva a cabo mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante dificultosa, y los rendimientos de producto, reducidos. Se dan a conocer procedimientos similares en la patente WO nº 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991.

De acuerdo con un enfoque diferente, se fusionan dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de unión anticuerpo-antígeno) a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, comprendiendo por lo menos parte de las regiones CH2 y CH3 de bisagra. Resulta preferente que la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, se encuentre presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión diferentes, y se cotransfeccionan en un organismo huésped adecuado. Ello permite una mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones cuando proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, resulta posible insertar las secuencias codificantes para dos, o para la totalidad, de las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales resulta en rendimientos elevados o cuando las proporciones no presentan ninguna significación particular.

En una realización preferente de dicho enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, debido a que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en únicamente una mitad de la molécula biespecífica permite un modo sencillo de separación. Este enfoque se da a conocer en la patente WO nº 94/04690. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986.

De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente WO nº 96/27011, puede construirse la interfaz entre una pareja de moléculas de anticuerpo para que maximice el porcentaje de heterodímeros que se recuperan a partir del cultivo celular recombinante. La interfaz preferente comprende por lo menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, se sustituyen una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo por cadenas laterales más grandes (por ejemplo de tirosina o de triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar al de la cadena o cadenas laterales grandes en el interfaz de la segunda molécula de anticuerpo sustituyendo las cadenas laterales de aminoácidos grandes por cadenas de menor tamaño (por ejemplo alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero respecto a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Entre los anticuerpos biespecíficos se incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Se han propuesto estos anticuerpos, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmunológico a células no deseadas (patente US nº 4.676.980), y para el tratamiento de infección por VIH (patente WO nº 91/00360, patente WO nº 92/20373 y patente EP nº 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse utilizando cualquier procedimiento conveniente de reticulación. Los agentes reticulantes adecuados son bien conocidos de la técnica, y se dan a conocer en la patente US nº 4.676.980, junto con varias técnicas de reticulación.

También se han descrito en la literatura técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos utilizando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81, 1985, describen un procedimiento en el que se cortan proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente acomplejante ditiol arsenito sódico para estabilizar los ditioles circundantes y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados seguidamente se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB después se reconvierte en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización específica de enzimas.

Algunos avances recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225, 1992, describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')_{2} completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se segregó separadamente de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico.

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También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir de un cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553, 1992). Los péptidos de cremallera de leucina procedentes de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los anticuerpos homodímeros se redujeron en la región bisagra para forman monómeros y después se reoxidaron para formar los anticuerpos heterodímeros. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de anticuerpos homodímeros. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un línker que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, se fuerza el apareamiento de los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante la utilización de dímeros Fv de una cadena (sFv) (ver Gruber et al., J. Immunol. 152:5368, 1994).

Se encuentran contemplados anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos (Tutt et al., J. Immunol. 147:60, 1991).

La expresión "recuperar un polipéptido" se refiere a obtener una preparación de polipéptido a partir de una "preparación previa a la recuperación" mediante la purificación de la preparación previa a la recuperación (ver posteriormente) o mediante la modificación de un polipéptido precursor para generar una forma del polipéptido que se encuentre libre del dominio precursor.

La "purificación" de una composición que comprende un polipéptido y uno o más contaminantes se refiere a incrementar el grado de pureza del polipéptido en la composición eliminando (completa o parcialmente) por lo menos un contaminante de la composición. Una "etapa de purificación" puede formar parte de un procedimiento global de purificación, resultando en una composición "esencialmente pura", que se utiliza en la presente invención para referirse a una composición que comprende por lo menos aproximadamente 90% en peso del polipéptido de interés, basado en el peso total de la composición, preferentemente por lo menos aproximadamente 95% en peso. La expresión "esencialmente homogéneo" en la presente invención se refiere a una composición que comprende por lo menos aproximadamente 99% en peso del polipéptido de interés, basado en el peso total de la composición.

El "reactivo" de interés en la presente invención es un composición o composición (preferentemente un polipéptido) que es capaz de unirse y/o de modificar un polipéptido de interés. Un reactivo "lixiviado" es un reactivo que se ha desprendido de la fase sólida. El reactivo puede unirse, por ejemplo, al polipéptido, tal como los "reactivos de captura" utilizados en los procedimientos de purificación por afinidad. Entre los ejemplos de estos "reactivos de captura" se incluyen la proteína A o la proteína G para capturar polipéptidos tales como anticuerpos e inmunoadhesinas; anticuerpos que pueden utilizarse para la purificación por afinidad de polipéptidos; un dominio de unión a ligando de un receptor para capturar un ligando del mismo; un dominio de unión a receptor para capturar un receptor o una proteína de unión fragmento del mismo (por ejemplo IGFBPs tales como IGFBP-3 y las proteínas de unión a hormona de crecimiento (GHBPs)) e inmunoadhesinas. Alternativamente, o además, el reactivo puede modificar el polipéptido de interés. Por ejemplo, el reactivo puede alterar química o físicamente el polipéptido. La expresión "alteración química" se refiere a la modificación del polipéptido mediante, por ejemplo, formación o rotura de enlaces, resultando en una nueva entidad química. La expresión "alteración física" se refiere a cambios en la estructura de orden superior del polipéptido. Los enzimas son ejemplos de reactivos que pueden modificar química y/o físicamente el polipéptido. El enzima preferente es un enzima que puede hidrolizar un polipéptido. Entre los ejemplos de proteasa se incluyen pepsina, catepsina, tripsina, papaína, elastasa, carboxipeptidasas, aminopeptidasas, subtilisina, quimotripsina, termolisina, proteasa V8, prolinasa y otras endopeptidasas o exopeptidasas.

