ES2288884T3

ES2288884T3 - Acido nucleico que codifica una proteina de la familia ctage, su uso y produccion.

Info

Publication number: ES2288884T3
Application number: ES00983011T
Authority: ES
Inventors: Stefan Eichmuller; Dirk Schadendorf; Dirk Usener
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2020-10-13
Also published as: DE19949595A1; AU1993601A; WO2001027255A3; EP1230265A2; EP1230265B1; ATE364626T1; WO2001027255A2; US7314922B1; DE50014417D1

Abstract

Un ácido nucleico, que codifica un antígeno asociado a tumor, donde el ácido nucleico se compone de: (a) el ácido nucleico de la Fig. 1 o la Fig. 2 o un ácido nucleico con al menos un 80% de identidad con el mismo, (b) un ácido nucleico emparentado mediante el código genético degenerado con el ácido nucleico de (a).

Description

Ácido nucleico que codifica una proteína de la familia CTAGE, su uso y producción.

La presente invención se refiere a una nueva familia de genes para genes asociados a linfoma de células T cutáneo ("cutaneous T-cell lymphoma associated genes") (CTAGE). La presente invención describe dos miembros de esta familia, CTAGE-1 y CTAGE-2, su ADNc subyacente (ctage-1 y ctage-2) y su uso para el diagnóstico y la terapia de enfermedades tumorales.

El linfoma de células T cutáneo (CTCL) es un tumor de la piel que se origina en linfocitos T, que en el estadio avanzado solamente se puede tratar difícilmente. Los linfomas de células T cutáneos generalmente pertenecen al grupo de los linfomas no Hodgkin. A los linfomas de células T cutáneos pertenecen, entre otras, las enfermedades micosis fungoide, el síndrome de Sézary y la reticulosis pagetoide. Las terapias convencionales (radiación, quimioterapia) en el estadio de la enfermedad metastatizante o como terapia preventiva después de la retirada del tumor primario, a menudo solamente son poco eficaces, y además presentan los graves efectos secundarios conocidos. A menudo, incluso, el tumor primario se ha extendido hasta tal punto y dispersado de tal modo, que una terapia operativa no tiene sentido. En tiempos recientes, precisamente para tumores cutáneos, se ha considerado la posibilidad de una posible inmunoterapia (vacunas contra tumores). El uso de tales formas de terapia, sin embargo, requiere antígenos específicos de tumor, que no se han descubierto hasta ahora para muchos tipos de tumores.

Los antígenos específicos de tumor, que, además de en tejido tumoral, también se han podido comprobar en tejido testicular, se describen en "Expression of multiple cancer/testis (CT) antigens in breast cancer and melanoma: basis for polyvalent CT vaccine strategies", International Journal of Cancer, Vol. 78, Nº 3, 1998, páginas 387-389; documento US 5 804 381 y en Sahin U. et al.: "Serological identification of human tumor antigens", Current Opinion in Immunology, Vol. 9, Nº 5, 1997, páginas 709-716.

Por lo tanto, a la invención subyace esencialmente el problema técnico de encontrar antígenos específicos de tumor adecuados para linfomas de células T cutáneos, que se pueden usar en el marco de una terapia de vacunación.

La solución de este problema técnico se logró mediante la preparación de las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Los inventores pudieron aislar una familia de moléculas de ADN, que, además en tejido testicular, solamente se expresa en diferentes tejidos tumorales, particularmente en linfomas de células T (como el síndrome de Sézary), tumores ORL o carcinoma ováricos (véase ejemplos 4 y 5). Pertenecen a los denominados "antígenos de cáncer-testículo". La identificación de tales genes (CTAGE-1 y CTAGE-2) es interesante, debido a que las proteínas codificadas por los mismos y los péptidos derivados de las mismas sirven como estructuras diana, por ejemplo, para células citotóxicas, y se pueden usar como antígenos para la producción de anticuerpos diagnósticos o terapéuticos. Para la terapia tumoral se pueden aplicar los péptidos o fragmentos de los mismos codificados por CTAGE-1 o CTAGE-2 directamente o se pueden introducir en células presentadoras de antígeno. Además, los péptidos que representan antígenos se pueden expresar con ayuda de vectores en diferentes células (por ejemplo, células dendríticas como células presentadoras de antígeno). Además, la clonación de uno o varios representantes de la familia de genes CTAGE forma la base para el desarrollo de pruebas diagnósticas, para garantizar en un futuro un diagnóstico en afectados más fiable y temprano. Por lo demás, sin duda, análisis funcionales de la proteína contribuirán al entendimiento del desarrollo del tumor. Por lo tanto, se tienen que considerar genes candidatos para investigaciones de los mecanismos patológicos en los que se basan las diferentes enfermedades tumorales.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a una molécula de ADN que codifica un antígeno asociado a tumor, que se compone de:

(a) el ácido nucleico de la Fig. 1 o la Fig. 2, o de un ácido nucleico con al menos un 80% de identidad con el mismo,

(b) un ADN emparentado por el código genético degenerado con el ácido nucleico de (a).

Las moléculas de ácido nucleico definidas en (a) y (b) codifican proteínas, polipéptidos o péptidos, que presentan además al menos una de las actividades biológicas descritas a continuación de la proteína codificada por el ácido nucleico de acuerdo con la Fig. 1 o la Fig. 2, que, por ejemplo, representan un antígeno específico de tu-
mor.

Las moléculas de ADN definidas en (a) también comprenden moléculas de ADN que se diferencian respecto a la secuencia indicada en la Figura 1 ó 2 por deleción(es), inserción(es), sustitución(es) y/u otras modificaciones conocidas en la técnica antecedente, por ejemplo, corte y empalme alternativo, o comprenden un fragmento de la molécula de ácido nucleico original, donde la proteína codificada por estas moléculas de ADN presenta además una o varias de las actividades biológicas que se han descrito anteriormente. A esto también pertenecen variantes alélicas. Los métodos para la generación de las anteriores modificaciones en la secuencia de ácido nucleico se conocen con el especialista en la técnica y se describen en obras de referencia de la biología molecular, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989). Las variantes tienen al menos un 80%, preferiblemente un 90, muy preferiblemente un 95, 96, 97, 98 ó 99% de identidad respecto a las secuencias de acuerdo con las Figs. 1 ó 2.

