ES2288486T3 - Tratamiento de canceres con aplidina. - Google Patents

Abstract

Uso de aplidina en la preparación de una composición farmacéutica para un método de tratamiento del cáncer en un paciente, que comprende administrar aplidina mediante infusión intravenosa según uno de los siguientes regímenes: a. infusión de 24 horas semanalmente durante tres semanas, seguido por una semana de descanso, a una dosis recomendada no superior a 3750 mcg/m2/sem, b. infusión de 24 horas bisemanalmente a una dosis recomendada no superior a 7000 mcg/m2/sem, c. infusión de 1 hora semanalmente durante tres semanas cada 4 semanas a una dosis recomendada no superior a 3600 mcg/m2/sem.

Description

Tratamiento de cánceres con aplidina.

La presente invención se refiere al tratamiento de cánceres.

Antecedentes de la invención

El cáncer comprende un grupo de neoplasias malignas que pueden dividirse en dos categorías, carcinoma, que comprende una mayoría de los casos observados en las clínicas, y otros cánceres menos frecuentes, que incluyen leucemia, linfoma, tumores del sistema nervioso central y sarcoma. Los carcinomas tienen su origen en tejidos epiteliales mientras que los sarcomas se desarrollan a partir de tejidos conjuntivos y aquellas estructuras que tenían su origen en tejidos mesodérmicos. Los sarcomas pueden afectar, por ejemplo, al músculo o al hueso y pueden producirse en los huesos, la vejiga, los riñones, el hígado, el pulmón, la parótida o el bazo.

El cáncer es invasivo y tiende a metastasizarse hacia nuevos sitios. Se propaga directamente en los tejidos circundantes y también puede diseminarse a través de los sistemas circulatorio y linfático. Están disponibles muchos tratamientos para el cáncer, incluyendo cirugía y radiación para enfermedad localizada, y fármacos. Sin embargo, la eficacia de los tratamientos disponibles en muchos tipos de cáncer es limitada, y se necesitan nuevas formas mejoradas de tratamiento que muestren beneficio clínico. Esto es especialmente cierto para aquellos pacientes que presentan enfermedad avanzada y/o metastásica. Es también cierto para pacientes que recaen en la enfermedad progresiva después de haberse tratado previamente con tratamientos establecidos para los que el tratamiento adicional con el mismo tratamiento es en general ineficaz debido a la adquisición de resistencia o a limitaciones en la administración de los tratamientos debido a las toxicidades asociadas.

La quimioterapia desempeña una parte significativa en el tratamiento del cáncer, ya que se requiere para el tratamiento de cánceres avanzados con metástasis a distancia y a menudo es útil para la reducción del tumor antes de la cirugía, y se han desarrollado muchos fármacos anticancerígenos basados en diversos modos de acción.

La deshidrodidemnina B, también conocida como aplidina, es el objeto del documento WO91/04985.

Puede encontrarse información adicional sobre la aplidina en, por ejemplo:

Jimeno, J., "Exploitation of marine microorganisms and invertebrates: Anticancer drugs from marine origin", IBC Conf Discov Drugs from Nat Novel Approaches New Sources (8-9 de diciembre, Londres) 1994.

Faircloth, G. et al., "Dehydrodidemnin B (DDM) a new marine derived anticancer agent (MDA) with activity against experimental tumour models", 9th NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (12-15 de marzo, Amsterdam) 1996, Abst 111.

Sakai, R. et al., "Structure-activity relationships of the didemnins", Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39(14): 2819.

Urdiales, J.L. et al., "Antiproliferative effect of dehydrodidemnin B (DDB), a depsipeptide isolated from Mediterranean tunicates", Cancer Letters 1996, 102(1-2): 31.

Faircloth, G. et al., "Preclinical characterization of aplidine (APD), a new marine anticancer depsipeptide (MADEP)", Proc Amer Assoc Cancer Res 1997, 38: Abst 692.

Depenbrock, H. et al., "In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells", British Journal of Cancer 1998, 78(6): 739.

Faircloth, G. et al., "Aplidine (aplidine) is a novel marine-derived depsipeptide with in vivo antitumour activity", Proc Amer Assoc Cancer Res 1998, 39: Abst 1551.

Faircloth, G. et al., "Preclinical development of aplidine, a novel marine-derived agent with potent antitumour activity", 10th NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (16-19 de junio, Amsterdam) 1998, Abst 129.

Mastbergen, S.C. et al., "Cytotoxicity and neurocytoxicity of aplidine, a new marine anticancer agent evaluated using in vitro assays", 10th NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (16-19 de junio, Amsterdam) 1998, Abst 131.

En estudios preclínicos, la aplidina tuvo una actividad citotóxica dependiente de la dosis frente a las dos líneas celulares de tipo epitelial, CT-1 y CT-2, y la línea celular de cáncer de colon humano, HT-29. La línea más proliferativa, CT-2, fue la más sensible a la aplidina. Además, el compuesto disminuyó la actividad ornitina descarboxilasa en las tres líneas celulares (Lobo C, Garcia-Pozo SG, et al. Effect of dehydrodidemnin B on human colon carcinoma cell lines. Anticancer Research. 17: 333-336, enero-febrero de 1997). En un estudio similar, la aplidina 50 nmol/l inhibió el crecimiento de las líneas celulares de cáncer de mama, MDA-MB231 y MCF-7 en un 17 y un 47%, respectivamente.

Se observó un aumento significativo en espermidina y espermina en las células tratadas (Gomez-Fabre PM, DePedro E, et al). Polyamine contents of human breast cancer cells treated with the cytotoxic agents chlorpheniramine and dehydrodidemnin B. Cancer Letters. 113: 141-144, 26 febrero de 1997). El análisis por citometría de flujo mostró que la aplidina no inducía ninguna perturbación evidente del ciclo celular (Erba E, Balconi G, et al. Cell cycle phases pertubations induced by new natural marine compounds. Annals of Oncology. 7 (Supl. 1): 82, 1996). En ratones, la aplidina era activa frente a la leucemia P388 y melanoma B16 implantados, con una dosis óptima de 160 microgramos/kg. A diferencia de la didemnina B, la aplidina era activa en carcinomas de pulmón de lewis implantados s.c. (Faircloth G, Rinehart K, et al. Dehydrodidemnin B a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumour models. Annals of Oncology. 7 (Supl. 1): 34, 1996).

La exposición continua a bajas concentraciones de aplidina inhibió el crecimiento de varias líneas celulares tumorales, incluyendo linfoma no Hodgkin, melanoma y melanoma de mama, cánceres de ovario y de pulmón de células no pequeñas. La magnitud del efecto era dependiente del tiempo de exposición y parecía que podía lograrse a concentraciones no mielotóxicas. El cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer de mama y las líneas celulares de melanoma eran sensibles a una exposición continua a aplidina a concentraciones de \geq 0,001 micromol/l. La aplidina tenía una toxicidad similar a la doxorubicina frente a células madre hematopoyéticas clonogénicas (Depenbrock H, Peter R, et al. In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells. British Journal of Cancer. 78: 739-744, Nº 6, septiembre de 1998).

