ES2255076T3 - Proteina con actividad adnasa. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UNA PROTEINA CON ACTIVIDAD ADNSE, DE UN ADN QUE LA CODIFICA Y DE UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIRLA. LA INVENCION TRATA ASIMISMO DEL EMPLEO DEL ADN Y DE LA PROTEINA, ASI COMO DE LOS ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA LA PROTEINA.

Description

Proteína con actividad ADNasa.

La presente invención se refiere a una proteína con actividad ADNasa, a un ADN que codifica una de éstas y a un procedimiento para la preparación de una de éstas. Además, la invención se refiere al uso del ADN y de la proteína, así como del anticuerpo dirigido contra la proteína.

Es conocido que muchas células experimentan una muerte celular programada. Esta muerte celular se designa como apoptosis. Se encuentra, por ejemplo, en el desarrollo de órganos y la metamorfosis, la atrofia de tejidos y la regresión tumoral. La apoptosis está ligada a una condensación del citoplasma, una pérdida de vellosidades de membrana plasmática, una segmentación del núcleo y, especialmente, una degradación extensa del ADN cromosómico. Por último, se muestra que en células apoptóticas se presenta un "patrón" de fragmentos de ADN, especialmente de tamaños de más de 600 kb, 50-300 kb y 50 kb. Hasta ahora, no es conocido qué mecanismos son responsables de la degradación del ADN cromosómico. Sin embargo, esto sería necesario para comprender mejor la apoptosis y, dado el caso, poder tomar medidas a favor o en contra de ella.

El documento WO-A-9007572 describe una ADNasa humana que presenta una homología de aproximadamente 55% con la ADNasa de la presente solicitud.

La presente invención se basa por tanto en el objetivo de preparar un agente que pueda analizar la degradación del ADN cromosómico en células apoptóticas.

Según la invención, se consigue esto al proporcionar los objetos de las reivindicaciones.

Es, por tanto, objeto de la presente invención una proteína con actividad ADNasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1 o un derivado o fragmento funcional de la misma, en la que este derivado o fragmento (i) presenta la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1 con adición y/o sustitución y/o deleción de uno o varios aminoácidos, (ii) está codificado por un ADN que hibrida con el ADN de la Fig. 1 a 20ºC por debajo del punto de fusión del ADN y (iii) presenta una actividad ADNasa. La expresión "actividad ADNasa" indica en consecuencia que la proteína puede cortar ADN mono- y/o bicatenario.

La expresión "derivado o fragmento funcional" comprende cualquier derivado o fragmento de la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1 que presente una actividad ADNasa. La secuencia de aminoácidos de la Fig 1 puede presentar también adiciones, sustituciones y/o deleciones de uno o varios aminoácidos, lo que también es válido para los derivados o fragmentos funcionales de la misma.

Es otro objeto de la presente invención un ácido nucleico que codifica una proteína precedente. Éste puede ser un ARN o un ADN. Por último, puede ser, por ejemplo, un ADN genómico o un ADNc. Se prefiere un ADN que comprende lo siguiente:

(a) el ADN de la Fig. 1

(b) un ADN hibridante con el ADN de (a), o

(c) un ADN relacionado con al ADN de (a) o (b) por el código genético degenerado.

La expresión "ADN hibridante" indica un ADN que, en condiciones convencionales, especialmente a 20ºC por debajo del punto de fusión del ADN, hibrida con un ADN de (a).

El ADN de la Fig. 1 se depositó en el DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) como JFC4 DSM 9993 el 23 de mayo de 1995.

A continuación, se describe un ADN según la invención en forma de un ADNc. Éste representa, por ejemplo, cada ADN que entra dentro de la presente invención.

Para la preparación de un ADNc según la invención, es ventajoso partir de una biblioteca de cósmidos, por ejemplo, q1Z (véase Dietrich, A. y col., Nucleic Acids Res., 19, (1991), 2567-2572) que comprende los clones de la región Xq27.3-Xqter del genoma humano. Dichos clones se fijan a una membrana de filtro e hibridan con conjuntos de ADNc obtenidos mediante transcripción inversa a partir de ARNm marcado de tejidos porcinos, por ejemplo, cerebro, músculo, hígado (véase Coy, J.F. y col., Mammalian Genome 5, (1994), 131-137). Aquellos clones que presenten una señal de hibridación con el conjunto de ADNc se usan para análisis de una biblioteca de ADNc humano, por ejemplo, de tejido cerebral fetal. Para ello, es especialmente adecuada la biblioteca de ADNc \lambda-Zap, Stratagene, nº de cat. 936206. Se obtiene un ADNc según la invención.