La expresión "fase sólida" se refiere a una matriz no acuosa a la que puede adherirse un reactivo. La fase sólida puede ser una columna de purificación, una fase discontinua de partículas discretas, o una membrana o filtro. Entre los ejemplos de materiales para formar la fase sólida se incluyen polisacáridos (tales como agarosa y celulosa), y otras matrices mecánicamente estables, tales como sílice (por ejemplo vidrio de poro controlado), poli(estirenodivinil)benceno, poliacrilamida, partículas cerámicas y derivados de cualesquiera de los anteriormente indicados. En realizaciones preferentes, la fase sólida comprende perlas de vidrio de poro controlado retenidas en una columna. En determinadas realizaciones, la fase sólida se recubre con un reactivo (tal como glicerol) destinado a prevenir la adherencia no específica de contaminantes a la fase sólida.

El reactivo comentado anteriormente puede "inmovilizarse" sobre o en la fase sólida formando un enlace covalente entre un grupo funcional del reactivo y un grupo reactivo sobre la superficie de la fase sólida. En otras realizaciones, el reactivo se "inmoviliza" en la fase sólida mediante adsorción y enlace iónico o puede atraparse en la fase sólida, por ejemplo dentro de células o polímeros de tipo reticulado o microcápsulas (ver Holenberg y Roberts, en: Enzymes as Drugs, John Wiley & Sons, NY, 1981, páginas 396-411). El reactivo esencialmente debe retener su capacidad de unirse y/o de modificar el polipéptido de interés tras su inmovilización en la fase sólida. La inmovilización del reactivo puede conseguirse mediante activación de la matriz. En breve, ello generalmente implica activar en primer lugar la fase sólida mediante una reacción química específica que depende de la química superficial y después inmovilizar el reactivo combinándolo con la fase sólida activada. La activación de la fase sólida puede implicar la activación de grupos hidroxilo (por ejemplo la activación con bromuro de cianógeno de la fase sólida); grupos carboxilo (por ejemplo utilizando N-hidroxibenzotriazol en presencia de una carbodiimida soluble en agua); acil hidrazida (utilizando, por ejemplo, glutaraldehído para generar grupos aldehído); aminas (utilizando, por ejemplo, ácido nitroso, fosgeno y tiofosgenos, o bromuro de cianógeno); o acrilonitrilo. En otra realización, el reactivo puede inmovilizarse utilizando un agente de reticulación (es decir, el reactivo se inmoviliza indirectamente en la fase sólida), tal como agentes reticuladores de longitud cero (por ejemplo carbodiimida, reactivo K de Woodward, cloroformatos y carbonildiimidazol); reticuladores homobifuncionales (por ejemplo glutaraldehído, cloroformatos y carbonildiimidazol, haluros heterocíclicos, divinilsulfona, quinonas e iones metales de transición); reticuladores heterobifuncionales, incluyendo, por ejemplo, haluro de monohalogenacetilo, epiclorohidrina, así como reactivos dirigidos por grupos amino y grupos tiol. En todavía una realización adicional, el reactivo se entrecruza con la fase sólida mediante una cadena carbohidrato. Para conseguirlo, los grupos azúcar pueden oxidarse en primer lugar para formar aldehídos que forman bases de Schiff con etilendiamina o con gliciltirosina. Puede utilizarse borohidruro sódico para estabilizar los enlaces. La glucoproteína derivatizada se inmoviliza en la fase sólida. Para una revisión de las técnicas de inmovilización, ver Wong, S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press Inc., Boston, 1991.

Una "cremallera de leucinas" es un péptido (con frecuencia de aproximadamente 20 a 40 residuos aminoácidos de longitud) que presenta varios aminoácidos repetidos, en el que cada séptimo aminoácido se encuentra un residuo leucina. Estas secuencias de cremallera de leucinas forman hélices \alpha anfipáticas, con los residuos leucina alineados en el lado hidrofóbico para la formación de dímeros. Las cremalleras de leucina pueden presentar la fórmula estructural general conocida como la repetición héptada (leucina-X_{1}-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}; SEC ID nº 4)_{n}, en la que X puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales, aunque más probablemente es uno de los aminoácidos con potencial de formación de hélice \alpha superenrollada, por ejemplo alanina, valina, ácido aspártico, ácido glutámico y lisina, y n puede ser tres o más, aunque típicamente n es 4 ó 5. Entre los ejemplos de cremalleras de leucinas en la presente invención se incluyen la cremallera de leucinas Fos-Jun (O'Shea et al., Science 245:646, 1989), que puede utilizarse para formar heterodímeros (por ejemplo anticuerpos biespecíficos); la cremallera de leucinas GCN4 de levadura (Landschutz et al., Science 240:1759-1764, 1988) que puede utilizarse para formar homodímeros (por ejemplo anticuerpos monoespecíficos, tal como en el ejemplo posteriormente) y cremalleras de leucinas que se encuentran en otras proteínas de unión a ADN, tales como C/EBP y c-myc, así como variantes de cualquiera de los mismos.

