ES2289312T3 - Procedimiento y composicion para la prevencion o el retraso del envejecemiento y su efecto durante el proceso de horneado de productos de panaderia. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la prevención o el retraso del envejecimiento durante el proceso de horneado de productos de panadería, que comprende la etapa que consiste en añadir a dichos productos de panadería por lo menos una serina-proteasa termoestable con una temperatura de actividad óptima superior a 60ºC, siendo dicha proteasa añadida en una cantidad que evita o retrasa el envejecimiento durante el procedimiento de horneado.

Description

Procedimiento y composición para la prevención o el retraso del envejecimiento y su efecto durante el proceso de horneado de productos de panadería.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento y a una composición para la prevención o retraso del envejecimiento y efectos relacionados durante el procedimiento de horneado de productos de panadería, que comprende por lo menos un intermediario termoestable y/o una serina proteasa termoestable.

Antecedentes de la invención

Los consumidores prefieren adquirir pan fresco y desean que permanezca fresco durante un tiempo prolongado. Retrasar el envejecimiento siempre ha sido un reto para los productores de los ingredientes de panadería. El hecho de que la producción de pan se encuentra crecientemente centralizada y alejada de los puntos de distribución incrementa la presión para el desarrollo de aditivos y de ingredientes que mantengan la blandura del pan. Además, los panecillos blandos, hamburguesas, bollos y productos de pastelería se ven sometidos a envejecimiento y a pérdida de blandura. Existen varios ingredientes que es conocido que retrasan el envejecimiento del pan y de los productos de panadería blandos. La grasa y los emulsionantes, tales como los monoglicéridos destilados y los estearoil-lactilatos ya se utilizan desde hace décadas. Los monosacáridos, disacáridos y polisacáridos presentan una influencia positiva sobre la retención y ligación del agua. Con frecuencia la pérdida de agua se asocia con el envejecimiento, y los sacáridos presentan una influencia positiva sobre la sensación en la boca de los productos horneados y de esta manera reducen la percepción de retrogradación. Es conocido que las amilasas presentan un efecto beneficioso sobre el envejecimiento y la retrogradación del almidón.

El envejecimiento del pan es un fenómeno complejo. Se percibe como un ablandamiento de la corteza, un endurecimiento de la miga y la desaparición del sabor a pan fresco. El endurecimiento de la miga no sólo se debe a una pérdida de agua durante el almacenamiento, tal como ya demostró Boussingault, en Ann. Chim. Phys. 3,36,490, 1852. Es el resultado de varios procesos fisicoquímicos. A lo largo de los años, los investigadores han intentado desentrañar estos procesos y han desarrollado diferentes teorías.

En los primeros tiempos, el endurecimiento del pan se atribuyó únicamente a la retrogradación del almidón (Katz, J.R., Z. Phys. Chem. 150:37-59, 1930). Se demostró mediante difracción de rayos X que el almidón en el pan forma una estructura microcristalina durante el almacenamiento. Posteriormente se demostró que la fracción soluble en agua del almidón se reducía durante el envejecimiento del pan (Schoch et al., Cereal Chem. 24:231-249, 1947), implicando que durante el horneo, los gránulos de almidón absorben agua. Las cadenas lineales de amilosa se solubilizan y se difunden hasta la fase agua. Con el tiempo, crece la cantidad de amilosa presente en la fase agua. Por lo tanto, la amilosa se lixivia parcialmente hacia el exterior de los gránulos hinchados de almidón. La amilopectina ramificada permanece en los gránulos. El proceso de lixiviado se encuentra limitado por la disponibilidad de agua. Durante el enfriamiento, la amilosa se retrograda muy rápidamente y forma un gel. Se cree que la retrogradación de la amilopectina implica principalmente la asociación de sus ramas externas y requiere un tiempo mayor que la retrogradación de la amilosa, subrayando su importancia en el proceso de envejecimiento, que se produce con el tiempo tras enfriarse el producto, se agrega más lentamente, debido a interferencias estereoquímicas. La amilopectina forma los enlaces intramoleculares. El papel prominente del almidón en el envejecimiento del pan se ilustra adicionalmente mediante la utilización de carbohidrasas para reducir o para enlentecer el envejecimiento de los productos horneados. Se ha demostrado (Conn, J. F. et al., Cereal Chem. 27:191-205, 1950) que las amilasas de origen bacteriano o fúngico enlentecen la velocidad de envejecimiento del pan y resultan en una estructura de la miga menos firme. La adición de alfa-amilasas o beta-amilasas termoestables resulta más efectiva. Sin embargo, ello también resulta en una miga gomosa y pegajosa.

El documento EP 0412607 da a conocer la utilización de una alfa-1,6-endoglucanasa termoestable o una alfa-1,4-exoglucanasa para reducir el envejecimiento; la patente EP 0234858 da a conocer la utilización de una beta-amilasa maltogénica termoestable para conservar la blandura de la miga.

Sin embargo, todavía no resulta claro si el efecto antienvejecimiento se debe a las dextrinas producidas o a la modificación de la amilosa y de la amilopectina y la consecuente tendencia reducida a cristalizar. Además, la influencia de los emulsionantes, tales como el monoestearato de glicerol y el estearoil-lactilato sódico aparentemente confirman el papel del almidón en el endurecimiento de la miga del pan (Schuster, G., Emulgatoren für Lebensmittel, Springer Verlag, páginas 323 a 329, 1985). Es la interacción entre estos emulsionantes y el almidón que resulta e una conformación modificada del almidón que explica la reducción observada del envejecimiento.

Debido a que no siempre se observa una buena correlación entre la estructura del almidón y el envejecimiento (Zobel, H.F. et al., Cereal Chem. 36:441, 1959), también e han investigado otros constituyentes de la harina. Se ha estudiado el papel de las proteínas de la harina en el proceso de endurecimiento de la miga, pero se ha descubierto que resultan menos importantes que el almidón (Cluskey, J.E., Cereal Chem. 36:236-246, 1959). Dragsdorf, R.D., Cereal Chem. 57:310-314, 1980, han estudiado la migración del agua entre el almidón y el gluten durante el almacenamiento del pan. Estos autores concluyeron que, debido a un cambio de la cristalinidad del almidón, adsorbía más agua, de manera que el agua migra desde el gluten hasta el almidón y por lo tanto se reduce la disponibilidad de agua libre.