En una realización particularmente preferida, la molécula de ADN de acuerdo con la invención es un ADNc.

En una realización preferida adicional, la molécula de ADN de acuerdo con la invención es un ADN genómico, que procede preferiblemente de un mamífero, por ejemplo, un ser humano. Los métodos de exploración basados en hibridación de ácidos nucleicos permiten el aislamiento de las moléculas de ADN genómico de acuerdo con la invención de cada organismo o de bancos de ADN genómico derivados, donde se usan sondas que contienen la secuencia de ácido nucleico indicada en la Figura 1 ó 2 o una parte de la misma.

Un ácido nucleico de acuerdo con la invención es particularmente adecuado como estructura codificante de antígeno para propósitos terapéuticos. Tiene que ser un objetivo la estimulación del sistema inmune, la eliminación de células tumorales, que se identifican por un miembro de la familia CTAGE, particularmente CTAGE-1 o CTAGE-2. Para ello existen diversas vías, por ejemplo, inyección del ADN desnudo en el paciente. Para ello se inyecta un plásmido con un promotor muy activo y un miembro de la familia CTAGE, particularmente CTAGE-1 o CTAGE-2, por ejemplo, en el músculo o por vía intradérmica. El objetivo es que las células integren el plásmido, produzcan antígenos, presenten péptidos individuales por moléculas HLA, y de este modo, induzcan una respuesta inmune de células T citotóxica. La misma tiene que conducir entonces al rechazo de células tumorales. De forma general, esta método se describe en Conry et al., Clinical Cancer Research, Vol. 4, págs. 2903-2912 (1998). Una vía alternativa está representada por el método "pistola de genes", que se describe en Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, Vol. 90, págs. 11478-11482 (1993).

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención también se pueden insertar en un vector o vector de expresión. Por lo tanto, la presente invención también comprende estos vectores que contienen moléculas de ácido nucleico. Los ejemplos de los mismos se conocen por el especialista en la técnica. En el caso de un vector de expresión para E. coli, los mismos son pGEMEX, derivados de pUC (por ejemplo, pUC8), pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b y pQE-8. Para la expresión en levaduras se tienen que mencionar, por ejemplo, pY100 y Ycpad1, mientras que para la expresión en células animales, se tienen que indicar, por ejemplo, pKCR, pEFBOS, cDM8 y PCEV4. Para la expresión en células de insecto es particularmente adecuado el vector de expresión de baculovirus pAcSGHisNT-A. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención se asocia de forma funcional en el vector con elementos de regulación, que permiten su expresión en células hospedadoras procariotas o eucariotas. Tales vectores contienen, además de los elementos reguladores, por ejemplo, un promotor, típicamente un origen de replicación y genes específicos, que permiten la selección fenotípica de una célula hospedadora transformada. A los elementos reguladores para la expresión en procariotas, por ejemplo, E. coli, pertenecen el promotor lac, trp o promotor T7 y para la expresión en eucariotas, el promotor AOX1 o GAL1 en levaduras, y el promotor CMV, SV40, RVS-40, potenciador CMV, o SV40 para la expresión en células animales. Los promotores de metalotioneína I y polihedrina son ejemplos adicionales de promotores adecuados.

A los vectores adecuados también pertenecen particularmente vectores de expresión basados en T7 para la expresión en bacterias (Rosenberg et al., Gene 56 (1987), 125) o pMSXND para la expresión en células de mamífero (Lee y Nathans, J. Biol. Chem. 263 (1988), 3521).

Por lo demás, el ADN de acuerdo con la invención se puede insertar en un vector no solamente con propósitos de la producción recombinante, sino también para inyectar el ADN con ayuda de vectores en pacientes, donde el mismo codifica un antígeno para propósitos terapéuticos. Para ello, el ADN se introduce con ayuda de un vector in vivo en células presentadoras de antígeno (CPA), por ejemplo, células dendríticas, para la presentación por HLA de CTAGE. El vector que contiene el ADN de acuerdo con la invención se puede inyectar por diferentes vías:

a): ADN o ARN empaquetado en lípidos o liposomas, por ejemplo, descrito de forma general en Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, Vol. 93, págs. 15388-15393 (1996)

b): con una bacteria como vehículo de transporte para el vector de expresión. Son bacterias adecuadas, por ejemplo, listerias (atenuadas) [por ejemplo, Listeria monocytogenes], cepas de Salmonela, [por ejemplo, Salmonella spp.]. De forma general, esta técnica se ha descrito por Medina et al., Eur. J. Immunol., 29, págs. 693-699 (1999) y Guzman et al., Eur. J. Immunol. 28, págs. 1807-1814 (1998). Por lo demás, se hace referencia al documento WO 96/14087; Weiskirch et al., Immunological Reviews, Vol. 158, págs. 159-169 (1997) y el documento US-A-5.830.702.

c): mediante pistola de genes (Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, Vol. 88, págs. 2726-2730, 1991)

En una realización preferida, el vector que contiene las moléculas de ADN de acuerdo con la invención es un virus, por ejemplo, un adenovirus, virus vaccinia o un virus AAV, que es útil en una terapia génica. Son particularmente preferidos los retrovirus. Son ejemplos de retrovirus adecuados MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV o GaLV. Además, también son adecuados los virus que se han mencionado anteriormente y el virus de la viruela aviar, el virus de la viruela del canario, el virus de la influenza o el virus Sindbis como base para una vacuna. Tales nuevas vacunas, que después de la administración al paciente proporcionan inmunidad antitumoral, se describen, por ejemplo, en N. Restifo, Current Opinion in Immunology, 8, págs. 658-663 (1996) o Ying et al., Nature Medicine, Vol. 5, Nº 7, pág. 823 y siguientes, (1999). Con propósitos de la terapia génica, las moléculas de ADN de acuerdo con la invención también se pueden transportar en forma de dispersiones coloidales hasta las células diana. A esto pertenecen, por ejemplo, liposomas o lipoplejos [Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).

