ES2288472T3 - Lipidos bipolares y su uso para la liberacion de sustancias bioactivas. - Google Patents

Abstract

Un lípido bipolar que comprende una cabeza catiónica (1), una cadena principal hidrófoba (2) y una cola hidrófila (3) en el cual: (A) la cabeza catiónica comprende dos o más centros catiónicos, conteniendo cada centro al menos un heteroátomo que es capaz de retener una carga positiva a un pH en el intervalo de 2 a 10 y que se une covalentemente al otro u otros centros mediante uno o más grupos espaciadores que contienen carbono; (B) la cadena principal hidrófoba comprende al menos una cadena de hidrocarburo; y (C) la cola hidrófila comprende al menos una unidad de cola seleccionada entre polioles sintéticos, polioles que se dan en la naturaleza, poli(óxidos de alquileno) y derivados de los mismos; estando cada uno de dichos componentes (1) a (3) covalentemente unidos, la cabeza (1) a la cadena principal (2) a la cola (3), y dispuestos de modo que dicha cadena de hidrocarburo de la cadena principal hidrófoba (2) está covalentemente unida a uno de dichos heteroátomos que retienen carga positiva en la cabeza catiónica (1) y a dicha unidad de cola en la cola hidrófila (3) de modo que la cadena contiene al menos diez átomos unidos en cadena entre sus puntos de unión a dicho heteroátomo que retiene carga positiva y a dicha unidad de cola.

Description

Lípidos bipolares y su uso para la liberación de sustancias bioactivas.

Esta invención se refiere a una serie de lípidos bipolares y a su uso para repartir sustancias bioactivas a las células.

Para ser eficaz, muchos agentes farmacéuticos necesitan ser liberados de manera eficaz al citoplasma de una célula eucariota. Para muchos compuestos de bajo peso molecular de baja a moderada polaridad esto no es un problema puesto que tales moléculas pueden pasar directamente a través de la membrana plasmática de la célula al citoplasma. El paso directo no está disponible para otros compuestos de mayor polaridad o alto peso molecular y estos generalmente entran en la célula por un receptor mediado por endocitosis o fagocitosis. Sin embargo, estos mecanismos no son eficientes con todos los tamaños y tipos de moléculas. En concreto, compuestos polianiónicos grandes no son fácilmente absorbidos por las células cuando se liberan a ellas en disolución acuosa.

Una solución general a este problema es acoplar cualquier agente farmacéutico escasamente transportado a un vehículo que sea absorbido fácilmente dentro del citoplasma de una célula. Sin embargo, esto no es siempre satisfactorio, puesto que el acoplamiento al vehículo puede tener un efecto indeseable sobre el metabolismo y/o la antigenicidad del agente farmacéutico y/o puede ser difícil recuperar la actividad biológica deseada a partir del conjugado resultante una vez dentro de la célula.

Una solución alternativa es formular el agente farmacéutico con un vehiculizante de reparto que sea soluble en disoluciones acuosas pero que también pueda imitar los constituyentes de la membrana celular que se dan en la naturaleza. Esto fomenta la fusión del vehiculizante con una membrana celular y el reparto posterior de cualquier agente farmacéutico asociado al citoplasma.

Los lípidos anfífilos frecuentemente se han usado con este propósito. Estos generalmente tienen una cadena principal hidrófoba compuesta de uno o más hidrocarburos y un grupo de cabeza polar hidrófilo que contiene uno o más grupos ionizables, para facilitar el transporte de macromoléculas a y a través de la membrana plasmática de las células y dentro del citoplasma. La polaridad del grupo de cabeza se puede controlar mediante la selección del número y/o tipo de grupos ionizables para conseguir un intervalo de lípidos cargados negativamente (aniónicos), neutros o cargados positivamente (catiónicos).

Para el reparto de polianiones generalmente es ventajoso usar lípidos catiónicos. La llegada de la terapia genética y la necesidad de repartir moléculas aniónicas tales como los ácidos nucleicos a células de mamíferos han impulsado mucho el desarrollo de esta clase de lípidos. Los compuestos de primera generación incluyen aquellos con un grupo de cabeza monocatiónico tal como cloruro de N-[1(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio [DOTMA; Feigner, P.L. y Ringold, G.M., Nature, 337:387-388 (1989)], bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetilhidroxietilamonio [DMRIE; Zabner, J. et al. J. Biol. Chem., 270:18.997-19.007 (1995)], y bolaanfífilos [Fuhrhop, J.H. et al., Chemistry and Physics of Lipids 43, 193-213 (1987)], 3\beta[N-(N^{1},N^{1}-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol [DC-Choi; Farhood, H. et al. Biochim. Biophys. Acta 1.111:239-246 (1992)] y aquellos con un grupo de cabeza de policatión tal como dioctadecil-amidoglicilespermina [DOGS; Behr, J.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:6.982-6.986
(1989)].

En un esfuerzo por mejorar las propiedades de estos primeros compuestos para el reparto in vivo de polianiones se han desarrollado muchos más lípidos catiónicos en los cuales se han variado la naturaleza y el tamaño de la cadena principal hidrófoba y/o el grupo de cabeza catiónico (véase, por ejemplo, las Memorias de Patente Internacional Nº WO95/21931, WO96/10038, WO96/17823, WO96/18273, WO96/25508, WO96/26179, WO96/41606, WO97/18185, WO97/25339, WO97/3010, WO97/31934 y WO99/52858).

El objetivo en el desarrollo de lípidos catiónicos para el uso in vivo es proporcionar una molécula que sea sencilla para usar en un marco clínico; que sea robusta; que forme pequeños complejos estables sobre amplios intervalos de pH y fuerza fónica; que no sea tóxico; y que sea capaz de repartir una alta concentración de polianión a una célula.

En la actualidad hemos desarrollado una clase de lípido que cumple con estos requerimientos. Más importante, nuestros lípidos son capaces de auto ensamblarse y formarán complejos estables en disoluciones acuosas. Los lípidos son capaces de compactar de manera eficaz polianiones para dar tamaños de partícula definidos de menos de 500 nm. El complejo lípido-polianión continúa asociado sobre amplios intervalos de pH y fuerza iónica y es capaz de repartir de manera eficaz altas concentraciones de polianiones a las células.

Por tanto, de acuerdo con un aspecto de la invención proporcionamos un lípido bipolar que comprende una cabeza catiónica (1), una cadena principal hidrófoba (2) y una cola hidrófila (3) en el cual:

(A)

la cabeza catiónica comprende dos o más centros catiónicos, conteniendo cada centro al menos un heteroátomo que es capaz de retener una carga positiva a un pH en el intervalo de 2 a 10 y que se une covalentemente al otro u otros centros mediante uno o más grupos espaciadores que contienen carbono;

(B)

la cadena principal hidrófoba comprende al menos una cadena de hidrocarburo; y

(C)

la cola hidrófila comprende al menos una unidad de cola seleccionada entre: polioles sintéticos, polioles que se dan en la naturaleza, poli(óxidos de alquileno) y derivados de los mismos;

estando cada uno de dichos componentes (1) a (3) covalentemente unidos, la cabeza (1) al cuerpo principal (2) a la cola (3), y dispuestos de modo que dicha cadena de hidrocarburo de la cadena principal hidrófila (2) está covalentemente unida a uno de dichos heteroátomos que retienen carga positiva en la cabeza catiónica (1) y a dicha unidad de cola en la cola hidrófila (3) de modo que la cadena contiene al menos diez átomos unidos en cadena entre sus puntos de unión a dicho heteroátomo que retienen carga positiva y a dicha unidad de cola.

En la práctica, que un heteroátomo retenga una carga positiva en el intervalo de pH de 2 a 10 tal como se ha especificado anteriormente dependerá de la naturaleza y número de cualquiera de los otros átomos o grupos unidos a él. Por tanto, ejemplos particulares de centros catiónicos adecuados incluyen grupos amino primarios, secundarios, terciarios y cuaternarios, grupos de sulfonio y fosfonio.

El número de centros catiónicos puede variar como se desee dependiendo del uso deseado del lípido de la invención. Al menos dos centros estarán presentes, pero opcionalmente se pueden incorporar tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más. Puede estar presente más de un tipo de centro, por ejemplo, pueden tener cabida mezclas de grupos amino y/o grupos de sulfonio y/o fosfonio.

En una preferencia general cada centro catiónico es un grupo amino. Los grupos amino particularmente útiles incluyen grupos amino primarios y secundarios. El número de centros catiónicos en la cabeza catiónica (1) preferiblemente será de tres a seis.

En general, cada centro catiónico estará separado de cualquier otro centro mediante grupos espaciadores colocados para unir los centros de un modo lineal (recto o ramificado) o cíclico. El efecto global puede ser una cabeza catiónica (1) que tiene una estructura lineal recta y/o ramificada, una estructura cíclica o una mezcla de estructuras lineales rectas y/o ramificadas y cíclicas. Más de un tipo de grupo espaciador puede estar presente en una cabeza catiónica (1). Si se desea un grupo espaciador puede formar un grupo terminal en la cabeza catiónica (1), actuando como un sustituyente en un centro catiónico en lugar de un grupo que conecta centros continuos.

Cada grupo espaciador, en general, será no iónico y contendrá al menos un átomo de carbono. Los grupos adecuados incluyen grupos alifáticos, cicloalifáticos, heteroalifáticos, heterocicloalifáticos, aromáticos o heteroaromáticos opcionalmente sustituidos.

Los ejemplos particulares de grupos espaciadores alifáticos opcionalmente sustituidos incluyen cadenas alifáticas C_{1-10} opcionalmente sustituidas tales como cadenas de alquileno C_{1-6}, alquenileno C_{2-6} o alquinileno C_{2-6} rectas o ramificadas opcionalmente sustituidas.

Los grupos espaciadores heteroalifáticos incluyen las cadenas alifáticas ya descritas pero conteniendo además con cada cadena uno, dos, tres o cuatro heteroátomos o grupos que contienen heteroátomo. Los heteroátomos o grupos particulares incluyen átomos o grupos L^{2} en los que L^{2} es tal como se define a continuación para L^{1} cuando L^{1} es un átomo o grupo conector ("linker"). Cada átomo o grupo L^{2} puede interrumpir la cadena alifática, o puede estar situado en su átomo de carbono terminal para conectar la cadena al átomo o grupo R^{1}.

Los ejemplos particulares de grupos espaciadores alifáticos incluyen: cadenas -CH_{2}-, -CH_{2}CH_{2}-, -CH(CH_{3})-,
-C(CH_{3})_{2}-, -(CH_{2})_{2}CH_{2}-, -CH(CH_{3})CH_{2}-, -(CH_{2})_{3}CH_{2}-, -CH(CH_{3})CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH(CH_{3})CH_{2}-, -C(CH_{3})_{2}CH_{2}-,
-(CH_{2})_{4}CH_{2}-, -(CH_{2})_{5}CH_{2}-, -CHCH-, -CHCHCH_{2}-, -CH_{2}CHCH-, -CHCHCH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CHCHCH_{2}-, -(CH_{2})_{2}CH
CH, -CC-, -CCCH_{2}-, -CH_{2}CC-, -CCCH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CCCH_{2}- o - (CH_{2})_{2}CC- opcionalmente sustituidas. Cuando sea apropiado cada una de dichas cadenas pueden estar opcionalmente interrumpidas por uno o dos átomos y/o grupos L^{2} para formar un grupo espaciador heteroalifático opcionalmente sustituido. Ejemplos particulares incluyen: cadenas -L^{2}CH_{2}-, -CH_{2}L^{2}CH_{2}-, -L^{2}(CH_{2})_{2}-, -CH_{2}L^{2}(CH_{2})_{2}-, -(CH_{2})_{2}L^{2}CH_{2}-, -L^{2}(CH_{2})_{3}- y -(CH_{2})_{2}L^{2}(CH_{2})_{2}- opcionalmente sustituidas. Los sustituyentes opcionales que pueden estar presentes en los grupos espaciadores alifáticos o heteroalifáticos incluyen uno, dos, tres o más sustituyentes seleccionados entre: átomos de halógeno, por ejemplo, átomos de flúor, cloro, bromo o yodo, o hidróxilo, alcoxi C_{1-6}, por ejemplo, metoxi o etoxi, haloalcoxi C_{1-6}, por ejemplo, halometoxi o haloetoxi tal como difluorometoxi o trifluorometoxi, tiol, o alquiltio C_{1-6}, por ejemplo, metiltio o etiltio. Ejemplos particulares de grupos espaciadores sustituidos incluyen aquellas cadenas específicas ya descritas sustituidas por uno, dos o tres átomos de halógeno tal como átomos de flúor, por ejemplo, cadenas del tipo -CH(CF_{3})-, -C(CF_{3})_{2}-,
-CH_{2}CH(CF_{3})-, -CH_{2}C(CF_{3})_{2}-, -CH(CF_{3})- y -C(CF_{3})_{2}CH_{2}-.

Los grupos espaciadores cicloalifáticos opcionalmente sustituidos en la cabeza catiónica (1) incluyen grupos cicloalifáticos C_{3-10} opcionalmente sustituidos. Los ejemplos particulares incluyen: grupos cicloalquileno C_{3-10}, por ejemplo, cicloalquileno C_{3-7}, cicloalquenileno C_{3-10}, por ejemplo, cicloalquenileno C_{3-7} o cicloalquinileno C_{3-10}, por ejemplo, cicloalquinileno C_{3-7} opcionalmente sustituidos.

Los ejemplos particulares de grupos espaciadores cicloalifáticos incluyen: grupos ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno, cicloheptileno, 2-ciclobuten-1-fileno, 2-ciclopenten-1-ileno y 3-ciclopenten-1-ileno opcionalmente sustituidos.

Los grupos espaciadores heterocicloalifáticos opcionalmente sustituidos incluyen los grupos cicloalifáticos opcionalmente sustituidos ya descritos pero conteniendo además con cada grupo uno, dos, tres o cuatro heteroátomos o grupos L^{2} que contienen heteroátomo tal como ya se han definido.

Los sustituyentes opcionales que pueden estar presentes en los grupos espaciadores cicloalifáticos o heterocicloalifáticos incluyen uno, dos, tres o más sustituyentes seleccionados entre: átomos de halógeno, grupos alquilo C_{1-6}, por ejemplo, metilo o etilo, haloalquilo C_{1-6}, por ejemplo, halometilo o haloetilo tal como difluorometilo o trifluorometilo, hidroxilo, alcoxi C_{1-6}, por ejemplo, metoxi o etoxi, haloalcoxi C_{1-6}, por ejemplo, halometoxi o haloetoxi tal como difluorometoxi o trifluorometoxi, tiol o alquiltio C_{1-6}, por ejemplo, metilito o etiltio.