En un estudio posterior (Martin et al., Cereal Chem. 68(5):498-503 y 503-507, 1991), aparentemente las dextrinas de elevado peso molecular no presentan un efecto antiendurecimiento sobre la miga del pan. Por el contrario, las dextrinas de DP elevado pueden enredarse y/o formar un enlace de hidrógeno con fibrillas de proteína, reticulando efectivamente de esta manera el gluten. En consecuencia, la velocidad de endurecimiento se incrementa. Se ha establecido que en las harinas más débiles, el gluten interacciona más intensamente con los gránulos de almidón. Esto provoca que la miga del pan se endurezca más rápido. Sin embargo, una mejor calidad del gluten y una harina más fuerte también resulta en un mayor volumen del pan y de esta manera, en una miga más blanda. Axford et al., 1968, citada en Faridi, H., Rheology of wheat products, AACC, páginas 263-264, 1985, demostraron que el volumen específico del pan era un factor importante en la medición de tanto la velocidad como el grado de endurecimiento. Por lo tanto, el papel del gluten en el endurecimiento del pan todavía sigue siendo cuestionable y se han realizado pocos intentos para ralentizar el endurecimiento basados en la modificación del gluten.

Las proteasas presentan una larga historia de utilización en el sector de la panadería. Mayoritariamente en panadería se utilizan para reducir los requisitos mecánicos de desarrollo de la masa del gluten inusualmente fuerte o resistente. Reducen la viscosidad e incrementan la extensibilidad de la masa. En el producto final mejoran la compresibilidad de la textura, el volumen del pan y el color del pan. Además, puede mejorarse el sabor mediante la producción de determinados péptidos. Las proteasas suavizan el gluten enzimáticamente y no mecánicamente. Reducen la consistencia de la masa, reduciendo el valor del farinógrafo. Las proteasas más utilizadas en panadería proceden de Aspergillus oryzae y de Bacillus subtilis. Las proteasas bacterianas neutras son mucho más activas sobre el gluten que las proteasas alcalinas. La papaína, la bromelaína y la ficina son tiol-proteasas extraídas de la papaya, de la piña y de los higos. Especialmente la papaína es muy reactiva en relación a las proteínas del gluten. Las proteasas bacterianas y la papaína, especialmente las proteasas neutras, se utilizan en galletas, bastones de pan y galletitas saladas, en los que se desea un ablandamiento de la masa. Sin embargo, en la fabricación del pan resulta preferida una hidrólisis más moderada de las proteasas fúngicas.

Las proteasas también adolecen de desventajas importantes. La acción de las proteasas no se encuentra limitada en el tiempo, continúa tras la mezcla y debilita la estructura de la masa con el tiempo. Este fenómeno incrementa el riesgo de debilitamiento de la masa e incrementa la pegajosidad de la masa. En ocasiones su acción incluso resulta incrementada por la caída de pH durante la fermentación. La utilización de proteasas durante el horneo requiere el control estricto de las condiciones de fermentación en masa y de prefermentación de la masa. Las proteasas resultan inactivadas durante el horneo (Kruger, J.E., Enzymes and their role in cereal technology, AACC páginas 290-304, 1987). Especialmente las proteasas neutras de Bacillus y la papaína deben dosificarse muy cuidadosamente, debido a que las sobredosis debilitan la masa en exceso. Ello puede resultar en el colapso de la masa previamente al horneo, o en un volumen menor del pan y en una estructura más abierta de la miga. Especialmente en Europa, donde las harinas son más débiles que en los Estados Unidos o que en Canadá, el riesgo de dosificación excesiva de la proteasa se encuentra muy presente.

Además, las proteasas también incrementan la pegajosidad debido a que, por la acción hidrolítica, se libera agua del gluten (Schwimmer, S., Source book of food enzymology, AVI Publishing, páginas 583-584, 1981). Ello implica que, en la práctica, las proteasas no se utilizan mucho en panadería en Europa.

El documento GB-A-906344 describe un aditivo antienvejecimiento del pan que comprende grasa o aceite y por lo menos un enzima proteolítico de Bacillus subtilis o de Aspergillus oryzae.

El documento EP 021179 da a conocer la utilización de una preparación de alfa-amilasa en la que la proteasa (inactivada) se utilizó en combinación con emulsionantes con el fin de inhibir el envejecimiento.

Conforti et al., FSTA 96(12), resumen de presentación nº M0190, 1996) añadieron una mezcla de enzimas que comprendía amilasa bacteriana, amilasa fúngica y proteasa fúngica a magdalenas de grasa sustituida. La magdalena que contenía grasa de control era más tierna. El tratamiento con enzimas redujo la tasa de envejecimiento. Lo anterior no resulta inesperado en vista de la presencia de amilasas.

La lipasa también es conocido que ablanda la miga del pan y en cierto grado reduce la velocidad de endurecimiento de la miga del pan (WO 94/04035, Ejemplo 2).

El documento EP-A-1186658 describe una solución de enzima con actividad proteolítica obtenida mediante el cultivo de Bacillus subtilis cepa M2-4 que presenta actividad de peptidasa altamente resistente al calor. Se descubrió que el volumen de pan se incrementaba un 10% tras la adición de la solución de enzima.

El documento DD-A-156714 y Bäcker y Konditor, 1984, se refieren a la preparación de una termitasa estable al cal, y a la utilización de la misma en productos de panadería (por ejemplo obleas) para debilitar el gluten.

Los documentos WO-A-0174169 y GB-A-375342 se refieren a la incorporación de papaína, una cisteína-proteasa en masas de pan y de galleta como agente de ablandamiento del gluten.

El documento US-A-3561975 da a conocer la utilización de proteasas recubiertas de grasa en masas de tarta.

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Los documentos RU (A)2177994, US-A-5569599, US-A-5124261 y US-A-5714373 describen la producción y utilización de algunas proteasas estables al calor, tales como queratinasa, acualisina I y una proteasa de Thermococcus.