Se pueden usar métodos generales conocidos en la técnica para la construcción de vectores o plásmidos, que contienen las moléculas de ADN de acuerdo con la invención y secuencias control adecuadas. A estos métodos pertenecen, por ejemplo, técnicas de recombinación in vitro, métodos sintéticos, y métodos de recombinación in vivo, como se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., supra.

La presente invención también se refiere a las células hospedadoras que contienen los vectores que se han descrito anteriormente. A estas células hospedadoras pertenecen las bacterias, levaduras, células de insecto y animales, preferiblemente de mamífero. Se prefieren las cepas de E. coli HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21, XL1Blue y SG 13009, la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae y las células animales L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa y las células de insecto sf9. En la técnica se conocen métodos para la transformación de estas células hospedadoras, para la selección fenotípica de los transformantes y para la expresión de las moléculas de ADN de acuerdo con la invención usando los vectores que se han descrito anteriormente.

Adicionalmente se prefiere, para generar una inmunidad contra tumores, transfectar el ADN de acuerdo con la invención en células presentadoras de antígeno e inyectar las mismas al paciente. Para ello, se introduce in vitro un plásmido en una célula presentadora de antígeno (CPA), por ejemplo, células dendríticas, que después producen antígenos y presentan péptidos individuales mediante moléculas HLA. El ADN de plásmido se puede llevar por diferentes vías a las células presentadoras de antígeno:

(a): como ADN desnudo, por ejemplo, mediante "pistola de genes" o electroporación

(b): ADN o ARN empaquetado en lípidos o liposomas (Nair et al., Nature Biotechnology Vol. 16, pág. 364 y siguientes (1998))

c): con un virus como vector (Kim et al., J. of Immunotherapy, 20(4), págs. 276-286 (1997)).

(d): con una bacteria como vehículo de transporte para el vector de expresión (Medina et al., Eur. J. Immunol., 29, págs. 693-699 (1999); Guzman et al., Eur. J. Immunol. 28, págs. 1807-1814 (1998)).

Un clon, que codifica un ácido nucleico de acuerdo con la invención (CTAGE-1), se presentó el 7 de octubre de 1999 en la DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig de acuerdo con el tratado de Budapest con el número de entrada DSM 13079 (= Escherichia coli XL2-Blue pCTAGE-1).

La presente invención también se refiere a un método para la producción de una proteína, que está codificada por los anteriores ácidos nucleicos, que comprende el cultivo de las células hospedadoras que se han descrito anteriormente en condiciones que permiten la expresión de la proteína (preferiblemente, expresión estable), y obtención de la proteína a partir del cultivo. Se conocen generalmente métodos adecuados para la producción recombinante de la proteína (véase, por ejemplo, Holmgren, Annu. Rev. Biochem. 54 (1985), 237; LaVallie et al., Bio/Technology 11 (1993), 187; Wong, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 517; Romanos, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 527; Williams et al., Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 538; y Davies Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 543. También se conocen generalmente métodos de purificación adecuados (por ejemplo, cromatografía de preparación, cromatografía de afinidad, por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad, HPLC, etc.).

En una realización adicional, la presente invención se refiere a una proteína codificada por las moléculas de ADN de acuerdo con la invención (CTAGE-1 o CTAGE-2) u obtenida de acuerdo con el anterior método. En la Figura 3 se muestra la proteína que codifica CTAGE-2. En este contexto se tiene que mencionar que la proteína de acuerdo con la invención puede estar modificada de acuerdo con métodos habituales conocidos en la técnica. A estas modificaciones pertenecen sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, que modifican la estructura de la proteína, donde su actividad biológica esencialmente se mantiene. A las sustituciones pertenecen preferiblemente sustituciones "conservativas" de residuos aminoacídicos, es decir, sustituciones por residuos biológicos similares, por ejemplo, la sustitución de un residuo hidrófobo (por ejemplo, isoleucina, valina, leucina, metionina) por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar (por ejemplo, arginina por lisina, ácido glutámico por ácido asparagínico, etc.). Las deleciones pueden conducir a la generación de moléculas que presentan un tamaño claramente menor, es decir, a las que les falta, por ejemplo, aminoácidos en el extremo N o C. Las variantes tienen al menos un 80%, preferiblemente un 90%, muy preferiblemente un 95, 96, 97, 98 ó 99% de identidad respecto a la secuencia aminoacídica que se deriva de la secuencia nucleotídica de acuerdo con la Fig. 1 o respecto a la secuencia aminoacídica de acuerdo con la Fig. 3.

Para la vacuna antitumoral deseada también son adecuadas inyecciones de la proteína o de uno o varios péptidos derivados de la misma. A partir de la secuencia de la proteína de acuerdo con la invención, para ello, se deducen, mediante programas de ordenador correspondientes o mediante experimentos (por ejemplo, inclusión fagocítica de la proteína global, después, análisis de los péptidos presentadores), fragmentos peptídicos dependientes de HLA. Los mismos se producen sintéticamente mediante métodos conocidos por especialista en la técnica y después (en un caso dado, con factores estimuladores del sistema inmune, por ejemplo, interferonas, interleucinas, etc.) se inyectan en el paciente. El objetivo en el que se basa este tratamiento es que las CPA integren los péptidos, los presenten y de este modo estimulen la producción in vivo de células T citotóxicas especificadas de tumor. En general, este principio se ha descrito por Melief et al., Current Opinion in Immunology, 8, págs. 651-657 (1996).