El término "filtro" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un medio filtrante poroso por el que se puede pasar una fase acuosa pero que retiene uno o más contaminantes. El filtro puede formarse a partir de una diversidad de materiales, tales como fibras de celulosa, incluyendo, por ejemplo, acetato de celulosa (membranas adsorbentes SARTOBIND^{TM}, de Sartorius), particulados de base sílice; elementos de filtro fibrosos y particulados; membranas de nilón o cualquiera de combinación de los mismos. El filtro de interés en la presente invención es un "filtro cargado" (es decir, cargado positiva o negativamente), implicando que porta una carga neta total positiva o una carga neta total negativa. Esto puede conseguirse, por ejemplo uniendo "grupos modificadores de carga" al filtro. Entre los modificadores de carga aniónica se incluyen polímeros solubles en agua que presentan grupos funcionales aniónicos, tales como grupos carboxilo, fosforoso, fosfórico o sulfónico (patente US nº 4.604.208). Entre los modificadores de carga catiónicos se incluyen el coloide catiónico formaldehído de melamina (patente US nº 4.007.113), el sílice coloidal catiónico inorgánico (patente US nº 4.305.782), la resina catiónica poliamido-poliamina epiclorohidrina, poliamina epiclorohidrina. El filtro preferentemente permite caudales elevados sin comprometer la capacidad ligante (al contrario que las columnas basadas en perlas, por ejemplo). Se encuentran contempladas diversas configuraciones del filtro, tales como módulos multicapa y dispositivos arrollados en espiral.

Un "tampón" es una solución que resiste los cambios de pH mediante la acción de sus componentes conjugados ácido-base. Un "tampón de equilibración" es un tampón utilizado para preparar una fase sólida para cargar el polipéptido de interés. El "tampón de carga" es un tampón que se utiliza para cargar la composición que comprende el polipéptido y contaminantes sobre la fase sólida. Con frecuencia, los tampones de equilibración y de carga son el mismo. El "tampón de elución" se utiliza para eluir el polipéptido de la fase sólida.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "inmunoadhesina" se refiere a moléculas similares a anticuerpos que combinan el "dominio de unión" de un polipéptido "adhesina" heterólogo (por ejemplo un receptor, ligando o enzima) con las funciones efectoras de un dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de la adhesina con especificidad de unión deseada que es diferente del sitio de reconocimiento y de unión de antígeno (sitio de unión de antígeno) de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina preferentemente se deriva de cadenas pesadas \gamma_{1}, \gamma_{2} o \gamma_{4}, debido a que las inmunoadhesinas que comprenden estas regiones pueden purificarse mediante cromatografía de proteína A (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13, 1983).

La expresión "dominio de unión de ligando" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a cualquier receptor nativo de superficie celular o cualquier región o derivado del mismo que retiene por lo menos una unión cualitativa de ligando de un receptor nativo correspondiente. En una realización específica, el receptor es de un polipéptido de superficie celular que presenta un dominio extracelular que es homólogo a un elemento de la familia supergénica de inmunoglobulinas. Otros receptores, que no son elementos de la familia supergénica de las inmunoglobulinas pero, de todas maneras, se encuentran comprendidos específicamente en esta definición, son receptores para citoquinas, y en particular receptores con actividad de tirosina quinasa (receptores tirosina-quinasa), elementos de las superfamilias de la hematopoyetina y del receptor del factor de crecimiento nervioso y moléculas de adhesión celular, por ejemplo selectinas E, L y P.

La expresión "dominio de unión de receptor" se utiliza para designar a cualquier ligando nativo de un receptor, incluyendo las moléculas de adhesión celular, o cualquier región o derivado de este ligando nativo que retiene por lo menos una capacidad cualitativa de unión a receptor de un ligando nativo correspondiente. Esta definición, entre otras, incluye específicamente secuencias de unión de ligandos para los receptores anteriormente indicados.

Modos de poner en práctica la invención

La invención en la presente memoria proporciona un procedimiento para modificar un polipéptido y/o para purificar un polipéptido a partir de una composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes. La composición es de manera general una que resulta de la producción recombinante del polipéptido, pero puede ser una composición resultante de la producción del polipéptido mediante síntesis peptídica (u otro medio de síntesis) o el polipéptido puede purificarse a partir de una fuente nativa del polipéptido. Preferentemente el polipéptido es un anticuerpo, por ejemplo uno que se une al antígeno CD18.

Para la producción recombinante del polipéptido, el ácido nucleico que lo codifica se aísla y se inserta en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) adicional o para la expresión del mismo. El ADN codificante del polipéptido se aísla y secuencia fácilmente mediante procedimientos convencionales (por ejemplo en los que el polipéptido es un anticuerpo, mediante la utilización de sondas oligonucleótidas que son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Se encuentran disponibles muchos anticuerpos. Los componentes del vector de manera general incluyen, aunque sin limitarse a ellos, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción (por ejemplo tal como se describe en la patente US nº 5.534.615).

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente invención son las células procariotas, levaduras o células eucariotas superiores indicadas anteriormente. Entre los procariotas adecuados para este fin se incluyen las eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos y Gram-positivos, por ejemplo Enterobacteriaceae, tal coom Escherichia, por ejemplo E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo Serratia marcescens, y Shigella, así como Bacillus, tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo B. licheniformis 41P, dado a conocer en la patente DD nº 266.710, publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped E. coli de clonación preferente es E coli 294 (ATCC nº 31.446), aunque resultan adecuadas otras cepas, tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC nº 31.537) y E. coli W3110 (ATCC nº 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos y no
limitativos.

Además de los procariotas, los microbios eucarióticos, tales como hongos filamentos o levaduras, resultan huéspedes de clonación o de expresión adecuados para los vectores codificantes de polipéptido. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadería, es la utilizada más frecuentemente de entre los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo, se encuentran disponibles y resultan útiles en la presente invención varios otros géneros, especies y cepas, tales como Schizosaccharomyces pombe, huéspedes Kluyveromyces, tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC nº 12.424), K. bulgaricus (ATCC nº 16.045), K. wickeramii (ATCC nº 24.178), K. waltii (ATCC nº 56.500), K. drosophilarum (ATCC nº 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia (patente EP nº 402.226); Pichia pastoris (patente EP nº 183.070); Candida; Trichoderma reesia (patente EP nº 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis, y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, huéspedes Neurospora, Penicillium, Tolypociadium y Aspergillus, tales como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptido glucosilado se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen las células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus, y células huésped de insecto permisivas correspondientes, a partir de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Se encuentran disponibles para el público una diversidad de cepas de virus para la transfección, pro ejemplo la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus pueden utilizarse como los virus de la presente invención según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También pueden utilizarse como huéspedes cultivos de células vegetales de algodón, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.