Las proteasas fúngicas son sensibles a las temperaturas elevadas. Su potencia de hidrólisis de las proteínas en un intervalo de temperaturas moderadas a elevadas de aproximadamente 50ºC o más normalmente es reducida. Algunas proteasas bacterianas neutras y alcalinas son resistentes a tratamientos de temperatura más elevada. Hasta el momento, los informes sobre las proteasas derivadas de bacterias con resistencia al calor que pueden conservar buena actividad de peptidasa, por ejemplo, en un intervalo de temperaturas elevadas de aproximadamente 60ºC, han sido escasos. El documento EP 1186658 da a conocer este tipo de enzima, producido por una bacteria de la especie Bacillus subtilis, más específicamente, una cepa M2-4. La mezcla de enzima dada a conocer, sin embargo, pierde por completo su actividad a una temperatura de aproximadamente 70ºC. Las proteasas termoestables neutras de Bacillus, que pueden ser tolerantes a los agentes oxidantes, resultan preferentes en las formulaciones de detergente. Además, las proteasas termoestables alcalinas de Bacillus se utilizaron en formulaciones de lavado y de detergente. La papaína es muy estable al calor y requiere un calentamiento prolongado a una temperatura comprendida entre 90ºC y 100ºC para desactivarse. La bromelaína es menos estable y puede desactivarse a una temperatura aproximada de 70ºC. Otras proteasas estables al calor son producidas por Bacillus licheniformis NS70 (Chemical Abstracts 127:4144, CA), Bacillus licheniformis MIR 29 (Chemical Abstracts 116:146805 CA), Bacillus stearothermophilus (Chemical Abstracts 124:224587 CA), Nocardiopsis (Chemical Abstracts 114:162444 CA) y Thermobacteroides (Chemical Abstracts 116:146805 CA). Ésta no es una lista exhaustiva, pero ilustra la importancia de las serina-proteasas termoestables y la aplicación de las mismas, mayoritariamente en detergentes. No se hace referencia a panadería ni a propiedades antienvejecimiento.

Es conocido asimismo que la lipasa ablanda la miga del pan y reduce el nivel de endurecimiento de la miga de pan (WO 94/04035 ejemplo 2).

Las proteasas fúngicas son sensibles a las temperaturas elevadas. Algunas proteasas bacterianas neutras y alcalinas son resistentes a tratamientos de temperatura más elevada. Las proteasas termoestables neutras de Bacillus, que pueden ser tolerantes a los agentes oxidantes, resultan preferentes en las formulaciones de detergente. Además, las proteasas termoestables alcalinas de Bacillus se utilizaron en formulaciones de lavado y de detergente. La papaína es muy estable al calor y requiere un calentamiento prolongado a una temperatura comprendida entre 90ºC y 100ºC para desactivarse. La bromelaína es menos estable y puede desactivarse a una temperatura aproximada de 70ºC. Otras proteasas estables al calor son producidas por Bacillus licheniformis NS70 (Chemical Abstracts 127:4144, CA), Bacillus licheniformis MIR 29 (Chemical Abstracts 116:146805 CA), Bacillus stearothermophilus (Chemical Abstracts 124:224587 CA), Nocardiopsis (Chemical Abstracts 114:162444 CA) y Thermobacteroides (Chemical Abstracts 116:146805 CA). Ésta no es una lista exhaustiva, pero ilustra la importancia de las serina-proteasas termoestables y la aplicación de las mismas, mayoritariamente en detergentes. No se hace referencia a panadería ni a propiedades antienvejecimiento.

La papaína es un constituyente proteolíticamente activo en el látex de la fruta tropical papaya. El látex seco crudo contiene una mezcla de por lo menos cuatro cisteína-proteinasas.

La termolisina es una metaloendopeptidasa extracelular secretada por la bacteria termofílica gram-positiva Bacillus thermoproteolyticus.

Estado de la técnica

La queratinasa es una proteasa activa sobre la queratina, una escleroproteína que existe como constituyente en la epidermis de mamífero, pelo, lana, uñas y plumas. Las aplicaciones prácticas del enzima son: ingrediente en composiciones depilatorias, como adyuvante depilatorio de pieles en la fabricación del cuero, la descomposición de la queratina y la reconstitución del mismo en tejidos textiles. No se conoce la aplicación de dicho enzima en la industria alimentaria.

Thermus aquaticus es un hipertermófilo perteneciente al taxón Arqueobacterias. La bien conocida "polimerasa Taq"^{TM} se aísla a partir de este organismo. Pyrococcus furiosus es otro representante de este grupo. Se aislaron proteasas termoestables a partir de estos organismos.

La termitasa es una endopeptidasa extracelular de Thermoactinomyces vulgaris. Debido a su especificidad relativamente reducida de corte de los enlaces peptídicos, la termitasa presenta muchas aplicaciones. Resulta adecuada para producir proteínas parcialmente hidrolizados para dietas de salud y otras dietas especiales.

Sumario de la invención

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la prevención o el retraso del envejecimiento y efectos asociados durante el procedimiento de horneado de productos de panadería, comprendiendo dicho procedimiento la etapa que consiste en añadir a los ingredientes de dichos productos de panadería una cantidad suficientemente efectiva de por lo menos una proteasa termoestable.

Preferentemente dichas proteasas son proteasas neutras o alcalinas, más preferentemente proteasas alcalinas.

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Preferentemente, el intermediario termoestable y/o serina-proteasa termoestable presenta una temperatura óptima de actividad superior a 60ºC, preferentemente superior a 70ºC, más preferentemente superior a 75ºC o incluso superior a 80ºC. El intermediario termoestable y/o serina-proteasa termoestable preferente utilizado en el procedimiento según la invención presenta una proporción entre la actividad de proteasa a temperatura óptima y la actividad de proteasa a 25ºC, superior a 10, preferentemente superior a 15. De esta manera, el enzima se encontrará preferentemente activo durante el procedimiento de horneado y preferentemente no durante el procedimiento de panificación.

Dicho intermediario termoestable y/o serina-proteasa termoestable puede obtenerse mediante extracción a partir de organismos eucarióticos o procarióticos de origen natural, mediante síntesis o mediante ingeniería genética mediante un procedimiento bien conocido por un experto en la materia.