Al igual que se ha descrito anteriormente, en vez de el vector, también se puede introducir la proteína de acuerdo con la invención o fragmentos de la misma in vitro en CPA. Las células cargadas, después, se inyectan en el paciente, por ejemplo, en los nódulos linfáticos y sirven directamente para la estimulación y multiplicación de células T citotóxicas específicas de tumor (Nestle et al., Nature Medicine, Vol. 4, Nº 3, págs. 328 y siguientes (1998); Schadendorf et al., en: Burg, Dummer, Strategies for Immunointerventions in Dermatology, Springer Verlag, Berlin Heidelberg, págs. 399-409, 1997). Para la vacunación puede ser ventajoso modificar, frente al antígeno de tipo silvestre, aminoácidos individuales, como se ha descrito anteriormente, debido a que de este modo se pueden conseguir entre otras cosas un aumento de la unión y una mejora de la eficacia (Clay et al., The Journal of Immunology 162: págs. 1749-1755, 1999).

La presente invención también se refiere a anticuerpos que reconocen específicamente la proteína CTAGE-1 o CTAGE-2 que se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales o sintéticos o fragmentos de los mismos, por ejemplo, fragmentos Fab, Fv o scFv. Preferiblemente se trata de anticuerpos monoclonales. Para la producción es adecuado inmunizar animales, particularmente conejos o pollos, para un anticuerpo policlonal y ratones para un anticuerpo monoclonal, con una proteína (de fusión) anterior o fragmentos de la misma. Se pueden realizar "refuerzos" adicionales de los animales con la misma proteína (de fusión) o fragmentos de la misma. El anticuerpo policlonal se puede obtener después a partir del suero o la yema de los animales. Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden producir de acuerdo con métodos convencionales, donde la proteína codificada por las moléculas de ADN de acuerdo con la invención o un fragmento sintético de la misma sirven como inmunógeno. Los anticuerpos monoclonales, por ejemplo, se pueden producir por el método descrito por Köhler y Milstein (Nature 256 (1975), 495) y Galfré (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3), donde células de mieloma de ratón se fusionan con células de bazo obtenidas de mamíferos inmunizados. Estos anticuerpos, por ejemplo, se pueden usar para la inmunoprecipitación de las proteínas que se han descrito anteriormente o para el aislamiento de proteínas emparentadas de bancos de expresión de ADNc. Los anticuerpos se pueden unir, por ejemplo, en inmunoensayos en fase liquida o en un soporte sólido. Los anticuerpos pueden estar marcados de diferentes maneras. En la técnica se conocen marcadores y métodos de marcación adecuados. Son ejemplos de inmunoensayos ELISA y RIA. Además, los anticuerpos, además de su uso diagnóstico, también se pueden usar de forma terapéutica. Para ello sirve, por ejemplo, una proteína de la familia CTAGE, por ejemplo, CTAGE-1 o CTAGE-2, como diana para anticuerpos biespecíficos. Para esto se hace referencia a Kastenbauer et al., Laryngorhinootologie, 78 (1), págs. 31-35 (1999) y Cao et al., Bioconj. Chem 9 (6), págs. 635-644 (1998). Adicionalmente, por el suministro de los anticuerpos, se puede contrarrestar el efecto de las proteínas CTAGE que favorece el crecimiento y la metastatización del
tumor.

Por lo demás, por el empleo de ADN antisentido de CTAGE-1 o CTAGE-2, se puede conseguir una inhibición de la traducción de CTAGE-1 o CTAGE-2, y de este modo, se puede ejercer un efecto terapéutico específicamente sobre este gen. En las correspondientes células tumorales se forman híbridos de ARN/ADN, que evitan de este modo la transcripción, y al mismo tiempo provocan una degradación de los híbridos (y por tanto, del ARN) por ARNasa H (Scanlon et al., The Faseb Journal, Vol. 9, págs. 1288-1296, 1995).

La presente invención además se refiere al uso de las moléculas de ADN que se han descrito anteriormente, vectores, proteínas y/o anticuerpos. Preferiblemente, los mismos se usan para la producción de un fármaco para el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades tumorales en las que la CTAGE-1 o CTAGE-2 juega un papel. Preferiblemente, la preparación de una sustancia de vacunación, como se ha descrito anteriormente, se basa en el ADN o en la proteína/el péptido.

Estos fármacos contienen, en un caso dado, adicionalmente un soporte farmacéuticamente aceptable. El especialista en la técnica conoce soportes adecuados y la formulación de tales fármacos. A los soportes adecuados pertenecen, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, por ejemplo, emulsiones de aceite/agua, tensioactivos, soluciones estériles, etc. El suministro del fármaco se puede realizar de forma oral o parenteral. Al método para la administración parenteral pertenece la administración tópica, intraarterial, intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal o intranasal. La dosificación adecuada se determina por el medico que realiza el tratamiento y depende de diferentes factores, por ejemplo, la edad, el sexo, el peso del paciente, el estadio de la enfermedad, el tipo de suministro, etc.

La presente invención se refiere además a una composición diagnóstica, que contiene la molécula de ADN que se ha descrito anteriormente o el anticuerpo o combinaciones de los mismos, en un caso dado, junto con una sustancia de ensayo adecuada. La composición diagnóstica es, por un lado, adecuada para comprobar una enfermedad tumoral, sin embargo, también para realizar un control del proceso.

La molécula de ADN de acuerdo con la invención como se ha definido anteriormente también se puede usar como una sonda para aislar moléculas de ADN, que, por ejemplo, se originan en otra especie o en otro organismo y que codifican una proteína con una actividad biológica igual. Preferiblemente, la sonda presenta una longitud de al menos 10, particularmente preferiblemente al menos 15 bases. El especialista en la técnica conoce métodos de control adecuados basados en hibridación, por ejemplo, transferencia de Southern o Northern. El especialista en la técnica también conoce marcados adecuados para la sonda, y a esto pertenecen, por ejemplo, marcado con radioisótopos, bioluminiscencia, quimioluminiscencia, marcadores fluorescentes, quelatos de metal, enzimas, etc.