La aplidina tuvo actividad significativa frente a ratones que portaban xenoinjertos de cáncer humano. A una dosis tolerada máxima de 2,1 mg/kg, la aplidina produjo casi remisiones completas en algunos animales a una razón de tumor tratado/control (T/C) del 9%. A 1,25 mg/kg, se observó una actividad significativa frente a tumores gástricos (T/C del 14%) y se observó también la inhibición del crecimiento del tumor de próstata (T/C del 25%) (Faircloth G, Grant W, et al. Preclinical development of aplidine, a novel marine-derived agent with potent antitumour activity. Annals of Oncology. 9 (Supl. 2): 34, 1998).

Sumario de la invención

Los inventores han desarrollado métodos para tratar pacientes humanos con aplidina que conducen a una mejora clínica. La invención se refiere a un uso tal como se reivindica en la reivindicación 1.

Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen líquidos (disoluciones, suspensiones o emulsiones) con composición adecuada para administración intravenosa, y pueden contener el compuesto puro o en combinación con cualquier vehículo u otros compuestos farmacológicamente activos.

Puede usarse el compuesto aplidina con otros fármacos para proporcionar una terapia de combinación. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición, o pueden proporcionarse como una composición separada para administración en el mismo momento o en un momento diferente. La identidad del otro fármaco no está particularmente limitada, y los candidatos adecuados incluyen:

a) fármacos con efectos antimitóticos, especialmente aquellos que seleccionan como diana elementos del citoesqueleto, incluyendo moduladores de microtúbulos tales como fármacos de taxano (tales como taxol, paclitaxel, taxotere, docetaxel), podofilotoxinas o alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina);

b) fármacos antimetabolitos (tales como 5-fluorouracilo, citarabina, gemcitabina, análogos de purina tales como pentostatina, metotrexato);

c) agentes alquilantes o mostazas nitrogenadas (tales como nitrosoureas, ciclofosfamida o ifosfamida);

d) fármacos que seleccionan como diana el ADN tales como los fármacos de antraciclina adriamicina, doxorubicina, farmorubicina o epirubicina;

e) fármacos que seleccionan como diana topoisomerasas tales como etopósido;

f) hormonas y agonistas o antagonistas de hormonas tales como estrógenos, antiestrógenos (tamoxifeno y compuestos relacionados) y andrógenos, flutamida, leuprorelina, goserelina, ciproterona u octreotida;

g) fármacos que seleccionan como diana la transducción de señales en células tumorales incluyendo derivados de anticuerpos tales como herceptina;

h) fármacos alquilantes tales como fármacos de platino (cis-platino, carboplatino, oxaliplatino, paraplidineatina) o nitrosoureas;

i) fármacos que afectan potencialmente la metástasis de tumores tales como inhibidores de la metaloproteinasa de la matriz;

j) terapia génica y agentes antisentido;

k) agentes terapéuticos de anticuerpos;

l) otros compuestos bioactivos de origen marino, particularmente Kahalalide F o las ecteinascidinas tales como et-743;

m) protectores del músculo esquelético tales como complementos de carnitina;

o) otros fármacos que combaten los efectos secundarios de la aplidina tales como antieméticos;

p) más generalmente fármacos que permiten que la aplidina se dosifique a la dosis recomendada y controlar la toxicidad.

Se ha descubierto además que la aplidina inhibe la expresión del gen (FLT1) que codifica para el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV).

Además, se ha descubierto que la aplidina inhibe gravemente la producción de la misma proteína FCEV por las células tumorales.

La secreción de FCEV por una masa celular, en particular una masa de células tumorales, produce vascularización de novo (angiogénesis), lo que conduce a que se formen nuevos vasos sanguíneos hacia la masa celular y a que se establezca una red de capilares que puede suministrarle irrigación para su proliferación sostenida. Estos efectos, en particular la supresión demostrada de la producción de FCEV por células tumorales, se espera que inhiban gravemente la capacidad de las células tumorales de dar lugar a angiogénesis. Además, algunas células tumorales hematopoyéticas (tales como células de leucemia humana MOLT4) requieren FCEV directamente como factor de crecimiento.

Por tanto, puede predecirse que la aplidina tiene un efecto inhibidor sobre la vascularización de novo de metástasis o tumores primarios en crecimiento, inhibiendo de ese modo el crecimiento de los tumores, que se sabe que requieren la vascularización para el crecimiento. La aplidina debe ser activa sobre tumores hematopoyéticos.

Además, se sabe que la aplidina modula la función de canal de calcio en las células.

Los tumores de vejiga son un tipo de tumor que sobreexpresa el receptor para el factor de crecimiento epitelial (EGF), que conduce a la regulación por incremento de FCEV y del receptor de FCEV. Se cree que la unión de FCEV a su receptor conduce a la estimulación del crecimiento celular por medio de cambios locales transitorios de ion calcio entre otros mecanismos para la señalización. Se espera que un compuesto que inhibe la acción de FCEV sea inhibidor para tales tumores.

Experimentalmente, se ha encontrado que la aplidina tiene una actividad extremadamente alta sobre el cáncer de vejiga humano (dando remisiones completas en algunos modelos animales), de acuerdo con la predicción.

Puede predecirse que la aplidina tiene una actividad antitumoral de amplio espectro debido a sus efectos sobre un gran número de tumores.

El efecto de FCEV es más relevante debido a que implica una inhibición de nuevos vasos sanguíneos. Además de los efectos sobre los vasos sanguíneos, determinados tumores requieren FCEV directamente para el crecimiento celular (es decir, leucemia, linfomas, tumores de vejiga y tumores de ovario).

En consecuencia, se prevé un método de tratamiento de un tumor que es dependiente del proceso angiogénico que implica la administración de aplidina. La invención proporciona además un procedimiento para preparar un inhibidor de la invasión del cáncer o metástasis del cáncer que comprende mezclar una dosis eficaz de aplidina con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En particular, se prevén métodos para tratar trastornos de la angiogénesis tales como neoplasia incluyendo metástasis.

Se han observado respuestas en pacientes con cáncer en ensayos clínicos con aplidina, lo que demuestra la utilidad del método de tratamiento.

Los estudios clínicos de fase I y los análisis farmacocinéticos demuestran que la aplidina presenta una ventana terapéutica positiva con toxicidad razonable en el intervalo de dosificación requerido para la eficacia clínica en el tratamiento de pacientes con cáncer.

La aplidina se suministra y almacena como un producto liofilizado estéril, que consiste en aplidina y excipiente en una formulación adecuada para uso terapéutico.

La aplidina solubilizada muestra degradación sustancial en condiciones de prueba de estrés por calor y luz, y se desarrolló una forma de dosificación liofilizada, véase el documento WO99/42125. En una realización actualmente preferida, se realizó el secado por congelación a partir de una disolución de aplidina 500 mg/ml en terc-butanol al 40% (v/v) en agua para inyección (API) que contenía D-manitol 25 mg/ml como agente de carga. El prototipo, que contenía 500 mg de aplidina y 25 mg de D-manitol como agente de carga por vial, se encontró que era la formulación óptima en cuanto a solubilidad, duración del ciclo de liofilización y requisitos de dosificación en los estudios clínicos. Se encontró que la disolución de reconstitución óptima era Cremaphor EL/etanol/API (CEW) 15/15/70% (v/v/v). Tanto el producto reconstituido como las diluciones (hasta 1:100 v/v) del producto reconstituido con solución salina normal parecían ser estables durante al menos 24 horas tras la preparación. Los datos de la vida útil de almacenamiento, disponibles hasta la fecha, muestran que la formulación es estable durante al menos 1 año cuando se almacena a 4ºC en la oscuridad.