El intermediario termoestable y/o serina-proteasa termoestable preferido es la proteasa Taq que puede aislarse ventajosamente de la cepa Thermus aquaticus (LMG8924) o es una queratinasa, preferentemente aislada a partir de Bacillus licheniformis (LMG7561) o es termitasa aisla de Thermoactinomyces vulgaris. Las tres proteinasas pertenecen a la clase de las serina-peptidasas. La papaína (perteneciente a la clase de las cisteína-peptidasas) y la termolisina (perteneciente a la clase de las metalopeptidasas) también se incluyeron en los ensayos de horneado llevados a cabo, pero no pudieron reducir el envejecimiento y/o presentaron efectos secundarios no deseables y/o efectos negativos sobre el procedimiento de horneado y los productos resultantes.

En el procedimiento según la invención, la utilización del intermediario termoestable y/o la serina-proteasa termoestable puede combinarse con otro enzima, tal como una \alpha-amilasa, \beta-amilasa, intermediario amilasa maltogénica termoestable, lipasa, glucosiltransferasas o pululanasas termoestables. La proteasa termoestable también puede añadirse a un aditivo no enzimático, tal como un emulsionante (monoglicérido, diglicérido y/o estearoil-lactilato). También pueden añadirse otros emulsionantes adecuados a dicho intermediario termoestable y/o serina-proteasa termoestable durante el procedimiento de horneado. Se observan efectos sinérgicos o acumulativos.

Por lo tanto, el procedimiento según la invención resultará en productos de panadería mejorados que preferentemente se seleccionan de entre el grupo constituido por pan, panecillos blandos, bagels, donuts, repostería danesa, panecillos para hamburguesa, pizza, pan de pita y pasteles.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición antienvejecimiento para productos de panadería, que comprende por lo menos una proteasa termoestable.

Otra forma de realización de la presente invención es una composición mejorante, más específicamente una composición mejorante del pan, que comprende por lo menos un intermediario termoestable y/o una serina-proteasa termoestable y los ingredientes activos habituales de una composición mejorante. Una composición mejorante es un concepto bien conocido por los panaderos. Es una mezcla de ingrediente activos, tales como enzimas y emulsionantes, que se mezclan con los ingredientes habituales para preparar el pan, tales como harina y agua.

Una forma de realización adicional de la presente invención se refiere a la utilización de dicho intermediario termoestable y/o proteasa termoestable, especialmente una queratinasa de la invención en la industria alimentaria y más específicamente en productos de panadería.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a la utilización de un intermediario termoestable y/o serina-proteasa termoestable en productos horneados. Preferentemente, estas serina-proteasas son proteasas alcalinas, pero también pueden ser proteasas neutras. La preparación de enzimas presenta un efecto pronunciado sobre la blandura de la miga y sobre el retraso del envejecimiento de los productos horneados. La preparación de enzima se caracteriza por el hecho de que no presente ningún efecto negativo sobre la reología de la masa, sobre la estructura de la miga y sobre el volumen del pan resultante. El enzima presenta una actividad reducida a una temperatura de entre 25ºC y 40ºC, implicando que presentarán una actividad reducida a nula durante el reposo y/o panificación de la masa. El enzima presenta una temperatura óptima comprendida entre 60ºC y 80ºC o superior. El enzima se inactiva o no se inactiva durante el procedimiento de horneado. El intermediario termoestable y/o serina-proteasas termoestables según la presente invención se caracterizan porque presentan un efecto positivo como agentes antienvejecimiento. Este efecto resulta especialmente notable en combinación con otros enzimas antienvejecimiento. Como ejemplos de otros enzimas antienvejecimiento, el experto en la materia puede seleccionar amilasa termoestables de Bacillus licheniformis o Bacillus stearothermophilus y amilasas maltogénicas termoestables (es decir Novamyl® de Novozymes). Su efecto también es aditivo respecto al efecto antienvejecimiento de monoglicéridos y diglicéridos, estearoil-lactilatos y otros emulsionantes utilizados en horneo.

El intermediario termoestable y/o serina-proteasas termoestables de la invención pueden utilizarse en pan, panecillos blandos, bagels, donuts, repostería danesa, panecillos para hamburguesa, pizza y pan de pita, pasteles y otros productos horneados en los que el envejecimiento e inhibición de los mismos representa una cuestión de calidad.

El intermediario termoestable y/o serina-proteasa termoestable de la invención puede ser producido por procariotas (bacterias) y eucariotas (hongos, arqueobacterias, animales, plantas, etc.) y/o puede producirse mediante ingeniería genética o incluso mediante síntesis con cualquier técnica conocida de la técnica.

Básicamente, las características más importantes d las proteasas que se utilizan en la presente invención son:

1) Su termoestabilidad: a un pH en el que el enzima es estable presentan una temperatura óptima que es superior a 60ºC, preferentemente superior a 70ºC y todavía más preferentemente superior a 75ºC, superior a 80ºC o a 85ºC.

2) La proporción entre la actividad en la temperatura óptima y a 25ºC es por lo menos superior a 10 y preferentemente superior a 15.

3) Pertenecen al grupo de las serina-proteasas.

Preferentemente, las proteasas de la invención no pierden su actividad a temperaturas superiores a 60ºC, preferentemente superiores a 70ºC, 75ºC, 80ºC o incluso 85ºC. Los enzimas de la presente invención todavía pueden encontrarse activos a las temperaturas internas muy elevadas que se alcanzan dentro de un producto durante el horneo (por lo menos aproximadamente 75ºC para el alimento horneado panificado con levadura y de por lo menos aproximadamente 90ºC a 95ºC para alimentos horneados panificados químicamente, cuando se encuentran completamente horneados). Dentro del intervalo de temperaturas de óptimo, la temperatura puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 60ºC y 61ºC, 62ºC, 63ºC, ... 84ºC, 85ºC, ... 89ºC, 90ºC, ... 94ºC, 95ºC, incluyendo todos los números enteros comprendidos entre los mismos.

El enzima de la invención es preferentemente una queratinasa, una proteasa Taq y/o una termitasa. La queratinasa preferentemente es producida por Bacillus licheniformis (por ejemplo B. licheniformis LMG 7561). La proteasa Taq preferentemente es producida por Thermus aquaticus (por ejemplo Thermus aquaticus LMG 8924). La termitasa es producida preferentemente por Thermoactinomyces vulgaris.