Por lo demás, esto también se puede realizar mediante una PCR (Wiedmann et al., PCR Methods Appl. 3, págs. 551-564 (1994); Saiki et al., Nature 324, págs. 163-166 (1986)) o "Reacción en Cadena de la Ligasa" (LCR) (Taylor et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6, págs. 24-29 (1995); Rouwendal et al., Methods Mol. Biol. págs. 149-156 (1996)), donde los cebadores se derivan de la secuencia de la Figura 1 o la Figura 2 y donde el especialista en la técnica puede diseñar cebadores adecuados (desde el punto de vista de la longitud, complementariedad respecto a la matriz, la zona que se tiene que amplificar, etc.) mediante métodos convencionales.

Además, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de enfermedades tumorales, in vitro, que comprende las siguientes etapas:

- aislamiento de ácido nucleico del paciente,

- realización de una LCR o PCR con cebadores adecuados o un análisis de hibridación con una o varias sondas adecuadas basadas en la secuencia codificante de la Fig. 1 o la Fig. 2,

- comprobación de un producto amplificado o una hibridación como indicio de la presencia de una enfermedad tumoral.

En el método que se ha mencionado anteriormente, el especialista en la técnica puede usar métodos conocidos respecto a la preparación de ADN o ARN de muestras biológicas, la digestión por restricción del ADN, la separación de los fragmentos de restricción en geles de separación por tamaño, por ejemplo, geles de agarosa, la producción y marcado de la sonda y la comprobación de la hibridación, por ejemplo, por "Transferencia de Southern" o hibridación in situ.

La anterior comprobación también se puede realizar por PCR o LCR. Para ello se usan cebadores que flanquean la secuencia de acuerdo a la invención o subzonas adecuadas. Son de importancia diagnóstica los productos de amplificación de ADN del tejido en cuestión, que se diferencian respecto a la presencia de bandas específicas de CTAGE-1 o CTAGE-2 de los productos de amplificación de ADN de tejido sano.

En una realización alternativa se puede usar un método que comprende las siguientes etapas:

- aislamiento de ARN del paciente,

- realización de un análisis Northern con una o varias sondas adecuadas,

- comparación de la concentración y/o longitud del ARNm del CTAGE-1 o CTAGE-2 de la muestra del paciente con un ARNm de una persona sana, donde la presencia de ARNm de CTAGE-1 o CTAGE-2, en comparación con el ARNm control de tejido normal, es indicativo de una enfermedad tumoral.

En este método, el especialista en la técnica puede usar métodos conocidos respecto a la preparación de ARN total o ARN poli(A)+ de muestras biológicas, la separación de los ARN en geles de separación por tamaño, por ejemplo, geles de agarosa desnaturalizantes, la producción y marcado de la sonda y la comprobación mediante "Transferencia de Northern".

En una realización alternativa adicional se puede diagnosticar una posible enfermedad también mediante un método que comprende las siguientes etapas:

- obtención de una muestra celular del paciente,

- puesta en contacto de la muestra celular obtenida de este modo con el anticuerpo de acuerdo con la invención que se ha descrito anteriormente, como sonda en condiciones que permiten la unión del anticuerpo, donde una unión del anticuerpo apunta a una expresión presente de CTAGE-1 o CTAGE-2, lo que es indicativo de una enfermedad tumoral.

Esta comprobación también se puede realizar usando técnicas convencionales conocidas por el especialista en la técnica. El mismo también conoce métodos de fragmentación de células que permiten el aislamiento de la proteína de tal modo, que la misma se puede poner en contacto con el anticuerpo. La comprobación del anticuerpo unido se realiza preferiblemente mediante inmunoensayos, por ejemplo, Transferencia de Western, ELISA, FACS o RIA o métodos inmunohistoquímicos. Además, los anticuerpos son adecuados para capturar CTAGE-1 o CTAGE-2 sobreexpresada en tumores y detener de este modo el crecimiento tumoral, debido a que hay indicios de que la presencia de CTAGE-1 CTAGE-2 no solamente indica la presencia de tumores, sino que fomenta activamente el crecimiento
tumoral.

Además, la presente invención se refiere a kits para la realización del método diagnóstico de acuerdo con la invención, que contienen el anticuerpo de acuerdo con la invención o un fragmento del mismo, una molécula de ADN de acuerdo con la invención como sonda o una pareja de cebador basado en la secuencia de la molécula de ADN de acuerdo con la invención, adecuada para PCR o LCR, en un caso dado en combinación con una sustancia de ensayo adecuada.

Dependiendo de la configuración del método diagnóstico que se tiene que realizar mediante el kit de acuerdo con la invención, las moléculas de ADN, los anticuerpos o fragmentos de los mismos contenidos en el kit se pueden inmovilizar sobre un soporte adecuado.

La invención se describe a continuación mediante las figuras, que muestran:

Fig. 1: Secuencia de ácido nucleico del ADNc de CTAGE-1

Fig. 2: Secuencia de ácido nucleico del ADNc de CTAGE-2

Fig. 3: Secuencia aminoacídica de CTAGE-2

Fig. 4: Método SEREX

La invención se describe a continuación con referencia a los ejemplos. Respecto a los métodos usados se hace referencia a Sambrook, J, Fritsch, E, F. y Maniatis, T. (Molecular cloning; a laboratory manual; segunda edición; Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989) y Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley E Hijos, 1994-1998), donde las técnicas que se mencionan a continuación, particularmente la exploración de bibliotecas de ADNc, preparación de ADN o ARN, PCR o Transferencia de Northern, son conocidos y dominados suficientemente por el especialista en la técnica.

Ejemplo 1 Identificación de CTAGE-1 de un banco de ADNc mediante el método SEREX

Se produjo un banco de fagos de ADNc (en Lambda ZAP) de ARNm de un testículo sano (Uni-ZAP^{TM} XR Biblioteca de ADNc adaptada, empresa Stratagene, Nº Cat 837201). El banco se exploró con el denominado método SEREX (Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, Vol. 92, págs. 11810-11813). El análisis de aproximadamente 1,8 x 10^{6} clones recombinantes de este banco con sueros de pacientes con linfomas de células T cutáneos (micosis fungoide, síndrome de Sézary) dio como resultado 26 clones positivos. En el análisis serológico de los clones obtenidos se usaron en total hasta 11 sueros de pacientes enfermos y 10 sueros de personas control. De forma interesante, ninguno de los clones se reconoció con sueros control (de personas sanas), sin embargo, sí con varios sueros de pacientes enfermos. Los clones se secuenciaron y se dedujo la secuencia mostrada en la Figura 1 para uno de los clones. Él mismo obtuvo la denominación CTAGE-1.