Los grupos espaciadores aromáticos opcionalmente sustituidos incluyen, por ejemplo, grupos aromáticos C_{6-12} monociclicos, tal como fenileno opcionalmente sustituido.

Los grupos espaciadores heteroaromáticos opcionalmente sustituidos, incluyen, por ejemplo, grupos heteroaromáticos C_{1-9} monociclicos opcionalmente sustituidos que contienen, por ejemplo, uno, dos, tres o cuatro heteroátomos seleccionados entre átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno. Los grupos heteroaromáticos monocíclicos incluyen, por ejemplo, grupos heteroaromáticos de cinco o seis miembros que contienen uno, dos, tres o cuatro heteroátomos seleccionados entre átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno.

Sustituyentes opcionales que pueden estar presentes en los grupos espaciadores aromáticos o heteroaromáticos incluyen uno, dos, tres o más sustituyentes seleccionados entre los ya descritos en relación con los grupos espaciadores cicloalifáticos y heterocicloalifáticos.

En una preferencia general cada grupo espaciador en la cabeza catiónica (1) es preferiblemente una cadena de alquileno C_{1-6} recta o ramificada opcionalmente sustituida. Las cadenas particularmente útiles incluyen: -(CH_{2})_{2}-, -(CH_{2})_{3}- y -(CH_{2})_{4}-.

La cadena principal hidrófoba (2) en los lípidos de acuerdo con la invención puede comprender una o más cadenas de hidrocarburo. Cada hidrocarburo puede ser, por ejemplo, una cadena alifática o heteroalifática, recta o ramificada, opcionalmente sustituida que contiene un mínimo de diez hasta un máximo de alrededor cien átomos unidos en cadena tal como se describe a continuación con más detalle. El hidrocarburo puede estar unido o bien directa o indirectamente a través de un átomo o grupo conector a la cabeza catiónica (1). Ejemplos particulares de grupos conectores adecuados son los representados por el grupo L^{1} descritos a continuación.

Al menos un heteroátomo que retiene carga positiva (tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria) en un centro catiónico en los lípidos de la invención está covalentemente unido a una cadena de hidrocarburo de la cadena principal hidrófoba (2). Si se desea además se puede unir cualquier otro heteroátomo adecuado que retenga carga positiva en el mismo o en cualquier otro centro catiónico a la misma u otras cadenas de hidrocarburo que componen la cadena principal (2). Sin embargo, generalmente es preferible unir la cadena principal (2) y la cabeza catiónica (1) en un heteroátomo que retiene carga positiva en un centro catiónico. Por tanto, una clase preferida de lípidos de acuerdo con la invención tiene una o dos cadenas de hidrocarburo tal como las ya descritas indirectamente unidas a través de un átomo o grupo conector a un heteroátomo que retiene carga positiva en un centro catiónico en la cabeza catiónica (1).

Cada unidad de cola en la cola hidrófila (3) puede estar unida directa o indirectamente a través de un átomo o grupo conector a una cadena de hidrocarburo de la cadena principal de hidrocarburo (2). El punto de unión puede ser cualesquiera en la cadena de hidrocarburo con tal de que sea al menos diez átomos unidos en cadena (es decir, al menos diez átomos a lo largo de la cadena, excluyendo ramificaciones) a partir del átomo de carbono terminal que conecta la cadena de hidrocarburo de la cadena principal hidrófoba (2) a la cabeza catiónica (1). En una preferencia general el punto de unión puede estar en un átomo de carbono terminal de una cadena de hidrocarburo distal al átomo de carbono de la cadena unido a la cabeza catiónica (1).

Un grupo particularmente útil de lípidos de acuerdo con la invención se puede representar por la fórmula (1):

(1)[R^{1}]_{m}-(L^{1})_{n}-R^{2}

en la que

R^{1} es una cadena de hidrocarburo opcionalmente sustituida por una o más unidades finales seleccionadas entre polioles sintéticos, polioles que se dan en la naturaleza, poli(óxidos de alquileno) y derivados de los mismos, con tal de que al menos una cadena de hidrocarburo R^{1} esté sustituida por al menos una de dicha unidad de cola y que cada dicha unidad de cola esté unida a la cadena de hidrocarburo para conseguir que al menos un átomo unido a la cadena de diez se coloque a lo largo de la cadena entre la unidad de cola y el grupo -(L^{1})_{n}-R^{2};

"m" es un número entero entre 1 y 6;

L^{1} es un átomo o grupo conector;

"n" es cero o el número entero 1;

R^{2} es un grupo alifático, cicloalifático, heteroalifático, heterocicloalifático, aromático o heteroaromático opcionalmente sustituido que contiene dos o más centros catiónicos, de modo que cada grupo [R^{1}]_{m}-(L^{1})_{n}- está unido a un heteroátomo que retiene carga positiva en un centro catiónico en R^{2};

y sus sales, solvatos e hidratos.

En los compuestos de fórmula (1), el grupo alifático, cicloalifático, heteroalifático, heterocicloalifático, aromático o heteroaromático opcionalmente sustituido representado por R^{2} puede ser un grupo alifático C_{1-30}, cicloalifático C_{3-10}, heteroalifático C_{1-30}, heterocicloalifático C_{3-10}, aromático C_{8-12} o heteroaromático C_{1-9} opcionalmente sustituido, que contiene dos o más centros catiónicos. Los ejemplos particulares de tales grupos incluyen los anteriormente descritos general y específicamente en relación con los grupos espaciadores presentes en la cabeza catiónica (1) con la presencia adicional de uno o más centros catiónicos tal como se han definido en la presente memoria.

En general, en los lípidos de la invención cuando la cadena principal hidrófoba (2) y la cabeza catiónica (1) están indirectamente unidas por un átomo o grupo conector, tal como el representado por L^{1} en los compuestos de fórmula (1) cuando "n" es 1, entonces el grupo o átomo conector puede ser cualquier grupo o átomo multivalente. Los ejemplos particulares de átomos o grupos conectores adecuados incluyen aquellos de fórmula -(Alk^{1})_{r}(X^{1})_{s}(Alk^{2})_{t}- en la que X^{1} es un átomo de -O- o -S- o un grupo -C(O)-, -C(O)O-, -C(S)-, -S(O)-, -S(O)_{2}, -N(R^{3})- [en el que R^{3} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo recto o ramificado tal como un grupo metilo o etilo o una cadena -Alk^{1}X^{1}-],
-CON(R^{3})-, -OC(O)N(R^{3})-, -CSN(R^{3})-, -N(R^{3})CO-, -N(R^{3})C(O)O-, -N(R^{3})CS-, -S(O)N(R^{3})-, -S(O)_{2}N(R^{3})-, -N(R^{3})S(O)-, -N(R^{3})S(O)_{2}-, -N(R^{3})CON(R^{3})- o -N(R^{3})SO_{2}N(R^{3})- [si cualquiera de estos grupos contiene dos sustituyentes R^{3}, estos pueden ser los mismos o diferentes]; Alk^{1} y Alk^{2}, los cuales pueden ser los mismos o diferentes son cada uno una cadena de alquileno C_{1-6}, alquenileno C_{2-6} o alquinileno C_{2-6} recta o ramificada, opcionalmente sustituida, opcionalmente interrumpida o terminada por uno o más, por ejemplo, uno, dos o tres, grupos carbociclicos o heterocarbocíclicos y/o heteroátomos o grupos que contiene heteroátomo X^{1} tal como los ya definidos, y "r", "s" y "t", los cuales pueden ser los mismos o diferentes, son cada uno cero o el número entero 1, con tal de que si uno de "r", "s" o "t" es cero al menos uno de los restantes es el número entero 1.

Los grupos carbociclicos que pueden interrumpir los grupos Alk^{1} y Alk^{2} incluyen, por ejemplo: grupos cicloalquilo C_{4-8} opcionalmente sustituidos, por ejemplo, grupos ciclopentilo o ciclohexilo opcionalmente sustituidos, o cicloalquenilo C_{4-8} opcionalmente sustituidos, por ejemplo, grupos ciclopentenilo o ciclohexenilo opcionalmente sustituidos. Los grupos heterocarbocíclicos incluyen, por ejemplo, grupos carbocíclicos de los tipos ya mencionados que contienen uno o más heteroátomos o grupos que contienen heteroátomo X^{1} tal como los anteriormente definidos. Los sustituyentes opcionales que pueden estar presentes en las cadenas representadas por Alk^{1} y Alk^{2} y los grupos carbocíclicos o heterocarbocíclicos que pueden interrumpirlas o terminarlas incluyen uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre: átomos de halógeno, por ejemplo, átomos de flúor, cloro, bromo o yodo o alquilo C_{1-3}, por ejemplo, grupos metilo o etilo, o alcoxi C_{1-3}, por ejemplo, grupos metoxi o etoxi.

Se apreciará que el átomo o grupo conector será al menos divalente en el caso en el que una cadena de hidrocarburo en la cadena principal hidrófoba (2) esté unida a él. Si se desea unir más de una cadena de hidrocarburo al agente conector éste necesitará ser seleccionado con una valencia apropiada y esto generalmente significará que al menos uno de Alk^{1} o Alk^{2} necesitará estar presente en una forma ramificada y con el número requerido de átomos o grupos X^{1} para conseguir el acoplamiento deseado.

Los ejemplos particulares de grupos conectores incluyen: grupos de fórmula -X^{1}Alk^{2}- en los que X^{1} es tal como se ha definido anteriormente y Alk^{2} es una cadena -CH_{2}-, -(CH_{2})_{2}-, -(CH_{2})_{3}, (CH_{2})_{4}-, -(CH_{2})_{5}- ó - (CH_{2})_{6}- opcionalmente sustituida; grupos de fórmula [X^{1}]_{2}Alk^{1}X^{1}Alk^{2} en la que Alk^{1} es un grupo -CH_{2}CH< y X^{1} y Alk^{2} son tal como ya se han definido o un grupo de fórmula [X^{1}]_{2}Alk^{1}Alk^{2} en la que X^{1}, Alk^{1} y Alk^{2} son tal como ya se han definido.

Cada cadena de hidrocarburo en la cadena principal hidrófoba (2) de los lípidos de acuerdo con la invención y la representada por R^{1} en compuestos de fórmula (1) puede ser una cadena de hidrocarburo C_{10} hasta aproximadamente C_{60}, por ejemplo, una cadena de hidrocarburo C_{16} a C_{60} tal como una cadena de hidrocarburo C_{18} a C_{48}.

En concreto, la cadena puede ser una cadena alifática C_{10-60} opcionalmente sustituida tal como una cadena de alquileno C_{10-60}, alquenileno C_{10-60} o alquinileno C_{10-60} recta o ramificada, opcionalmente sustituida. Los sustituyentes opcionales que pueden estar presentes en tales cadenas incluyen: uno o más átomos de halógeno, por ejemplo, átomos de flúor, cloro, bromo o yodo, o grupos haloalquilo C_{1-8}, por ejemplo, grupos -CF_{3}. Si se desea cada cadena de alquileno, alquenileno o alquinileno puede estar interrumpida por uno o más átomos de oxígeno o azufre o grupos cicloalquilo C_{5-7}, por ejemplo, ciclopentilo o ciclohexilo, cicloalquenilo C_{5-7}, por ejemplo, ciclopentenilo o ciclohexenilo, -C(O)-, -C(S)-, -C(O)N(R^{3})-, -C(S)N(R^{3})-, -N(R^{3})C(O)-, -N(R^{3})C(S)-, -C(O)O-, -C(O)S-, -OC(O)N(R^{3})-, -S(O)-, -S(O_{2})-, -S(O)N(R^{3})-, -S(O)_{2}N(R^{3})-, -N(R^{3})S(O)-, -N(R^{3})S(O)_{2}-, -N(R^{3})C(O)N(R^{3})-, -N(R^{3})C(S)N(R^{3})-, -N(R^{3})S(O)N(R^{3})- o -N(R^{3})S(O)_{2}N(R^{3}) - opcionalmente sustituidos. Los sustituyentes opcionales que pueden estar presentes en los grupos cicloalquilo o cicloalquenilo de este tipo incluyen uno o más átomos de halógeno o grupos haloalquilo tal como los ya descritos. Se apreciará que cuando la cadena de hidrocarburo en la cadena principal hidrófoba (2) es una cadena de alquenileno o alquinileno puede tener más de un grupo insaturado.

Las unidades finales de poliol adecuadas son polioles que se dan en la naturaleza tal como azúcares acíclicos y derivados de los mismos y polioles sintéticos. Azúcares particulares incluyen mono- y oligosacáridos acíclicos. Los derivados de azúcar incluyen glucósidos acíclicos en los cuales un grupo alifático o heteroalifático no iónico (por ejemplo, del tipo descrito en la presente memoria) está unido a un azúcar por un enlace glucosídico. Los monosacáridos acíclicos incluyen, por ejemplo, compuestos de cadena abierta que contienen de tres a ocho, por ejemplo, cinco o seis, átomos de carbono y al menos dos sustituyentes hidroxilo. Los oligosacáridos acíclicos incluyen, por ejemplo, al menos dos monosacáridos de cadena abierta tal como ya se han definido unidos juntos por un enlace glucosidico. Más de un tipo de monosacárido de cadena abierta puede estar presente para producir un homo- o heterooligosacárido.

Si no, la unidad de cola puede ser un poli(óxido de alquileno) o derivado del mismo, tal como poli(óxido de etileno), poli(óxido de propileno) o metoxi poli(óxido de etileno).

Cada unidad de cola puede estar unida directa o indirectamente a una cadena de hidrocarburo en la cadena principal hidrófoba (2). Para el enlace indirecto se puede emplear un átomo o grupo conector, por ejemplo, un átomo o grupo L^{3} en el que L^{3} es tal como se ha definido anteriormente para el átomo o grupo conector L^{1}. Si el grupo L^{3} es multivalente, por ejemplo, cuando es un cadena de alquileno ramificada que contiene más de un átomo o grupo X^{1}, se puede unir a él más de un hidrocarburo hidrófilo.