La preparación de la disolución de infusión también se realiza en condiciones asépticas retirando el volumen de disolución reconstituido correspondiente a la dosificación calculada para cada paciente, e inyectando lentamente el volumen requerido de disolución reconstituida en una bolsa o botella de infusión que contiene entre 100 y 1000 ml de cloruro de sodio al 0,9%, después de lo cual se homogeniza el total mediante agitación manual lenta. La disolución de infusión de aplidina debe administrarse por vía intravenosa, tan pronto como sea posible, en el plazo de 48 horas tras la preparación. Los sistemas de infusión de PVC y polietileno, así como de vidrio transparente, son recipientes y materiales de conducto preferidos.

La administración se realiza en ciclos. Los retrasos en la dosis y/o las reducciones en la dosis y los ajustes en el programa se realizan tal como se necesite dependiendo de la tolerancia del paciente individual a los tratamientos, en particular se recomiendan reducciones en la dosis para pacientes con niveles en suero superiores a los normales de transaminasas hepáticas, o fosfatasa alcalina o bilirrubina.

La dosis recomendada (DR) es la dosis más alta que puede administrarse de manera segura a un paciente que produce toxicidad tolerable, razonable y reversible según los criterios comunes de toxicidad establecidos por el Instituto Nacional del Cáncer (National Cancer Institute), (EE.UU), presentando, no más de 2 de cada 6 pacientes alguna toxicidad limitante de la dosis (TLD).

Las directrices para el tratamiento del cáncer requieren frecuentemente la administración de agentes quimioterapéuticos a la dosis segura más alta a la que la toxicidad es razonable con el fin de lograr la eficacia (DeVita, V.T. Jr., Hellman, S. y Rosenberg, S.A., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 3ª ed., 1989, Lipincott, Filadelfia).

Se determinaron las TLD para la aplidina en estudios clínicos. Estos estudios establecieron un nivel de dosis recomendada para diferentes tipos de protocolos de dosificación.

La aplidina puede administrarse de manera segura a un nivel de dosificación a la dosis recomendada (DR) o por debajo.

Los regímenes de infusión de esta invención son los siguientes:

infusión de 24 horas semanalmente durante varias semanas, dígase tres semanas, seguido de una semana de descanso;

infusión de 24 horas bisemanalmente;

infusión de 1 hora semanalmente durante 3 semanas cada 4 semanas;

En particular, la infusión intravenosa puede llevarse a cabo como una infusión de 24 horas una vez a la semana durante 3 semanas cada 4 semanas. Se dan más datos en los ejemplos 3, 4, 10 y 11. Una dosis recomendada de 3750 \mug/m^{2}/sem x 3 parece ser apropiada. Este protocolo se ha corregido y los pacientes se tratarán ahora usando un programa diferente que parece viable: 3 horas de infusión cada 2 semanas sin descanso. Véase el ejemplo 11. En el estudio de 24 horas bisemanalmente, los pacientes se están tratando a 7000 \mug/m^{2}/2 sem. Véanse los ejemplos 6, 13 y 16. Los pacientes incluidos en el estudio de 1 h/sem x 3 cada 4 semanas se están tratando a dosis de hasta 3600 \mug/m^{2}/sem x 3 semanas. Véanse los ejemplos 12 y 15. Cuando se usa la aplidina en combinación con otros agentes terapéuticos, puede necesitarse ajustar las dosificaciones de ambos agentes.

Previamente, las principales respuestas biológicas notificadas para la administración de aplidina se habían observado en animales o en modelos in vitro, conocidos por ser notoriamente inexactos en lo que se refiere a su utilidad para predecir respuestas en pacientes humanos, o en pacientes humanos en sistemas experimentales en los que no estaba disponible un método de tratamiento eficaz y seguro (o bien la dosificación usada era una dosis tóxica significativamente elevada por encima de la dosis recomendada o bien el programa de administración no era apropiado).

En ensayos clínicos que usaban el método de esta invención, se lograron niveles plasmáticos apropiados en pacientes a la DR, y de la manera más importante, las respuestas objetivamente medibles demostraron pruebas de beneficio clínico para los pacientes.

Las definiciones para las toxicidades de los pacientes se adoptan de los criterios de la OMS y las respuestas se determinan siguiendo los criterios de respuesta de la OMS.

Se obtuvieron respuestas objetivas en pacientes con cánceres metastáticos y/o avanzados resistentes a tratamientos previos, que incluían los descritos en los ejemplos.

En particular, el tratamiento con este método ha mostrado respuestas en pacientes con cáncer con enfermedad avanzada y/o metastásica, que mostraban enfermedad progresiva después de haberse tratado previamente con tratamientos establecidos.

Por tanto, un método preferido implica identificar pacientes con cáncer que se han tratado para el cáncer, particularmente pacientes que han recibido quimioterapia, y tratarlos con aplidina.

Descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la disminución en la expresión de flt-1 observada usando micromatrices confirmado por el análisis por RT-PCR.

La figura 2 muestra la disminución en el ARNm de flt-1 inducida por la aplidina en células MOLT-4.

Las figuras 3a y 3b muestran el bucle autocrino FCEV-Flt-1 en células MOLT-4 y el efecto de la aplidina.

La figura 4 muestra que la aplidina bloquea la secreción de FCEV a partir de células MOLT-4.

La figura 5 muestra el bloqueo inducido por la aplidina de la secreción de FCEV.

La figura 6 muestra una fuerte disminución en los niveles de ARNm de FCEV en células MOLT-4.

La figura 7 muestra que la dosis de aplidina no disminuye la actividad del promotor de FCEV transfectado en células MOLT-4.

La figura 8 muestra que la aplidina no bloquea la unión de los factores de transcripción HIF-1 y AP-1 a sus secuencias consenso de ADN presentes en el promotor de FCEV.

La figura 9 muestra que la aplidina no bloquea la unión del factor de transcripción HIF-1 a sus secuencias consenso de ADN presentes en el promotor de FCEV.

Las figuras 10a y 10b muestran que el FCEV añadido en el medio de cultivo de células MOLT-4 redujo ligeramente la actividad de bajas concentraciones de aplidina mientras que a altas concentraciones no tiene efectos.

La figura 11 muestra que la aplidina puede reducir la secreción de FCEV a partir de la línea de cáncer de ovario humano IGROV-1.

La figura 12 muestra que la aplidina reduce los niveles de ARNm de FCEV también en la línea de cáncer de ovario human IGROV-1.

La figura 13 muestra que la aplidina no afecta a la actividad del promotor de FCEV media usando el sistema del gen indicador de luciferasa/renilla.

La figura 14 muestra una relación dosis-AUC.

Las figuras 15a y 15b muestran la actividad en el cáncer de tiroides medular: niveles de ACE.

Ejemplos Ejemplo 1

(Ejemplo comparativo)

Perfil de expresión génica en células MOLT4 leucémicas tratadas con el compuesto marino aplidina

Se evaluaron los cambios tempranos en la expresión génica inducida por la aplidina en células MOLT-4 usando matrices de expresión de ADNc (Atlas Human Cancer, Clontech). Se trataron las células MOLT-4 durante 1 hora con concentraciones de aplidina que inhiben el crecimiento en un 50% y se aisló ARN total a las 0, 1, 6 y 24 horas después de que se lavase el fármaco. Se hibridaron los filtros con cantidades iguales de ADNc marcado con 32P. Se llevó a cabo el análisis de los resultados usando el software ATLAS IMAGE 1.0. Los cambios en la expresión génica mayores de dos veces se tomaron como cambios significativos en la expresión de ARN y se confirmaron posteriormente mediante PCR. Se observó una marcada reducción dependiente del tiempo en la expresión de FCEV-R1 (flt-1) y se confirmó a nivel del ARN mediante PCR y a nivel de la proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western.