Sin embargo, las células de vertebrado han despertado el mayor interés, y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Entre los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles se incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC nº CRL-1651), la línea renal embrionaria humana (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977; células renales de hámster neonato (BHK, ATCC nº CCL-10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980), células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980), células renales de mono (CV1, ATTC nº CCL-70), células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC nº CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC nº CCL-2); células renales caninas (MDCK, ATCC nº CCL-34); células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC nº CRL-1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC nº CCL-75); células hepáticas humanas (HepG2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC nº CCL-51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4, y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Se transforman células huésped con los vectores de expresión o de clonación anteriormente indicados para la producción de polipéptido y se cultivan en medio nutritivo convencional modificado según resulte apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes codificantes de las secuencias deseadas.

Las células huésped utilizadas para producir el polipéptido de la presente invención pueden cultivarse en una diversidad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como medio de Ham F10 (Sigma), medio esencial mínimo (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma), resultan adecuados para cultivar las células huésped. Además, puede utilizarse cualquiera de los medios indicados en Ham et al., Meth. Enz. 58:44, 1979; Barnes et al., Anal. Biochem. 102255, 1980; patentes US nº 4.767.704, nº 4.657.886, nº 4.927.762, nº 4.560.655 o nº 5.122.469, patentes WO nº 90103430 y nº 87/00195, o patente US nº Re 30.985, como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según resulte necesario con hormonas y/o con otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes habitualmente a concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También pueden incluirse otros suplementos necesarios a concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquéllas utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para el experto ordinario en la materia.

En el caso de que se utilicen técnicas recombinantes, el polipéptido puede producirse intracelularmente, en el espacio periplasmático, o segregarse directamente en el medio. Si el polipéptido se produce intracelularmente, a modo de primera etapa se eliminan los residuos particulados, sean células huésped o células lisadas (por ejemplo resultantes de la homogeneización), por ejemplo mediante centrifugación o ultrafiltración. En el caso de que el polipéptido se segregue en el medio, los sobrenadantes de estos sistemas de expresión en primer lugar generalmente se concentran utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.

A continuación, el polipéptido se somete a una o más etapas de purificación. Entre los ejemplos de procedimientos de purificación se incluyen el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la cromatografía de interacción hidrofóbica (por ejemplo en fenil-sefarosa), la precipitación con etanol, la HPLC de fase reversa, la cromatografía en sílice, la cromatografía en heparin-Sepharose^{TM}, la cromatografía de intercambio aniónico, la cromatografía de intercambio catiónico (por ejemplo en una columna ABX Bakerbond o en una columna HP SP-Sepharose), el cromatoenfoque, el SDS-PAGE, la precipitación con sulfato amónico, la cromatografía en hidroxilapatito, la electroforesis en gel, la diálisis y la cromatografía por afinidad (por ejemplo utilizando proteína A, proteína G, un anticuerpo, un sustrato, ligando o antígeno específico como reactivo de captura).

En una realización de la invención, la etapa de recuperación implica exponer una composición que comprende el polipéptido (y opcionalmente uno o más contaminantes) a una fase sólida sobre la que se inmoviliza un reactivo que se une o modifica el polipéptido. Esta etapa puede realizarse al inicio o final o en cualquier punto en una secuencia de etapas de recuperación del polipéptido. En una realización, la fase sólida se empaqueta en una columna y el reactivo inmovilizado captura el polipéptido. En otra realización, el reactivo modifica química y/o físicamente el polipéptido y resulta inmovilizado sobre la fase sólida, que se encuentra, por ejemplo, empaquetada en una columna, y la composición se pasa por la columna. Por ejemplo, el polipéptido puede comprender un dominio precursor que el reactivo inmovilizado elimina como parte del procedimiento de recuperación. En el ejemplo posteriormente, el polipéptido precursor es un anticuerpo con un dominio de dimerización de cremallera de leucinas que se elimina con pepsina inmovilizada durante el procedimiento de recuperación. Tras esta etapa, la fase sólida (por ejemplo la columna de cromatografía) puede regenerarse utilizando técnicas aplicables para la regeneración de la fase sólida.

Se ha descubierto en la presente invención que la lixiviación del reactivo inmovilizado de la fase sólida puede ocurrir, y ello puede resultar en la reducción del rendimiento y/o en la contaminación de la preparación de polipéptido tras esta etapa. En particular, en el ejemplo posteriormente, se descubrió que la pepsina podía lixiviarse de una columna en la que se había inmovilizado, y resultar en la digestión del anticuerpo tras la eliminación de la cremallera de leucinas, reduciendo de esta manera el rendimiento de anticuerpo funcional.