Un grupo particularmente útil de compuestos de acuerdo con la invención tiene la fórmula (1a):

(1a)[R^{7}]_{p}-(L^{3})_{q}-[R^{6}]_{m}-(L^{1})_{n}-R^{2}

en la que

R^{2}, L^{1}, "m" y "n" son tal como se han definido para la fórmula (1) ;

R^{6} es una cadena de hidrocarburo;

L^{3} es un átomo o grupo conector;

R^{7} es una unidad de cola seleccionada entre polioles sintéticos, polioles que se dan en la naturaleza, poli(óxidos de alquileno) y derivados de los mismos;

"q" es cero o un número entero entre uno y seis;

"p" es un número entero entre uno y seis;

con tal de que cada grupo R^{7} o L^{3}, si están presentes, estén unidos a un grupo R^{6} para conseguir que al menos un átomo unido a la cadena de diez se coloque a lo largo de R^{6} entre R^{7} o L^{3} y el grupo -(L^{1})_{n}-R^{2};

y sus sales, solvatos e hidratos.

En los compuestos de fórmula (1a) la cadena de hidrocarburo representada por R^{6} puede ser una cadena de hidrocarburo C_{10} hasta aproximadamente C_{60} tal como generalmente y más particularmente se ha descrito anteriormente en relación con el grupo R^{1}. El grupo L^{3} puede ser un átomo o grupo conector tal como ya se ha definido.

La cabeza catiónica (1) en los lípidos de acuerdo con la invención preferiblemente será un grupo R^{2} tal como se ha descrito anteriormente en relación con los compuestos de fórmulas (1) y (1a). En los grupos de este tipo, R^{2} es preferiblemente un grupo -WSp^{1}[WSp^{2}]_{b}WSp^{3} o -WSp^{1}[WSp^{2}]_{b}WH en el cual Sp^{1}, Sp^{2} y Sp^{3}, los cuales pueden ser los mismos o diferentes, son cada uno un grupo espaciador tal como los definidos anteriormente, "W" es un centro catiónico tal como el definido en la presente memoria y "b" es cero o un número entero entre uno y seis.

En grupos particulares de este tipo, el centro catiónico "W" es preferiblemente un grupo -NH-. Sp^{1}, Sp^{2} y Sp^{3}, los cuales pueden ser los mismos o diferentes, son cada uno preferiblemente una cadena de alquileno C_{1-6} opcionalmente sustituida. "b" es preferiblemente un número entero entre dos y cuatro.

Cabezas catiónicas (1) particularmente útiles en los compuestos de la invención incluyen las de fórmula -NH[Sp^{1}NHSp^{2}]NH_{2}, -NH[Sp^{1}NHSp^{2}NHSp^{2}]NH_{2} o -NH[Sp^{1}NHSp^{2}NHSp^{2}]NHCH_{3} en las que cada grupo Sp^{1} y Sp^{2} es el mismo o diferente y es un cadena de alquileno C_{1-6} opcionalmente sustituida, particularmente en las que Sp^{1} es -CH_{2}- y cada Sp^{2} es -(CH_{2})_{3}- o -(CH_{2})_{4}-.

En general, en los lípidos de acuerdo con la invención la cadena principal hidrófoba (2) comprende preferiblemente dos o, especialmente una cadena de hidrocarburo tal como se ha definido en la presente memoria. Por tanto, "m" en las fórmulas (1) y (1a) es preferiblemente un número entero 2 o, especialmente, un número entero 1. Cada cadena de hidrocarburo, por ejemplo, como la representada por R^{1} y R^{6} en las fórmulas (1) y (1a) respectivamente, es preferiblemente lineal y, en concreto, es una cadena de alquileno C_{16-38} opcionalmente sustituida y lineal. Las cadenas de alquileno C_{18-24} opcionalmente sustituidas son particularmente útiles.

En general, cada cadena de hidrocarburo en la cadena principal hidrófoba (2) preferiblemente está unida indirectamente a la cabeza catiónica (1) a través de un átomo o grupo conector. El átomo o grupo conector puede ser, por ejemplo, un átomo o grupo L^{1} tal como se ha definido en la presente memoria y, por tanto, en los compuesto de fórmulas (1) y (1a), por ejemplo, "n" es preferiblemente el número entero 1.

Agentes conectores preferidos incluyen los de fórmula -X^{1}Alk^{2}- o -[X^{1}]_{2}Alk^{1}X^{1}Alk^{2}- en los que X^{1}, Alk^{1} y Alk^{2} son tal como se han definido previamente. Agentes conectores particularmente útiles de estos tipos son aquellos en los que Alk^{2} es una cadena -(CH_{2})_{4}-, -(CH_{2})_{5}- o, especialmente, -(CH_{2})_{6}. X^{1} en estos agentes conectores es preferiblemente un grupo -CONH-. Alk^{1}, si está presente, es preferiblemente una cadena -CH_{2}-CH<.

En otra preferencia general cada cadena de hidrocarburo en la cadena principal de hidrocarburo (2) tiene dos, o especialmente una, unidad de cola unida a ella. Cada unidad de cola está preferiblemente unida al átomo de carbono terminal de la cadena de hidrocarburo distal al átomo de carbono de la cadena unido a la cabeza catiónica (1). Preferiblemente la cadena de hidrocarburo e hidrocarburo hidrófilo están indirectamente unidas a través de un átomo o grupo conector. Por tanto, en una preferencia particular en los compuestos de fórmula (1a) "q" es el número entero 1 y "p" es el número entero 1 ó 2.

En los compuesto de este tipo y en general el grupo L^{3} puede ser preferiblemente un átomo o grupo -X^{1}-,
-X^{1}Alk^{1}X^{1}- o -[X^{1}Alk^{1}]_{2}X^{1}Alk^{2}X^{1}-. Los grupos L^{3} particularmente útiles incluyen los grupos -NHCO-, -CONH-, -CONH(CH_{2})_{2}NHCO- o -[CONH(CH_{2})_{2}-]_{2}NCO(CH_{2})_{2}CONH-.

Lípidos particularmente útiles de acuerdo con la invención son los descritos en los Ejemplos de más adelante.

Los lípidos de acuerdo con la invención generalmente se pueden preparar mediante el acoplamiento de cabezas catiónicas apropiadamente sometidas a funcionalización (1), hidrocarburos hidrófobos (2) y tramos finales hidrófilos (3) en un orden predeterminado. Se pueden emplear técnicas estándar de acoplamiento químico utilizando materiales de partida que contienen uno o más grupos funcionales reactivos tales como ácidos, tioácidos, anhídridos, haluros de ácido, ésteres, imidas, aldehídos, cetonas, alcoholes y aminas. En los Ejemplos de más adelante se describen en detalle reacciones ilustrativas para la preparación de un número de lípidos de acuerdo con la invención y estos fácilmente se pueden adaptar usando diferentes materiales de partida para proporcionar otros compuestos de la invención.

Por tanto, en un enfoque general primero se puede acoplar una cadena de hidrocarburo homo- o heterobifuncional a una cola hidrófila o cabeza catiónica y el producto resultante se acopla cuando sea necesario al componente restante para proporcionar el lípido de la invención.

La cadena de hidrocarburo homo- o heterobifuncional puede ser cualquier cadena de hidrocarburo descrita en la presente memoria que contenga dos grupos funcionales reactivos diferentes de los tipos ya descritos. Los grupos particularmente útiles incluyen ácidos y tioácidos y derivados reactivos de los mismos y aminas. Estos se pueden usar para participar en las reacciones de acilación o tioacilación para acoplar la cadena de hidrocarburo a una amina o ácido cuando sea apropiado en cualquier cola hidrófila adecuada y/o cabeza catiónica.

La acilación o tioacilación se puede conseguir usando condiciones estándar para las reacciones de este tipo. Por tanto, por ejemplo, la reacción se puede llevar a cabo en un disolvente, por ejemplo, un disolvente orgánico inerte tal como una amida, por ejemplo, una amida sustituida tal como dimetilformamida, un éter, por ejemplo, un éter cíclico tal como tetrahidrofurano, o un hidrocarburo halogenado tal como diclorometano, a una temperatura entre alrededor la temperatura ambiente y la temperatura de reflujo, opcionalmente en presencia de una base tal como una amina, por ejemplo, trietilamina, o una amina cíclica, tal como 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec7-eno, piridina, dimetilaminopiridina o N-metilmorfolina.

Si se usa un ácido la acilación se puede realizar además en presencia de un agente de condensación, por ejemplo, una diimida tal como 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida o N,N'-diciclohexilcarbodiimida, de manera ventajosa en presencia de un catalizador tal como un compuesto N-hidroxi, por ejemplo, una N-hidroxitriazola tal como 1-hidroxibenzotriazola o una N-hidroxiimida tal como N-hidroxisuccinimida. Si no, se puede hacer reaccionar el ácido con un cloroformato, por ejemplo, etilcloroformato, antes de la reacción con la amina.

En la cadena de hidrocarburo heterobifuncional uno de los grupos funcionales reactivos puede que necesite estar en una forma protegida antes de cualquier reacción de acoplamiento para evitar su participación no deseada en la reacción. Igualmente otros grupos funcionales cuando están presentes en la cadena de hidrocarburo, o los intermediarios usados para generar la cola hidrófila y/o la cabeza catiónica puedan necesitar estar en una forma protegida antes de que se puedan usar estos reactivos. Se pueden usar grupos protectores convencionales de acuerdo con la práctica estándar [véase, por ejemplo, Green, T. W., en "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1991 y los ejemplos de más adelante].

Las cadenas de hidrocarburo heterobifuncionales adecuadas son o bien materiales conocidos, fácilmente disponibles o se pueden obtener mediante síntesis usando técnicas convencionales, por ejemplo, como las descritas en los Ejemplos de más adelante. Por tanto, generalmente una cadena de hidrocarburo heterobifuncional de cualquier longitud deseada se puede sintetizar en una o más reacciones usando apropiadamente cadenas más cortas sometidas a funcionalización. Por tanto, en un ejemplo se puede hacer reaccionar un aldehído de cadena más corta con una sal de fosfonio de cadena más corta para producir una olefina de cadena más larga de la longitud deseada. En este ejemplo particular se puede llevar a cabo la reacción en presencia de una base, por ejemplo, una base organometálica tal como un compuesto de organolítio, un hidruro tal como hidruro de sodio o potasio o un alcóxido tal como un alcóxido de sodio, por ejemplo, metóxido de sodio. La reacción se puede realizar en un disolvente adecuado, por ejemplo, un disolvente aprótico polar tal como un sulfóxido de alquilo, por ejemplo, dimetilsulfóxido a una temperatura baja, por ejemplo alrededor de 0ºC. El aldehído y la sal de fosfonio de partida se pueden obtener a partir de alcoholes y haluros de partida conocidos respectivamente usando procedimientos convencionales. Si se desea, la olefina obtenida anteriormente se puede someter a hidrogenación usando hidrógeno y un catalizador, por ejemplo, catalizador de Pearlman, para producir la correspondiente cadena de hidrocarburo saturado.

Si se desea obtener cadenas de hidrocarburo que contengan uno o más heteroátomos o grupos que contienen heteroátomo éstas se pueden sintetizar a partir de cadenas más pequeñas que contienen grupos funcionales que se pueden acoplar químicamente, por ejemplo, mediante acilación o tioacilación tal como se ha descrito anteriormente de manera general.

Los tramos finales hidrófilos sometidos a funcionalización adecuados o las cabezas catiónicas para el acoplamiento a la cadena de hidrocarburo heterobifuncional o bien están fácilmente disponibles o se pueden sintetizar a partir de materiales conocidos mediante métodos convencionales, por ejemplo, tal como los descritos en los Ejemplos de más adelante.

Las propiedades ventajosas de los lípidos de acuerdo con la invención se pueden demostrar usando los ensayos a pequeña escala descritos más adelante en los Ejemplos. En estos los lípidos se pueden mostrar eficazmente para compactar cualquier sustancia bioactiva, y para auto ensamblarse con la sustancia en disolución acuosa para producir complejos estables que se mantienen asociados sobre amplios intervalos de pH y fuerza fónica y que repartirán eficazmente la sustancia a células eucariotas.

Por tanto, se puede esperar que los lípidos sean de uso para el reparto de sustancias bioactivas a las células, particularmente células eucariotas, in vitro y especialmente in vivo. Por tanto, usos generales particulares para los cuales se pueden utilizar los lípidos incluyen el reparto de sustancias bioactivas a células en cultivo, y en medicina humana el reparto de agentes terapéuticos o de diagnóstico, o agentes que pueden generar una respuesta inmune del hospedante para vacuna u otros propósitos inmunomoduladores. Los lípidos particularmente son muy apropiados para el reparto de polianiones bioactivos, especialmente ácidos nucleicos y son de uso particular para modificar un genotipo del hospedante o su expresión.

Por tanto, en otro aspecto de la invención proporcionamos un complejo lipidico caracterizado porque comprende un lípido bipolar de acuerdo con la invención en asociación con al menos una sustancia bioactiva.

En los complejos de acuerdo con la invención, cada sustancia bioactiva puede ser, por ejemplo, un agente farmacológicamente activo, un agente de diagnóstico o cualquier agente capaz de modificar el genotipo y/o fenotipo de una célula.

Ejemplos particulares de tales sustancias incluyen: proteínas bioactivas, péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos incluyendo polinucleótidos, oligonucleótidos sintéticos y derivados de los mismos, lípidos, glucolípidos, lipoproteinas, lipopolisacáridos y fracciones víricas, bacterianas, protozoicas, celulares o de tejido.

Si se desea, los complejos de acuerdo con la invención pueden contener dos o más lípidos bipolares diferentes de la invención. Las mezclas especialmente útiles incluyen aquellas que contienen dos o más lípidos bipolares de la invención que difieren uno de otro en la naturaleza de la cola hidrófila presente en cada uno. La proporción de cada lípido en los complejos de este tipo se puede manipular para obtener complejos con diferentes propiedades físico-químicas, por ejemplo, la carga de superficie total y/o el tamaño de partícula, adaptadas para cumplir con el uso deseado del complejo. Por tanto, por ejemplo, en un complejo lipidico ventajoso que contiene dos o más lípidos bipolares, uno de los lípidos tiene una cola hidrófila formada por un poli(óxido de alquileno) o un derivado del mismo tal como se ha definido en la presente memoria, mientras que cada uno de los otros tiene una cola hidrófila formada por un poliol sintético o que se da en la naturaleza tal como se ha descrito previamente. Se puede variar la proporción del primer lípido que contiene poli(óxido de alquileno) en tales complejos para que la relación molar entre el primer lípido y el segundo y otros lípidos esté entre 1:10.000 y 1:1, ventajosamente entre alrededor 1:1.000 y alrededor 1:20, especialmente alrededor 1:10. Se pueden obtener complejos de estos tipos, particularmente cuando el poli(óxido de alquileno) es poli(óxido de etileno), los cuales ventajosamente tienen carga de superficie cero y no se juntan cuando se dejan en disolución y los cuales además son capaces de compactar una sustancia bioactiva para dar partículas pequeñas de 150 nm e inferior, particularmente 100 nm e inferior, especialmente alrededor de 80-85 nm.