Ejemplo 2

(Ejemplo comparativo)

Correlación de actividades antitumorales selectivas del compuesto derivado del mar aplidina usando diferentes sistemas modelo

Se evaluaron diferentes sistemas modelo para proporcionar la base para el trabajo clínico adicional. Se observaron actividades antitumorales selectivas frente a dos tumores sólidos histológicamente diferentes: carcinomas gástrico y de próstata humanos. Es evidente una potente actividad in vitro frente a las muestras de tumor gástrico primario o a las células tumorales gástricas Hs746T con valores de CI_{50} de 146 y 450 pM, respectivamente. Se determinó una actividad CI_{50} menos potente, pero no menos selectiva, de 3,4 nM, frente a células de tumor de próstata PC-3. Se evaluaron las actividades in vitro en roedores desnudos usando fragmentos de tumor implantados s.c. o fibras huecas (FH) que contenían células tumorales.

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TABLA 1 Dosis óptima y actividades in vivo de la aplidina

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Se observaron actividades óptimas en tumores gástricos xenoinjertados (17-20%) y de próstata (25-38%) tras la administración i.p. Los estudios de seguimientos necesitaron usar ratas para infusiones i.v. Con esta variación, un programa de infusión i.v. de 24 horas produjo actividades similares frente a las células de tumor gástrico FH (20%) y de próstata FH (31%). También se encontró citotoxicidad usando un programa de infusión i.v. de 5 días frente a células de tumor de próstata FH (33%). Las evaluaciones in vivo prolongadas no solo muestran que existe una fuerte correlación con el perfil citotóxico in vitro, sino también una fuerte correlación con modelos in vivo usados para caracterizar la selectividad del tumor que identificó la aplidina como un candidato para el desarrollo clínico.

Ejemplo 3 Un estudio farmacocinético y de fase I de aplidina administrada como una infusión de 24 horas semanalmente en pacientes con tumores sólidos avanzados

Los estudios in vivo revelaron que aumentó la actividad in vivo prolongando la duración de la infusión. En este estudio se trataron 16 pacientes. Características de los pacientes: edad media 55 años, EG medio 1, hombres/mujeres 11/5, siendo los tipos de tumor tal como sigue: de cabeza y cuello 5, de riñón 2, de colon 3, de recto 2, sarcoma 1 y melanoma 3, tratados todos previamente con quimioterapia (2 líneas de media).

Se administró la aplidina como una infusión de 24 h a los siguientes niveles de dosis (ND): 133 (3 pacientes), 266 (3 pacientes), 532 (3 pacientes), 1000 (3 pacientes), 2000 (3 pacientes) y 3000 (1 paciente) mcg/m^{2}/sem x 3 cada 28 días.

No se observaron toxicidades limitantes de la dosis (TLD). Sólo se notificaron toxicidades no hematológidas suaves que consistían en náuseas g 1, mucositis g 1, astenia g 1. La flebitis del brazo de la infusión era común y dependiente de la concentración. Se realizó análisis farmacocinético en todos los pacientes, que mostraban niveles plasmáticos a los ND de 1000 mcg/m^{2}/sem y de 2000 mcg/m^{2}/sem equivalentes a la concentración activa in vitro (1 ng/ml). Se observó una mejora clínica a un ND de 532 mcg/m^{2}/sem en 1 paciente tratado previamente con melanoma avanzado.

Ejemplo 4 Estudio farmacocinético (FC) y de fase I de la aplidina (APL) usando un programa de 24 horas, semanalmente

Hasta la fecha, se han tratado en este estudio de fase I 25 pacientes (edad media 58 años, ECOG media 1) con linfoma o tumores sólidos avanzados, tratados previamente. Usando un programa de APL de 24 h semanalmente x 3 seguido de 1 semana de descanso, se han sometido a prueba los siguientes niveles de dosis: 133 (n-3 pacientes), 266 (3), 532 (3), 1000 (3), 2000 (3), 4500 (3) y 3750 \mug/m^{2}/sem (3). Con 60 ciclos (180 infusiones) administrados, se evaluaron todos los pacientes para determinar la toxicidad. La dosis máxima tolerada fue de 4500 \mug/m^{2}/sem x 3 con una toxicidad muscular de grado (G) 3 (atrofia muscular de tipo II comprobada por biopsia). CPK G4 y transaminitis G3 fueron las toxicidades limitantes de la dosis en 2 ó 4 pacientes. Se observó malestar G2 en la mayoría de los pacientes y emesis G2/3 a \geq 2000 \mug/m^{2}. La flebitis es común pero dependiente de la concentración. Se tomaron muestras de todos los pacientes para el análisis de FC mediante LC-EM/EM. Los datos preliminares indican una distribución en el tejido extensa, un t ½ de eliminación largo de 10-24 horas y niveles plasmáticos > 1 ng/ml (que es activo in vitro). Un paciente con melanoma avanzado resistente a DTIC/interferón tuvo una mejora clínica mantenida durante > 30 semanas. Este estudio de infusión semanalmente demuestra la viabilidad y la actividad de un programa de APL de dosis densa. Tal como se esperaba, la toxicidad neuromuscular es limitante de la dosis. Se está evaluando la dosis posible recomendada de 3750 \mug/m^{2}/sem x 3.

Ejemplo 5 Farmacocinética clínica (FC) de la aplidina (APL) en pacientes con tumores sólidos y linfomas no Hodgkin

Están en evaluación de fase I cuatro programas intravenosos: infusión de 24 h semanalmente, infusión de 24 h bisemanalmente e infusión de 1 h 5 días consecutivos cada 3 semanas. Se analizaron las concentraciones sanguíneas de APL mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem. Los resultados iniciales muestran acumulación en células sanguíneas y una FC plasmática caracterizada por una distribución extensa (volumen de distribución normalmente en exceso de 200 l/m^{2}) y semividas de eliminación en el orden de 10 a 24 h. Un modelo de 2 compartimentos abierto se ajusta apropiadamente a la mayoría de los perfiles tras la infusión de 24 h. Para infusiones de 1 h, un modelo de 3 compartimentos proporciona un mejor ajuste en la mayoría de los casos. Se sabe que los niveles plasmáticos obtenidos son activos in vitro. Está en curso la evaluación de pacientes adicionales y una comparación de la FC plasmática y de células sanguíneas.