El método de acuerdo con la invención se muestra en la Fig. 4 adjunta.

Ejemplo 2 Producción y purificación de una proteína CTAGE-1 de acuerdo con la invención

Para la producción de la proteína CTAGE-1 de acuerdo con la invención, al ADN de la Fig. 1 se provee de enlazadores BamHI, se corta con BamHI y se inserta en el vector de expresión pQE-8 (Qiagen) abierto con BamHI. Se obtiene el plásmido de expresión pQ/CTAGE-1. El mismo codifica una proteína de fusión de 6 residuos de histidina (pareja de extremo N) y la proteína CTAGE-1 de acuerdo con la invención (pareja de extremo C). El pQ/CTAGE-1 se usa para la transformación de E. coli SG 13009 (compárese Gottesmann, S. et al., J. Bacteriol. 148 (1981), 265-273). Las bacterias se cultivan en un medio LB con 10 \mug/ml de ampicilina y 25 \mug/ml de kanamicina y se inducen 4 h con 60 \muM de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Por la adición de clorhidrato de guanidina 6 M se consigue una lisis de las bacterias, a continuación, con el lisado, se realiza una cromatografía (resina Ni-NTA) en presencia de urea 8 M de acuerdo con las indicaciones del fabricante (Qiagen). La proteína de fusión unida se eluye en un tampón de pH 3,5. Después de su neutralización, la proteína de fusión se somete a una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 18% y se tiñe con azul de Coomassie (compárese Thomas, J.O. y Kornberg, R.F., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).

Se demuestra que se puede producir una proteína (de fusión) de acuerdo con la invención en forma altamente purificada.

Ejemplo 3 Producción y comprobación de un anticuerpo de acuerdo con la invención

Una proteína de fusión de acuerdo con la invención del ejemplo 2 se somete a una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 18%. Después de teñir el gel con acetato sódico 4 M se recorta la banda correspondiente del gel y se incuba en solución salina tamponada con fosfato. Se sedimentan los trozos de gel antes de que se determine la concentración de proteínas del sobrenadante mediante una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, seguida de una tinción
con azul de Coomassie. Los animales se inmunizan del siguiente modo con la proteína de fusión purificada en gel:

Protocolo de inmunización para anticuerpos policlonales en conejo

Por inmunización se usan 35 \mug de proteína de fusión purificada en gel en 0,7 ml de PBS y 0,7 ml de adyuvante de Freund completo o incompleto.

Día 0:: 1. inmunización (adyuvante completo de Freund)

Día 14:: 2. inmunización (adyuvante incompleto de Freund; AIF)

Día 28:: 3. inmunización (AIF)

Día 56:: 4. inmunización (AIF)

Día 80:: Sangrado

\vskip1.000000\baselineskip

El suero del conejo se ensaya en inmunotransferencia. Para esto, una proteína de fusión de acuerdo con la invención del ejemplo 2 se somete a una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y se transfiere a un filtro de nitrocelulosa (compárese Khyse-Andersen), J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). El análisis de transferencia de Western se realiza como se describe en Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229. Para ello, el filtro de nitrocelulosa se incuba durante 1 hora a 37ºC con un primer anticuerpo. Este anticuerpo es el suero del conejo (1:10000 en PBS). Después de varias etapas de lavado con PBS, el filtro de nitrocelulosa se incuba con un segundo anticuerpo. Este anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de cabra anti-IgG de conejo acoplado a fosfatasa alcalina (Dianova) (1:5000) en PBS. Después 30 minutos de incubación a 37ºC se realizan varias etapas de lavado con PBS, y a continuación, la reacción de comprobación de fosfatasa alcalina en solución de revelado (5' bromo-4-cloro-3-indolilfosfato 36 \muM, nitroazul de tetrazolio 400 \muM, Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM) a temperatura ambiente hasta que se hacen visibles las bandas.

Se demuestra que se pueden producir anticuerpos policlonales de acuerdo con la invención.

Protocolo de inmunización para anticuerpos policlonales en pollo

Por inmunización se usan 40 \mug de proteína de fusión purificada en gel en 0,8 ml de PBS y 0,8 ml de adyuvante de Freund completo o incompleto.

Día 0:: 1ª inmunización (adyuvante completo de Freund)

Día 28:: 2ª inmunización (adyuvante incompleto de Freund; AIF)

Día 50:: 3ª inmunización (AIF).

\vskip1.000000\baselineskip

Se extraen anticuerpos de la yema y se ensayan en la transferencia de Western. Se verifican anticuerpos policlonales de acuerdo con la invención.

Protocolo de inmunización para anticuerpos monoclonales de ratón

Por inmunización se usan 12 \mug de proteína de fusión purificada en gel en 0,25 ml de PBS y 0,25 ml de adyuvante de Freund completo o incompleto; en la cuarta inmunización, la proteína de fusión se disuelve en 0,5 ml (sin adyuvante).

Día 0:: 1ª inmunización (adyuvante completo de Freund)

Día 28:: 2ª inmunización (adyuvante incompleto de Freund; AIF)

Día 56:: 3ª inmunización (AIF)

Día 84:: 4ª inmunización (PBS)

Día 87:: Fusión

\vskip1.000000\baselineskip

Se ensayan los sobrenadantes de hibridomas en la transferencia de Western. Se verifican anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención.