Los lípidos de acuerdo con la invención particularmente son muy apropiados para el reparto de polianiones a células y, por tanto, los complejos lipídicos preferidos de la invención incluyen complejos lípido-polianión en los cuales el polianión puede ser cualquiera de las sustancias bioactivas anteriormente mencionadas que poseen una carga negativa neta. Los polianiones particulares incluyen ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN o ARN de cadena sencilla o doble, circular o sobreenrrollado y derivados de los mismos. Si se desea el ADN puede ser parte de una estructura tal como un plásmido.

Los complejos lipídicos en general comprenderán un lípido de acuerdo con la invención y una sustancia bioactiva en una relación de peso de alrededor 0,1:1 a alrededor 100:1, por ejemplo, de alrededor 1:1 a alrededor 50:1. Los complejos se pueden formar como líquidos, mezclando inicialmente uno o más lípidos bipolares de acuerdo con la invención, y una sustancia bioactiva a la vez de manera ventajosa en un disolvente acuoso usando procedimientos convencionales. Si se desea el disolvente se puede retirar, por ejemplo, mediante liofilización, para obtener un complejo lipídico sólido.

Si se desea los complejos lipídicos pueden ser complejos lipídicos diana en los cuales el complejo lipídico está ensamblado con una o más, particularmente una, moléculas diana, y la invención incluye tales ensamblajes. La molécula diana puede ser, por ejemplo, un miembro de un par de unión complementario, estando presente el otro miembro del par en un mamífero, por ejemplo ser humano, u otro animal, insecto, hospedante microbiano o vegetal o bien unido a una membrana celular o a otra superficie celular o en forma soluble y presente intracelular y/o extracelularmente. Por tanto, en general, la molécula diana puede ser un péptido, incluyendo un glucopéptido, un polipéptido, proteína, incluyendo una glucoproteína o fosfoproteína, un carbohidrato, glucolípido, fosfolípido, oligonucleótido, polinucleótido u otra molécula orgánica, por ejemplo, una vitamina, que pueda unirse específicamente a un receptor, ligando, antígeno u otra molécula orgánica que se de en la naturaleza o sintética.

La afinidad de unión de la molécula diana por el otro miembro del par complementario será al menos 10^{-5} M, preferiblemente 10^{-7} M y superior, por ejemplo, de alrededor 10^{-8} M a alrededor 10^{-12} M. Preferiblemente la molécula diana será selectiva para el otro miembro del par y no interaccionará aunque la especificidad absoluta no es esencial. Ventajosamente la interacción de la molécula diana con su ligando conduce al reparto del complejo lipídico al interior celular.

Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno y derivados de los mismos tales como Fab, Fab' y fragmentos F_{v} de cadena sencilla forman una clase particular de moléculas diana adecuadas. Provechosamente el anticuerpo es un anticuerpo completo, particularmente un anticuerpo IgG, o un Fab, Fab' o F_{v} de cadena sencilla del mismo. Ventajosamente el anticuerpo, fragmento o derivado es un anticuerpo, fragmento o derivado de interiorización.

Otros ejemplos de moléculas diana adecuadas incluyen: moléculas miméticas de anticuerpo producidas mediante medios combinacionales u otros medios sintéticos; interferones, por ejemplo, interferones \alpha, \beta y \gamma; factores de necrosis tumoral \alpha y \beta; interleuquinas, por ejemplo, interleuquinas 1 a 15; quimiocinas, por ejemplo, MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES; factores de crecimiento, por ejemplo, PDGF, VEGF, EGF, TGF\alpha, TBF\beta, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, FGF, IGF, bombesinas, trombopoyetina, eritropoyetina, oncostatina y endotelina 1; hormonas peptídicas, por ejemplo, LH, FSH, TRH, TSH, ACTH, CRH, PRH, MRH, MSH, glucagón y prolactina; transferrina; lactoferrina; angiotensina; histamina; insulina; lectinas; inhibidor tisular de metaloproteinasas, por ejemplo, TIMP-1, TIMP-2 y TIMP-3; apolipoproteínas, por ejemplo, apolipoproteina E; cininas; y vitaminas, por ejemplo, ácido fólico y vitamina B12. Se pueden usar fragmentos y otros análogos sintéticos de estas moléculas, cuando éstas retienen o tienen la apropiada acción de unión selectiva. Se apreciará que la anterior lista no es exhaustiva y se puede ampliar para incluir otras moléculas de unión que se dan en la naturaleza, incluyendo, por ejemplo, el compañero de unión complementario o un fragmento
de unión del mismo, de cada una de las mencionadas, por ejemplo, el receptor de PDGF, el receptor de VEGF, etc.

Igualmente, se pueden usar en la invención como moléculas diana las moléculas de adhesión y sus parejas de unión o fragmentos de unión de los mismos. Los ejemplos particulares incluyen: VLA-4, VMAC-1, fibronectina, LFA-1, MAC-1, ICAM-1, ICAM-2, lewis X, GMP-140, ELAM-1, S-Lewis X, fibrinógeno, GPIIb/IIIa, CD28, B7, CD40, CD402L, CD4, laminina, VLA-1, VLA-2, VLA-3 y VLA-6.

Otros ejemplos de moléculas diana adecuadas incluyen monosacáridos y oligosacáridos tales como galactosa, lactosa y mannosa.

La molécula diana puede estar presente en el complejo lipídico diana o bien asociada no covalentemente o unida covalentemente a un lípido bipolar de la invención o a cualquier otro lípido u otro componente que pueda estar presente como parte de una formulación como la descrita a continuación. Se pueden obtener complejos lipídicos diana unidos covalentemente acoplando juntas una molécula diana y un lípido bipolar u otro u otro componente usando técnicas de acoplamiento químico estándar y grupos funcionales apropiados presentes en los materiales de partida, por ejemplo, como los descritos anteriormente para la preparación de los lípidos bipolares de la invención.

Los complejos lipídicos de acuerdo con la invención incluyendo los complejos lipídicos diana, se pueden formular con otros materiales tales como otro u otros lípidos u otros vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables y la invención incluye tales composiciones. En este aspecto de la invención el "otro" lípido puede ser seleccionado, por ejemplo, entre cualquier lípido neutro y/o catiónico conocido, por ejemplo, seleccionado entre los descritos en la presente invención en la introducción a su memoria y también incluyendo especialmente DOPE y otros derivados del colesterol tal como el hemisuccinato de colesterol. Las formulaciones particularmente útiles de este tipo son aquellas en las que el lípido bipolar de la invención tiene una cola de poli(óxido de alquileno), especialmente una cola de poli(óxido de etileno).

Las composiciones particulares incluyen formulaciones liposomales, preparadas usando tecnología liposomal convencional. De otra manera, las composiciones pueden tomar cualquier otra forma adecuada para la administración oral, bucal, parenteral, nasal, local o rectal, o una forma adecuada para la administración por inhalación o insuflación.

Para la administración oral, las composiciones pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos, pastillas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como los agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); rellenos (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogeno fosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Los comprimidos se pueden revestir mediante métodos muy conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, disoluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para la constitución con agua u otro vehiculizante adecuado antes de usarlo. Tales preparaciones líquidas se pueden preparar mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehiculizantes no acuosos y conservantes. Las preparaciones también pueden contener sales tampón, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes cuando sea apropiado.

Las preparaciones para la administración oral se pueden formular adecuadamente para proporcionar reparto controlado del compuesto activo.

Para la administración bucal las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

Los complejos de la invención se pueden formular para la administración parenteral mediante inyección, incluyendo la inyección o infusión intravenosa rápida o inyección mediada por partícula. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolla de cristal o recipientes de dosis múltiple, por ejemplo, viales de cristal o un dispositivo que contenga un gas comprimido tal como helio para la administración mediada por partícula. Las composiciones para la inyección o infusión intravenosa rápida puede tomar tales formas como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehiculizantes acuosos o aceitosos, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, estabilizadores, conservantes y/o dispersantes. Si no, el complejo puede estar en forma de polvos para la constitución con un vehiculizante adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógeno, antes de usarlo. Para la administración mediada por partícula el complejo puede estar revestido sobre partículas tales como partículas microscópicas de oro.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los complejos también se pueden formular como una preparación de liberación retardada. Tales formulaciones de actuación a largo plazo se pueden administrar mediante implantación o mediante inyección intramuscular.

Para la administración nasal o administración por inhalación, los complejos se pueden repartir convenientemente en forma de una presentación de vaporización por aerosol para paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de propelantes adecuados, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado o mezcla de gases.

Los complejos pueden, si se desea, estar presentes en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contenga el ingrediente activo. El paquete o dispositivo dispensador puede estar acompañado por instrucciones para la administración.

La cantidad de complejo lipídico requerida para cualquier aplicación particular dependerá en gran medida de la naturaleza de la sustancia bioactiva a repartir. Otro factor importante incluirá si el complejo lipídico está destinado al uso in vitro o in vivo. Si es el último caso la vía de administración y formulación particular elegida así como los factores como la edad y la condición del sujeto regirá la cantidad de complejo lipídico usado. Sin embargo, en general se puede usar hasta alrededor de 50 mg de complejo lipídico por cada kilogramo de peso corporal.

Los siguientes Ejemplos ilustran las invenciones. En los Ejemplos se usan las siguientes abreviaciones: THF-tetrahidrofurano; Bn-bencilo; DMSO-dimetilsulfóxido; DMF-dimetilformamida; LDA-diisopropilamida de litio; Ac-acetilo; MeOH-metanol; DCM-diclorometano; BOC-t-butiloxicarbonilo.

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Los compuestos de la invención preparados en estos Ejemplos se muestran a continuación y se enumeran (14), (19) y (24);

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(14) N-(Aminopropilaminobutilaminopropilaminohexil)-24-(glucuronilamino)tetracosanamida

1

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(19) N-Aminopropilaminobutilaminopropil-N'-glucuronil-1,24-diaminotetracosano

2

(24) N-Aminopropilaminobutilaminopropil-N'-glucuronil-1,36-diaminohexatriacontano

3

(1) Hidrocloruro de 12-aminododecanol

NH_{2}(CH_{2})_{11}CH_{2}OH.HCl

Se hizo una suspensión de ácido 12-aminododecanoico (21,52 g, 100 mmol) en THF (100 cm^{3}) y se añadió complejo borano-THF (500 mmol, disolución 1 M). La reacción se dejó durante la noche y se enfrió con cuidado con metanol antes de la retirada del disolvente. Los residuos se colocaron en suspensión en HCl 1 M (500 cm^{3}) y se calentaron a 40ºC durante 1 hora y se dejaron durante la noche. Se extrajo por filtración el sólido blanco, se lavó con HCl 1 M frío y se cristalizó de nuevo el producto a partir de HCl 1 M. Rendimiento 18,70 g (79%). Pf 120ºC se reblandece, 169ºC líquido.

C_{12}H_{28}N_{1}O_{1}Cl.1/5 H_{2}O requiere C: 59,70%, H: 11,86%, N: 5,80%. Encontrado: C: 59,65%, H: 11,82%, N: 5,76%. C_{12}H_{27}N_{1}O_{1} requiere 201. ES^{+} encontró: MH^{+} 202,1 (100%). \delta_{H} (CD_{3}CO_{2}D) 3,64 (2H, t, CH_{2}O), 3,06 (2H, t, NCH_{2}), 1,73 (2H, m, CH_{2}CH_{2}O), 1,57 (2H, m, NCH_{2}CH_{2}), 1,2-1,5 (16H, m, CH_{2}).

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(2) 12-(Dibencilamino)dodecanol

Bn_{2}N(CH_{2})_{11}CH_{2}OH

Se añadió lentamente bromuro de bencilo (33,7 g, 23,5 cm^{3}, 189,6 mmol) al compuesto 1 (15 g, 63,2 mmol) en suspensión en una mezcla de diclorometano (150 cm^{3}) y carbonato de sodio saturado en agua (150 cm^{3}). Se aclaró la suspensión y se completó la reacción después de 4 horas. Se añadió amoníaco acuoso (0,880, 30 cm^{3}) y la reacción se dejó durante la noche. Se secó la capa orgánica (sulfato de magnesio) y se evaporó hasta sequedad. Los residuos se disolvieron en hexano en reflujo y se cristalizaron a -20ºC hasta rendimiento (18,03 g, 75%).

Pf 45ºC. C_{26}H_{39}N_{1}O_{1} requiere C: 81,84%, H: 10,30%, N: 3,67%. Encontrado: C: 81,64%, H: 10,24%, N:3,54%. C_{26}H_{39}N_{1}O_{1} requiere 381. ES^{+} encontró: MH^{+} 382 (100%). \delta_{H} (CDCl_{3}) 7,1- 7,6 (10H, m, Ar), 3,64 (2H, t, CH_{2}O), 3,56 (4H, s, ArCH_{2}), 2,41 (2H, t, NCH_{2}), 1,1-1,8 (22H, dm, CH_{2}).

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(3) 12-(Dibencilamino)dodecanal

Bn_{2}N(CH_{2})_{11}CHO

Se añadió con cuidado cloruro de oxalilo (2,6 cm^{3}, 30 mmol) en diclorometano (60 cm^{3}) a una disolución de dimetilsulfóxido anhidro (30 mmol, 2,13 cm^{3}) en diclorometano (200 cm^{3}) a -78ºC. Después de 15 minutos se añadió el compuesto 2 (10 g, 26 mmol) en diclorometano (60 cm^{3}) y se agitó la reacción durante 20 minutos a -78ºC. Se añadió gota a gota trietilamina (28 cm^{3}) a la reacción fría. Se formó un precipitado y después de 15 minutos se dejó que la reacción alcanzara la temperatura ambiente. Se añadió agua (100 cm^{3}) a la reacción que se extrajo con diclorometano. Se lavaron las capas orgánicas con agua, se secaron (sulfato de magnesio) y se evaporaron hasta sequedad. El residuo se sometió a cromatografía (SiO_{2}, hexano-acetato de etilo en hexano al 10%) para dar el producto como un aceite (7,97 g, 80%). Este compuesto es inestable y se debería usar en el día de la preparación.