Con el fin de evitar dicho problema, la invención proporciona una etapa tras la exposición de la composición al reactivo inmovilizado tal como se ha comentado anteriormente. Esto implica pasar la composición que comprende el polipéptido y el reactivo lixiviado (y opcionalmente uno o más contaminantes adicionales) por un filtro con carga opuesta a la carga del reactivo al pH de la composición, de manera que se elimina el reactivo lixiviado de la composición. El filtro puede encontrarse cargado positivamente para eliminar contaminantes que se encuentran cargados negativamente al pH de la composición, tales como proteasas ácidas, proteína A, proteína G u otros reactivos que pueden lixiviarse de las columnas de afinidad. Alternativamente, el filtro puede cargarse negativamente para eliminar contaminantes que se encuentran cargados positivamente al pH de la composición, tales como proteasas básicas. Preferentemente, las características de carga del polipéptido de interés en la composición que se pasa por el filtro permiten que el polipéptido no resulte retenido significativamente por el filtro y pase por el mismo. La capacidad del reactivo lixiviado de unirse al filtro y del polipéptido de pasar por el mismo varía dependiendo del pH de la composición que pasa por el filtro. Para determinar qué filtro debe utilizarse (es decir, si el filtro debe presentar carga positiva o negativa), debe investigarse el pI del reactivo lixiviado y, opcionalmente, el pI del polipéptido expuesto al reactivo inmovilizado tal como se ha comentado anteriormente. En una realización (por ejemplo tal como en el ejemplo posteriormente), el pH de la composición permitirá que el reactivo lixiviado y el polipéptido ya presenten cargas netas contrarias. En otra realización, puede resultar beneficioso ajustar el pH de la composición que debe pasarse por el filtro cargado de manera que el reactivo lixiviado y el polipéptido presenten cargas contrarias. Esta alteración del pH de la composición puede servir para incrementar la unión de contaminantes de carga opuesta al filtro y/o para reducir la unión del polipéptido de interés al filtro. En la presente invención se encuentran contempladas otras modificaciones de la composición para conseguir el mismo efecto. Tras cualquier modificación opcional de la composición, puede seleccionarse un filtro que presente una carga contraria a la del reactivo lixiviado que debe eliminarse de la composición.

En una realización preferente de la invención, el filtro se coloca "en línea" con el efluente tratado tal como en la etapa anterior (es decir, el efluente fluye directamente por el filtro). Esto puede conseguirse conectando el filtro directamente a la salida de efluente de la columna antes de que éste se recoja en un tanque de recolección. El filtro puede regenerarse utilizando técnicas aplicables al tipo de filtro utilizado.

La preparación de polipéptido puede someterse a purificación adicional, si resulta necesario. Se han comentado anteriormente etapas adicionales de purificación ejemplares. El polipéptido recuperado de esta manera puede formularse en un portador farmacéuticamente aceptable y utilizarse para diversos usos diagnósticos, terapéuticos u otros usos conocidos para las moléculas.

Los ejemplos siguientes se proporcionan a título ilustrativo y no limitativo.

Ejemplo

El presente ejemplo se refiere a un anticuerpo (CD18 rhuMAb) producido en forma de polipéptido precursor con un dominio de cremallera de leucinas que se elimina durante el procedimiento de purificación de la invención. Se creó anticuerpo anti-CD18 humanizado recombinante (CD18 rhuMAb) que presentaba la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1A (cadena pesada, SEC ID nº 1) y en la figura 1B (cadena ligera; SEC ID nº 2), mediante humanización del anticuerpo monoclonal murino muMAb H52 (Hildreth et al., J. Immunology 134:3272-3280, 1985).

Producción recombinante de CD18 rhuMAb: se construyó plásmido pS1130 para dirigir la producción de la molécula precursora de CD18 rhuMAb en E. coli. El precursor se corta durante el procedimiento de purificación con la proteasa pepsina, rindiendo CD18 rhuMAb. CD18 rhuMAb es una molécula F(ab')_{2} compuesta de dos péptidos diferentes (cadenas ligera y pesada) unidas mediante enlaces disulfuro. La región Fc de los anticuerpos intactos normalmente mantiene juntos los dos brazos Fab (figura 2A), de manera que cuando se produce Fab' en E. coli, se forma una cantidad muy reducida de F(ab')_{2}. La fusión de un dominio de dimerización de cremallera de leucinas GCN4 de levadura con el extremo C-terminal de un Fab' sustituye la región Fc y permite la producción eficiente de F(ab')_{2} en E. coli. Los dominios de cremallera de leucinas GCN4 interaccionan, formando estructuras diméricas estables (hélices enrolladas paralelas) que mantienen juntos los residuos de cisteína de dos cadenas pesadas, de manera que pueden formarse los dos enlaces disulfuro nativos entre cadenas. Ello resulta en la formación de complejos F(ab')_{2} que se encuentran unidos covalentemente por enlaces disulfuro. Los dominios de cremallera de leucina se eliminan posteriormente del precursor de CD18 rhuMAb durante el procedimiento de purificación utilizando la proteasa pepsina, que corta uniformemente entre los dos residuos de leucina de la bisagra. Ello resulta en la formación de la molécula F(ab')_{2} CD18 rhuMAb (figura 2B).

El plásmido pS1130 (figura 3) se basa en el plásmido bien caracterizado pBR32, con un casete de expresión de 2.143 pb (figura 4) insertado en el sitio de restricción EcoRI. El plásmido pS1130 es resistente a los antibióticos tetraciclina y \beta-lactamo. El casete de expresión contiene una copia única de cada gen ligadas en tándem. La transcripción de cada gen en un único ARNm dicistrónico se encuentra controlada por el promotor phoA de E. coli (Chang et al., Gene 44:121-125, 1986) y finaliza en el terminador t_{0} del fago lambda (Scholtissek y Grosse, Nucleic Acids Research 15:3185, 1987). Las señales de inicio de traducción para cada cadena las proporcionan las secuencias de Shine-Dalgarno de la STII (enterotoxina termoestable) de E. coli (Picken et al., Infection and Immunity 42:269-275, 1983). La traducción de cada cadena se inicia con un péptido de señal de STII de 23 residuos que dirige la traslocacion de los péptidos a través de la membrana citoplasmática hacia el espacio periplásmico (SEC ID nº 6 y 7). El péptido de señal de STII después resulta eliminado por la peptidasa líder de E. coli. Las cadenas ligera y pesada se pliegan en sus conformaciones nativas tras la secreción hacia el periplasma y se asocian con el precursor de CD18 rhuMAb, un F(ab')_{2} unido covalentemente (figura 2B). El dominio de cremallera de leucinas se separa del precursor durante el procedimiento de purificación (ver posteriormente), rindiendo CD18 rhuMAb (figura 2B). La línea celular utilizada en la producción de CD18 rhuMAb es 49A5, derivada de la línea celular W3110 de E. coli (ATCC nº 27.325), tal como se muestra en la figura 5. El procedimiento de fermentación tiene lugar tal como se muestra en la figura 6. La producción de precursor de CD18 rhuMAb se produce cuando se agota el fosfato en el medio, típicamente 30 a 60 horas tras la inoculación.