Un ADNc según la invención puede presentarse en un vector o vector de expresión. Los ejemplos de estos son conocidos por el experto. En el caso de un vector de expresión para E. coli, éste es, por ejemplo, pGEMEX, derivados de pUC, pGEX-2T, pET3b y pQE-8, prefiriéndose este último. Para la expresión, han de citarse levaduras, por ejemplo, pY100 e Ycpadl, mientras que para la expresión en células animales se indican, por ejemplo, pKCR, pEFBOS, cDMB y pCEV4. Para la expresión en células de insecto, es especialmente adecuado el vector de expresión de baculovirus pAcSGHisNT-A.

El experto conoce las células adecuadas para expresar un ADNc según la invención presente en un vector de expresión. Los ejemplos de dichas células comprenden las cepas de E. coli HB101, DH1, x1776, JM 101, JM 109, BL21 y SG 13009, prefiriéndose esta última, la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae y las células animales L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero y HeLa, así como las células de insecto sf9.

El experto sabe de qué manera debe insertarse un ADNc según la invención en un vector de expresión. Es también conocido por él que este ADN puede insertarse unido a un ADN que codifica otra proteína o péptido, de modo que el ADNc según la invención puede expresarse en forma de una proteína de fusión.

Además, el experto conoce las condiciones de cultivo de células transformadas o transfectadas. Son también conocidos por él procedimientos para aislar y purificar proteínas expresadas por el ADNc según la invención. Una de dichas proteínas, que puede ser también una proteína de fusión, dado el caso es por tanto igualmente objeto de la presente invención.

Otro objeto de la presente invención es un anticuerpo dirigido contra una proteína o proteína de fusión precedente. Puede prepararse uno de dichos anticuerpos mediante procedimientos convencionales. Puede ser policlonal o monoclonal. Para su preparación, es ventajoso inmunizar animales, especialmente conejos o gallinas para un anticuerpo policlonal y ratones para monoclonal, con una proteína (de fusión) precedente o fragmentos de la misma. Pueden realizarse "recuerdos" adicionales al animal con la misma proteína (de fusión) o fragmentos de la misma. El anticuerpo policlonal puede obtenerse además a partir del suero o la yema de huevo del animal. Para el anticuerpo monoclonal, se fusionan células de bazo del animal con células de mieloma.

Se depositó un anticuerpo preferido de la presente invención, concretamente el anticuerpo monoclonal 11/78/1, en la DSM como DSM ACC2211 el 26 de abril de 1995.

La presente invención permite analizar la degradación del ADN cromosómico en células apoptósicas. Este análisis puede llevarse a cabo en líquidos corporales aislados de una persona. Con un anticuerpo según la invención, puede detectarse la ADNasa responsable de la degradación precedente. Además, con una proteína según la invención puede detectarse un anticuerpo dirigido contra esta ADNasa. Ambas detecciones pueden realizarse mediante procedimientos convencionales, especialmente una transferencia Western, una ELISA, una inmunoprecipitación o mediante inmunofluorescencia. Además, con un ácido nucleico según la invención, especialmente un ADN y cebadores derivados del mismo, puede detectarse la expresión del gen que codifica la ADNasa precedente. Esta detección puede realizarse de modo convencional, especialmente en una transferencia Southern.

Además, la presente invención es adecuada para tomar medidas a favor o en contra la de apoptosis. Estas medidas comprenden la administración de un objeto según la invención a una persona. Con un anticuerpo según la invención, puede inhibirse una ADNasa precedente, con lo que se reduce la degradación del ADN cromosómico. Por otro lado, con una proteína según la invención, especialmente después de acoplamiento con una proteína no considerada extraña por el cuerpo, por ejemplo transferrina o BSA, puede potenciarse esta degradación, lo que sería especialmente adecuado para el tratamiento de células tumorales. Correspondientemente, puede conseguirse también un ácido nucleico según la invención, especialmente un ADN, que esté dispuesto bajo el control de un promotor inducible en determinados tejidos, por ejemplo, tumores, y que conduzca después de su expresión a la preparación de una proteína según la invención en estos tejidos. Además, puede emplearse también un ácido nucleico según la invención, especialmente ADN, para la inhibición de una ADNasa precedente. Para ello, se usa el ácido nucleico, por ejemplo, como base para la construcción de oligonucleótidos sin sentido para la inhibición de la expresión del gen que codifica la ADNasa precedente.

La presente invención representa por tanto una gran contribución para la asignación de diagnóstico y terapéutica de la apoptosis.

Breve descripción del dibujo

La Fig. 1 muestra la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos derivada de ella de una proteína según la invención con actividad ADNasa.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.