Las proteasas pueden obtenerse a partir de los microorganismos respectivos mediante la utilización de cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, la preparación de proteasa puede obtenerse mediante fermentación de un microorganismo y el posterior aislamiento de la preparación que contiene proteasa a partir del caldo resultante mediante procedimientos conocidos de la técnica, tales como la centrifugación y la ultrafiltración. Las proteasas también pueden obtenerse mediante clonación de la secuencia de ADN codificante de una proteasa adecuada en un organismo huésped, que expresa la proteasa intracelular o extracelularmente y recogiendo el enzima producido. Preferentemente, la proteasa se encuentra presente en una forma que permite la dosificación exacta y/o más o menos exacta. La dosificación puede resultar difícil cuando las proteasas son parte de una mezcla natural compleja que comprende más de un tipo de enzima. En este caso, puede resultar necesaria la restricción de una o más etapas de purificación.

Las proteasas también pueden obtenerse mediante evolución dirigida o intercambio de genes de serina-proteasas o enzimas termoestables o no termoestables. Con la condición de que presenten actividad de corte de péptidos, se consideran proteasas dentro del alcance de la presente invención.

Inesperadamente, los inventores descubrieron que la utilización de una proteasa que no presentaba ninguna acción perceptible sobre la reología de la masa presentaba un efecto pronunciado sobre la blandura y retraso de la dureza de la miga. No se observó ningún efecto negativo sobre la elasticidad de la miga o ningún incremento de la pegajosidad de la miga en comparación con un control. El efecto era aditivo respecto a los agentes antienvejecimiento conocidos (tales como las amilasas) y permite el desarrollo de pan y de otros productos de horneado blandos, con una vida de almacenamiento prolongada.

La elección de la proteasa resulta muy importante. La proteasa no debe ejercer ningún efecto negativo durante la mezcla y la prefermentación posterior. De otra manera, la dosis que puede administrarse resulta excesivamente baja para reducir la velocidad de envejecimiento y para mantener una buena elasticidad de la miga. Cuanto más elevada sea la temperatura óptima del enzima, menor es el efecto negativo sobre la estructura de la miga y sobre la reología de la masa.

A continuación se describe la presente invención en detalle en los ejemplos no limitativos siguientes y haciendo referencia a las figuras adjuntas.

Descripción breve de las figuras

La figura 1 representa la temperatura óptima de la proteasa expresada como función de la actividad relativa (%) a pH 7,0, en una solución tamponada de fosfato 0,1 M para la acualisina I (\blacklozenge, línea continua) y queratinasa (\cdot, línea de puntos).

La figura 2 representa el efecto retardante de la adición de proteasa Taq (0 U: \blacklozenge, 800 U) tras el envejecimiento del pan en ausencia y en presencia de Novamyl® (0 a 8 g/100 kg de harina).

La figura 3 muestra el efecto mejorado sobre el retraso del envejecimiento del pan tras la adición de queratinasa
(0 U: \blacklozenge, 800 U) en el pan en ausencia y en presencia de Novamyl® (0 a 8 g/100 kg de harina).

La figura 4 muestra la temperatura óptima de la termitasa, expresada como función de su actividad relativa (%) a pH 7,0, en una solución tamponada de fosfato 0,1 M.

La figura 5 muestra la estabilidad térmica de la termitasa, expresada como función de su actividad relativa (%).

Descripción de una forma de realización preferida de la invención

Una de las serina-proteasas preferidas utilizadas se obtiene a partir de la cepa Bacillus licheniformis LMG 7561 y presenta actividad de queratinasa. Mediante la similitud de la cadena de aminoácidos y la inhibición por fluoruro de fenilmetilsulfonilo, se demostró que la queratinasa era una serina-proteasa. La queratinasa en cuestión se obtiene cultivando la cepa Bacillus licheniformis LMG 7561 en el medio siguiente: NH_{4}Cl 0,5 g/l, NaCl 0,5 g/l, K_{2}HPO_{4} 0,3 g/l, KH_{2}O_{4} 0,4 g/l MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 0,1 g/l, ácido cítrico 2 g/l, extracto de levadura 0,1 g/l y harina de plumas
10 g/l. El medio se ajustó a pH 6,5 con ácido fosfórico. No se impuso ningún control del pH. La incubación se realizó a 45ºC bajo aireación (pO_{2} 60%, 1,25 vvm) durante 40 horas, después de las cuales se recogió el medio para su concentración adicional. A continuación, se concentró el sobrenadante mediante ultrafiltración por membrana (valor de corte molecular: 5.000 Da). La solución de queratinasa cruda obtenida de esta manera se almacenó congelada hasta su utilización en ensayos de horneado.

La solución de queratinasa obtenida de esta manera muestra actividad máxima a una temperatura de 60ºC y a un pH de 8,0. En el intervalo de pH de entre 7 y 9, se midió una actividad superior al 85% de la actividad máxima. No se produjo prácticamente ninguna pérdida de actividad enzimática durante el calentamiento de la solución durante una hora a 60ºC. El calentamiento del enzima a 70ºC durante 14 minutos reduce la actividad en el 50%.

Se midió la actividad sobre la queratina. Para las mediciones estándar, se disolvieron 4 g de queratina en 100 ml de hidróxido sódico. Tras la disolución, se ajustó el pH lentamente a 8,0 con ácido fosfórico 3,2 M. Se añadió agua destilada hasta un volumen final de 200 ml. Se preincubaron 5 ml de la solución de sustrato a 60ºC. Se añadió 1 ml de solución de enzima y se incubó a 60ºC. A continuación, se añadieron 5 ml de TCA (ácido tricloroacético) al 14% a la solución de enzima incubada. Se mezcló durante 60 minutos. La solución se filtró y se midió la absorbancia a 275 nm respecto a una solución blanco (enzima añadido tras la adición del TCA).

La actividad está expresada en KU/ml = \frac{(A275 \ nm \ Enzima \ - \ A275 \ nm \ Blanco) \ * \ 11}{0,0075*30}

La fermentación contenía 300 a 1.500 KU/ml.

Para el horneo, la actividad se expresó en mU/ml basándose en la determinación con tableta de protazima. Se utilizaron los KU únicamente para demostrar la presencia de la queratinasa.