La purificación de precursor de CD18 rhuMAb de la pasta celular de E. coli se llevó a cabo de la manera siguiente.

Homogeneización y centrifugación: se disolvieron pellets celulares congelados que contenían anticuerpo precursor anti-CD18, en aproximadamente 3 volúmenes de tampón de extracción (MES 120 mM, tampón EDTA 5 mM, pH 6) calentado hasta 30ºC a 40ºC. Esto resultó en una suspensión con un pH de entre aproximadamente 5,4 y 6,5. Esta suspensión se pasó dos veces por un homogeneizador Gaulin a 5.500 a 6.500 psi y se mantuvo por debajo de 20ºC con un intercambiador de calor. Se añadió polietilenimina (PEI) al 5% (p/v), pH 6, al homogenado hasta una concentración final de PEI del 0,2%. La mezcla se incubó durante aproximadamente una hora a una temperatura comprendida entre 2ºC y 8ºC. Se añadió aproximadamente un volumen de tampón de extracción (MES 120 mM, EDTA 5 mM, pH 6) antes de separar los sólidos mediante centrifugación a 15.280 g. El sobrenadante transparente se acondicionó a una conductividad inferior a 3 mohms mediante la adición de agua fría.

Cromatografía de intercambio iónico: el sobrenadante condicionado se cargó en una columna de intercambio catiónico (columna ABX; Mallinckrodt Baker Inc., NJ, USA) equilibrada en MES 50 mM, pH 6,. La columna se lavó con el tampón de equilibración y el precursor anti-CE18 se eluyó con un gradiente lineal desde MES 50 mM, pH 6,0, hasta MES 50 mM, citrato sódico 100 mM, pH 6,0. Se realizó un seguimiento de la columna mediante absorbancia a 280 nm, y el eluído se recogió en fracciones. Las fracciones apropiadas se agruparon basándose en la cromatografía líquida hidrofóbica analítica de intercambio catiónico (HPLC). Tras utilizar la columna de intercambio catiónico, ésta se regeneró con HCl de guanidina 3,0 M, tampón HEPES 20 mM, pH 7,4, seguido de ácido acético al 1% y ácido fosfórico 120 mM. La columna se almacenó en ácido acético al 1% y ácido fosfórico 120 mM.

Digestión del precursor: se acopló químicamente pepsina (Sigma, MO, USA) a vidrio de poro controlado (CPG) de Bioprocess Ltd., UK. El CPG se activó con NaIO_{4} seguido de la reducción de la base de Schiff formada entre el CPG y la pepsina utilizando NaBH_{3}CN.

El pool de anticuerpo precursor anti-CD18 de intercambio catiónico de la etapa anterior se diluyó con MES 50 mM, citrato sódico 3 mM, pH 4,0, hasta una concentración de aproximadamente 2 g/l. A continuación, se ajustó el pool a pH 4 mediante la adición de ácido cítrico 2 M y se hizo fluir por una columna que contenía pepsina inmovilizada (pepsina-CPG) equilibrada previamente con MES 50 mM, citrato sódico 36 mM, pH 4,0. Este procedimiento eliminó las cremalleras de la región bisagra, dejando F(ab')_{2} intacto. Tras utilizar la columna de pepsina, se regeneró con HCl acuoso al 0,12%, pH 1,5, y se almacenó en acetato sódico 100 mM, cloruro sódico 150 mM, timerosal al 0,01% y glicerol al 50%, pH 4,5.

Filtración de intercambio aniónico: el efluente de la columna de pepsina-CPG se pasó directamente en línea a través de una membrana Sartobind Q de intercambio aniónico (Sartorius, Goettingen, Alemania). El anticuerpo F(ab')_{2} anti-CD18 generado fluye a través de la membrana, mientras que la pepsina y otras impurezas cargadas negativamente se unen fuertemente a la membrana. La membrana se regeneró utilizando MES 50 mM, citrato sódico 36 mM, cloruro sódico 1 M, pH 4,0 y se almacenó en hidróxido sódico 0,1 N.

Análisis de la reacción de digestión: se analizó la digestión del anticuerpo precursor anti-CD18 mediante cromatografía HPLC de intercambio catiónico en una columna BAKERBOND^{TM} carboxi-sulfon (CSX) de 50 x 4,6 mm (J. T. Baker Pillipsburg, NJ) mantenida a 55ºC. Los polipéptidos se eluyeron utilizando un gradiente lineal creciente entre pH 6,0 y pH 8,0 a un caudal de 4 ml/min utilizando una longitud de onda de detección de 280 nm. El tampón A contenía 16 mM de cada uno de HEPES/PIPES/MES, pH 6,0, y el tampón B contenía 16 mM de cada uno de HEPES/PIPES/MES, pH 6,0. Para la separación del anticuerpo precursor anti-CD18 digerido y no digerido, se corrió un gradiente lineal durante 10 minutos entre 40% de B y 100% de B.