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Ejemplo 1 Preparación y purificación de una proteína según la invención

Para la preparación de una proteína según la invención, se usó el ADN de la Fig. 1 como molde. Se llevó a cabo un procedimiento PCR. Como par cebador se usaron: 5'-CAGGGATCCGATGACGATGACAAAATGCACTACC
CAACTGCAC-3' y 5'-GGGGGATCCTCAGGCAGCAGGGCACAG-3'. La preparación PCR o las condiciones PCR fueron las siguientes:

Preparación PCR
ADN molde (Fig. 1)	1 \mul= 1 ng
Tampón polimerasa Pfu 10x	10 \mul= 1x
DMSO	10 \mul= 10%
DNTP	1 \mul= 200 \muM cada uno
Oligonucleótidos, 1,5 \mul cada uno	3 \mul= 150 ng cada uno
H_{2}O bidestilada	hasta 99 \mul

Condiciones PCR

- 92ºC, 5 min

- Adición de 1 \mul de polimerasa Pfu (Stratagene)= 2,5 unidades.

- Adición de parafina.

1

Se escindió el ADN amplificado con BamHI y se insertó el vector de expresión pOE-8 (Diagen) en el único sitio BamHI. Se obtuvo el plásmido de expresión pQ/DNaseX. Éste codifica una proteína de fusión de 6 restos de histidina (asociado N-terminal) y la proteína según la invención de la Fig. 1 (asociado C-terminal). El pQ/DNaseX se usó para la transformación de E. coli SG 13009 (véase Gottesman, S. y col., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273). Las bacterias se cultivaron en un medio LB con ampicilina 100 \mug/ml y kanamicina 25 \mug/ml, y se indujeron durante 4 h con 60 \mul de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 60 \muM. Mediante la adición de clorhidrato de guanidina 6 M, se consiguió la lisis de las bacterias, a continuación, se llevó a cabo con el lisado una cromatografía (resina Ni-NTA) en presencia de urea 8 M correspondientemente a los datos del fabricante del material de cromatografía (Diagen). Se eluyó la proteína de fusión unida con un tampón a pH 3,5. Después de su neutralización, se sometió la proteína de fusión a una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 18% y se tiñó con azul de Coomasie (véase Thomas, J.O. y Komberg, R.D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).

Se muestra que puede prepararse una proteína (de fusión) según la invención en forma de alta pureza.

Ejemplo 2 Preparación de un anticuerpo según la invención

Se sometió una proteína de fusión del ejemplo 1 según la invención a una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 18%. Después de teñir el gel con acetato de sodio 4 M, se recortó la banda de 35 kDa del gel y se incubó en solución de sal común tamponada con fosfato. Se sedimentaron los trozos de gel antes de determinar la concentración de proteína del sobrenadante mediante una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, seguida de tinción con azul de Coomasie. Se inmunizaron animales con la proteína de fusión purificada por gel de la siguiente manera:

Protocolo de inmunización para anticuerpo policlonal en conejos

Se utilizaron 35 \mug de proteína de fusión purificada por gel por inmunización en 0,7 ml de PBS y 0,7 ml de coadyuvante de Freund completo o incompleto.

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Día 0	1ª Inmunización (coadyuvante de Freund completo)
Día 14	2ª Inmunización (coadyuvante de Freund incompleto, icFA)
Día 28	3ª Inmunización (icFA)
Día 56	4. Inmunización (icFA)
Día 80	Desangrado

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Se ensayó el suero del conejo en inmunotransferencia. Para ello, se sometió la proteína de fusión del ejemplo 1 según la invención a una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y se transfirió a un filtro de nitrocelulosa (véase Khyse-Andersen, J. J. Biochem. Meth. 10 (1984), 203-209). Los análisis Western se llevaron a cabo como se describe en Bock, C.-T., y col., Virus Genes, 8, (1994), 215-229. Para ello, se incubó el filtro de nitrocelulosa durante 1 hora a 37ºC con un primer anticuerpo. Este anticuerpo era el suero del conejo (1:10.000 en PBS). Después de varias etapas de lavado con PBS, se incubó el filtro de nitrocelulosa con un segundo anticuerpo. Este anticuerpo era un anticuerpo monoclonal IgG de cabra anti-conejo acoplado a fosfatasa alcalina (Dianova) (1:5.000) en PBS. Después de una incubación de 30 minutos a 37ºC, siguieron varias etapas de lavado con PBS y a continuación la reacción de detección de fosfatasa alcalina con solución de revelado (fosfato de 5'-bromo-4-cloro-3-indolilo 36 \muM, azul de nitrotetrazolio 400 \muM, Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM) a temperatura ambiente, hasta que las bandas fueron visibles.

Se muestra que pueden prepararse anticuerpos policlonales según la invención.