La proteasa Taq en cuestión se obtiene cultivando la cepa Thermus aquaticus LMG 8924 en el medio siguiente: triptona 1 g/l, extracto de levadura 1 g/l, solución salina 100 ml/l y 900 ml de agua destilada. El pH se ajustó a 8,2 con NaOH 1 M previamente a la esterilización a 121ºC durante 15 minutos. La solución salina presenta la composición siguiente: ácido nitriloacético 1 g/l, CaSO_{4}\cdot2H_{2}O 0,6 g/l, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 1 g/l, NaCl 80 mg/l, KNO_{3} 1,03 g/l, NaNO_{3} 6,89 g/l, Na_{2}HPO_{4}\cdot12H_{2}O 2,8 g/l, solución de FeCl_{3}\cdot6H_{2}O 10 ml/l (47 mg/100 ml), solución de elementos traza 10 ml/l y 1 l de agua destilada. La solución de elementos traza presenta la composición siguiente: H_{2}SO_{4} 0,5 ml/l, MnSO_{4}\cdotH_{2}O 1,7 g/l, ZnSO4\cdot7H_{2}O 0,5 g/l, H_{3}BO_{3} 0,5 g/l, CuSO_{4}\cdot5H_{2}O 25 mg/l, Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O 25 mgl, CoCl_{2}\cdot6H_{2}O 46 mg/l y
1 l de agua destilada. La incubación se realizó a 60ºC bajo aireación (pO_{2} 60%, 4 vvm) durante 24 horas, y se recogió a continuación el medio para su concentración adicional. Thermus aquaticus LMG 8924 produjo por lo menos dos tipos de proteasas extracelulares. Una de las proteasas extracelulares se denomina acualisina I, y es una proteasa alcalina secretada linealmente desde la etapa estacionaria temprana hasta el momento en que las células cesan su crecimiento. La temperatura óptima de la actividad proteolítica se encontraba comprendida entre 70ºC y 80ºC. La otra se denominó acualisina II y es una proteasa neutra, la producción de la cual apareció a partir del día 4 y la concentración de esta proteasa continuó linealmente durante 5 días. La actividad máxima se obtuvo a 95ºC (la temperatura más elevada sometida a ensayo). Se utilizó el extracto de fermentación tras 1 día de fermentación para los ensayos de horneado. Debido a que se detuvo la fermentación tras 1 día, la proteasa presente es la acualisina I. La acualisina I resulta fuertemente inhibida por los inhibidores de serina-proteasa microbiana y puede clasificarse como una serina-proteasa alcalina.

A continuación, se concentró el sobrenadante mediante ultrafiltración a través de membrana (valor de corte molecular: 10.000 Da). La solución de proteasa Taq cruda obtenida de esta manera se almacenó congelada hasta su utilización en ensayos de horneado.

La solución de proteasa Taq obtenida de la manera indicada anteriormente muestra la actividad máxima a una temperatura de 80ºC. Prácticamente no se produjo ninguna pérdida de actividad enzimática durante el calentamiento de la solución durante una hora a 80ºC. El calentamiento del enzima a 90ºC durante 10 minutos redujo la actividad en el 60%.

Se midió la actividad de proteasa en caseína entrecruzada con azurina (AZCL-caseína). Se preparó mediante la tinción y la reticulación de la caseína para producir una material que se hidratase en agua pero que fuese insoluble en agua. La hidrólisis por proteasas produce fragmentos teñidos solubles en agua, y la velocidad de liberación de estos (incremento de absorbancia a 590 nm) puede relacionarse directamente con la actividad enzimática (tabletas Protazyme AK, Megazyme, Irlanda). Se incubó una tableta de Protazyme AK en NaHPO_{4}\cdot2H_{2}O 100 mM, pH 7,0 a 60ºC durante 5 minutos. Se añadió una alícuota de enzima (1,0 ml) y se dejó que continuase la reacción durante exactamente 10 minutos. Se terminó la reacción mediante la adición de fosfato trisódico (10 ml, al 2% p/v, pH 12,3). El tubo se dejó reposar durante aproximadamente 2 minutos a temperatura ambiente y se filtró el contenido. Se midió la absorbancia del filtrado a 590 nm frente a un sustrato de blanco.

La actividad está expresada en mU/ml = \frac{(34,2 \ * \ Abs_{590} enzima \ - \ Abs_{590} \ blanco \ + \ 0,6)}{disolución}

En el caso de los microorganismos termofílicos, Thermoactinomyces vulgaris, es conocido que, durante la etapa logarítmica de la multiplicación, se segregan varios enzimas proteolíticos hacia el medio circundante. De entre los hasta cinco componentes proteolíticos del filtrado de cultivo, domina una proteasa, representando entre 70% y 80% de la actividad total, denominada termitasa.

La termitasa es una serina-proteinasa termoestable extracelular. El perfil de pH muestra un óptimo ancho comprendido entre pH 7,5 y 9,5. El enzima muestra estabilidad máxima en el intervalo de pH de entre 6,4 y 7,6, con inestabilidad creciente a pH superior a 8,0 e inferior a 5,75, especialmente a temperaturas elevadas y en periodos de tiempo más prolongados. Dependiendo del tamaño del sustrato, la termitasa muestra actividad máxima a temperaturas comprendidas entre 65ºC (gelatina), 70ºC (protamina) y 85ºC (azocaseína). El óptimo de temperatura es más pronunciado con el sustrato de mayor tamaño (azocaseína): la actividad a 85ºC es 12 veces superior a la actividad a 25ºC.

La termitasa en cuestión se obtiene cultivando la cepa Thermoactinomyces vulgaris NRRL b-1617 en un medio de cultivo con la composición siguiente: almidón de trigo (20 g/l), peptona bacteriológica (5 g/l), extracto de levadura (3 g/l) y extracto de malta (3 g/l) en agua destilada. La incubación se realizó a 45ºC con una aireación de 12 l/min y rotación a 200 rpm. Se recogió el sobrenadante tras 24 horas de incubación. Debido al hecho de que el sobrenadante del cultivo contenía mucha actividad de \alpha-amilasa, se llevó a cabo una primera etapa de purificación para separar la actividad de proteasa de la actividad de \alpha-amilasa al llevar a cabo los ensayos de horneado. Se concentró el sobrenadante mediante ultrafiltración a través de membrana (valor de corte molecular: 10.000 Da). Se purificó la termitasa mediante cromatografía de columna en una columna de S-sefarosa (Pharmacia). La columna se equilibró con tampón de acetato de Na 500 mM (pH 4,5) y después con tampón de acetato de Na 10 mM (pH 4,5) y CaCl_{2} 5 mM. La actividad de \alpha-amilasa no se ligó a la columna y la termitasa se eluyó con el tampón de acetato de Na 10 mM (pH 4,5), CaCl_{2} 5 mM y NaCl 1 M. La fracción eluida se dializó frente a tampón de acetato de Na 10 mM (pH 4,5) y CaCl_{2} 5 mM y se utilizó para llevar a cabo los ensayos de horneado.