I.R 1.725 cm^{-1} (COH). C_{26}H_{37}NO requiere 379, 29. ES^{+} encontró: MH^{+} 380, 29. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,32 (14H, br, (CH_{2})_{7}
(CH_{2})_{2}N), 1,61 (4H, 2xp, CH_{2}CH_{2}N, CH_{2}CH_{2}CO), 2, 43, 2,44 (4H, 2xt, CH_{2}N, CH_{2}CO), 3,60 (4H, s, CH_{2}Ph), 7,2-7,5 (10H, m, Ph), 9,78 (1H, t, COH). \delta_{c} (CDCl_{3}) 22,0, 26,9, 27,1, 29,0, 29,3, 29,4, 29,5, (9C, (CH_{2})_{9}CH_{2}N), 43,8 (1C, CH_{2}COH), 53,3 (1C, CH_{2}N), 58,2 (2C, CH_{2}Ph), 126,6 (2C, CH(CH)_{2}C), 128,0 (4C, CHC), 128,6 (4C, CHCHC), 140,0 (2C, CCH_{2}N), 202,3 (1C, COH).

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(4) Bromuro de 11-(Carboxiundecil)trifenilfosfonio

4

Se añadió lentamente trifenilfosfina (2,818 g, 10,7 mmol) a ácido 12-bromododecanoico (3,000 g, 10,7 mmol) en suspensión en acetonitrilo (12 cm^{3}). Se calentó la reacción a 100ºC (no condensador) con argón que se echaba sobre el matraz hasta que la reacción era una fusión, a continuación, se mantuvo a 100ºC (con condensador) durante 24 horas. Los residuos templados se disolvieron en acetonitrilo (18 cm^{3}) y se añadieron gota a gota a dietil éter frío (hielo seco) rápidamente agitado. A continuación, el precipitado blanco formado se extrajo por filtración y se secó la sal de fosfonio (5,353 g, 92%).

Pf 110-112ºC. C_{30}H_{38}O_{2}PBr requiere C: 66,54%, H: 7,07%. Encontrado: C: 66,42%, H: 7,10%. \delta_{p} (CDCl_{3}) 24,3 (s). \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,05-1,30 (12H, br, (CH_{2})_{6}(CH_{2})_{2}CO_{2}H), 1,53 (6H, br, (CH_{2})_{2}CH_{2}P, CH_{2}CH_{2}CO_{2}H), 2,28 (2H, t, CH_{2}CO_{2}), 3,55 (2H, br, CH_{2}P), 7,6-7,8 (15H, m, Ph). \delta_{c} (CDCl_{3}) 22,1, 22,3, 22,8, 24,5, 28,8, 28,9, 30,0, 30,2 (10C, (CH_{2})_{10}CO_{2}H), 34,2 (10, CH_{2}P), 117,3, 118,7 (3C, CP), 130,3, 130,5 (6C, CHCHCP), 133,3, 133,5 (6C, CHCP), 134,9 (3C, CH(CH)_{2}CP), 177,4 (1C, CO_{2}H).

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(5) Ácido 24-(dibencilamino)-12-tetracosenoico

Bn_{2}N-(CH_{2})_{11}-CH=CH-(CH_{2})_{10}-CO_{2}H

Se disolvió el compuesto 4 (13,52 g, 25 mmol) en DMSO seco (40 cm^{3}) bajo argón a -0ºC (no solidificación de DMSO). Se añadieron 2,2 equivalentes de LDA 2,0 M (25 cm^{3}), volviéndose naranja la disolución. La reacción se dejó a 0ºC durante 30 minutos, y a la disolución ahora naranja oscuro se añadió una disolución del compuesto 3 (7,97 g, 21 mmol) en THF seco (30 cm^{3}). Se mantuvo la disolución a 0ºC durante 4 horas y, a continuación, se añadió a HCl 2M (50 cm^{3}). La capa acuosa se extrajo con diclorometano, las fracciones se combinaron, se secaron (MgSO_{4}) y se retiró el disolvente para producir el material en bruto como una goma amarrilla clara. La cromatografía en columna de sílice (acetato de etilo en hexano al 30-100%) obtuvo el producto deseado (6,20 g, 53%), como una goma amarilla clara.

C_{38}H_{59}NO_{2} requiere 561,46. ES^{+} encontró: MH^{+} 562,53, ES^{-}. (M-H^{+})^{-} 560,55. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,26 (30H, br, (CH_{2})_{8}
CH_{2}CH=CHCH_{2}(CH_{2})_{7}), 1,42-1,72 (4H, m, CH_{2}CH_{2}CO_{2}H, CH_{2}CH_{2}N), 2,02 (4H, dxt, CH_{2}CH=CHCH_{2}), 2,34 (2H, t, CH_{2}CO_{2}H), 2,46 (2H, t, CH_{2}N), 3,65 (4H, s, CH_{2}Ph), 5,36 (2H, t, CH=CH), 7,2-7,4 (10H, m, Ph). \delta_{c} (CDCl_{3}) 25,0, 26,4, 27,2, 29,3, 29,6 (19C, (CH_{2})_{10}CH=CH (CH_{2})_{9}), 34,5 (1C, CH_{2}CO_{2}H), 52,9 (1C, CH_{2}N), 57,7 (2C, CH_{2}Ph), 127,0 (2C, CH(CH)_{2}C), 128,2 (4C, CHC), 129,1 (4C, CHCHC), 129,9 (2C, CH=CH), 138,6 (2C, CCH_{2}N), 179,2 (1C, CO_{2}H).

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(6) Ácido 24-aminotetracosanoico

NH_{2}(CH_{2})_{23}CO_{2}H

Se calentó el compuesto 5 (6,2 g) bajo una atmósfera de hidrógeno a 60ºC durante la noche en ácido acético glacial usando el catalizador de Pearlman (p/p al 10%). Se filtró la reacción a través de fibra de vidrio y se evaporó hasta sequedad. Se cristalizó el producto a partir de ácido acético/éter (4,2 g, 100%). El producto se sometió a alto vacío para eliminar las trazas de ácido acético.

Pf 151-155ºC. C_{24}H_{49}NO_{2}. 0,75 CH_{3}CO_{2}H requiere C: 71,44%, H: 12,23%, N: 3,27%. Encontrado: C: 71,43%, H: 12,15%, N: 3,26%. C_{24}H_{49}NO_{2} requiere 383,38. ES^{+} encontró: MH^{+} 384,29. \delta_{H} (CD_{3}OD+TFA) 1,32 (38H, br, (CH_{2})_{19}(CH_{2})_{2}NH_{2}), 1,65 (4H, br, CH_{2}CH_{2}NH_{2}, CH_{2}CH_{2}CO_{2}H), 2,33 (2H, t, CH_{2}CO_{2}H), 2,74 (2H, m, CH_{2}NH_{2}). \delta_{c} (CD_{3}OD+TFA) parcial 33,8 (1C, CH_{2}CO_{2}H), 35,3 (1C, CH_{2}NH_{2}).

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(7) Ácido 24-(glucoronilamino)tetracosanoico

5

Se calentaron una suspensión del compuesto 6 (792 mg, 2,064 mmol), 6-gluconolactona (1,839 g, 10,32 mmol) y 1,8-diazabiciclo(5.4.0)undeceno (DBU) (4,2 g, 30,9 mmol) en metanol seco (90 cm^{3}) a 60ºC durante aproximadamente 10 minutos hasta que todos los sólidos se habían disuelto. Se dejó la disolución a temperatura ambiente durante la noche, a continuación, se retiró el disolvente. Se recogieron los residuos en agua (5 cm^{3}) y se acidificaron a pH 1 con HCl 1 M para precipitar el compuesto deseado. Este se extrajo por filtración y se secó para producir un sólido blanco (765 mg, 66%). Rf de la TLC de sílice 0,35, ninhidrina negativa (metanol:ácido acético:diclorometano 1:1:1).

I.R. 1.581 cm^{-1} (CO_{2}^{-}), 1.639 cm^{-1} (CONH). \delta_{H} (DMSO) 1,32 (42H, br, (CH_{2})_{21}CH_{2}CO_{2}H), 2,27 (2H, t, CH_{2}
CO_{2}H), 3,15 (2H, m, CH_{2}N), 3,3-3,8 (4H, m, CHOH), 4,0-4,1 (2H, m, CH_{2}O).

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(8) Ácido 24-(peracetilglucuronilamino)tetracosanoico

6

Se añadió anhídrido acético (20 cm^{3}) al compuesto 7 (765 mg, 1,362 mmol) disuelto en piridina seca (20 cm^{3}). Se agitó la disolución bajo argón durante la noche y se añadió lentamente agua (50 cm^{3}). Se extrajo la disolución con diclorometano y, a continuación, se lavó el diclorometano con HCl pH 3 (2x20 cm^{3}) y agua (5x30 cm^{3}). Los compuestos orgánicos se secaron (MgSO_{4}) y se retiró el disolvente para obtener el producto pentaacetilado como un sólido blanco (940 mg, 89%). Rf de la TLC de alúmina 0,15 (metanol en diclorometano al 15%).

C_{40}H_{69}NO_{13} requiere 771,48. ES^{+} encontró: MH^{+} 772,07, MNa^{+} 794,25. ES^{-}: (M-H^{+})^{-} 770,65. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,26 (38H, br, (CH_{2})_{19}(CH_{2})_{2}CO_{2}H), 1,64 (4H, m, CH_{2}CH_{2}CO_{2}H, CH_{2}CH_{2}NH), 2,07, 2,11, 2,13, 2,21 (15H, s, CH_{3}CO), 2,35 (2H, t, CH_{2}CO_{2}H), 3,24 (2H, m, CH_{2}NH), 4,30 (2H, 2 x dxd, CH_{2}OAc), 5,05 (1H, q, CH (OAc) CH_{2}OAc), 5,32 (1H, d, CH (OAc) CONH), 5,46 (1H, t, CH(OAc)CH(OAc)CH_{2}OAc), 5,70 (1H, t, CH(OAc)CH(OAc)CONH), 6,42 (1H, t, NH). \delta_{c} (CDCl_{3}) 20,4, 24,5, 26,6, 28,8-29,5 (26C, (CH_{2})_{21}CH_{2}CO_{2}H, CH_{3}CO), 33,8 (1C, CH_{2}CO_{2}H), 39,3 (1C, CH_{2}NH), 61,3 (1C, CH_{2}OAc), 68,5, 68,9, 69,1, 71,5 (4C, CHOAc), 165,8 (1C, CONH), 160,0, 169,5, 169,7, 170,4 (5C, CH_{3}CO), 178,6 (1C, CO_{2}H).

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(9)N,N'-bis (t-Butiloxicarbonil)-N-t-butiloxicarbonilaminopropil-N'-aminopropil-1,4-diaminobutano

7

Se añadió trifluoroacetato de etilo (2,601 g, 18,31 mmol) durante 30 minutos a espermina (3,704 g, 18,31 mmol) disuelta en metanol (200 cm^{3}) a -78ºC. Se agitó la disolución durante unos 30 minutos más a -78ºC, a continuación, se calentó a 0ºC durante 1 hora. A continuación, se añadió dicarbonato de terc-butilo (15,981 g, 73,23 mmol) como un sólido, se dejó que la reacción se calentara hasta la temperatura ambiente durante 1 hora, y 2 horas más tarde se añadió hidróxido de amonio concentrado (aproximadamente 40 cm^{3}) hasta que se alcanzó un pH>11. Se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, se retiraron los disolventes y los residuos se purificaron mediante cromatografía de sílice (DCM:MeOH:NH_{4}OH 70:10:1) para obtener el producto, 4,240 g, 46% como un aceite amarillo claro.

C_{25}H_{50}N_{4}O_{6} requiere 502,4. ES^{+} encontró: MH^{+} 503,4. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,44 (31H, m, C (CH_{3})_{3}, NCH_{2}(CH_{2})_{2}CH_{2}N), 1,64 (4H, m, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N), 3,14 (2H, t, CH_{2}NH_{2}), 3,0-3,4 (10H, m, CH_{2}N).

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(10)N-t-Butiloxicarbonil-N-[t-butiloxicarbonilaminopropil(t-butiloxicarbonil)aminobutil(t-butiloxicarbonil)amino-propil-N',N'-dibencil-1,6-diaminohexano

8

Se agitaron el compuesto 9 (535 mg, 1,064 mmol), 6-(dibencilamino)hexanal (286 mg, 0,968 mmol) (sintetizado como para el compuesto 3 a partir de 6-aminohexanol) y Na_{2}SO_{4} durante la noche en metanol anhidro (50 cm^{3}) a temperatura ambiente bajo argón. Se añadió a la reacción filtrada triacetoxiborohidruro de sodio (410 mg, 1,94 mmol) y se dejó la reacción durante 3 horas en dicho momento se añadió agua (0,5 cm^{3}) y la reacción se dejó durante la noche para enfriar el agente de reducción en exceso. Se añadieron a la reacción dicarbonato de terc-butilo (633 mg, 2,903 mmol) y trietilamina (490 mg, 4,838 mmol) y se dejó la reacción durante 3 horas. Se retiró el disolvente y los residuos se purificaron mediante cromatografía en columna de sílice eluyendo con acetato de etilo en hexano al 25-50% para producir el compuesto deseado, 311 mg, 36% como una goma incolora.

C_{50}H_{82}N_{5}O_{8} requiere 881,6. ES^{+} encontró: MH^{+} 882,5. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,1-1,8 (52H, m, (CH_{3})_{3}C, Bn_{2}NCH_{2}(CH_{2})_{4}, CH_{2}CH_{2}N), 2,39 (2H, t, Bn_{2}NCH_{2}), 3,0-3,4 (14H, br, CH_{2}N), 3,54 (4H, s, CH_{2}Ph), 7,2-7,4 (10H, m, Ph).

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(11)N-t-Butiloxicarbonil-N-[t-butiloxicarbonilaminopropil(t-butiloxicarbonil)aminobutil(t-butiloxicarbonil)amino-propil-1,6-diaminohexano

9

Se añadió el catalizador de Pearlman (100 mg) al compuesto 10 (311 mg) en terc-butanol a 40ºC y se cambió la atmósfera a hidrógeno. Se dejó la hidrogenación durante dos días a 40ºC, se extrajo por filtración el catalizador y se retiró el disolvente. Los residuos se purificaron mediante cromatografía de sílice eluyendo inicialmente con DCM:MeOH:NH_{4}OH 100:10:0 para rescatar las impurezas, a continuación, con 100:10:1 para rescatar la amina primaria deseada como un aceite claro incoloro, 163 mg, 66%.