Protocolo de inmunización para anticuerpo policlonal en gallina

Se utilizaron 40 \mug de proteína de fusión purificada por gel por inmunización en 0,8 ml de PBS y 0,8 ml de coadyuvante de Freund completo o incompleto.

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Día 0	1ª Inmunización (coadyuvante de Freund completo)
Día 28	2ª Inmunización (coadyuvante de Freund incompleto, icFA)
Día 50	3ª Inmunización (icFA)

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Se extrajeron anticuerpos de yema de huevo y se ensayaron en transferencia Western. Se detectaron anticuerpos policlonales según la invención.

Protocolo de inmunización para anticuerpo monoclonal de ratón

Se utilizaron 12 \mug de proteína de fusión purificada por gel por inmunización en 0,25 ml de PBS y 0,25 ml de coadyuvante de Freund completo o incompleto; en la 4ª inmunización, se disolvió la proteína de fusión en 0,5 ml (sin coadyuvante).

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Día 0	1ª inmunización (coadyuvante de Freund completo)
Día 28	2ª inmunización (coadyuvante de Freund incompleto, icFA)
Día 56	3ª inmunización (icFA)
Día 84	4ª inmunización (PBS)
Día 87	Fusión

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Se ensayaron los sobrenadantes de hibridomas con transferencia Western. Se detectaron anticuerpos monoclonales según la invención. Uno de ellos, 11/78/1, se depositó en la DSM como DSM ACC2211 el 26 de abril de 1995.

Ejemplo 3 Detección de la actividad ADNasa de una proteína según la invención

Se llevó a cabo un ensayo de actividad ADNasa correspondientemente al procedimiento de Rosenthal, A.L. & Lacks, S.A., Anal. Biochem. 80, (1977), 76-90 con modificaciones. Para ello, se preparó un gel de SDS-poliacrilamida al 18% que contenía EDTA 2 mM y ADN desnaturalizado de testículos de salmón o ARN de levadura hasta una concentración final de 10 \mug/ml en gel de separación o concentración. Se desnaturalizaron las muestras calentando durante 4 min en tampón de muestra de Laemmli que contenía 5% de 2-mercaptoetanol. Se usaron como muestras una proteína según la invención (del ejemplo 1) y ADNasa bovina 1 (control). Como marcador de proteína, se usó un patrón de 10 kDa (Gibco BRL) que se separó en el mismo gel, se recortó después de la electroforesis y se tiñó con azul de Coomasie. Para la separación del SDS después de la electroforesis, se lavó el gel que contenía las muestras 4 x 30 minutos con 100 ml de Tris-HCl 40 mM, pH 7,6, y se incubó durante una noche a temperatura ambiente en Tris-HCl 40 mM, pH 7,6, con azida de sodio al 0,02% y MgCl_{2} 2 mM, CaCl_{2} 2 mM o con MgCl_{2} 2 mM, ZnCl_{2} 2 mM. Para la detección de la actividad enzimática, se cambió el tampón y se añadió bromuro de etidio hasta una concentración final de 2 \mug/ml. Se analizó y fotografió el gel periódicamente a una longitud de onda de luz UV.

Se muestra que una proteína según la invención presenta una actividad ADNasa.

Claims (10)

1. Proteína con actividad ADNasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1 o un derivado o fragmento funcional de la misma, en la que este derivado o fragmento (i) presenta la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1 con adición y/o sustitución y/o deleción de uno o varios aminoácidos, (ii) está codificado por un ADN que hibrida con el ADN de la Fig. 1 a 20ºC por debajo del punto de fusión del ADN y (iii) presenta una actividad ADNasa.

2. ADN que codifica una proteína según la reivindicación 1.

3. ADN según la reivindicación 2, en el que el ADN comprende:

(a)

el ADN de la Fig. 1,

(b)

un ADN hibridante con el ADN de (a) a 20ºC por debajo del punto de fusión del ADN, o

(c)

un ADN relacionado con al ADN de (a) o (b) por el código genético degenerado.

4. Plásmido de expresión que comprende el ADN según la reivindicación 2 ó 3.

5. Células transformadas que contienen el plásmido de expresión según la reivindicación 4.

6. Procedimiento para la preparación de la proteína según la reivindicación 1, que comprende el cultivo de las células transformadas según la reivindicación 5 en condiciones adecuadas.

7. Anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína según la reivindicación 1.

8. Uso del ADN según la reivindicación 1 para la preparación de un reactivo para el diagnóstico y/o la terapia de apoptosis.

9. Uso del ADN según la reivindicación 2 ó 3 para la preparación de un reactivo para el diagnóstico y/o la terapia de apoptosis.

10. Uso del anticuerpo según la reivindicación 7 para la preparación de un reactivo para el diagnóstico y/o la terapia de apoptosis.