Ejemplo 6 Resultados preliminares de un estudio farmacocinético y de fase I de la aplidina administrada como una infusión de 24 h cada 2 semanas en pacientes con tumores sólidos y linfomas no Hodgkin

Se administra aplidina como una infusión de 24 horas cada 2 semanas. La dosis inicial fue de 200 \mug/m^{2}/d y se realizó un aumento de la dosis incluyendo hasta el momento 400, 800, 1600 y 3200 \mug/m^{2}/d. Han entrado un total de 18 pacientes (H/M: 7/11, edad media 52, OMS 0/1: 10/8). Hasta el momento no se ha observado toxicidad limitante de la dosis. Entre los pacientes evaluables, la toxicidad consistía en náuseas/vómitos suaves de grado I-II, astenia de grado I-II y calambres que se producían durante o inmediatamente después de la infusión. No se notificó toxicidad neuromuscular a las dosis evaluadas. Un paciente con un cáncer de pulmón avanzado y progresión del tumor documentada a la dosis de 1600 \mug/m^{2} desarrolló una anemia hemolítica y trombocitopenia que se consideró que no estaba relacionada probablemente con el fármaco de estudio. El análisis farmacocinético inicial mostró que el fármaco se distribuye extensamente y las concentraciones sanguíneas. Un modelo de 2 compartimentos abierto se ajusta apropiadamente a la mayoría de los perfiles de concentración plasmática. La semivida terminal está normalmente en el orden de 10-24 h. Se observó mejora clínica en un paciente con un linfoma no Hodgkin. La recolección está en curso para determinar la toxicidad limitante de la dosis y la dosis que va a recomendarse en los estudios de fase II.

Ejemplo 7

(Ejemplo comparativo)

Perfil de expresión génica en células MOLT4 leucémicas humanas tratadas con el compuesto marino aplidina

En el presente estudio, se han evaluado los cambios tempranos en la expresión génica inducidos por la aplidina en células MOLT-4 usando matrices de expresión de ADNc (Atlas Human Cancer, Clontech). Se trataron células MOLT-4 durante 1 hora con concentraciones de aplidina que inhiben el crecimiento en el 50% y se aisló el ARN total a las 0, 1, 6 y 24 horas después de que se lavase el fármaco. Se hibridaron los filtros con cantidades iguales de ADNc marcado con 32P. Se llevó a cabo el análisis de los resultados usando el software ATLAS IMAGE 1.0. Los cambios en la expresión génica mayores de dos veces se tomaron como cambios significativos en la expresión de ARN y se confirmaron posteriormente por PCR. Se observó una marcada reducción dependiente del tiempo en la expresión de FCEV-R1 (flt-1) y se confirmó al nivel de ARN mediante PCR y al nivel de la proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western. Actualmente, está en investigación si la regulación por disminución de flt-1 está implicada en el efecto citotóxico y antitumoral de la aplidina. También, la caracterización de la expresión de otros agentes que parecen estar regulados por disminución tras la exposición a aplidina está actualmente en marcha.

Cambios cuantitativos en la expresión génica inducidos por la aplidina en células MOLT-4

3

La disminución en la expresión de flt-1 observada usando micromatrices, se confirmó mediante análisis por RT-PCR, véase la figura 1.

Usando protección de ARNasa, se cuantificó la disminución en el ARNm de flt-1 inducida por aplidina 20 nM en células MOLT-4, véase la figura 2.

Las figuras 3a y 3b muestran el bucle autocrino FCEV-Flt-1 en células MOLT-4 y el efecto de la aplidina en el bucle autocrino FCEV-FLT-1.

La aplidina bloquea la secreción de FCEV a partir de células MOLT-4, véase la figura 4. Se trataron las células durante 1 h con aplidina 20 nM. Se midió el FCEV secretado en el medio mediante ELISA al final del tratamiento y tras incubación de 6 y 24 horas en medio libre de fármaco.

El bloqueo inducido por la aplidina de la secreción de FCEV depende de la concentración y puede observarse todavía a 5 nM, véase la figura 5.

Usando protección de ARNasa, pudo observarse una fuerte disminución en los niveles de ARNm de FCEV en células MOLT-4 después de aplidina 20 nM, véase la figura 6.

La aplidina no disminuye la actividad del promotor de VEGF transfectado en células MOLT-4, véase la figura 7. Se transfectaron las células con el promotor de VEGF (que abarca las primeras 1000 bases en sentido 5' del sitio de iniciación unido al gen indicador de la luciferasa) y con un plásmido control que contenía el gen indicador de la renilla. Se trataron entonces las células con diferentes concentraciones de aplidina y se midió la actividad luciferasa tras 24 horas y se comparó con la actividad renilla.

La aplidina no bloquea la unión de los factores de transcripción HIF-1 y AP-1 a sus secuencias de ADN consenso presentes en el promotor de VEGF, véase la figura 8. Se incubaron extractos nucleares con diferentes concentraciones de aplidina y oligonucleótidos marcados durante 60 min. Usando un ensayo de retardo en gel, se monitorizó la unión de HIF-1 o AP-1.

La aplidina no bloquea la unión del factor de transcripción HIF-1 a sus secuencias de ADN consenso presentes en el promotor de VEGF, véase la figura 9. Se incubaron extractos nucleares, obtenidos de células tratadas con diferentes concentraciones de aplidina, con oligonucleótidos marcados durante 60 min. Usando un ensayo de retardo en gel, se monitorizó la unión de HIF-1.

VEGF (10 ng/ml) añadido en el medio de cultivo de las células MOLT-4 cultivadas en FCS al 10% redujo ligeramente la actividad de bajas concentraciones de aplidina mientras que a altas concentraciones no tiene efectos, véanse las figuras 10a, 10b.

La aplidina también puede reducir la secreción de VEGF a partir de la línea de cáncer de ovarios humano IGROV-1, véase la figura 11.

La aplidina reduce los niveles de ARNm de VEGF también en la línea de cáncer de ovarios humano IGROV-1, véase la figura 12.

La aplidina no afecta a la actividad del promotor de VEGF medida usando el sistema del gen indicador de luciferasa/renilla, véase la figura 13.

Ejemplo 8

(Ejemplo comparativo)

La aplidina bloquea la secreción de VEGF y el bucle autocrino VEGF/VEGF-R1 en una línea de células leucémicas humanas

Se encontró que la aplidina induce fuerte apoptosis en la línea celular de leucemia humana MOLT-4. En la misma línea celular, el análisis de micromatrizes reveló cambios en la expresión de diferentes genes en momentos tempranos tras el tratamiento. Entre estos, se encontró que VEGF-R1(flt-1) se reguló por disminución mediante el tratamiento con fármaco y se confirmó su regulación por disminución mediante análisis de inmunotransferencia de tipo northern y western. Estudios adicionales mostraron que el tratamiento del mismo sistema celular con el compuesto dio como resultado una fuerte reducción de la secreción de VEGF en el medio. La disminución en la secreción de VEGF estaba asociada con una disminución en el ARNm que codifica para VEGF en las células MOLT-4 tratadas con aplidina. Intentado esclarecer el mecanismo mediante el cual la aplidina bloquea la secreción de VEGF, se encontró que el compuesto no cambia la semivida del ARNm de VEGF. De manera similar, usando el ensayo de desplazamiento por electromovilidad, la aplidina no cambió la capacidad de dos factores de transcripción, HIF-1 y AP-1 de unirse a su secuencia consenso respectiva presente en el promotor de VEGF y no disminuyó la transcripción de VEGF cuando se usó un constructo promotor de VEGF-luciferasa en experimentos de transfección transitoria. La disminución de secreción de aplidina estaba asociada con un aumento de la acumulación intracelular de VEGF, lo que sugiere fuertemente que el compuesto podría actuar a través de un bloqueo de la secreción de VEGF. El tratamiento simultáneo de células MOLT-4 con bajas concentraciones de aplidina y VEGF suprimió parcialmente la actividad de la aplidina, lo que sugiere que el fármaco podría ejercer parcialmente su actividad en este sistema celular mediante el bloqueo del bucle autocrino VEGF/VEGF-R1.