C_{36}H_{71}N_{5}O_{8} requiere 701,5. ES^{+} encontró: MH^{+} 702,4. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,2-1,8 (52H, m, (CH_{3})_{3}C, H_{2}NCH_{2}(CH_{2})_{4}, CH_{2}CH_{2}N), 2,88 (2H, br, CH_{2}NH_{2}), 3,0-3,4 (14H, m, CH_{2}N).

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(12)N-(t-Butiloxicarbonilaminopropil(t-butiloxicarbonil)aminobutil(t-butiloxicarbonil)aminopropil(t-butiloxicarbo-nil)aminohexil]-24-(peracetilglucuronilamino)tetracosanamida

10

Se añadieron hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (48 mg, 0,250 mmol), N-hidroxisuccinimida (22 mg, 0,187 mmol) al compuesto 8 (96 mg, 0,125 mmol) en diclorometano anhidro (10 cm^{3}) y se dejó la reacción durante la noche. A continuación, a esto se añadieron el compuesto 11 (92 mg, 0,131 mmol) y trietilamina (63 mg, 0,624 mmol) y de nuevo se dejó la reacción durante la noche. Se retiraron los disolventes y los residuos se purificaron mediante cromatografía en gradiente de sílice eluyendo con acetato de etilo en hexano al 50-70% para obtener el producto, 157 mg, 86% como un sólido blanco.

\delta_{H} (CDCl_{3}) 1,24 (44H, br, (CH_{2})_{20}CH_{2}CO, N(CH_{2})_{2}(CH_{2})_{2}(CH_{2})_{2}N), 1,44 (50H, br+m, (CH_{3})_{3}C, CH_{2}CH_{2}N), 2,04-2,20 (15H, 5xs, CH_{3}CO), 2,29 (2H, t, CH_{2}CO), 3,0-3,4 (18H, m, NCH_{2}), 4,12, 4,31 (2H, m, CH_{2}OAc), 5,05 (1H, m, CHCH_{2}OAc), 5,29 (1H, d, NHCOCHOAc), 5, 44, 5,67 (2H, 2xt, AcOCH_{2}CHOAc(CHOAc)_{2}), 6,06 (2H, br, NHCO).

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(13)N-[t-Butiloxicarbonilaminopropil(t-butiloxicarbonil)aminobutil(t-butiloxicarbonil)aminopropil(t-butiloxicarbonil)aminohexil]-24-(glucuronilamino)tetracosanamida

11

Se añadió lentamente con agitación NH_{4}OH (4 cm^{3}) al compuesto 12 (156 mg) disuelto en metanol (10 cm^{3}) hasta que la disolución comenzó a enturbiarse. Después de aproximadamente 20 minutos se añadió 3 cm^{3} más de metanol para disolver algo del precipitado blanco que se forma. Se agitó la disolución/suspensión durante un total de una hora en dicho momento se retiraron todos los disolventes. Los residuos se purificaron mediante cromatografía en fase inversa eluyendo con CH_{2}Cl_{2}:MeOH:NH_{4}OH 2:6:1 para producir un sólido incoloro, 123 mg, 92%.

C_{66}H_{128}N_{6}O_{15} requiere 1.244,9. ES^{+} encontró: MNa^{+}, 1.267,8. \delta_{H} (CD_{3}OD) 1,28 (44H, br, NH (CH_{2})_{2}(CH_{2})_{20}, N(CH_{2})_{2}(CH_{2})_{2}(CH_{2})_{2}N), 1,4-1,9 (50H, brm, (CH_{3})_{3}C, CH_{2}CH_{2}N), 2,16 (2H, t, CH_{2}CO), 3,0-3,4 (18H, m, CH_{2}N), 3,6-3,9 (4H, m, CHOH), 4, 09, 4,19 (2H, 2xm, CH_{2}OH).

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(14)N-(Aminopropilaminobutilaminopropilaminohexil)-24-(glucuronilamino)tetracosanamida

12

El compuesto 13 (120 mg) se trató con ácido trifluoroacético:agua 96:4 durante 20 minutos y se retiraron los disolventes para producir un sólido el cual se recogió en agua, se filtró a través de un filtro de polipropileno de 0,2 \mum y se liofilizó para obtener el producto en el rendimiento cuantitativo como un sólido blanco.

C_{46}H_{96}N_{6}O_{7} requiere 844,7. ES^{+} encontró: MH_{2}^{2+}, 423,5. \delta_{H} (CD_{3}OD) 1,28 (44H, m, (CH_{2})_{20}CH_{2}CO, N(CH_{2})_{2} (CH_{2})_{2}(CH_{2})_{2}N), 1,5-1,8 (6H, m, CH_{2}CH_{2}N), 1,81 (4H, m, NCH_{2}(CH_{2})_{2}CH_{2}N), 2,10 (2H, m, CH_{2}CO), 2,16 (4H, m, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N), 2,95-3,30 (18H, m, NCH_{2}), 3,55-3,80 (4H, m, CHOH), 4,08, 4,20 (2H, 2xm, CH_{2}OH).

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(15) 23-Azido-1-(1,3-dioxalan-2-il)tricosa-11-eno

13

Se añadió azida de sodio (7,4 g, 113,8 mmol) a 23-cloro-1-(1,3-dioxalan-2-il)tricosa-11-eno (7,7 g, 16,3 mmol) (sintetizado a través del acoplamiento por la reacción de Witting de 12-clorododecanal y la sal de trifenilfosfonio de su acetal usando 1 equivalente de LDA en THF a 0ºC) en DMF (120 cm^{3}) y se agitó la reacción durante la noche bajo argón a temperatura ambiente. Se redujo el disolvente a aproximadamente 20 cm^{3} y se añadió agua (50 cm^{3}). Se extrajo la disolución con hexano, se secó (MgSO_{4}) y se retiró el disolvente para producir un sólido ceroso, 7,023 g, 99%.

\delta_{H} (CDCl_{3}) 1,27 (32H, m, N3 (CH_{2})_{2}(CH_{2})_{8}CH_{2}CH=CHCH_{2}(CH_{2})_{8}), 1,60 (4H, m, CH_{2}CH_{2}N_{3}, CH_{2}CHO), 2,00 (4H, m, CH_{2}CH=), 3,25 (2H, t, CH_{2}N_{3}), 3,83, 3,96 (4H, 2xm, OCH_{2}), 4,84 (1H, t, CHO), 5,34 (2H, m, CH=CH).

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(16)N-Azidotetracos-12-enil(t-butiloxicarbonil)aminopropil-N',N'-bis(t-butiloxicarbonil)-N'-t-butiloxicarbonilami-nopropil-1,4-diaminobutano

14

Se añadió lentamente ácido tosic (1 g) en agua (3 cm^{3}) a una suspensión rápidamente agitada de sílice (100 cm^{3}) y diclorometano en hexano al 40% (100 cm^{3}). La suspensión se agitó durante 10 minutos y se usó para empaquetar una columna. Después de lavar la columna con diclorometano en hexano al 40% se cargó el compuesto 15 (537 mg) y lentamente eluyó durante 2 horas con diclorometano en hexano al 40% para dar el aldehído, 464 mg, 96% como un aceite incoloro. A este aldehído (464 mg, 1,185 mmol) y al compuesto 9 (655 mg, 1,303 mmol) disuelto en THF anhidro (40 cm^{3}) se añadieron Na_{2}SO_{4}, ácido acético (20 \mul) y triacetoxiborohidruro de sodio (377 mg, 1,77 mmol) y se dejó la reacción bajo argón durante la noche. Todos los sólidos se extrajeron por filtración, se retiró el disolvente y los residuos se recogieron en diclorometano. Se lavó la disolución (KOH(_{aq})), se secó (MgSO_{4}) y se redujo en volumen a aproximadamente 30 cm^{3}. A la disolución se añadió dicarbonato de terc-butilo (388 mg, 1,77 mmol) y se dejó la reacción durante la noche. Se retiró el disolvente y los residuos se purificaron mediante cromatografía de sílice en gradiente (acetato de etilo en hexano al 20-40%) para dar el producto deseado, 352 mg, 30% como una goma incolora.

C_{54}H_{103}N_{7}O_{8} requiere 977,8. ES^{+} encontró: MH^{+}, 978,7. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,26 (34H, m, (CH_{2}CH_{2}CH=CHCH_{2}(CH_{2})_{9}),
1,44 (40H, m, (CH_{3})_{3}C, NCH_{2}(CH_{2})_{2}CH_{2}N), 1,55-1,80 (6H, m, CH_{2}CH_{2}N_{3}, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N), 2,03 (4H, m, CH_{2}CH=), 3,05-3,40 (14H, m, NCH_{2}), 3,24 (2H, t, CH_{2}N_{3}), 5,34 (4H, m, CH=CH).

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(17)N-t-Butiloxicarbonil-N-[t-butiloxicarbonilaminopropil(t-butiloxicarbonil)aminobutil(t-butiloxicarbonil)amino-propil-1,24-diaminotetracosano

15

Se añadió paladio sobre carbono al 10% (40 mg) al compuesto 16 (204 mg) disuelto en t-butanol (20 cm^{3}) a 40ºC y se cambió la atmósfera a hidrógeno. Se mantuvo la hidrogenación a 40ºC durante 3 días, el catalizador se extrajo por filtración y se retiró el disolvente. Los residuos se purificaron mediante cromatografía en columna de sílice eluyendo con metanol en diclorometano al 10% para eluir las impurezas seguido de DCM:MeOH:NH_{4}OH 90:10:1 para rescatar la amina deseada como una goma incolora, 61 mg, 31%.

C_{54}H_{107}N_{5}O_{8} requiere 953,8. ES^{+} encontró: MH^{+}, 954,6. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,24 (42H, br, (CH_{2})_{21}CH_{2}NH_{2}), 1,43 (42H, br, (CH_{3})_{3}C, NCH_{2}(CH_{2})_{2}CH_{2}N, CH_{2}(CH_{2})_{22}NH_{2}), 1,70 (4H, m, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N), 2,70 (2H, t, CH_{2}NH_{2}), 3,0-3,4 (14H, brm, CH_{2}N), 5,35 (1H, br, CONH).

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(18)N-t-Butiloxicarbonil-N-[t-butiloxicarbonilaminopropil(t-butiloxicarbonil)aminobutil(t-butiloxicarbonil)amino-propil-N'-glucuronil-1,24-diaminotetracosano

16

Se añadieron \delta-gluconolactona (17 mg, 0,097 mmol) y trietilamina (26 mg, 0,260 mmol) al compuesto 17 (62 mg, 0,065 mmol) en metanol anhidro (8 cm^{3}) y se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente bajo argón. Se retiraron los disolventes y los residuos se purificaron mediante cromatografía en fase inversa eluyendo con DCM:MeOH:H_{2}O 2:6:1 para dar el producto, 32 mg, 43% como un sólido blanco.

C_{60}H_{117}N_{5}O_{14} requiere 1.131,9. ES^{+} encontró: MH^{+}, 1.132,8. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,25 (40H, br, N(CH_{2})_{2}(CH_{2})_{20}), 1,44 (40H, br, (CH_{3})_{3}C, CH_{2}CH_{2}CO, NCH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{20}CH_{2}CH_{2}N), 1,6-1,8 (8H, m, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N, NCH_{2}(CH_{2})_{2}CH_{2}N), 3,0-3,4 (16H, brm, NCH_{2}), 3,80 (4H, br, CHOH), 4, 1, 4,3 (2H, 2xbr, CH_{2}OH), 5,37 (1H, br, NHCO_{2}), 7,22 (1H, br, NHCO).

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(19)N-Aminopropilaminobutilaminopropil-N'-glucuronil-1,24-diaminotetracosano

17

El compuesto 18 (32 mg) se trató tal como para la síntesis del compuesto 14 para dar el producto en rendimiento cuantitativo como un sólido blanco.

C_{40}H_{85}N_{5}O_{6} requiere 731,7. ES^{+} encontró: MH^{+}, 732,6, MH_{2}2+, 367,0. \delta_{H} (CD_{3}OD) 1,28 (40H, br, NH(CH_{2})_{2}(CH_{2})_{20}), 1,53 (2H, p, CONHCH_{2}CH_{2}), 1,69 (2H, p, (CH_{2})_{22}CH_{2}CH_{2}NHCH_{2}), 1,81 (4H, m, NCH_{2}(CH_{2})_{2}CH_{2}N), 2,10 (4H, m, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N), 2,9-3,3 (16H, m, CH_{2}N), 3,55-3,85 (4H, m, CHOH), 4,09, 4,20 (2H, 2xm, CH_{2}OH).

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(20) 35-Azido-1-(1,3-dioxalan-2 -il)pentatriaconta-11,23-dieno

18

Se añadió azida de sodio (1,224 g, 18,83 mmol) a 35-cloro-1-(1,3-dioxalan-2-il)pentatriaconta-11,23-dieno (1,602 g, 2,690 mmol) (sintetizado a través del acoplamiento por la reacción de Witting de 12-clorododecanal y la sal de trifenilfosfonio de 23-cloro-1-(1,3-dioxalan-2-il)tricosa-11-eno usando 1 equivalente de LDA en THF a 0ºC) en DMF anhidro (70 cm^{3}) y se calentó la reacción durante 5 días a 50ºC bajo argón. Se redujo el disolvente hasta casi la sequedad y los residuos se recogieron en agua (150 cm^{3}) y acetato de etilo (150 cm^{3}). La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (4x150 cm^{3}), se combinaron las fracciones, se lavaron (2x150 cm^{3} de agua), se secaron (MgSO_{4}) y se retiró el disolvente para producir cuantitativamente la azida como un sólido ceroso amarillo claro.

C_{38}H_{71}N_{3}O_{2} requiere 601,6. ES^{+} encontró: MNH_{4}^{+}, 619,6. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,27 (48H, br, N_{3}(CH_{2})_{2}(CH_{2})_{8}CH_{2}CH=
CHCH_{2}(CH_{2})_{8}CH_{2}CH=CHCH_{2}(CH_{2})_{8}), 1,61 (4H, m, CH_{2}CH, CH_{2}CH_{2}N_{3}), 2,00 (8H, m, CH_{2}CH=), 3,25 (2H, t, CH_{2}N_{3}), 3,8-4,05 (4H, m, CH_{2}O), 4,84 (1H, t, CH), 5,34 (4H, m, CH=CH).