Ejemplo 4 Transferencias de Northern

Se hibridaron transferencias de Northern con ARNm de diferentes tejidos sanos a 50ºC durante una noche en un tampón de hibridación con 2xSSC, solución de Denhardt factor 10, sulfato de dextrano al 10%, SDS al 1%, SSC al 3% y 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón y la sonda especifica. La sonda específica se produjo por marcado radioactivo (kit de marcado de ADN de cebador al azar; Roche-Diagnostics) del producto de PCR de una PCR en ADNc control de testículo, como se describe a continuación en el ejemplo 5. Los filtros se lavaron respectivamente una vez a 65ºC en 2xSSC/SDS al 0,1% y en 0,2 por SSC/SDS al 0,1% y se expuso con los mismos a -70ºC una película Kodak o película Fuji entre 24 a 7 días.

La transferencia de Northern demostró que la CTAGE-1 se puede verificar solamente en testículo, sin embargo, no en tejido control.

Ejemplo 5 Diagnóstico de tumores mediante PCR

Se obtuvo ARNm de diferentes tejidos y sangre usando el kit "RNAclean" (empresa AGS-Hybaid, Heidelberg) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. El ARN se trató con ADNasa y se produjo, con ayuda de un kit de ADNc de Roche Diagnostics, un ADNc. Para ello se usa 1 \mug de ARN y 20 U de Transcriptasa Inversa AMV con adición de 1,6 \mug de inhibidor de ARNasa en un volumen total de 20 \mul. Este método se realizó de acuerdo con las indicaciones del fabricante. El ADNc obtenido a partir del ARN se comprobó con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa mediante cebadores específicos para CTAGE-1 respecto a la presencia de CTAGE-1. Las condiciones de PCR eran:

5 \mul (aproximadamente 100 ng) de ADNc que se tiene que amplificar

(NH_{4})_{2} SO_{4} 16 mM

Tris-HCl 67 mM, pH 8,8

MgCl_{2} 1,5 mM

Tween 20 al 0,01%

dGTP 200 \muM

dCTP 200 \muM

dTTP 200 \muM

dATP 200 \muM

1 U de Taq ADN polimerasa por sedimento (=25 \mul)

Cebador 1 400 nM

Cebador 2 400 nM

DMSO 10%

\vskip1.000000\baselineskip

95ºC 5 min.

Durante 35 ciclos: 95ºC 1 min., 20ºC 1 min., 72ºC 2 min.

72ºC 10 min.

\vskip1.000000\baselineskip

Cebador 1:	5'-CTC CTG ACT TCT TTC CCA ACC TTT ACC-3'

Cebador 2:	5'-TGC AAT TCC CAC CTA ACT TCC ATT CTG-3'

Los productos amplificados se hicieron visibles después de la separación electroforética en un gel de agarosa (1,5%) por bromuro de etidio.

Los resultados son los siguientes:

Tejido control

Al usar ADNc de tejido testicular, la PCR usando los cebadores indicados era positiva, mientras que todos los tejidos indicados a continuación dieron como resultado un resultado negativo:

Intestino, intestino delgado, hígado fetal, pulmón fetal, bazo fetal, riñón fetal, músculo esquelético fetal, timo fetal, cerebro fetal, corazón fetal, cerebro, piel, corazón, huesos, hígado, pulmón, estomago, bazo, riñón, ovario, páncreas, linfocitos de sangre periférica, placenta, próstata, músculo esquelético, linfocitos T (activados), timo, tráquea.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

4

\newpage

Ejemplo 6 Identificación de CTAGE-2

La identificación de CTAGE-2 se realizó mediante PCR Race (empresa Clontech, Heidelberg).

1. Kits/Reactivos

Kit de amplificación de ADNc SMART^{TM}

Kit de PCR de polimerasa Advantage^{R}

Transcriptasa inversa MMLV (empresa Gibco, Nº Cat.18064-014)

2. Producción de ADNc SMART^{TM}

ADNc de 5' RACE Ready

1 \mug de ARN (testículo)

1 \mul de cebador 5' CDS

1 \mul de SMART II Oligo

\vskip1.000000\baselineskip

ADNc de 3' RACE Ready

1 \mug de ARN (testículo)

1 \mul de cebador 3' CDS

\vskip1.000000\baselineskip

rellenar hasta respectivamente 5 \mul de volumen con H_{2}O

incubar 2 minutos a 72ºC

sobre hielo durante 2 minutos

centrifugación

\vskip1.000000\baselineskip

2 \mul de tampón de primera hebra 5x

1 \mul de DTT (20 mM)

1 \mul de mezcla de dNTP (10 mM)

1 \mul de transcriptasa inversa MMLV (200 U/\mul)

\vskip1.000000\baselineskip

mezcla por pipeteado

centrifugación

incubar 1,5 horas a 42ºC

detención de la reacción con tampón Tricina EDTA:

200 \mul con ARN < 200 ng

100 \mul con ARN > 200 ng

250 \mul con ARNm

\vskip1.000000\baselineskip

incubación durante 7 min a 72ºC

almacenamiento a -20ºC

\vskip1.000000\baselineskip

3. Selección de cebador

Los cebadores tienen que tener una longitud de aproximadamente 23-28 nucleótidos y se tienen que seleccionar con una temperatura de hibridación muy elevada (preferiblemente superior a 70ºC). El cebador que alarga en el sentido 5' se tiene que situar en proximidad del extremo 5', el que alarga en el sentido 3', próximo al extremo 3'. La selección de cebador es conocida por el especialista en la técnica.

El cebador que alarga en el sentido 5' es un cebador inverso y se denomina Race 1, el cebador que alarga en el sentido 3' es un cebador directo y se denomina Race 2.