Ejemplo 9

(Ejemplo comparativo)

Perfil de seguridad in vitro de la aplidina, un producto natural marino con potencial quimioterapéutico

Usando el ensayo de citotoxicidad in vitro CellTiter96 (MTS, Promega), la aplidina muestra poca toxicidad hepática (AML-12) o cardiaca (H9 c2 (2-1); DL_{50} de 1 \muM). En cambio, la aplidina es muy tóxica para el músculo esquelético (L8) y las células renales (NRK-52E) (DL_{50} de 0,1 nM), con toxicidad intermedia para células madre mielógenas (FDC-P1, DL_{50} de 0,1 \muM) en acuerdo estrecho con los datos de toxicidad clínica. De hecho, la toxicidad limitante de la dosis en seres humanos es la atrofia del músculo esquelético.

La aplidina muestra neurotoxicidad a concentraciones superiores in vitro. Usando una tinción de viabilidad fluorescente (homodímero de etidio y calceína AM, Molecular Probes) acoplada con inmunohistoquímica, se observó que aproximadamente 1 \muM de aplidina es tóxica para las células cerebrales (tanto para neuronas como para astrocitos) y neuronas motoras (positivas para colina acetil transferasa) en la médula espinal, pero no para neuronas sensoriales positivas para sustancia P. La sensibilidad de las neuronas motoras puede ayudar a explicar la atrofia muscular tipo II observada (tal como se predijo) en un pequeño grupo de pacientes en los que la concentración AUC del fármaco es elevada debido a la disminución en la excreción.

Ejemplo 10 Estudio farmacocinético y clínico de fase I de la aplidina, una nueva didemnina marina, administrada como una infusión de 24 horas semanalmente

Se realizó un ensayo de fase I usando infusión de 24 horas semanalmente x 3 seguido por 1 semana de descanso. Se trataron 32 pacientes (edad media 58 años, ECOG media 1) con tumores sólidos avanzados, tratados previamente. Recibieron 64 ciclos (media/paciente: 2 (1-6)) a través de 8 niveles de dosis: 133 (3 pacientes), 266 (3 pacientes), 532 (3 pacientes), 1000 (3 pacientes), 2000 (3 pacientes), 3000(3 pacientes), 4500 (4 pacientes) y 3750 mcg/m^{2}/semana (10 pacientes). 2 de 3 pacientes evaluables tuvieron TLD a 4500 mcg/m^{2}/sem: toxicidad neuromuscular reversible grado (G) 4 (atrofia muscular tipo II comprobada por biopsia) y aumento en CK G4 (1 paciente) y transaminitis G3 transitoria (1 paciente). Otras toxicidades incluyeron malestar G 1-2 (la mayoría de los pacientes tratados a \geq 3000 mcg/m^{2}/sem), calambres musculares, emesis G 1-2 (sensible a antieméticos) y reacción en el sitio de la inyección (muy común y dependiente de la concentración). Se tomaron muestras de todos los pacientes para el análisis de FC mediante el método de LC/EM/EM. La farmacocinética es lineal y los perfiles se ajustan a un modelo abierto de 2 compartimentos. El fármaco tiene una distribución tisular extensa (Vss = 611 l), alto aclaramiento (0,47 l/min) y un t ½ de eliminación de 18,8 h. Se obtuvieron niveles plasmáticos mantenidos > 1 ng/ml (activos in vitro) a dosis \geq 3000 mcg/m^{2}. Un paciente con melanoma avanzado resistente a DTIC/interferón tuvo una mejora clínica definitiva mantenida durante > 30 semanas. Cuatro pacientes adicionales tuvieron respuestas menores o enfermedad estable durante \geq 4 meses. En conclusión, las TLD de la aplidina administrada en un programa de infusión semanal eran transaministis y toxicidad muscular reversible, que se observaron a una DMT (dosis máxima tolerada) de 4500 mcg/M^{2}/semana. La dosis recomendada para ensayos futuros, 3750 mcg/m^{2}/semana x 3, administrada a través de un catéter en una vena central, es viable y está asociada con toxicidad leve.

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(Tabla pasa a página siguiente)

Ejemplo 11 Estudio farmacocinético y clínico de fase I de la aplidina, una nueva didemnina marina, administrada como una infusión de 24 horas semanalmente

4

5

Actividad antitumoral

Paciente nº 008 - (Madrid) Se observó mejora clínica y reducción tumoral del melanoma matastásico no medible sumamente tratado previamente. Una biopsia de una de las lesiones metastásicas no reveló pruebas de tejido tumoral residual.

Paciente nº 032 - (Madrid) Carcinoma renal: reducción tumoral en un 20%.

Paciente nº 034 - (Madrid) Carcinoma medular de tiroides. Mejora clínica y EE en la linfagitis pulmonar. Disminución en el marcador ACE.

Farmacocinética

Se determinaron las concentraciones plasmáticas de aplidina mediante cromatografía de líquidos/espectrografía de masas en tándem con un límite de cuantificación de 0,25 ng/ml y un intervalo lineal amplio de hasta 16,00 ng/ml.

Se tomaron un total de 15 muestras hasta 24 horas después del final de la infusión.

Farmacocinética lineal con respecto a la dosis

Alta media de Cl ((cuartiles) 0,47 (0,40-0,56) l/min) y variabilidad entre pacientes (coeficiente de variación del aclaramiento (Cl), 45%). Semivida (t ½) de intermedia a larga (media (cuartiles) 18,9 (25,3-25,4) h). Distribución extensa con volumen suprafisiológico de distribución (Vss) (media (cuartiles) 611 (434-733) l). Acumulación en células sanguíneas (2-8 veces comparado con el plasma). Los perfiles se ajustan a un modelo abierto de 2 compartimentos.

La figura 14 muestra la relación dosis-AUC.

Conclusiones

Las TLD de la aplidina administrada usando este programa eran transaminitis y toxiciidad muscular reversible observadas a la DMT de 4500 mcg/m^{2}/semana x 3.

La dosis recomendada para futuros ensayos, 3750 mcg/m^{2}/semana x 3 es viable y está asociada con toxicidad leve (principalmente astenia leve). Fue común flebitis en el brazo de la infusión, dependiente de la concentración y evitable mediante la administración a través de un catéter en una vena central. No se observó toxicidad hematológica.

La FC se caracteriza por la linealidad con respecto a la dosis, residencia en el organismo relativamente prolongada del compuesto y distribución extensa. Se alcanzan niveles plasmáticos potencialmente activos desde 2000 mcg/m^{2}.

Está en curso un estudio de fase I adicional que investiga una infusión de 3 h i.v. administrada cada dos semanas. Dosis de inicio de 3000 mcg/m^{2} cada 2 semanas.