(21)N-Azidohexatriaconta-12,24-dienil(t-butiloxicarbonil)aminopropil-N',N'-bis(t-butiloxicarbonil)-N'-t-butiloxi-carbonilaminopropil-1,4-diaminobutano

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19

Se añadió lentamente ácido tosic (2 g) en agua (6 cm^{3}) a una suspensión rápidamente agitada de sílice (200 cm^{3}) y diclorometano en hexano al 50% (200 cm^{3}). Se agitó la suspensión durante 10 minutos y se usó para empaquetar la columna. Después de lavar la columna con diclorometano en hexano al 50% se cargó el compuesto 20 (998 mg) y se eluyó durante 2 horas con diclorometano en hexano al 50% para dar el aldehído, 591 mg, 65% como un aceite incoloro. A este aldehído (591 mg, 1,059 mmol) y al compuesto 9 (559 mg, 1,112 mmol) disuelto en MeOH:DCM 30:70 anhidro (30 cm^{3}) se añadió Na_{2}SO_{4} y se calentó la reacción a reflujo durante la noche. Se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (449 mg, 2,118 mmol) y se dejó la reacción durante 4 horas. Se retiró el agente de secado, se añadió agua (1 cm^{3}) y se dejó la reacción durante la noche. Se añadieron dicarbonato de t-butilo (694 mg, 3,178 mmol) y trietilamina (536 mg, 5,296 mmol) y de nuevo se dejó la reacción durante la noche. Se retiró el disolvente y los residuos se purificaron mediante cromatografía de sílice en gradiente eluyendo con acetato de etilo en hexano al 20-40% para obtener el producto, 226 mg, 19% como una goma incolora.

C_{66}H_{125}N_{7}O_{8} requiere 1.144,0. ES^{+} encontró: MNa^{+}, 1.166,8. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,27 (50H, br, N_{3}CH_{2}(CH_{2})_{9}CH_{2}CH=
CHCH_{2}(CH_{2})_{8}CH_{2}CH=CHCH_{2} (CH_{2})_{8}), 1,4-1,9 (46H, m, (CH_{3})_{3}C, CH_{2}CH_{2}N), 2,0 (8H, m, CH_{2}CH=), 3,05-3,4 (14H, m, CH_{2}N), 3,24 (2H, t, CH_{2}N_{3}), 5,34 (4H, m, CH=).

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(22)N-t-Butiloxicarbonil-N-[t-butiloxicarbonilaminopropil(t-butiloxicarbonil)aminobutil(t-butiloxicarbonil)amino-propil]-1,36-diaminohexatriacontano

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20

Se añadió paladio sobre carbono al 10% (60 mg) al compuesto 21 (220 mg) disuelto en terc-butanol a 40ºC y se cambió la atmósfera a hidrógeno. Se dejó la hidrogenación durante dos días, el catalizador se extrajo por filtración, se retiró el disolvente y los residuos se purificaron mediante cromatografía de sílice eluyendo con diclorometano:metanol 100:10 luego con diclorometano:metanol:NH_{4}OH 100:10:1 para dar el producto como una goma incolora, 147 mg, 68%.

C_{66}H_{131}N_{5}O_{8} requiere 1.122,0. ES^{+} encontró: MH^{+}, 1.122,9. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,25 (64H, br s, (CH_{2})_{32}(CH_{2})_{2}NH_{2}), 1,4-1,8 (48H, br s, (CH_{3})_{3}C, CH_{2}CH_{2}N), 2,88 (2H, t, CH_{2}NH_{2}), 3,0-3,4 (14H, br, CH_{2}N).

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(23)N-t-Butiloxicarbonil-N-[t-butiloxicarbonilaminopropil(t-butiloxicarbonil)aminobutil(t-butiloxicarbonil)amino-propil]-N'-glucuronil-1,36-diaminohexatriacontano

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21

Se añadieron trietilamina (47 mg, 0,463 mmol) y 6-gluconolactona (62 mg, 0,347 mmol) al compuesto 22 (130 mg, 0,116 mmol) en metanol anhidro (8 cm^{3}) bajo argón a 40ºC y se dejó la reacción durante la noche. Se retiró el disolvente y los residuos se purificaron mediante cromatografía de sílice en fase inversa en gradiente eluyendo con diclorometano:metanol:agua 2:6:1 a 2:6:0,25 para dar el producto como un sólido incoloro, 83 mg, 55%.

C_{72}H_{141}N_{5}O_{14} requiere 1.300,0. ES^{+} encontró: MNa^{+}, 1.323,0. \delta_{H} (CDCl_{3}) 1,25 (64H, br, N(CH_{2})_{2}(CH_{2})_{32}), 1,35-1,80 (48H, br m, CH_{2}CH_{2}N, (CH_{3})_{3}C), 3,0-3,4 (16H, br m, NCH_{2}), 3,55-4,0 (4H, br, CHOH), 4, 20, 4,45 (2H, 2xbr, CH_{2}OH), 5,28 (1H, br, NHCO_{2}), 7,78 (1H, br, CONH (CH_{2})_{36}).

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(24)N-Aminopropilaminobutilaminopropil-N'-glucuronil-1,36-diaminohexatriacontano

22

El compuesto 23 (83 mg) se trató tal como en la síntesis del compuesto 14 para obtener cuantitativamente el producto como un sólido blanco.

C_{52}H_{1091}N_{5}O_{6} requiere 899,8. ES^{+} encontró: MH^{+}, 900,9. \delta_{H} (CD_{3}OD) 0,8-2,2 (76H, br, (CH_{2})_{32}(CH_{2})_{2}N, CH_{2}
CH_{2}N), 2,8-3,4 (16H, br, CH_{2}N), 3,5-3,9 (4H, br, CHOH), 4, 08, 4,20 (2H, 2xbr, CH_{2}OH).

Las propiedades ventajosas de los lípidos de acuerdo con la invención se pueden demostrar en los siguientes ensayos:

Tratamiento con PRONASA y ADNasa

Uno de los últimos objetivos de la investigación de la terapia genética actual es desarrollar un sistema de reparto que continuará estable y eficaz in vivo, puesto que esto eliminaría la necesidad de manipulaciones ex vivo caras y que requieren mucho tiempo. Puesto que la administración intravenosa ofrece la posibilidad de el reparto al mayor número de sitios de tejido, la supervivencia del complejo de reparto genético en presencia de suero podría ser una característica importante de cualquier tecnología eficaz. Muchos estudios publicados han demostrado la susceptibilidad de los complejos de reparto genéticos a la inactivación por suero incluso a niveles tan bajos como el 10%. Este efecto es debido, al menos en parte, a la desestabilización de los complejos mediante un mecanismo escasamente entendido y esto puede conducir a la degradación del ADN dentro del complejo por nucleasas asociadas a suero. Por lo tanto, hemos formado complejos entre los lípidos de la invención y ADN plásmido y hemos sometido estos a tratamiento con ADNasa y pronasa purificada así como con suero de ternera fetal al 50%. A continuación, se midió la integridad del ADN plásmido.

Métodos

Se preparó ADN plásmido (pEGlacZ) a una concentración de 120 \mug/ml en agua. Se preparó un lípido de acuerdo con la invención (por ejemplo, la hexamina H18 descrita en el Ejemplo anterior) en un intervalo de concentraciones de modo que se obtendrían relaciones de carga de lípido:ADN de 0,25:1, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1 (suponiendo que ADN a 120 \mug/ml es equivalente a 0,387 mM de carga negativa, y la hexamina H18, por ejemplo, a 10 mg/ml es equivalente a 36,23 mM de carga positiva). Un volumen igual de ADN se añadió gota a gota a un tubo de centrifugación que contenía el lípido en agua. Para el tratamiento con ADNasa, se añadió ADNasa I (FPLC pura, Pharmacia) a una concentración de 1 unidad/1 \mug de ADN y se incubaron los tubos a 37ºC durante 10 minutos. Para inhibir más la acción de la ADNasa, se añadió EGTA a una concentración final de 25 mM. Para el tratamiento con pronasa, se añadió proteasa XIV (Sigma) a las muestras a una concentración final de 150 \mug/ml, y se incubaron las muestras durante 30 minutos a 37ºC. Los complejos se alteraron en SDS al 0,5% con incubación a 55ºC durante 20 minutos. El tratamiento con suero implicaba incubar las muestras en presencia de suero de ternera fetal al 50% (concentración final) durante 30 minutos a 37ºC. Se añadió EGTA para una concentración final de 50 mM en un intento de prevenir la posterior acción de las nucleasas asociadas a suero. Finalmente, se analizaron todas las muestras mediante electroforesis sobre geles de agarosa al 0,8%.

Resultados

El análisis de la movilidad del ADN plásmido a través de los geles demostró que, a medida que se incrementaba la cantidad de lípido, el ADN tendía a retardarse en los pocillos. Por tanto, por ejemplo, en una relación de carga de 2:1 (H18:ADN), el ADN no entró en el gel, y a relaciones mayores, el ADN plásmido ya no era visible mediante fluorescencia de bromuro de etidio (véase a continuación), sugiriendo que el ADN se había llegado a condensar completamente. Los condensados de H18/ADN eran resistentes al tratamiento con pronasa. Además, el ADN condensado con H18 en una relación de carga de al menos 2:1 era resistente al tratamiento con ADNasa. A relaciones de carga de 2:1 o superiores, la adición de suero al 50% no condujo a un incremento en la cantidad de degradación de ADN, sugiriendo que los lípidos de acuerdo con la invención son estables en suero.

Ensayos físico químicos

Se pueden usar dos ensayos físicos químicos para valorar la capacidad de los lípidos de la invención para compactar ADN sobreenrrollado y para determinar la estabilidad de las partículas condensadas.

Ensayo 1

El primer ensayo implica el uso de bromuro de etidio, una molécula que se vuelve fluorescente cuando se intercala en la hélice de ADN. Se preparan disoluciones que contienen ADN y un lípido de acuerdo con la invención para que la relación de carga entre los grupos de fosfato cargados negativamente del ADN y las poliaminas cargadas positivamente de los lípidos varíe entre cero y tres (véase el apartado "Métodos" en la anterior sección). Después de que se haya añadido el bromuro de etidio a cada disolución se mide la lectura de fluorescencia. A medida que se incrementa la relación de carga hacia la neutralidad de carga, debido al incremento de cantidades de lípido presente, hay un descenso progresivo en la fluorescencia del bromuro de etidio cuando esta molécula es excluida de la unión al ADN cuando ocurre la compactación. El punto en el cual la compactación es completa corresponde al punto en el que la lectura de fluorescencia se estabiliza en un mínimo. En el caso de los lípidos de la invención se alcanza el mínimo de fluorescencia en relaciones de carga entre lípido y ADN en el intervalo entre 0,8 y 2,5. Este ensayo se ha usado para demostrar que los lípidos son competentes en la compactación bajo condiciones de sal fisiológica (NaCl 150 mM) y en condiciones ácidas por debajo de pH 3,0. La repetición del ensayo también muestra que las partículas de ADN compactado son estables durante muchas horas tanto en sal fisiológica como bajo condiciones de pH bajo.

Ensayo 2

El segundo ensayo implica la electroforesis en gel usando bromuro de etidio como tinte. Se preparan muestras de lípido y ADN como antes y se cargan en carriles separados en un gel de poliacrilamida. Después de la electroforesis se determina la lectura de fluorescencia de cada carril. Se observan dos efectos. En primer lugar, a medida que se incrementa la relación de carga hacia la neutralidad la distancia que recorre el complejo ADN/lípido a través del gel desciende progresivamente. Este es un resultado de dos procesos físicos: compactación, que vuelve al ADN menos capaz de moverse a través del gel viscoso, y neutralización de la carga negativa del ADN, que reduce la atracción electrostática entre el complejo y el cátodo. En segundo lugar, a medida que se incrementa la relación de carga más allá de la neutralidad el brillo de la respuesta fluorescente disminuye ya que el tinte de bromuro de etidio es excluido de la hélice de ADN. Este ensayo se ha usado para confirmar que los lípidos de acuerdo con la invención causan compactación de ADN cerca del punto de neutralidad de carga, de acuerdo con la teoría.

Transfección de células de mamífero con complejos de adn condensados con lípido Condensación de ADN

Se preparó ADN plásmido (pEGlacZ) a concentraciones de generalmente 60 ó 120 \mug/ml en agua. Se prepararon disoluciones de lípidos de acuerdo con la invención en agua sobre un intervalo de concentraciones (generalmente 30 a 960 p.g/ml). Se añadió gota a gota un volumen igual de ADN a un tubo que contenía una disolución de los lípidos mientras se centrifugaba el tubo.

Protocolo de Transfección en CHO

Se sembraron células de Ovario de Hámster Chino (CHO, del Inglés "Chinese Hamster Ovary")) en placas de 24 pocillos a 100.000 células por pocillo 24 horas antes del experimento. Se lavaron las células una vez en medio Optimem^{TM} antes de la transfección. Se retiró el medio de lavado y se reemplazó con 0,5 ml de Optimem^{TM} al cual se añadió la cantidad requerida de ADN condensado con lípido (generalmente 1 a 5 \mug equivalente de ADN). Normalmente se colocaron tres pocillos de réplica de transfección por muestra de ADN condensado ensayada. Se incubaron las células durante unas 3 a 4 horas más a 37ºC, CO_{2} al 5%, antes de la retirada del complejo y la adición de 1 ml de medio fresco (medio Iscoves^{TM}: DMEM modificado más glutamato, asparagina, adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina y suero de ternera fetal sometido a diálisis al 10%). Se cultivaron las células durante unas 48 a 72 horas más antes de la recolección y el ensayo. Se determinaron los niveles de actividad del gen informativo de beta galactosidasa usando un sistema de ensayo enzimático de Promega tal como sigue. Se lavaron las células dos veces con 1 ml de disolución salina tamponada con fosfato y se disolvió en 200 \mul de ixtampón de lisis celular. Se incubó 50 \mul de extracto celular con el tampón proporcionado y el sustrato o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranosida y se midió la densidad óptica de manera espectrofotométrica. Se cuantificaron los niveles de expresión de \beta-gal con referencia a la curva patrón y en relación con la cantidad de proteína en el extracto (medida usando el kit de ensayo BCA de Pierce) para dar un valor final expresado como mU de \beta-gal por mg de proteína.