Se midieron las actividades laterales, tales como la actividad de amilasa, con el ensayo Phadebas Amylase^{TM} (Pharmacia & Upjohn). El sustrato es un polímero de almidón reticulado insoluble en agua que porta un pigmento azul. Resulta hidrolizado por la amilasa, formando fragmentos azules solubles en agua. La absorbancia de la solución azul es una función de la actividad de amilasa en la muestra.

Se midió la actividad lateral de xilanasa mediante el procedimiento Xylazyme Method^{TM} (Megazyme). El sustrato utilizado es xilano reticulado con azurina. Este sustrato se prepara mediante tinción y enlace cruzado de xilano altamente purificado (procedente de madera de abedul), produciendo un material que se hidrata en agua pero que es insoluble en el mismo. La hidrólisis por endo-(1,4)-D-xilanasa produce fragmentos teñidos solubles en agua, y la velocidad de liberación de éstos (incremento de la absorbancia a 590 nm) puede relacionarse directamente con la actividad del enzima.

La solución de proteasa Taq obtenida no mostró ninguna actividad lateral de amilasa o de xilanasa.

La solución de queratinasa obtenida no presentaba actividad de xilanasa y contenía menos de 8 U/ml de actividad de \alpha-amilasa según medición con el ensayo Phadebas.

La solución de termitasa obtenida tras el procedimiento de purificación no mostró ninguna actividad lateral de
\alpha-amilasa o de xilanasa.

Se llevaron a cabo ensayos de horneado en 1 kg de pan. La receta básica (en gramos) era:

Harina (Duo):	1.500
Agua:	840
Levadura fresca (Bruggeman, Bélgica):	75
Cloruro sódico:	30
Aceite de palma parcialmente hidrogenado:	21
Monoglicéridos destilados:	3
Sacarosa:	6
Ácido ascórbico	0,06

Se utilizó el procedimiento de panificación siguiente: los ingredientes se mezclaron durante 2' a velocidad baja y durante 6' a velocidad elevada en un mezclador Diosna SP24. La temperatura final de la masa era de 29ºC. Tras la fermentación en masa durante 20' a 25ºC, se prepararon trozos de masa de 600 g utilizando el Euro 200S (Bertrand-Electrolux Baking) a R8/L19 y se moldearon. Los trozos de masa se prefermentaron a 35ºC durante 50' a una humedad relativa de 95%. A continuación, los panes se hornearon a 230ºC en un horno MIWE CONDO (Micheal
Wenz - Arnstein - Alemania) con vapor (0,1 l antes y 0,2 l después de hornear los panes). Resulta evidente para un experto en la materia que pueden obtenerse los mismos resultados finales mediante la utilización de equipos de otros proveedores.

Se midió la blandura del pan con un analizador de textura TA-XT2 (Stable Micro Systems UK). Se rebanó el pan y se midió la fuerza necesaria para obtener una deformación del 25% de 4 rebanadas. Esta fuerza se denomina "dureza". Se midió la dureza el día 1 y el día 6 después del horneo. La diferencia entre las dos medidas de fuerza es la "pérdida de blandura".

Pérdida de blandura = fuerza de deformación el día 6 - fuerza de deformación el día 1

Es una medida relativa. Los valores absolutos carecen de significado en sí mismos, sino que deben compararse a una referencia para su interpretación.

La elasticidad es la diferencia entre la fuerza anteriormente indicada y la fuerza tras 20 segundos de relajación. Cuando la elasticidad es inferior a la medida en el pan de referencia, ello significa que la miga pierde resistencia. Al comprimir la miga, ésta no recupera su forma original. Ello significa que, durante el rebanado o la manipulación, la estructura de miga puede perderse irreversiblemente. Resulta importante que, mediante la utilización de un enzima añadido, no se produce pérdida de elasticidad en comparación con un pan de control.

La adición de los enzimas de la presente invención a la masa del pan no modificó el tiempo de prefermentación, la humedad del pan ni el volumen específico del mismo. El contenido de humedad inicial del pan varió ligeramente, pero la totalidad de los panes perdió aproximadamente la misma cantidad de humedad durante los seis días de almacenamiento a temperatura ambiente.

Ejemplos Ejemplo 1 Proteasa Taq

Se horneó un pan siguiendo el procedimiento anteriormente indicado, con adición de proteasa Taq (finalmente en presencia de diferentes dosis de Novamyl® 10.000 BG, de Novozymes (Dinamarca)).

Las dosis se expresan respecto a 100 kg de peso de harina en el ensayo de horneado.

La tabla 1 siguiente expresa la pérdida de blandura entre el día 1 y el día 6 tras el horneo tal como se ha definido anteriormente.

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TABLA 1 Blandura

1

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El ejemplo muestra que la utilización de proteasa Taq retrasa el envejecimiento del pan. Una combinación de proteasa Taq y una amilasa maltogénica termoestable intermediaria (por ejemplo Novamyl®, enzima comercial de Novozymes) retrasa el envejecimiento del pan significativamente. Por lo tanto, existe un efecto sinérgico entre las serina-proteasas termoestables y las amilasas. Este efecto se vuelve más pronunciado a dosis más elevadas de Novamyl® (ver la figura 2).

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La tabla 2 muestra que la elasticidad de la miga del pan apenas resulta afectada por la utilización de la proteasa Taq.

TABLA 2 Elasticidad

2

Ejemplo 2 Queratinasa

Se horneó un pan de acuerdo con el procedimiento anteriormente indicado con la adición de queratinasa (finalmente en la presencia de Novamyl® 10.000 BG, de Novozymes (Dinamarca).

Las dosis en la tabla 3 siguiente se expresan respecto a 100 kg de peso de harina utilizados en el ensayo de horneado.

La tabla expresa la pérdida de suavidad entre el día 1 y el día 6 tras el horneo tal como se ha definido anteriormente.