Ejemplo 12 Ensayo de fase I de aplidina administrada como una infusión intravenosa de 1 hora semanalmente en pacientes con linfoma y tumores sólidos avanzados

Se consideran elegibles pacientes adultos con enfermedad avanzada, EG<3 y función orgánica apropiada; los pacientes reciben aplidina semanal 3 de cada 4 semanas. Se han incluido 24 pacientes con tumor sólido: edad media (m) 55 años, ECOG media = 1, 15/24 pacientes tratados con = > 2 ciclos de tratamiento. Se han evaluado siete niveles de dosis (ND) desde 133 mcg/m^{2}/sem hasta 2700 mcg/m^{2}/sem: 102 infusiones son evaluables para determinar la toxicidad (tox). No se ha notificado toxicidad hematológica, se observaron vómitos que requerían profilaxis desde 800 mcg/m^{2}/sem. A 2700 mcg/m^{2}/sem (4 pacientes), 1 tuvo hiperbilirrubinemia G3 que se ha considerado que es limitante de la dosis y por tanto se está expandiendo el ND de 2700 mcg/m^{2}/sem. Se han tomado muestras de todos los pacientes para el análisis de FC (LC-ESI-EM/EM); la cinética es lineal, Vss medio = 308 l/m^{2}, el CL es alto m = 0,60 l/m y la semivida de eliminación m = 14,2 h. Los niveles plasmáticos > 1 ng/ml 24 horas tras la infusión pueden alcanzarse desde 1800 mcg/m^{2}/sem. Se han observado indicios tempranos de actividad en cáncer gástrico (1 paciente a 1200 mcg/m^{2}). Un paciente con cáncer renal avanzado resistente a VBL-IFN ha tenido una respuesta objetiva en curso (metástasis de pulmón con RP y EE en enfermedad peritoneal) a un ND de 2700 mcg/m^{2}/sem. La aplidina parece ser clínicamente viable a niveles de dosis farmacológicamente apropiados.

Ejemplo 13 Un estudio farmacocinético y de fase I de aplidina administrada como una infusión continua de 24 horas cada dos semanas (cada 2 semanas) en pacientes con tumor sólido y linfoma

Se administró aplidina a pacientes con tumor sólido/LNH como una infusión de 24 horas/cada 2 sem a 35 pacientes (edad media = 51/ECOG = 1) con tumor sólido (32 pacientes) o LNH (3 pacientes). 23/35 pacientes se expusieron previamente a \geq3 líneas de quimioterapia. Se administraron nueve niveles de dosis (200-7000 \mug/m^{2}/sem/cada 2 sem) y 65 ciclos (120 infusiones). No se notificó toxicidad hematológica. La toxicidad consistió en astenia y emesis G2-3 en 9-2 pacientes y 12-1 pacientes, respectivamente. Se trataron eficazmente las naúseas/vómitos G3 (\geq5000 \mug/m^{2}) y se previnieron entonces con regímenes de 4HT3. No se notificó toxicidad cardiaca. A la dosis de 5000 \mug/m^{2}/sem/cada 2 sem, 2 pacientes experimentaron calambres musculares transitorios con aumentos G3 de la CPK-MM. Entre 9 pacientes tratados a 6000 \mug/m^{2}/sem, 3 pacientes experimentaron un aumento de la CPK-MM y la aldolasa tras la tercera inyección de aplidina. Los aumentos de la CPK fueron G1-G2 y no sintomáticas en 2 pacientes, pero se notificó un aumento G3 de la CPK con dolor muscular G3 y pérdida de fuerza muscular (TLD) en un paciente. Esto fue reversible sin secuelas. La biopsia muscular reveló que no existía una necrosis significativa de miocitos. La miscrocopía electrónica ultraestructural indicó que no existía alteración morfológica de las mitocondrias pero si una pérdida de los filamentos gruesos de miosina. A 7000 \mug/m^{2}/cada 2 sem, se han incluido 4 pacientes. El análisis farmacocinético (LC-ESI/EM/EM) mostró que el aumento de AUC es lineal, con un gran Vss = 5391/m^{2}, un alto aclaramiento (352 ml/mm.m^{2}) y una semivida terminal larga (15-35 h). Las concentraciones plasmáticas 24 h después del final de la infusión a dosis \geq3000 \mug/m^{2}/cada 2 sem son comparables a las concentraciones eficaces in vitro (<1 ng/ml). Se observó actividad en LNH (1/3 pacientes), cáncer de tiroides molecular (2/2 pacientes), cáncer renal (1/5 pacientes) y cáncer neuroendocrino (1 paciente). Las hipótesis mecanísticas y las estrategias preventivas frente a la toxicidad muscular están en evaluación.

Ejemplo (14)

(Ejemplo comparativo)

Ensayo de micromatriz

Se usó la línea celular de leucemia humana MOLT-4 para estos experimentos. Se trataron células MOLT-4 durante 1 hora con aplidina 20 nM. Se extrajo el ARN total al final del tratamiento y 6 y 24 horas después de la recuperación en medio libre de fármaco.

Se retrotranscribieron 5 \mug de ARN total en ADNc en presencia de ^{32}P-ATPd. Se hibridaron cantidades iguales de sondas radiactivas en micromatrices de cáncer humano Atlas (Clontech). Tras lavar, se expusieron los filtros y se analizaron los resultados usando el software Atlas Image. Sólo se tomó en cuenta una diferencia en la expresión génica mayor de 2 veces entre células tratadas y sin tratar. Se han realizado análisis de RT-PCR y Northern para confirmar los cambios en la expresión génica encontrados con las micromatrices.

Resultados

El tratamiento con aplidina produjo cambios significativos en la expresión génica tan temprano como 1 hora tras el tratamiento. Tras 6 y 24 horas de recuperación en medio libre de fármaco, se ha observado la expresión y el número aumentado de genes.

Al final del tratamiento, los cambios más significativos se observaron en la expresión del gen de respuesta temprana ETR, y en el gen VEGF-RI/flt-1, que aumentan y disminuyen respectivamente por el tratamiento.

Los niveles de ETR volvieron a niveles normales tras 6 y 24 horas, mientras que los niveles de flt-1 disminuyeron adicionalmente en 6 y 24 horas.

La aplidina también indujo un aumento en los niveles de B-RAF y Fms, claramente observables 6 horas tras la recuperación en medio libre de fármaco.

\newpage

Los cambios observados en estos genes se confirmaron o bien mediante RT-PCR o bien mediante análisis de inmunotransferencia de tipo northern.

A partir del análisis de micromatriz, se observaron diferencias en la expresión génica (todavía no confirmadas mediante RT-PCR) para otros genes tales como PLK-1.

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Ejemplo 15 Ensayo de fase I de aplidina, administrada como una infusión i.v. de 1 h semanalmente en pacientes con tumores sólidos avanzados y linfoma no Hodgkin Administración del fármaco

Se administró aplidina como 1 hora semanalmente 3 de cada cuatro semanas

6

8

Caracterización de la toxicidad limitante de la dosis notificada

Paciente nº 28 - Edimburgo con adenocarcinoma esofágico (sin metástasis hepáticas) tratado a 2700 \mug/m^{2} semanalmente tuvo una recuperación retrasada del aumento de enzimas hepáticas (AST G3; bilirrubina G3; ALP G3) descartando la administración semanal de dosis adicionales.

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Indicios de actividad

Paciente nº 16 - (Edimburgo) con adenocarcinoma gástrico primario resistente a FAM. Ligera mejora en las masas del ganglio linfático alrededor de la curva menor del estómago, tronco celíaco y pelvis con aplidina a 1200 \mug/m^{2} semanalmente (3600 \mug/m^{2}).

Paciente nº 23 - (Barcelona) con carcinoma renal y nódulos pulmonares como el principal punto de la enfermedad, resistencia primaria a VBL + IFN\alpha y a doxorubicina liposomal. Remisión parcial en los nódulos pulmonares y mejora clínica con resolución de la disnea tras 2 infusiones de aplidina a 2700 \mug/m^{2} semanalmente (8100 \mug/m^{2}).