Claims (48)

1. Un lípido bipolar que comprende una cabeza catiónica (1), una cadena principal hidrófoba (2) y una cola hidrófila (3) en el cual:

(A)

la cabeza catiónica comprende dos o más centros catiónicos, conteniendo cada centro al menos un heteroátomo que es capaz de retener una carga positiva a un pH en el intervalo de 2 a 10 y que se une covalentemente al otro u otros centros mediante uno o más grupos espaciadores que contienen carbono;

(B)

la cadena principal hidrófoba comprende al menos una cadena de hidrocarburo; y

(C)

la cola hidrófila comprende al menos una unidad de cola seleccionada entre polioles sintéticos, polioles que se dan en la naturaleza, poli (óxidos de alquileno) y derivados de los mismos;

estando cada uno de dichos componentes (1) a (3) covalentemente unidos, la cabeza (1) a la cadena principal (2) a la cola (3), y dispuestos de modo que dicha cadena de hidrocarburo de la cadena principal hidrófoba (2) está covalentemente unida a uno de dichos heteroátomos que retienen carga positiva en la cabeza catiónica (1) y a dicha unidad de cola en la cola hidrófila (3) de modo que la cadena contiene al menos diez átomos unidos en cadena entre sus puntos de unión a dicho heteroátomo que retiene carga positiva y a dicha unidad de cola.

2. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que cada centro catiónico es un grupo amino.

3. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, en el que el número de centros catiónicos en la cabeza catiónica es de tres a seis.

4. Un lípido de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 1 a la Reivindicación 3, en el que cada grupo espaciador que contiene carbono en la cabeza catiónica es un grupo alifático, cicloalifático, heteroalifático, heterocicloalifático, aromático o heteroaromático opcionalmente sustituido.

5. Un lípido de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 1 a la Reivindicación 4, en el que dicha cadena de hidrocarburo en la cadena principal hidrófoba es una cadena alifática o heteroalifática, recta o ramificada, opcionalmente sustituida que contiene entre diez y alrededor de cien átomos unidos en cadena.

6. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 5, en el que la cadena principal hidrófoba tiene una o dos cadenas de hidrocarburo indirectamente unidas a través de un átomo o grupo conector ("linker") a uno de dichos heteroátomos que retienen carga positiva en la cabeza catiónica (1).

7. Un lípido de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 1 a la Reivindicación 5, en el que dicha unidad de cola en la cola hidrófila (3) está unida a una cadena de hidrocarburo de la cadena principal de hidrocarburo (2) en el átomo de carbono terminal de dicha cadena distal al átomo de carbono de la cadena unido a la cabeza catiónica (1).

8. Un lípido de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 1 a la Reivindicación 7, el cual tiene la fórmula (1):

(1)[R^{1}]_{m}(L^{1})_{n}-R^{2}

en la que

R^{1} es una cadena de hidrocarburo opcionalmente sustituida por una o más unidades finales seleccionadas entre polioles sintéticos, polioles que se dan en la naturaleza, poli(óxidos de alquileno) y derivados de los mismos, con tal de que al menos una cadena de hidrocarburo R^{1} esté sustituida por al menos una de dicha unidad de cola y que cada dicha unidad de cola esté unida a la cadena de hidrocarburo para conseguir que al menos un átomo unido a la cadena de diez se coloque a lo largo de la cadena entre la unidad de cola y el grupo -(L^{1})_{n}-R^{2};

"m" es un número entero entre 1 y 6;

L^{1} es un átomo o grupo conector;

"n" es cero o el número entero 1; y

R^{2} es un grupo alifático, cicloalifático, heteroalifático, heterocicloalifático, aromático o heteroaromático opcionalmente sustituido que contiene dos o más centros catiónicos, de modo que cada grupo [R^{1}]_{m}-(L^{1})_{n}- está unido a un heteroátomo que retiene carga positiva en un centro catiónico en R^{2};

y sus sales, solvatos e hidratos.

\newpage

9. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 8, en el que "n" en -(L^{1})_{n}- es el número entero 1.

10. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 9, en el que L^{1} es un grupo -X^{1}Alk^{2}- o -[X^{1}]_{2}ALk^{1}X^{1}Alk^{2}- en el que X^{1} es un átomo -O- o -S- o un grupo -C(O)-, -C(O)O-, -C(S)-, -S(O)-, -S(O)_{2}-, -N(R^{3})-, -CON(R^{3})-, -OC(O)N(R^{3})-, -CSN(R^{3})-, -N(R^{3})CO-, -N(R^{3})C(O)O-, -N(R^{3})CS-, -S(O)N(R^{3})-, -S(O)_{2}N(R^{3})-, -N(R^{3})S(O)-, -N(R^{3})S(O)_{2}-, -N(R^{3})CON(R^{3})- o -N(R^{3})SO_{2}N(R^{3})- en el que cada R^{3} se selecciona de manera independiente entre átomos de hidrógeno, grupos alquilo rectos y ramificados y cadenas -Alk^{1}X^{1}-; y Alk^{1} y Alk^{2} pueden ser los mismos o diferentes y son cada uno una cadena de alquileno C_{1-6}, alquenileno C_{2-6} o alquinileno C_{2-6} recta o ramificada opcionalmente sustituida, opcionalmente interrumpida o terminada por uno o más grupos carbocíclicos o heterocarbocíclicos, heteroátomos o grupos que contienen heteroátomo X^{1} tal como se han definido en esta reivindicación.

11. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 10, en el que X^{1} es un grupo -COHN-, Alk^{1} es una cadena -CH_{2}-CH< y Alk^{2} es una cadena -(CH_{2})_{4}-, -(CH_{2})_{5}- o -(CH_{2})_{6}.

12. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 8, el cual tiene la fórmula (1a):

(1a)[R^{7}]_{p}-(L^{3})_{q}-[R^{6}]_{m}(L^{1})_{n}-R^{2}

en la que

R^{2}, L^{1}, "m" y "n" son tal como se han definido para la fórmula (1);

R^{6} es una cadena de hidrocarburo;

L^{3} es un átomo o grupo conector;

R^{7} es una unidad de cola seleccionada entre polioles sintéticos, polioles que se dan en la naturaleza, poli(óxidos de alquileno) y derivados de los mismos;

"q" es cero o un número entero entre uno y seis;

"p" es un número entero entre uno y seis; con tal de que cada grupo R^{7} o L^{3}, si están presentes, estén unidos a un grupo R^{6} para conseguir al menos un átomo unido a la cadena de diez que se coloca a lo largo de R^{6} entre R^{7} o L^{3} y el grupo -(L^{1})_{n}-R^{2};

y sus sales, solvatos e hidratos.

13. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 12, en el que R^{2} es un grupo -WSp^{1}[WSp^{2}]_{b}WSp^{3} o -WSp^{1}[WSp^{2}]_{b}
WH en el cual Sp^{1}, Sp^{2} y Sp^{3}, que pueden ser los mismos o diferentes, son cada uno un grupo espaciador, "W" es un centro catiónico y "b" es cero o un número entero entre uno y seis.

14. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 13, en el que Sp^{1}, Sp^{2} y Sp^{3} son cada uno un grupo alifático, cicloalifático, aromático o heteroaromático opcionalmente sustituido.

15. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que Sp^{1}, Sp^{2} y Sp^{3} son cada uno una cadena de alquileno C_{1-6} opcionalmente sustituida.

16. Un lípido de acuerdo con cualquiera de la Reivindicación 13 a la Reivindicación 15, en el que "W" es un grupo -NH-.

17. Un lípido de acuerdo con cualquiera de la Reivindicación 13 a la Reivindicación 16, en el que "b" es un número entero entre 2 y 4.

18. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 12, en el que R^{2} es un grupo -NH[Sp^{1}NHSp^{2}]NH_{2}, -NH[Sp^{1}NHSp^{2}
NHSp^{2}]NH_{2} o -NH[Sp^{1}NHSp^{2}NHSp^{2}]NHCH_{3} en el que Sp^{1} es -CH_{2}- y cada Sp^{2} es -(CH_{2})_{3}- o -(CH_{2})_{4}-.

19. Un lípido de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 12 a la Reivindicación 18, en el que "m" es un número entero 1 ó 2.

20. Un lípido de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 12 a la Reivindicación 19, en el que R^{6} es una cadena alifática C_{10-60} opcionalmente sustituida.

21. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 20, en el que R^{6} es una cadena de alquileno C_{16-38} opcionalmente sustituida y lineal.

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22. Un lípido de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 12 a la Reivindicación 21, en el que "q" es el número entero 1 y "p" es un número entero 1 ó 2.

23. Un lípido de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 12 a la Reivindicación 22, en el que L^{3} es un átomo o grupo -X^{1}-, -X^{1}Alk^{1}X^{1}- o -[X^{1}Alk^{1}]_{2}X^{1}Alk^{2}X^{1}- en el que X^{1} es un átomo -O- o -S- o un grupo -C(O)-, -C(O)O-, -C(S)-, -S(O)-, -S(O)_{2}-, -N(R^{3})-, -CON(R^{3})-, -OC(O)N(R^{3})-, -CSN(R^{3})-, -N(R^{3})CO-, -N(R^{3})C(O)O-, -N(R^{3})CS-, -S(O)N(R^{3})-, -S(O)_{2}N(R^{3})-, -N(R^{3})S(O)-, -N(R^{3})S(O)_{2}-, -N(R^{3})CON(R^{3})- o -N(R^{3})SO_{2}N(R^{3}) en el que cada R^{3} se selecciona de manera independiente entre átomos de hidrógeno, grupos alquilo rectos y ramificados y cadenas de -Alk^{1}X^{1}-; y Alk^{1} y Alk^{2} pueden ser los mismos o diferentes y son cada uno una cadena de alquileno C_{1-6}, alquenileno C_{2-6} o alquinileno C_{2-6} recta o ramificada, opcionalmente sustituida, opcionalmente interrumpida o terminada por uno o más grupos carbocíclicos o heterocarbocíclicos, heteroátomos o grupos que contienen heteroátomo X^{1} tal como se han definido en esta reivindicación.

24. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 23, en el que L^{3} es un grupo -NHCO-, -CONH-, -CONH(CH_{2})_{2}
NHCO- o -[CONH(CH_{2})_{2}]_{2}NCO(CH_{2})_{2}CONH.

25. Un lípido de acuerdo con cualquiera de la Reivindicación 12 a la Reivindicación 24, en el que R^{7} es un poli(óxido de alquileno) o un derivado del mismo.

26. Un lípido de acuerdo con la Reivindicación 25, en el que R^{7} es un poli(óxido de etileno).

27. Un lípido de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 12 a la Reivindicación 24, en el que R^{7} es un poliol que se da en la naturaleza.

28. Un lípido de acuerdo con la reivindicación 27, en el que R^{7} es un mono u oligosacárido acíclico.

29. Una composición lipídica diana que comprende un lípido bipolar de acuerdo con cualquiera de la Reivindicación 1 a la Reivindicación 28 ensamblado con al menos una molécula diana.

30. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 29, en la que dicha molécula diana es un anticuerpo o un fragmento o un derivado del mismo.

31. Un complejo lipídico que comprende un lípido bipolar de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 1 a la Reivindicación 28 en asociación con al menos una sustancia bioactiva.

32. Un complejo de acuerdo con la Reivindicación 31, en el que dicha sustancia bioactiva es una proteína bioactiva, péptido, polisacárido, ácido nucleico, oligonucleótido o derivado del mismo, lípido, glucolípido, lipoproteína, lipopolisacárido o fracción vírica, bacteriana, protozoica, celular o de tejido.

33. Un complejo de acuerdo con la Reivindicación 32, en el que dicha sustancia bioactiva es un polianión.

34. Un complejo de acuerdo con la Reivindicación 33, en el que dicha sustancia bioactiva es un ácido nucleico.

35. Un complejo de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 31 a la Reivindicación 34, conteniendo dos o más lípidos bipolares diferentes.

36. Un complejo de acuerdo con la Reivindicación 35, en el que un lípido bipolar tiene unidades finales formadas por un poli(óxido de alquileno) o un derivado del mismo y el otro u otros tiene o tienen unidades finales formadas por un poliol sintético o que se da en la naturaleza.

37. Un complejo de acuerdo con la Reivindicación 36, en el que el poli(óxido de alquileno) es poli(óxido de etileno).

38. Un complejo de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 31 a la Reivindicación 37, comprendiendo además al menos una molécula diana.

39. Un complejo de acuerdo con la Reivindicación 38, en el que el lípido bipolar está asociado a dicha molécula diana.

40. Una composición que comprende un complejo de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 31 a la Reivindicación 39 y al menos otro lípido.

41. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 40, en la que dicho otro lípido es un lípido neutro o catiónico.

42. Una composición que comprende un complejo de acuerdo con una cualquiera de la Reivindicación 31 a la Reivindicación 41 y uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

43. Un método de preparación de un lípido bipolar tal como el definido en una cualquiera de la Reivindicación 1 a la Reivindicación 28, que comprende el acoplamiento de:

(A)

una cabeza catiónica que comprende dos o más centros catiónicos, conteniendo cada centro al menos un heteroátomo que es capaz de retener una carga positiva a un pH en el intervalo de 2 a 10 y que está covalentemente unido al otro u otros centros mediante uno o más grupos espaciadores que contienen carbono;

(B)

una cadena principal hidrófoba que comprende al menos una cadena de hidrocarburo; y

(C)

una cola hidrófila que comprende al menos una unidad de cola seleccionada entre polioles sintéticos, polioles que se dan en la naturaleza, poli(óxidos de alquileno) y derivados de los mismos,

en el que los materiales de partida (A), (B) y (C) contienen uno o más grupos funcionales reactivos adecuados para facilitar el acoplamiento de modo que dicha cadena de hidrocarburo de la cadena principal hidrófoba esté covalentemente unida a uno de dichos heteroátomos que retienen carga positiva en la cabeza catiónica y a dicha unidad de cola en la cola hidrófila de modo que la cadena contiene al menos diez átomos unidos en cadena entre sus puntos de uniones a dicho heteroátomo que retiene carga positiva y a dicha unidad de cola.

44. Un método de acuerdo con la Reivindicación 43, que comprende la etapa de desprotección de un derivado protegido de dicho lípido.

45. Un método de preparación de un complejo lipídico tal como el definido en una cualquiera de la Reivindicación 31 a la Reivindicación 39, que comprende mezclar dicho lípido bipolar con una sustancia bioactiva.

46. El uso de un complejo tal como el definido en una cualquiera de la Reivindicación 31 a la Reivindicación 39 para el reparto de una sustancia bioactiva a células in vitro.

47. El uso de una composición tal como la definida en una cualquiera de la Reivindicación 40 a la Reivindicación 42 para la preparación de un medicamento para el reparto de una sustancia bioactiva.

48. El uso tal como se ha reivindicado en la Reivindicación 46 o la Reivindicación 47, en el que dicha sustancia bioactiva es un agente terapéutico, de diagnóstico o inmunomodulador.