TABLA 3 Suavidad

3

Resulta evidente a partir del presente experimento que la adición de serina-proteasa termoestable queratinasa presenta un efecto pronunciado sobre la suavidad. Se produce un efecto acumulativo con las amilasas maltogénicas termoestables, tal como Novamyl® (ver la figura 3). Se verificó mediante ensayo independiente con dicha amilasa que la reducida cantidad de amilasa presente en la preparación no presentaba ningún impacto sobre la suavidad ni sobre la proporción de relajación.

La tabla 4 también muestra que no se produjo ningún efecto negativo sobre la proporción de relajación al utilizar dicha proteasa.

TABLA 4 Elasticidad

4

Ejemplo 3 Termitasa

Se horneó un pan de acuerdo con el procedimiento indicado anteriormente con la adición de termitasa (finalmente en combinación con Novamyl® 10.000 BG, de Novozymes (Dinamarca)).

Las dosis en la tabla 5 siguiente se expresan respecto a 100 kg de peso de harina utilizados en el ensayo de horneado.

La tabla 5 expresa la pérdida de suavidad entre el día 1 y el día 6 tras el horneo tal como se ha definido anteriormente.

TABLA 5 Suavidad

5

Resulta evidente a partir del presente experimento que la adición de la serina-proteasa termoestable termitasa presenta un efecto pronunciado sobre la suavidad. También se produce un efecto acumulativo con amilasas maltogénicas termoestables, tales como Novamyl®. Tras la purificación de la termitasa, no había alfa-amilasa en la preparación que pudiese presentar un impacto sobre la suavidad ni sobre la proporción de relajación.

La tabla 6 muestra que tampoco se produjo ningún efecto negativo sobre la proporción de relajación cuando se utilizó dicha proteasa.

TABLA 6 Elasticidad

6

Se proporcionan la actividad relativa óptima de termitasa (%) de la proteasa a pH 7,0 en una solución tamponada de fosfato 0,1 M y la estabilidad térmica (expresada como función de la estabilidad relativa a una temperatura dada) en las figuras 4 y 5, respectivamente.

El tratamiento con proteasa Taq, queratinasa y/o termitasa solas, en mezcla y/o conjuntamente con amilasas termoestables (por ejemplo Novamyl®) afecta significativamente a la suavidad del pan. El pan tratado con enzima era más blando tras añadir proteasa Taq, queratinasa y/o termitasa. Los ejemplos ilustran que las serina-proteasas termoestables según la presente invención incrementan la vida de almacenamiento de los productos horneados en términos de suavidad y envejecimiento.

Ejemplo 4 Efecto de queratinasa, termitasa y proteasa Taq sobre la estructura de la miga y las características sensoriales del pan

El intermediario termoestable y/o serina-proteasas termoestables anteriormente indicadas según la presente invención no presentaron ningún efecto negativo sobre la estructura de la miga, mientras que otras proteasas no termoestables o proteasas pertenecientes a otro grupo de proteasas, tales como la papaína (cisteína-peptidasa) o la termolisina (metalopeptidasa) sí presentaron un efecto negativo. La utilización de, por ejemplo, la papaína o la termolisina resultó en una estructura de miga más abierta, dependiendo de las dosis utilizadas. Tampoco se produjo ningún efecto sobre el volumen de los productos horneados al utilizar las serina-proteasas termoestables de la invención.

El color de la corteza, el carácter de la corteza, el color de la miga, y el aroma y el sabor del pan no cambiaron significativamente con la adición de queratinasa, proteasa Taq y/o termitasa.

Ejemplo 5 Aplicación de proteasa Taq a pasteles

Receta:

Mezcla pastel Satin Crème: 1.000 g

\quad

Huevos: 350 g

\quad

Aceite: 300 g

\quad

Agua: 225 g

Procedimiento:

Mezclador: Hobart

\quad

Instrumento: Pala

\quad

Velocidad: 1 minuto a velocidad 1 y 2 minutos a velocidad 2, después: Adición de aceite y agua, 1 minuto a velocidad 1, raspar la mezcla y 2 minutos a velocidad 1

\quad

Peso de pasta: 300 g

\quad

Temperatura: 180ºC

\quad

Tiempo: 45 minutos

Las dosis en la tabla 7 siguiente se expresan respecto a 100 kg de peso de harina utilizados en el ensayo de horneado.

La tabla 7 expresa la pérdida de suavidad medida tras 4 días, 1 semana, 2 semanas y 3 semanas tras el horneo.

TABLA 7 Suavidad

7

Claims (9)

1. Procedimiento para la prevención o el retraso del envejecimiento durante el proceso de horneado de productos de panadería, que comprende la etapa que consiste en añadir a dichos productos de panadería por lo menos una serina-proteasa termoestable con una temperatura de actividad óptima superior a 60ºC, siendo dicha proteasa añadida en una cantidad que evita o retrasa el envejecimiento durante el procedimiento de horneado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la serina-proteasa termoestable presenta una temperatura de actividad óptima superior a 70ºC, y más preferentemente superior a 75ºC.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la proporción entre la actividad de proteasa a la temperatura óptima y la actividad de proteasa a 25ºC es superior a 10, preferentemente superior a 15.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la serina-proteasa termoestable se obtiene mediante extracción a partir de organismos eucarióticos o procarióticos de origen natural, mediante síntesis o mediante ingeniería genética.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la serina-proteasa termoestable es una proteasa neutra o más preferentemente una proteasa alcalina.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha proteasa se selecciona de entre el grupo constituido por acualisina I, acualisina II, termitasa y queratinasa.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la serina-proteasa termoestable es una proteasa Taq aislada a partir de Thermus aquaticus LMG 8924, una queratinasa, aislada a partir de Bacillus licheniformis LMG 7561 y/o una termitasa aislada a partir de Thermoactinomyces vulgaris.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la etapa que consiste en añadir además un aditivo antienvejecimiento seleccionado de entre el grupo constituido por una \alpha-amilasa termoestable, una \beta-amilasa, una amilasa maltogénica termoestable intermediaria, una lipasa, unas glucosiltransferasas, unas pululanasas y emulsionantes, preferentemente monoglicéridos, diglicéridos y/o estearoil-lactilatos.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el producto de panadería se selecciona de entre el grupo constituido por pan, panecillos blandos, bagels, donuts, repostería danesa, panecillos para hamburguesa, pizza, pan de pita y pasteles.