Paciente nº 29 - (Barcelona) con carcinoma renal. Mejora clínica tras 3 infusiones en la evaluación de una adenopatía supraclavicular. Evaluación pendiente en el 2º ciclo.

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Datos farmacocinéticos

FC lineal respecto a la dosis hasta el nivel de dosis actual de 2700 \mug/m^{2}. Importante variabilidad interpaciente: coeficiente de variación de CL, 33%. CL plasmático relativamente alto: media (cuartiles) 329 (288-407 ml/min/m^{2}).

t ½ intermedio: media (cuartiles) 15,8 (13,3-19,5) h.

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Distribución extensa: Vss medio (cuartiles), 345 (220-398) l/m^{2}.

Análisis compartimental preliminar: los perfiles se ajustan mejor mediante un modelo de 3 compartimentos de primer orden con una fase inicial muy rápida (semivida media de 0,04 h) seguido por una fase intermedia (semivida media de 1,4 h) y una fase terminal más larga (semivida media de 20,7 h).

Conclusiones

Este estudio en curso indica que la aplidina administrada como una infusión de 1 hora semanalmente con una semana de descanso es clínicamente viable hasta una dosis de 3600 mcg/m^{2} cada semana. No se ha notificado toxicidad para la médula ósea. La emesis puede controlarse mediante antieméticos profilácticos. Se ha observado toxicidad muscular que consiste en debilidad muscular y aumento de la CK en un paciente tratado a 3600. Se ha notificado toxicidad hepática al nivel de dosis más alto investigado en varios pacientes aunque era TLD en un paciente. La información farmacocinética indica que pueden lograrse niveles potencialmente terapéuticos en plasma en pacientes tratados a partir de 1200 \mug/m^{2} en adelante.

Se está investigando la viabilidad de 3600 mcg/m^{2} cada semana (nivel de dosis VIII).

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Ejemplo 16 Un estudio farmacocinético y de fase I de aplidina, administrada como una infusión continua de 24 h cada dos semanas en pacientes con tumores sólidos y linfoma no Hodgkin

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9

10

Caracterización de la toxicidad muscular (TLD)

Paciente nº 27 - Paciente varón con carcinoma de tiroides medular tratado a 6000 \mug/m^{2} semanalmente tuvo CPK G3 sintomática con dolor muscular G2. Toxicidad recuperada en el plazo de 3 semanas tras la interrupción del tratamiento.

3 pacientes (5000 y 6000 \mug/m^{2}) experimentaron un aumento menor de las CPK (\geq G2), que consistía en un aumento de la CPK MM (muscular) sin aumento significativo de la CPK MB (cardiaca). Se observó un aumento paralelo del nivel de aldolasa. Se están notificando signos de mejora usando complementos de carnitina como protectores del músculo esquelético. Se realizaron biopsias musculares en 2 pacientes; E/M: desaparición parcial de los filamentos gruesos de la miosina.

Datos farmacocinéticos

La aplidina parece tener un perfil de FC lineal respecto a la dosis (dentro de las limitaciones impuestas por el bajo tamaño de muestra). CL plasmático relativamente alto: valor medio (cuartiles) 252 (192-145 ml/min/m^{2}). Alta variabilidad de Cl interpaciente (coeficiente de variación de CL del 62%). t ½ de intermedio a largo con un valor medio (cuartiles) de 23,8 (15,7-35,0 h). Distribución amplia, Vss medio (cuartiles) de 413 (274-638 l/m^{2}).

Análisis compartimental preliminar: los perfiles plasmáticos se ajustan mejor mediante un modelo de 2 compartimentos de primer orden con una fase inicial rápida (semivida media de 0,64 h) y una terminal más larga (semivida media de 25,8 h).

Relaciones de la miotoxicidad de la aplidina con la farmacocinética

Ha aparecido toxicidad muscular sólo a dosis altas y a exposiciones tras 24 h de infusión. Los valores Cmax tras infusión de 1 h ya son superiores a aquéllos tras infusión de 24 h. Por tanto, pueden descartarse una relación con Cmax. Los valores de AUC en los pacientes con miotoxicidad son altos pero no el máximo. Afectaban a pacientes con altas concentraciones plasmáticas mantenidas de aplidina. Los 3 pacientes con toxicidad muscular clara tuvieron un t ½ en exceso de 44 h comparado con un t ½ medio de 25,8 h tras infusión de 24 h.

Las figuras 15a y 15b muestran la actividad en el cáncer de tiroides medular: niveles de ACE.

Conclusiones

Los cambios musculares inducidos por el fármaco (que se espera que sean la toxicidad limitante de la dosis), notificados a partir del nivel de dosis número III en adelante (de 1800 mcg/m^{2} a 5000 mcg/m^{2}) son la toxicidad limitante de la dosis a 6000 mcg/m^{2} (1/9 pacientes). Se ha observado también actividad antitumoral en pacientes con LNH y carcinoma renal. El estudio está investigando ahora la viabilidad de 6000-7000 mcg/m^{2} cada dos semanas usando complementos de carnitina como protectores del músculo esquelético.

Claims (10)

1. Uso de aplidina en la preparación de una composición farmacéutica para un método de tratamiento del cáncer en un paciente, que comprende administrar aplidina mediante infusión intravenosa según uno de los siguientes regímenes:

a.

infusión de 24 horas semanalmente durante tres semanas, seguido por una semana de descanso, a una dosis recomendada no superior a 3750 mcg/m^{2}/sem,

b.

infusión de 24 horas bisemanalmente a una dosis recomendada no superior a 7000 mcg/m^{2}/sem,

c.

infusión de 1 hora semanalmente durante tres semanas cada 4 semanas a una dosis recomendada no superior a 3600 mcg/m^{2}/sem.

2. Uso de aplidina según la reivindicación 1, que comprende administrar aplidina mediante infusión intravenosa como una infusión de 24 horas semanalmente durante tres semanas, seguido por una semana de descanso, a una dosis recomendada no superior a 3750 mcg/m^{2}/sem.

3. Uso de aplidina según la reivindicación 1, que comprende administrar aplidina mediante infusión intravenosa como una infusión de 24 horas bisemanalmente a una dosis recomendada no superior a 7000 mcg/m^{2}/sem.

4. Uso de aplidina según la reivindicación 3, que comprende administrar aplidina mediante infusión intravenosa, como una infusión de 24 horas bisemanalmente a una dosis de 5000 mcg/m^{2}/sem.

5. Uso de aplidina según la reivindicación 1, que comprende administrar aplidina mediante infusión intravenosa como una infusión de 1 hora semanalmente durante tres semanas cada 4 semanas a una dosis recomendada no superior a 3600 mcg/m^{2}/sem.

6. Uso de aplidina según la reivindicación 5, que comprende administrar aplidina mediante infusión intravenosa como una infusión de 1 hora semanalmente durante tres semanas cada 4 semanas a una dosis de 2700 mcg/m^{2}/sem.

7. Uso según cualquier reivindicación precedente, en el que la aplidina se administra como parte de una terapia de combinación.

8. Uso según cualquier reivindicación precedente, en el que la aplidina se administra junto con un protector del músculo esquelético.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que el protector del músculo esquelético es carnitina.

10. Uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el paciente ya ha recibido el tratamiento convencional para su enfermedad cancerígena y el tumor es resistente al tratamiento.