Análisis de pepsina: se determinó la cantidad de pepsina que se había lixiviado de la columna de pepsina-CPG mediante análisis de HPLC de fase reversa y mediante análisis ELISA de la pepsina.

Para el análisis de HPLC, se realizó el seguimiento de una columna TosoHass TSK-fenilo (7,5 x 75 mm) con 90% de solvente A (TFA al 0,1% en agua) y 10% de solvente B (TFA al 0,1% en acetonitrilo). Tras la inyección de 75 \mug de muestra, se inició un gradiente durante 30 minutos entre 10% y 25% de solvente B; el caudal era de 1 ml/min. Se utilizaron anticuerpos policlonales anti-pepsina de cabra para recubrir una placa de microtitulación de 96 pocillos. Se incubaron muestras que contenían pepsina y estándares en los pocillos recubiertos. Se completó el sándwich con anti-pepsina de cabra biotinilada. Previamente a la biotinilación, se purificaron por afinidad los segundos anticuerpos utilizando CPG-pepsina. Los complejos inmunológicos se detectaron en las placas utilizando estreptavidina-fosfatasa alcalina y sustrato p-nitrofenil fosfato. Se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de placas de microtitulación. Los estándares cubren el intervalo de 33,3 \mug/ml hasta 0,5 \mug/ml en diluciones dobles. Las diluciones se llevaron a cabo para las muestras (muestra pura o diluida 1:2, 1:4 y 1:8). También se añadieron a las muestras 10 \mug/l de pepsina y se sometieron a ensayo al igual que las muestras anteriores. El límite de detección del ensayo era de 1 \mug/ml. Una curva logística de 4 parámetros de ajuste a los datos proporcionó una curva estándar aceptable.

Cromatografía de intercambio catiónico: el pool se diluyó para proporcionar una conductividad de aproximadamente 7 mohms mediante la adición de agua. El pool se aplicó a una columna de intercambio catiónico (SP-sefarosa de alto rendimiento; SPHP) equilibrada en MES 25 mM, ácido acético 60 mM, pH 4,0. Se lavó la columna de SP-sefarosa con MES 25 mM, acetato sódico 75 mM, pH 5,6, y se eluyó en un gradiente lineal de acetato sódico 75 a 110 mM en MES 25 mM, pH 5,6. Se realizó un seguimiento del eluido de la columna a 280 nM y las fracciones de eluido se agruparon basándose en la HPLC analítica de intercambio iónico. La columna de SP-sefarosa se regeneró en MES 25 mM, acetato sódico 400 mM, pH 5,6, seguido de un lavado con hidróxido sódico al 0,5%. La columna se almacenó en NaOH al 0,1%.

Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC): la fracción agrupada procedente de la columna de SP-sefarosa se diluyó mediante la adición de sulfato amónico 3,0 M, MES 25 mM, pH 6,0, en una proporción de 0,26 litros por litro de pool. A continuación, la fracción diluida se pasó por una columna HIC (fenil-sefarosa FF de baja sustitución) previamente equilibrada en sulfato amónico 0,625 M, MES 25 mM, pH 6,0. Tras la carga, la columna se lavó con el mismo tampón utilizado en la equilibración y el CD18 rhuMAb se eluyó en sulfato amónico 0,375 M, MES 25 mM, pH 6,0. Se realizó un seguimiento del eluido a 280 nM y las fracciones se recogieron basándose en la HPLC analítica de fase reversa. La columna HIC se regeneró en MES 25 mM, pH 6,0, seguido de un lavado en NaOH al 0,5%. La columna se almacenó en NaOH al 0,1%.

Resultados

Se llevaron a cabo dos operaciones separadas de purificación a gran escala (ver la figura 7). El procedimiento de purificación se inició con pasta celular de E. coli que contenía anticuerpo precursor anti-CD18, y se completó con el F(ab')_{2} anti-CD18 que carecía del dominio de dimerización de cremallera de leucinas. Durante ambas operaciones de purificación, se llevó a cabo la digestión de la molécula de anticuerpo precursor pasando anticuerpo precursor anti-CD18 parcialmente purificado por una columna de pepsina-CPG. Se realizó un seguimiento de la digestión mediante SDS-PAGE y HPLC analítica de intercambio catiónico. Se determinó la cantidad total de pepsina lixiviada de la columna de pepsina-CPG midiendo la pepsina en el pool de anticuerpo precursor digerido tras la digestión de CPG-pepsina y la etapa de filtración, y en el pool de regeneración de la membrana de intercambio aniónico. La regeneración de la membrana se llevó a cabo eluyendo la pepsina y los contaminantes unidos a la membrana con MES 50 mM, citrato sódico 36 mM y tampón cloruro sódico 1 M, pH 4,0 (ver la figura 7). Se realizó un seguimiento de la eliminación efectiva de la pepsina durante las etapas de purificación utilizando transferencia western con anticuerpos purificados de cabra anti-pepsina y se cuantificó con la técnica ELISA.

Los resultados del análisis de HPLC de fase reversa se muestran en la Tabla 1. En la primera operación, se detectó pepsina tanto en el pool de regeneración de la membrana de intercambio aniónico, a una concentración de 40 \mug/ml, como en el pool de anticuerpo precursor digerido tras las etapas de CPG-pepsina y de filtración, a una concentración de 48,3 \mug/ml. Sumando la concentración total de pepsina en ambos pools se determinó que 13,4 g de pepsina lixiviaron de la columna de CPG-pepsina durante la etapa de digestión en la primera operación. Los datos también revelaron que el área de filtración utilizada para eliminar la pepsina lixiviada no era suficiente para los caudales y pH utilizados en la primera operación. Sin embargo, la membrana fue capaz de eliminar 21% de la cantidad total de pepsina lixiviada de la columna de pepsina-CPG. Debido a que el pool de anticuerpo precursor digerido contenía 10,6 g de pepsina lixiviada que no había sido eliminada de la membrana, los rendimientos de purificación de la etapa de digestión de pepsina-CPG y de la etapa de SPHP fueron reducidos: 77% y 53% respectivamente. Además, el análisis de transferencia western detectó pepsina en el pool de SPHP.