\vskip1.000000\baselineskip

4. PCR Race 4.1 Preparación de la mezcla madre

5

\vskip1.000000\baselineskip

PCR Control 1:

6

\vskip1.000000\baselineskip

PCR Touch Down

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

Resultado esperado:

\quad: 5': 2,6 kb

\quad: 3': 2,9 kb (a veces 0,6 kb)

\quad: Resultado: ADNc correcto

\newpage

4.2 Realización de la PCR Race

Esquema de pipeteado:

7

8

Programa: PCR Touch Down

101

Resultado:

\quad: Controles negativos: sin amplificación

\quad: Race: amplificación se ha producido

\quad: Alternativas, cuando la Race solamente suministra "emborronamientos": Race anidada

\quad: Diluir el producto amplificado por PCR de la 1. Race en tampón EDTA 1:50

\vskip1.000000\baselineskip

Race anidada:

\quad: Esquema de pipeteado modificado: en vez de 5 \mul de UPM, 1 \mul de NUP (mezcla de cebadores universales anidados)

\quad: en vez de Race 1, Race \beta anidada

\quad: Programa PCR modificado: en vez de PCR Touch Down, Race de 15 ciclos

\quad: 94ºC, 5 min

\quad: 94ºC, 0,3 min 15x

\quad: 68ºC, 0,3 min 15x

\quad: 72ºC, 3 min 15x

\quad: 72ºC, 10 min

\quad: 4ºC, almacenamiento

\vskip1.000000\baselineskip

Con el método descrito se realiza una rápida amplificación de los extremos de ADNc:

5.1 síntesis de ADNc

5.1.1.3'

La síntesis de ADNc 3' utiliza una reacción de transcriptasa inversa normal con un cebador oligo dT inicial, que hibrida en el extremo poli A.

En la mezcla CDS 3' (oligomezcla dT) también está contenido Smart Oligo II (en menor concentración) (véase 5.2.2), de forma que realiza una polimerización 5' de longitud completa. En el cebador oligo dT se une una secuencia conocida (= Smart).

5.1.2.5'

La síntesis de ADNc 5', como la síntesis 3' se inicia por un oligo dT (mezcla CDS 5') en el extremo 3' del ARNm.

El sistema de oligo Smart II utiliza la característica de que la transcriptasa inversa MMLV, después de una transcripción de longitud completa, adopta una actividad transferasa terminal, que une 3-5 nucleótidos (preferiblemente dCtp) en la nueva hebra sintetizada (1ª hebra).

En esta región rica en citosina se puede unir el oligo SMART II debido a que tiene una región rica en guanina. En la misma se une una secuencia conocida (oligo Smart II). El oligo SMART II sirve como cebador para la transcripción inversa, ahora en sentido 3'.

La transcriptasa MMLV se une ahora completamente por ARNm polimerizados a tal región rica en citosina, de forma que de este modo se garantiza que solamente se produzcan ADNc de longitud completa.

5.2. PCR Race 5.2.1 Mezcla de Polimerasa Advantage 2

\quad: Taq^{TM} Polimerasa Advantage

\quad: Polimerasa de lectura de prueba

\quad: Anticuerpo Taq Start^{TM}

La lectura de prueba produce una polimerización sin errores.

El anticuerpo provoca una PCR de inicio en caliente automático. El anticuerpo monoclonal se une al extremo N de la Taq polimerasa y de este modo inhibe su actividad. Con el calentamiento inicial a 95ºC, el anticuerpo se desnaturaliza y la polimerasa no se sigue inhibiendo.

Con todo, esta combinación posibilita una reacción de la polimerasa en tramos largos.

5.2.2 PCR

La PCR Race se sirve de que el ADNc de longitud completa SMART está limitado por secuencias conocidas. Éstas sirven como cebadores directos/inversos para la amplificación. La secuencia conocida, que se une en el oligo dT en la mezcla de cebador 3' CDS es la misma que representa la unión de oligo SMART II en la secuencia rica en guanina.

Claims

1. Un ácido nucleico, que codifica un antígeno asociado a tumor, donde el ácido nucleico se compone de:

(a): el ácido nucleico de la Fig. 1 o la Fig. 2 o un ácido nucleico con al menos un 80% de identidad con el mismo,

(b): un ácido nucleico emparentado mediante el código genético degenerado con el ácido nucleico de (a).

2. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde es un ADNc o un ADN genómico.

3. Un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

4. El vector de acuerdo con la reivindicación 3, donde el ácido nucleico se asocia de forma funcional a elementos reguladores, que permiten la expresión en células hospedadoras procariotas o eucariotas.

5. El vector de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, que es un plásmido, bacteria, virus o retrovirus.

6. Un transformante que contiene el vector de acuerdo con la reivindicación 3, 4 ó 5.

7. El transformante de acuerdo con la reivindicación 6, que es una bacteria, célula de levadura, de insecto, de animal o de mamífero.

8. Un antígeno asociado a tumor, que está codificado por la secuencia nucleotídica de la Fig. 1 o por una secuencia nucleotídica con al menos un 80% de identidad con la misma.

9. El antígeno asociado a tumor, que comprende la secuencia aminoacídica de la Fig. 3 o una secuencia aminoacídica con al menos un 80% de identidad con la misma.

10. Un método para la producción del antígeno de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, que comprende el cultivo de los transformantes de acuerdo con la reivindicación 6 a 7 en condiciones que permiten la expresión de la proteína, y la obtención de la proteína a partir del cultivo.

11. Un anticuerpo que reconoce de forma específica el antígeno de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9.

12. Un uso (a) de la secuencia aminoacídica, que se deduce a partir de la secuencia nucleotídica de acuerdo con la Fig. 1 o una secuencia aminoacídica con al menos un 80% de identidad con la misma o (b) la secuencia aminoacídica de acuerdo con la Fig. 3 o una secuencia aminoacídica con al menos un 80% de identidad con la misma para la producción de un antígeno específico de tumor para el diagnóstico y/o terapia de tumores.

13. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para el uso como reactivo para el diagnóstico y/o la terapia de tumores.

14. Un anticuerpo específico de acuerdo con la reivindicación 11 para el uso como reactivo para el diagnóstico y/o la terapia de tumores.

15. Un uso de un antígeno de acuerdo con la reivindicación 12, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13 o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 para la producción de una vacuna para la terapia de tumores.

16. El uso de un antígeno de acuerdo con la reivindicación 12 para la producción de células presentadoras de antígeno cargadas de péptidos.

17. El uso de un antígeno de acuerdo con la reivindicación 12 o de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13 para la generación de células citotóxicas específicas de tumor.

18. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 15 a 17, donde el antígeno es un fragmento peptídico dependiente de HLA.