TABLA 1

1

Tras la etapa final de purificación (fenil-sefarosa), no se detectó pepsina mediante ELISA (Tabla 2) o mediante análisis de transferencia western. En la segunda operación, se dobló el área de filtración de la membrana de intercambio aniónico, de 11.000 cm^{2} a 22.000 cm^{2}. Se detectó pepsina únicamente en el pool de regeneración de intercambio aniónico, a una concentración de 230 \mug/ml. No se detectó pepsina en el pool de anticuerpo precursor digerido, tras las etapas de digestión de CPG-pepsina y de filtración. La cantidad total de pepsina lixiviada por la resina CPG-pepsina fue de 2,3 g. Este valor representa el 17% de la cantidad total de pepsina lixiviada detectada durante la primera operación. No se detectó pepsina mediante fase reversa, ELISA para pepsina o transferencias western durante las etapas de purificación restantes de la segunda operación. Como resultado de la eliminación completa de la pepsina del pool de precursor digerido, los rendimientos de purificación de la etapa de digestión de pepsina-CPG y del SPHP se mejoraron en el 97% y 90%, respectivamente.

TABLA 2

2

Los resultados de estos experimentos demuestran que la utilización de una membrana de carga positiva en línea inmediatamente después de la etapa de digestión de la pepsina inmovilizada resulta ventajosa. Cuando la membrana no eliminó por completo la pepsina del pool de anticuerpo precursor digerido, se obtuvieron rendimientos reducidos de anticuerpo funcional. Sin restringirse a ninguna teoría en particular, ello probablemente fue el resultado de la digestión excesiva por parte de la pepsina remanente en el pool. Además, cuando la membrana positivamente cargada no eliminó por completo la pepsina, se detectó en el pool de SPHP mediante transferencias western. En la segunda operación, la pepsina lixiviada fue completamente eliminada por la membrana. Como resultado, los rendimientos de recuperación para la etapa de digestión con pepsina y de intercambio catiónico en SPHP se mejoraron. La introducción de la membrana de intercambio aniónico mejoró el procedimiento de purificación de anti-CD18 de dos maneras fundamentales. En primer lugar, se mejoraron los rendimientos eliminando con eficacia la pepsina del pool de digestión de CPG, evitando la digestión posterior. En segundo lugar, la eficiencia global y la reproducibilidad del procedimiento se mejoraron mediante la eliminación de la pepsina y de otros contaminantes cargados negativamente en etapas tempranas el procedimiento.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Recuperación de proteínas

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 7

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

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(A)

DESTINATARIO: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1 DNA Way

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(C)

CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: 3,5 pulgadas, diskete de 1,44 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WinPatin (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

DATOS DEL CESIONARIO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Schwartz, Timothy R.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32171

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: P110541PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 650/225-7467

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(B)

TELEFAX: 650/952-9881

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 241 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:

3

4

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 214 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:

5

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 36 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

101

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2.143 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: única

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:

6

7

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 237 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:

8

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 7:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 300 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:

9

10

Claims (19)

1. Procedimiento para la recuperación de un polipéptido, que comprende:

(a) exponer una composición que comprende un polipéptido a un reactivo que se une a, o que modifica, el polipéptido, en el que el reactivo se encuentra inmovilizado sobre una fase sólida; y después

(b) pasar la composición por un filtro con una carga que es contraria a la carga del reactivo en la composición, de manera que se elimina el reactivo lixiviado de la composición.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las características de carga del polipéptido en la composición en la etapa (b) permiten que el polipéptido pase por el filtro.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que l filtro se encuentra cargado positivamente.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el filtro se encuentra cargado negativamente.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el filtro se sitúa en línea con la composición expuesta al reactivo tal como en la etapa (a).

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el reactivo inmovilizado es una proteasa.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la proteasa es la pepsina.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el polipéptido expuesto a la proteasa en la etapa (a) es un polipéptido precursor y la proteasa elimina un dominio precursor del polipéptido.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el dominio precursor comprende una cremallera de leucinas.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el polipéptido es un anticuerpo.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo es un fragmento F(ab')_{2}.

12. Procedimiento para la recuperación de un polipéptido, que comprende eliminar un reactivo lixiviado de una composición que comprende el polipéptido y el reactivo lixiviado pasando la composición por un filtro que presenta una carga contraria a la del reactivo lixiviado, en el que el reactivo lixiviado se ha inmovilizado previamente sobre una fase sólida.

13. Procedimiento para la modificación de un anticuerpo precursor que comprende una cremallera de leucinas, que comprende exponer el anticuerpo precursor a una proteasa inmovilizada sobre una fase sólida, de manera que la proteasa separa la cremallera de leucinas del anticuerpo precursor, de manera que el procedimiento comprende pasar el anticuerpo del que se ha separado la cremallera de leucinas, por un filtro cargado positivamente.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la proteasa es la pepsina.

15. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la fase sólida comprende perlas de vidrio de poro controlado.

16. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el anticuerpo es un F(ab')_{2}.

17. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la cremallera de leucinas es GCN4.

18. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el anticuerpo se une a CD18.

19. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el anticuerpo se une al receptor HER2, HER3 o HER4.